Centro Federal de Educação Tecnológica de Química de Nilópolis – Unidade Rio de Janeiro

Relatório de Microbiologia: Técnicas de Contagem – “Pour-Plate” e “Spread-Plate”

Rio de Janeiro, 16 deMaio de 2008.

Alunas: Adriana de Menezes N°.: 01

Elizana Azevedo Silva N°.: 06

Thays Cristine dos Santos Vieira Nº.: 15

Turma: QM 171.

Professoras: Carolina e Lidiane.

Disciplina: Microbiologia.

Rio de Janeiro

2008

Técnicas de Contagem – “Pour-Plate” e “Spread-Plate”

Introdução Teórica:

Além da identificação do tipo do microrganismo de um meio, também é importante em alguns casos sua quantificação. Como exemplo de casos em que a quantificação de microrganismos torna-se importante,

pode-se citar: quantificação da população de microrganismos da água e alimentos para avaliar a qualidade microbiológica dos mesmos, na análise da eficiência de agentes antimicrobianos ou a eficácia de práticas higiênco-sanitárias para se verificar a população sobrevivente ao tratamento. E, a várias técnicas de contagem de microrganismos.

Assim, os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o número de células presentes num determinado material ou superfície, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez, determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA) ou através da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado.

Esse último método leva em consideração um “quesito” importante para a técnica de contagem, que é a quantificação de apenas células vivas. Pois, em determinadas circunstâncias, como aquelas em que se avalia as práticas higiênico-sanitárias, é preciso determinar a população de células viáveis. E, para efetuar a contagem total de bactérias numa determinada suspensão da amostra faz-se diluições decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela técnica de “Pour-Plate” ou “Spread-Plate” com Alça de Drigalsky, em meios de cultura apropriados. Após o período de incubação em condições de temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do número de colônias.

A diferença de um método para o outro é que o método “Pour-Plate” coloca-se, primeiramente, a alíquota de 1ml da amostra com os microrganismos em uma Placa de Petri estéril sem, o meio de cultura, pois esse será colocado por cima dos microrganismos na placa. E, na técnica “Spread-Plate” o meio de cultura já se encontra na placa e os microrganismos são colocados por cima do meio e são espalhados com o auxílio da Alça de Drigalsky (figura 1).

Figura1

Figura retirada do site: www.cial-paulinia.com.br

Porém, as “regras” são as mesmas para as duas técnicas de quantificação direta. Sendo elas:

Príncípio Básico: “Cada colônia é originada do crescimento e multiplicação de 1 célula bacteriana.”

As placas devem conter de 30 a 300 colônias e para isso fazem-se as diluições seriadas, como o procedimento feito para essa prática.

Assim, para a realização da seguinte prática utilizou-se a bactéria Escherichia coli, que assume a forma de um bacilo e pertence à família das Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu habitat natural é o lúmen intestinal dos seres humanos e

de outros animais de sangue quente. E possui múltiplos flagelos dispostos em volta de sua célula.

Objetivo:

Verificar a validade dos métodos Spred-Plate e Pour-Plate para a quantificação células viáveis de microrganismos.

Materiais e Reagentes:

1) “Pour – Plate”:

Materiais Reagentes

Estante para Tubos de Ensaio Cultura de E. coli

2 Tubos de Ensaio com 9mL de Água Peptonada Água Peptonada

2 Placas de Petri Meio de Cultura – Ágar Nutriente

3 Pipetas de 2mL

Vórtex

Pró-pipete

Bico de Bunsen

2) “Spread – Plate”:

Materiais Reagentes

1 Alça de Vidro – Alça de Driglasky Cultura de E. coli

2 Tubos de Ensaio com 9mL de Água Peptonada Água Peptonada

2 Placas de Petri com Meio Agar Nutriente Meio de Cultura – Ágar Nutriente

Bico de Bunsen

Bécher com Álcool

2 Pipetas de 5mL

1 Pipeta de 2mL

Estante de Tubos de Ensaio

Pró-pipete

Vórtex

Procedimentos:

Primeiramente foram realizadas as manobras assépticas adequadas, higienizando-se as mãos e esterilizando-se a bancada, ambos com álcool iodado, a fim de reduzir a carga microbiana do local de trabalho. E trabalhou-se, todo o tempo, nas proximidades do Bico de Bunsen, na chamada zona estéril.

