COMPORTAMENTO FISIOLÓGICO DE MICRORGANISMOS … · viabilidade celular, a menor concentração de...

UNI VERSI DADE EST ADUAL PAULI ST A “JULI O DE MESQUI T A FI LHO”

FACULDADE DE CI ÊNCI AS AGRÁRI AS E VET ERI NÁRI AS

CÂMPUS DE JABOT I CABAL

COMPORT AMENT O FI SI OLÓGI CO DE MI CRORGANI SMOS

SUBMET I DOS A BI OCI DAS CONVENCI ONAL E NAT URAL NA

PRODUÇÃO DE CACHAÇA ORGÂNI CA.

Flávia Cecílio Ribeiro Bregagnoli

MS. Engenheiro Agrônomo

JABOT I CABAL – SÃO PAULO – BRASI L

Março de 2006

UNI VERSI DADE EST ADUAL PAULI ST A “JULI O DE MESQUI T A FI LHO”

FACULDADE DE CI ÊNCI AS AGRÁRI AS E VET ERI NÁRI AS

CÂMPUS DE JABOT I CABAL

COMPORT AMENT O FI SI OLÓGI CO DE MI CRORGANI SMOS

SUBMET I DOS A BI OCI DAS CONVENCI ONAL E NAT URAL NA

PRODUÇÃO DE CACHAÇA ORGÂNI CA.

Flávia Cecílio Ribeiro Bregagnoli

Orientador: Profa. Dra. Márcia Justino Rossini Mutton

T ese apresentada à Faculdade de CiênciasAgrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus deJaboticabal, como parte das exigências para aobtenção do título de Doutor em Microbiologia(Microbiologia Agropecuária).

JABOT I CABAL – SÃO PAULO – BRASI L

Março de 2006

Bregagnoli, Flávia Cecílio RibeiroB833c Comportamento fisiológico de microrganismos submetidos a

biocidas convencional e natural na produção de cachaça orgânica /Flávia Cecílio Ribeiro Bregagnoli. – – Jaboticabal, 2006

viii, 76 f. ; 28 cm

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade deCiências Agrárias e Veterinárias, 2006

Orientador: Márcia J. R. MuttonBanca examinadora: Fernando Valadares Novaes, Francisco

Gaiotto Cleto, João Bosco Faria, Clóvis Parazzi.Bibliografia

1. Cachaça Orgânica. 2. Contaminantes. 3. Biocidas naturais. I.Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.

CDU 664.153

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

iii

DADOS CURRICULARES DA AUTORA

FLÁVIA CECÍLIO RIBEIRO BREGAGNOLI – Nascida em Guaxupé (MG), em 10 de

dezembro de 1971, graduada em Engenharia Agronômica em janeiro de 1997 pela

Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP/ Jaboticabal , pós-graduada pela

mesma Universidade em Julho de 2000, ao nível de Mestrado em Agronomia – área de

concentração em produção e Tecnologia de Sementes. Foi instrutora pedagógica e

professora substituta - nível E da Escola Agrotécnica federal de Muzambinho (MG) do setor

de Agroindústria.

iv

Ao meu filho João que é a luz da minha vida.

Ao meu filho Pedro que vai nascer e somar alegria as nossas vidas.

Ao Marcelo pelo incentivo e carinho.

A Márcia e ao Miguel Mutton por tudo que fizeram por mim e pela minha família.

Aos meus pais Odilon e Maria Paixão pela vida.

Dedico

A Cláudia pela dedicação e amor à nossa família.

Ao meu irmão Odilon por tudo que já vivemos.

A dona Cleuza e a Vó Maria pelo incentivo. “Existem pessoas naturalmente sábias”

Aos meus sobrinhos Marcus Vinícius e Ana Clara pelo carinho.

Ofereço

v

PAI

Obrigada por todo AMOR, obrigada pelos exemplos, obrigada por ter sido um

GRANDE PAI, obrigada acima sobretudo pelo AMOR ao meu filho JOÃO...

ORAÇÃO DE SÃO FRANCISCO DE ASSIS

Senhor, fazei de mim, instrumento de Vossa Paz;Onde houver ódio, que eu leve o amor;Onde houver ofensa que eu leve o perdão;Onde houver discórdia que eu leve a união;Onde houver dúvida que eu leve a fé;Onde houver erro que eu leve a verdade;Onde houver desespero que eu leve a esperança;Onde houver tristeza que eu leve a alegria;Onde houver trevas que eu leve a luz.Oh Mestre! permita que eu procureMais consolar que ser consolado;Compreender que ser compreendido;Amar que ser amado;Pois é dando que se recebe;É perdoando que se é perdoado;E é morrendo que se vive para vida eterna.

Amém.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus pela possibilidade da vida, pela oportunidade de aprender, evoluir e amar.

A FCAV/ UNESP Campus de Jaboticabal e à CAPES pela oportunidade de realizar o

Doutorado em Microbiologia com todo amparo financeiro e tecnológico.

Ao Miguel, Márcia, Michele, Matheus, Lydi, Vó, enfim toda essa família maravilhosa .

Aos meus tios e primos pela convivência em família, berço de precioso aprendizado.

Aos amigos do laboratório colocados por Deus no meu caminho para me ajudar e alegrar os

meus dias. Leandro, Ronaldo, Fernando, Kaspa, Tiraboschi, Cidinha e Álvaro.

Aos amigos que já passaram por lá, mas deixaram o carinho e a saudade Cláudia, Chico,

Marco , Munira, Fernanda, Renata e Maionese.

Aos amigos Diane Teo, Gisele Ravanili, Eduardo Rossini, Leonardo Madaleno e David

Banzatto pela amizade, ensinamentos, ajuda e pelo carinho comigo e com o João, amo

vocês.

Ao amigo Sérgio Nobukuni pela ajuda, atenção e carinho.

Aos amigos do laboratório de Enzimologia Prof. João Pizauro, Fátima e Vanessa Nakagi pelo

carinho e amizade.

Aos Professores Fátima Antunes Nogueira, Venâncio Vicente, Miguel Mutton, David

Ariovaldo Banzatto pelo auxílio, correções e atenção dispensados.

Aos amigos José Mauro, Gratieri, Binho, Juliana, Guy, Babete, Gustavo, Tia Nenén, Tia

Lena, Barreto, enfim a todos aqueles que me apoiam e alegram.

A todos que cuidaram do João Marcelo com todo zelo e carinho enquanto trabalhava: Dina,

Manoel, Biana, Beta, Sílvia, Iara, Tuti, Biba, Cristiane, Juliana, Gisele, Eduardo Rossini,

Diane, Leandro, Miguel, Márcia e Marcelo. Minha eterna gratidão.

Aos atenciosos vizinhos Ester e Afonso.

Aos fiadores do imóvel Telo e Ditinha.

As indústrias de bebidas Muller pela atenção e pelas análises cromatográficas.

Ao amigo Valmir Barbosa pela atenção e concessão do caldo de cana.

A Angélica (Usina Santa Adélia) pela atenção e pelo extrato de pomelo.

Aos membros da banca examinadora pelo carinho e pelas dicas preciosas.

Aqueles que direta ou indiretamente colaboraram pela realização do Doutorado.

vii

SUMÁRIO

Página

I. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 01

II. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 03

2.1 Considerações Gerais................................................................................................ 03

2.2 Cachaça..................................................................................................................... 04

2.3 Fermentação .............................................................................................................. 06

2.4 Formação de Componentes Secundários.................................................................. 08

2.5 Microrganismos Contaminantes da Fermentação Alcoólica ...................................... 09

2.6 Antissépticos no Controle de Bactérias Contaminantes............................................. 10

2.7 Extratos de Própolis e de Pomelo .............................................................................. 12

III. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 18

3.1 Matéria Prima............................................................................................................. 18

3.2 Preparo do Mosto....................................................................................................... 18

3.3 Leveduras .................................................................................................................. 18

3.4 Biocidas ..................................................................................................................... 19

3.5 Preparo dos Inóculos ................................................................................................. 19

3.6 Condução da Fermentação........................................................................................ 19

3.7 Análises Microbiológicas do Caldo, Mosto e Vinho.................................................... 20

3.8 Destilação .................................................................................................................. 21

3.9 Amostragens e Avaliações......................................................................................... 22

3.10 Análises Físico-químicas do Mosto, Vinho e Destilado............................................ 22

3.11 Delineamento Experimental ..................................................................................... 23

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 24

4.1 Condições de Desenvolvimento do Experimento....................................................... 24

4.2 Comportamento Microbiológico.................................................................................. 24

4.3 Glicerol ....................................................................................................................... 47

4.4 Acidez Sulfúrica ......................................................................................................... 50

4.5 Teor Alcoólico ............................................................................................................ 51

4.6 Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT) .......................................................... 54

viii

4.7 Componentes Secundários........................................................................................ 55

V. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 58

VI. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 59

ix

COMPORTAMENTO FISIOLÓGICO DE MICRORGANISMOS SUBMETIDOS A BIOCIDAS

CONVENCIONAL E NATURAL NA PRODUÇÃO DE CACHAÇA ORGÂNICA.

RESUMO: As indústrias sucroalcooleira e de bebidas alcoólicas têm como

preocupação o controle de bactérias contaminantes do processo de produção, que

causam problemas como o menor rendimento em álcool e na qualidade final do

produto, sendo necessária à utilização de agentes antimicrobianos. Com esse

enfoque, o objetivo deste trabalho foi utilizar antimicrobianos naturais para redução da

contaminação na fermentação etanólica. Foi empregado o delineamento inteiramente

casualizado em esquema fatorial 4x2x10: mosto testemunha, mosto com extrato de

própolis 4mg L-1, mosto com solução de ampicilina 4mg L-1 e mosto com extrato de

pomelo 18mg L-1, dois inóculos e dez ciclos fermentativos. Entre os tratamentos a

solução de ampicilina e extrato de própolis apresentaram os maiores índices de

viabilidade celular, a menor concentração de bactérias, além de baixa produção de

glicerol. O tratamento com extrato de pomelo diferiu significamente da testemunha na

concentração de bactérias, porém demonstrou influenciar negativamente na atividade

metabólica das células de leveduras visto que, o vinho, apresentou maior teor de

glicerol, maior concentração de açúcares redutores residuais totais e menor

porcentagem de álcool. O extrato de própolis pode ser utilizado no controle de

bactérias contaminantes, uma vez que se mostrou tão eficiente quanto a ampicilina.

Palavras-chave adicionais: ampicilina, fermentação alcoólica, própolis, pomelo.

x

Physiological behaviour of microorganism submet to conventional and natural

biocides in organic cachaça production.

SUMMARY: Sugar, alcohol and beverage industries have a growing concern with the

control of contaminating bacteria, which are responsible for sugar loss and lower

alcohol yield. For this reason, synthetic antimicrobial substances have been widely

used in sugar and alcohol mills. This work was undertaken to evaluate the efficiency of

natural biocides on contamination control in ethanolic fermentation. The experiment

was arranged in completely randomized design in a 4x2x10 factorial. Factor A was

represented by the biocides [control, propolis-treated must (4 mg L-1), ampicillin-treated

must (4 mg L-1) and grapefruit extract treated must (18 mg L-1). Factor B corresponded

to yeast types and factor C comprised ten fermentation cycles. Ampicillin and propolis-

treated musts showed higher yeast cell viabilities, lower bacterial contamination and

lower glycerol yield. Bacterial contamination in grapefruit-treated must was significantly

lower than control must, although it negatively influenced yeast cell metabolism, which

can be seen from the higher glycerol production, higher total residual reducing sugars

and lower alcohol yield. Propolis has shown to be as efficient as ampicillin and can

therefore be used to control bacterial contamination.

keywords: alcoolic fermentation, ampicillin, grapefruit ,propolis.

I. INTRODUÇÃO

Genuinamente brasileira, a cachaça é o destilado mais consumido no país,

onde a produção ultrapassa 1,5 bilhão de L/ano com receita superior a US$ 600

milhões e 450 mil empregos. É produzida em todas as regiões do país, com

destaque para os estados de São Paulo, Pernambuco, Ceará, Rio de Janeiro,

Goiás e Minas Gerais. Atualmente, 20 milhões de litros/ano são vendidos para

mais de 60 países, reflexo do aumento expressivo das vendas para o mercado

externo nos últimos cinco anos. Embora o mercado da cachaça possua uma série

de pontos favoráveis, é preciso que o produtor atente para a qualidade do

destilado, de modo a garantir a permanência nos mercados interno e externo.

A cachaça é obtida pela destilação do vinho de cana, produzida tanto em

alambique como em colunas industriais, é produzida em pequenas propriedades,

embora o maior volume seja obtido em grandes indústrias. Produzida em pequena

ou grande escala, a cachaça pode ter suas qualidades química e sensorial

reduzidas, devido à presença de microrganismos contaminantes que se instalam

ao longo do processo de sua produção. A contaminação bacteriana é o fator que

mais preocupa o produtor, sob os pontos de vista qualitativos e quantitativos da

bebida pois, além de contribuir para a redução do rendimento alcoólico do

processo fermentativo, as bactérias são responsáveis pela produção de

substâncias como ácidos (acético, láctico e outros) que interferem no sabor e

aroma da cachaça, além de contribuir para a síntese de compostos causadores da

chamada “ressaca”, compostos estes dificilmente eliminados durante o processo

de destilação. É importante que as bactérias contaminantes sejam controladas

não somente para garantir a conversão dos açúcares em álcool mas, sobretudo,

almejando uma bebida de qualidade.

