CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES

CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE Eugenia arenosa

MATTOS (MYRTACEAE) FRENTE A Escherichia coli

CAMILA ERTHAL

Lajeado, julho de 2012

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Camila Erthal

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE Eugenia arenosa

MATTOS (MYRTACEAE) FRENTE A Escherichia coli

Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia apresentado na disciplina de Estágio Supervisionado III, como exigência parcial para a obtenção do título de Bacharel em Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Miranda Ethur

Lajeado, julho de 2012

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RESUMO

O Brasil possui uma rica biodiversidade, permitindo assim vários estudos

científicos através do conhecimento popular. O intuito desse trabalho foi obter dados

sobre uma espécie pouco conhecida Eugenia arenosa pertencente a família da

Myrtaceae. Neste trabalho, foi realizada a atividade antimicrobiana, do extrato

aquoso e etanólico, e o screening fitoquimico das folhas, da espécie nativa do RS,

Eugenia arenosa. Através do screening fitoquímico foram detectadas a presença de

flavonoides e taninos. Tanto o extrato aquoso como etanólico inibiram o crescimento

da Escherichia coli em uma CIM de 1250 µg/mL, apresentando desta foram

atividade bacteriostática.

Palavras-chave: Eugenia arenosa. Extratos vegetais. Atividade antimicrobiana.

Escherichia coli.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Foto da espécie vegetal Eugenia arenosa coletada em Manoel Viana. 11

FIGURA 2 – Foto de uma colônia de E. coli. ............................................................. 12

FIGURA 3 - Foto dos extratos aquoso e etanólico de Eugenia arenosa, na diluição

de trabalho. ............................................................................................................... 20

FIGURA 4 - Placa de 96 poços utilizada para o ensaio de Concentração Inibitória

Mínima. ..................................................................................................................... 22

FIGURA 5 - Resultado da Concentração Bactericida Mínima para Escherichia coli. 27

FIGURA 6 – Resultado do teste para taninos do extrato aquoso de E. arenosa. A

esquerda, o resultado do tubo A; resultado do tubo B ,resultado tubo C indicando a

presença dos metabólitos.......................................................................................... 28

FIGURA 7 – Resultado do teste para flavonoides do extrato aquoso de E. arenosa. A

esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos

metabólitos. ............................................................................................................... 29

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Principais agentes causadores de diarreia infecciosa (MARQUES,

2008). ........................................................................................................................ 14

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 6

2 OBJETIVO ........................................................................................................... 8

2.1 Objetivo geral ................................................................................................. 8

2.2 Objetivo específico ......................................................................................... 8

3 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................... 9

3.1 Eugenia arenosa .......................................................................................... 10

3.2 Escherichia coli ............................................................................................ 11

3.3 Screening fitoquímico ................................................................................... 16

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 18

4.1 Materiais vegetais ........................................................................................ 18

4.2 Preparo dos extratos .................................................................................... 18

4.2.1 Extrato aquoso....................................................................................... 18

4.2.2 Extrato etanólico .................................................................................... 19

4.3 Micro-organismo .......................................................................................... 19

4.4 Diluição dos extratos .................................................................................... 19

4.5 Fármaco utilizado como referência antimicrobiana ...................................... 20

4.6 Controle diluente .......................................................................................... 21

4.7 Atividade antimicrobiana .............................................................................. 21

4.7.1 Determinação da concentração mínima inibitória pelo método de

microdiluição. ..................................................................................................... 21

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4.7.2 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) ................. 23

4.8 Screening fitoquímico ................................................................................... 24

4.8.1 Taninos .................................................................................................. 24

4.8.2 Flavonóides ........................................................................................... 24

4.8.3 Alcalóides .............................................................................................. 25

5 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................................ 26

5.1 Screening fitoquímico ................................................................................... 27

5.1.1 Taninos .................................................................................................. 28

5.1.2 Flavonoides ........................................................................................... 29

6 CONCLUSÃO .................................................................................................... 30

PERSPECTIVAS PARA NOVOS TRABALHOS ........................................................ 31

BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 32

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1 INTRODUÇÃO

O Brasil apresenta uma ampla diversidade ecológica, com uma das floras

mais ricas do mundo permitindo, assim, diversos estudos científicos e,

consequentemente, aumentando o desenvolvimento nesta área. Com o passar do

tempo, o homem veio descobrindo, através de pesquisas, que as frutas possuem

não só um valor nutricional, mas, além disso, um grande efeito medicinal e

cosmético (GUERRA; NODARI 2004).

