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Cláudia Emanuele Carvalho de Sousa

Caracterização do eixo imune-pineal: Mecanismo de

ação do controle da função pineal pela citocina pró-

inflamatória TNF

Characterization of immune-pineal axis: Mechanism of

action of the control of pineal function by pro-inflammatory cytokine

TNF

São Paulo

2011

Cláudia Emanuele Carvalho de Sousa

Caracterização do eixo imune-pineal: Mecanismo de

ação do controle da função pineal pela citocina pró-

inflamatória TNF

Characterization of immune-pineal axis: Mechanism of

action of the control of pineal function by pro-inflammatory cytokine

TNF

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade de São Paulo,

para a obtenção de Título de Mestre em

Ciências na Área de Fisiologia Geral.

Orientadora: Regina Pekelmann Markus

São Paulo

2011

Ficha Catalográfica

Carvalho-Sousa, Cláudia Emanuele

Caracterização do eixo- imune-pineal : mecanismo de ação do controle da função

pineal pela citocina pró-inflamatória TNF.

120 p. : il.

Dissertação (Mestrado) – Instituto de Biociências da

Universidade de São Paulo. Departamento de Fisiologia. 2011.

1. Glândula Pineal. 2. NFKB. 3. TNF. I. Pelkemann, Regina Markus. II. Título. III.

Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Fisiologia.

Comissão Julgadora:

____________________________ ____________________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

____________________________

Prof(a). Dr(a).

Orientadora

Dedicatória

“Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como

o metal que soa ou como o címbalo que retine.

E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e

ainda que tivesse toda fé, de maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse

amor, nada seria (I Coríntios 13: 1; 2)”.

À minha família que representa o amor mais profundo que posso experimentar.

A arte de ser feliz

Houve um tempo em que minha janela se abria sobre uma cidade que parecia ser feita de

giz. Perto da janela havia um pequeno jardim quase seco.

Era uma época de estiagem, de terra esfarelada, e o jardim parecia morto. Mas todas as

manhãs vinha um pobre com um balde, e, em silêncio, ia atirando com a mão umas gotas

de água sobre as plantas. Não era uma rega: era uma espécie de aspersão ritual, para que

o jardim não morresse. E eu olhava para as plantas, para o homem, para as gotas de água

que caíam de seus dedos magros e meu coração ficava completamente feliz.

Às vezes abro a janela e encontro o jasmineiro em flor. Outras vezes encontro nuvens

espessas. Avisto crianças que vão para a escola. Pardais que pulam pelo muro. Gatos que

abrem e fecham os olhos, sonhando com pardais. Borboletas brancas, duas a duas, como

refletidas no espelho do ar. Marimbondos que sempre me parecem personagens de Lope

de Vega. Ás vezes, um galo canta. Às vezes, um avião passa. Tudo está certo, no seu

lugar, cumprindo o seu destino. E eu me sinto completamente feliz.

Mas, quando falo dessas pequenas felicidades certas, que estão diante de cada janela,

uns dizem que essas coisas não existem, outros que só existem diante das minhas

janelas, e outros, finalmente, que é preciso aprender a olhar, para poder vê-las assim.

Cecília Meirelles

Agradecimentos

Meu Deus obrigada por ser comigo quando e onde precisei, por permitir que

conseguisse passar por todas etapas até aqui. Agradeço por todas pessoas que foram

usadas para me fortalecer e fazer crescer.

Aos meus pais, sempre incentivadores! Minha mãe pelo exemplo de vida, de

sabedoria, pelos cuidados, por me dar tantos motivos para seguir adiante. Meu pai pelo

carinho, pela alegria, por todos sacrifícios empregados. Às minhas amadas irmãs, por

trazerem tantas alegrias. Lina, por ser a melhor amiga que pude contar, pelos dias

maravilhosos durante a faculdade, pelos ensinamentos de vida, por sua doçura e amor.

Ticinha, você é luz em nossas vidas, seu apoio foi essencial, nossas conversas à distância

mudaram a cor do meu dia. Eduardo, um irmão que a vida me trouxe, obrigada por

deixar tantas boas novas, por tantos risos, por me lembrar da grandeza de Deus em

todas as coisas. Ao querido Miguel, que nos ensinou tanto, nosso amor foi incondicional

às realidades, um anjo que logo chegou e partiu.

À família Carvalho, pela presença constante em minha vida. Em especial a tia

Melânia, tio Pedro, tio Chico, tia Dulce e ao meu tio Marconi pelo maior presente que

pude receber, saudades eternas. Ao meu afilhado, por ser também exemplo. Aos meus

primos queridos, sempre amáveis e divertidos, pela força. Em especial ao Pedrinho e

Samuel, meus queridos, e ao André, um grande irmão.

Aos irmãos que pude escolher, meus amigos! Tenho tantos nomes na cabeça, mas

sei que alguns não são apenas nomes, fizeram parte de tudo até aqui. A vocês que

fizeram da saudade algo suportável, pela alegria, por vivências memoráveis. À minha

amiga Lívia, uma dádiva de Deus em minha vida, pelas incontáveis demonstrações de

carinho, de companheirismo, sua amizade é imprescindível, obrigada por tanta

paciência, pelos conselhos, pela força. Às minhas amigas de Abaeté, Gabi, Alana,

Marjory, Tati e Thaís, que mesmo a distância mostraram que o essencial é duradouro.

Aos amigos da Igreja Batista, pela oração e por tanto carinho. Aos colegas de faculdade

que tanto aprendi, em especial as minhas grandes e eternas amigas, Fabi, Mayna, Sarah

e Suzana, que marcaram Juiz de Fora em minha vida. Aos amigos da escola Daniel e

Vinícius, pela fidelidade. E as minhas mais recentes amigas, que compartilharam comigo

toda a caminhada na pós-graduação, Maisinha, Naty, Ketrin e Nortista, representam

minha família aqui, nossos momentos ora trágicos e cômicos, as discussões filosóficas,

científicas, angústias, quantas experiências trocadas.

Aos amigos do laboratório, companheiros da vida acadêmica. Obrigada por tanto

aprendizado, pela paciência, pelas colaborações, pelas brincadeiras. Em especial, ao

Sanseray, grande amigo e colaborador, obrigada pelo incentivo desde o curso de inverno,

por todos momentos que pude contar com você. Ao Eduardo, um exemplo pra mim,

obrigada por ser tão disponível, por me auxiliar em todas etapas deste trabalho. Ao

Pedroca, agora Professor Pedro, por tantas contribuições, por me ajudar na caminhada

do laboratório, pelas conversas produtivas, sua orientação foi essencial em todo

processo. À Professora Luciana Pinato, pela constante colaboração, pelas boas

conversas, pelos ensinamentos. À Sandrinha, entrou agora e já participou de tantas

vivências no laboratório, pelo apoio, amizade e colaboração. À professora Zulma

Ferreira, sempre disposta a ajudar, pelas contribuições nos ensaios e como não falar nas

boas risadas. À orientadora Regina P. Markus, pela acolhida, confiança, incentivo, pelas

críticas fundamentais ao longo desses dois anos, por compartilhar suas experiências e

conhecimento, pela presença sempre marcante, por ensinar em todas oportunidades.

Agradeço, por fim, o fundamental apoio financeiro e científico da FAPESP

(08/56080-4), CNPq e CAPES.

Índice

I. Introdução ................................................................................................................................ 13

1. Glândula Pineal .................................................................................................................... 13

1.1. Histórico da glândula pineal ......................................................................................... 13

1.2. Aspectos Morfofuncionais - Anatomia, Histologia, Inervação e Vascularização ......... 15

1.3. Produção de melatonina pela glândula pineal ............................................................. 19

1.4. Da secreção aos mecanismos de ação da melatonina ................................................. 25

2. Fator de Necrose Tumoral (TNF) ......................................................................................... 26

2.1. Caracterização do TNF .................................................................................................. 26

2.2. Sinalização do TNF ........................................................................................................ 28

3. Fator de Transcrição Nuclear Kappa B (NFKB) .................................................................... 32

3.1. Ativação do NFKB ......................................................................................................... 34

4. Eixo-Imune-Pineal ............................................................................................................... 38

4.1. Melatonina e defesa ..................................................................................................... 38

4.2. O tempo na resposta imune: relação entre melatonina e adaptação. ........................ 40

4.3. A construção de um novo conceito: Pineal como alvo para mediadores da resposta

imune .................................................................................................................................. 42

II. Objetivos ................................................................................................................................. 49

III. Material e Métodos ................................................................................................................ 51

1. Animais ................................................................................................................................ 51

2. Drogas e Reagentes ............................................................................................................. 51

3. Preparo de drogas ............................................................................................................... 52

4. Cultura da glândula pineal .................................................................................................. 53

5. Cultura de pinealócitos ....................................................................................................... 53

6. Teste de Viabilidade Celular ................................................................................................ 54

7. Imuno-histoquímica da glândula pineal .............................................................................. 54

7.1. Método de Revelação com DAB ................................................................................... 54

7.2. Imunofluorescência- Free Floating ............................................................................... 56

8. Imunofluorescência de cultura de pinealócitos .................................................................. 57

9. Detecção da produção de NO por microscopia confocal .................................................... 58

10. Extração de proteína nuclear ............................................................................................ 59

11. Ensaio de eletromobilidade por retardo em gel (EMSA) .................................................. 60

12. Ensaio de supershift .......................................................................................................... 61

13. Análise dos resultados ....................................................................................................... 61

IV. Resultados .............................................................................................................................. 63

1- Expressão Do Receptor TNF-R1 Nos Diferentes Tipos Celulares Da Pineal. ....................... 63

2- Variação Da Expressão Do TNF-R1 Ao Longo Do Dia .......................................................... 66

3. Pinealócitos Expressam Constitutivamente o Receptor TNF-R1 ......................................... 67

4. TNF Promove A Translocação Nuclear Do NFKB ................................................................. 69

4.1. Decurso temporal da ativação do NFKB induzida por TNF .......................................... 69

4.2. Subunidades presentes na translocação nuclear do NFKB .......................................... 71

4.3. Efeito do TNF sobre a translocação dos dímeros do NFKB .......................................... 73

5. TNF promove a degradação da proteína inibitória IKBα em pinealócitos dispersos .......... 74

6. TNF aumenta a expressão de iNOS em pinealócitos através de mecanismo dependente de

NFKB ........................................................................................................................................ 76

6.1. TNF induz a expressão da sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) em pinealócitos

isolados ................................................................................................................................ 76

7. TNF Induz A Produção De Óxido Nítrico Em Pinealócitos Isolados ..................................... 78

V. Discussão ................................................................................................................................. 81

VI. Conclusões ............................................................................................................................. 90

VII. Resumo ................................................................................................................................. 91

VIII. Abstract ................................................................................................................................ 92

IX. Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 93

X. Súmula Curricular .................................................................................................................. 111

XI. Anexos .................................................................................................................................. 120

Lista de abreviaturas

5-HT- serotonina

5-HTP- 5-hidroxitriptofano

AAAD- enzima descarboxilase de

aminoácidos aromáticos

AA-NAT- enzima arilalquilamina N-

acetiltransferase

AC- enzima adenilil ciclase

AMPc- monofosfato de adenosina

cíclico

AP-1- proteína ativadora 1

ATP- adenosina trifosfato

BCG- Bacilo Calmette-Guerin

CD14- cluster differentiation 14

COX- ciclooxigenase

CRE- elemento responsivo a AMPc

CREB- proteína de ligação ao elemento

responsivo a AMPc

DAB- 3, 3‟-diaminobenzidina

DAF-FM-DA- 4-amino-5-metilamino-

2´,7´- difluorofluoresceina

DAPI- 4’, 6- diamidino-2-fenilindol

EMSA- ensaio de eletromobilidade por

retardo em gel

FADD - Fas-associated DD protein

GABA- ácido gama-aminobutírico

GCS- gânglio cervical superior

GFAP- glial fibrillary acidic protein,

marcador de astrócitos

GR- receptor de glicocorticóide

HIOMT- enzima hidroxindol-O-

metiltransferase

IFN-γ- interferon gama

IKB- proteína inibitória kappa B

IKK- proteína quinase de IKB

IL- interleucina

iNOS- sintase de óxido nítrico

induzível

IP3- inositol trifosfato

LPS- lipopolissacarídeo

MAPK- mitogen-activated protein kinase

MEL- melatonina

MTT- brometo de 3-(4,5)-

dimetiltialzolil -2,5 difeniltetrazólio

NA- noradrenalina

NAS- N-acetilserotonina

NEMO- modulador essencial de NFKB

NFKB- fator nuclear kappa B

NLS- sequência de localização nuclear

NSQ- núcleos supraquiasmáticos

PACAP- peptídeo ativador de adenilil

ciclase na pituitária

PAMP- padrões moleculares associados

à patógenos

PBS- phosfate buffer saline

PDTC- pirrolidinaditiocarbamato

PKA- proteína quinase dependente de

AMPc

PKC- proteína quinase dependente de

cálcio

PLC- fosfolipase C

pM, nM, μM- picomolar, nanomolar e

micromolar, respectivamente

PVN- núcleos paraventriculares

RHD- domínio de homologia Rel

RIP1- receptor-interacting protein 1

SNC- sistema nervoso central

SP1- specificity protein 1

TACE- enzima conversora de TNF alfa

TAD- domínio de transativação

TGF-β- fator de crescimento

transformador beta

TLR4- receptor do tipo toll 4

TNF- fator de necrose tumoral

TNF-R- receptor de TNF

TPOH- triptofano hidroxilase

TRAF- TNF receptor-associated factor

μm- micrômetro

____________

Introdução

13 I. Introdução 13 I. Introdução

I. INTRODUÇÃO

1. GLÂNDULA PINEAL

11..11.. HHiissttóórriiccoo ddaa ggllâânndduullaa ppiinneeaall

A identificação da pineal como órgão distinto foi feita entre os séculos III e IV

a.C. por Herófilo. Séculos mais tarde Claudio Galeno (130-200), médico e filósofo grego

caracterizou o tecido localizado no cérebro humano como uma glândula e nomeou-a de

conarium. Este termo em latim (cone) lembra a forma de uma pinha e mais tarde o nome

desta glândula passou a ser pineal (Zrenner, 1985). Já no século XVII, René Descartes

(1596–1650), conhecido por numerosas contribuições matemáticas e filosóficas,

escreveu tratados sobre a concepção do homem e suas duas naturezas: o corpo e a alma.

Sua preocupação baseava-se em como essas duas partes interagiam, ou mesmo se

conectavam. Nessa visão, a pineal aparecia como o elo de ligação física entre o corpo e a

alma. Descartes foi o primeiro a especular que a pineal seria a sede da alma e regularia o

fluxo de espíritos nos animais, controlando funções como os movimentos corporais,

memória e imaginação. O órgão também foi chamado de corpo cervical ou epífise

cerebral, este último nome se refere à localização da pineal acima do cérebro em

contraposição à hipófise que está localizada na sela túrcica, abaixo do cérebro. Assim

como para outros órgãos e estruturas anatômicas a cunhagem do nome da glândula

refletiu o estado do conhecimento e do desenvolvimento tecnológico da época.

Os estudos científicos da glândula pineal tiveram poucos progressos até a

segunda metade do século XIX. No final desse século a anatomia, histologia,

embriologia e inervação da glândula foram extensivamente elucidadas por autores como

Ahlborn, Rabl-Ruckhardt, Graaf, Korschelt e Spencer que, em conjunto, mostraram


semelhanças entre a pineal de mamíferos e a epífise de vertebrados inferiores.

Posteriormente, Studnicka (1905) estabeleceu que a glândula pineal era

filogeneticamente derivada de órgãos fotorreceptores, permanecendo, no entanto, sua

função desconhecida (para revisão, Simonneaux & Ribelayga, 2003).

A primeira função fisiológica atribuída à pineal foi sugerida pela análise de um

caso clínico propondo a relação entre um tumor na pineal e o aparecimento da

puberdade precoce. Essa observação foi feita pelo médico Otto Heubner que relacionou

a alteração gonadal com o tumor da pineal. Vários estudos se seguiram na tentativa de

entender a ação dos hormônios da pineal sobre a fisiologia reprodutiva. Muitos desses

trabalhos avaliaram o efeito dos extratos da pineal sobre o trato reprodutor (Simonnet

et al., 1951; Moszkowska, 1951; Kitay & Altschule, 1954). A associação da pineal com o

sistema reprodutor ficou estabelecida desde então e passou a ser estudada por

diferentes pesquisadores.

No final da década de 1950, um grupo de pesquisadores conseguiu isolar e

caracterizar a partir de extratos de pineal bovina a indolamina N-acetil-5-

metoxitriptamina (Lerner et al., 1959), denominada melatonina por sua habilidade de

promover a agregação de melanóforos da pele de anfíbios (Lerner et al., 1958). Na década

de 1960 é estabelecida a relação entre a luz ambiental e a atividade metabólica da

glândula pineal (Wurtman et al., 1963; 1967, Quay, 1967), sendo evidenciado o ritmo

diário de serotonina (Quay, 1963) e da melatonina em pineais de ratos (Quay, 1964).

Destaca-se a partir dessa concepção o entendimento de que o fotoperíodo seria um fator

determinante na adaptação de várias espécies, regulando a fisiologia e o comportamento

reprodutivo. Nesse sentido, observou-se que a pineal é responsável pela resposta

endócrina às adaptações sazonais (Hoffman & Reiter, 1965a,b). A chegada de dias

curtos ou longos significa respostas diferentes dependendo das espécies estudadas.


Em resumo, pode-se perceber que a busca sobre o conhecimento da glândula

pineal é antiga. A caracterização de sua origem e estrutura e, por fim, o entendimento do

controle de sua função por fatores externos representam contribuições notáveis e

universais sobre a pineal no século XX. Outros aspectos de sua fisiologia e outras ações

de seu hormônio melatonina também tiveram destaque e desde então constituem

diversas linhas de pesquisa dos dias atuais.

11..22.. AAssppeeccttooss MMoorrffooffuunncciioonnaaiiss -- AAnnaattoommiiaa,, HHiissttoollooggiiaa,, IInneerrvvaaççããoo ee

VVaassccuullaarriizzaaççããoo

1.2.1. Estrutura e composição celular

Existe uma grande variação morfológica da glândula pineal ao longo da escala

filogenética tanto intra quanto interespecífica. Anatomicamente, é considerada parte

do epitálamo, situada dorsalmente à região caudal do diencéfalo. Na maioria dos

mamíferos a glândula pineal se localiza na porção dorsal do tronco cerebral conectada

por um pedúnculo às comissuras habenular e posterior (Møller, 1992; Vollrath, 1981).