Atualmente o controle das bactérias contaminantes, ocorre através da

redução do pH do “pé-de-cuba” ou fermento, pela adição de ácido sulfúrico, ou

pela adição de antibióticos, como a Penicilina e seus derivados, nas dornas de

fermentação. A acidificação do meio pode gerar inconvenientes, como a redução

da viabilidade das células de leveduras que embora ácido-tolerantes, são

2

sensíveis ao tempo de exposição ao ácido, donde a queda da viabilidade. A

adição de produtos químicos no controle de bactérias contaminantes além de ser

prática onerosa, pode comprometer o produto final. Neste caso, verifica-se que

não atende as características exigidas para um produto de qualidade, podendo

inclusive interferir na saúde do consumidor. Alternativa para o impasse seria o

emprego de biocidas naturais que poderiam atender aos produtores do destilado

convencional, como também, aqueles que vislumbram o lucrativo e crescente

mercado dos produtos orgânicos. Biomoléculas naturais como as contidas nos

extratos de própolis e de pomelo (Citrus paradisi) apresentam-se eficientes no

controle de bactérias.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o comportamento de leveduras

alcoólicas em presença de biocidas convencional e natural na produção de

cachaça orgânica, e sua eficiência no controle de bactérias contaminantes.

II. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Considerações Gerais

O setor de agronegócios tem grande importância na geração de divisas para o

país. Com a globalização da economia, as empresas deste setor ao se voltarem para as

exportações, melhoram sua capacidade produtiva, de sorte a gerar produtos de

qualidade superior. O agronegócio da cachaça, no período de 1970 a 1999, alavancou

a produção de 418 milhões de litros para 1,5 bilhão de litros anuais (SEBRAE, 2001).

A Federação das Indústrias do Estado de Minas Gerais (Fiemg) em pesquisas

realizadas pelo consultor Eduardo Campelo, relata que a VARIG serve doses de

cachaça em todos seus 88 vôos internacionais (AFFONSECA, 2000). As exportações

deste destilado tipicamente nacional, no período de 1999 a 2001, passaram de US$ 7,3

milhões para US$ 8,7 milhões, evidência do aumento de adeptos da bebida, embora

apenas 20 milhões de litros sigam para mercados externos (FRANCO, 2001).

A cachaça produzida no Brasil ainda não ocupa o seu lugar de direito junto às

demais bebidas destiladas no mercado internacional. Sua comercialização no exterior

exige que nosso produto se enquadre em critérios de qualidade dos países

importadores, critérios estes muitas vezes mais rígidos que os nossos. No Brasil, os

critérios de qualidade existentes em cada etapa da produção de cachaça precisam ser

mais difundidos entre os pequenos e médios produtores, individualmente pouco

expressivos do ponto de vista de mercado CHAVES & PÓVOA (1992). Ao final da

década de 70, segundo artigo publicado por STUPIELLO (1979) a agroindústria de

aguardente de cana (cachaça), apesar do importante papel no contexto nacional, já

mostrava baixo desenvolvimento tecnológico.

Os produtores de cachaça erroneamente procuravam crescer baseados no

aumento da quantidade e não da qualidade do que era produzido; Embora possa

parecer contraditório, perceberam que investir em qualidade era a saída para a

conquista de novos mercados FARIA (1996). O caminho em busca da qualidade de

bebidas alcoólicas já foi trilhado pelos produtores do uísque, da grapa, da vodka, do

4

rum, do vinho e do conhaque, que atingiram seu “status” junto ao mercado consumidor,

após muito investimento em pesquisa (ISIQUE et al., 2001).

O aprimoramento da tecnologia de produção de cachaça é essencial para se

obter um produto com preço e padrão de qualidade competitivos, propiciando condições

de abertura de um firme e uniforme mercado de exportação, bem como aumentar sua

aceitação pelas classes de maior poder aquisitivo no mercado interno (BOZA &

OETTIERER, 1999).

2.2 Cachaça

A cachaça é um produto nacional de graduação alcoólica que oscila entre 38 a

48% em volume. Sua produção é obtida pelo processo de destilação alcoólica simples

do vinho do caldo de cana. No Brasil, a Lei número 8.918, de 14 de julho de 1994,

dispõe sobre a padronização, classificação, registro, inspeção, produção e a

fiscalização de bebidas, complementada pelo Decreto número 4.851, de 2 de outubro

de 2003. Visando proteger a marca brasileira no cenário internacional, o artigo 92 desta

Lei define que cachaça é um produto genuinamente brasileiro, além da Instrução

Normativa nº 13 publicada no D.O.U. de 30/06/05. “A produção de cachaça é uma

atividade desenvolvida em todo o Brasil, incorporando segredos e tradição pelo seu

valor histórico” (CÂMARA, 2004).

Até o início da década de 1980 conceitos, crendices e técnicas populares

envolviam esta atividade de tal forma que cada alambique parecia produzir uma

cachaça especial e diferente de todas as outras. Embora a contragosto da elite

brasileira, a cachaça tornou-se a bebida nacional, a cara do Brasil (ABRANTES, 2005).

Em 2002, após diversos debates, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

regulamentou o setor de cachaça a operar em sistema de cooperativas, decisão esta

que colocou o setor no mesmo nível das indústrias de destilado de todo mundo, que

operam em tal sistema (RODAS, 2005).

Ao lado desta realidade, já existem pequenos grupos de empreendedores que

perceberam o potencial que a cachaça possui e investem no setor com espírito

5

empresarial. Resultado deste empreendedorismo, os produtores vêm substituindo

embalagens tradicionais (garrafões, cascos de cerveja e etc.) por embalagens melhor

elaboradas, rótulos sofisticados, usando diversos artifícios para agregar valor ao

produto (MESTRINTER, 2004), bem como investem na qualidade da bebida.

A cachaça é o destilado mais consumido no país e ocupa o segundo lugar entre

as bebidas alcoólicas, ficando atrás somente da cerveja. Graças ao sucesso da

caipirinha, a cachaça ingressou também no mercado externo, consolidando-se a cada

ano. De acordo com PORTER (1989), é importante que se formule uma estratégia

competitiva relacionando a indústria ao meio ambiente. Um importante nicho de

mercado e que atende esta relação é o de produtos orgânicos, que também possuem

forte apelo comercial e demanda crescente no mercado, cerca de 20% ao ano, sem,

contudo, suprir a demanda. Os preços são de 30 a 200% superiores aos produtos

convencionais (CACHAÇA ORGÂNICA, 2005).

Ainda, com a globalização da economia, a vinda de empresas multinacionais e

decorrente intercâmbio de executivos estrangeiros e nacionais mostraram ao mundo

que o Brasil não fabrica somente apenas cachaça industrial (destilado básico para

fabricação de caipirinha), mas tem como tradição a produção de cachaça de alambique

que rivaliza em aroma, paladar e técnicas de fabricação com destilados mundialmente

conhecidos como vodka, whisky e o cognac (RODAS, 2005).

A cachaça orgânica, aquela onde não há emprego qualquer tipo de produto

químico durante todo o processo de produção, é o principal responsável pela

valorização deste produto no exterior (CACHAÇA ORGÂNICA - BAHIA, 2005). Para se

consolidar no cenário nacional, a cachaça orgânica na Bahia precisa superar a

concorrência com as cachaças industriais, que contam com uma produção mil vezes

maior (200 milhões por ano, contra 200 mil litros da cachaça orgânica). Na Bahia,

existem cerca de cinco mil produtores, sendo que apenas vinte estão capacitados a

disputar esse mercado com produtores de outros estados (CACHAÇA ORGÂNICA -

BAHIA, 2005).

Embora tenham assumido um papel importante na mídia internacional, sobretudo

por tratar-se de antítese aos alimentos geneticamente modificados, os produtos

6

orgânicos ainda representam uma pequena parte do mercado de alimentos e de

bebidas, como a cachaça. As informações sobre sua participação no mercado mundial

são difusas e muitas vezes imprecisas. Até o início de 2002 não existiam dados

consolidados sobre o volume e o valor de produtos orgânicos comercializados no

mundo. A Europa é o maior mercado consumidor mundial, com movimento anual de

US$ 6,2 bilhões, seguida pelos Estados Unidos (US$ 4,2 bilhões) e pelo Japão (US$

1,2 bilhão). De acordo com a Agra Europe, empresa inglesa especializada em

informações para a indústria alimentícia, o consumo de alimentos orgânicos tem

crescido, nos últimos 10 anos, a taxas próximas de 25% ao ano na Europa, nos

Estados Unidos e no Japão (PRODUTO ORGÂNICO, 2005).

2.3 Fermentação

A fermentação etanólica é o processo biológico através do qual as leveduras

desdobram os carboidratos presentes no substrato, transformando-os principalmente

em etanol e gás carbônico. Assim, quando o inóculo é obtido a partir de fermento

selecionado, ocorre a homogeneidade no processo, considerando-se o aspecto da

contaminação microbiana.

A fermentação deve ser conduzida para possibilitar a obtenção do máximo

rendimento alcoólico, e a destilação deve ser efetuada de forma que o destilado tenha

aroma e sabor dos elementos naturais voláteis contidos no mosto fermentado, derivado

do processo fermentativo, ou formados durante a destilação, conforme proposto por

VARGAS & GLÓRIA (1995).

As características que melhoram o sabor da cachaça são determinadas pelos

componentes secundários formados durante o processo de fermentação, destilação,

matéria-prima e processo de envelhecimento em tonéis de madeira (BOZA &

OETTIERER, 1999).

O processo fermentativo de caldo de cana-de-açúcar para a produção de

cachaça, normalmente é realizado num período de 24 horas em bateladas sucessivas,

com o aproveitamento do fermento em vários ciclos subseqüentes. Este sistema faz

7

com que as leveduras se tornem mais resistentes a altas concentrações de etanol. Este

método é o mais utilizado pelas destilarias de produção de álcool combustível

(AQUARONE et al., 1986; MAIA et al., 1995).

Com relação ao mosto, é importante determinar a diluição a ser empregada para

a fabricação da cachaça. Quanto maior for a quantidade de açúcar disponível, maior

será o teor de álcool produzido; portanto , concentração elevada de açúcar pode levar a

uma concentração de álcool que é prejudicial à ação fermentativa da levedura e , com

isso, diminuir o rendimento na produção.

Efeito inibitório da atividade da levedura foi confirmado por MAIA et al. (1995),

sendo observado que em altas concentrações de açúcar, o processo de fermentação foi

mais lento e ocorreu um aumento de congêneres nos destilados. A temperatura e

acidez do mosto são outros fatores que afetam a atividade microbiana e,

consequentemente, a eficiência e produtividade do processo de fermentação. A faixa

ideal de temperatura para fermentação alcoólica, segundo MARQUES (1991) está entre

26 e 32ºC. Para manter essa faixa de temperatura, a indústria deve aquecer o mosto

em épocas frias e possuir um sistema de resfriamento quando a temperatura estiver

elevada.

Em baixas temperaturas, há um retardamento do processo fermentativo e em

altas temperaturas pode ocorrer evaporação de álcool (MARQUES, 1991). Deve-se

considerar ainda que sendo o processo exotérmico, há a liberação de grande

quantidade de calor para o meio, resultante do metabolismo natural dos açúcares e de

sua transformação em etanol.

Na produção artesanal da cachaça, a fermentação do mosto inicia-se com o

inoculo “caipira” (pé-de-cuba) ao qual podem ser adicionados vários ingredientes

naturais (fubá de milho, farelo de soja, caldo de cana, biscoito, limão), os quais são

contaminados pela microbiota local. Estes microrganismos contaminantes são

provenientes da manipulação na colheita, do transporte e da moagem da cana. O maior

grau de contaminação aparece no caldo bruto, pois, geralmente as águas de

embebição ou de diluição apresentam poucos microrganismos (CLETO, 1997; CLETO

& MUTTON, 1995).

8

Além dos cuidados durante os processos fermentativos e de destilação, existem

também indicações de que a avaliação da microbiota e a seleção de melhores

linhagens de leveduras fermentativas venham a contribuir para melhora da qualidade

da bebida (PATARO et. al., 1998; MENDONÇA, 1999). A qualidade e o tipo de fermento

ou inoculo são imprescindíveis para o processo fermentativo, sendo considerados, por

alguns autores, mais importantes do que a matéria-prima utilizada (NIKANEN, 1996).

Nas indústrias de cachaça são utilizados basicamente quatro tipos de fermento

ou pé-de-cuba: “caipira” (selvagem), prensado (panificação), misto, (selvagem e

panificação) e liofilizado, sendo os dois primeiros de uso mais extensivo. O fermento

selecionado, obtido a partir de leveduras selvagens que foram isoladas e selecionadas,

é indicado como o melhor inoculo em termos de produtividade. Isto porque, durante a

seleção das estirpes, são isoladas aquelas que se destacam pela tolerância a elevados

teores alcoólicos e rapidez de fermentação (NÓBREGA, 1994).