As afecções de origem alimentar ocorrem devido à ingestão de alimentos

contaminados com micro-organismo ou toxinas indesejáveis. Esses micro-

organismos aderem à mucosa do intestino proliferando e penetrando nos tecidos ou,

ainda, produzem toxinas que alteram o funcionamento das células do trato

gastrintestinal. Entre as bactérias invasivas destacam-se a Salmonella, Shigella,

Escherichia coli invasora, Yersinia enterocolitica. E as bactérias toxigênicas,

incluem-se Vibrio cholerae, Escherichia coli enterotoxigênica, Campylobacter jejuni

(FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAFF 2008).

No inicio de 2012, foram incluídas no projeto de pesquisa "Estudo Químico e

Atividade Biológica de Plantas Nativas e Adaptadas do RS", como objeto de estudo

quatro Myrtaceaes – Eugenia anomala, Eugenia pluricepala, Eugenia pitanga e

Eugenia arenosa – todas coletadas no interior do município de Manoel Viana, RS, e,

para todas, verificou-se uma carência de estudos, tanto sobre o ponto de vista

agronômico, químico como biológico.

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Desta forma temos como proposta de Trabalho de Conclusão de Curso, aqui

apresentado, o início dos estudos em relação a essas quatro Myrtaceaes, tanto

químico como de suas atividades biológicas.

Assim, foi selecionada a espécie vegetal nativa Eugenia arenosa, e o micro-

organismo Escherichia coli. Esta bactéria Gram-negativa está presente em um

grande incidência deste em casos de intoxicação alimentar, causando desde casos

de diarreia e até mesmo a morte, no caso de cepas mais patogênicas.

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2 OBJETIVO

2.1 Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de

uma espécie vegetal Eugenia arenosa frente ao micro-organismo Escherichia coli.

2.2 Objetivo específico

Obter extrato aquoso, etanólico das folha Eugenia arenosa;

Realizar o screening fitoquímico do extrato aquoso das folha Eugenia

arenosa;

Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) frente ao micro-organismo

Escherichia coli.

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3 REFERENCIAL TEÓRICO

A familia Myrtaceae é considerada uma das mais importantes encontradas no

Brasil. Esta família envolve cerca 129 gêneros e 4620 espécies e configura-se como

a maior família da ordem Myrtales, com dois grandes centros de dispersão nas

Américas e na Austrália embora possam ser encontradas em todo mundo (COLE et

al., 2007; JOLY,1993).

Pode ser dividida em duas subfamílias Myrtoideae e Leptospermoideae que

são diferenciadas pela morfologia das folhas e frutos. Na subfamília família

Myrtoideae as folhas são opostas e frutos carnosos já na família Leptospermoideae

as folhas são alternas e frutos secos (SOBRAL, 2003).

As plantas que pertencem a essa família são lenhosas, arbustivas ou

arbóreas, as folhas simples, opostas, de bordos inteiros. As Myrtaceae brasileiras

são caracterizadas por possuir tronco de casca lisa e florescem no início da

primavera (JOLY, 1993; SOBRAL, 2003).

Na flora brasileira essa família aparece entre as mais comuns na maioria das

formações vegetais, destacando a Floresta Atlântica e a floresta de Restinga, onde

espécies de Eugenia, Marlierea, Gomidesia são muito comuns (SOUZA; LORENZI

2005).

Trabalhos realizados por Cruz e Kaplan (2004) e Alves (2008) revelaram que

a família Myrtaceae apresenta um indicie bastante significativo em relação ao

número de espécies empregadas para fins medicinais.

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Vários estudos apontam que inúmeras espécies que pertencem a essa família

apresentam alguma atividade terapêutica. lha confirmou que o extrato etanólico dos

frutos Psidium guajava L (goiaba) apresentam atividade antimicrobiana frente a

bactérias Gram-positiva como Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis

(IHA et al., 2008).

Luzia verificou que o extrato etanólico da semente de Eugenia Uniflora L

apresenta atividade antioxidante e um elevado grau de instauração que favorece seu

uso para fins comestíveis como matéria prima para indústrias farmacêuticas (LUZIA

et al., 2010).

Algumas espécies são utilizadas na culinária (Syzigium aromaticum), outras

como plantas ornamentais (Melaleuca leucadendra, Eugenia sprengelii, E. ficifolia) e

ainda como frutos comestíveis (Eugenia uniflora, Psidium guajava, Psidium

cattleyanum) (SOUZA; LORENZI, 2005).