Em humanos, a pineal desenvolve-se a partir de uma evaginação do teto do terceiro

ventrículo (Oksche, 1965) que inicia-se no segundo mês de gestação e sua localização é

mantida na vida adulta. Em roedores, a pineal migra dorso-caudalmente durante a

ontogênese e se localiza centralmente no topo do cérebro entre os hemisférios cerebrais

e o cerebelo (Vollrath, 1981; Heidbüchel & Vollrath, 1983; 1999; Møller & Baeres, 2002).

O parênquima da pineal de mamíferos consiste em cordões de células separadas

por capilares com grande espaço perivascular. Em espécies de maior porte, o

parênquima é dividido em lóbulos separados por septos de tecido conjuntivo frouxo

derivado da pia-máter. O tipo celular mais abundante na pineal de mamíferos é o

pinealócito, mas também são encontradas células da glia (Korf, 2000, Møeller & Baeres,


2002). Em mamíferos, apesar dos pinealócitos serem células tipicamente endócrinas,

ainda expressam proteínas características de células fotorreceptoras, tais como opsinas

(Korf et al. 1985; Huang et al., 1992), recoverina (Korf et al., 1992), e antígeno S (Korf et al.,

1985, 1990). Em vertebrados não mamíferos, os pinealócitos além de produzirem o

hormônio do escuro, melatonina, também são células fotorreceptoras (Ekstro & Meissl,

2002).

A presença da glia na pineal já foi considerada questionável e o termo célula

intersticial foi utilizado para sua denominação (Wolfe, 1965). Além disso, as células

intersticiais foram tidas como pinealócitos tipo II (Calvo & Boya, 1983). O

desenvolvimento de marcadores químicos específicos para células gliais e os estudos

ultra-estruturais confirmaram a presença peculiar de células gliais típicas no

parênquima da pineal (Luo et al., 1984). Células da região proximal do parênquima da

glândula apresentam imunoreatividade positiva para proteína fibrilar associada à

astrócitos (GFAP) (Møller et al., 1978; López- Muñoz et al., 1992; Suzuki & Kachi, 1995).

Para identificação da microglia na pineal foram utilizados os mesmos marcadores de

macrófagos: ED-1, OX-42 e OX-6 que, em conjunto, revelam a imunoreatividade positiva

em todo parênquima (Tsai & McNulty, 1997; Jiang-Shieh et al., 2003, 2005). Dessa

forma, a glia apresenta localização diferencial, os astrócitos estão localizados próximos

ao pedúnculo pineal, na porção proximal da glândula e a microglia está distribuída de

forma difusa por todo o parênquima da glândula entre os pinealócitos.

1.2.2. Vascularização

A pineal se destaca por sua intensa vascularização, já apontada nos estudos

anatômicos de Andreas Versalius (1515–1564) (para revisão, Stanley, 1994). Ela recebe

suprimento sanguíneo por pequenas ramificações arteriolares provenientes das artérias


coroidais. Por sua vez, cada uma das artérias origina-se da artéria cerebral posterior

(Reiter, 1981). Em ratos, a glândula também se destaca por ter um alto fluxo sanguíneo;

o maior comparado às outras glândulas do organismo (Goldman & Wurtman, 1964).

A pineal é reconhecida como um órgão circumventricular (Johnson & Gross,

1993; Duvernoy & Risold, 2007). Esses órgãos apresentam características morfológicas

que os distinguem do resto do sistema nervoso (Hofer, 1958). São estruturas localizadas

na linha média do cérebro circundando o terceiro e quarto ventrículo e que apresentam

a barreira endotelial mais frouxa devido a ausência de junções oclusivas e a presença de

capilares fenestrados (Johnson & Gross, 1993). Essas características permitem a

comunicação direta entre o sangue e líquor sendo funcionalmente semelhantes a

portões através da barreira hematoencefálica, o que levou a comparação dessas

estruturas a “janelas do cérebro” (Gross, 1987).

1.2.3. Inervação

O padrão de inervação da pineal está diretamente relacionado às diferenças

anatômicas da pineal entre as espécies devido, principalmente, à posição da pineal em

relação ao cérebro. A glândula pineal recebe uma inervação complexa com fibras

nervosas de diferentes origens. A principal fonte consiste em fibras pós-ganglionares

simpáticas provenientes do gânglio cervical superior que chegam até a pineal através do

nervo conário (Bargmann, 1943; Kappers, 1960). Está é a inervação mais compreendida e

estudada em humanos e em outros mamíferos. A atividade destas fibras pós-

ganglionares é regulada pelos núcleos supraquiasmáticos do hipotálamo (NSQ) que,

por sua vez, recebem informações diretamente de células ganglionares retinianas via

trato retino-hipotalâmico (Kappers, 1960). As terminações nervosas simpáticas contêm,

além do neurotransmissor noradrenalina, os neuromoduladores neuropeptídeo Y (NPY)


(Schon et al., 1985; Zhang et al., 1991; Mikkelsen & Møller, 1999) e ATP (adenosina tri-

fosfato) (Mortani-Barbosa et al., 2000). A noradrenalina tem grande importância

funcional pois é o estímulo indutor da síntese de melatonina (Klein & Weller., 1970)

enquanto o ATP e o NPY atuam como co-transmissores e regulam a estimulação

adrenérgica. O ATP é co-liberado com a noradrenalina pelos terminais simpáticos e

interage com receptores do subtipo P2Y1 (Ferreira et al., 2001) potencializando a síntese

de melatonina induzida por noradrenalina (Ferreira et al., 2003). Já o NPY modula a

transmissão noradrenérgica por mecanismos pré e pós-sinápticos. A estimulação com

NPY de receptores pós-sinápticos inibe a liberação de noradrenalina (Vacas et al., 1987;

Simonneaux et al., 1994) e a formação de AMPc (Olcese, 1991; Harada et al., 1992;

Simonneaux et al., 1994). Por outro lado, embora haja redução de AMPc, o NPY mostrou

exercer efeito positivo sobre a síntese de melatonina em glândula pineal de rato (Vacas

et al., 1987, Simonneaux et al., 1994).

As técnicas neuroanatômicas mais modernas como o traçamento neuronal, a

imuno-histoquímica e a hibridização in situ tiveram grande destaque no entendimento

da inervação não simpática. Os primeiros estudos ultra-estruturais da pineal já

sugeriam a presença de fibras extra-simpáticas pela presença de botões sinápticos

contendo vesículas granulares do tipo peptidérgica e colinérgica. Outra importante

evidência anatômica foi obtida pela demonstração de que após a remoção do gânglio

cervical superior diversas fibras peptidérgicas permaneciam na pineal (Møller et al.

1996). Da mesma forma, o uso da técnica de traçamento viral confirmou a existência de

conexões neurais entre algumas áreas cerebrais e a pineal em diversas espécies de

roedores (Møller, 1999; Møller & Baeres, 2002).

As fibras centrais derivam de diferentes regiões encefálicas, especialmente do

núcleo paraventricular hipotalâmico (PVN) (Korf & Wagner 1980; Møller et al., 1990,


Larsen et al., 1991), folheto intergeniculado talâmico (IGL) (Mikkelsen & Møller, 1990;

Cipolla et al., 1994) e núcleo dorsal da rafe (Leander et al. 1998; Møller & Hay-Schmidt,

1998). Estas projeções terminam, em sua maior parte, na porção proximal da glândula

através das comissuras habenular e posterior (Kappers, 1960, Møller, 1978) e do

pedúnculo pineal. Também estão presentes inervações de outras áreas cerebrais e

periféricas que contribuem para liberação de uma variedade de neuropeptídeos, a citar:

substância P, PACAP (do inglês, pituitary adenylate cyclase-activating peptide), CGRP (do

inglês, calcitonin gene-related peptide), peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e ácido gama-

aminobutírico (GABA). Em resumo, a inervação autonômica simpática e

parassimpática, bem como inervação direta proveniente do sistema nervoso central,

projetam-se sobre a pineal. Destas, o efeito funcional da inervação simpática é a mais

conhecida e estudada.

11..33.. PPrroodduuççããoo ddee mmeellaattoonniinnaa ppeellaa ggllâânndduullaa ppiinneeaall

1.3.1. Controle neural

As mudanças diárias nas condições de iluminação ambiental geram impactos em

vários aspectos da vida. Como resposta adaptativa vários processos fisiológicos e

comportamentais são rítmicos. Alguns são meramente reativos a essas condições

externas e outros são antecipatórios, controlados pelo relógio biológico interno. Em

mamíferos, o relógio biológico central é localizado nos núcleos supraquiasmáticos

(NSQ) do hipotálamo anterior. Estes núcleos geram um ritmo endógeno circadiano com

período muito próximo a 24 horas (para revisão, Reppert & Weaver, 2002). Os núcleos

supraquiasmáticos têm papel essencial na variação diária da produção de melatonina,


gerando o ritmo e propagando a resposta à luz detectada pela retina (para revisão

Moore, 1997; Kennaway & Wright, 2002).

A informação luminosa é percebida por meio do fotorreceptor melanopsina

presente nas células ganglionares retinianas, transformada em um sinal elétrico e

transmitida pelo trato retino-hipotalâmico aos NSQ (Provencio et al., 2000). Estes,

através de uma via polissináptica, projetam-se para o núcleo paraventricular do

hipotálamo (PVN) promovendo a liberação de GABA (Kalsbeek et al., 1999, 2000).

Portanto, os NSQ controlam o ritmo da produção de melatonina por imposição de um

sinal inibitório GABAérgico sobre o PVN durante a fase de claro, inibindo assim, a

produção de melatonina pela pineal neste ponto da via (Teclemariam-Mesbah et al.,

1999). Na fase escura do dia, o PVN é ativado a partir dos NSQ por uma via

glutamatérgica que promove a ativação de uma via polineural que chega à coluna

intermediolateral da medula espinal. Fibras pré-ganglionares simpáticas projetam-se ao

gânglio cervical superior que, por sua vez, emite neurônios pós-ganglionares simpáticos

que inervam diretamente a pineal e liberam noradrenalina (Wurtman et al., 1967) e ATP

(Mortani-Barbosa, 2000) induzindo a síntese de melatonina (revisto por Simonneaux e

Ribelayga, 2003; Perreau-Lenz et al., 2003).

1.3.2. Via biossintética da melatonina

Como mencionado anteriormente, na ausência de iluminação ambiental as fibras

simpáticas que inervam a pineal liberam os co-transmissores noradrenalina e ATP

(Mortani-Barbosa et al., 2000). A noradrenalina liberada pelos terminais simpáticos

interage com receptores pós-sinápticos dos tipos α1 e β1-adrenérgicos presentes na

membrana dos pinealócitos e o ATP promove a ativação de receptores P2Y1( Ferreira et

al., 1994, 2001). A ativação dos adrenoceptores β é essencial para a indução da síntese de


melatonina enquanto que a estimulação de adrenoceptores alfa, ou de receptores

purinérgicos P2Y1 potencia a resposta desencadeada por ativação dos adrenoceptores β

(Mortani-Barbosa, 2000; Klein et al., 1983).

A ativação dos receptores β1 induz a ativação da proteína G estimulatória (Gs)

que, por sua vez, ativa a enzima adenilil ciclase (AC) promovendo a formação do

segundo mensageiro monofosfato de adenosina cíclico (AMPc). O aumento de AMPc

ativa a proteína quinase dependente de AMPc (PKA) induzindo a transcrição do gene

(roedores) e/ou potenciando a atividade (roedores, ungulados e primatas) da enzima

arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT). Este é um dos passos chave para a

síntese de melatonina pois resulta no padrão de atividade rítmica desta enzima

controlado pelo ciclo claro-escuro (Klein & Weller, 1970).

Os receptores alfa adrenérgicos são acoplados à proteína Gq que, ao se ligarem a

noradrenalina, ativam a enzima fosfolipase C (PLC) promovendo aumento do cálcio

intracelular (Ca+2) via inositol trifosfato (IP3) e, consequentemente, a ativação da

proteína quinase dependente de cálcio (PKC) (Sugden et al., 1985; Vanecek et al., 1985). A

co-transmissão purinérgica também atua por mecanismo semelhante ao induzir a

ativação da enzima PLC e consequente elevação dos níveis de cálcio (Ferreira et al., 2001,

2003). Dessa forma, a estimulação dos receptores α1 e P2Y1 convergem com a resposta

β-adrenérgica por promoverem a regulação positiva da PKC sobre a adenilil ciclase e

portanto potencializando a via de sinalização necessária para transcrição da AA-NAT.

As cascatas de sinalização estão representadas em forma esquemática na figura 1.

A síntese de melatonina é iniciada pela captação do aminoácido triptofano da

corrente sanguínea. Esse precursor é hidroxilado a 5-hidroxitriptofano pela enzima

triptofano hidroxilase e é, em seguida, descarboxilado formando serotonina (5-

hidroxitriptamina, 5-HT). A serotonina é acetilada pela enzima AA-NAT à N-


acetilserotonina que é, por fim, convertida em melatonina (N-acetil-5-

metoxitriptamina) pela enzima hidroxindol-O-metiltransferase (HIOMT) (Axerold &

Weissbach, 1960).

1.3.3. Regulação transcricional e pós-transcricional da enzima AA-NAT

Existem diferenças pontuais na regulação da via biossintética de melatonina

entre as espécies de vertebrados. Em comum, a parte final da via neural consiste na

liberação circadiana de noradrenalina sobre a glândula exclusivamente à noite. A síntese

de melatonina é melhor estudada em roedores onde sua regulação ocorre no nível

transcricional. Nessas espécies, a resposta beta-adrenérgica na glândula promove a

ativação da via de transcrição AMP cíclico- proteína quinase A (PKA). A PKA fosforila

o fator de transcrição CREB (do inglês, cyclic-AMP regulating element binding) e a enzima

AA-NAT. CREB fosforilado se liga ao elemento CRE (do inglês, cAMP-responsive element)

do DNA no promotor do gene da AA-NAT promovendo a transcrição gênica. A

fosforilação da AA-NAT induz a sua interação com a chaperona 14-3-3 (Ganguly et al.,

2001, 2002) que impede sua degradação pelo proteassoma (Gastel et al., 1998; Ganguly et

al., 2001). Tanto o gene quanto a proteína da AA-NAT apresentam um ritmo circadiano

com níveis de transcrição 100-150 vezes maior durante a noite (Borjigin et al., 1995;

Roseboom et al., 1996; Garidou et al., 2001).

Em ungulados e primatas os níveis do RNAm do gene da AA-NAT não

apresentam diferenças significativas entre o dia e noite (Coon et al., 1995; Schomerus et

al., 2000; Johnston et al., 2004) indicando a expressão constitutiva deste gene e

sugerindo que a regulação da atividade da AA-NAT seja pós-transcricional. Durante o

dia, a proteína, assim que traduzida, é rapidamente degradada por atividade

proteassomal (Korf et al., 1998; Stehle et al., 2001). Na fase de escuro a ativação da via


AMPc/PKA (para revisão Ganguly et al., 2002), a fosforilação da AA-NAT e a

consequente ligação com a chaperona 14-3-3 impedem sua degradação. Como já descrito

anteriormente, a produção circadiana de melatonina é gerada pelo ritmo de

atividade/transcrição da enzima AA-NAT. Já a enzima HIOMT não apresenta ritmo

diário evidente sendo sua atividade regulada a longo termo (Axelrod et al., 1965; Sugden

& Klein, 1983,a.b; Ribelayga et al., 1997) e participando da resposta sazonal da síntese de

melatonina (Ribelayga et al., 1999, 2000).


FIGURA 1. VViiaass ddee ssiinnaalliizzaaççããoo ddaa bbiioossssíínntteessee ddee mmeellaattoonniinnaa nnaa ppiinneeaall ddee rraattooss.. No escuro as

fibras pós-ganglionares simpáticas liberam noradrenalina (NA) ativando os receptores β e α-

adrenérgicos. A ativação dos receptores β1 promove a ativação da adenilil ciclase (AC) que

resulta no aumento dos níveis de AMPc, ativação da proteína PKA e fosforilação o fator de

transcrição CREB, que induz a transcrição da AA-NAT (indicado nas setas verdes). A ativação

dos receptores α1 pela noradrenalina e P2Y1 pelo co-transmissor ATP induz cascatas de

sinalização que convergem com a resposta β-adrenérgica (setas vermelhas). Estas vias levam ao

aumento dos níveis de cálcio e a consequente ativação da PKC que, por sua vez, potencia a

atividade da enzima AC. A PKA também fosforila a enzima AA-NAT após sua tradução,

permitindo sua ligação à chaperona 14-3-3 e sua estabilização e ativação. AA-NAT é o fator

chave para síntese de melatonina, pois a via só prossegue após a sua tradução, como

esquematizado na parte direita da figura.


11..44.. DDaa sseeccrreeççããoo aaooss mmeeccaanniissmmooss ddee aaççããoo ddaa mmeellaattoonniinnaa

A melatonina é uma molécula altamente lipofílica. Ao invés de ser armazenada

na pineal após sua síntese, ela é liberada nos capilares se ligando à albumina (Cardinali

et al., 1972). A melatonina secretada tem meia vida curta na circulação de

aproximadamente 30 minutos, dependendo da espécie examinada (Cardinali et al., 1972;

Waldhauser et al., 1984). A melatonina é metabolizada primariamente no fígado onde

sofre uma reação de duas etapas, primeiro é hidroxilada, seguida da conjugação com

sulfato ou glucoronato pelo citocromo p450 formando 6-sulfatoximelatonina (para

revisão, Tan et al., 2007). Estudos recentes apontam que esse metabólito também pode

ser formando em outros locais além do fígado como o córtex cerebral, os rins e o coração

de ratos (Lahiri et al., 2004). O perfil desse metabólito na urina e no plasma reflete tanto

aspectos quantitativos como qualitativos da secreção de melatonina e serve para análise

do ritmo endógeno de melatonina (Arendt, 1986; Bojkowskl, 1987).

Por ser uma molécula lipofílica a melatonina pode atravessar passivamente a

membrana celular e dessa forma, além de atuar sobre receptores, pode regular

diretamente reações/funções no interior das células independentemente da interação

com receptores. Por outro lado, diversas ações da melatonina são mediadas por

receptores de membrana MT1 e MT2 (Reppert et al., 1994, 1995; Dubocovich, 1988;

1997). Esses receptores pertencem a família de receptores acoplados a proteína G, que

contém sete domínios transmembrânicos e são responsáveis principalmente pelos

efeitos cronobiológicos sobre o NSQ. Neste caso, o receptor MT2 atua induzindo o

deslocamento de fase enquanto o receptor MT1 age inibindo a atividade de disparo

neuronal. Esses efeitos são mediados por concentrações equivalentes as encontradas no

plasma (pM a nM) durante a noite (para revisão, Dubocovich et al., 2010).