Entretanto, para o processo de produção de cachaça, as leveduras selecionadas

ainda não estão disponíveis no mercado. O processo de seleção de leveduras para uso

em processos fermentativos tem sido realizado com objetivos distintos, para a produção

de álcool combustível (BASSO et al., 1996), bebidas fermentadas, vinho

(COLAGRANDE et al., 1994) e cachaça (PATARO, et al., 1998; DATO, 2001 e FIALHO,

2004).

2.4 Formação de Compostos Secundários

O glicerol, um dos produtos secundários sintetizados durante a fermentação

alcoólica, é volátil e contribui para a qualidade de bebidas como o vinho e também dos

destilados, pois conferem doçura e viscosidade á bebida (WANG et al., 2001). O glicerol

é um importante osmoregulador presente em S. cerevisiae , que em condições de

estresse osmótico ocorre um aumento da síntese deste trialcool, sendo o glicerol

responsável pela estabilização da membrana plasmática da célula de levedura. A

quantidade de glicerol depende da estirpe da levedura bem como da composição do

meio fermentativo (fonte de nitrogênio, oxigênio, temperatura e pH) REMIZE et al, 2000.

9

A formação de congêneres como acetaldeído ocorre principalmente nas

primeiras horas da fermentação, diminuindo posteriormente, principalmente, sob

condições de anaerobiose (MAIA et al., 1995). A formação de álcool superior está

relacionada com a linhagem da levedura e com a ocorrência de oxigênio e

temperaturas elevadas. Os ácidos são compostos normais da fermentação pois estão

sempre presentes na matéria-prima. Ésteres, como o acetato de etila, são formados a

partir de uma reação entre os álcoois e ácidos, têm aroma peculiar de frutas e compõe

o “buquet” de vinhos e destilados (CARDOSO 2001).

As estirpes de leveduras, a matéria-prima, a destilação e o envelhecimento são

fatores determinantes dos níveis, da natureza e proporção dos compostos citados

anteriormente. Pesquisas apontam que as leveduras e as condições das fermentações

são os principais fatores determinantes do sabor e aroma das bebidas alcoólicas, já que

é durante a fermentação que a maior parte dos compostos secundários é formada

(SUOMALAINEN & LEHTONEN 1979).

Aqueles compostos são indesejáveis no de álcool combustível ao passo que na

cachaça quantidades harmônicas dos congêneres são desejáveis, tornando o destilado

agradável, dotado de sabor e aroma característicos (VALSECHI, 1960). Uma prática

que vem auxiliar na obtenção de quantidades adequadas de congêneres em bebidas

destiladas é a separação das frações cabeça, coração e cauda. Sendo feita tal

separação, a fração “cabeça” concentrará o metanol caso este composto tóxico tenha

se formado, além do etanol.

2.5 Microrganismos Contaminantes da Fermentação Alcoólica

Durante a fermentação alcoólica, etapa do processo de produção de álcool

etílico, as leveduras convertem os açúcares presentes no substrato em etanol e gás

carbônico. Nesta fase podem ocorrer vários problemas. Entre os principais merece

destaque a contaminação bacteriana (CHERUBIN, 2003), que consiste em uma das

principais preocupações das agroindústrias de açúcar (como a formação de gomas),

álcool e cachaça. Os contaminantes causam problemas como: consumo de açúcar,

10

queda de viabilidade de células de levedura, floculação do fermento e queda no

rendimento industrial (AMORIM et al.,1989), bem como bebidas de baixa qualidade e

baixo valor comercial.

O caldo de cana contém quantidades variáveis de nutrientes orgânicos e

inorgânicos, alta atividade de água (Aa), pH e temperatura favoráveis que proporcionam

o crescimento de uma grande flora microbiana; enfim, as próprias condições de cada

etapa do processo de produção de álcool selecionam o desenvolvimento de

microrganismos, sendo que todo o processo está sujeito à contaminação, desde a

cana-de-açúcar no campo até a fermentação do seu caldo (GALLO, 1989).

A contaminação bacteriana é considerada a maior causa da redução na

produção de etanol durante a fermentação de meios amiláceos e de mosto de cana, por

S. cerevisiae. O estímulo para o desenvolvimento de bactérias como as do gênero

Lactobacillus, quando em cultura mista, se deve à excreção de metabólitos, de

leveduras para o meio, tais como adenina, guanina, ácido aspártico e nicótico,

triptofano, glicina, alanina e lisina (NARENDRANATH et al., 1997; CHIN & INGLEDEW,

1994).

Portanto, o estímulo ao desenvolvimento bacteriano também é causado pela

liberação de aminoácidos, sendo que a presença destes no meio fermentativo pode ser

causada pela autólise das células de leveduras. O desenvolvimento bacteriano é

favorecido nos estágios finais do ciclo fermentativo (OLIVA NETO, 1995).

A maioria dos trabalhos identificou e tornou evidente a predominância de

bactérias Gram-positivas e em formas de bastonetes no processo de fermentação

alcoólica, com destaque para os gêneros Bacillus e Lactobacillus e as espécies L.

fermentum e L. helveticos (CHERUBIN, 2003).

2.6 Antissépticos no Controle de Bactérias Contaminantes

Os antissépticos não são largamente usados; há restrições, porque existe

possibilidade de deixarem resíduos nos destilados. Pentaclorofenol foi usado durante

alguns anos nas proporções de 0,01 a 0,05 g/L de mosto, com bons resultados, porém

11

seu uso é hoje proibido. O hexaclorofenol em dose de 4 mg/L de mosto contribui para

boas fermentações. Sulfato de cobre e colofônia também são citados na literatura,

como bons antissépticos (LIMA, 2001).

O ácido sulfúrico que se adiciona nos mostos em fermentação é um dos

antisséptico mais utilizados nas fermentações industriais para produção de álcool. Os

antibióticos, em virtude de suas propriedades bactericidas ou bacteriostáticas, agem

como agentes desinfetantes. Foi demonstrado que a administração de penicilina ao

mosto, na concentração de 500 a 1000 unidades por litro, resulta em acréscimo do

rendimento de álcool, cuja diferença com o controle compensou o gasto com este

antibiótico (LIMA, 2001).

A escolha do antibiótico depende de seu custo no tratamento (LIMA, 2001). O

cloranfenicol e a tetraciclina também são empregados, mas a penicilina é

economicamente mais vantajosa (ROITMAN et al., 1988). A ampicilina é um tipo de

penicilina de amplo espectro, sendo um quimioterápico do grupo β-lactâmico que

interfere na síntese de polipeptidioglicano, na parede celular bacteriana, cuja ação final

é a inativação de um inibidor das enzimas autolíticas, conduzindo à lise da bactéria. A

ampicilina é destruída por algumas bactérias que produzem β-lactamase e por muitos

microrganismos Gram-negativos (RANG et al.,1995).

A fermentação alcoólica industrial é um processo fermentativo que, certas vezes

se processa em condições tecnicamente adversas. Canas cortadas há muitos dias,

secas, contaminadas com diversos tipos de microrganismos, mostos ricos em

impurezas minerais, são comuns em destilarias (MUTTON, 1998).

As contaminações também se apresentam com freqüência na produção de

cachaça, prejudicando o rendimento do processo e a qualidade da bebida. E esse

inconveniente pode ser contornado com supervisão constante, para evitar ou suprimir

as infecções (LIMA, 2001). Deve-se registrar que a acidificação através de adição de

ácido sulfúrico ao mosto ou “pé-de-cuba” é a prática mais freqüente na produção de

cachaça em média e grande escala (CLETO & MUTTON, 1995). No entanto, esta

prática não se adequa à produção de cachaça orgânica, pois descaracteriza o produto

do ponto de vista natural.

12

2.7 Extratos de Própolis e de Pomelo

A própolis se constitui numa série de substâncias resinosas, gomosas e

balsâmicas, de consistência viscosa, recolhida de brotos e cascas de árvores ou de

outras partes do tecido vegetal, pelas abelhas, que a transportam até a colméia, onde

modificam sua composição, através de secreções próprias como a cera e secreções

salivares essenciais ou, ainda, seria resultante do processo de digestão do pólen pelas

abelhas (PARK et al., 1997). Possui aroma característico (balsâmico e resinoso),

dependendo da origem botânica, cor variável desde a amarelada, esverdeada clara ao

pardo escuro. Pode ter um sabor de suave balsâmico a forte, amargo e picante e a sua

consistência varia do maleável a ligeiramente rígida, quando em temperatura ambiente,

e rígida em temperaturas abaixo de 20ºC. É composta, em média, por 55% de resinas e

bálsamos, 30% de ceras, 10% de óleos voláteis e 5% de pólen (GRANGE & DAVEY,

1990).

Possui uma composição química complexa, contendo mais de 160 componentes

e, dentre os compostos químicos identificados, podem ser citados os flavonóides

(flavonas, flavolonas e flavononas), chalconas, ácido benzóico e derivados,

benzaldeídos, álcoois, cetonas, fenólicos, heteroaromáticos, álcool cinâmico e

derivados, ácido caféico e derivados, ácidos diterpenos e triterpenos, minerais e outros

(SOARES et al., 2000).

Entre as substâncias isoladas, preponderam os flavonóides (flavonas, flavolonas

e flavononas), como uns dos principais responsáveis pelas atividades antiviróticas,

antiparasitárias, antibacterianas, antioxidantes e demais propriedades farmacológicas

observadas na própolis (GRANGE & DAVEY, 1990). As vitaminas B1, B2, B6, C, E e

minerais como manganês, ferro, cálcio, alumínio também já foram identificados em

amostras de própolis , assim como os açúcares arabinose, frutose, glicose, sacarose e

maltose (BONVEHI et al., 1994). Diversos pesquisadores relatam que na própolis

brasileira os ácidos fenólicos são mais abundantes que os flavonóides (SEIXAS et al.,

2000). Dependendo do tipo de solvente empregado na extração ou mesmo das

13

condições utilizadas no processo, haverá maior ou menor eficiência de extração das

substâncias fenólicas, nas quais concentra-se a maior parte da atividade farmacológica

da própolis (MARCUCCI et al., 1998).

Extrato etanólico de amostra de própolis originária da França foi testado quanto à

sua atividade antimicrobiana “in vitro” contra algumas linhagens de bactérias Gram

positivas e Gram negativas. O extrato inibiu completamente o crescimento de

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp.,

Corynebacterium spp., Branhamella catarrhalis e Bacillus cereus .Houve inibição do

crescimento de Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, mas não houve efeito

sobre Klebsiella pneumoniae. As propriedades antimicrobianas e os efeitos benéficos

da própolis foram atribuídos à presença de flavonóides na sua composição. (GRANGE

& DAVEY, 1990).

Foram isolados três compostos antimicrobianos distintos da própolis brasileira

coletada no Estado de São Paulo: ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico, ácido 3- prenil-

4-dihidroxicinamoloxicinâmico e ácido 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano.

Estes compostos foram testados contra B. cereus, Enterobacter aerogenes e

Arthroderma loenhaniae, sendo que o primeiro composto apresentou maior atividade

(AGA et al., 1994).

A atividade antibacteriana de alguns própolis do Brasil e Bulgária foi investigada,

utilizando Staphylococcus aureus. Os autores notaram atividade em todos os extratos

alcoólicos de própolis e também na mistura de constituintes voláteis, exceto para os

voláteis da Bulgária (BANKOVA et al., 1995).

Foram isolados quatro tipos de ácidos diterpênicos e siringaldeído da própolis do

Brasil, sendo que todos apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus

aureus. Os diterpenos encontrados pela primeira vez na própolis são típicos de

algumas espécies de Araucaria, indicando uma possível fonte vegetal da própolis do

Brasil (BANKOVA et al., 1996).

Foi testada a atividade antimicrobiana da própolis comercial preparada com os

seguintes solventes: etanol 60%, glicerol puro, propilenoglicol e óleo de cereais

comestíveis. Os autores mostraram que o tipo de solvente aplicado para a extração

14

pode aumentar a potência da atividade antimicrobiana, sendo que os melhores

resultados foram obtidos utilizando óleo de cereais como solvente (TOSI et al., 1996).

Algumas amostras de extrato etanólico de própolis do Brasil foram testadas,

mostrando que todas inibiram o crescimento de Staphylococcus aureus (coagulassse

+), não havendo inibição da E.coli ( coagulasse -) (PARK et al., 1997).

Foi verificada a inibição do crescimento de Streptococcus mutans e da enzima

glicosiltransferase, pelos extratos etanólicos de amostras de própolis do Brasil,

provenientes dos Estados de Minas Gerais, São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul,

Paraná e Rio Grande do Sul. A atividade antimicrobiana foi atribuída aos compostos

pinocembrina e galangina. Devido ao sinergismo dos efeitos antimicrobianos e inibição

da atividade da enzima glicosiltransferase, conclui-se que a própolis poderia controlar a

cárie dental (PARK et al., 1998a).

Foi estudada a relação entre a virulência de linhagens de bactéria e sua

susceptibilidade ao extrato etanólico de própolis (EEP). Das quatro linhagens não

virulentas estudadas nenhuma era susceptível ao EEP; enquanto que das 13 virulentas,

7 foram susceptíveis e 6 resistentes (SCHELLER et al., 1998).