3.1 Eugenia arenosa

A espécie vegetal Eugenia arenosa (FIGURA 1) é um subarbusto que atinge

até 0,5 m; possui ramos jovens, folhas lanceoladas ou oblongas, frutos não vistos.

Essa planta se distribui em campos arenosos da região da Campanha no Rio

Grande do Sul e ocorre também no Paraná e no Paraguai. Existem tão poucos

estudos sobre a planta, que não foi encontrada nenhum nome popular para a

mesma (SOBRAL, 2003).

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FIGURA 1 – Foto da espécie vegetal Eugenia arenosa coletada em Manoel Viana.

Fonte: Dos autores.

3.2 Escherichia coli

A bactéria Escherichia coli (E. coli, FIGURA 2) pertence a família

Enterobacteriaceae. São bacilos Gram-negativo, não esporulados, aeróbicos e

anaeróbicos facultativos, capazes de fermentar glicose com produção de ácido e

gás, sendo um dos habitantes mais comum da microbiota intestinal dos animais e

dos homens (GERMANO; GERMANO, 2001; FRANCO; LANDGRAFF 2008;

TORTORA; FUNKE; CASE 2005).

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FIGURA 2 – Foto de uma colônia de E. coli.

Fonte: Eric Erbe, colorida digitalmente por Christopher Pooley, USDA, ARS, EMU. http://en.wikipedia.org/wiki/File:E_coli_at_10000x,_original.jpg

A E. coli geralmente não é considerada patogênica, contudo, pode estar

envolvida nas infecções urinárias. Existem certas cepas que podem ser patogênicas,

apresentando fímbrias especializadas que se ligam a certas células do epitélio

intestinal produzindo uma toxina, provocando distúrbios gastrointestinais

(GERMANO; GERMANO 2001).

Com base nos fatores de virulência, manifestações clínicas e

epidemiológicas, as linhagens dessas bactérias consideradas patogênicas são

divididas em: E. coli enteropatogênica clássica, enteroinvasora, enterotoxigênica,

entero-hemorrágica enteroagregativa (FORSYTHE, 2002).

A E. coli enterotoxigênica (ETEC) é conhecida como a causadora da diarreia

dos viajantes, ou seja, ocorre entre pessoas recém-chegadas em determinado lugar

devido às mudanças alimentares. A ETEC causa uma diarreia liquida, e produz

febres baixas. O micro-organismo coloniza próximo ao intestino delgado

(FORSYTHE, 2002; JAY, 2005).

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As condições favoráveis para o desenvolvimento desse bacilo são:

temperatura de 37 °C, existindo casos de cepas que podem se proliferar a 4 °C, pH

7,5 e sobrevivem por longos períodos em alimentos fermentados ou ácidos

(GERMANO;GERMANO, 2001).

A transmissão pode ocorrer através do consumo de alimentos contaminados

de origem animal ou vegetal, principalmente crus ou levemente cozidos, leite cru,

além de água de abastecimento não tratada, facilitando a contaminação cruzada na

preparação de alimento (FORSYTHE, 2002; GERMANO; GERMANO, 2001).

A ocorrência de infecções é maior nas regiões tropicais, onde há predomínio

de uma grande concentração de pessoas, onde as condições sanitárias são

precárias e a contaminação de água é seguida (GERMANO; GERMANO, 2001).

Nos dias atuais a E. coli é umas das principais bactérias envolvidas em

surtos. No ano de 1996, 9000 pessoas no Japão ficaram doentes e 7 morreram

(TORTORA; FUNKE; CASE 2005). Em 2011, foi relatado, na Alemanha, um surto

envolvendo a E. Coli 0104:H4. A origem foi atribuída a contaminação de brotos de

feijão e sementes germinadas, onde causou 276 casos de síndrome hemolítica-

urêmica e 3 mortes. Já na França também ocorreram surtos envolvendo E. Coli

0104:H4. O surto acometeu 4137 pacientes, levando 50 a óbito, sendo a origem por

contaminação de alimentos (MARTINO; MENEZES, 2011).

Em vários países no mundo a E. coli, juntamente com outros micro-

organismos, é responsável também por diversos casos de diarreia.

Segundo a OMS, a diarreia é a segunda causa de morte infantil no mundo,

sendo responsável por cerca de 16% das mortes em crianças de até 5 anos, o que

representa algo em torno de 1,5 milhões de mortes (WHO, 2009 ).