Um terceiro receptor, inicialmente descrito como MT3 (Dubocovich, 1988) foi

caracterizado posteriormente como sendo a enzima quinona redutase II (Nosjean et al.,

2000). Esse receptor ainda não foi clonado e por isso e de acordo o comitê de

nomenclatura IUPHAR é grafado em itálico (Dubocovich et al., 2000). A quinona

redutase participa da proteção contra o estresse oxidativo evitando reações de

transferência de elétrons de quinonas (Foster et al., 2000). A melatonina também se liga

com menor afinidade à calmodulina (Benitez-King, 2006) assim como a receptores

nucleares da família do ácido retinóico RORa1, RORa2 e RZRb (Wiesenberg et al., 1995;

Carlberg, 2000). Parte das ações antioxidantes da melatonina são mediadas por

mecanismos dependentes de receptor, mas também incluem ações que não dependem

dessa interação constituindo da ligação direta a radicais livres e reações de transferência

de elétrons na cadeia respiratória (Poeggeler et al., 2002).

2. FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF)

22..11.. CCaarraacctteerriizzaaççããoo ddoo TTNNFF

O TNF também descrito como caquexina foi identificado em 1975 como a

proteína induzida por uma endotoxina e que causava a necrose hemorrágica de

sarcomas transplantados em camundongos o que resultou na denominação de “fator de

necrose tumoral” (Carswell et al., 1975). Este termo já foi utilizado para denominar duas

proteínas diferentes, TNF- α e TNF-β, mas considerando suas especificidades, em 1998

chegou-se ao consenso que TNF- α e TNF- β seriam substituídos por TNF e linfotoxina

α (LTF α), respectivamente (Tracey, 2008). No presente texto utilizaremos a

nomenclatura acordada em 1998.


Após sua descoberta o grande interesse sobre o TNF foi baseado na expectativa

de seu potencial como uma droga anti-cancer. Mais tarde ficou evidente que o TNF é

uma citocina altamente pleiotrópica mediando diversas atividades biológicas. Foi

originalmente identificado como o mediador humoral da resposta endotóxica sistêmica

que causava febre, hipotensão e choque (Cerami & Beutler, 1988, Tracey et al., 1988). Os

estudos desde então revelaram também que o TNF é um dos mediadores inflamatórios

mais proeminentes para o início das reações inflamatórias do sistema imune inato,

incluindo a indução da produção de outras citocinas, a ativação ou expressão de

moléculas de adesão e multiplicação celular (Wajant., 2003). A importância do papel do

TNF durante o processo inflamatório pode ser demonstrada pela perspectiva

encontrada nas terapias anti-TNF que baseiam-se na utilização de anticorpos anti-TNF

ou administração de receptores solúveis de TNF no controle da artrite reumatóide e em

outras condições inflamatórias (Mpofu et al., 2005; Tracey, 2008).

O TNF é produzido primariamente como uma proteína de 26 kDa conhecida

como pró-TNF (Kriegler et al., 1988), que é expressa na membrana plasmática onde pode

ser clivada no seu domínio extracelular pela metaloproteinase TACE (do inglês, TNF

alpha converting enzyme) (Black et al., 1997; Moss et al., 1997) resultando na forma solúvel de

TNF (17 kDa). Tanto a forma associada à membrana como a forma solúvel de TNF são

ativas apenas na conformação trimérica e possuem distintas atividades biológicas.

Diversos tipos celulares linfóides ou não podem produzir TNF, incluindo macrófagos,

células T, mastócitos, granulócitos, natural killer (NK), fibroblastos, neurônios,

queratinócitos e células musculares (revisto por Bradley, 2008). Inclusive a própria

pineal produz TNF em resposta a estimulação com lipopolissacarídeo (LPS) (da Silveira

Cruz-Machado et al., 2010).


O TNF não é detectável em indivíduos saudáveis, mas os níveis séricos e

teciduais são elevados em condições inflamatórias e infecciosas, e se correlacionam com

a severidade das infecções (Nurnberger et al., 1995; Waage et al., 1997; Robak et al., 1998).

22..22.. SSiinnaalliizzaaççããoo ddoo TTNNFF

Os efeitos do TNF são mediados por dois tipos de receptores, designados como

receptor de TNF tipo 1 (TNF-R1) (descrito também como TNFRSF1A, p55/60, CD120a)

e receptor de TNF tipo 2 (TNF-R2) (descrito também como TNFRSF1B p75/80,

CD120b) (Ledgerwood, 1999). Enquanto os dois receptores compartilham similaridades

no domínio extracelular que consiste em repetições de cisteína (Beutler & van Huffel,

1994), TNF-R1 e TNF-R2 diferem no domínio intracelular, na afinidade a ligantes, no

perfil de expressão celular, na cascata de sinalização e consequentemente na sua função.

As duas formas de TNF, tanto membranar (TNFm) quanto a solúvel (TNFs), podem se

ligar aos dois tipos de receptores, no entanto, algumas ligações podem ser mais

favorecidas que outras. O TNFs se liga preferencialmente ao TNF-R1 (constante de

dissociação [Kd]∼20 pM) do que ao TNFR2 (Kd∼400 pM). (Greel et al, 1998). O TNF-

R1 é constitutivamente expresso na maioria dos tecidos enquanto a expressão do TNF-

R2 é restrita, tipicamente encontrada nas células do sistema imune. Por isso, na maior

parte das células, o TNF-R1 é o principal mediador da sinalização do TNF (Thoma et al.,

1990)

Alguns dos membros da família do TNF são conhecidos por sua capacidade de

induzir a morte celular por ativar a via de sinalização apoptótica. Esses receptores,

incluindo o TNF-R1, têm em comum o chamado domínio de morte (do inglês death

domain) (DD), presente na porção intracelular da molécula (Tartaglia et al., 1993a;

Schulze-Osthoff et al., 1998) e essencial para induzir a apoptose. Em receptores não


estimulados, o domínio citoplasmático é pré-associado à proteína inibitória SODD (do

inglês, silencer of death domains) com o domínio de morte. Essa proteína evita a sinalização

constitutiva do TNF-R1. A ligação do TNF ao domínio extracelular do receptor induz a

dissociação da proteína inibitória SODD com o DD que fica livre para ligar-se à proteína

adaptadora TRADD (Chen et al, 2002). Esse novo complexo protéico serve de

plataforma para ligação de diferentes proteínas que contém o DD. A via de sinalização a

ser disparada pela interação entre TNF e TNF-R1 depende de qual proteína se acoplará

à TRADD (do inglês, TNFRSF1A-Associated via death domain). TRADD inicia a sinalização

recrutando duas proteínas adicionais RIP-1 (do inglês, receptor interacting protein-1), uma

serina/treonina quinase que se liga ao TRADD por seu próprio domínio de morte (Hsu

et al., 1996) permitindo a ligação ao TRAF2 (do inglês, TNFR-associated factor 2) que não

possui DD (Takeuchi et al., 1996). O complexo TRADD-RIP1-TRAF2 é internalizado

(Jones et al., 1999) e liberado do TNF-R1. A formação desse complexo resulta na ativação

de diferentes quinases: NIK (do inglês, NFKB inducing kinase), IKKα e β (do inglês, IKB

kinase α e β) (Mercurio & Manning, 1999) ou MAP quinases (Eder, 1997), ERK, JNK e

p38 quinase (Liu et al., 1996; Kelliher et al., 1998). A ativação dessas quinases promove

tanto a sobrevivência celular quanto a geração de sinais pró-inflamatórios através da

ativação do fatores de transcrição, fator nuclear kappa B (NFKB) e AP-1 (do inglês,

activator protein 1). O TNF-R1, como já abordado anteriormente, pode ainda sinalizar por

vias que levam a morte celular. Essas vias envolvem a ligação da proteína FADD (do

inglês, Fas-associated DD protein) ao TRADD e o recrutamento subsequente da pro-caspase

8 que inicia a apoptose através da clivagem e ativação da pro-caspase 3. O recrutamento

e a ativação da pro-caspase 8 pode ser inibido por cFLIP (do inglês, Cellular caspase-8


(FLICE)-like inhibitory protein) induzido pela via NFKB, inibindo a via apoptótica. Esta

sinalização pode ser resumida no esquema representado na figura 2.

As vias de sinalização ativadas pelo TNF-R2 são menos definidas do que aquelas

envolvidas na sinalização do TNF-R1. Sem ter o domínio de morte a interação mais

relevante após a ativação do TNF-R2 é o recrutamento de TRAF2 que promove a

ativação da via do NFKB. A ativação do TNF-R2 resulta na expressão de citocinas e

também de proteínas intracelulares regulatórias com potencial anti-apoptótico, tais

como TRAF1, TRAF2 e proteínas inibidoras de apoptose c-IAP1 e c-IAP2, (Wang et al.,

1998) além de também poder ocorrer a ativação das MAP quinases p38 e JNK (Winston

et al., 1995; Liu et al., 1996, Kelliher et al., 1998; Lee et al., 2003).

A utilização de diferentes mecanismos de sinalização pelos receptores de TNF

condiz com a habilidade de cada receptor em sinalizar uma reposta biológica distinta. A

ligação do TNF-R1 é necessária e suficiente para induzir tanto efeitos citotóxicos como

respostas pró-inflamatórias, enquanto que o TNF-R2 ativa vias inflamatórias e de

sobrevivência celular (Rothe et al., 1994, 1995). Em algumas circunstâncias as vias

podem convergir, o TNF-R2 pode promover a sinalização do TNF-R1 por aumentar a

associação do TNFs com o TNF-R1 através de um mecanismo de passagem de ligante

que ocorre, principalmente, em baixas concentrações (Slowik et al., 1993); nestes casos o

TNF-R2 captura o TNFs passando-o ao TNF-R1 (Tartaglia et al., 1993b).


FIGURA 2. RReepprreesseennttaaççããoo eessqquueemmááttiiccaa ddooss ccoommppoonneenntteess ddaa vviiaa ddee ssiinnaalliizzaaççããoo ddoo TTNNFF.. O TNF

possui dos tipos de receptores, TNF-R1 e TNF-R2 e no esquema são representadas as vias de

ativação desencadeadas por cada um. A ligação do TNF ao TNF-R1 resulta no recrutamento de

TRAF2, RIP1 e FADD através da proteína adaptadora TRADD. FADD recruta e ativa a caspase

8, levando à apoptose. TRAF2 e RIP1 levam à ativação dos fatores de transcrição AP-1 e NFKB

através da ativação das proteínas quinases JNK, p38 e IKK. A ligação do TNF ao TNF-R2 ativa o

recrutamento de TRAF1, 2 e 3 que, através da ligação a proteína RIP-1, pode tanto levar a

cascata da ativação do NFKB, via IKKs, ou do fator de transcrição AP-1, por meio das MAPKs

(Baseado em Baud & Karin, 2001; Wajant, 2003).


Muitas linhagens celulares co-expressam os dois receptores, embora o TNF-R2

esteja preferencialmente expresso em células hematopoiéticas. Esses receptores

apresentam um padrão de expressão mais limitado in vivo, sendo regulado pelas

condições fisiopatológicas do tecido. Em condições de injúria ou isquemia por exemplo,

a expressão desses receptores pode mudar de intensidade e localização variando

conforme o tecido. Esse tipo de variação resulta de mudanças no nível da síntese desses

receptores bem como na liberação desses receptores da membrana. Alguns estímulos

que incluem o próprio TNF aumentam a expressão do TNF-R2 através de ativação

transcricional enquanto que o TNF-R1 sofre comumente uma regulação negativa

(Winzen et al., 1992; Kalthoff et al., 1993).

3. FATOR DE TRANSCRIÇÃO NUCLEAR KAPPA B (NFKB)

O NFKB foi inicialmente descrito como fator regulador do gene que transcrevia

a cadeia leve kappa da imunoglobulina de linfócitos B (Sen & Baltimore, 1986) o que

resultou no termo fator nuclear kappa B. Desde essa descoberta houve grande interesse

em entender os estímulos que o ativavam, os diversos genes e as funções biológicas que

esse fator regula. A função mais relevante do NFKB foi demonstrada no sistema imune

onde a expressão dos genes regulados por ele é essencial para as respostas da imunidade

inata e adquirida (Li et al., 2002; Bonizzi & Karin, 2004).

Originalmente descoberto no núcleo de linfócitos (Sen & Baltimore, 1986), o

fator nuclear kappa B é expresso de maneira ubíqua em todos os tipos celulares. A

família de fatores de transcrição NFKB inclui um grupo de proteínas conservadas desde

a Drosófila até o homem e que possuem em comum uma sequência de 300 aminoácidos

denominada domínio de homologia Rel (RHD, do inglês, Rel homology domain)

(Hoffmann et al., 1999). Esse domínio que nomeia o grupo, também conhecido como


família Rel, contem regiões funcionais cruciais localizadas na porção N-terminal da

proteína , responsável pela ligação ao DNA, dimerização, interação com as proteínas

inibitórias IKBs (também conhecidas como NFKBI) e direcionamento nuclear.

A família Rel consiste em cinco genes Nfkb1, Nfkb2, Rela, C-rel e Relb os quais

codificam sete proteínas: p105, p50 (ou NFKB1), p100, p52 (ou NFKB2), p65 (ou RelA),

c-Rel e RelB. p50 é gerada através da clivagem de p105, e a p52 a partir da proteína p100.

Essas proteínas são funcionais como dímeros e podem se apresentar como homodímeros

ou heterodímeros produzindo 15 possíveis combinações de dímeros. Neste trabalho será

utilizado a nova nomenclatura para a família NFKB assim como para as proteínas

regulatórias, de acordo com HUGO Gene Nomenclature Committe at the European

Bioinformatics Institute (disponível em http //www.genenam es.org).

As subunidades do NFKB ainda apresentam diferenças importantes em sua

expressão, regulação e funcionalidade. As proteínas RelA, c-Rel e RelB possuem o

domínio de transativação C-terminal (TAD, do inglês, transcription activation domain)

necessário para transcrição gênica sendo, portanto, consideradas as subunidades

ativadoras de expressão gênica. Já as subunidades p52 e p50 não tem o domínio TAD e

por isso são por definição repressoras da transcrição gênica. Por isso, a ligação dos

homodímeros dessas subunidades, a exemplo de p50/p50, ao sítios kappa B leva a

repressão da expressão gênica. Essas subunidades dependem da interação com outros

fatores para regular positivamente a transcrição (Hayden & Ghosh, 2008). Por isso,

heterodímeros de p50 ou p52 com as demais subunidades onde o TAD é presente atuam

como ativadoras da expressão gênica. A expressão dessas moléculas também varia em

relação ao tipo celular. As subunidades RelA e p50 estão presentes praticamente em

todos tipos celulares estudados, enquanto c-Rel, RelB e p52 tem expressão restrita a

células hematopoiéticas (revisto por Liou & Hsia, 2003).


RelB preferencialmente forma heterodímeros com p100 assim que é processada

em p52 (Dobrzanski et al., 1995) enquanto que RelA e c-Rel formam

predominantemente heretodímeros com p50 (Karin & Ben-Neriah, 2000).

Diferentemente dos outros membros RelB possui um domínio chamado zíper de leucina

(LZ) na porção N-terminal que tem função transcricional importante. Esse domínio

também confere especificidade adicional a RelB, incluindo sua heteromerização com

p52. Existem também modificações pós-transcricionais em partes diferentes das

subunidades de NFKB que incluem fosforilações e acetilações que modulam a ligação do

DNA e atividade transcricional (Perkins, 2006).

33..11.. AAttiivvaaççããoo ddoo NNFFKKBB

Em células não-estimuladas os dímeros do NFKB são retidos no citoplasma em

virtude de sua associação com a família de proteínas inibitórias IKB (Karin & Neriah,

2000). A interação com as proteínas IKB mascara a sequência de localização nuclear

(NLS, do inglês, nuclear localization sequence) do NFKB impedindo sua translocação ao

núcleo (Hayden & Ghosh, 2004). A família IKB consiste em nove membros IKBα, iKBβ,

BCL-3, iKBε e iKBγ além das proteínas precursoras p100 e p105 que possuem em

comum repetições múltiplas de anquirinas que medeiam a ligação com os dímeros do

NFKB (Hatada et al., 1992).

Os IKBs têm estrutura similar mas possuem diferenças em relação a sua

preferência de ligação e sua regulação transcricional pelos membros do NFKB. O

heterodímero clássico RelA/p50 é majoritariamente regulado pelo IKBα. Já o iKBε

regula preferencialmente os dímeros RelA/RelA e c-Rel/RelA (para revisão, Whiteside

& Israel, 1997). O papel do IKBβ é menos conhecido mas também se associa a RelA/p50.

Além de diferentes perfis de ligação aos dímeros, as três formas principais de IKB tem


diferentes cinéticas (Hoffmann et al., 2002). A proteína IKBα, por exemplo, é degradada

mais rapidamente em resposta a estímulos como o próprio TNF ou sua síntese.

Muitos dos sinais extracelulares que resultam na ativação da via de transcrição

NFKB disparam vias de transdução de sinal que culminam na ativação de um mesmo

alvo molecular. Essas vias se iniciam principalmente a partir da ativação de receptores

como o TNF-R1, cada qual com seus mecanismos intrínsecos de regulação, mas

convergindo para fosforilação das quinases IKKs (do inglês, iKB kinase).

Consequentemente, esse é um passo importante de regulação para determinar a

resposta de ativação do NFKB a vários estímulos. As IKKS consistem de um complexo

trimérico de quinases que compreende as subunidades catalíticas IKKα, IKKβ e a

subunidade IKKγ ,também conhecida como NEMO (do inglês, NFKB essential modulator),

que tem papel estrutural e regulatório. As proteínas das famílias NFKB e IKB e o

complexo de IKKs estão representadas na figura 3.


Família Rel

Família IKB

Complexo IKK

FIGURA 3. OOss mmeemmbbrrooss ddaass ffaammíílliiaass NNFFKKBB,, IIKKBB ee IIKKKK. A) Membros da família NFKB: RelA

(p65), RelB, c-Rel, p50/p105 (NFKB1) e p52/p100 (NFKB2). As subunidades p50 e p52 (não

mostrada) são derivadas do precursor mais proteínas P105 e P100, respectivamente. Todos os

membros da família NFKB contêm um domínio N-terminal Rel homologia (RHD) que medeia a

ligação do DNA e a dimerização e contém o domínio de localização nuclear. As proteínas RelA,

RelB e c-Rel, contêm na porção C-terminal o domínio de ativação transcricional (TAD). B) As

proteínas inibitórias IKBs consistem em IKBα, IKBβ, IKBε e BCL-3 mais as proteínas da família

NFKB, p105 e p100, que possuem o domínio de repetição de anquirinas (ANK) na porção C-

terminal. C) As três subunidades do complexo IKKs são mostradas: as subunidades catalíticas

IKKα e IKKβ e a subunidade reguladora NEMO, também conhecido como IKKγ. DD, região de

homologia com um domínio de morte; HLH, hélice-alça-hélice; LZ, domínio de zíper de leucina;

NDB, NEMO-binding domain obrigatórios; PEST, domínio rico em prolina.