Os extratos etanólicos das própolis brasileiras coletadas nos Estados: do Paraná,

São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e Rio Grande do Sul, foram

testados quanto à sua atividade “in vitro” contra Streptococcus mutans, Staphylococcus

aureus e Actinomyces naeslundii e potencial de inibição da atividade da enzima

glicosiltransferase, relacionada à formação da placa e cárie dentária. Todas as

amostras inibiram a atividade enzimática e crescimento microbiano, sendo que a

amostra proveniente do Rio Grande do Sul apresentou maior atividade em ambos os

casos (PARK et al., 1998b).

Um novo composto do extrato etanólico da própolis cubana foi isolado por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), sendo identificado como uma

benzofenoma poliprenilada. Suas atividades antimicrobianas e fungicidas foram

testadas contra Actinomyces, linhagens de bactérias Gram positivas e negativas e

leveduras. A maior atividade foi observada contra duas linhagens Gram positivas:

Streptomyces chartrensis e S. violochromogenes. Em relação às linhagens Gram

15

negativas e leveduras, foi verificada atividade contra Shigella somnei, Candida albicans,

Candida tropicalis, Pseudomonas aeuruginosa e Candida parapsilosis (RUBIO et al.,

1999).

Foram analisados os extratos etanólicos das própolis, bem como seus

compostos voláteis de diversas regiões como: Sofia (Bulgária), Tirana (Albânia), Ulan

Bator (Mongólia),Bani Swaief (Egito),Prudentópolis (PR-Brasil), Rio Claro (SP-

Brasil),Pacajus (CE-Brasil), Limeira (SP-Brasil), San Mateo ( Ilhas Canárias), Telde

(Ilhas Canárias). As atividades antibacteriana (S.aureus e E. coli) ,antifúngica (Candida

albicans) e antiviral (vírus influenza) dos extratos etanólicos foram investigadas. Todas

as amostras apresentaram atividades antibacteriana, antifúgica e antiviral similares,

sendo que a própolis das Ilhas Canárias foi mais potente contra S.aureus. Nenhuma

amostra apresentou atividade anti E. coli . Essas similaridades contradizem às

diferentes composições químicas, levando os autores a concluir que as propriedades se

devem à mistura de substâncias, e não a um composto específico (KUJUNGIEV et al.,

1999).

Os extratos etanólicos da própolis de Minas Gerais e extratos de Arnica montana

foram testados contra 15 linhagens de bactérias: Candida albicans (duas linhagens),

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus sobrinus, S. sanguis, S.

cricetus, S. mutans, Actinomyces naeslundii, A. Viscosus, Porphyromonas gingivalis, P.

Endodontalis e Prevotella denticola. O extrato de própolis inibiu todos os

microrganismos apresentando maior atividade contra Actinomyces spp. O extrato de

Arnica montana não demonstrou atividade significante. A aderência das células e

formação de glucana insolúvel em água também foram quase que totalmente inibidos

por uma concentração de 400ug/ml e 500 ug/ml de extrato de própolis,

respectivamente; enquanto que o extrato de Arnica montana apresentou leve inibição

da aderência das células (19% para S. mutans e 15% para S.sobrinus) e formação de

glucana insolúvel em água (29%) na mesma concentração (KOO et al., 2000 a).

Uma nova variedade de própolis originária da Bahia (nordeste do Brasil) foi

avaliada quanto à inibição do crescimento de Streptococcus mutans, S. sobrinus e S.

cricetus, aderência da célula e síntese de glucana insolúvel em água, sendo comparada

16

com as amostras previamente testadas, provenientes dos Estados de Minas Gerais e

Rio Grande do Sul. Os resultados mostraram que a nova variedade de própolis

apresenta maior potência em relação a todos os parâmetros “in vitro” testados, sendo

excepcionalmente efetiva contra S. mutans (KOO et al., 2000 b).

O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos tem

levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a esses

compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma alternativa eficaz

e econômica (CRISAN, 1995). O problema da resistência microbiana é crescente e a

perspectiva de uso de drogas antimicrobianas no futuro é incerta. Portanto, devem ser

tomadas atitudes que possam reduzir este problema como, por exemplo, controlar o

uso de antibióticos, desenvolverem pesquisas para melhor compreensão dos

mecanismos genéticos de resistência e continuar o estudo de desenvolvimento de

novas drogas, tanto sintéticas como naturais (NASCIMENTO, 2000).

Sugere-se que o extrato etanólico de própolis tem efeito bactericida causado pela

presença de ingredientes muito ativos, porém, lábeis. É sugerido que a combinação de

extratos de própolis com antimicrobianos possa permitir a redução da dose clínica de

determinados antibióticos e, assim, diminuir a incidência de efeitos colaterais e, ao

mesmo tempo, potencializar a antibioticoterapia no tratamento de infecções em que a

resistência bacteriana torna-se fator determinante (RANG et al., 1995). Nenhum

componente isolado possui atividade antibacteriana sobre o Staphylococcus aureus, ou

outra bactéria, tão potente quanto todo o extrato (KUJUNGIEV et al., 1999).

Muitos trabalhos nacionais e estrangeiros ilustram a diversidade de atividades

biológicas da própolis e, dentre elas, a antibacteriana. A maioria dos relatos mostra que

os diversos tipos de extratos de própolis possuem acentuada ação inibidora, in vitro,

sobre os gêneros Gram-positivos e, em menor escala, sobre as bactérias Gram-

negativas (GRANGE & DAVEY, 1990). Esta e outras reconhecidas capacidades desta

resina natural servem de estímulo para investigações sobre a sua utilização em

processos de obtenção de álcool combustível ou de cachaça convencional; sobretudo,

de cachaça orgânica.

17

O extrato de pomelo, outro antimicrobiano natural, é empregado na conservação

de pescado e higienização de equipamentos; elimina em torno de 97% das bactérias da

superfície de folhas de alface, contribuindo para conservação pós-colheita do produto.

O extrato de pomelo tem na sua composição vários princípios ativos como o ácido

caféico e terpenos (LÓPEZ et al. 2001). O ácido caféico é um agente bactericida e os

terpenos são fungicidas em potencial (ORDONEZ, 2004).

Não existem trabalhos na literatura científica sobre o uso de extratos de própolis

e/ou derivados no controle ou prevenção da contaminação bacteriana do caldo de

cana-de-açúcar, bem como o mosto usado nas fermentações para obtenção de

produtos derivados. Este trabalho é pioneiro abordando controle de bactérias

contaminantes da fermentação alcoólica utilizando biocidas naturais como o extrato de

própolis e o extrato de pomelo (Citrus paradise).

III. MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Açúcar e do Álcool-

Microbiologia das Fermentações, do Departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP,

Campus de Jaboticabal-SP, durante a safra 2004/2005.

3.1 Matéria-Prima

Utilizaram-se neste estudo colmos de cana-de-açúcar da variedade SP87-5181,

ciclo precoce, cultivada em unidade de produção orgânica do município de Cajuru-SP,

sob solo areno-argiloso. Os tratos culturais consistiram em adição de cinzas e

fertirrigação com vinhaça, ambos resíduos provenientes da produção da cachaça

orgânica do alambique da propriedade. A infestação de pragas e incidência de doenças

foi baixa, dispensando-se medidas de controle adequadas ao cultivo orgânico. A cana

foi cortada manualmente sem queima prévia, despontada e processadas imediatamente

em moendas sem embebição.

3.2 Preparo do Mosto

O caldo extraído foi filtrado em tecido de trama fina para retenção de impurezas

minerais e bagacilho. O grau Brix inicial era de 20 e foi reduzido através da adição de

água destilada para preparo de mostos de 6, 9, 12 e 14° Brix. O pH foi de 5,2 e foi

mantido nas diferentes fases do experimento.

3.3 Leveduras

Os microrganismos utilizados para a composição dos inóculos foram o fermento

comercial prensado constituído predominantemente por Saccharomyces cerevisiae e a

mistura composta por S. cerevisiae e duas estirpes de leveduras nativas, pertencentes

à coleção do Laboratório de Microbiologia das Fermentações do Departamento de

19

Tecnologia da FCAV/UNESP, Jaboticabal-SP, Pichia anomala e Pichia silvicola. Essas

leveduras foram isoladas de processos fermentativos, que segundo DATO (2001)

apresentaram-se como excelentes fermentadoras.

3.4 Biocidas

A própolis utilizada neste experimento foi coletada no município de Guaxupé-MG

e a extração dos princípios ativos foi realizada a partir da mistura de 25g de própolis

triturada em 100mL de solução de etanol 80% v.v-1 sob agitação em banho

termostatizado a temperatura de 70ºC durante 30 minutos (KOO, 1996). O extrato de

pomelo (Citrus paradisi) utilizado foi o da marca comercial Citril 200d. A solução de

ampicilina foi elaborada triturando-se um comprimido de ampicilina 500 mg em

almofariz e, a seguir, completando-se o volume para 100mL com água autoclavada.

3.5 Preparo dos Inóculos

As leveduras selecionadas foram reativadas e cultivadas em meio estéril YEPD

(2% extrato de levedura, 1% peptona e 2% de dextrose) entre 24 e 48h a 32ºC em

agitador a 100rpm. A massa de células foi centrifugada (10000 g/15min) e transferida

para mosto de caldo de cana a 6° Brix, visando à multiplicação de células, através do

processo de cortes, até a obtenção da massa necessária para o início das

fermentações. Foram adicionados 30g de massa úmida equivalente a 60x108

células.mL-1 para o inóculo S. cerevisiae e 10g de massa úmida equivalente 20x108

células.mL-1 das estirpes P. anomala , P. silvícola e S. cerevisiae para o inoculo

composto pela mistura de leveduras.

3.6 Condução da Fermentação

As fermentações foram realizadas em bateladas, com recuperação do fermento

por decantação, em dornas de aço inoxidável de fundo cônico, com capacidade para 6L

20

de mosto (volume útil) a 14º Brix, pH 5,2, Açúcares Redutores Totais (ART) 13,1%,

Acidez Total 0,37g de H2SO4 L-1. Dividiu-se a alimentação das dornas em quatro etapas

de 1,5L em intervalos de 60 min. Os tratamentos utilizados foram: mosto testemunha,

mosto com adição de 4 mg L-1 de extrato de própolis, mosto com 4 mg L-1 de ampicilina

e mosto com 18 mg L-1 de extrato de pomelo a temperatura de 30°C ± 2.As doses dos

biocidas foram definidas após a realização de ensaios preliminares. No 1º ciclo, cada

dorna recebeu por hora 1500 mL de mosto a 6, 9, 12 e 14° Brix, respectivamente na 1ª,

2ª, 3ª e 4ª hora. Do 2º ao 10º ciclo, 1500 mL de mosto não estéril, a 14° Brix foi

adicionado a cada alimentação/dorna.

Foram conduzidos 10 ciclos fermentativos, em duplicata, com duração variável

entre 18 a 21 horas cada um, considerando o final da fermentação, quando o Brix do

vinho era ≤ 1. A cada dois ciclos o fermento foi lavado com água destilada para a

testemunha e água destilada mais os biocidas correspondentes a cada tratamento, nas

concentrações citadas anteriormente. Após o final do 4º ciclo fermentativo foi realizada

a limpeza do fundo de dornas para retirada de material inerte e células mortas.

3.7 Análises Microbiológicas do Caldo, Mosto e Vinho.

As análises microbiológicas pelo método direto foram realizadas no início e final

de cada ciclo segundo LEE et al. (1981). Os parâmetros avaliados foram: viabilidade

celular e de brotos e concentração de bactérias contaminantes.

Para realização do plaqueamento (método indireto) foram retiradas amostras do

vinho, no início e final de cada ciclo fermentativo. O plaqueamento foi feito em meio de

cultura WLN (Wallerstein Laboratories Nutrient Agar-Difco: glicose – 50g, fosfato

hidratado de potássio – 550mg, cloreto de potássio – 425mg, cloreto de cácio – 125mg,

sulfato de magnésio – 125mg, cloreto férrico – 2,5mg, sulfato de manganês – 2,5g,

caseína – 5g, extrato de levedura – 4g, verde de bromocresol – 22mg e Agar – 20g

para cada litro de meio) com ampicilina (500mg/L) e ácido nalidíxico (500mg/L), para

contagem total de leveduras. Para contagem de microrganismos totais utilizou-se o

21

meio de cultura PCA (Plate Count Agar – Difco: caseína – 5g, extrato de levedura –

2,5g, dextrose – 1g e Agar – 15g por litro de meio).

O meio de cultura MRS (Man, Rogosa e Sharp – Merck: extrato de levedura – 5g,

peptona – 10g, extrato de carne – 5g, dextrose – 20g, fosfato hidrogênio dipotássico –

2g, tween 80 – 1g, acetato de sódio – 5g, sulfato de magnésio – 0,05g e agar – 15g por

litro de meio) com cicloheximida (100mg/L), foi utilizado para contagem de bactérias

láticas.

