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ENQUALAB-2006 - Congresso e Feira da Qualidade em Metrologia Rede Metrolgica do Estado de So Paulo - REMESP 30de maio a 01de junho de 2006, So Paulo, Brasil

COMO INICIAR A VALIDAO DE MTODOS ANALTICOSAndria de Paula Silva1, Mriam C. Carvalho Alves21

Laboratrio de Ensaios Fsico-Qumicos em Alimentos, Escola SENAI Mario Amato, So Bernardo do Campo-SP, Brasil, labalimentos@sp.senai.br 2 Environ Cientfica Ltda., So Bernardo do Campo-SP, Brasil, miriam_coutinho@ig.com.brisso, estabelecem-se nveis de exigncia que podem definir a aprovao do produto ou espcie em estudo. Para tanto, fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para demonstrar que os mtodos que utilizam conduzem a resultados confiveis, que garantam qualidade, idoneidade e credibilidade de seus produtos e/ou servios. importante enfatizar que qualquer alterao de mtodos normalizados implica em revalidar o mtodo [2]. Ao empregar mtodos de ensaios qumicos emitidos por rgo de normalizao, organizaes reconhecidas na sua rea de atuao ou publicados em livros e/ou peridicos de grande credibilidade na comunidade cientfica, o laboratrio precisa demonstrar que tem condies de aplicar de maneira adequada estes mtodos normalizados, dentro das condies especficas existentes nas suas instalaes antes de implant-los. Como os mtodos normalizados so mtodos validados, no necessrio realizar o processo completo de validao, desde que no ocorram alteraes significativas dos mesmos. Entretanto, a conformidade dos mtodos normalizados utilizados deve ser verificada sob condies reais de uso. responsabilidade do laboratrio verificar se as caractersticas de desempenho prescritas no mtodo oficial podem ser obtidas. A validao deve ser efetuada aps seleo, desenvolvimento, e otimizao dos mtodos. O procedimento operacional padro deve ser claro, objetivo e completo de acordo com a norma ISO 78 -2, e aprovado, autorizado e revisado pelo grupo de garantia da qualidade da empresa. A documentao da validao deve conter ainda, especificao dos requisitos, caractersticas de desempenho obtidas, critrios de aceitao dos valores obtidos das caractersticas de desempenho em comparao com os requisitos, e a afirmao da validade dos resultados quanto ao atendimento das necessidades do problema analtico. O uso de testes estatsticos adequados (t de Student, Fisher, Cochran, Grubbs, ANOVA, testes de hipteses) torna as decises menos subjetivas o que faz com que o processo de validao de mtodos analticos seja mais objetivo, mais fcil de demonstrar e implementar. 4

Resumo: A validao de mtodos analticos determina o desempenho caracterstico de um mtodo, partindo-se da avaliao de parmetros como exatido, preciso, seletividade, linearidade e faixa de trabalho, limites de deteco e quantificao, variaes intra-laboratoriais e inter-laboratoriais. Este estudo teve como objetivo demonstrar como avaliar e obter dados preliminares para a validao de um mtodo titulomtrico para determinao de acidez em gua, utilizando-se ensaios de proficincia baseados nas normas DOQ-CGCRE-008 (INMETRO: 2003), Guia EURACHEM verso Brasileira (QUAM 2002) e ISO/IEC 17025 (NBR:2001). A validao apresenta importncia fundamental para laboratrios que buscam um rigoroso programa de Garantia de Qualidade e realizam periodicamente avaliao de seu desempenho. Palavras chave: Validao, mtodos analticos. 1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GERAL Esse trabalho tem por objetivo enfatizar a importncia da validao de mtodos anliticos para laboratrios que desejam a acreditao pelo INMETRO, segundo a norma NBR ISO/IEC 17025; demonstrando a seqncia de planejamento e parmetros necessrios validao. 1.2 OBJETIVO ESPECFICO Exemplificar experimentalmente a avaliao de dados preliminares para a revalidao de um mtodo titulomtrico de determinao de acidez em gua, partindo-se da alterao de um mtodo normalizado. 2. INTRODUO