O TNF, a IL-1β e o LPS disparam a via de sinalização do NFKB chamada clássica

ou canônica que culmina com a translocação nuclear do dímero RelA/p50. O

acoplamento do receptor com seus ligantes resulta na ativação do complexo de IKKs

que fosforila o IKBα nas serinas 32 e 36 promovendo sua poliubiquitinação. Quando

ubiquitinado o IKBα é degradado pelo proteassoma 26S expondo,portanto, o sítio NSL

de RelA e induzindo a translocação nuclear do dímero RelA/p50 (para revisão,

Rothwarf & Karin 1999; Ghosh & Karin, 2002). O complexo IKK também fosforila os

TADs de RelA e c-Rel podendo aumentar a sua atividade transcricional (Perkins, 2006).

Na via clássica IKKβ é a subunidade catalítica responsável pela atividade de IKK na

maioria dos tipos celulares. A deleção de IKKα em células que expressam IKKβ não

afeta a atividade clássica de IKK (Hu et al., 1999). A via alternativa depende somente da

subunidade IKKα a qual fosforila p100 induzindo o processamento de p52 e

subsequente ativação de RelB/p52. Essa via é ativada em resposta a uma parte dos

ligantes da família TNF incluindo CD40l, LTαβ, BAFF, RANKL e TWAK, e sua

regulação se difere da via clássica.

A rápida ativação do NFKB é essencial para uma resposta imune eficiente, mas

essa resposta não pode perdurar e precisa ser finalizada no tempo apropriado para

evitar o dano tecidual ou maiores complicações. O processo inflamatório descontrolado

é indesejado, além de aumentar o risco de câncer e doenças auto-imunes. O controle da

ativação do NFKB é feito por dois mecanismos principais. Um deles constitui de uma

alça de retroalimentação negativa que evolve a síntese de novas proteínas iKBs. Assim

que os dímeros de NFKB translocam ao núcleo um dos genes alvo é o gene Ikbα que

codifica o IKBα (Sun et al., 1993). Os novos IKBα sintetizados são direcionados ao

núcleo como monômeros e se associam aos dímeros p50/RelA levando à sua inativação e

exportação para o citoplasma. Outro mecanismo que contribui para a finalização da


resposta do NFKB é a degradação das subunidades de NFKB ligadas ao DNA pelo

proteassoma (para revisão, Vallabhapurapu & Karin, 2009).

4. EIXO-IMUNE-PINEAL

44..11.. MMeellaattoonniinnaa ee ddeeffeessaa

A melatonina, originalmente descrita como hormônio da glândula pineal,

também é produzida por outras estruturas. Esta molécula, altamente conservada ao

longo da escala filogenética, atuava inicialmente como antioxidante e bloqueadora de

processos enzimáticos relacionados com o estresse oxidativo sendo a função de defesa a

principal ação da melatonina em organismos mais primitivos (Hardeland & Fuhrberg,

1996, Reiter et al., 2000). Em vertebrados, a melatonina acumula funções de defesa com

função cronobiótica, isto é, marcadora do escuro (Hardeland & Fuhrberg, 2006; Tan et

al., 2010).

Ao longo das últimas duas décadas um grupo substancial de pesquisadores tem

demonstrado o papel regulatório da melatonina sobre as funções de defesa (Nelson &

Demas, 1997; Gilad et al., 1998; Maestroni, 1998; Hotta et al., 2000; Garcia et al., 2001;

Andrew & Hotchkiss, 2002; Guerrero & Reiter, 2002; Carrillo-Vico et al., 2003; Pontes

et al., 2006; Srinivasan et al., 2008). Os estudos iniciais sobre sua ação imunomodulatória

baseavam-se na retirada da glândula pineal e na observação de diversos parâmetros

imunológicos, incluindo principalmente os órgãos linfóides. A supressão da imunidade,

atrofia do timo e a redução de células imunes no baço após a pinealectomia representam

evidências marcantes do papel regulador exercido pela melatonina no sistema imune

(Csaba & Barath, 1975; Maestroni et al., 1986; Brainard et al., 1988; Jankovic et al., 1994).


Um importante aspecto dos efeitos da melatonina é que estes são observados em

uma ampla faixa de concentrações. Esta variabilidade implica que suas ações sejam

ligadas, ou não, à ritmicidade circadiana. A melatonina pode ser produzida em outros

locais além da pineal, tendo sido descrita no trato gastrointestinal (Bubenik, 2002), na

retina (Zmijewski et al., 2009), células epidérmicas (Slominski et al., 1996, 2002) e células

imunocompetentes (Carrilo-Vico et al., 2004; Pontes et al., 2006, 2007). Nestas condições

a melatonina é produzida em altas concentrações, na faixa de μM – mM, enquanto a

concentração plasmática noturna está na faixa de pM – nM. A produção extrapineal

pode ocorrer de maneira rítmica como acontece na retina ou constitutiva como acontece

no trato gastrointestinal, mas, em nenhum desses locais, a melatonina secretada parece

contribuir para variação rítmica do hormônio na circulação, sendo este padrão

dependente exclusivamente da produção pineal. Estudos mostram que tanto os níveis

de melatonina noturnos como a produzida localmente produzem efeitos regulatórios

sobre o sistema de defesa.

Os efeitos citoprotetores da melatonina são mediados por sua capacidade de

atuar como anti-oxidante (Reiter et al., 2002, Bilici et al., 2002, Zhang et al., 2004) e por

inibir vias de sinalização que desencadeiam respostas inflamatórias (Gilad et al., 1998;

Maestroni, 1998; Lissoni, 1999; Reiter et al., 2000; Skwarlo-Sonta et al., 2003, Markus et

al., 2010). Esses efeitos são obtidos em altas concentrações de melatonina e incluem sua

ações diretas como “scavenger” de radicais livres (Poeggeler et al., 2002) ou como

indutora do aumento da atividade de enzimas antioxidantes (para revisão Luchetti et al.,

2010).

Outra abordagem dos efeitos da melatonina está em sua ação sobre a resposta

imune inata, exibindo padrões diferentes de regulação. Em altas concentrações, a

melatonina possui efeitos imuno-estimulatórios. Ela promove aumento da transcrição


do gene de diversas citocinas pro-inflamatórias em células mononucleares (Garcia-

Maurino et al., 1997; Liu et al, 2001; Carrillo-Vico et al., 2003), aumento da atividade

fagocítica dessas mesmas células (Pontes et al., 2006) e da apresentação de antígenos

(Pioli et al., 1993), além do aumento da proliferação de linfócitos T e atividade de células

linfóides. Todos esses efeitos são relevantes para a montagem da resposta inflamatória,

por isso nestas condições a melatonina tem propriedades pró-inflamatórias. Por outro

lado, em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação a melatonina tem

efeitos contrários, de inibição da resposta inflamatória. A concentração plasmática de

melatonina reduz de forma significativa a adesão e rolamento de células

imunocompetentes à camada endotelial e o aumento da permeabilidade vascular

induzidos por agentes pró-inflamatórios em ratos (Lotufo et al., 2001, 2006). Suas ações

devem ser entendidas de acordo com o contexto fisiológico e fisiopatológico, por isso

restringir seu caráter ao efeito pró ou anti-inflamatório pode ser equivocado. As suas

propriedades bem marcadas como sua ação citoprotetora e imunomodulatória podem

predizer a sua aplicação e investigação em diversas condições e doenças.

44..22.. OO tteemmppoo nnaa rreessppoossttaa iimmuunnee:: rreellaaççããoo eennttrree mmeellaattoonniinnaa ee aaddaappttaaççããoo..

Os mecanismos biológicos evoluíram de forma a permitir a antecipação das

mudanças ambientais associadas ao tempo. Essas adaptações são cruciais para

sobrevivência, principalmente para espécies que convivem com mudanças drásticas no

ambiente. Essas espécies se deparam com desafios de disponibilidade de alimento e

baixas temperaturas que fazem do inverno, um período particularmente difícil para se

reproduzir e sobreviver. Nesse sentido, os indivíduos deveriam também prever

condições imunologicamente desafiantes.


Diferentemente de algumas funções fisiológicas, a função imune foi tida por

muitos anos como relativamente constante ao longo das estações (Sheldon & Verhulst,

1996), inclusive as flutuações no número de morte e doenças ao longo do tempo foram

mais atribuídas a virulências dos agentes causadores do que necessariamente a

mudanças na própria imunidade (Nelson et al., 2002). A manutenção da função imune é

considerada energeticamente elevada, as cascatas de atividade mitótica, a montagem do

processo inflamatório, a febre e a produção de fatores imunorregulatórios requerem

energia substancial (Demas et al., 1997). Diante disso, todos esses processos devem ser

altamente regulados para que a imunidade não perca efetividade diante de situações

desfavoráveis como nas mudanças sazonais do ambiente. Considerando que certas

atividades como a reprodução podem ser reduzidas durante períodos desfavoráveis,

outras como a função imune não pode ser reduzida sem graves comprometimentos para

a sobrevivência (Nelson et al., 2002).

Picos sazonais no tamanho dos órgãos linfáticos geralmente ocorrem no final do

outono ou no início do inverno e mínimos sazonais são observados antes do início da

reprodução. Dados de campo sugerem que a função imunológica e processos de doença

são reforçados durante o inverno (Nelson & Demas, 1997; Hotchkiss & Nelson, 2002).

Nos seres humanos também foram descritas mudanças sazonais na função imune.

Citocinas pró-inflamatórias como interferon (IFNγ) e INFα e IL6 estão aumentadas

durante o inverno em comparação com o verão (Katila et al., 1993; Maes et al., 1994).

As mudanças sazonais na função imune são determinadas pelo fotoperíodo e

mediadas pela duração da secreção de melatonina (Nelson & Demas, 1995, 1996; Nelson

& Drazen, 2000; Prendergast et al, 2004). De forma geral, o reforço da função imune

provê a antecipação do organismo frente aos estressores recorrentes que comprometem

a imunidade (Nelson et al., 2002). Em conjunto, todas as mudanças exercidas pela


melatonina no sistema imune são significativas para uma resposta imune integrada e

relevante para sobrevivência. Sobre a mesma lógica, o sistema imune pode atuar

diretamente sobre a função pineal. Essas ações refletem-se em ajustes sobre a

melatonina circulante de modo a permitir a regulação da função imune (Nelson &

Drazen, 1999; Skwarlo-Sonta et al., 2003).

Em modelo de inflamação crônica através da injeção de Bacilo Calmette-Guerin

(BCG) em patas de camundongo foi observado um ritmo diário da lesão granulomatosa

induzida. O edema da pata era menor à noite e maior durante o dia. Nesse caso a

extirpação da pineal aboliu o ritmo do edema que era restaurado após a administração

de melatonina durante a fase escura (Lopes et al., 1997). Pode-se entender que a natureza

da resposta imune é também modificada por uma variação diária das concentrações de

melatonina. Entende-se que o tempo também é determinante sobre a função imune em

uma escala muito menor,ou seja, o ciclo dia/noite também implica em alterações no

perfil de resposta inflamatória.

44..33.. AA ccoonnssttrruuççããoo ddee uumm nnoovvoo ccoonncceeiittoo:: PPiinneeaall ccoommoo aallvvoo ppaarraa mmeeddiiaaddoorreess

ddaa rreessppoossttaa iimmuunnee

Em mamíferos, a glândula pineal é responsável pela transdução do fotoperíodo

ambiental em sinalização hormonal. O escuro captado pela retina e processado pelo

sistema nervoso é traduzido através da produção e liberação do hormônio melatonina.

Portanto, esta indolamina é também conhecida como o hormônio do escuro (Reiter,

1993).

Os dados da literatura demonstram que melatonina é uma molécula diretamente

relacionada à resposta imune. Os estudos caracterizaram seu papel regulatório em

diferentes células imunes e a sua relação com a adaptação sazonal e processos de defesa

(para revisão, Guerrero & Reiter, 2002). Sobre a mesma lógica o sistema imune pode


atuar diretamente sobre a função pineal. Essas ações refletiram-se em ajustes sobre a

melatonina circulante de modo a permitir a regulação da função imune (Nelson &

Drazen, 1999; Skwarlo-Sonta et al., 2003). Nesse sentido, a própria pineal passa a ser

também alvo de mediadores imunológicos. Consistindo nessa concepção diversos

estudos mostraram que citocinas e outros sinalizadores da inflamação afetam a função

pineal (Mucha et al. 1994; Withyachumnarnkul et al., 1990a, 1990b; Zylinska et al., 1995,

Tsai et al., 2001; Ferreira et al., 2005; Jiang-Shieh et al., 2005; Fernandes et al., 2006; 2009;

da Silveira Cruz-Machado et al., 2010). Essas relações apontam para a existência de uma

comunicação bidirecional entre o sistema imune e a glândula (Skwarlo-Sonta et al, 2003;

Markus et al., 2007,). A proposta do Eixo-Imune-Pineal tem como pressuposto essa

interação e traz o conceito de que a comunicação recíproca entre a glândula pineal e o

sistema imune é essencial para a montagem da resposta inflamatória. As diversas

abordagens que contribuíram para construção dessa proposta serão apresentadas a

seguir. O presente trabalho tem como precursor resultados que constituem parte dessa

concepção e deram suporte para sua elaboração.

No estudo conduzido por Lopes e colaboradores (1997), além da observação de

que a lesão induzida por BCG na pata de camundongos apresentava ritmo diário e este

era alterado após pinealectomia e restaurado com melatonina exógena, foi mostrado

ainda que o ritmo da excreção do metabólito da melatonina, a 6-sulfatoximelatonina,

era perdido após remoção da adrenal (Lopes et al., 2001). Esses dados sugeriam pela

primeira vez a participação da adrenal no controle da função pineal. Foi demonstrada a

importância dos glicocorticóides na manutenção do ritmo diário da lesão

provavelmente pela indução do pico noturno de melatonina nessas condições. Essa

interação foi confirmada posteriormente quando demonstrou-se que a corticosterona


potencia a síntese de melatonina in vitro (Ferreira et al., 2005) e in vivo (Fernandes et al.,

2009).

Diversos mediadores da resposta imune também demonstraram exercer efeitos

sobre a função pineal. Foi mostrado que a citocina interleucina 1 beta (IL-1β) é expressa

constitutivamente na glândula pineal e aumentada após tratamento com noradrenalina,

IFNγ e LPS (Tsai & McNulty, 1999). Estudo do mesmo grupo também mostrou que o

RNAm da IL-6 e do fator de crescimento beta (TGF-β) são transcritos na glândula

pineal e regulados positivamente pela noradrenalina (Tsai et al., 2001a). O efeito dessas

citocinas sobre a atividade da glândula foi avaliado através da análise do conteúdo ou

síntese de precursores e da própria melatonina. Foi observado que o IFNγ pode induzir

tanto o aumento como a redução da melatonina em pineais cultivadas dependendo das

concentrações de IFNγ e do nível de estimulação adrenérgica utilizada

(Withyachumnarnkul et al. 1990b). Os fatores estimulares de colônias granulocitárias

(GM-CSF e G-CSF) e citocinas secretadas por células imunocompetentes ativadas

potenciam a produção de melatonina in vivo e in vitro na pineal de rato (Zylińska et al.,

1995). Também foi avaliado a participação da microglia na resposta da pineal à essas

citocinas. IL-1β, TNF e INFγ modulam o conteúdo de 5-HT em culturas de glândulas

pineais de rato (Tsai et al., 2001b).

Os efeitos inibitórios da melatonina noturna sobre a migração de leucócitos à

camada endotelial (Lotufo et al., 2001, 2006) implicariam que, durante a noite, a

montagem da resposta seria retardada por ação desse hormônio. Para haver o

recrutamento celular adequado, independente da hora do dia, os níveis de melatonina

circulantes devem ser reduzidos. Essa hipótese foi confirmada pela demonstração de

que agentes envolvidos na fase de montagem da resposta promovem efeitos negativos

sobre a produção de melatonina. O TNF inibe transientemente a transcrição do gene


que codifica a enzima AA-NAT e também a produção do precursor da melatonina, a N-

acetilserotonina, em glândulas pineais de ratos em cultura (Fernandes et al., 2006). O

estudo in vivo com um modelo de inflamação em humanos também mostrou a mesma

relação. Mulheres com mastite, um processo inflamatório não-infeccioso, apresentam

altos níveis de TNF e têm supressão do ritmo de melatonina (Pontes et al., 2006). No

mesmo contexto de uma resposta pró-inflamatória, a injeção de LPS promove a redução

dos níveis plasmáticos de melatonina em ratos (Tamura et al., 2010) e inibição da

produção de N-acetilserotonina e melatonina induzida por noradrenalina em pineais em

cultura (da Silveira Cruz-Machado et al., 2010). Observou-se ainda que em quadros de

infecção generalizada, caracterizada por altos níveis de TNF, há supressão do ritmo de

melatonina (Mundigler et al., 2002)

A caracterização dos mecanismos envolvidos na regulação da função pineal por

diversos fatores inflamatórios permitiu sugerir que o fator NFKB está diretamente

evolvido nas respostas observadas. Esse fator é constitutivamente expresso na glândula

pineal e apresenta ritmo diário, com máximo acúmulo nuclear no final da fase de claro e

rápida redução após o apagar das luzes (Cecon et al., 2010). A ativação da via NFKB por

fatores pró-inflamatórios como o TNF e LPS bloqueia (Fernandes et al., 2006, da Silveira

Cruz-Machado et al., 2010), enquanto que a inibição dessa via por corticosterona

potencia a síntese de melatonina induzida por noradrenalina em glândulas pineais em

cultura (Ferreira et al., 2005). A pineal também mostrou ser instrumentalizada para

responder à esses fatores. Já foram detectados em pinealócitos receptores para LPS,

TLR4 e CD14 (da Silveira Cruz-Machado et al., 2010) e para glicocorticóides (GR)

(Ferreira et al., 2005).

