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1 INTRODUO

Anualmente milhares de pessoas sofrem com problemas do corao, especificamente aqueles que envolvem as vlvulas cardacas. As causas so de variadas fontes sejam elas congnitas ou adquiridas. Em muitos casos faze-se necessrio a troca das vlvulas doentes por prteses, que podem ser de origem mecnica ou biolgica. As vlvulas mecnicas foram as primeiras a serem implantadas seguidas pelas prteses biolgicas, porm apresentam muitos problemas de rejeio. Sendo assim, as bioprteses so mais adequadas para implantes, no entanto tambm esto expostas a complicaes sendo a calcificao a pior delas. Para evitar esse problema muitos tipos de tratamentos j foram desenvolvidos, aprimorados e outros ainda em estudo. Atualmente a

descelularizao do pericrdio bovino, material mais utilizado na confeco das vlvulas biolgicas, tem tido destaque nas pesquisas para o melhoramento do tecido. Porm ao submeter o material a algum tipo de tratamento faz-se necessrio saber qual ser a sua influncia na estrutura do material, sendo necessria uma avaliao das propriedades mecnicas aps o tratamento. Na maioria dos casos o ensaio de trao utilizado nessa avaliao, comparando os resultados do tecido tratado com o no tratado. Devido ao desconhecimento do efeito da descelularizao utilizando o mtodo PUC I, desenvolvido na Pontifcia Universidade Catlica do Paran, no Ncleo de Enxertos Cardiovasculares (NEC PUCPR), sobre o pericrdio bovino, foi proposto o trabalho aqui apresentado. O objetivo ser analisar a resistncia trao do pericrdio bovino descelularizado para a sua utilizao em prteses valvares cardacas e comparar os resultados entre o pericrdio descelularizado e o no descelularizado. Neste trabalho parcial sero apresentados: reviso bibliogrfica, os mtodos a serem utilizados e os resultados parciais at ento obtidos.

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2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 FUNCIONAMENTO DO CORAO

O corao realiza basicamente dois tipos de movimento, a sstole e a distole. Cada um desses movimentos divido em duas fases denominadas: isomtrica e isotnica. Durante a sstole ocorre a contrao da musculatura ventricular. Na fase isomtrica, figura 1, os ventrculos esto cheios de sangue provindo dos trios e as valvas do tronco pulmonar e da aorta esto fechadas. Devido contrao o sangue recebe um aumento de presso, tendendo retornar ao trio, porm devido ao seu mecanismo de funcionamento as vlvulas atrioventriculares se fecham fazendo com que a presso aumente ainda mais.

Figura 1 - Representao da sstole isomtrica. Fonte: Vigu, 2010.

Na fase isotnica, figura 2, devido ao aumento contnuo da presso, as vlvulas do tronco pulmonar e da aorta se abrem, permitindo a passagem do sangue do ventrculo esquerdo para a aorta e do ventrculo direito para o tronco pulmonar.

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Figura 2 - Representao da sstole isotnica. Fonte: Vigu, 2010.

No prximo movimento, a distole, ocorre a relaxao dos ventrculos. Na fase isomtrica, figura 3, depois do esvaziamento do sangue nos ventrculos, a presso em seu interior diminui, tendendo a um retorno do sangue aos ventrculos. Para que isto no ocorra as vlvulas do tronco pulmonar e da aorta se fecham e os ventrculos aumentam sua cavidade devido relaxao. Neste momento os trios j esto cheios de sangue, porm as vlvulas atrioventriculares se mantm fechadas.

Figura 3 - Representao da distole isomtrica. Fonte: Vigu, 2010.

Na fase isotnica, figura 4, a presso no interior dos ventrculos se torna inferior presso dos trios, fazendo com que as vlvulas atrioventriculares se abram e permitam a passagem do sangue aos ventrculos.

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Figura 4 - Representao da distole isotnica. Fonte: Vigu, 2010.

2.2 DOENAS DO CORAO

Como qualquer outro rgo ou sistema do corpo humano, o corao est sujeito falhas ou leses que podem ser de originadas por problemas genticos, como resultado dos esforos suportados, ou ainda de outras doenas. No caso das vlvulas cardacas (ORFICE 2006) as falhas podem ocorrer por problemas de vrias naturezas como a malformao congnita, doenas reumticas, sfilis, processos infecciosos, artrite e processos de calcificao. Na figura 5 esto distribudas em percentagem as doenas na vlvula mitral.