A validao de mtodos analticos comprova atravs de evidncias objetivas que requisitos para uma determinada aplicao ou uso especfico so atendidos [1]. Pode ser definida como o processo que confere validade a um mtodo analtico, instrumento ou equipamento, cujas especificaes so aceitas como corretas, conferindo confiabilidade aos resultados obtidos. 2,3 Ter validado um resultado significa que o procedimento, que inclui desde as condies de operao do equipamento at toda a seqncia analtica, seja aceito como correto. Para

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O planejamento e a execuo da validao seguem a seqncia de trabalho abaixo: Definir a aplicao, objetivo e escopo do mtodo; Definir os parmetros de desempenho e critrios de aceitao; Desenvolver um procedimento operacional para validao; Definir os experimentos de validao; Verificar se as caractersticas de desempenho do equipamento esto compatveis com o exigido pelo mtodo em estudo; Qualificar os materiais, por exemplo, padres e reagentes; Executar os experimentos preliminares de validao; Ajustar os parmetros do mtodo e/ou critrios de aceitao, se necessrio; Executar experimentos completos de validao; Preparar um procedimento operacional para execuo do mtodo, na rotina; Definir critrios de revalidao (por exemplo, mudanas de pessoal, condies ambientais, equipamentos, periodicidade, etc), e Definir tipo e freqncia de verificaes de controle da qualidade analtica para a rotina [1-2]. 3. PRINCPIOS DA VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS

americana USP 24 (Seo de Ensaios Gerais ) apresenta sugestes para a validao de mtodos analticos oficiais. Apresenta tambm um sumrio das caractersticas de desempenho requeridas para os vrios tipos de mtodos de ensaios. Sendo assim os mtodos normalizados so aqueles desenvolvidos por um organismo de normalizao ou outras organizaes, cujos mtodos so aceitos pelo setor tcnico em questo,e mtodo no normalizado aquele desenvolvido pelo prprio laboratrio ou outras partes, ou adaptado a partir de mtodos normalizados e validados [34]. 4. DOCUMENTAO DE MTODOS VALIDADOS

Uma vez cumpridas todas as etapas do processo de validao, importante documentar os procedimentos de forma que o mtodo possa ser implementado de maneira clara e sem ambigidades. A documentao apropriada auxilia na aplicao consistente do mtodo, j que, uma vez implantado o mtodo, ele ser sempre executado conforme descrito; caso contrrio o desempenho real do mtodo no ir corresponder quele previsto nos dados de validao. Documentaes que registrem etapas da validao so necessrias tambm para fins de avaliao e podem ser exigidas por razes contratuais ou at mesmo por organismos regulamentadores. A sistemtica de controle de documentos do laboratrio deve permitir a retirada de circulao dos documentos obsoletos e emisso de mtodos revisados. As alteraes devem ser realizadas somente por pessoas autorizadas. A Norma NBR ISO/IEC 17025 estabelece requisitos para o controle de documentos[2-3]. 5. PARAMETROS DE VALIDAO [1-3-5]

Uma forte infra-estrutura internacional de medies est sendo implementada, para isso h necessidade progressiva de dados analticos comparveis e consistentes, para a eliminao de barreiras tcnicas entre os pases. Para atingir este processo de reconhecimento mtuo em nvel internacional devem ser observados requisitos legais, de certificao e de acreditao, ou seja, uma vez efetuada a medio esta aceita em qualquer pas. As normas internacionais (ISO, USP, FDA, AOAC, NATA, ASTM) e sistemas da qualidade (Boas prticas de laboratrio; ISO/IEC 17025) requerem a validao de mtodos analticos e a documentao do trabalho de validao, para a obteno de resultados confiveis e adequados ao uso pretendido. Portanto existem fortes razes, legais, tcnicas e comerciais, que justificam a validao de mtodos analticos. Os mtodos analticos usados para avaliao da qualidade de produtos, tais como, farmacuticos, alimentcios, cosmticos, agro-qumicos, esto sujeitos a vrios requisitos legais e normativos. Segundo requisitos da norma 21 CFR 211.194 (a) (2), os mtodos de ensaios usados para avaliar a conformidade destes produtos com especificaes estabelecidas devem atingir padres adequados de exatido, preciso e confiabilidade. A norma NBR ISO/IEC 17025 especifica o requisito tcnico - "Validao de mtodos analticos". A farmacopia