As amostras de vinho foram diluídas em solução salina estéril (0,85%), para 10-7

e 10-8 para os meios WLN e PCA e 10-5 e10-6 para o meio MRS. Alíquota de 0,1mL

foram transferidas para as placas contendo os meios de culturas e incubadas por 7 dias

a 25°C±1 para o WLN e 32°C±2 por 4 dias para os meios PCA e MRS.

3.8 Destilação

A destilação foi realizada em aparelho de cobre, com capacidade para destilar 20

litros de vinho. O equipamento foi aquecido através de fogo direto (Figura 1). O vinho

decantado foi recolhido na quantidade de 4.500 mL de cada repetição, em cada

tratamento. Os vinhos dos mesmos tratamentos (repetições) foram misturados

totalizando 9.000 mL e enviados ao alambique, aquecido sob temperatura constante. A

destilação foi conduzida separando-se as frações de cabeça, coração e cauda. Foi

recolhida a fração de coração, correspondente a 80% (volume) do destilado com

graduação de 36 a 40% (36% para os vinhos obtidos nos tratamentos com extrato de

pomelo).

22

Figura 1: Destilador de cobre para obtenção da cachaça, aquecimento direto.

3.9 Amostragens e Avaliações

Foram coletadas amostras de mosto (300mL) para realização de análises físico-

químicas que apresentaram as seguintes características: pH 5,2; Açúcares Redutores

Totais (ART) 13,1%, Acidez Total 0,37g de H2SO4 L-1. Para o vinho foram coletadas três

amostras simples, de 50mL, no fundo, no meio e na superfície de cada dorna,

perfazendo-se uma amostra composta de 150mL. Realizaram-se análises físico-

químicas para Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT%), Acidez Total

(gH2SO4/L), Glicerol (mg 100mL-1), pH e º Brix além das Análises Microbiológicas.

3.10 Análises Físico-químicas do Mosto, Vinho e Destilado.

• Brix do caldo, mosto e do vinho: quantificado por densimetria com correção de

temperatura.

• pH do mosto: determinado por leitura direta no pHmetro, modelo DMPH-2

digital, com correção de temperatura.

• Açúcares redutores totais (ART) % do mosto: expressos em relação à glicose

e dosados pelo método volumétrico de LANE & EYNON (1934).

23

• Acidez sulfúrica do mosto e vinho: metodologia proposta por AMORIM (1996).

• Açúcares redutores residuais totais (ARRT) do vinho: segundo técnica

descrita em COPERSUCAR (1988).

• Glicerol: segundo MACGOWAN et al. (1983).

Para análises cromatográficas (teor alcoólico, componentes secundários e

carbamato de etila) das cachaças, foram coletadas amostras da fração de coração dos

ciclos: 1, 4, 7 e 10. As análises foram realizadas segundo MONICK (1986).

3.11. Delineamento Experimental

O experimento foi conduzido na safra 2004/2005, utilizando delineamento

inteiramente casualizado em esquema fatorial 4x2x10, com duas repetições, sendo o

primeiro fator os tratamentos testemunha e três biocidas (extrato de própolis, solução

de ampicilina e extrato de pomelo), o segundo dois inóculos: S. cerevisiae e mistura de

leveduras (S. cerevisiae, P. anomala e P. silvicola) e o terceiro os 10 ciclos

fermentativos.

A análise estatística dos componentes secundários foi realizada em

delineamento em blocos casualizados, utilizando-se o esquema fatorial 4x2 com quatro

repetições (ciclos 1, 4, 7 e 10), analisando-se amostras do destilado de coração de três

biocidas (extrato de própolis, solução de ampicilina e extrato de pomelo) e da

testemunha, provenientes da fermentação em dois inóculos: S. cerevisiae e mistura de

leveduras (S. cerevisiae, Pichia anomala e Pichia silvicola) BANZATTO & KRONKA

(1995).

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Condições de Desenvolvimento do Experimento

O experimento foi realizado de modo a reproduzir em laboratório as condições de

produção de cachaça orgânica, conforme as Boas Práticas de Fabricação (BPF).

Seguiram-se os preceitos de higiene e práticas que aperfeiçoam e/ou preservam a

qualidade da matéria prima, como colheita sem queima, desponte e processamento

imediato dos colmos, além de passagem por peneiras e ajuste do grau brix do caldo,

para obtenção do mosto. Empregaram-se também práticas como lavagem do fermento

a cada dois ciclos e limpeza do fundo de dornas, de maneira a reduzir a incidência de

bactérias contaminantes.

Para garantir ainda a qualidade do destilado realizou-se a separação das frações

de cabeça, coração e cauda. Os vinhos e destilados obtidos neste experimento foram

analisados e as informações resultantes destas análises estão apresentadas e

discutidas a seguir.

4.2 Comportamento Microbiológico

Os resultados obtidos e submetidos a análise de variância, para a viabilidade das

células de leveduras presentes no vinho no início e no final dos ciclos fermentativos,

indicaram diferença significativa (p<0,01) (Tabela 1) com os maiores valores de F no

início das fermentações para inóculos e ciclos e no final para inóculos e biocidas. Os

resultados médios de viabilidade celular obtidos para os tratamentos com extrato de

própolis e solução de ampicilina foram superiores aos dos tratamentos testemunha e

com o extrato de pomelo, para ambos inóculos utilizados (Figura 1).

A levedura é um microrganismo que se adapta ao meio facilmente, dependendo

onde é inoculada. Esta ocorre, sobretudo, em condições que favoreçam suas atividades

metabólicas, como por exemplo, a presença no meio de nutrientes essenciais ao seu

metabolismo, que é afetado em condições adversas ocasionando então o estresse do

25

Tabela 1: Análise de variância da porcentagem de viabilidade de células de levedurasno início e final dos ciclos fermentativos, em vinho de mosto de cana.

Causas da variação Viabilidade (valores de F)

Início Final

Biocidas (A) 51,67** 37,79**

Inóculos (B) 27,51** 69,33**

Ciclos (C) 11,42** 01,76ns

AxB 04,10** 03,24*

AxC 03,29** 02,12*

BxC 04,36** 01,60ns

AxBxC 01,78* 00,88ns

NS= não significativo, *= significativo ao nível de 5% e **= significativo ao nível de 1%

Bc

Ab

AaAa

Bb

Aa

Ac Ac

82

84

86

88

90

92

94

96

98

100

Saccharomyces Mistura (S.c+P.a+Ps)

Via

bilid

ade

inic

ial (

%)

Testemunha Própolis Ampicilina Pomelo

Figura 1: Interação entre biocidas e inóculos para viabilidade de células de leveduras(%) em amostragens realizadas nos ciclos fermentativos. Letras maiúsculas comparamas médias entre inóculos e letras minúsculas comparam as médias entre os biocidas.

microrganismo MUTTON (1998). De acordo com pesquisas de OLIVA-NETO &

YOKOYA, 1997 o principal indicador de estresse na levedura é a viabilidade celular.

Quanto maior a viabilidade, melhor o desempenho fermentativo. Baseados nestes

preceitos os resultados obtidos neste estudo evidenciam que os mostos tratados com

26

extrato de própolis ou solução de ampicilina não contribuem para o estresse das

leveduras, Uma vez que não se detectou diminuição da viabilidade celular,

permanecendo a níveis superiores a 93% de células vivas. Pode-se relacionar este fato

a ocorrência de algum tipo de estresse, causados por contaminação bacteriana ou

mesmo biomoléculas presentes no extrato de pomelo.

No decorrer dos ciclos fermentativos no início das fermentações, os índices de

viabilidade decresceram para os tratamentos testemunha e extrato de pomelo, o que

era esperado em função da perda de células viáveis devido aos reciclos e lavagem do

fundo das dornas, bem como aumento da competitividade entre células de levedura e

de bactérias contaminantes. Para o tratamento com o extrato de própolis a viabilidade

manteve-se constante e sempre a níveis elevados e superiores a 92%. A viabilidade,

embora tenha oscilado, também foi superior para o tratamento com solução de

ampicilina, o que pode estar relacionado a redução da competitividade das bactérias

contaminantes com as leveduras, demonstrando assim, a eficiência daqueles dois

biocidas sob o controle das bactérias contaminantes. A manutenção e supremacia da

viabilidade no tratamento com extrato de própolis podem estar relacionados não

somente a sua eficiência biocida sobre as bactérias, mas também devido à presença de

compostos como as vitaminas B1, B2, B6, C, E e minerais como manganês, ferro, cálcio

e açúcares presentes nesta resina BURDOCK (1998). Tais elementos são importantes

para o metabolismo das leveduras do ponto de vista nutricional contribuindo assim para

maior viabilidade celular (Figura 2).

A ocorrência de situações de estresses na fermentação provoca reduções na

viabilidade da levedura. Esta também pode ser resultante da recirculação de células,

uma vez que a reciclagem do fermento não seleciona somente células viáveis. Assim

sendo, o reaproveitamento do inóculo promove um estímulo à multiplicação bacteriana

devido ao enriquecimento do meio causado pelas proteínas hidrolisadas e aminoácidos

provenientes das células de leveduras CHERUBIN (2003), fato comprovado neste

estudo, principalmente nos tratamentos testemunha e com extrato de pomelo.

Ao longo dos ciclos os índices de viabilidade não diferiram significativamente e

apresentaram menores valores em relação ao início. Tal era esperado, pois no início do

27

Aa

AB

a

Aa

AB

a

Cb

AB

Cb

AB

Cb A

BC

ab

AB

Cb

AB

Cb

Aa

Aa Aa

Aa

Aa

Aa

Aa

Aa

Aa

Aa

Bab

AB

a

AB

a

AB

a

Aa

AB

ab

AB

a

AB

ab

AB

ab

AB

ab

Aa Aa

Aa A

a

BC

Db

Dc

CD

b

AB

Cb

AB

b

AB

ab

75

80

85

90

95

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Ciclos

Via

bilid

ade

inic

ial (

%)


Figura 2: Interação entre biocidas e ciclos para a viabilidade de células de leveduras(%) em amostragens realizadas no início das fermentações. Letras maiúsculascomparam médias entre ciclos e letras minúsculas comparam médias entre biocidas.

processo, o mosto é rico em nutrientes e açúcares dando condição para a levedura se

desenvolver, o que não ocorre no final da fermentação, quando se observa redução

natural da viabilidade. A concentração de etanol também contribuiu para reduzir a

viabilidade no final dos ciclos fermentativos (MUTTON, 1998). Existe ainda relação

inversa entre viabilidade celular de leveduras e concentração de bactérias (final das

fermentações), principalmente pela competição entre leveduras e bactérias pelos

nutrientes e açúcares do meio, bem como pela excreção de metabólitos tóxicos pelas

bactérias.

A análise de variância do brotamento de células de leveduras tanto no inicio

quanto no final dos ciclos fermentativos, foi significativa para biocidas, inóculos, ciclos e

para as interações entre eles. Os valores de F estão representados na (Tabela 2).

O brotamento no início dos reciclos foi superior para o tratamento com extrato de

própolis seguido pelos tratamentos testemunha e com solução de ampicilina que não

diferiram entre si no inóculo composto pela mistura de leveduras. Já o tratamento com

28

Tabela 2: Análise de variância da porcentagem de brotamento de células de levedurasem amostragens feitas no início e final das fermentações (brotamento inicio de ciclos ebrotamento final de ciclos), em vinho de mosto de cana-de-açúcar.

Causas da variação Brotamento (valores de F)

Início Final

Biocidas (A) 43,46** 25,92**

Inóculos (B) 09,97** 00,49NS

Ciclos (C) 15,97** 10,97**

AxB 10,41** 10,21**

AxC 05,12** 03,93**

BxC 29,52** 15,81**

AxBxC 03,40** 03,04**


extrato de pomelo apresentou diferença significativa e menor porcentagem de

brotamento em relação aos demais. Ocorreu comportamento diferente do inóculo

composto somente por S. cerevisiae onde o brotamento foi superior somente para o

tratamento com extrato de própolis nos demais não houve diferença significativa (Figura

3).

Aa

Bb

AaAa Aa

Bb

Bb

Ab

2

3

4

5

6

Saccharomyces Mistura

Bro

tam

ento

Inic

ial (

%)


Figura 3: Interação entre biocidas e inóculos para brotamento de células de leveduras(%) em amostragens realizadas no início das fermentações. Letras maiúsculascomparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam as médias entre osbiocidas.

29

O brotamento celular ao final dos reciclos, foi superior para o tratamento com

extrato de própolis, diferindo significativamente dos demais tratamentos em ambos

inóculos. Observa-se também que no inóculo S. cerevisiae o tratamento com extrato de

própolis apresentou maior brotamento, seguido pelos tratamentos testemunha e com

extrato de pomelo. O mesmo comportamento não foi observado para o inóculo

composto pela mistura de leveduras onde o tratamento com extrato de própolis

apresentou maior brotamento em relação aos demais, que não diferiram significamente

entre si (Figura 4).

Bb

Ab

AaAa

Ab

BcBb

Ab

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


Bro

tam

ento

Fin

al (%

)


Figura 4: Interação entre biocidas e inóculos para brotamento de células de leveduras(%) em amostragens realizadas no final das fermentações. Letras maiúsculascomparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam as médias entre osbiocidas.