A diarreia pode ser definida pelo excessivo aumento da quantidade de água

eliminada nas fezes, sendo que até 200 g/dia do peso da água fecal, é um limite

aceitável para adultos saudáveis. A grande parte dos casos de diarreia resulta de

desordens de transporte da água e eletrólitos no intestino (MARQUES, 2008;

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GOODMAN; GILMAN 2010). Popularmente é tratada como uma enfermidade, mas

constitui um mecanismo fisiológico onde o próprio organismo busca eliminar

rapidamente substâncias estranhas, podendo ser tóxicas ou irritantes (MARQUES,

2008).

A diarreia, por ser uma manifestação comum de doenças infecciosas, pode vir

acompanhada de alguns sintomas, tais como: flatulência, debilidade, mal-estar em

geral, dor abdominal, febre, incontinência, vômitos, sensação de urgência e dor

perianal. Alguns fatores como os socioeconômicos, ambientais, nutricionais,

demográficos e comportamentais, podem interferir diretamente para sua ocorrência

(MARQUES, 2008).

Segundo Marques, a diarreia infecciosa pode ser causada por inúmeros

agentes etiológicos, tais como vírus, bactérias e parasitas (MARQUES, 2008). A

Tabela 1, a seguir, mostra uma relação dos principais agentes causadores.

TABELA 1 – Principais agentes causadores de diarreia infecciosa (MARQUES, 2008).

O tratamento farmacológico da diarreia será de acordo com a intensidade,

duração e a causa do quadro diarreico. Uma das medidas mais frequentes é o uso

de reidratantes orais a base de solução de cloreto de sódio, cloreto de potássio,

glicose e bicarbonato de sódio. O uso desses reidratantes é uma alternativa barata e

de fácil aquisição, existindo, ainda, uma fórmula caseira que possibilita, assim, o

tratamento de pessoas de baixa renda e, consequentemente, diminuindo o risco de

mortalidade (MARQUES, 2008; RANG et al., 2008).

Bactérias Protozoários Vírus

E. coli E. histolytica Rotavírus

Shigella Giardia lamblia Adenovírus

Salmonella Cryptosporidea Coronavírus

Vibrio cholera Astrovírus

S. aureus Calicivírus

Campylobacter

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Segundo Oliveira, a partir da década de 1990, houve um significativo declínio

nos casos registrados da doença, porém, a mesma ainda representa um grande

problema de saúde pública, principalmente na população de menor renda e devido

ao fato dos serviços de saúde não assumirem um papel eficiente na assistência

precoce para a prevenção da doença, levando, inclusive, ao óbito em alguns casos

(OLIVEIRA; LATORRE 2010).

Desde os tempos antigos a humanidade vem acumulando inúmeras

informações sobre o ambiente em que a rodeia, resgatando e promovendo medidas

para melhorar as condições de sobrevivência. Os países em desenvolvimento

buscam alternativas terapêuticas nas plantas, pois, muitas vezes, são a única forma

de acesso aos cuidados básicos de saúde, devido à pobreza ou precariedade no

sistema de saúde (DI STASI, 1996).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 80% da

população desses países, encontra nas plantas alguma ação terapêutica, sendo,

inúmeras vezes, o único recurso encontrado para alívios de uma enfermidade.

(CALIXTO, 2001).

As informações sobre o uso de plantas medicinais e seus efeitos terapêuticos

foram sendo acumuladas durante séculos, ou seja, passando de pai para filho, de

uma geração para outra. Muitos desses conhecimentos empíricos, atualmente, já

possuem comprovação cientifica quanto a sua eficácia, podendo ser um atalho para

a descoberta de novos fármacos (DI STASI, 1996).

No entanto, essas informações sobre o uso popular e tradicional, não são

suficientes para comprovar quanto à eficácia e segurança, devendo ser previamente

validada, ou seja, sua ação comprovada e sua toxicidade potencial devem ser

avaliadas cientificamente na espécie humana. (LAPA et al.,2004)

Através de um levantamento etnofarmacológico sobre o uso de plantas

medicinais empregadas no tratamento de transtornos menores de saúde na cidade

de Tubarão/SC, conclui-se que a população estudada utiliza pelo menos um tipo de

planta na resolução de algum problema e ainda sofre influência de diferentes

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conhecimentos, uma vez que possui mais que uma etnia. O estudo ainda

demonstrou que o emprego em relação às plantas está de acordo com as

propriedades farmacológicas associadas (NIEHUES et al., 2011).

Um estudo realizado por Agra no Nordeste do Brasil, em 2007, registra o uso

de 483 plantas para fins medicinais. Muitas dessas espécies relatadas ainda não

foram comprovadas cientificamente, mas o estudo visa salientar a importância de

investigar mais plantas de conhecimento popular (AGRA et al., 2007).