Figura 5 - Causas de doenas da vlvula mitral. Fonte: Braunwald, 1998.

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2.3 VLVULAS CARDACAS ARTIFICIAIS

Devido s deficincias apresentadas pelas vlvulas cardacas, muitas vezes faze-se necessria a troca dessas vlvulas, que podem ser de origem mecnica ou biolgica.

2.3.1 Vlvulas mecnicas

O primeiro implante de uma prtese valvular mecnica data de 1952 (ORFICE 2006). A vlvula consistia em uma bola dentro de uma gaiola, conhecida tambm como vlvula de Starr Edwards. Um exemplo dessa vlvula mostrado na figura 6.

Figura 6 - Vlvula mecnica de bola. Fonte: Braunwald, 1998.

A gaiola formada por um orifcio circular e trs (artica) ou quatro (mitral) hastes finas reunidas no pice. A bola moldada em silicone e impregnada com sulfato de brio para ter radiopacidade. O anel de fixao tem uma cobertura acolchoada espessa para melhorar a coaptao nos leitos tissulares irregulares (BRAUNWALD 1998). Vlvulas de disco basculante foram introduzidas nos anos 70, que comparativamente s vlvulas de bola, apresentaram uma melhor hemodinmica. Esse tipo de vlvula foi projetada para a oscilao de um disco pivotado em uma carcaa que permite sua movimentao da posio fechada posio aberta, com movimento de rotao de um disco (ORFICE 2006). Na figura 7 so apresentados

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exemplos desse tipo de vlvula.

Figura 7 - (A) e (B), exemplos de vlvula de disco. Fonte: Braunwald, 1998.

Esse tipo de movimento possibilita que o fluxo de sangue passe pelo centro da vlvula, reduzindo o espao necessrio para a sua implantao, como tambm reduz as turbulncias geradas durante a passagem do sangue. O ngulo de abertura pode variar entre 60 e 85 . No fim da dcada de 70 surgiram as vlvulas de duplo folheto, a St. Jude foi a primeira bem sucedida e j foram usados mais de meio milho de vezes desde seu primeiro implante em 1977 (BRAUNWALD 1998). A grande inovao nesse tipo de vlvula foi a utilizao do carbono piroltico, que possui boas propriedade mecnicas e biocompatibilidade considervel. Esse tipo de vlvula consiste basicamente em dois folhetos semicirculares pivotados. Durante a passagem do sangue eles se separam dando origem a trs reas de fluxo. Um esquema e exemplo desse tipo de vlvula so mostrados na figura 8.

Figura 8 - Vlvula de duplo folheto. Fonte: Braunwald, 1998.

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Com esta configurao de abertura possvel alcanar um real fluxo central, com pouca turbulncia e baixo gradiente de presso. O ngulo de abertura de 85 , pois o que apresenta um melhor comportamento com relao gerao de gradientes de presso e permite uma vazo igualitria em cada uma das reas formada durante o fluxo. Quando se mantm a diferena de presso baixa, diminuse a perda de energia do sangue ao passar pela vlvula e conseqentemente o grau de estenose do implante e do trauma s clulas sanguneas.

2.3.2 Vlvulas biolgicas

O inicio do uso biovalvular se deu em 1955, onde Murray utilizava valvas naturais de cadveres (ORFICE 2006). Tambm foram utilizadas vlvulas de fscia lata e dura-mter, porm devido a problemas de calcificao e da degenerao em um curto espao de tempo, as de fscia lata foram rapidamente desempregadas. As de dura-mter foram muito utilizadas tendo como um primeiro tipo de tratamento a utilizao de formaldedo e glicerol como estabilizadores. Um mtodo de tratamento desenvolvido por Carpentier e colaboradores, deu incio ao uso do glutaraldedo, melhorando tanto a biocompatibilidade quanto as propriedades mecnicas das bioprteses. Esse mtodo desenvolvido no final dos anos 60 utilizado at hoje. Devido a problemas de obteno e de conservao do tecido para a confeco das vlvulas de dura-mter, elas foram extintas, dando incio utilizao de prteses produzidas a partir de outros animais. Em 1970 o laboratrio Hancock introduziu a primeira vlvula comercial heterloga de porcina, utilizando o glutaraldedo no mtodo de tratamento. A figura 9 mostra dois exemplos de valvas porcinas de Hancock.