Para validar um mtodo faz-se necessria a aplicao dos parmetros: Especificidade e Seletividade; Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho; Linearidade; Sensibilidade; Limite de deteco; Limite de quantificao; Exatido e tendncia (bias); Preciso; Robustez; Incerteza de medio. 5.1 Especificidade e Seletividade a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto especfico independente da matriz da amostra e de suas impurezas. Para anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio demonstrar a capacidade de seleo do mtodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela obteno de resultados positivos em amostras contendo o analito, comparativamente com resultados negativos obtidos com amostras que no contm o analito, contendo estruturas semelhantes. A especificidade e a seletividade esto relacionadas ao evento da deteco. A especificidade refere-se a um mtodo especfico para um nico analito e a seletividade refere-se a um mtodo utilizado para vrios analitos com capacidade de distino entre eles.

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5.1.1 Testes de Especificidade Os testes de especificidade tm como objetivo determinar os componentes que precisam ser analisados na amostra, para isso, necessrio definir a matriz, assim com os possveis interferentes. Para anlise quantitativa (teor) e anlise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparao dos resultados obtidos de amostras contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou amostras no contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste no afetado por esses materiais. 5.1.2 Testes de Seletividade A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medio pelo detector selecionado, sem causar um sinal visvel no teste de especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito tambm pode depender da concentrao. Para fazer o teste de seletividade podem ser utilizados diversos testes, depende da disponibilidade do analito, da matriz sem o analito e de amostras de referncia nas concentraes de interesse. Podem ser aplicados os teste F (Snedecor) de homogeneidade de varincias e o teste t (Student) de comparao de mdias. De incio, parte-se da hiptese em que a matriz no afeta o sinal do analito em nveis de concentrao elevados ou acima da faixa. Preparam-se dois grupos de amostras de teste, um com a matriz e o outro sem a matriz, ambos os grupos com a concentrao do analito idntica em cada nvel de concentrao de interesse. O nmero de amostras paralelas em cada nvel de concentrao deve ser maior ou igual a 7 (sete) para permitir o uso adequado dos modelos estatsticos e proporcionar uma comparao vlida. Com os valores obtidos nos dois grupos de amostras calculase o teste F e compara-se o valor do teste F com o valor do teste F tabelado. Se o valor do teste F calculado for menor que o valor do teste F tabelado, a matriz no tem efeito significativo sobre a preciso do mtodo, caso contrrio a matriz interfere na preciso do mtodo. O teste t (Student) deve ser calculado e comparado com o teste t tabelado, caso o valor o calculado seja menor que o valor do teste t tabelado, a matriz no tem efeito significativo sobre o ensaio, caso contrrio a matriz tem efeito estatisticamente significante sobre o resultado do ensaio. O teste t de Student pode ser utilizado como fator decisivo caso o teste F calculado tenha um valor maior que o teste F tabelado, porm o teste t sempre deve ser calculado independente do resultado do teste F. 5.2 Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho Em qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do analito no qual o mtodo pode ser

aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos limites de deteco e de quantificao e os ltimos dependem do sistema de resposta do equipamento de medio. A faixa linear definida como a faixa de concentraes na qual a sensibilidade pode ser considerada constante e so normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado obtido pelo mtodo analtico. Para escolher a faixa de trabalho procede-se da seguinte maneira: quando se tem uma amostra especfica, a concentrao esperada deve se situar no meio da faixa de trabalho e quando a concentrao do analito desconhecida utiliza-se a faixa de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos tm que estar dentro da faixa de trabalho, e os valores medidos prximos ao limite inferior da faixa de trabalho ter que ser diferente dos brancos dos mtodos. 5.2.1 Mtodos para determinao da Faixa de Trabalho e Faixa Linear Para determinao da faixa de trabalho e faixa linear podese usar um mtodo com 3 etapas: 1 etapa: Passar sete ou mais vezes o branco com adio de concentraes variadas do analito preparados de forma independente. Colocar no eixo x as concentraes do analito e no eixo do y as respostas das medies. Objetivo: identificar por observao visual, a faixa linear aproximada e o limite superior e inferior da faixa de trabalho. 2 etapa: Passar sete ou mais vezes materiais de referncia (diferentes concentraes), na faixa linear e branco da amostra com adio de concentraes variadas do analito, na faixa linear. Colocar no eixo x as concentraes do analito e no eixo do y as respostas das medies; Verificar visualmente a existncia de dispersos que possam interferir na regresso; Calcular o coeficiente de regresso linear; Calcular e fazer o grfico dos valores dos resduos (resduo a diferena entre o valor observado e o valor calculado pela equao da reta de regresso para cada valor de x); A distribuio aleatria em torno da linha reta confirma a linearidade; Tendncias sistemticas indicam a no linearidade. Objetivo: determinar a faixa de trabalho e confirmar a linearidade. 3. Etapa: Passar sete vezes o branco da amostra com adio de concentraes variadas do analito, prximas ao LD. Expressar o LQ como a concentrao mais baixa do analito que pode ser determinada com um nvel aceitvel de incerteza. Objetivo: determinar o Limite de Quantificao (LQ), que efetivamente forma o limite mais baixo da faixa de trabalho. 5.3 Linearidade