As plantas estão sendo essenciais na descoberta de produtos naturais

biologicamente ativos, sendo que, muitas delas apresentam-se como base para a

síntese de novos fármacos (GUERRA; NODARI 2004).

3.3 Screening fitoquímico

Neste trabalho foi dada uma maior atenção aos dois principais grupos de

metabólitos encontrados em espécies da família Myrtaceae, os taninos e os

flavonoides.

Os taninos são substâncias fenólicas solúveis em água, apresentam

capacidade de formar complexos insolúveis em água com alcaloides, gelatina e

outras proteínas, estão distribuídas no reino vegetal (SANTOS; MELLO 2004).

Os taninos são classificados em hidrolisáveis e condensados. Os taninos

condensados podem ser encontrados em plantas lenhosas enquanto os taninos

hidrolisáveis ocorrem em dicotiledônia herbácea e lenhosa (SANTOS; MELLO

2004).

Na medicina tradicional o emprego de plantas ricas em taninos ocorre no

tratamento de diversas moléstias como hipertensão arterial, reumatismo, diarreia,

hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais, problemas renais e

processos inflamatórios (SANTOS; MELLO 2004).

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O emprego na indústria tem sido na utilização no curtimento do couro, a

contribuição também pode ser feita na fabricação de vinhos, chás, suco de frutas

devido sua adstringência uma característica comum desse metabólito (SANTOS;

MELLO 2004).

Já os flavonoides, caracterizam por ser um dos grupos fenólicos mais

importantes e diversificados entre os produtos de origem natural sendo amplamente

encontrada no reino vegetal e com isso são utilizados como marcador taxonômico

(ZUANAZZI, 2004).

São atribuídas diversas funções para os flavonoides nas plantas, tais como:

proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta, proteção contra

insetos, fungos, vírus, bactérias, atraentes de animais com finalidade de polinização,

antioxidante entre outas (ZUANAZZI, 2004).

O interesse econômico nesses compostos é devido a suas diferentes

propriedades, por exemplo: as cores que esses pigmentos possuem, sua

importância no processo de tanagem do couro, na fermentação do chá-da-índia, na

manufatura do cacau e suas contribuições em nutrição e sabor de alimentos

(ZUANAZZI, 2004).

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais vegetais

As folhas de Eugenia arenosa foram coletadas no município de Manoel Viana

no Rio Grande do Sul, em novembro de 2011. A identificação do material vegetal foi

realizada pela botânica Prof. Dra. Elisete Maria de Freitas.

4.2 Preparo dos extratos

A partir do material coletado foram preparados os extratos aquoso e etanólico

das folhas de Eugenia arenosa.

4.2.1 Extrato aquoso

O extrato aquoso foi obtido pelo processo de infusão. As folhas verdes foram

trituradas para aumentar a superfície de contato do vegetal com a solução extratora.

O solvente utilizado, nesse processo foi água destilada. Após, foi adicionado 100

gramas de folhas em 1000 mL de água destilada fervente durante 30 minutos. Em

seguida o material foi filtrado, acondicionado em frasco âmbar e guardado sob

refrigeração.

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Após esse período retirou-se todo o solvente com o auxilio de um rota-

evaporador em uma temperatura 40 °C, onde o extrato foi guardado sob refrigeração

até a realização dos testes antimicrobianos e de screening fitoquímicos.

4.2.2 Extrato etanólico

O extrato etanólico foi obtido pelo processo de maceração a frio. Foram

utilizadas 70 g de folhas trituradas (o que aumenta a superfície de contato do vegetal

com a solução extratora) em 700 mL de álcool etílico 90 %. Estocou-se essa solução

à temperatura ambiente, protegida da luz por um período de sete dias procedendo-

se em seguida a filtração a vácuo do material.

Após esse período retirou-se todo o solvente com o auxilio de um rota-

evaporador em uma temperatura 40 °C, onde o extrato foi guardado sob refrigeração

até a realização dos testes antimicrobianos.

4.3 Micro-organismo

Para a avaliação da atividade antimicrobiana e da Concentração Inibitória

Mínima (CIM) foi empregada uma cepa padrão proveniente da American Type

Culture Collection (ATCC) Escherichia coli (ATCC 25922) cedida pelo Laboratório de

Microbiologia do UNIANÁLISES.