Figura 9 - (A) e (B), tipos de vlvula porcina tipo Hancock. Fonte: Braunwald, 1998.

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Esse tipo de vlvula possui uma estrutura formada por um cilindro flexvel de prolipopileno com um anel radiopaco de Stellite 21 adicionado para dar rigidez. Dracon utilizado no recobrimento da estrutura e do anel de sutura de silicone. A vlvula de orifcio modificado (MO) de Hancock (B) foi projetada para corrigir restries de fluxo. Logo aps vlvula de Hancock, foi introduzida a vlvula porcina de Carpentier-Edwards, figura 10. A estrutura produzida Elgilcoy, um metal flexvel, com o objetivo de diminuir as tenses nos folhetos e orifcio.

Figura 10 - Vlvula porcina tipo Carpentier-Edwards. Fonte: Braunwald, 1998.

A partir de 1974 o pericrdio bovino foi introduzido na confeco de bioprteses, figura 11, sendo hoje, o pericrdio tratado com glutaraldedo, o material mais utilizado na produo de vlvulas cardacas (BAUCIA 2005).

Figura 11 - Vlvula fabricada com tecido de pericrdio bovino. Fonte: Cardioprtese, 2011.

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2.4 PERICRDIO BOVINO

Pericrdio uma membrana fibroelstica que envolve o corao, formado de vasos sanguneos e linfticos, alm de outras trs camadas. A preferncia dada ao pericrdio bovino em funo da sua estrutura, tendo como principal componente o colgeno presente em duas camadas do pericrdio (ORFICE 2006). O colgeno uma protena fibrosa responsvel pela integridade estrutural do tecido e dar resistncia mecnica. Devido aos seus componentes permite-se reagir, possibilitando alteraes qumicas (ORFICE 2006). So conhecidos 29 tipos de colgenos (PEDROZO 2009), sendo o tipo I que predomina no pericrdio bovino, ele est presente tambm em tendes, vlvulas cardacas, entre outros tecidos. O colgeno formado por trs cadeias, sendo duas idnticas alfa1 e outra denominada alfa 2. Entrelaadas elas formam uma trplice hlice, figura 12.

Figura 12 - Cadeia de colgeno e o entrelaamento delas para formao da tripla hlice. Fonte: Orfice, 2006.

2.5 TRATAMENTOS QUMICOS

Devido sua rpida degenerao o colgeno necessita ser estabilizado para prolongar a estrutura e a integridade mecnica, alm de remover ou neutralizar as suas propriedades antignicas. Aps vrios testes o glutaraldedo mostrou-se como o agente qumico mais eficaz em impedir a degenerao estrutural, sendo hoje o mais utilizado (BAUCIA 2005). O glutaraldedo reage na matriz de colgeno formando ligaes qumicas do tipo base de Shiff (-CH=N) unindo duas cadeias por ligao cruzada ou reticulao, aumentando a estabilidade mecnica, trmica e qumica do pericrdio bovino

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(ORFICE 2006), figura13.

Figura 13 - Esquema mostrando como o glutaraldedo reage na matriz colagnica para formar uma ligao do tipo base de Schiff. Fonte: Orfice, 2006.

A tcnica de fixao do glutaraldedo pode variar entre diferentes autores em concentrao, 0,1 a 2,5% com aumento gradual ou no, em tempo, de 12 minutos a 8 semanas e em temperatura, de 2 a 37 (BAUCIA 200 5). C Apesar do tratamento com glutaraldedo ser o mais utilizado a ele atribudo a maior responsabilidade pelas falhas observadas nas vlvulas biolgicas, sendo a calcificao a principal delas. A calcificao um processo de formao de depsito mineral de fosfato de clcio insolvel na forma de hidroxiapatita Ca10(PO4)3(OH)2, e mais observada entre jovens devido ao metabolismo de crescimento sseo (ORFICE 2006). No intuito de diminuir ou retardar o efeito da calcificao vrios tratamentos tem sido desenvolvidos, podendo ser separados em dois grupos. No primeiro grupo tm-se os tratamentos sem objetivo reticulante, como os que utilizam ons metlicos e detergentes. No segundo grupo tm-se os tratamentos que no prprio processo fazem a reticulao, na maioria das vezes com o prprio glutaraldedo. Alm da calcificao, outro problema a inflamao que a partir de evidncias tem como possvel causador clulas ainda presentes no colgeno. Foi introduzido ento o tratamento de descelularizao com o objetivo de tornar os tecidos protticos mais biocompatveis (COSTA 2005).