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a capacidade de uma metodologia analtica demonstrar que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica (equao da regresso linear) usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na amostra real. O coeficiente de correlao linear (r) freqentemente usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo matemtico. Um valor maior que 0,90 , usualmente, requerido. O mtodo pode ser considerado como livre de tendncias (unbiased) se o corredor de confiana da reta de regresso linear contiver a origem. 5.4 Sensibilidade Sensibilidade um parmetro que demonstra a variao da resposta em funo da concentrao do analito. Pode ser expressa pela inclinao da curva de regresso linear de calibrao, e determinada simultaneamente aos testes de linearidade. A sensibilidade depende da natureza do analito e da tcnica de deteco utilizada. 5.5 Limite de Deteco Limite de deteco a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectada, porm no necessariamente quantificada, sob as condies experimentais estabelecidas. No caso de mtodos no instrumentais (CCD, titulao, comparao de cor), esta determinao pode ser feita visualmente, onde o limite de deteco o menor valor de concentrao capaz de produzir o efeito esperado (mudana de cor, turvao, etc). E no caso de mtodos instrumentais (CLAE, CG, absoro atmica), a estimativa do limite de deteco pode ser feita com base na relao de 3 vezes o rudo da linha de base. 5.5.1. Determinao de Limite de Deteco (LD) Para determinao do LD analisam-se 7 ou mais amostras em branco e calcula-se o LD = x + ts onde x a mdia dos valores das amostras em branco e s o desvio padro das amostras em branco. A mdia e o desvio padro so dependentes da matriz e vlido somente quando os valores das amostras em branco apresentarem um desvio padro diferente de zero. Pode ser determinado tambm analisando-se sete ou mais amostras em branco com a adio da menor concentrao aceitvel do analito e calcula-se LD = 0 + ts onde: s = desvio padro das amostras em branco com adio. A menor concentrao aceitvel aquela tida como a concentrao mais baixa para a qual um grau aceitvel de incerteza pode ser alcanado. 5.6 Limite de Quantificao a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com preciso e exatido aceitveis sob as

condies experimentais estabelecidas. Onde o limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues contendo concentraes decrescentes do analito at o menor nvel determinvel com preciso e exatido aceitveis. O Limite de Quantificao refere-se concentrao do analito correspondente ao valor da mdia das amostras em branco mais 5, 6 ou 10 desvios padro ou pode corresponder ao padro de calibrao de menor concentrao descontando o branco. 5.6.1 Determinao do Limite de Quantificao (LQ) Para determinao do LQ analisa sete vezes a amostra em branco e calcula LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s, onde X = Mdia dos valores dos brancos e s = Desvio padro dos brancos, onde a obteno do branco verdadeiro pode ser difcil. Ou pode ser determinado analisando-se sete brancos com adio de concentraes variadas do analito, prximas ao LD. Que para clculos pode-se: Medir, uma vez cada 7 replicatas independentes a cada nvel de concentrao; Calcular o desvio padro s do valor do analito, para cada concentrao; Fazer o grfico s versus concentrao e atribuir um valor para o LQ, por inspeo; Expressar o LQ como a concentrao mais baixa do analito que pode ser determinada com um nvel aceitvel de incerteza. Onde o LQ faz parte do estudo para determinao da faixa de trabalho. 5.7 Exatido e Tendncia (Bias) A exatido de um mtodo analtico verificada quando so obtidos resultados muito prximos em relao ao valor verdadeiro, a exatido calculada como porcentagem de recuperao da quantidade conhecida do analito adicionado amostra, ou como a diferena porcentual entre as mdias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiana. A exatido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mnimo, 9 (nove) determinaes contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada. A tendncia implica numa combinao de componentes de erros aleatrios e sistemticos, onde a determinao da tendncia total com relao aos valores de referncia apropriados importante no estabelecimento da rastreabilidade aos padres reconhecidos. A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica (valor observado / valor esperado). A tendncia deve ser corrigida ou demonstrada ser desprezvel, mas em ambos os casos, a incerteza associada com a determinao da tendncia