4.4 Diluição dos extratos

Para preparar soluções de cada extrato, aquoso e etanólico, pesou-se 0,2

gramas de cada um em copo de Becker de 25 mL. Em seguida, adicionou-se 8 mL

de água deionizada estéril, e 0,5 mL de DMSO. Após a solubilização do extrato,

transferiu-se para um balão volumétrico de 10 mL e com auxilio de uma pipeta de

Pasteur, foi completando o volume com água deionizada estéril.

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Desta forma, foi obtida uma solução de 20.000 μg/mL com dimetilsulfóxido

(DMSO) a 0,5% conforme a Figura 3.

FIGURA 3 - Foto dos extratos aquoso e etanólico de Eugenia arenosa, na diluição de trabalho.

Fonte: dos autores.

4.5 Fármaco utilizado como referência antimicrobiana

Para o controle antimicrobiano foi utilizado como referência o antibiótico

cloranfenicol, adquirido comercialmente na forma de colírio oftalmológico onde se

preparou uma solução de 200 μg/mL, a partir de 500 L diluídos em 10 mL de água

destilada e desionizada.

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4.6 Controle diluente

Para o controle diluente foi preparado uma solução. Em um balão volumétrico

de 10 mL, adicionou-se 0,5 mL de DMSO e completou-se o volume com água

deionizada estéril.

4.7 Atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana é avaliada através da determinação de uma

pequena quantidade de substância necessária para inibir o crescimento do micro-

organismo,conhecida como Concentração Inibitória Mínima (CIM). O método

empregado foi descrito por Clinical and Laboratory Standards Insitute (CLSI).

4.7.1 Determinação da concentração mínima inibitória pelo método de

microdiluição.

A determinação da concentração mínima inibitória foi realizada através do

método de microdiluição, utilizando placas de acrílico com 96 poços. Nas placas

foram aplicados os extratos aquoso e etanólico, o fármaco antimicrobiano

(cloranfenicol), o diluente (DMSO) todos em triplicata. Também foram feitos controle

positivo e negativo.

A técnica foi realizada em capela de fluxo laminar, onde primeiramente

desinfetou-se com álcool 70 °GL, o manipulador pavimentou-se de acordo e após foi

colocado todos os materiais necessários para a realização dos testes.

Inicialmente com auxilio de uma alça estéril, retirou-se algumas colônias e

inoculou-se em solução salina 0,8% em tubo de ensaio. Em seguida ajustou-se o

inoculo conforme à escala de 0,5 Mc Farland.

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Após retirou-se 200 μL do inóculo padronizado e transferiu-se para tubos de

ensaio contendo 10 mL de caldo de caseína de soja. Deixando um tubo de ensaio

sem micro-organismo para o controle do meio.

As placas apresentavam linhas de A – H e colunas de 1 a 12 conforme a

Figura 4.

FIGURA 4 - Placa de 96 poços utilizada para o ensaio de Concentração Inibitória Mínima.

Fonte: Dos autores

Para cada um dos 12 poços da linha A até a linha F foram adicionados 100 μL

do meio de caseína de soja com o inoculo. Na linha G adicionou-se apenas em cada

poços 100 μL do meio de caseína de soja com o inoculo para o controle do

crescimento do micro-organismo. Na linha H apenas foi adicionado o meio (caldo de

caseína de soja sem o inóculo), em cada poços 100 μL.

As colunas 1, 2, 3 foram destinadas para os extratos aquosos, as colunas 4,

5, 6 para extrato etanólicos as colunas 7, 8 ,9 ao cloranfenicol e as colunas 10 , 11 e

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12 ao DMSO. Adicionou-se 100 μL de cada extrato, cloranfenicol e DMSO aos seus

respectivos poços da linha A totalizando 200 μL em cada poço.

Após, iniciou-se as diluições. Homogenizou-se cuidadosamente os primeiros

poços da linha A, transferindo 100 μL para os poços seguintes, usando as mesmas

ponteiras, e assim sucessivamente, até a linha F.

Terminada as diluições, as placas foram incubadas a 36 °C por 24 horas.

As concentrações finais, após as diluições para cada extrato, foram:

1°poço:10.000 µg/mL, 2º poço: 5.000 µg/mL, 3º poço:2.500µg/mL, 4º poço:1.250

µg/mL, 5º poço: 625 µg/mL 6º poço: 312,5 µg/mL

As concentrações finais para o cloranfenicol foram: 1°poço:0,1µg/mL, 2º poço:

0,05 µg/mL, 3º poço:0,025µg/mL, 4º poço:0,0125 µg/mL, 5º poço: 0,00625, 6º poço:

0,003125 µg/mL

Após o tempo de incubação, realizou-se a leitura das placas. A ausência de

crescimento bacteriano foi representada pelo poços límpido e o crescimento

bacteriano foi representado pelo poços turvo. O primeiro poço onde não se observou

crescimento (de maior diluição), (de menor valor) corresponde ao valor da

concentração inibitória mínima.