2.6 TESTES MECNICOS DO TECIDO

Para ser validado como material adequado ao implante, o tecido de pericrdio bovino deve responder a alguns pr-requisitos como, estabilidade trmica

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(temperatura de encolhimento) (Ts) > 83 espessur a entre 0,25 e 0,30 mm, C, alongamento maior que 17%, ndice de tenacidade > 11,5 e resistncia a trao > 1,8 kgf/mm (ORFICE 2006). Apesar da melhoria dos tecidos com relao biocompatibilidade, a partir dos tratamentos qumicos, tm-se a preocupao de como o reagente influir nas propriedades mecnicas do prprio tecido. Por isso so realizados testes estticos e dinmicos com o objetivo de validar ou no os tratamentos desenvolvidos. Estudos tm mostrado que tratamentos com agentes anticalcificantes fixado com glutaraldedo alm de dar boa resposta quanto calcificao, proporcionam ao tecido um comportamento mecnico adequado, mesmo em explantes aps 4 meses em ratos (BAUCIA 2005). O pericrdio um material anisotrpico, devido sua estrutura em forma de longas fibras, mudando assim as propriedades conforme a direo em que feito o ensaio de trao. Segundo (SNCHEZ-ARVALO 2010) o tecido apresenta uma tenso mxima maior no sentido longitudinal das fibras e uma deformao maior no sentido diagonal. Devido dificuldade em se observar a direo das fibras a olho nu um bom mtodo para a visualizao a utilizao do Azul de Metileno, utilizado no mesmo trabalho citado anteriormente.

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3 METODOLOGIA

Uma simplificao metodologia est apresentada atravs de um fluxograma na figura 14.

Figura 14 - Fluxograma da metodologia adotada. Fonte: Autoria prpria, 2011.

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A seguir apresentada de forma detalhada a metodologia:

a) Coleta. Em um abatedouro sero coletados os tecidos de pericrdio bovino, pela equipe da Cardioprtese, onde recebero uma primeira lavagem com soro fisiolgico (0,9% NaCl) a 4 e posteriorment e armazenados em prprio C soro;

b) Seleo. No prprio abatedouro, o material ser analisado com relao a sua espessura que deve variar entre 0,45 - 0,65 mm, e tambm ao seu aspecto como rasgos e imperfeies. Os que apresentarem melhores condies de uso sero separados para os experimentos;

c) Tratamento qumico. Sero feitos trs tratamentos, o primeiro tratamento ser o de descelularizao utilizando o mtodo (PUC I) com dodecilsulfato de sdio 0,1%, que ser feito em apenas uma parte do tecido. O segundo ser o tratamento de pr-fixao e fixao com glutaraldedo. No terceiro, ser feito o tratamento anticalcificante com acetal* glutmico. O segundo e terceiro tratamentos sero feitos em todo o tecido.

A descelularizao ser feita no Ncleo de Enxertos Cardiovasculares (NECPUCPR), a pr-fixao e a fixao sero realizadas na Cardioprtese.

d) Identificao das fibras. Os dois grupos sero colocados em soluo de lcool ou soro, isto depende do resultado preliminar de teste, contendo Azul de Metileno obtido na Usina Piloto da PUCPR.

O tratamento ser realizado no Laboratrio de Cincia em Engenharia de Materiais LaCEM PUCPR. Ser utilizada uma balana de preciso com quatro dgitos LabStore para o clculo da porcentagem utilizada na soluo de Azul de Metileno. A soluo em um bquer ser posta em um agitador para causar homogeneidade.

e) Corte das amostras. Aps esta etapa as amostras sero cortadas a laser na empresa Dynamiclaser, no sentido longitudinal das fibras. A geometria do

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corpo de prova (Figura 15) ser com base no trabalho de (SNCHEZARVALO 2010).