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permanece como um componente essencial da incerteza global. Os processos normalmente utilizados para avaliar a exatido de um mtodo so, dentre outros: uso de materiais de referncia, participao em comparaes interlaboratoriais e realizao de ensaios de recuperao. 5.7.1 Materiais de referncia certificados (MRC) Os materiais de referncia certificados so utilizados no processo de validao de um mtodo de ensaio para avaliar o desempenho do laboratrio, por isso o fornecimento de MRC realizado por organismos reconhecidos e confiveis, como por exemplo, NIST, LGC, dentre outros. Na avaliao da exatido utilizando um material de referncia, os valores mdios obtidos pelo laboratrio e o desvio padro de uma srie de ensaios em replicata, devem ser comparados com os valores certificados do material de referncia, para esta comparao podem ser utilizados: Erro relativo (ER); Teste de hipteses; ndice z (z Score); Erro normalizado; 5.7.2 Comparaes interlaboratoriais Busca mostrar o desempenho do laboratrio em; estabelecer a eficcia e a comparabilidade de novos mtodos de ensaio ou de medio; monitorar mtodos estabelecidos e determinar as caractersticas de desempenho de um mtodo, geralmente conhecido como processos colaborativos que uma forma de ensaio para avaliar o desempenho de um mtodo nas condies normais de trabalho em vrios laboratrios, atravs de ensaio de amostras homogneas preparadas cuidadosamente. 5.7.3 Comparao de mtodos Tem como objetivo estudar o grau de proximidade dos resultados obtidos pelos diferentes mtodos de ensaio comparando os resultados obtidos utilizando um mtodo interno e um mtodo de referncia, que busca avaliar a exatido do mtodo interno relativamente ao de referncia. 5.8 Preciso A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra, onde as duas formas mais comuns de express-la so por meio de repetitividade e reprodutividade expressa pelo desvio padro. A preciso geralmente expressa como desvio padro ou desvio padro relativo. Ambas repetitividade e reprodutibilidade so geralmente dependentes da concentrao do analito e, deste modo, devem ser determinadas para um diferente nmero de concentraes; em casos relevantes, a relao entre preciso e concentrao do analito deve ser estabelecida. Neste caso o desvio padro

relativo pode ser mais til, pois foi normalizado com base na concentrao e deste modo ele praticamente constante ao longo da faixa de interesse, contanto que esta no seja muito extensa. 5.8.1 Repetitividade Repetitividade a preciso intra-corrida, ou seja o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas, efetuadas sob as mesmas condies de medio. Todas as medies com o mesmo procedimento; mesmo analista; mesma instrumentao, dentro de um curto perodo de tempo. A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio da anlise de padres, material de referncia ou adio ao branco de vrias concentraes da faixa de trabalho. A partir do desvio padro dos resultados dos ensaios sob condio de repetitividade, calcula-se o limite de repetitividade r que capacita o analista a decidir se a diferena entre anlises duplicatas de uma amostra significante para um nvel de confiana de 95%. 5.8.2 Reprodutibilidade Reprodutibilidade a preciso interlaboratorial, ou seja, o grau de concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes como em estudos colaborativos. Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao de mtodo executado por um nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio busca a verificao do desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos atravs de comparao interlaboratorial. A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite de reprodutibilidade R, o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da duplicata das amostras analisadas sob condies de reprodutibilidade significante. 5.8.3 Preciso intermediria Preciso intermediria a preciso intercorridas, ou seja, refere-se concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a determinao da preciso intermediria recomenda-se um mnimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. Existem vrios mtodos para determinao e controle desse parmetro de qualidade, como por exemplo, por meio de grfico de controle de amplitude, que podero ser aplicados para replicatas de amostra e para padres estveis ao longo do tempo. Um mtodo simplificado para estimar intermediria baseia-se na execuo de: uma mesma amostra; amostras supostamente idnticas; padres. a preciso