A confirmação de crescimento microbiano nos poços, foi realizado por meio

da aplicação de 10 μL de uma solução de cloreto de trifeniltetrazólico 0,5 % (TTC), o

que revelou uma coloração avermelhada onde houve crescimento.

4.7.2 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

Inicialmente verteu-se o meio de cultura (ágar nutriente) sobre as placas de

Petry estéreis. Em seguida onde os poços estavam límpidos com o auxilio de uma

alça estéril foi semeado sobre o meio. Essas placas foram incubadas a 36 °C por 24

horas.

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A leitura dos resultados é realizada da seguinte maneira:

Caso ocorra crescimento do micro-organismo no meio de cultura, significa

ação bacteriostática;

A ausência de crescimento do micro-organismo no meio de cultura, significa

ação bactericida.

4.8 Screening fitoquímico

A pesquisa fitoquímica tem como principio conhecer os constituintes químicos

das espécies vegetais ou avaliar a sua presença. A caracterização dos grupos de

metabolitos foi realizada utilizando reações químicas específicas para cada caso,

que resultam no desenvolvimento de cor ou precipitado característico (SIMOES et al,

2002).

4.8.1 Taninos

Para o teste dos taninos, extraiu-se cerca 0,1 g dos extratos vegetais em 20

mL de água por 30 minutos em banho-maria fervente. Após o resfriamento, filtrou-se

e dividiu-se em 4 tubos de ensaio (A,B,C,D). No tubo A adicionou-se 1 mL de

solução de gelatina 1%. A formação de turvação ou precipitado indica uma reação

positiva (presença de taninos). No tubo B foram adicionadas 2 gotas de uma solução

de FeCl3 1%. O desenvolvimento de uma coloração azulada ou esverdeada indica a

presença taninos. No tubo C foi adicionado 1 mL de ácido clorídrico 10% e aqueceu-

se em banho-maria por 30 minutos. O desenvolvimento de flobafenos indica a

presença de taninos condensados. O tubo D foi usado como controle da coloração

inicial da amostra vegetal.

4.8.2 Flavonóides

Para o desenvolvimento deste teste, extraiu-se cerca de 0,2 g dos extratos

em 50 mL de água em banho-maria fervente. Após o resfriamento filtrou-se e

extraiu-se em funil de separação com 10 mL de n-butanol, repetindo mais uma vez

essa etapa. Evaporou-se a fração orgânica até à secura em cápsula de porcelana,

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retomou-se o extrato em metanol e em seguida dividiu-se em dois tubos de ensaio,

A e B. No tubo A adicionou-se cuidadosamente 0,5 g ácido clorídrico concentrado e

após 0,1 g de magnésio metálico.

O desenvolvimento de uma coloração violácea indica a presença flavanonas,

a coloração laranja indica a presença de flavonas e a coloração vermelha indica a

presença de flavonóis. O tubo B foi usado como controle da coloração inicial da

amostra vegetal.

4.8.3 Alcalóides

Para a identificação de alcaloides, extraiu-se cerca de 0,1 g dos extratos

vegetais com 20 mL de metanol. Essa solução foi dividida em 3 tubos de ensaio

onde adicionou-se em cada tubo 5 mL de ácido clorídrico 10%. Os tubos foram

aquecidos em banho-maria durante 30 minutos em uma temperatura 40°C. Após o

resfriamento, filtrou-se e transferiu-se uma parte deste para um vidro relógio e

adicionou-se gota a gota os reagentes Bouchardat, Mayer, Dragendorff e Bertrand a

formação de um precipitado indica a presença de alcalóides.

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5 RESULTADO E DISCUSSÃO

O rendimento dos extratos das folhas Eugenia arenosa foi calculado após o

término da remoção do solvente. O extrato aquoso de Eugenia arenosa teve um

rendimento 3,92%. Já o extrato etanólico Eugenia arenosa teve um rendimento

32,72%.

A atividade antimicrobiana do extrato aquoso e etanólico da Eugenia arenosa

foi determinada através da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração

Bactericida Mínima (CBM) pelo método de microdiluição em caldo.