Figura 15 - Geometria do corpo de prova, medidas em mm. Fonte: Snchez-Arvalo, 2010.

f) Ensaio de trao. As amostras dos dois grupos sero submetidas ao ensaio de trao na mquina EMIC localizada no LaCEM PUCPR. Os grficos de tenso versus deformao sero obtidos atravs do software instalado em um computador conectado mquina de ensaios;

g) Microscopia eletrnica. Para avaliao da integridade do material ser feita observao das amostras atravs de microscopia eletrnica de varredura;

h) Avaliao dos resultados. Aps os testes sero analisados e discutidos os resultados, atravs dos grficos e micrografias.

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4 RESULTADOS PRELIMINARES

Devido no ser conhecida a quantidade necessria do reagente na soluo foram realizados trs testes variando a sua porcentagem e o tipo de soluo. No primeiro teste foram usadas duas solues, uma com soro fisiolgico utilizado na prpria conservao do tecido, e outra com lcool etlico (70%). Foram utilizados o equivalente a 50 ml de solvente para 0,125 g de Azul de Metileno, agitao de 1 minuto. O tecido foi deixado de molho por 24 horas em abas as solues. A amostra com lcool etlico no mostrou tingimento suficiente alm de ficar com as pontas enrugadas. A amostra em soro mostrou um bom tingimento, no entanto formaram-se cristais que ficaram no tecido sendo difcil a sua remoo. No fundo do bquer havia tambm cristais precipitados, figura 16.

A

B

Figura 16 - (A) amostra com cristais aderidos superfcie. (B) aspecto dos cristais em microscopia tica, aumento em 200x. Fonte: Autoria prpria, 2011.

No segundo teste retirou-se um pouco da soluo utilizada com soro fisiolgico colocando em um bquer somente com soro, para diluir a soluo, uma nova amostra foi colocada. A amostra antiga foi colocada apenas em soro na tentativa da remoo dos cristais. Aps 24 horas verificou-se que a nova soluo no mostrou aparecimento dos cristais e a antiga amostra continuou impregnada com os cristais. Conclui-se assim que seria necessrio diminuir a quantidade de Azul de Metileno. No terceiro teste a quantidade de reagente foi reduzida em 0,05 g para cada

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50 ml, 0,1% em peso considerando a densidade do soro como 1 g/ml. A soluo foi agitada durante 1 minuto, colocando-se uma nova amostra. Aps 24 horas constatou-se que o tecido havia sido corado o suficiente para visualizao do sentido das fibras, figura 17.

A

B

Figura 17 - (A) e (B), aspecto do tecido tingido, os crculos em branco evidenciam as regies onde possvel a visualizao do sentido das fibras. Fonte: Autoria prpria, 2011.

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REFERNCIAS

BAUCIA JA. Tratamentos anticalcificantes do pericrdio bovino fixado com glutaraldedo: comparao e avaliao de possveis efeitos sinrgicos. Brazilian Journal Cardiovascular Surgery. 2006; 21(2): 180-7.

BAUCIA, JA. Tratamentos anticalcificantes do pericrdio bovino fixado com glutaraldedo empregado na confeco de vlvulas cardacas. [Tese]. So Paulo: Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares; 2005. 78p. Bussyguin G. Ensaios Mecnicos Preliminares em Pericrdio Bovino. Universidade Federal do Paran, 1988.

BRAUNWALD E, editor. Atlas de doenas cardiovasculares. Porto Alegre: Artmed; 1998.

COSTA, JNL. Comparao entre o pericrdio bovino descelularizado e o pericrdio bovino convencional utilizado na confeco de bioprteses valvares cardacas. [Tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo; 2005. 133p.

ORFICE RL, PEREIRA MM, MANSUR HS. Biomateriais, fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Cultura Mdica; 2006. 538p.

Snchez-Arvalo FM, Farfn M, Covarrubias D, Zenit R, Pulos G. The micromechanical behavior of lyophilized glutaradehyde-treated bovine pericardium under uniaxial tension. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials 2010; 3: 640-6. (Ingls)

VIGU J, ORTE EM. Atlas do corpo humano. So Paulo: Barsa Planeta; 2010. 384p.