Os achados sobre a função pineal e processos de injúria indicam a comunicação

bidirecional do sistema imune com a glândula pineal. Essa concepção antes era proposta


do ponto de vista que presumia a existência de um mecanismo de retroalimentação para

regulação da melatonina circulante, considerando-se seu papel imunomodulatório

(Nelson & Drazen, 1999; Tsai et al., 2001b; Skwarlo-sonta et al., 2003). A proposta do

Eixo-Imune-Pineal considera a existência de mecanismos comuns de regulação da

produção de melatonina frente a condições desafiantes e relevante para uma resposta

inflamatória. No estado de higidez do organismo a melatonina é sintetizada

ritmicamente pela pineal. Diante de uma situação adversa como uma injúria, a pineal é

sinalizada a interromper a produção de melatonina para permitir a montagem da

resposta inflamatória. Por outro lado, na periferia, células imunocompetentes seriam

estimuladas e passariam a produzir grandes quantidades de melatonina que atuaria de

maneira parácrina, exercendo seu efeito antioxidante e anti-inflamatório, contribuindo

para finalização da resposta. Essa situação aconteceria de maneira transiente, de modo a

admitir que o animal resolva uma infecção ou lesão tecidual de maneira eficiente,

quando esses níveis assim seriam restaurados. O catabolismo dos mediadores e aumento

de glicocorticóides circulantes após a fase de resolução contribuiriam positivamente

para o retorno da síntese de melatonina pela glândula pineal (Markus et al., 2007).


FIGURA 4. OO EEiixxoo--iimmuunnee--ppiinneeaall: Em sujeitos saudáveis o NSQ controla a produção de

melatonina transduzindo a informação ambiental luminosa no pico noturno de melatonina em

concentrações que reduz a transmigração de leucócitos para os tecidos. Em uma situação de

injúria, moléculas produzidas no início da inflamação são percebidas pela glândula pineal

sinalizando a supressão da síntese de melatonina. A ausência do pico noturno de melatonina

permite a migração adequada de leucócitos e portanto uma montagem eficiente da resposta. Os

leucócitos já nos locais de injúria passam a produzir melatonina de forma parácrina de maneira

a resolver o processo inflamatório.

____________

Objetivos

49 II. Objetivos 49 II. Objetivos

II. OBJETIVOS

Objetivo desta dissertação foi demonstrar que algumas das moléculas mais

relevantes para desencadear a resposta ao TNF estão presentes em glândulas pineais em

cultura e em pinealócitos isolados de ratos. Neste sentido também analisamos o efeito

funcional da ativação da via de sinalização do TNF em pinealócitos. Para isso avaliamos:

1. A presença dos receptores TNF-R1 nos diferentes tipos celulares da pineal

2. A presença do receptor TNF-R1 em cultura de pinealócitos e o efeito do TNF

sobre a expressão do receptor.

3. A translocação nuclear do fator NFKB em glândulas pineais em cultura.

4. As subunidades do NFKB presentes em glândulas pineais estimuladas ou não

com TNF.

6. O efeito do TNF sobre a expressão da proteína inibitória IKBα em

pinealócitos em cultura.

5. O efeito do TNF sobre a expressão de iNOS e produção de óxido nítrico

____________

Material e Métodos

51 III. Material e Métodos 51 III. Material e Métodos

III. MATERIAL E MÉTODOS

1. ANIMAIS

Foram utilizadas ratos (Rattus novergicus) fêmeas pré-púberes da linhagem Wistar

criadas no biotério do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Os

animais foram alojados em gaiolas de polipropileno mantidas em sala com temperatura

e umidade controladas e adequadas à espécie. O ciclo claro-escuro empregado foi de 12

h claro/ 12 h escuro, luz ligada às 06:30 h. Os animais receberam ração e água ad libitum

durante todo procedimento experimental. Os animais foram mortos por decapitação

sem administração de anestésicos antes do apagar das luzes (ZT10 – ZT12) (ZT –

Zeitgeber time – ZT zero corresponde ao momento do ascender das luzes). Os

experimentos foram conduzidos de acordo com os princípios da ética em

experimentação animal, e aprovado pela Comissão de Ética em Uso de Animais em

Experimentação (CEUA) do Instituto de Biociências (protocolo 081/2008).

2. DROGAS E REAGENTES

As drogas e os reagentes utilizados são descritos a seguir conforme a empresa de

procedência.

Abcam (Cambridge, MA, EUA): anticorpos anti-TNF-R1 (ab19139) e anti-ED1

(ab31630)

Calbiochem (Darmstadt, Alemanha): NP-40 e 1400W.

Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA): penicilina, estreptomicina e glutamina.


Invitrogen Life Technology (Calrsbad, CA, EUA): ditiotreitol (DTT), fluoreto de

fenilmetilsulfonil (PMSF), anticorpo anti-coelho conjugado ao fluoróforo FITC, T4

polinucleotídeo quinase, DMEM (do inglês, Dulbecco’s modified Eagle médium) soro fetal

bovino, e 4’ 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 4-amino-5-metilamino-2´,7´-

difluorofluoresceina (DAF-FM-DA).

Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califórnia, EUA): (Santa Cruz, Califórnia,

EUA): anticorpos da via NFKB: anti-p-50 (sc-114X); anti-RelA (sc-109X); anti-p52 (sc-

298X); anti-c-Rel (sc-70X); anti-RelB (sc-226X); anti-BCL-3 (sc-185X); anti-IKBα

(sc371) e anti-iNOS (sc-651).

Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, EUA): HEPES, meio de cultura BGJb,

bisacrilamida (N, N’-metilenobisacrinamida; anticorpo anti-GFAP conjugado ao fluoróforo

Cy3, poli(dIdC), pirrolidinaditiocarbamato (PDTC), 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-

difenil-brometo de tetrazolium (MTT); fator de necrose tumoral (TNF), tripsina;

inibidor de tripsina e albumina bovina fração V (BSA).

Perkin Elmer (Boston, MA, EUA): Easy Tides Adenosine 5’-triphosphate, [γ-32P].

Promega (Madison, MA, EUA): Oligonucleotídeo consenso para NFKB (5’-

AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’) e AP-1 (5'-CGTTGATGAGTCAGCCGG AA-

3').

3. PREPARO DE DROGAS

O TNF foi preparado em alíquotas na concentração de 100 µg/mL em água

deionizada purificada e os estoques foram congelados a -20 °C. No dia do experimento

as alíquotas foram diluídas em meio de cultura DMEM (cultura de células) ou BGJb

(cultura de glândula pineal).


O indicador de NO, DAF-FM DA, foi diluído em DMSO (100%) e estocado em

alíquotas de 1 mM a -20 °C. No momento do uso as alíquotas foram diluídas em solução

salina (mM ; NaCl 150, KCl 5, CaCl2 2, NaHCO3 15, C6H12O6 11).

As demais drogas listadas anteriormente foram, quando necessário, diluídas em

água deionizada purificada por sistema Milli-Q (Millipore®, Billerica, MA, EUA).

4. CULTURA DA GLÂNDULA PINEAL

A cultura das glândulas foi realizada segundo protocolo descrito por Parfitt e

col. (1976) e modificado por Ferreira e col. (1994). Após a decapitarão do animal as

pineais foram retiradas do crânio rapidamente e cultivadas em placas de cultura de 24

poços. Foi adicionada uma pineal por poço, contendo 200 µl de meio de cultura BGJb

acrescido de glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/mL) e

mantidas a 37 °C em atmosfera com 95% de saturação de O2 e 5% de CO2 por 48 horas

antes de serem submetidas aos protocolos experimentais O meio de cultura foi trocado

a cada 24 h e 1h antes da administração de TNF.

5. CULTURA DE PINEALÓCITOS

A cultura de pinealócitos foi realizada segundo protocolo descrito por Ferreira e

col. (2003). Glândulas pineais foram retiradas, cortadas em pequenos pedaços e

submetidas à dissociação enzimática com tripsina (0,25 %, 37 °C, 15 min) seguida por

dispersão mecânica na presença de inibidor de tripsina (0,3% em solução contendo, em

mmol/L, NaCl 120, KCl 5, NaHCO3 25, KH2PO4 1,2, glicose 12 e 0,1% w/v albumina

bovina). Logo após a dispersão a suspensão foi centrifugada (1000 g, 15 min), descartado

o sobrenadante e as células foram ressuspensas em meio de cultura DMEM acrescido de

soro fetal bovino (10 %, inativado por calor) e penicilina (100 U/mL). Dessa suspensão


foi retirada uma alíquota para contagem do número de células utilizando a câmara de

Neubauer e a viabilidade das células foi estimada pela técnica de exclusão por azul de

Trypan. Após o cálculo de viabilidade e número de células por poço, as células foram

semeadas em placas cobertas previamente com poli-L-lisina (0,5 a 1 x 105 céls./poço). A

cultura foi mantida em estufa (37 °C em atmosfera com 95% de saturação de O2 e 5% de

CO2 ) por 18 horas antes do início dos tratamentos.

6. TESTE DE VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio colorimétrico de MTT. Os

pinealócitos foram semeados na densidade de 5 × 104 células/poço em placas de 96 poços

(150 mL) e tratados ou não com TNF (80 ng/mL, 2h) e, em seguida, incubados com

MTT (0,5 mg/mL) por 4h a 37 °C. A inibição da ligação DNA-NFKB e da atividade da

enzima sintase de óxido nítrico induzida (iNOS) foi obtida através da incubação das

células com PDTC (25 µM) ou 1400W( 1 µM), respectivamente. O corante formazan foi

dissolvido com dimetilsulfóxido (DMSO). As placas foram lidas em espectrofotômetro

de microplacas (Spectramax 250, Molecular Devices, CA, EUA) a 540 nm. A viabilidade

celular foi definida de acordo com o percentual de densidade óptica de cada grupo em

relação ao grupo controle.

7. IMUNO-HISTOQUÍMICA DA GLÂNDULA PINEAL

77..11.. MMééttooddoo ddee RReevveellaaççããoo ccoomm DDAABB

Para obtenção dos tecidos, os animais foram anestesiados através de injeção

intramuscular de ketamina (160 mg/kg) acrescido de xilazina (40 mg/kg) e perfundidos

transcardialmente com aproximadamente 150 mL de solução salina, seguida de


aproximadamente 300 mL de solução salina acrescida de paraformaldeído (PAF, 4%) a

4°C (pH 9,5). Cada pineal foi então removida e crioprotegida no mesmo fixador

enriquecido com 20% de sacarose por 12 h, seguindo-se por solução de sacarose 30% em

tampão fosfato-salino (PBS, pH 7.4, mmol/L: NaCl 137, KCl 2,7, Na2HPO4 2 H2O 8,1,

KH2PO4 1,76) a 4 °C por 24 h adicionais. As pineais foram então incluídas em meio para

congelamento (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrence, CA, EUA), rapidamente

congeladas em gelo seco e estocadas a -80 °C. A criomicrotomia foi realizada em

criostato e os cortes com espessura de 10 μm foram montados em lâminas para

microscopia com aderência eletrostática (Star Frost, Alemanha). Após secarem em

temperatura ambiente, as lâminas foram estocadas a -20 °C até a realização da imuno-

histoquímica. Seguindo o protocolo de imuno-histoquímica, após fixação em

paraformaldeído 4% por 30 min, os cortes foram incubados com glicina (0,1 M) por 5

min, seguido por incubação com solução de bloqueio (3% de albumina e 0,01% de

saponina em PBS) por 30 min em temperatura ambiente. A biotina endógena foi

bloqueada com o kit comercial avidin-biotin blocking kit (Vector, SP2001, Burlingame,

CA, EUA) por 30 min. Seguiu-se então, a incubação com o anticorpo produzido em

coelho anti-TNF-R1 (1:500, Abcam) diluído em solução de bloqueio. O anticorpo

primário foi incubado por 16 h a 4 °C, seguindo-se de incubação com o anticorpo

secundário anti-coelho conjugado a biotina (1:200, Abcam) por 1 h a temperatura

ambiente. O complexo avidina-biotina foi marcado com kit comercial (Vectastain Elite

Kit, Vector, PK-605, Burlingame, CA, EUA) e a atividade da peroxidase foi revelada com

3, 3’-diaminobenzidina (DAB, substrate kit for peroxidase, Vector, SK-4100, Burlingame,

CA, EUA). Após o ensaio de imuno-histoquímica as lâminas foram contra-coradas com

azul de metileno.


77..22.. IImmuunnoofflluuoorreessccêênncciiaa-- FFrreeee FFllooaattiinngg

Cada pineal foi removida do crânio e fixada em paraformaldeído 4%

suplementado com 20% de sacarose a 4 °C por 3 dias seguido de crioproteção em

solução de sacarose 30% em PBS a 4 °C por 18h adicionais. As pineais foram então

incluídas em meio para congelamento (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrence, CA,

EUA), rapidamente congeladas em gelo seco e estocadas a -80 °C. Os cortes foram

realizados em criostato com espessura de 30 μm. Os cortes foram primeiramente

lavados em PBS (3X 10 min) seguido por incubação com solução de bloqueio (2% de

albumina e 0,3% de Triton X em PBS) a temperatura ambiente por 60 min. Foi então

realizada a incubação com os anticorpos primários: produzido em coelho anti-TNF-R1

(1:100, Abcam), produzido em camundongo anti-ED-1 (1:100, Abcam) e/ou produzido

em camundongo anti-GFAP conjugado ao fluoróforo Cy3 (1:2000, Sigma-Aldrich) e

produzido em camundongo anti-TNF-R2 diluídos em solução de bloqueio por 48 h a

4˚C em constante agitação. Após esta etapa, os cortes foram novamente lavados em PBS

por 30 min, seguindo-se da incubação dos anticorpos secundários fluorescentes

apropriados: anti-coelho conjugado ao FITC (1:200, Sigma-Aldrich) e/ou anti-

camundongo conjugado ao Cy3 (1:200, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,

USA) por 90 min em temperatura ambiente. O núcleo foi marcado com DAPI (30 μM, 5

min , Invitrogen) diluído em PBS e incubado em temperatura ambiente.

Os controles negativos foram realizados com a omissão do anticorpo primário e

com a incubação dos cortes com o anticorpo secundário correspondente. A marcação foi

observada por microscopia confocal (Zeiss, LSM510, Baden-Wurttemberg, Alemanha)

sendo utilizado o laser HeNe 543 para excitação do fluoróforo Cy3 no comprimento de

onda de 543 nm e filtro de emissão em 560 nm. Para a excitação do fluoróforo FITC

utilizou-se laser argônio no comprimento de onda de 488 nm e filtro de emissão em 505.


O laser enterprise (UV) foi utilizado para excitação do marcador DAPI no comprimento

de onda de 364 nm e a emissão verificada com filtro de 435-485 nm.

8. IMUNOFLUORESCÊNCIA DE CULTURA DE PINEALÓCITOS

Para o ensaio de imunocitoquímica os pinealócitos foram semeados em placas de

8 poços (Lab-Tek chamber slide, Nalge Nunc International, Nova York, EUA). Após o

período de execução do protocolo experimental, as células foram lavadas 2X em PBS e

em seguida fixadas com paraformaldeido 4% em PBS por 15 minutos. Após a fixação as

células foram lavadas novamente em PBS e permeabilizadas com solução de saponina

0,5 % em PBS e por último incubadas com solução de bloqueio (1% BSA e 0,3 M de

glicina em PBS). Após essa sequência as células foram incubadas overnight (18 h, 4°C).

em câmara úmida com os anticorpos primários: produzido em coelho anti-TNF-R1

(1:100), produzido em coelho anti-IKBα (1:50) e/ou produzido em coelho anti-NOS2

conjugado ao fluoróforo TRITC (1:25). Após a incubação com os anticorpos primários,

as células foram lavadas com PBS (2X) e em seguida incubadas com o anticorpo

secundário anti-coelho conjugado ao fluoróforo Texas Red (1:400, Abcam) por 1 h em

temperatura ambiente. O núcleo foi marcado com DAPI (300 μM, 5 min) a temperatura

ambiente.

A marcação foi analisada por microscopia confocal (Zeiss, Baden-Wurttemberg,

Alemanha) e visualizada por diferentes objetivas. O laser HeNe 543 foi utilizado para

excitação dos fluorofóros Texas Red e TRITC (excitação em 543 nm e filtro de emissão

em 650 e 560-615 nm, respectivamente). Para visualização do DAPI foi utilizado o laser

enterprise (UV), excitação no comprimento de onda de 364 nm com filtro de emissão

em 435–485 nm. Para cada ensaio foi realizada a análise de 3 imagens correspondentes a

campos diferentes com, aproximadamente, 7 células por campo. A quantificação da


fluorescência foi realizada através do programa público Image J (National Institute of

Health, USA, download em http://rsb.info.nih.gov/ij).

9. DETECÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO POR MICROSCOPIA

CONFOCAL

A produção de NO foi detectada por microscopia confocal utilizando o

indicador intracelular DAF-FM DA. O DAF-FM DA reage com o NO-2 (formado durante

a oxidação espontânea do NO) e essa reação emite fluorescência (Kojima et al., 1998).

A detecção do NO nos pinealócitos foi realizada de acordo com protocolo

descrito por Tamura e col. (2009). Os pinealócitos foram cultivados em lamínulas de

vidro contidas em placas próprias para microscopia confocal mantidas por 18 h em

estufa (200 µL DMEM, 37°C, 5% CO2,). Após esse período o meio foi substituído por

solução salina contendo, em mM: NaCl 150, KCl 5, CaCl2 2, NaHCO3 15, C6H12O6 11 e

suplementada com L-arginina (100 M), pH 7,4. Seguiu-se o tratamento experimental e

nos últimos 50 minutos de tratamento as células foram carregadas com o indicador de

NO DAF-FM DA (5 M). Após o tratamento, as células foram lavadas com solução

salina para retirar o excesso do probe e levadas para análise dos níveis de NO por

microscopia confocal. O ensaio foi realizado em ambiente com baixa luminosidade

desde a incubação com DAF-FM DA até a obtenção das imagens. Os registros foram

feitos com a objetiva de imersão em óleo (40X), a excitação realizada com laser argônio

(488 nm) e a emissão 515-530 nm. Foram obtidas 4 imagens de campos selecionados

aleatoriamente de cada placa, contendo pelo menos 7 células viáveis. A quantificação da

fluorescência emitida pelo DAF-FM DA foi realizada através do programa Image J. Ao final

dos experimentos as células foram tratadas com o doador de NO nitroprussiato de sódio

(1 mM) para verificar a eficácia da detecção de NO. O efeito dos diferentes tratamentos


no aumento de NO induzido por TNF foi avaliado tendo sido o valor da média

(unidades arbitrárias) obtida no grupo controle considerado como 100%.

10. EXTRAÇÃO DE PROTEÍNA NUCLEAR

Após cultivo e tratamentos as glândulas pineais foram armazenadas em freezer -

80° C e depois processadas para extração nuclear de proteínas. Cada glândula pineal foi

homogeneizada em 100 μL de tampão de lise (HEPES, pH 7,5, 10 mM; KCl 10 mM;

EDTA 0,1 mM; glicerol 10%, DTT, 1 mM, PMSF, 0,1 mM) com utilização de um

homogenizador e pistilo apropriados. Em seguida, foi adicionado 12,5 μL do detergente

NP-40 (10%), as amostras foram agitadas rapidamente com auxílio do vortex e

incubadas em gelo por 15 min. Após esse período foram centrifugadas (12000 g, 1 min,

4°C) e o sobrenadante, correspondente a fração citoplasmática do extrato, descartado.