A Concentração Inibitória Mínima é determinada pela menor concentração

capaz de impedir o crescimento de um micro organismo, no presente estudo foi

certificada pela presença de poços límpidos (NCCLS - Document M7-A6, 2003).

O extrato etanólico e aquoso de Eugenia arenosa mostrou possibilidade de

inibir o crescimento da cepa Escherichia coli em uma CIM de 1250 µg/mL.

Para a determinação da concentração que origina a morte do micro

organismo (CBM), foi indispensável semear alíquotas das diluições que

desenvolveram poços límpidos que não houve crescimento para placas de Petry.

Após 24 horas, o período necessário para a incubação, foi confirmado a presença de

crescimento bacteriano nas placas de Escherichia coli, como mostra a Figura 5.

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FIGURA 5 - Resultado da Concentração Bactericida Mínima para Escherichia coli.

Fonte: Dos autores.

O método microbiológico que avalia a capacidade de um antimicrobiano

eliminar bactérias é conhecido como atividade bactericida. Outro método

microbiológico onde tem a capacidade de inibir sua multiplicação é conhecido como

atividade bacteriostático (FUCHS; WANNMACHER 2010).

Diante desse resultado, o extrato pode ser considerado bacteriostático, pois

apenas inibiu o crescimento bacteriano e não teve capacidade de ocasionar a morte

do micro-organismo.

5.1 Screening fitoquímico

A partir dos resultados encontrados nos testes fitoquímicos, verificou-se a

presença de alguns compostos nas folhas de Eugenia arenosa tais como

flavonoides e taninos. Não foi verificada a presença de alcaloides na espécies.

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5.1.1 Taninos

O teste para caracterização de taninos dos extratos de Eugenia arenosa

resultou no desenvolvimento de um precipitado no tubo A (gelatina 1%), pois os

taninos por serem substâncias fenólicas precipitam proteínas. A complexação de

hidroxilas com Fe²+ leva o surgimento de substâncias de coloração azul ou verde, o

tubo B (cloreto de ferro 1%), caracterizou uma coloração esverdeada, indicando a

presença de tanino condensado (FIGURA 6).

O tubo C também indica a presença de taninos, pois em contato com ácidos

diluídos e aquecidos precipitam sob a forma de grumos grosseiros.

FIGURA 6 – Resultado do teste para taninos do extrato aquoso de E. arenosa. A esquerda, o resultado do tubo A; resultado do tubo B ,resultado tubo C indicando a presença dos metabólitos.

Da direita para esquerda: resultado do precipitado, resultado coloração esverdeada, presença de grumos. Fonte. Dos autores.

Segundo o estudo Loguercio em 2005 aponta que as folhas jambolão

Syzygium cumini (L) rica em tanino apresentam atividade antibacteriana frente a

bactérias gram-positiva e gram-negativas, onde as bactérias gram-positiva obtiveram

maior atividade pois sua estrutura celular é mais rígida, parede celular menos

complexa e menor teor lipídico do que comparada as bactérias gram-negativa

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5.1.2 Flavonoides

Na reação para detecção de flavonoides no extrato Eugenia arenosa obteve-

se uma coloração alaranjada indicando a presença de flavonoides. Conforme mostra

a Figura 7.

FIGURA 7 – Resultado do teste para flavonoides do extrato aquoso de E. arenosa. A esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos metabólitos.

A esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos metabólitos. Fonte. Dos autores.

Um estudo, feito por Iha (2008), demonstrou que os taninos são os possíveis

responsáveis pela atividade antimicrobiana; Utilizando extrato etanólico dos frutos

Psidium guajava (goiaba) frente a S. epidermidis, S. aureus. Neste mesmo estudo

ficou evidenciado que os flavonoides são os possíveis responsáveis pela atividade

antioxidante.

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6 CONCLUSÃO

Com a avaliação antimicrobiana do extrato aquoso e etanólico de Eugenia

arenosa, verificou-se que os extratos apresentaram atividade bacteriostática nas

concentrações de 1250 µg/mL, para ambos os extratos, frente a Escherichia Coli.

O screening fitoquímico empregado indicou a presença de taninos e

flavonoides, onde a presença de taninos pode ser responsável pela atividade

antimicrobiana encontrada.

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PERSPECTIVAS PARA NOVOS TRABALHOS

Serão necessários maiores estudos relacionando a composição química com

a atividade biológica; pois assim seria possível correlacionar o tipo de metabólito

com sua aplicação terapêutica. É uma tarefa imprescindível para um mercado cada

vez mais exigente em todo o mundo.

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