Quanto ao comportamento dos inóculos durante os ciclos fermentativos

observou-se neste estudo que o brotamento celular foi superior para o inóculo S.

cerevisiae nos ciclos 1, 8 e 9 diferindo significativamente do inóculo composto pela

mistura de leveduras. Nos ciclos 2, 3, 5 e 7 o inóculo que apresentou maior brotamento

30

foi aquele composto pela mistura de leveduras. Já nos ciclos 4, 6 e 10 não houve

diferenças significativas (entre inóculos quanto ao brotamento das células de

leveduras). E comportamento oscilante entre inóculos, ora mostrando melhores

porcentagens em um ora em outro, e ainda em ciclos onde não se observaram

diferenças significativas pode estar ligado à adaptabilidade das leveduras ao longo dos

ciclos na tentativa de permanecer no meio fermentativo. (Figuras 5 e 6).

CD

Ea

BC

a

Aa

BC

b

AB

a

Eb

CD

a

DE

b

CD

Eb

Aa

Da

DbC

Db

Aa

Ba

Aa

Da

BC

aBa

Bb

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Bro

tam

ento

Inic

ial(%

)


Figura 5: Interação entre inóculos e ciclos para brotamento de células de leveduras (%)em amostragens realizadas no inicio das fermentações. Letras maiúsculas comparamas médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médias entre os inóculos.

31

Bb

Bb

Aa

Bb

Bb

Aa

Bb

AaA

aAa

Aa

Aa

Ab

AaA

a

Bb

Aa

Bb

Aa

Aa

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Bro

tam

ento

Fin

al(%

)


Figura 6: Interação entre inóculos e ciclos para brotamento de células de leveduras (%)em amostragens realizadas no final das fermentações. Letras maiúsculas comparam asmédias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médias entre os inóculos.

Antes do início do 5°ciclo fermentativo houve remoção de resíduos dos fundos

das dornas de fermentação o que acarretou perdas de células reduzindo

conseqüentemente o número das mesmas responsáveis pela conversão do açúcar em

álcool. Ambos os inóculos apresentaram adaptabilidade a este procedimento. O inóculo

S. cerevisiae apresentou maior brotamento no início do 6°ciclo e o inóculo composto

pela mistura de leveduras apresentou maior brotamento no ao final do 5° e 7° ciclo

(Figuras 5 e 6), portanto ambos foram capazes de repor o número de células viáveis

perdidas através da limpeza das dornas, em detrimento a produção de álcool.

Da interação entre biocidas e ciclos observa-se que o brotamento de células de

leveduras foi oscilante em ambos os momentos da avaliação isto é, inicio das

fermentações (Figura 7) e final das fermentações (Figura 8). De modo que, as maiores

porcentagens de brotamento foram observadas nos vinhos tratados com extrato de

própolis, seguidas pelo tratamento com solução de ampicilina. Nos tratamentos

“testemunha” e com “extrato de pomelo” o brotamento foi menor, o que era esperado

uma vez que a viabilidade celular também foi menor para ambos. O brotamento celular

32

pode estar ligado a vários fatores dentre os quais destaca-se o estado nutricional das

células que refletem em maior viabilidade celular no início, sobretudo no final das

fermentações.

Os tratamentos com extrato de própolis e solução de ampicilina apresentaram

menor índice de bactérias contaminantes, portanto, atenuaram a competição entre

células de leveduras e bactérias pelos nutrientes do meio. Além disso, há relatos na

literatura de que o extrato de própolis possui compostos que podem regenerar as

células (MARCUCCI et al., 1998). O brotamento como o próprio nome indica, é o

método mais comum de reprodução celular das leveduras. Os compostos que podem

regenerar as células provavelmente auxiliam na reprodução.

Aa

AB

CD

a

BC

Da

CD

Eab

AB

CD

a

AB

a

BC

Db A

BC

b

DE

b

Eb

AB

Ca

Ca

BC

a

BC

a BC

a

AB

a

Aa

Aa

BC

a

BC

a

BC

Da

AB

a

CD

a

Da C

Dab

AB

Ca

Aa

Dc

BC

Dab

CD

a

Aa

AB

a

Cb C

b

BC

a

BC

b

BC

b

AB

Cbc

BC

ab

Cb

1

3

5

7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Bro

tam

ento

Inic

ial(%

)


Figura 7: Interação entre biocidas e ciclos para o brotamento de células de leveduras(%) em amostragens realizadas no início das fermentações. Letras maiúsculascomparam médias entre ciclos e letras minúsculas comparam médias entre biocidas.

O presente estudo não identificou nem classificou as bactérias contaminantes

observadas no vinho, mas quantificou o número de células mL –1 de bactérias

presentes, tanto no inicio quanto no final das fermentações, os quais foram

33

significativamente diferentes (p<0,01) para biocidas, inóculos, ciclos e para as

interações biocidas e ciclos e inóculos e ciclos (Tabela 3).

Os principais microrganismos contaminantes da fermentação etanólica são

bactérias dos gêneros: Staphylococcus, Acetobacter, Lactobacillus, Bacillus,

Streptococcus, Leuconostoc, Aerobacter e outros (AMORIM & OLIVEIRA, 1982). O

extrato de própolis exerce efeito antibacteriano sobre bactérias do gênero

Staphylococcus, Streptococcus e outros gêneros de bactérias (PINTO et al., 2001) o

extrato de própolis possui mais de 160 substancias ativas; contudo não se pode atribuir

CD

b

CD

b

AB

Ca

Db

Db

BC

Da

Db

BC

Da

AB

aAa

AB

CaA

Ba

AB

CaA

a

AB

a

BC

a

AB

a

Ca

AaAa

AB

ab

AB

b

Aa

AB

bAB

b

Bb

AB

a

AB

Eb

AB

b

AB

a

BC

Dab

Dab

AB

Ca

CD

b

CD

b

AB

CD

a

BC

DbAB

CD

aAB

ab

Aa

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Bro

tam

ento

Fin

al(%

)


Figura 8: Interação entre biocidas e ciclos para o brotamento de células de leveduras(%) em amostragens realizadas no final das fermentações. Letras maiúsculascomparam médias entre ciclos e letras minúsculas comparam médias entre biocidas.

a esta ou aquela sustância seus efeitos bactericidas. A ampicilina é um tipo de

penicilina de amplo espectro, possuindo apenas um ingrediente ativo e interferindo na

síntese de peptidioglicanos. Tanto o extrato de própolis quanto a solução de ampicilina

não são eficazes no controle de bactérias Gram-negativas; no entanto, o são em

bactérias Gram-positivas. As bactérias contaminantes da fermentação alcoólica são em

34

Tabela 3: Análise de variância da concentração de bactérias contaminantes (10 7 UFCmL-1 em amostragens feitas no início e final das fermentações) em vinho de mosto decana-de-açúcar.

Causas da variação UFC mL-1 (valores de F)

Início Final

Biocidas (A) 203,51** 243,67**

Inóculos (B) 42,19** 6,15**

Ciclos (C) 41,77**20,23**

AxB 0,62NS 7,43**

AxC 5,02** 3,98**

BxC 7,53** 8,23**

AxBxC 1,66* 2,67**


sua maioria Gram-positivas, o que pode explicar a eficiência biocida do extrato de

própolis e solução de ampicilina.

Analisando a interação entre biocidas e ciclos observou-se que a contaminação

foi crescente ao longo dos ciclos para todos os tratamentos, tendo sido superior na

testemunha, seguida pelo tratamento com extrato de pomelo (Figura 9). Pode-se

verificar que o extrato de pomelo na dosagem utilizada no presente estudo é menos

eficaz que os biocidas extrato de própolis e solução de ampicilina.

Os maiores prejuízos causados pela contaminação bacteriana são a degradação

da sacarose e a formação de ácidos lático e acético que ocasionam perda de açúcar e

intoxicação das leveduras (OLIVA NETO & YOKOYA, 2001). A presença dos ácidos

lático e acético, que permanecem no produto final após a destilação, contribui para a

depreciação da bebida.

Para controlar as bactérias contaminantes, uma vez que as medidas anteriores à

contaminação falharam, é necessário o uso de biocidas que não afetem o fermento

(AMORIM & OLIVEIRA, 1982) e controlem as bactérias, evitando os inúmeros prejuízos

por elas causados. O controle das bactérias foi efetivo quando o extrato de própolis, a

solução de ampicilina e o extrato de pomelo foram utilizados (Figura10), sendo que este

último foi menos eficaz (no controle das bactérias) em ambos os inóculos.

35

Aa

AB

Ca

AB

Ca

AB

Ca

BC

Da

CD

Ea

DE

a

AB

a

EFa

Fa Ac

AB

bc

AB

Cc

AB

Cbc

BC

c

AB

Cbc

CbCcB

Cb

Cb A

c

Ac

Ac

AcAc

AbAc

Ab

Aab

Ac

Ab

BC

b

Bb

BC

b

BC

b

BC

b

BC

a

BC

b

CbBC

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Ciclos

Con

tam

inan

tes

Fina

l(1

07 UFC

/mL)


Figura 9: Interação entre biocidas e ciclos para o número de UFC mL-1 de bactérias emamostragens realizadas no final das fermentações. Letras maiúsculas comparammédias entre ciclos e letras minúsculas comparam médias entre biocidas.

BaAa

Ac AcAc Ac

Bb Ab

0

0,5

1

1,5


Con

tam

inan

tes

Fina

l (1

07 UFC

mL-1

)


Figura 10: Interação entre biocidas e inóculos para concentração de bactériascontaminantes (10 7 UFC mL-1) em amostragens realizadas no final das fermentações.Letras maiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparamas médias entre os biocidas.

36

Os resultados da análise de variância para o plaqueamento dos vinhos diluídos

para 10-8 em meio PCA mostraram haver diferenças significativas para biocidas,

inóculos e ciclos (p<0,001) em plaqueamentos feitos tanto no início quanto no final das

fermentações (Tabela 4).

O meio de cultura elaborado para o crescimento de microrganismos totais

mostrou que estas estavam presentes em ambos os momentos das análises. Alguns

gêneros de bactérias exercem um efeito inibidor sobre a levedura em função da

pressão osmótica exercida pela presença de ácido lático no meio de cultivo no caso do

vinho (NGANG et al., 1989).

Tabela 4: Análise de variância do Número de UFC em placas de PCA de vinhosdiluídos a 10-8 em amostragens feitas no início e final das fermentações em vinho demosto de cana-de-açúcar.

Causas da variação UFC mL-1 (valores de F) em PCA

Início Final

Biocidas (A) 49,54** 155,45**

Inóculos (B) 11,47** 7,79**

Ciclos (C) 18,53** 22,77**

AxB 4,29** 3,37*

AxC 3,67** 8,85**

BxC 1,16NS 1,39NS

AxBxC 2,43** 2,48**


Das interações entre os fatores pode-se observar que para o tratamento

testemunha o número de UFC mL-1 foi semelhante em ambos os inóculos e superior

para os tratamentos com extrato de própolis, solução de ampicilina e extrato de pomelo

respectivamente, evidenciando a capacidade dos biocidas usados neste estudo em

controlar as bactérias láticas, que são produtoras de peptídeos cuja função é executar

a comunicação célula-célula e exercer atividade antimicrobiana sobre outras espécies

de bactérias QUADRI (2002) o que faz a supremacia destas no ambiente em questão.

37

Analisando-se a interação entre biocidas e inóculos no início das fermentações

para o inóculo composto pela Saccharomyces o número de UFC mL-1 foi distinto nos

tratamentos testemunha e com extrato de pomelo e semelhante nos tratamentos com

extrato de própolis e solução de ampicilina (Figura 11 e 12). Para o inóculo composto

pela mistura de leveduras não houve diferença significativa entre os tratamentos

testemunha e extrato de pomelo que apresentaram número de UFC mL-1 elevados, ou

seja o biocida natural, extrato de pomelo, proporcionou crescimento de bactérias láticas

semelhante ao que ocorreu na testemunha na dosagem utilizada neste estudo, o que

pode caracterizar a sua incapacidade de controlar este grupo de bactérias.

O biocida natural extrato de própolis e o convencional solução de ampicilina

apresentaram menor número de UFC mL-1 em ambos os inóculos, sendo que o extrato

de própolis foi mais efetivo no controle das bactérias no inóculo composto pela mistura

de leveduras (Figura 11) este comportamento foi semelhante ao final dos ciclos

fermentativos.

AaAa

AcAc

Ab

Bc

Aa

Bb

100

120

140

160

180

200

220


PC

A in

icio

(UFC

x 10

8 mL-1

)


Figura 11: Interação entre biocidas e inóculos no número de UFC em placas de PCAde vinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os biocidas.

38

BaAa

AbAcBb

Ac

Ba Ab

7090

110130150170190210230


PC

A fi

nal(U

FCx

108 m

L-1)


Figura 12: Interação entre biocidas e inóculos no número de UFC em placas de PCAde vinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no final das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os biocidas.

