Citometria de fluxo
-
Upload
labimuno-ufba -
Category
Technology
-
view
17.276 -
download
5
description
Transcript of Citometria de fluxo
![Page 1: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/1.jpg)
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
CITOMETRIA DE FLUXO
Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e
Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
![Page 2: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/2.jpg)
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 3: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/3.jpg)
o DEFINIÇÃO:
• É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas
microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a
análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida
também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um
aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de
características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O
citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da
emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated
Cell Sorter).
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 4: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/4.jpg)
• Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha
devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e
reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as
propriedades de dispersão de luz pelas as células e a
emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 5: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/5.jpg)
• VANTAGENS
• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
• Grande número de células analisadas com rapidez;
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 6: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/6.jpg)
o APLICAÇÕES
• Fenotipagem dos leucócitos
• Fenotipagem de células tumorais
- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos
linfomas
• Análise de DNA
• Análise da função dos neutrófilos
• Contagem de reticulócitos
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 7: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/7.jpg)
o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA
• Quantificação de subpopulações linfocitárias
• Quantificação das células CD34+ como indicação da
capacidade de reconstituição hematopoiética após o
transplante de células-tronco
• Avaliação de eritrócitos
• Avaliação de plaquetas
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
![Page 8: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/8.jpg)
METODOLOGIA
![Page 9: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/9.jpg)
• As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e
interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER).
• Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa
através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou
FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou
mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através
do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes
encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor
frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e
fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações
de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente)
é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e
química de cada partícula.
METODOLOGIA
![Page 10: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/10.jpg)
Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de luz frontal
Tamanho celularFSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm
METODOLOGIA
![Page 11: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/11.jpg)
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA
METODOLOGIA
![Page 12: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/12.jpg)
3)Dispersão lateral de luz
1)Suspensão de células
Laser3)Dispersão de luz para a frente
4)Filtro
6) Análise de dados
5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula
METODOLOGIA
![Page 13: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/13.jpg)
Linfócito TCD4
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescenteLaser
Contagem das células
METODOLOGIA
![Page 14: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/14.jpg)
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmenteOs círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
METODOLOGIA
![Page 15: Citometria de fluxo](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022061219/54b9e2ee4a7959db198b4598/html5/thumbnails/15.jpg)
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3-
Neste quadrante estão as células CD4- e CD3-
(células que não linfócitos)
Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+
(outros linfócitos que não Th)
Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)
METODOLOGIA