Como Purificar Proteínas?

Marcius S. Almeida; Eleonora Kurtenbach;

Introdução

Importância da Purificação

Estudo da atividade de uma enzima frente a substâncias passíveis de serem usadas em terapêutica;

Uso direto como medicamento (tratamento de doenças decorrentes da modificação da estrutura e/ou atividade de proteínas);

Proteoma, análise e caracterização das proteínas expressas em uma situação;

Análise da estrutura tridimensional para inferir sua atividade através de análise de homologia estrutural;

Processos de purificação

O que é: distinção das proteínas com base na seqüência de aminoácidos, no conteúdo de carboidratos e lipídios, estrutura tridimensional, e atividade biológica;

Mais utilizados: o Cromatografia em coluna de gel;o Filtração;o Adsorção;

Processos de purificação

Problema: mudança na estrutura das proteínas por ser imprevisível o seu comportamento no decorrer do processo;

Desafios hoje: o Encontrar melhores estratégias;o Adequação da metodologia;o Custo, velocidade e pureza;

Considerações Iniciais

Considerações Iniciais

Proteínas são macromoléculas frágeis e sofrem alterações físico-quimicas facilmente que levam a modificação ou perda de sua atividade;

Exemplos: o Temperatura adequar o ambiente;o Oxidação adicionar agentes redutores

(β-mercaptoetanol) ou evitar a formação de bolhas;

o Soluções muito diluídas ou concentradas;

Requerimento Inicial

Consiste na liberação dessa proteína de sua fonte natural EXTRATO BRUTO;

Obtenção do Extrato Bruto:o Trituração dos tecidos;o Lise das bactérias, das leveduras ou das

células animais provenientes da cultura;

Requerimento Inicial

Processos de Lise Celular:o Sonicação;o Variações repentinas de pressão;o Osmolaridade;o Forte agitação na presença de esferas de

vidro ou por enzimas citolíticas;

Requerimento Inicial

A proteína desejada pode estar restrita a uma organela em particular;

Purificação substancial dessa proteína:o Isolamento dessas estruturas celulares;o Centrifugação diferencial em gradiente de

sacarose;

A liberação das proteínas pode ser facilitado pelo uso de detergentes não iônicos;

Requerimento Inicial

Pode ocorrer acidentalmente a degradação química ou enzimática da proteína de interesse;

Como evitar:o São incluídos diversos aditivos:

•Agentes redutores β-mercaptoetanol;•Estabilizantes glicerol;•Inibidores de proteases EDTA;

Requerimento Inicial

Em alguns casos, esse passo inicial não é necessário;o Exemplo:

•Proteínas recombinantes levedura Pichia pastoris;

•São secretadas para o meio de cultura;

Clarificação da Amostra

Representa um grande problema;o Técnicas utilizadas são centrifugação e

filtração;

Exemplos de transtornos:o Obtenção de uma solução ainda

particulada;o Entupimento das membranas de filtração;o Manipulação de um grande volume num

tempo excessivamente longo;o Custo elevado;

Clarificação da Amostra

Solução: Resinas Cromatográficas:

o Permitem a adsorção de amostras contendo materiais particulados e/ou células;

o Sistema de Leito Expandido;

Sistema de Leito Expandido

1. Equilibrar a fase estacionária na forma expandida, com o tampão de equilíbrio;

2. Aplicar a amostra de células, no sentido de baixo para cima, no leito estabilizado;

3. Lavar a resina de baixo para cima, com o tampão de lavagem;

4. Eluir a proteína de interesse invertendo-se o fluxo pela coluna, com o leito sedimentado;

5. A coluna é limpa e regenerada para um novo uso;

Métodos de Purificação

A Escolha dos Métodos de Purificação

Planejamento de estratégias;

Esquema ideal de purificação de proteínas não depende apenas das características da proteína de interesse;

Escolha do Procedimento

A escolha do Procedimento deve considerar vários aspectos:o Estabilidade da proteína;o Aplicação final do produto;o Escala de manufatura necessária;o Eficiência do processo;o Viabilidade econômica;o Existência de facilidades;o Adequações à farmacopéia;

Processo de purificação

Linha geral de se seguir divisão em 3 fases;Fase I:

o Baixo poder de resolução;o Duas vantagens:

•Aumentar a concentração da proteína na amostra;

•Preparar amostra para cromatografia;o Utiliza-se: diálise, precipitação ou

precipitação fracionada;

Processo de purificação

Fase II:o Fase mais eficiente;o Explora as características físico-químicas

da proteína de interesse;o Compreende o uso de diferentes técnicas

de cromatografia;

Cromatografia

É a passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.

Cromatografia

Cromatografia de troca iônica:o Fase estacionária é altamente carregada

(sinal contrário da fase móvel);o Separação pela afinidade iônica;

Cromatografia de fase reversa:o Fase estacionária grupamentos

hidrofóbicos (hidrocarbonetos);o Separação pela interação com a fase

móvel; Cromatografia de afinidade:

o Fase estacionária ligantes específicos;o Separação pela ligação específicas;

Processo de Purificação

Fase III: Fase Final;o Retira contaminantes:

•Liofilização;•Diálise;•Ultracentrifugação;

o Psd1 e Psd2 -> defensinas liofilizadas - acetonitrila e ác. Trifluoracético

Deve-se considerar

Técnicas: o Diferentes propriedades físico-químicas

das proteínas;Atividade:

o Método + simples e sensível; Quantidade:

o Absorção de luz (faixa UV);o Azul de Coomassie;o Sulfato de cobre II;

Deve-se considerar

Purificação:o Pode ser acompanhada usando-se Ac.

Específicos;o Dot Blotting e Western Blotting;

Aumentar a seletividade e resolução no decorrer do processo;

Manter o processo simples;

Quantificação da Pureza

Quantificação da pureza

Sequênciamento peptídico automático;

Espectrometria de massa;

Ressonância magnética nuclear de alta resolução;

Procedimento mais comum

Eletroforese - Impregnação de prata:o Separação por peso molecular

Eletroforese Bidimensional:o Peso molecular e ponto isoelétrico

Cromatografia em coluna: o Ótima confiabilidade

Conclusão

Não existe um protocolo definido para purificação de proteínas;

É preciso desenvolver um protocolo específico – diversos métodos;

Obrigada!!!

Obrigada!!!

Hesther Bousquet; Maína Terra; Mayara Martins; Nígela RodriguesBiomedicina – 6º Período