Da interação entre biocidas e ciclos observou-se que para vinhos inoculados no

meio de cultura PCA, não mostraram diferenças significativas entre os tratamentos

quanto ao número de UFC mL-1 tendo apresentado maiores valores nos ciclos 2, 3, 4 e

5. A partir do 6° ciclo fermentativo o tratamento testemunha, quando comparado aos

demais, mostrou maior número de UFC mL-1. O menor número de UFC mL-1 foi

observado nos tratamentos com extrato de própolis e solução de ampicilina, seguidos

pelo tratamento com extrato de pomelo em avaliações feitas no início das fermentações

(Figura 13) e também no final destas. Resultado semelhante ocorreu na avaliação

direta (câmara de Neubauer), evidenciando o efetivo controle das bactérias pelos

biocidas estudados.

39

Aa

AB

a

Aa

AB

Ca

BC

Da

CD

a

CD

a

Da

Ea

CD

a

AcA

b

Ac

AbAb

AaA

aAa

Aa

Ab

AB

c

Ab

Ab

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b

AB

ab

AB

a

AB

a

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a

Bb

AB

a

AB

Cb

Aa

AB

abAa

BC

Dab

AB

Ca

BC

Da

BC

Da

CD

a

Db

50

90

130

170

210

250

290

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

PC

A In

icia

l(UFC

x 10

8 mL-1

)


Figura 13: Interação entre biocidas e ciclos no número de UFC em placas de PCA devinhos diluídos a 108 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os biocidas.

No final dos ciclos fermentativos, os tratamentos com extrato de própolis e

solução de ampicilina apresentaram menores números de UFC mL-1 e não diferiram

entre si ao longo dos processos. A testemunha não diferiu (em alguns ciclos) do

tratamento com extrato de pomelo quanto ao número de UFC mL-1 , evidenciando

novamente que este biocida na dosagem utilizada neste estudo foi menos eficaz que os

demais biocidas utilizados.

Para vinhos diluídos para 10-8 e plaqueados em meio WLN próprio para o

crescimento de leveduras, a análise de variância das médias do número de unidades

formadoras de colônia por mL revelou a existência de diferenças significativas para

biocidas, inóculos, ciclos e para as interações entre estes (p<0,001) em vinhos

analisados no início e no final das fermentações (Tabela 5).

40

Tabela 5: Análise de variância do Número de UFC em placas de WLN de vinhosdiluídos a 10-8 em amostragens feitas no início e final das fermentações (WLN inicio deciclo e WLN final de ciclo), em vinho de mosto de cana-de-açúcar.

Causas da variação UFC mL-1 (valores de F) em WLN

Início Final

Biocidas (A) 1674,19** 258,61**

Inóculos (B) 7,37** 228,61**

Ciclos (C) 1656,75** 406,72**

AxB 1161,97** 80,73**

AxC 109,24** 19,84**

BxC 247,82** 101,11**

AxBxC 166,95** 25,42**


Da interação entre biocidas e inóculos observou-se que no início das

fermentações em meio WLN o número de UFC mL-1 foi maior no inóculo S. cerevisiae

para os tratamentos com extrato de própolis e solução de ampicilina. Tal era esperado

pois as condições oferecidas pelos vinhos neste estudo eram mais favoráveis ao

crescimento das leveduras, pois devido ao efeito dos biocidas, ocorreu menor número

de bactérias que poderiam competir com o inóculo pelos nutrientes e açúcares do meio

(CHERUBIN, 2003) (Figuras 14 e 15). O número de UFC mL-1 neste meio de cultura foi

maior no inóculo composto pela mistura de leveduras nos vinhos provenientes dos

tratamentos com extrato de própolis e solução de ampicilina, demonstrando que a

combinação de leveduras (convencional e nativas) aliado ao fato de estarem presentes

em vinhos com menor número de bactérias devido a interferência das biomoléculas

constituíra para que o meio fosse mais propício para a fermentação.

Da interação entre inóculos e ciclos no início e final das fermentações o número

de UFC mL-1 observados em placas de WLN aumentou do início ao final dos cilcos para

ambos os inóculos (Figuras 16 e 17).

41

AcBd

Aa

Bb

BbAa

Bd

Ac

100

120

140

160

180

200


WLN

inic

io (U

FCx1

08 m

L-1)

Testem unha Própolis Am picilina Pom elo

Figura 14: Interação entre biocidas e inóculos no número de UFC em placas de WLNde vinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os biocidas.

Bd

Ac

Bc

AbBb

AaAaBb

50

70

90

110

130


WLN

Fin

al (U

FCx1

08 mL-1

)


Figura 15: Interação entre biocidas e inóculos no número de UFC em placas de WLNde vinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no final das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os biocidas.

42

Ca

Aa

Ba

DaCD

a

Eb

Fb

Gb

Hb

Ib

Db

Ab

Bb

BbBb

Ca

Da

Ea

Fa

Ea

60

120

180

240

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

WLN

Inic

ial (

UFC

x 1

08 mL

-1)


Figura 16: Interação entre inóculos e ciclos para número de UFC em placas de WLN devinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os inóculos.

Da interação entre biocidas e ciclos, o extrato de própolis e solução de ampicilina

apresentaram, de maneira geral, maior número de UFC mL-1 ao longo dos ciclos

fermentativos, em relação aos demais tratamentos, em avaliações feitas no início das

fermentações (Figura18) e final das fermentações.

43

Ab

Bb

Cb

Ba

Ba

EbD

a

EFb

Fb

Eb

Aa

Aa

Ba

Cb

Db

Ca

Eb

Ca

Da

Ca

40

80

120

160

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

WLN

Fin

al (U

FC x

10

8 mL-1

)


Figura 17: Interação entre ciclos e ciclos para número de UFC em placas de WLN devinhos diluídos a 108 em amostragens realizadas no final das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os inóculos.

Ea

Gb

Gc F

d Ed

CD

c

BC

b

Bc

Ac

Dc

Eb E

a Da C

a

Aa

Bb A

a Ab

Ab

CcE

b

Ab G

Ha

Gb F

b

Bc

Ca B

a Aa

Da

FG

c

Gc F

c

Ec

BC

c

Bc

Dc C

d

Ad Ab

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

WL

N In

icia

l (U

FC

x 10

8 /mL-1

)


Figura 18: Interação entre biocidas e ciclos para número de UFC em placas de WLN devinhos diluídos a 10-8 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os biocidas.

44

Observou-se também que no meio WLN houve crescimento de leveduras que

apresentaram colônias com bordas pontiagudas que desidratavam rapidamente o meio

de cultura e produziam formação vigorosa de células (Figura 19A). Isto ocorreu

principalmente no vinho proveniente do inóculo composto pela mistura de leveduras.

Ocorreu também crescimento de leveduras de coloração rubra (Figura 19B).

Figura 19: Placas com meio de cultura WLN de vinhos (testemunha) diluídos à 10-8.

Os vinhos diluídos para 10-6 e plaqueados em meio MRS para crescimento de

bactérias láticas mostraram diferenças significativas quanto ao número de UFC mL-1

nos plaqueamentos feitos no início e final dos ciclos fermentativos, para biocidas,

inóculos e ciclos, verifica-se interações entre eles, principalmente em amostras

analisadas no início das fermentações (Tabela 6).

A partir da interação entre biocidas e ciclos observou-se que o maior número de

UFC mL-1 tanto no início quanto no final das fermentações foi contabilizado nos vinhos

dos tratamentos testemunha e com extrato de pomelo. Os menores números de UFC

mL-1 foram contabilizados nos tratamentos com extrato de própolis e solução de

ampicilina (Figura 20). Portanto a capacidade dos biocidas natural e convencional em

controlar bactérias principalmente, já que nestes plaqueamentos houve raras colônias

de fungos.

A B

45

Tabela 6: Análise de variância do Número de UFC ml-1 em placas de MRS de vinhosdiluídos a 106 em amostragens feitas no início e final das fermentações (MRS inicio deciclo e MRS final de ciclo), em vinho de mosto de cana-de-açúcar.

Causas da variação UFC mL-1 (valores de F) em MRS

Início Final

Biocidas (A) 232,02** 426,89**

Inóculos (B) 11,11** 7,51**

Ciclos (C) 7,09** 13,55**

AxB 4,24** 2,02NS

AxC 3,45** 4,86**

BxC 3,14** 1,73NS

AxBxC 1,88* 1,18NS


Ea

Da

Da

BC

Da

CD

a

AB

Ca

BC

Da

AB

CD

a Aa

AB

a

Aa A

b

Ab

Ab A

b

Ab

Ab

Ab Ac Ac

AbAa

Ab

Ab Ab A

b

Ab

Ab

Ac A

cBa

Aa A

a

Aa A

a Aa

Aa A

a

Ab

Ab

0

5

10

15

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

MR

S fi

nal (

UFC

106 m

L-1)


Figura 20: Interação entre biocidas e ciclos para número de UFC em placas de MRS devinhos diluídos a 106 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os biocidas.

Da interação entre inóculos e ciclos observou-se que no início dos reciclos, o

número de UFC mL-1 foi maior no inóculo composto pela mistura de leveduras (Figura

21) o que também ocorreu em avaliações realizadas no final das fermentações.

46

Ba

AB

a Aa

Aa

AB

b

Ab

Aa A

a

AB

Cb

AB

b

Da

CB

a AB

CD

a AB

CD

a Aa

AB

a

BC

Da

AB

a

AB

Ca

AB

Ca

2

6

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

MR

S In

icia

l (U

FC x

106 m

L-1)


Figura 21: Interação entre inóculos e ciclos para número de UFC em placas de MRS devinhos diluídos a 106 em amostragens realizadas no início das fermentações. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os ciclos.

Ao longo dos ciclos fermentativos, os tratamentos biocidas extrato de própolis e

solução de ampicilina mantiveram as médias de UFC mL-1 abaixo de 5 106 UFC mL-1,

enquanto que os tratamentos testemunha e com extrato de pomelo mostraram números

entre 1,0 e 1,6.107 UFC mL-1 em meio MRS, tanto no início (Figura 21), quanto no final

dos ciclos fermentativos o que, de acordo com CHERUBIN (2003), causa prejuízos

econômicos significativos. O meio MRS foi o que menos evidenciou variação

morfológica e de tamanho das colônias, sendo que a maioria apresentava bordas lisas

e de cor branca.

47

4.3 Glicerol

De acordo com o quadro da análise da variância, pode-se observar que houve

diferenças significativas na produção de glicerol para biocidas, inóculos, ciclos e para

as interações entre eles (p<0,001).

Tabela 7: Análise de variância dos valores médios de glicerol mg mL-1 dos vinhos demosto de cana-de-açúcar.

Causas da variação Glicerol (valores de F)

Biocidas (A) 84,79**

Inóculos (B) 65,00**

Ciclos (C) 15,85**

AxB 48,61**

AxC 14,80**

BxC 10,88**

AxBxC 10,34**


Os maiores teores de glicerol foram obtidos pelo inóculo composto por S.

cerevisiae nos vinhos oriundos de mostos tratados com extrato de pomelo. Este fato

pode estar ligado a ação de compostos presentes no extrato desse antimicrobiano

natural sobre as atividades e o desempenho fisiológico das leveduras. O inóculo S.

cerevisiae mostrou-se ainda sensível à solução de ampicilina, originando maiores

valores deste triálcool. Considerando-se o fato de que a produção de diferentes

quantidades de glicerol depende da estirpe da levedura (BASSO et al.,1996) a variação

entre inóculos era esperada, além de que isto pode se intensificar na presença de

certas biomoléculas, como aquelas presentes no extrato de pomelo que, a exemplo do

extrato de própolis, é composto por diversos princípios ativos (Figura 22).

O glicerol forma-se na mesma via de síntese do etanol, como um desvio,

competindo com este pela utilização do poder redutor (NADH), motivo pelo qual a

síntese deste composto é inversamente proporcional à do etanol (BASSO et al., 1996).

48

AbaAc AaAcBa

AbBa

Aba

10

12,5

15

17,5

20


Glic

erol

(mg

100m

L-1)


Figura 22: Interação entre biocidas e inóculos na produção de glicerol mg mL-1 nosvinhos. Letras maiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculascomparam as médias entre os biocidas.

Da interação entre biocidas e ciclos verificou-se que a produção do triálcool,

formado pela redução da dihidroxicetona fosfato (DHAP) a glicerol 3-fosfato, através da

enzima glicerol 3-fosfatase (CRONWRIGHT & ROHWER, 2002), foi menor na

testemunha (ciclos: 7, 8, 9 e 10) e no tratamento onde se utilizou o extrato de própolis

(ciclos 1, 2, 3 ,4 e 5), seguidos pelo tratamento com solução de ampicilina e, finalmente,

naquele com extrato de pomelo, o qual apresentou maiores valores de glicerol nos

primeiros ciclos fermentativos (Figura 23).

Ao longo dos ciclos fermentativos, a produção de glicerol variou e os maiores

valores foram produzidos nos 5° e 6° ciclos, em todos os tratamentos (Figura 23). Este

fato pode estar relacionado com a limpeza feita no fundo das dornas para remoção de

material inerte, células mortas e bactérias, o que, devido à redução da viabilidade

celular, pode ter ocasionado estresse no inóculo restante, acarretando maior produção

de glicerol.