Foram utilizados dois métodos de contagem do crescimento microbiano, primeiramente o “Spread-Plate” e após o “Pour-Plate”.

No método “Spread-Plate”, foram feitas duas diluições com a solução concentrada de cultura bacteriana (10-1 e 10-2), ao qual essa cultura, onde estava presente a bactéria E.coli, foram diluídas em água peptonada.

Essas diluições foram feitas da seguinte forma: Com o auxílio de uma pipeta graduada de 2mL foi adiciona 1mL da solução concentrada de cultura bacteriana ao tubo de ensaio onde a diluição foi de 10-1, tendo-se, posteriormente, homogeneizado o tubo. Com outra pipeta graduada de 2mL, foi adicionado 1mL da solução primeiramente diluída (de concentração 10-1) no tubo de diluição 10-2(posteriormente homogeneizado). Com essa mesma pipeta, retirou-se 0,1mL da solução diluída de 10-1 e colocou-se em uma Placa de Petri anteriormente esterilizada.

Pegou-se uma terceira pipeta graduada e retirou-se, também 0,1mL, da solução diluída de 10-2 e colocou-se em outra Placa de Petri, anteriormente esterilizada.

Após ter posto nas placas as culturas bacterianas diluídas, colocou-se sobre ele o àgar nutriente em seu estado líquido (o ágar deve estar em uma temperatura ideal para que não mate a cultura bacteriana). Completou-se, assim, o método “Spread-Plate”.

No método “Pour-Plate”, realizou-se as mesmas diluições, da mesma forma como foi feito no método “Spread-Plate”. Após serem feitas as diluições, pegou-se uma pipeta graduada e retirou-se 0,1 de cada tubo(diluições 10-1 e 10-2) e colocou-se cada solução em uma Placa de Petri anteriormente esterilizada e contendo a solução de ágar nutriente.

Com o auxílio de uma Alça de Drigalsky, anteriormente flambada, espalhou-se a solução contendo a cultura microbiana homogeneamente sobre a superfície do ágar.

Incubou-se as Placas de Petri em estufa a temperatura de 36-37ºC por um período de 24 horas, após esse período, levou-se as placas para a geladeira.

Resultados e Discussão:

1) “Pour – Plate”:

Tanto na placa de concentração 10-1 quanto na placa de concentração 10-2, não foi possível contar o numero de colônias, pois estavam acima do limite (entre 30 e 300 colônias). Pode-se perceber que para uma contagem efetiva seria necessário, no mínimo, mais uma diluição.

Na foto abaixo, que mostra os resultados obtidos nessa prática, visualiza-se porque a contagem não foi possível.

Figura 2: Resultado da prática de contagem – Técnica “Pour-Plate” – Placa da esquerda (conc. 10-2) – Placa da direita (conc. 10-1).

2) “Spread – Plate”:

Não foi possível realizar a contagem em nenhuma das placas. Novamente, assim como na técnica do “Pour-Plate”, as concentrações das colônias estavam acima do valor máximo. Nessa técnica também seria necessária mais uma diluição.

Nas fotos abaixo, pode-se comparar o resultado obtido com o resultado que seria ideal.

Figura 3: Exemplo de placa “contável” – Cultura de Salmonella – prática realizada por outra turma (conc. 10-2).

Figura 4: Resultado da prática de contagem – Técnica “Spread-Plate” – Placa da esquerda (conc. 10-1) – Placa da direita (conc. 10-2).

Conclusão:

Após a visualização dos resultados da prática, pode-se concluir que os dois métodos seriam eficazes para a contagem de colônias bacterianas. Porém, isso não foi possível em nosso experimento, pois as soluções utilizadas ainda possuíam altas concentrações de bactérias, sendo necessário, no mínimo, mais uma diluição para a realização da contagem.

Bibliografia:

Acessados em 13/05/2008:

www.microbiologia.ufba.br/aulas/Contagem%20em%20placas%20pourplate.rtf –

www.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat2.pdf -

www.dbi.ca/Books/Graphics/image-27.gif