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5.8.4 Comparao da preciso entre mtodos A preciso de um mtodo analtico pode ser expressa como o desvio padro ou desvio padro relativo de uma srie de medidas. Quando se pretende avaliar se dois mtodos (A e B) tm diferenas significativas entre si, em termos de preciso, pode-se recorrer ao teste F. Este se baseia no clculo da razo entre as varincias dos dois mtodos (Fcal = SA/SB), colocando-se a maior no numerador, de modo que a razo seja maior ou igual a um. Em seguida, compara-se este valor obtido com o valor tabelado de F. Se Fcalculado Ftabelado, os dois mtodos no apresentam diferenas significativas entre si, relativamente s suas precises. 5.8.5 Recuperao A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo menos trs diferentes concentraes. A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est necessariamente na mesma forma que apresente na amostra. A presena de analitos adicionados em uma forma mais facilmente detectvel pode ocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao. 5.8.6 Mtodo de determinao de Repetitividade e Reprodutibilidade Analisar 7 Padres, materiais de referncia ou amostras de branco fortificadas a vrias concentraes ao longo da faixa de trabalho. Com mesmo analista, equipamento, laboratrio, em um perodo curto de tempo. Determinar o desvio-padro (s) da repetitividade de cada concentrao; Analistas e equipamentos diferentes, mesmo laboratrio, perodo estendido (preciso intermediria). Determinar o desvio-padro da reprodutibilidade intralaboratorial de cada concentrao. Analistas, equipamentos e laboratrios diferentes, perodo estendido. Determinar o desvio-padro da reprodutibilidade interlaboratorial de cada concentrao. 5.9 Robustez A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer quando esse est sendo executado. Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden. Trata-se de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for robustez de um mtodo, maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso.

5.10. Incerteza de Medio Os estudos de validao e o seu acompanhamento que deve ser feito de acordo com a rotina do laboratrio, produzem dados de desempenho global do mtodo e fatores de influncia individuais que podem ser aplicados estimativa da incerteza associada aos resultados do mtodo em rotina. Atravs desses dados possvel calcular as variaes sofridas pelo mtodo e determinar a incerteza, ou seja, quanto o meu resultado vai variar para mais ou para menos numa determinada faixa de trabalho com uma determinada matriz. Aps essa etapa, o mtodo pode ser considerado validado e passar para o processo de acreditao, onde todos os parmetros da validao sero avaliados pelo rgo certificador responsvel. A manuteno da validao do mtodo tambm ser analisada atravs do uso de padres de verificao e de participao em estudos interlaboratoriais [1-3-5]. 6. PARTE EXPERIMENTAL

Para exemplificar o processo de validao, foram aplicadas algumas alteraes no mtodo 2310 do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater titulomtrico para determinao de acidez em gua, conforme abaixo: Uso exclusivo do indicador fenolftalena 1% (m v-1); Extenso da faixa de trabalho (de 50 a 1000 mg de CaCO3 L-1); Acondicionamento da amostra com cido sulfrico 0,02N. A revalidao do mtodo necessria para verificar se as alteraes feitas no modificam o desempenho do mtodo. A validao desse mtodo foi feita para a matriz de gua potvel, visando restringir os estudos sobre o efeito da matriz. Como em toda a validao, foram adotados alguns critrios para melhor compreenso e efetuao dos clculos, deixando claro que esse trabalho visa indicar um caminho e no uma regra para a validao de mtodos de ensaio qumico. Durante os clculos a constante k que um fator de cobertura, ou seja, fator de confiana; igual a 2, o que significa que o nvel de confiana de 95%. Este fator de 95% o mais utilizado em laboratrios qumicos e metrolgicos, porm em outros tipos de laboratrio esse fator pode ser alterado de acordo com o nvel de confiana que se deseja alcanar. Outro fator que deve ser definido a temperatura do ambiente onde sero realizadas as anlises. No caso deste trabalho, adotou-se 22C + 2C; esse valor no casual, foi escolhido devido calibrao do material volumtrico a 20C e, por esse motivo, a temperatura ambiente foi mantida na faixa de 20 a 24C onde a variao da densidade da gua e da dilatao do vidro so considerados constantes [3].