O pellet resultante foi então lavado com 50 μL do tampão de lise e centrifugado (12000 g,

1 min, 4°C) sendo o sobrenadante novamente descartado. O pellet nuclear formado foi

ressuspenso em 20 μL do tampão de extrato nuclear (HEPES, pH 7,5, 10 mM; KCl 5 M;

EDTA 1 mM; glicerol 10%, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM) ficando 15 min em gelo sob

agitação. Após centrifugação (20.000 g, 5 min, 4°C) o sobrenadante (extrato nuclear)

foi aliquotado e estocado a -20 °C até o ensaio.

A quantificação da concentração de proteína dos extratos foi realizada a 280 nm

através do espectrofotômetro ND-1000 (Nanodrop, Wilmington, DE, EUA).


11. ENSAIO DE ELETROMOBILIDADE POR RETARDO EM GEL

(EMSA)

O EMSA determina o acúmulo nuclear do fator NFKB. O ensaio consiste na

reação de ligação de proteínas do extrato nuclear com a sequência consenso específica

para o fator de transcrição NFKB marcada com o radioisótopo 32P.

Para os ensaios foi utilizado 6 μg de proteína do extrato nuclear de pineais

incubadas na ausência ou presença de TNF (30 ng/mL) por 5 a 60 minutos. Seguiu-se

incubação destas, com tampão de ensaio (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 1 mM, NaCl

50 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,5 mM, poli (dIdC) 1 μg e glicerol 4%) por 20 min em

temperatura ambiente. Na sequência, as amostras foram incubadas por 30 min em

temperatura ambiente com 40000 cpm de sonda de oligonucleotídeo dupla-fita

correspondente ao consenso para NFKB (5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’,

Promega, Madison, WI, EUA) marcado com radioisótopo. A marcação da sonda foi

realizada pela incubação do oligonucleotídeo consenso para NFKB com 1 μL de [γ32P]-

ATP (atividade específica 3000 Ci/mmol) na presença da enzima T4 polinucleotídeo

quinase (10 U). Esta enzima substitui os fósforos do oligonucleotídeo por fósforo

radioativo e o que não é incorporado é removido por coluna sefadex G-25 (GE

Healthcare Life Sciences). Em seguida, foi adicionado 2 μL de tampão de corrida (Tris-

HCl 250 mM pH 7,5, glicerol 4%, azul de bromofenol 0,2%). Os complexos proteína-

DNA foram analisados em gel de poliacrilamida não-desnaturante, 6% de

acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) por eletroforese (150V, 1h30min) em tampão 0,25 x de

Tris-borato/EDTA (TBE). Finalizada a corrida, o gel foi seco a vácuo, exposto ao filme

BIOMAX-MS (Kodak, Rochester, NY, EUA) em cassete apropriado por 48 h a -80˚C.

Seguiu-se a revelação por imersão do filme em solução reveladora por 5 min (Kodak,

Rochester, NY, EUA) e em solução fixadora por 10 min (Kodak, Rochester, NY, EUA).

As autoradiografias foram quantificadas através do programa Image J.


12. ENSAIO DE SUPERSHIFT

As subunidades de NFKB presentes nos extratos nucleares de glândulas pineais

tratadas ou não com TNF (30 a 90 ng/mL, 5 min) foram identificadas através do ensaio

de EMSA. Foram utilizados 6 μg de proteína de um pool de 4 extratos de cada grupo

experimental. Neste ensaio foram adicionados 2 µg/mL anticorpos específicos para

subunidades de NFKB: RelA, p50, p52, c-Rel, RelB, e/ou Bcl3 por 45 minutos antes da

incubação dos extratos com a sonda consenso para NFKB-32P. As demais etapas que se

seguiram foram realizadas conforme o protocolo de EMSA descrito anteriormente.

13. ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média (e. p. m).

O ensaio de EMSA foi quantificado pelo programa Image J. As comparações entre as

médias foram obtidas por análise de variância (ANOVA) de uma via seguida de pós-

teste Newman-Keuls utilizando o programa GraphPad Prism 5. Os grupos foram

considerados significativamente diferentes quando apresentavam probabilidade de

ocorrência ao acaso menor que 5 % (p<0,05).

____________

Resultados

63 IV. Resultados 63 IV. Resultados

IV. RESULTADOS

1- EXPRESSÃO DO RECEPTOR TNF-R1 NOS DIFERENTES TIPOS

CELULARES DA PINEAL.

A glândula pineal é composta de diferentes tipos celulares, os pinealócitos, que

representam a maioria das células do parênquima (90%) e células da glia. A expressão

do receptor TNF-R1 nos diferentes tipos celulares foi determinada pelos ensaios de

dupla imunofluorescência e análise por microscopia confocal.

Para marcação do receptor TNF-R1 utilizamos o anticorpo primário específico

seguido do secundário fluorescente (em verde, FITC). Verificamos uma

imunorreatividade positiva para TNF-R1 em todo parênquima da glândula (figura 5; A e

D). Para identificar os tipos celulares da pineal, utilizamos anticorpos específicos anti-

GFAP, marcador de astrócitos e anti-ED-1, marcador de microglia (ambos em vermelho,

Cy3). As células imuno-positivas para GFAP mostraram ser restritas à região proximal

da glândula, adjacentes ao pedúnculo pineal. Já a imunorreatividade para o marcador

ED-1 mostrou estar difusa ao longo do parênquima.

A sobreposição das imagens com dupla marcação mostra co-localização de TNF-

R1 com astrócitos (figura 5C) e microglia (figura 5E). A análise da imagem em objetiva

maior (figura 6) revela que grande parte das células do parênquima pineal tem

imunorreatividade positiva para TNF-R1 (figura 6, A e D). Praticamente todas as células

que imunoreagem para GFAP também marcam para TNF-R1 (figura 6, C), revelando a

expressão constitutiva do receptor em astrócitos. Em relação a co-localização com

microglia (figura 6, F) apenas parte das células marcadas com anti ED-1 apresentam

imunorreatividade positiva para TNF-R1 (figura 6, F, indicado pela seta), sugerindo que


nem todas células da microglia expressam TNF-R1. Como a pineal é formada por 5-10%

de células da glia a marcação para TNF-R1 em células adjacentes (figura 6, F, círculo)

não reativas para marcadores gliais sugere a expressão do receptor em pinealócitos.

FIGURA 5. IImmaaggeennss rreepprreesseennttaattiivvaass ((44XX)) ddaa eexxpprreessssããoo ddee TTNNFF--RR11 eemm sseeççõõeess ddee ggllâânndduullaa

ppiinneeaall ((3300 µµmm)). A marcação positiva de TNF-R1 em todo parênquima pineal é mostrada em

verde (A e D). As células da glia são marcadas em vermelho, astrócitos (GFAP, B) ou microglia

(ED-1, E). As células positivas para GFAP são restritas à região proximal perto do pedúnculo

pineal (B), enquanto as células ED-1-positivas estão dispersas no parênquima (E). Sobreposição

das imagens indica a marcação dupla do TNF-R1 e GFAP (C) ou ED-1 (F). Barra da escala = 200

µm.


FIGURA 6. IImmaaggeennss eemm mmaaiioorr oobbjjeettiivvaa((6600XX)) ddaa eexxpprreessssããoo ddoo TTNNFF--RR11 eemm sseeççõõeess ddee ppiinneeaall ddee

rraattooss ((3300 µµmm)).. TNF-R1 é marcado em verde, com imunorreatividade positiva ao longo do

parênquima pineal (A, C e D, F). As células da glia foram marcadas em vermelho com GFAP

para astrócitos e ED-1 para microglia. A microglia apresenta um padrão difuso de distribuição

ao longo do parênquima (E). A marcação em azul representa os núcleos emitida pelo DAPI. As

imagens amarelas mostram a colocalização positiva do TNF-R1 em astrócitos (C) e da microglia

(F). A seta cheia (F) indica células da microglia (vermelho) não positivas para o TNF-R1, e na

cabeça de seta a co-localização positiva entre microglia e TNF-R1 (amarelo). O círculo envolve

um pinealócito, que expressa o TNF-R1 (verde). Barra de escala = 20 µm.


2- VARIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO TNF-R1 AO LONGO DO DIA

Tendo confirmado que a glândula pineal de ratos expressa constitutivamente o

receptor TNF-R1, na próxima etapa foi avaliada se esta expressão apresenta ritmicidade

na pineal. Para isso, foi utilizado cortes de pineais de ratos obtidas por eutanásia nos

ZTs 2, 10, 14, 18 e 22 (ZT 0 corresponde ao ascender das luzes, 6: 30 h). Através do

método de imunoperoxidase foi possível observar que a expressão deste receptor varia

ao longo das 24 horas, sendo a imunoreatividade maior no ZT10 (figura 7).

FIGURA 7. VVaarriiaaççããoo ddaa iimmuunnoorrrreeaattiivviiddaaddee ppaarraa TTNNFF--RR11 aaoo lloonnggoo ddoo ddiiaa eemm sseeççõõeess ddee ggllâânndduullaa ppiinneeaall.. O

slide mostra a marcação do TNF-R1 em tempos diferentes (ZT 0 corresponde ao ascender das luzes, 6: 30

h). A expressão de TNF-R1 na glândula pineal varia ao longo do dia, sendo a expressão máxima na fase de

clara (ZT 10). O controle negativo foi realizado com a omissão do anticorpo primário. Barra de escala = 50

µm.


3. PINEALÓCITOS EXPRESSAM CONSTITUTIVAMENTE O

RECEPTOR TNF-R1

Demonstramos a expressão constitutiva do receptor TNF-R1 em cortes sagitais

da glândula pineal e verificamos que tanto astrócitos como a microglia expressam o

receptor de TNF. Como comentado anteriormente, a existência de células adjacentes

não reativas aos marcadores de células da glia sugeriu que os pinealócitos expressam

constitutivamente esse receptor.

Para confirmar a presença do TNF-R1 em pinealócitos isolamos essas células em

cultura e analisamos a expressão por imunofluorescência. Verificamos que os

pinealócitos apresentam constitutivamente imunorreatividade para o TNF-R1 e que

esta é reduzida ao incubarmos as células com TNF (80 ng/mL) (figura 8). A incubação

com TNF entre 60 e 180 minutos promoveu a redução em aproximadamente 60% da

intensidade de fluorescência (44,18% ± 3.1; basal = 100%), sugerindo a diminuição do

número de receptores expressos nos pinealócitos. O teste de viabilidade celular pelo

ensaio do MTT mostrou que as concentrações de TNF utilizadas não induziram a morte

celular.


FIGURA 8. EExxpprreessssããoo ddee TTNNFF--RR11 eemm ppiinneeaallóócciittooss iissoollaaddooss..

A) Imagens representativas da imunofluorescência em pinealócitos cultivados

mostrando a expressão constitutiva do TNF-R1 (marcada em vermelho, à esquerda).

B) Quantificação da fluorescência em pinealócitos estimulados (barras cinza) ou não

(barra branca) com o TNF (80 ng / mL) por 30 a 180 min (basal =100%). Os dados estão

expressos como a média ± e.p.m. n = 4 culturas independentes. Em cada poço foram contadas 21

células escolhidas aleatoriamente em três campos diferentes. * p<0,05 vs TNF 0. Barra da escala=

20 µm.


4. TNF PROMOVE A TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DO NFKB

A via do NFKB é considerada central para o processo inflamatório. Essa via

também é ativada pelo TNF através da ativação dos receptores de membrana TNF-R em

diversos tipos celulares. Verificamos se o TNF promove a ativação desse fator na

glândula pineal de rato por meio da quantificação do acúmulo nuclear do NFKB e de

suas subunidades. Para tanto foi utilizado o ensaio de eletromobilidade em gel (EMSA)

e o ensaio de supershift, respectivamente.

44..11.. DDeeccuurrssoo tteemmppoorraall ddaa aattiivvaaççããoo ddoo NNFFKKBB iinndduuzziiddaa ppoorr TTNNFF

Primeiramente avaliamos o tempo de ativação da translocação nuclear do NFKB

induzida por TNF (30 ng/mL, 0, 5, 10, 15, 30 e 60 minutos). Os extratos nucleares de

cada amostra foram incubados com o oligonucleotídeo específico para o NFKB marcado

radiotivamente com γ32P. A sonda específica para o NFKB revelou dois complexos (C1

e C2) nos extratos nucleares da pineal. Observamos, através da quantificação

densitométrica do gel revelado que o TNF aumenta a translocação nuclear de C1 após 5

minutos de incubação e que os níveis nucleares deste fator de transcrição retornam aos

níveis basais após 15 minutos de incubação com TNF (Figura 9).


FIGURA 9.. DDeeccuurrssoo tteemmppoorraall ddaa ttrraannssllooccaaççããoo ddoo NNFFKKBB iinndduuzziiddaa ppoorr TTNNFF eemm ggllâânndduullaass

ppiinneeaaiiss ddee rraattoo.

A) Imagem representativa de EMSA da quantidade de NFKB nuclear nos diferentes

tempos de incubação com TNF.

(B) Quantificação densitométrica do NFKB. Os valores são representados pela média ±

e.p.m de 3-4 glândulas por ponto após a incubação com TNF 30 ng/mL em diferentes tempos. *

p<0,05 vs 0 min.


44..22.. SSuubbuunniiddaaddeess pprreesseenntteess nnaa ttrraannssllooccaaççããoo nnuucclleeaarr ddoo NNFFKKBB

Observamos que o TNF promove o aumento do acúmulo nuclear do NFKB após

5 minutos de incubação. A identificação das subunidades do NFKB presentes nos

complexos formados foi obtida através do ensaio de supershift. Para isso foi utilizado um

pool de extratos de glândulas tratadas ou não com TNF (30 ng/mL, 5 min) nos quais

foram incubados anticorpos específicos para as diferentes subunidades: p50, RelA, p52,

c-Rel, RelB e Bcl-3. Quando se adiciona um anticorpo com a proteína de interesse

forma-se um complexo maior que promove um retardo ainda maior na migração dos

extratos no gel o que nomeamos de shift , sendo neste caso um supershift.

Tanto no grupo não estimulado como no tratado com TNF, apenas o complexo

C1 apresentou um deslocamento (shift) quando incubado com os anticorpos específicos

para cada subunidade da família NFKB (Figura 10). Extratos nucleares de glândulas não

estimuladas tiveram retardo para p50 e RelA mas não para os outros anticorpos

testados. A incubação com anticorpo anti-p50 promove o deslocamento de todo o

complexo, enquanto que RelA promove um deslocamento parcial de C1. Um gel

demonstrativo é mostrado na figura 10A. É interessante notar que para p50 observamos

duas bandas de retardo (figura 10B, indicado pela primeira seta) enquanto que para

RelA só há uma banda (figura 10B, segunda seta). Portanto, podemos sugerir que na

glândula pineal em cultura (48h) tanto os dímeros p50/p50 e p50/RelA são presentes no

extrato nuclear.


FIGURA 10. EEnnssaaiioo ddee SSuuppeerrsshhiifftt ddee ggllâânndduullaass ppiinneeaaiiss eemm ccuullttuurraa..

A) Autoradiografia representativa mostrando o supershift para p50 e RelA em pineais

não-estimuladas.

B) Gráfico obtido a partir do analisador de gel do Programa Image J. Os gráficos

mostram, em cada linha, a banda de retardo (supershift, SS) correspondente de cada coluna do gel

representativo. O primeiro e o segundo picos correspondem respectivamente a C2 e C1. Cada

ponto foi obtido de um pool de 3-4 glândulas


44..33.. EEffeeiittoo ddoo TTNNFF ssoobbrree aa ttrraannssllooccaaççããoo ddooss ddíímmeerrooss ddoo NNFFKKBB

O efeito do TNF sobre a translocação dos dímeros do NFKB foi avaliado pela

incubação das glândulas por 5 minutos em concentrações crescentes (10, 30, 60, 90

ng/mL). TNF induz a translocação nuclear de ambos os dímeros (p50/p50 e p50/RelA)

(Figura 11). Concentrações mais baixas são capazes de aumentar a translocação nuclear

de p50/RelA, enquanto que as concentrações mais altas promovem a translocação de

ambos os dímeros.

FIGURA 11. EEffeeiittoo ddoo TTNNFF ssoobbrree aa ttrraannssllooccaaççããoo ddaass ssuubbuunniiddaaddeess ddoo NNFFKKBB ppaarraa oo nnúúcclleeoo ddee

ppiinneeaaiiss eemm ccuullttuurraa..

A) Gel representativo do supershift para RelA de glândulas estimuladas ou não com o

TNF (10-90 ng / mL) por 5 min.

B) Gel representativo do supershift para p50 de glândulas estimuladas ou não com o TNF

(10-90 ng/mL) por 5 min. Os gráficos abaixo representam a análise densitométrica dos géis

mostrados acima feita pelo software Image J. Cada ponto foi obtido a partir de um pool de 3-4

glândulas.


5. TNF PROMOVE A DEGRADAÇÃO DA PROTEÍNA INIBITÓRIA

IKBα EM PINEALÓCITOS DISPERSOS

Na maioria dos tipos celulares a ativação do complexo NFKB é regulada por uma

família de proteínas citoplasmáticas conhecidas como inibidoras do NFKB, NFKBI

(antes citadas como IKBs). Essas proteínas inibitórias retêm o complexo NFKB no

citoplasma, impedindo sua translocação ao núcleo e, portanto, sua associação com DNA

(Rice & Ernst, 1993). A ativação do NFKB depende da fosforilação do IKBα e

subsequente ubiquitinação que resulta na degradação do IKBα pelo proteassoma. A

liberação do NFKB permite sua translocação para o núcleo onde ele atua na transcrição

de vários genes.

Para avaliar a ativação do fator NFKB em pinealócitos isolados observamos a

expressão da proteína inibitória IKBα através de estudos imunocitoquímicos. A

expressão constitutiva da proteína é considerada como 100% do valor da fluorescência

detectada. Verificamos que o TNF (80 ng/mL) induz uma diminuição significativa (de

100% ± 3,5 para 30,1 % ± 2,0) da imunorreatividade para proteína inibitória IKB-α após

10 minutos de incubação. A redução em relação a imunofluorescência basal é mantida

dos 15 aos 60 minutos. A partir dos 15 minutos a fluorescência relativa tende a aumentar

significativamente em relação aos 10 minutos, porém não restaurando os níveis basais. A

diminuição da fluorescência após estimulação com TNF sugere a degradação da

proteína e a consequente ativação do NFKB em pinealócitos isolados (figura 12).