49

Db

Dc

BC

Db

BC

Da

AB

b

AB

Cb

Aa

Aa

Ab

CD

b

AB

Ca

Aa

Aa

AB

CaA

b

AB

b

BC

b

Cb

DcDc

AB

a

BC

bAB

Ca

AB

Ca

AB

Cb

Cb

Aa

AB

Cb

Cb

AB

Cb

DaC

Db

CD

a

Da

Aa

Aa

AB

a

BC

aAB

aAB

a

6

9

12

15

18

21

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Glic

erol

(mg

100

mL-1

)


Figura 23: Interação entre biocidas e ciclos na produção de glicerol mg mL-1 no svinhos. Letras maiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculascomparam as médias entre os biocidas.

No tratamento com extrato de pomelo, a formação de glicerol foi maior nos seis

primeiros ciclos, em relação aos demais tratamentos, provavelmente resultado da

resposta das leveduras ao estresse nelas provocado por este extrato. Após o 6° ciclo os

teores de glicerol para os tratamentos com extrato de própolis, solução de ampicilina e

extrato de pomelo foram semelhantes, o que pode estar relacionado com a adaptação

dos inóculos à presença da biomolécula que outrora causava estresse.

Valores elevados de glicerol no produto final são indesejáveis. Este estudo

mostrou que o extrato de pomelo proporcionou maiores teores de glicerol. Embora

estes valores tenham se estabilizado a partir do 6° ciclo. Neste caso, a qualidade da

bebida estaria comprometida, já que a maioria dos produtores de cachaça misturam os

destilados provenientes de diferentes ciclos fermentativos em tanques de

armazenamento, para posterior comercialização.

50

4.4 Acidez Sulfúrica

Quanto à acidez dos vinhos, analisando-se a interação entre biocidas e inóculos,

observou-se que os maiores valores ocorreram no tratamento testemunha em ambos

os inóculos; contudo, no inóculo composto pela mistura de leveduras produziram-se

vinhos com menor acidez em todos os tratamentos em relação ao inóculo S cerevisiae.

A acidez dos vinhos tratados com biocidas foi menor que 2g L-1 e a acidez dos vinhos

dos tratamentos com extrato de própolis, solução de ampicilina e extrato de pomelo

foram menores do que a acidez do vinho testemunha em ambos os inóculos. Portanto,

quanto a acidez produzida, o comportamento dos inóculos foi semelhante (Figura 24).

Ba

Aa

BbAb AbAb AbAb

1

1,5

2

2,5

3


Aci

dez

(H2S

O4 m

L-1

)


Figura 24: Interação entre biocidas e inóculos na acidez mg mL-1 no s vinhos. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre inóculos e letras minúsculas comparam asmédias entre os biocidas.

Em observações feitas da interação inóculos e ciclos, nos primeiros quatro ciclos

fermentativos, em ambos os inóculos, a acidez não diferiu significativamente entre si e

se manteve em torno de 1,5 g L-1. Os maiores valores de acidez foram observados no

51

inóculo composto por S. cerevisiae, ficando entre 2,5 e 3 gL-1. Já no inóculo composto

pela mistura de leveduras, os valores ficaram entre 1,5 e 2 gL-1 (Figura 25).

As bactérias contaminantes do processo fermentativo provocam um aumento na

acidez do meio, devido à maior produção dos ácidos fixos e voláteis (AMORIM &

OLIVEIRA, 1982). No presente trabalho, o ligeiro aumento da acidez evidenciado no

tratamento testemunha foi decorrente da ação do maior número de bactérias no meio,

assim como o aumento progressivo da acidez observada no decorrer dos ciclos. Logo a

ação dos biocidas estudados seja ela mais ou menos eficaz teve reflexos na acidez dos

vinhos.

Aa

AB

a

BC

a

CaCa

Da

DaDa

Da

Da

Ab

Ab

Aa

Aa

Bb

Cb

BaBa

Ba

Ba

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Aci

dez

(g H

2SO

4mL-1

)


Figura 25: Interação entre inóculos e ciclos na acidez mg mL-1 no s vinhos. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os inóculos.

4.5 Teor Alcoólico

A análise de variância dos valores médios para o grau alcoólico dos vinhos indica

diferenças significativas para biocidas, inóculos, ciclos e para as interações entre eles

52

(p<0,001 e p<0,05), exceto para a interação entre biocidas e inóculos, que não

apresentou diferenças significativas.

Tabela 8: Análise de variância dos valores médios do álcool vv1 dos vinhos de mosto decana-de-açúcar.

Causas da variação Teor Alcoólico (valores de F)


Inóculos (B) 53,40**

Ciclos (C) 11,71**

AxB 1,48NS

AxC 4,13**

BxC 3,07**

AxBxC 1,81*


Comparando-se os inóculos, observou-se que os maiores teores de álcool

ocorreram naquele composto pela mistura de leveduras, corroborando com as

conclusões obtidas por GUIDI (2000), DATO (2001) e FIALHO (2004) que descreveram

a mistura destas leveduras como excelentes fermentadoras (Figura 26).

Em observações feitas a partir da interação entre biocidas e ciclos, os vinhos do

tratamento com extrato de pomelo foram aqueles que produziram menor teor alcoólico

em relação aos tratamentos, testemunha, extrato de própolis e solução de ampicilina

(Figura 27), o que pode ser explicado pela maior produção de glicerol pelas leveduras

naquele tratamento, resposta à anaerobiose e/ou estresse osmótico das células de

levedura (OVERKAMP et al., 2002). As células de leveduras produzem glicerol para

manter o potencial redox citosólico para, mesmo sob condições de estresse, obter ATP

e NADH da via glicolítica (CRONWRIGHT & ROHWER, 2002).

53

Cb B

Cb

Bb A

a

AB

a

Ba

BC

b

BC

a

Cb B

Ca

BC

a AB

a

Aa

AB

a

BC

a

AB

Ca

AB

Ca

Ca

BC

a

BC

a

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Teor

Alc

oólic

o (v

v-1 )


Figura 26: Interação entre inóculos e ciclos nos teores alcoólicos dos vinhos. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os inóculos.

CD

ab AB

CD

ab

Aab Aa

AB

a

AB

a

AB

Ca

Db

Db B

CD

b

Ca

AB

Ca

Aa

AB

a

AB

Ca

AB

Ca

BC

a

BC

a

Ca AB

Ca

AB

a

Cb B

Cb

AB

b

Aa

AB

a

AB

a

AB

a

AB

a

AB

ab

AB

c

Ac

BC

c

AB

Cb

AB

Cb

BC

b

BC

b

BC

c

Cc BC

c

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

Teor

Alc

oólic

o (v

v-1)


Figura 27: Interação entre biocidas e ciclos nos teores alcoólicos dos vinhos. Letrasmaiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculas comparam as médiasentre os inóculos.

54

4.6 Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT)

De acordo com a análise de variância das médias dos valores de Açúcares

Redutores Residuais Totais (ARRT) presentes nos vinhos, pode-se observar diferença

significativa entre biocidas (p<0,001), ciclos (p<0,05) e para as interações biocidas e

inóculos (p<0,05) e biocidas e ciclos (p<0,001); Portanto verifica-se que os inóculos não

interferem nos níveis de ARRT dos vinhos.

Tabela 9: Análise de variância dos valores médios de ARRT dos vinhos de mosto decana-de-açúcar.

Causas da variação ARRT (valores de F)


Inóculos (B) 0,51NS

Ciclos (C) 2,02*

AxB 3,17*

AxC 2,05**

BxC 0,47NS

AxBxC 0,51NS


Observou-se em representação gráfica a interação biocidas e ciclos, verificando-

se que no tratamento onde se empregou extrato de pomelo, a porcentagem de ARRT

foi superior aos demais tratamentos, já estes, não diferiram entre si. Tal fato pode estar

relacionado ao estresse provocado pelo biocida extrato de pomelo nos inóculos. Nesta

condição, as leveduras não foram capazes de metabolizar grande parte do açúcar do

mosto, além de desviarem a rota fermentativa para a produção de glicerol, em

detrimento da síntese de etanol (Figura 28).

O extrato de pomelo tem na sua composição elementos capazes de controlar

bactérias, como é o caso do ácido caféico; No entanto, também possui moléculas de

terpenos, compostos capazes de controlar o desenvolvimento de fungos ORDONEZ

(2004), podendo assim, interferir na fisiologia das leveduras. O extrato de própolis,

embora de composição variável e complexa, não mostrou neste estudo possuir

55

princípios ativos que interfiram de forma negativa no desempenho fisiológico das

leveduras.

Ab

Ab

Ab

Ab Ab

Ab

Ab

Ab

Ab

Ab

Ab Ab

Ab

Ab Ab Ab

Ab Ab

Ab

Ab

Ab

Ab

Ab

Ab Ab

Ab

Ab

Ab Ab

Ab

AB

a

Aa

BC

a

AB

Ca

AB

Ca

BC

a

BC

a

BC

a

Ca BC

a

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclos

AR

RT

(%)


Figura 28: Interação entre biocidas e ciclos nos valores médios de ARRT presente nosvinhos. Letras maiúsculas comparam as médias entre ciclos e letras minúsculascomparam as médias entre os biocidas.

4.7 Componentes Secundários

Os componentes secundários analisados por cromatografia gasosa e analisados

estatisticamente, conforme descrito no capítulo materiais e métodos, mostraram valores

que não diferiram entre si em ambos os inóculos, bem como entre os biocidas

utilizados. Para compostos como: N-propanol, valores entre 20 e 25 mg 100 mL-1, N-

butanol, valores entre 0,4 e 0,6 mg 100 mL-1 , metanol, valores entre 2 e 3 mg 100

mL-1, álcool isoamílico 270 a 280 mg 100 mL-1 e acetona, valores entre 0,2 e 0,32 mg

100 mL-1 . Portanto, dentro daqueles previstos na legislação para compostos

secundários da cachaça.

56

Os componentes secundários, como os aldeídos, foram significativamente

superiores nos vinhos provenientes do inóculo S. cerevisiae, enquanto que este

composto apresentou menores valores nos vinhos obtidos do inóculo composto pela

mistura de leveduras (Figura 29). Embora estes valores não tenham ultrapassado

aqueles previstos na legislação, pesquisas revelam que cachaças ricas em acetaldeído

são provenientes de alambiques cuja separação das frações cabeça, coração e cauda

não é realizada (CHAVES & POVOA,1992).

Composto como o metanol não foi observado nas amostras analisadas, o que

pode estar relacionado com o preparo do mosto, onde o caldo foi coado para retirada

do bagacilho, que contém pectinas que, por hidrólise ácida é responsável pela

formação do metanol durante a fermentação.

O isobutanol foi produzido em maiores quantidades nos vinhos obtidos a partir do

inóculo composto pela mistura de leveduras, e esta diferença foi significativamente

maior do que aquela observada para o inóculo S. cerevisiae (Figura 30). Segundo

SUOMALAINEN & LEHTONEN (1979), as quantidades de propanol, isoamílico e

isobutanol produzidas durante a fermentação do mosto variam conforme a levedura

utilizada. Resultados concordantes foram observados neste estudo no inóculo

composto pela mistura de levedura convencional e leveduras nativas.

Para o carbamato de etila presente nos destilados, o inóculo composto pela

mistura de leveduras apresentou maior teor deste composto, sendo os menores valores

observados para o inóculo S. cerevisiae, no entanto estes valores provavelmente não

se atribuem aos inóculos mas sim a precursores deste composto nos vinhos.

As análises para detectar e quantificar compostos secundários nas cachaças

originadas neste estudo, objetivar não somente a detecção destes congêneres per si,

mas também de incrementos significativos na produção de compostos não permitidos;

ainda a possibilidade de formação de compostos outrora não freqüentes no destilado,

que poderiam estar relacionados à adição aos mostos dos diferentes biocidas

estudados.

57

0

10

20

30

Saccharomyces cerevisiae Mistura

Inoculos

Ald

eído

s m

g 10

0mL-1

Figura 29: Interação entre biocidas e inóculos nos valores médios de aldeídos presentenos destilados.

0

20

40

60

80

Saccharomyces cerevisiae Mistura

Inoculos

Isob

utan

ol m

g 10

0mL

-1

Figura 30: Interação entre biocidas e inóculos nos valores médios de isobutanolpresente nos destilados.

V. CONCLUSÕES:

O extrato de própolis pode ser utilizado no controle de bactérias

contaminantes, uma vez que se mostrou tão eficiente quanto a ampicilina.

Os biocidas, na dosagem utilizada, não interferiram na formação de

componentes secundários avaliados.

O extrato de pomelo, nas condições deste trabalho, mostrou-se inadequado

no controle de bactérias contaminantes, por causar inibição parcial do processo

fermentativo.

Novos estudos devem ser conduzidos a fim de identificar os princípios ativos

do extrato de própolis responsáveis pela redução do número de bactérias

contaminantes da fermentação alcoólica.

VI REFERÊNCIAS

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http://inventabrasil.net.t5.com.br/cachaça.htm. Acesso em: 29 de jun. 2005.

AFFONSECA, F. A cachaça quer virar símbolo nacional. Jornal O Tempo, Belo

Horizonte, 8 outubro.2000. Negócios: bebidas, p.4.

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