14Conc. em mg de CaCO3 .L-1 (mdia dos valores) 299,47 349,48 400,92 449,51 501,67 550,26 600,27 651,72 700,30 750,32 801,04 850,35 901,07 952,52 999,68

7.

PRINCPIO DO MTODO [8]

Conc. em mg CaCO3.L-1 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 Continuao da tabela 1.

A acidez da gua esta diretamente relacionada aos ons de hidrognio presentes na amostra, como resultado da dissociao ou hidrlise de solutos e a sua capacidade de reao com uma soluo padro de uma base forte adicionada amostra. O valor da acidez depende do valor de pH adotado como ponto final ou do indicador utilizado, o valor encontrado pode variar significativamente de acordo com o valor de pH utilizado na determinao como ponto final. A acidez a medio de uma propriedade agregada gua que pode ser interpretada de em termos especficos onde a composio da amostra conhecida. Minerais fortemente cidos, cidos fracos como o carbnico e o actico, e sais hidrolisados como sulfatos de ferro ou alumnio tambm contribuem para a determinao de acidez segundo este mtodo. Essa determinao pode refletir a qualidade da gua. 7.1 Reagentes e Materiais: Os materiais e os reagentes utilizados para a realizao dos ensaios so controlados e obedecem aos critrios estabelecidos pelo mtodo de anlise, assim como as solues requeridas por ele. 7.2 Determinao de Acidez da gua800,00

Faixa de Trabalho e Faixa de LinearidadeAcidez1200,00 R2 =1

1000,00

Pipetou-se 100mL de amostra ou padro e transferiu-se para um erlenmeyer de 250mL, adicionou-se 5mL de soluo de cido sulfrico 0,02N e 5 gotas de perxido de hidrognio 30% (v.v-1), aqueceu-se por 5 minutos. Resfriou-se at a temperatura ambiente e adicionou-se 5 gotas da soluo de fenolftalena 1% (m v-1), titulando-se com a soluo de hidrxido de sdio 0,1N at o ponto final indicado pela colorao rosa (primeiro tom de rosa). Efetuar a prova em branco com gua tipo I [8]. Determinao de acidez Acidez mg CaCO3 .L-1 = [( A x B ) ( C x D )] x 50000 mL de amostra Onde: A= Volume gasto de hidrxido de sdio 0,1N (mL); B= Normalidade real do hidrxido de sdio 0,1N; C= Volume adicionado de cido sulfrico 0,02N (mL); D= Normalidade real do cido sulfrico 0,02N. 7.3 Valores Experimentais: Tabela 1: Mdia dos resultados obtidos utilizando-se a faixa estendida "com a matriz".Conc. em mg CaCO3.L-1 Branco 50 100 150 200 250 Conc. em mg de CaCO3 .L-1 (mdia dos valores) 1,52 49,39 100,83 149,42 200,15 250,88

600,00

400,00

200,00

0,00 0 200 400 600 800 1000 1200

C on c e nt r a e s d o A n a l i t o

Figura 1: Curva linear, utilizando os valores mdios das concentraes encontradas a partir das mdias das concentraes dos padres analisados com a "matriz" descontando o branco.

Equao da linha de tendncia da curva: y = ax + b Onde: y = Resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.); x = Concentrao; a = Inclinao da curva de calibrao = sensibilidade; b = interseo com o eixo y, quando x = 0. A equao da reta (equao de regresso) do grfico elaborado com as mdias dos resultados obtidos foi: y = 1,0008x + 0,1218; e o coeficiente de correlao linear, tambm chamado de R foi igual a 1.