FIGURA 12. EExxpprreessssããoo ddoo IIKKBBαα eemm ppiinneeaallóócciittooss iissoollaaddooss..

A) Imagens representativas da imunocitoquímica mostrando a expressão do IKBα

(marcado em vermelho) em cultura de pinealócitos na ausência (esquerda) ou presença de TNF

(80 ng/mL, por 10 min; imagem à direita). Em azul estão representados os núcleos dos

pinealócitos marcados com DAPI. Barra da escala = 10 µm.

B) Quantificação da fluorescência em pinealócitos estimulados (barra cinza) ou não

(barra branca) com TNF (80 ng/mL) de 1 a 60 min. Dados são apresentados como média ± e.p.m.

(basal =100%). n = 3 experimentos independentes. *p < 0.05 vs. TNF 0.


6. TNF AUMENTA A EXPRESSÃO DE INOS EM PINEALÓCITOS

ATRAVÉS DE MECANISMO DEPENDENTE DE NFKB..

Uma vez que TNF induz a translocação nuclear dos dímeros p50/RelA, utilizamos

como medida funcional a expressão da enzima iNOS e NO em pinealócitos isolados.

66..11.. TTNNFF iinndduuzz aa eexxpprreessssããoo ddaa ssiinnttaassee ddee óóxxiiddoo nnííttrriiccoo iinndduuzzíívveell ((iiNNOOSS)) eemm

ppiinneeaallóócciittooss iissoollaaddooss

A expressão de iNOS foi verificada por imunofluorescência em pinealócitos

dispersos. Pinealócitos isolados foram incubados com concentrações crescentes de TNF

(30, 60, 90 ng/mL, por 120 min). Os resultados demonstram que o TNF (120 min.) induz o

aumento concentração-dependente da imunorreatividade para iNOS, sendo

estatisticamente significativo nas concentrações de 60 e 90 ng/mL (figura 13A).

A enzima iNOS é a isoforma de sintase de NO que depende de indução

transcricional. O promotor da enzima iNOS possui sítio de ligação tanto para o NFKB como

para o fator de transcrição AP-1 sendo que este último varia entre indução e repressão (Xie

et al., 1994, Lowestein et al, 1993, Chu et al.,1998). A ativação do NFKB é essencial para

indução da transcrição de iNOS por IL-1 e LPS (Di Marco et al, 2005). Para avaliar se o

efeito da indução de iNOS por TNF em pinealócitos isolados é dependente da ativação do

fator NFKB utilizamos o inibidor sintético da via NFKB, pirrolidina ditiocarbamato

(PDTC), (Schreck et al., 1992). Verificamos que o PDTC (25 M), pré-incubado por 30

minutos em pinealócitos isolados, inibe a expressão de iNOS induzida por TNF (80ng/mL,

120 min) (Figura 13, B)


FIGURA 13. EExxpprreessssããoo ddee iiNNOOSS iinndduuzziiddaa ppoorr TTNNFF eemm ppiinneeaallóócciittooss eemm ccuullttuurraa.

A) Imagens representativas da imuno-histoquímica para iNOS (marcação em vermelho)

em pinealócitos estimulados ou não com TNF (30-90 ng/mL por 120 min). Os núcleos dos

pinealócitos estão marcados em azul com DAPI.

B) Quantificação da fluorescência relativa da imunorreatividade para iNOS nas

diferentes concentrações de TNF (30, 60 e 90 ng/mL). (basal =100%). *p < 0.05 vs. TNF 0.

C) Quantificação da fluorescência relativa da imunorreatividade para iNOS em

pinealócitos incubados com TNF (80 ng/mL, 120 min) e com PDTC (25µM). Os dados são

expressos como média ± e.p.m. n = 3 experimentos independentes para cada parâmetro *p < 0.05

vs. TNF 0 (barra branca); **p < 0.05 quando comparado o grupo estimulado ou não com TNF na

presença ou ausência do PDTC.


7. TNF INDUZ A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO EM

PINEALÓCITOS ISOLADOS

Tendo em vista que o TNF é capaz de induzir o aumento da expressão de iNOS em

pinealócitos isolados, analisamos a habilidade das células estimuladas por esta citocina em

produzir óxido nítrico. Para tanto utilizamos um método de detecção in situ do óxido

nítrico através do marcador fluorescente DAF-FM DA e analisamos por microscopia

confocal.

Para avaliar o efeito do TNF sobre a produção de NO foi utilizada a dose

submáxima desta citocina necessária para a indução de iNOS (80 ng/ml). Observamos

que pinealócitos incubados por 2 horas com TNF tiveram aumento significativo da

intensidade de fluorescência em relação ao basal (para 174,8% ± 8,6% vs basal)

indicando o acúmulo de NO (Figura 14). Com o objetivo de verificar se produção de NO

é mediada pela indução de iNOS, pinealócitos foram pré-incubados com o inibidor

específico da enzima, 1400W (1 µM, 50 min). Constatamos que a produção de NO

induzida por TNF é bloqueada quando as células são previamente tradadas com o

inibidor de iNOS (90,5% ± 5,7 vs grupo tratado com TNF).


FIGURA 14. TTNNFF iinndduuzz aa pprroodduuççããoo ddee NNOO eemm ppiinneeaallóócciittooss eemm ccuullttuurraa..

A) Imagens representativas do acúmulo de NO induzido por TNF em pinealócitos

isolados. As imagens mostram a fluorescência do marcador de NO DAF-FM em pinealócitos

sem marcador (SALINA), células incubadas apenas com marcador (salina mais DAF-FM) e

células carregadas com marcador e estimuladas com TNF (80 ng/mL). Escala de 30 µm (barra

verde).

B) Os dados estão apresentados como média ± e.p.m da porcentagem de fluorescência

emitida pelo marcador de NO (basal =100%). n = 3 experimentos independentes. *p < 0,05 vs.

TNF 0 (barra branca); **p < 0,05 quando comparado o grupo estimulado ou não com TNF na

presença ou ausência do 1400W.

____________

Discussão

81 V. Discussão 81 V. Discussão

V. DISCUSSÃO

A regulação da produção de melatonina pela glândula pineal era considerada

exclusivamente dependente da ativação da via simpática pela alternância claro/escuro,

ou pela inibição da mesma por fibras GABAérgicas estimuladas pela luz (Simmoneaux

& Ribelayga, 2003). Desta forma, a pineal era o único órgão que não respondia

diretamente a estímulos endógenos, mas sim à variação da iluminação ambiental. No

entanto, alguns autores sugeriam que a glândula pineal poderia ser alvo de citocinas e

hormônios, de tal forma que a produção noturna de melatonina seria regulada pelo

estado de higidez do animal (Skwarlo-Sonta et al., 2003, Nelson et al., 2002).

A citocina pró-inflamatória TNF é capaz de suprimir a via biossintética da

melatonina induzida por noradrenalina (Fernandes et al., 2006). Uma correlação

negativa entre melatonina e TNF em pacientes septicêmicos (Mundigler et al., 2002),

portadores de infarto do miocárdio (Dominguez-Rodriguez et al., 2004) e parturientes

portadoras de mastite (Pontes et al., 2006), reforça a hipótese que o TNF é capaz de

suprimir a produção noturna de melatonina. Por outro lado, os glicocorticóides, que são

potentes agentes anti-inflamatórios, potenciam a produção de melatonina tanto in vitro

quanto in vivo (Ferreira et al., 2005, Couto-Moraes et al., 2009; Fernandes et al., 2009).

Já é sabido que a glândula pineal expressa receptores de glicocorticóides, que

inibindo a via de sinalização NFKB, potenciam a produção de melatonina induzida por

noradrenalina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2009). Neste trabalho foram

determinados os mecanismos moleculares envolvidos na resposta induzida por TNF,

sobre a glândula pineal, dando subsídio para o entendimento de como esta citocina

pode inibir a produção noturna de melatonina.


Detectamos por técnicas de imuno-histoquímica e imunocitoquímica a

marcação com anticorpos específicos para receptores TNF-R1 e TNF-R2 tanto em

pinealócitos quanto em células da glia. Vale ressaltar que a expressão de TNF-R1 é

difundida entre diferentes tecidos, tais como glandulares, musculares, neurais e células

imunocompetentes, enquanto que TNF-R2 tem sido encontrado preferencialmente em

células do sistema imune (Hehlgans & Männel, 2002). Para que fosse avaliada a

localização celular dos receptores TNF-R1 nas células da glândula pineal, inicialmente

caracterizamos os tipos celulares presentes usando imunomarcadores específicos para

astroglia e microglia.

Os estudos imuno-histoquímicos confirmaram que os astrócitos estão restritos à

região proximal, ou pedúnculo por onde penetram artéria, veia e fibras nervosas (Luo et

al., 1984, Zang et al., 1985, Schröder & Malhotra, 1987; Berger & Hedger, 2000; Jiang-

Shieh et al., 2003). Já a microglia difunde-se por todo o parênquima glandular.

A imunoreatividade positiva para TNF-R1 pode ser co-localizada com a dos

marcadores GFAP para astrócitos e ED-1 para microglia. Todas as células marcadas com

anticorpos contra GFAP (astrócitos) apresentaram dupla marcação para TNF-R1,

sugerindo fortemente uma expressão constitutiva destes receptores na astroglia. Por

outro lado, apenas algumas das células imunorreativas para ED-1 (microglia)

apresentavam colocalização para TNF-R1. Esta marcação parcial da microglia pode ser

dependente da existência de diferentes tipos de células, como sugerido em estudo com

anticorpos mais seletivos (Jiang-Shieh et al., 2003). Desta forma, podemos considerar

que nem todas as células que compõe a microglia expressam receptores para TNF-R1.

Receptores que reconhecem moléculas sinalizadoras de patógenos (PAMPS) já

foram detectados na glândula pineal. Foi mostrada a expressão constitutiva dos

receptores TLR-4 e CD-14 que reconhecem o principal componente da parede de


bactérias gram-negativas (LPS) (da Silveira Cruz-Machado et al., 2010). A expressão

desses receptores tem sido relatada na literatura como restrita a células da microglia e

também astroglia. Já na pineal, foi verificado que além dos astrócitos e da microglia os

pinealócitos também expressam o receptor TLR-4. A expressão constitutiva desses

receptores nos órgãos circumventriculares estudados é crucial para reação imune inata

no sistema nervoso central (Laflamme & Rivest, 2001). A detecção do LPS circulante

promove uma rápida resposta pró-inflamatória, primeiro nesses órgãos e

posteriormente é perceptível ao longo do parênquima cerebral (Rivest, 2003). Assim

que a glia é estimulada o LPS circulante é capaz de causar uma rápida ativação da

transcrição dos genes que codificam a proteína CD14 como, por exemplo, os das

citocinas IL-1β, IL-6 e TNF gerando um sinal amplificador da resposta pró-inflamatória

também em outras regiões encefálicas. A presença constitutiva desses receptores na

pineal amplia o entendimento de que a pineal é também regulada pelo estado

fisiopatológico do animal estando instrumentalizada a reconhecer moléculas específicas

de patógenos.

Os dados da literatura para o receptor de TNF-R1 na glia ainda são esparsos e

não permitem fazer a mesma análise. No entanto, seria muito especulativo imaginar que

o mesmo ocorreria para o TNF-R1 na pineal, visto que o efeito de TNF em culturas de

pineal é máximo após 12 horas de incubação, sendo que após 24 ou 48 horas não mais é

observada a supressão da produção de N-acetilserotonina induzida por noradrenalina

(Fernandes et al., 2006).

A imunoreatividade para o TNF-R1 no parênquima da pineal foi observada tanto

em células que imunorreagiam ao ED-1, quanto as que não apresentavam dupla-

marcação, sugerindo que os pinealócitos também apresentavam imunorreatividade para

o TNF-R1. A presença destes receptores em pinealócitos foi confirmada em estudo


imunocitoquímico realizado com pinealócitos dispersos. Esta constatação deve ser

destacada aqui. A presença constitutiva do receptor TNF-R1 também nos pinealócitos

indica que estas células podem responder diretamente ao TNF. Isso sugere que

independente da ativação de células gliais, as células produtoras de melatonina podem

detectar e responder ao TNF presente na circulação. A especulação que se fazia até

então era que as células gliais, a se destacar a microglia, seriam as células moduladoras

da resposta pineal às citocinas. De fato foi mostrado que a presença da microglia em

cultura de pinealócitos influencia o padrão de resposta às citocinas IL-1β, IFN-γ e ao

TGFβ, mas em relação ao TNF, interessantemente, a resposta é a mesma independente

da constituição de microglia (Tsai et al., 2001b). Este trabalho corrobora com os nossos

dados que mostram a presença de receptores de TNF-R1 também nos pinealócitos,

sugerindo a resposta direta do TNF nestas células.

Após caracterizar a presença dos receptores, nosso objetivo foi avaliar a

funcionalidade dos mesmos. Vale ressaltar que o agonista endógeno para TNF-R1 é o

TNF solúvel, enquanto TNF-R2 interage com a forma ligada à membrana (Grell et al.,

1998; McCoy e Tancey, 2008).

A ligação do TNF com o receptor TNF-R1 promove a ativação da cascata de

sinalização que leva à translocação nuclear do fator de transcrição NFKB (Tracey et al.,

2008). Aqui verificamos que o TNF induz ao aumento da translocação nuclear do NFKB

em pineais em cultura. Este aumento ocorre de maneira rápida, após 5 minutos de

estimulação, e transiente, retornando aos níveis basais em 15 minutos. A cinética da

ativação do NFKB pelo TNF é descrita na literatura por ser rápida e temporalmente

regulada (Hoffmann et al., 2002; Werner et al., 2008). As alças de retroalimentação

negativa controladas pelas proteínas IKBs são determinantes para rápida finalização da

resposta do NFKB. Tão logo o NFKB transloca ao núcleo após a estimulação com TNF


ele induz a transcrição de novas proteínas IKBα que, por sua vez se ligam aos dímeros

do NFKB sequestrando-os para o citoplasma na forma inativa (Werner et al., 2008). Já o

tempo de indução da resposta ao TNF é variável e depende do estado basal de ativação

do NFKB e das quantidades de IKBα disponíveis no núcleo (Lipniack et al., 2004).

Em pineais de ratos em cultura por 48 horas obtidas de animais eutanasiados às

16h horas, encontramos a presença dos dímeros de NFKB p50/p50 e p50/RelA. Isto

contrastou com os resultados obtidos com pineais de ratos não cultivadas (Cecon et al.,

2010), ou cultivadas por 48 horas, mas obtidas de animais mortos às 9h horas (da

Silveira Cruz-Machado et al., 2010). Nestes casos apenas dímeros p50/p50 foram

observados no núcleo. Este dímero é constitutivamente ativado na pineal apresentando

um ritmo diário, com maior translocação nuclear no final da fase de claro e queda

abrupta no início da fase de escuro (Cecon et al., 2010). Uma vez que p50/p50 não possui

o domínio de transativação (Hayden & Ghosh, 2008), ele atuaria como repressor da

transcrição gênica o que explicaria seus baixos níveis durante a noite, permitindo a

produção de melatonina. De fato a inibição do NFKB constitutivo potencia a síntese de

melatonina induzida por noradrenalina em pineais em cultura (Ferreira et al., 2005).

A estimulação das glândulas pineais com TNF aumentou o conteúdo nuclear

tanto do homodímero p50/p50 quanto do heterodímero p50/RelA. O aumento da

translocação nuclear de p50/p50 vai ao encontro dos achados da regulação desse dímero

sobre da produção de melatonina, uma vez que o TNF inibe a via biossintética da

melatonina (Fernandes et al., 2006). Além disso, estudos in silica indicam a presença de

elementos kappa B no promotor do gene da enzima AA-NAT, que é chave na via

biossintética da melatonina (Markus et al., 2007). A ligação de um dímero de NFKB

desprovido de domínio de transativação como é o caso de p50/p50 (Karin & Ben-

Neriah, 2000) resultaria na inibição da transcrição do gene da AA-NAT.


A estimulação com TNF também promove o aumento da translocação de

p50/RelA. A ativação da translocação nuclear deste dímero está ligada à via clássica do

NFKB (Karin & Ben-Neriah, 2000; Perkins, 2007), que é essencial para indução da

transcrição de uma variedade de genes essenciais para a montagem da resposta

inflamatória. Genes que regulam a expressão de moléculas de adesão, citocinas,

quimiocinas e enzimas tais como a sintase de óxido nítrico induzida (iNOS) e a

ciclooxigenase II (COX II), são alguns cuja transcrição é induzida pelo dímero p50/Rel

A (para revisão, Lawrence, 2009).

Desta forma, o aumento do conteúdo nuclear de p50/RelA em glândulas pineais

em cultura após estimulação com TNF deveria resultar na expressão de proteínas

envolvidas na montagem de respostas inflamatórias. De fato, a ativação desses dímeros

induz a produção de TNF, observada após incubação de glândulas pineais com LPS que

também é temporalmente coincidente com o aumento da expressão do receptor TNF-

R1 em pinealócitos isolados (da Silveira Cruz-Machado et al., 2010). Interessante

destacarmos aqui, que o TNF produzido localmente possa também exercer efeitos

parácrinos na pineal amplificando o sinal gerado inicialmente pelo LPS para promoção

da inibição da síntese de melatonina. No presente trabalho, escolhemos avaliar a

expressão da enzima iNOS quando as culturas de pinealócitos eram estimuladas com

TNF.

Vale ressaltar que são conhecidas três isoformas da enzima NOS, sendo duas

constitutivas e uma induzida. A pineal expressa a enzima constitutiva neuronal, e

apesar de ainda não ser entendida a sua função, sabe-se que sua expressão tem

regulação fotoperiódica (Jacobs et al., 1999).

Nossos dados demonstram, que o TNF é capaz de induzir ao aumento da

imunorreatividade para iNOS, sugerindo a indução desta enzima. Além disso, esta

indução é dependente da concentração de TNF e antagonizada por inibidores da ligação


de NFKB com seu elemento cognato no promotor dos genes controlados por este fator

de transcrição. Portanto, fica pela primeira vez demonstrado que há indução de iNOS

em pineais ativadas por TNF e que é controlada pela via de transcrição NFKB. A

produção de NO foi também demonstrada em pinealócitos estimulados com TNF, e a

incubação com o inibidor da enzima iNOS bloqueia esse efeito indicando que o acúmulo

de NO é gerado a partir de sua atividade. Vale ressaltar que a ativação do NFKB medeia

a inibição da produção de melatonina, e que doadores de NO reduzem a produção de

melatonina em glândulas pineais (Maronde et al., 1995). Esses dados podem sugerir que

o efeito do TNF sobre a produção de óxido nítrico via iNOS seja relacionada à resposta

inibitória na glândula. Esta especulação indica que a ativação da via NFKB através do

recrutamento de dímeros diferentes promove respostas transcricionais negativas e

positivas mas convergindo para um mesmo efeito.

Em suma, os resultados apresentados aqui, demonstram a base molecular para

considerar as células da pineal alvos para o TNF e, neste contexto, amplia o nosso

entendimento de que a pineal é parte integrante do sistema de alerta do organismo para

detecção de injúrias (figura 15). Podemos ressaltar que ativação do fator NFKB é

essencial para resposta ao TNF na glândula pineal. Confirmamos aqui, que este mesmo

estímulo pode ativar cascatas regulatórias diferentes. Enquanto a ativação dos dímeros

p50/p50 explicam o efeito inibitório desse fator sobre a produção de melatonina, o

acúmulo de p50/RelA nos permite especular que a ativação da transcrição de genes

também é um mecanismo relevante para resposta imune inata da pineal. Nossos

resultados corroboram com dados anteriores do nosso grupo que mostram ser a pineal

apta a responder a estímulos injuriantes. Portanto, corroboram a existência do eixo-

imune-pineal, ativo durante a montagem de uma resposta inflamatória.


FIGURA 15. RReepprreesseennttaaççããoo eessqquueemmááttiiccaa ddoo eeffeeiittoo dduupplloo ddoo TTNNFF eemm ppiinneeaallóócciittooss. O TNF ativa

o TNF-R1, levando à interiorização do receptor e a ativação da via NFKB. Esta ativação é

mediada pela degradação do IKBα, que depende de sua fosforilação (Neumann e Naumann,

2007). Na sequência observou-se a translocação nuclear dos dímeros p50/p50 e p50/RelA. É

sabido que p50/p50 atua inibindo a transcrição gênica enquanto p50/RelA é capaz de ativar a

transcrição de genes. Foi mostrado previamente que o TNF inibe a transcrição do gene Aa-nat,

que codifica a proteína-chave para a síntese de melatonina (Fernandes et al., 2006). Além disso,

aqui demonstramos que a translocação nuclear de p50/RelA induz a transcrição da iNOS, uma

enzima clássica de respostas inflamatórias. Sugerimos que o mecanismo de ação do TNF,

divulgado no presente trabalho, é a base molecular para a compreensão da inibição da síntese de

melatonina, que ocorre no início de uma resposta imune.

____________

Conclusões

90 VI. Conclusões

VI. CONCLUSÕES

1. Glândulas pineais de rato expressam de maneira constitutiva o receptor TNF-

R1. Este receptor é expresso nos três principais tipos celulares da pineal, em

pinealócitos, e nas células gliais, astrócitos e microglia.

2. A expressão do receptor TNF-R1 no parênquima da glândula pineal varia ao

longo dia, sendo maior no ZT 10.

3. Pinealócitos expressam o receptor TNF-R1. Na presença de TNF a expressão

do TNF-R1 é reduzida após 60 minutos de incubação.

4. Os dímeros do NFKB p50/p50 e p50/RelA são constantemente ativados em

pineais em cultura (retiradas no ZT 10). A estimulação com TNF promove o aumento da

translocação dos mesmos.

5. A proteína inibitória IKBα é expressa em pinealócitos em cultura. A presença

do TNF promove a redução da expressão dessa proteína, sugerindo sua degradação.

Portanto podemos concluir que o NFKB é ativado por TNF em pinealócitos em cultura.

6. O TNF induz a expressão da enzima iNOS em pinealócitos isolados. Vimos

que essa indução é dependente da ativação do fator NFKB e leva a produção de NO.

91 VII. Resumo

VII. RESUMO

O TNF atua diretamente sobre a pineal inibindo a via biossintética da

melatonina. De forma semelhante o LPS, potente ativador da resposta imune inata, tem

efeito inibitório sobre a produção de melatonina e seu precursor. A supressão da síntese

noturna de melatonina é admitida de forma a permitir a montagem da resposta

inflamatória, tanto durante o dia como à noite. Dados do grupo tem demonstrado que o

NFKB é um fator constitutivamente expresso na glândula pineal e que o ritmo diário de

translocação pode ser determinante para o início da síntese de melatonina. A inibição de

sua ativação potencia a síntese de melatonina enquanto que fatores que classicamente

promovem a sua ativação inibem esta produção. Nesta dissertação, verificamos as

moléculas envolvidas no reconhecimento e na de sinalização desta citocina na pineal.

Demonstramos que a pineal está apta a responder ao TNF, células gliais da pineal e as

células secretoras, os pinealócitos, expressam constitutivamente o receptor TNF-R1. O

TNF promove a translocação nuclear dos dímeros p50/p50 e p50/RelA do NFKB em

glândulas pineais em cultura. Confirmamos a ativação desta via em pinealócitos pela

análise da proteína inibitória IKBα. Vimos que a ativação desse fator é essencial para

expressão da iNOS e a produção de NO induzida por TNF em pinealócitos isolados.

Além disso, mostramos que o TNF promove a redução da expressão do receptor TNF-

R1 na membrana de pinealócitos. Em resumo, mostramos neste trabalho que a pineal

está instrumentalizada a responder ao TNF, e que os pinealócitos são alvos diretos para

o seu reconhecimento. Confirmamos a relevância do fator NFKB na resposta da pineal

em situações de injúria, ampliando o conceito de que a pineal está apta a detectar

moléculas do processo inflamatório.

92 VIII. Abstract

VIII. ABSTRACT

TNF acts directly on the pineal gland by inhibiting the biosynthesis of

melatonin. Similarly, LPS, a potent activator of the innate immune response has an

inhibitory effect on the production of melatonin and its precursor. The suppression of

nocturnal melatonin synthesis is admitted to allow the full mounting of the

inflammatory response both during the day and night. Data from our laboratory have

shown that the NFKB is constitutively expressed in the pineal gland and that the daily

rate of translocation can be determinant for the onset of melatonin synthesis. Inhibition

of their activation potentiates melatonin synthesis whereas factors that promote its

activation classically inhibit this production. In this dissertation we find the molecules

involved in recognition and signaling of this cytokine in the pineal. We demonstrated

that the pineal is responsive to TNF, the pineal glial cells and secretory cells, the

pinealocytes, constitutively express the TNF-R1. TNF promotes nuclear translocation

of p50/RelA and p50/p50 NFKB dimers in the pineal glands in culture. We confirmed

the activation of this pathway in pinealocytes by analyzing the inhibitory protein IKBα.

We have seen that the activation of this factor is essential for iNOS expression and NO

production induced by TNF in isolated pinealocytes. Furthermore we show that TNF

promotes the reduction of the expression of TNF-R1 receptor on the membrane of

pinealocytes. In summary, we show here that the pineal is instrumented to respond to

TNF and that the pinealocytes are direct targets for its recognition. We confirm the

relevance of NFKB in the pineal response in situations of injury extending the concept

that the pineal is able to detect molecules in the inflammatory process and respond

accordingly.

93 IX. Referências Bibliográficas

IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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111 X. Súmula Curricular

X. SÚMULA CURRICULAR

Nome: Cláudia Emanuele Carvalho de Sousa

Naturalidade: Abaeté-MG

Data de Nascimento: 16/12/1986

Email: [email protected]

FORMAÇÃO ACADÊMICA

Mestrado

Ciências- Fisiologia Geral

Instituição: Universidade de São Paulo (USP), Instituto de Biociências

Tema: Caracterização do Eixo imune-pineal: Mecanismo de ação da citocina pró-

inflamatória TNF no controle da função pineal

Laboratório de Cronofarmacologia

Período: 12/2008 - 03/2011

Graduação

Licenciatura em Ciências Biológicas

Instituição: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)

Juiz de Fora - MG

Período 03 /2005 - 12 /2008

2° grau

Colégio Cenescista Nossa Senhora de Fátima

Abaeté - MG

2002 – 2004


1º grau

Colégio Cenecista Nossa Senhora de Fátima

1998 - 2001

Escola Frederico Zacarias

Abaeté - MG

1994 - 1997

MONITORIA

1. Disciplina: Zoologia dos Invertebrados I

Profª Sueli de Souza Lima

Departamento de Zoologia do Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Juiz de Fora

Período: 2º sem./2006 (bolsista) e 1° sem./2007(s/bolsa)

2. Disciplina: Biofísica

Prof. Sérgio Luiz Schmidt

Departamento de Fisiologia do Instituto de Ciências Biológicas


Período: 2º sem./2006 (s/bolsa)

3. Programa de Preparação Pedagógica - Fisiologia para o Ensino Médio (PAE)

Profª. Responsável: Regina Pekelmann Markus

Departamento de Fisiologia

Universidade de São Paulo

Período: 1º sem./2010


PRODUÇÃO CIENTÍFICA

Trabalhos Apresentados em eventos

1. STUTZ-REIS, Sarah, STUTZ-REIS, Suzana, SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho

de, MARTINS-NETO, Rafael Gioia. A evolução da musicalidade dos grilos. XXIX

Semana da Biologia, Juiz de Fora, MG, 2006.

2. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, STUTZ-REIS, Sarah, STUTZ-REIS,

Suzana MARTINS-NETO, Rafael Gioia. The colour patterns in fossils: a probable

unpalatable butterfly from São Paulo Oligocene. XXIV Encontro Anual de Etologia,

Brasília, DF, 2006.

3. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, STUTZ-REIS, Sarah, STUTZ-REIS,

Suzana, MARTINS-NETO, Rafael Gioia. Insect/flora interactions in the brazilian

permian: possible coleopteran (Insecta) perforations in fossil stem from Itapetininga,

SP (Irati formation, Paraná basin). XXIV Encontro Anual de Etologia, Brasília, DF,

2006.

4. STUTZ-REIS, Suzana, STUTZ-REIS, Sarah, SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho

de, MARTINS NETO, Rafael Gioia. Paleotanatosis: a new and fertile field of animal

behavior research. XXIV Encontro Anual de Etologia, Brasília, DF, 2006.

5. STUTZ-REIS, Sarah, SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, MARTINS-NETO,

Rafael Gioia. “Death Behavior” (Thanatoethology) in fishes from the Santana Formation

(Lower Cretaceous, Northeast Brazil). XXIV Encontro Anual de Etologia, Brasília, DF,

2006.

6. MARTINS-NETO, Rafael Gioia; SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de.

Paleobiomecânica de gafanhotos (Insecta, Orthoptera) da formação Santana como

indicativo de distintos nichos ecológicos. Congresso de Ecologia do Brasil, Caxambu,

MG, 2007.

7. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, CRUZ-MACHADO, Sanseray da Silveira.

Ritmos biológicos: um enfoque sobre o sistema de temporização circadiana dos


mamíferos. XXXI Semana da Biologia da UFJF e XIV Mostra de Produção Científica,

Juiz de Fora, MG, 2008.

8. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, TEIXEIRA, Lívia Clemente Motta,

TOSTES, Fabiana, PETERS, Vera Maria. Influência do índice sexual da ninhada no

desenvolvimento pós-natal de crias de ratos Wistar. 12ª Semana Temática da Biologia,

IB-USP, São Paulo, SP, 2009.

9. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, FERNANDES, Pedro Augusto Magno,

TAMURA, Eduardo Koji, PETRILLI, Camila Lopes, MARKUS, Regina Pekelmann.

“TNF induces iNOS expression by pineal cells through a mechanism dependent of

NFkB. 41º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Ribeirão

Preto, SP, 2009.

10. CARVALHO-SOUSA, Cláudia Emanuele, CRUZ-MACHADO, Sanseray da

Silveira, PINATO, Luciana, TAMURA, Eduardo Koji, FERNANDES, Pedro Augusto

Carlos Magno, MARKUS, Regina Pekelmann. Pineal gland expresses TNFR1 in a

constitutive and rhythmic manner. XV Meeting of the Brazilian Society for Cell Biology,

São Paulo, SP, 2010.

11. CRUZ-MACHADO, Sanseray da Silveira, PINATO, Luciana, CARVALHO-SOUSA,

Cláudia Emanuele, TAMURA, Eduardo Koji, MARKUS, Regina Pekelmann. Evidences

for glia-pinealocytes interaction in cultured rat pineal gland. XV Meeting of the

Brazilian Society for Cell Biology, São Paulo, SP, 2010.

12. CRUZ-MACHADO, Sanseray da Silveira, PINATO, Luciana, CARVALHO-

SOUSA, Cláudia Emanuele, TAMURA, Eduardo Koji, FERREIRA, Zulma Silva,

MARKUS, Regina Pekelmann. Signaling transduction pathway involved in LPS-

Induced suppression of melatonin production by rat pineal gland. 42º Congresso

Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Ribeirão Preto, SP, 2010.

13. PETRILLI, Camila Lopes, CARVALHO-SOUSA, Cláudia Emanuele, MUXEL,

Sandra Márcia MARKUS, Regina Pekelmann, FERREIRA, Zulma Silva. PY1 receptors

stimulation on rat pineal glands effects on nuclear factor kappa B pathway (NFKB) and

inducible nitric oxide synthase (iNOS). 42º Congresso Brasileiro de Farmacologia e

Terapêutica Experimental, Ribeirão Preto, SP, 2010.


14. CARVALHO-SOUSA, Cláudia Emanuele, CRUZ-MACHADO, Sanseray da

Silveira, PINATO, Luciana, TAMURA, Eduardo Koji, FERNANDES, Pedro Augusto

Carlos Magno, MARKUS, Regina Pekelmann. Pineal gland is instrumented to be an

integral player of innate immune response. 42º Congresso Brasileiro de Farmacologia e

Terapêutica Experimental, Ribeirão Preto, SP, 2010

.

Publicações

1. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, CRUZ-MACHADO, Sanseray da Silveira,

TAMURA, Eduardo Koji. Os ritmos circadianos e a reprodução em mamíferos. Boletim

do Centro de Biologia da Reprodução. 27 (1/2): 15-20, 2008.

2. SOUSA, Cláudia Emanuele Carvalho de, TEIXEIRA, Lívia Clemente Motta,

TOSTES, Fabiana, PETERS, Vera Maria. Proporção sexual da ninhada e

desenvolvimento ponderal de crias de ratos Wistar: dados preliminares. Revista

Interdisciplinar de Estudos Experimentais - Animais e Humanos. 1 (2): 82-83, 2010.

3. CRUZ-MACHADO, Sanseray da Silveira, CARVALHO-SOUSA, Cláudia

Emanuele, TAMURA, Eduardo Koji, et al. TLR4 and CD14 receptors expressed in rat

pineal gland trigger NFKB pathway. Journal of pineal research. 49 (2): 183-92, 2010.

Submetido: Claudia E Carvalho-Sousa, Sanseray S Cruz-Machado, Eduardo K Tamura, Pedro

ACM Fernandes, Luciana Pinato, Sandra M Muxel, Érika Cecon, Regina P. Markus.

Molecular basis for defining pineal gland and pinealocytes as targets for tumor necrosis

factor (TNF). Frontiers in Cellular Endocrinology (Dezembro, 2010).

PREMIAÇÃO

1. 3º lugar na categoria Melhor Trabalho de Iniciação Científica

Evento: XXIV Encontro anual de Etologia, Brasília, 2006

Trabalho: Paleotanatosis: a new and fertile field of animal behavior research


2. Menção Honrosa

Evento: Mostra Científica da Universidade Federal de Juiz de Fora

Projeto de Iniciação Científica: Paleoartropodofauna do Cretáceo Brasileiro

3. Menção Honrosa

Evento: 41º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Ribeirão

Preto, 2009.

Trabalho: TNF induces iNOS expression by pineal cells through a mechanism

dependent of NFkB

4. Menção Honrosa: Semifinalista na Categoria Jovem Pesquisador-Mestrado.

Evento: XV Meeting of the Brazilian Society for Cell Biology, São Paulo, 2010.

Trabalho: Pineal gland expresses TNFR1 in a constitutive and rhythmic manner

ORGANIZAÇÃO DE EVENTOS /ATIVIDADES COMPLEMENTARES

1. Comissão Organizadora da I Mostra de Paleobiodiversidade

Duração: 16 a 20 de outubro de 2006

Instituto de Ciências Biológicas


4. Aula ministrada no VI Curso de Inverno: Tópicos Avançados de Fisiologia

Tema: Introdução à Cronobiologia

Instituto de Biociências

Julho/2009

5. Comissão Organizadora do VII Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia

Comparativa


Duração: 5 a 23 de julho, 2010.

CURSOS

Cursos de curta duração

1. Curso de processamento de imagens com o programa Image J

XV Meeting of the Brazilian Society for Cell Biology

Período: 21-23 de julho

Carga Horária: 18h

2.Writing a Scientific Paper: Theory and Practice

Sociedade Brasileira de Farmacologia e terapêutica experimental

18 a 21 de outubro de 2010

Cursos de Longa Duração

2. IV Curso de Inverno- Tópicos em Fisiologia Comparativa

Departamento de Fisiologia do Instituto de Biociências

Universidade de São Paulo (USP)

Duração: 10 a 27/07/2007

Carga Horária: 80h

3. XVII Curso de Verão em Fisiologia e Farmacologia “Prof.Wilson Teixeira

Beraldo”

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)

Duração: 14 a 25/01/2008

Carga Horária: 80h


4. Curso “Desenho Experimental e Determinação Amostral com Animais de

Laboratório”

Centro de Biologia da Reprodução


Dra. Adela Rosenkranz- Universidade de Buenos Aires, Argentina

Carga Horária: 40h

ESTÁGIOS

1. Estágio Curricular I em Zoologia/ Iniciação Científica

Projeto: Paleoartropodofauna do Cretáceo Brasileiro

Orientador: Rafael Gioia Martins Neto

Programa de Pós - Graduação em Biologia e Comportamento Animal


Período: 10/2005 a 10/2007

2. Bolsista do Programa de Treinamento Profissional em Biologia da Reprodução

Projeto: Treinamento Profissional em boas práticas aplicadas às atividades de Biotério

do Centro de Biologia da Reprodução.

Orientadora: Vera Maria Peters



Período: 04/2007 a 03/2008

3. Estágio Curricular II em Biologia da Reprodução

Tema: Fatores que interferem no desenvolvimento pós-Natal de crias de ratos Wistar

Orientadora: Vera Maria Peters




Período: 03/2008 – 07/2008

4. Estágio de Férias em Cronofarmacologia

Projeto: Estudo do Eixo Imune-Pineal

Orientadora: Regina P. Markus

Laboratório de Cronofarmacologia

Departamento de Fisiologia - IB

Universidade de São Paulo-USP

Período: Fevereiro de 2008; Julho de 2008

5. Bolsista do Programa de Treinamento Profissional em Morfologia

Projeto: Treinamento Profissional em Práticas e Técnicas em Histologia

Orientador: Rogério Estevam Farias

Departamento de Morfologia


Período: 05/2008 a 12/2008

120 XI. Anexos

XI. ANEXOS

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