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Tabela 2: Parmetros para avaliao da sensibilidadeConc. em mg de CaCO3 .L-1 (mdia dos valores) xmedido 1,52 49,39 100,83 149,42 200,15 250,88 299,47 349,48 400,92 449,51 501,67 550,26 600,27 651,72 700,30 750,32 801,04 850,35 901,07 952,52 999,68 Valores calculados xcalculado 1,40 49,23 100,63 149,18 199,87 250,56 299,11 349,08 400,48 449,03 501,15 549,70 599,67 651,08 699,62 749,60 800,28 849,55 900,23 951,64 998,76 Resduo R=A-B 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40 0,44 0,48 0,52 0,56 0,60 0,64 0,68 0,72 0,76 0,80 0,84 0,88 0,92 sr tcalculado 1,31 1,72 2,16 2,57 3,00 3,44 3,85 4,28 4,71 5,13 5,57 5,99 6,41 6,85 7,27 7,69 8,12 8,54 8,98 9,42 9,82

Limite de Quantificao (LQ): Onde: LQ = X + 10s X = mdia dos valores dos brancos; s = desvio padro dos brancos.

8.

CONCLUSO

0,25

Analisando-se os aspectos abordados neste trabalho, evidencia-se a importncia da validao da metodologia analtica aplicada em laboratrio, uma vez que assegura-se a confiabilidade dos resultados obtidos, delegando qualidade aos produtos e/ou servios prestados, alm de reconhecimento comercial. Na parte experimental, observou-se que as alteraes aplicadas no mtodo normalizado no influenciaram seu desempenho em relao a parmetros, tais como linearidade, seletividade, especificidade, faixa de trabalho, limite de deteco, limite de quantificao e sensibilidade, os quais so dados preliminares para iniciar o processo de revalidao. Partindo-se da avaliao dos parmetros acima, a etapa seguinte seria testar os demais parmetros, que so: robustez, repetitividade, reprodutibilidade, preciso intermediria, comparao com outros mtodos e recuperao e etc, prosseguindo ao estudo do clculo de incerteza e, por fim, a acreditao do mtodo. 9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Clculo dos desvios de linearidade(t): tcalculado = resduo sr n Onde: resduo = xmedido - xcalculado sr = desvio padro dos resduos; n = numero de pontos.

Sensibilidade: S = dx dc S=a Onde: S = sensibilidade; a = inclinao da curva de calibrao; dx = variao da resposta; dc = variao da concentrao. Logo: a = 1,0008 S = 1,0008

[1] NBR ISO/IEC 17025:2001. Requisitos Gerais para a Competncia de Laboratrios de Calibrao e de Ensaios. ABNT. RJ. Brasil. [2] LEITE, Flvio - Validao em Anlise Qumica Editora tomo, 1996. [3] Guia EURACHEM. Primeira Edio do Guia EURACHEM/ CITAC, 2 ed.,2000. Determinando a Incerteza na Medio Analtica. QUAM 2002. Verso Brasileira. [4] BARROS,C & HIRATA,Y, 2002. Apostila do Curso Estimativa da Incerteza nas Medies Laboratoriais Rev.02 - Outubro/ 2002. CPTI.So Paulo. SP. [5] COSTA NETO, Pedro Luiz de Oliveira - Estatstica - 2 edio, editora Edgard Blcher Ltda., 2002. [6] KELLY, William D. - Basic Statistics for Laboratories Ed. Van Nostrand Reynolds, 1991. [7] ISO/ IEC 17025:1999. General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories. 1999. International Organization for Standardization. ISO, Geneva. Switzerland. [8] Mtodo 2310-Acidity - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater -20Th Edition, 1998.

Tabela 3: Parmetros para avaliao do limite de detecoConcentrao real do Branco mg CaCO3.L-1 X t (95%) s LD 6,51

0,09 5,09 0,09 0,09 5,09 0,09 0,09 1,52 2,447 2,04

Limite de Deteco (LD): LD = X + ts Onde: X = mdia dos valores dos brancos; t = valor da abscissa t (Student) para (1- ) x 95% nvel de confiana; s = desvio padro dos brancos (para s = 0). Tabela 4: Parmetros para avaliao do limite de quantificaoConcentrao real do Branco mg CaCO3.L-1 0,09 5,09 0,09 0,09 5,09 0,09 0,09 X 1,52 s 2,04 LQ 21,92