COMPOSTOS BIOATIVOS DO ABRICÓ (Mammea americana),...

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POLLYANE DA SILVA PORTS MARÇAL DE VASCONCELOS

COMPOSTOS BIOATIVOS DO ABRICÓ (Mammea americana),

FRUTA DA REGIÃO AMAZÔNICA BRASILEIRA.

CAMPINAS,

2015

vii

RESUMO GERAL

Este trabalho objetivou avaliar a fruta Mammea americana, conhecida popularmente como abricó, obtida de dois estados brasileiro (Belém/PA e Manaus/AM) e mais 2 acessos (Kamatá 1 e Kamatá 2) cedidos pela EMBRAPA – Amazônia Oriental quanto a presença de compostos químicos (fenólicos totais e individuais, capacidade antioxidante, ácidos graxos e tocoferóis) presentes na polpa da fruta. Inicialmente foi feito um estudo para otimização da extração dos compostos fenólicos presentes na polpa, utilizando uma metodologia de superfície de resposta (MSR) no intuito de avaliar a melhor condição de extração para obtenção dos fenólicos totais. Após a obtenção do ponto ótimo (52% de metanol/água, 5 extrações consecutivas no tempo de 10 minutos cada uma) esta foi aplicado a todas as amostras e nelas foram realizadas a avaliação da capacidade antioxidante, através dos métodos in vitro do radical livre estável DPPH• (2,2-difenil-1-picrilidrazila), pelo Método de Redução de Ferro (FRAP) e pelo método de ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Os compostos fenólicos majoritários foram separados, identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada aos detectores de arranjo de diodos e de espectrometria massas (HPLC-PDA-MS/MS). Através do uso da metodologia de superfície de resposta (MSR) para otimização da extração obteve-se resultados para compostos fenólicos totais presentes na polpa em na faixa de 3,53 a 7,12 mgEAG.mL-1, dentre às análises de capacidade antioxidante a de ORAC foi a que mostrou resultados mais expressivos, valores que variaram entre 23,27 e 153,05 μM ET/g, para Kamatá 2 e Manaus respectivamente. Aplicou-se também uma MSR para otimização das condições de hidrólise (liberação das agliconas), onde o composto utilizado como resposta foi o ácido 3,4-dihydroxybenzóico, a concentração deste composto variou de 109,53 a 195,95 mg.g-1, além deste, outros compostos foram detectados com a ajuda de um espectrômetro de massa como a quercetina e o kaempferol. A análise de perfil e composição dos ácidos graxos presentes na polpa foi realizada através de um GC/FID e a confirmação em um GC/MS. Foram encontrados nas maiores porcentagens o ácido palmitoleico com 26%, juntamente com o ácido oleico com 20%, seguido do ácido linoleico com 20% e do ácido linolênico com 17%. Para análise de tocoferóis apenas o alfa-tocoferol foi detectado na concentração de aproximadamente 1,1 µg.g-1 para todas as amostras. Os resultados evidenciam que o abricó possui quantidade significativa de ácidos graxos insaturados e de tocoferóis, contudo demonstra reduzida capacidade antioxidante e baixo teor de compostos fenólicos. Entretanto, em consideração a enorme biodiversidade do Brasil, o conhecimento e divulgação desses resultados é um incentivo para o início de muitos outros trabalhos que podem ser realizados para aumentar a demanda e incentivar a produção e comercialização do abricó, além da possibilidade de inserção das mesmas em outras áreas industriais.

Palavras-chave: Abricó, fenólicos, antioxidante, ácidos graxos e tocoferóis.

ix

ABSTRACT

This study evaluated the Mammea Americana fruit, popularly known as apricot, obtained from two Brazilian states (Belém/PA and Manaus/AM) and 2 accesses (Kamata 1 and Kamata 2) provided by EMBRAPA - Eastern Amazon, for the presence of chemical compounds (total and individual phenolics, antioxidant capacity, fatty acids and tocopherols) in the fruit pulp. Initially a study was performed to optimize the phenolic compounds extraction present in the pulp, using a response surface methodology (RSM) in order to assess the best extraction condition to obtain the total phenolics. After the optimum condition was established (52% methanol/water, 5 consecutive extraction of 10 minutes each), it was applied to all samples. The antioxidant capacity was evaluated by using the in vitro stable free radical •DPPH method (2,2-diphenyl-1-picrilidrazila), the iron reduction method (FRAP) and the method ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). The major phenolic compounds were separated, identified and quantified by high-performance liquid chromatography coupled to diode array detectors and mass spectrometry (HPLC-PDA-MS/MS). By using response surface methodology (RSM) for optimization it was ranger obtained 3,53 to 7,12 mgGAE.mL-1 for the extraction of total phenolic compounds present in the pulp. The antioxidant capacity by ORAC analysis was the one that showed better results, values ranging between 23,27 and 153,05 uM ET/g to Kamata 2 and Manaus, respectively. RSM was also applied for hydrolysis conditions (release of the aglycones) optimization. In this analyse, the compound used as was the 3,4-dihydroxybenzóico acid, the concentration of this compound ranged from 109,53 to 195,95 µg.g-1 besides this, others compounds, such as quercetin and kaempferol, were detected with the aid of a mass spectrometer. The fatty acids profile and composition present in the pulp was performed using a GC/FID and confirmed on a GC/MS. The higher amounts were found for palmitoleic acid (26%), followed by oleic acid (20%), linoleic acid (20%) and linolenic acid (17%). At tocopherol analysis only alpha-tocopherol was detected at a concentration around 1,1 μg.g-1 for all tested samples. The results show that apricot has a significant amount of unsaturated fatty acids and tocopherols, on the other hand apricot extracts presented reduced antioxidant capacity and low phenolic compounds content. However, taking into account the enormous biodiversity of Brazil, the knowledge and dissemination of these results is an incentive for the beginning of many other jobs that can be performed to increase demand and encourage the production and marketing of apricot, plus the ability to insert it in other industrial areas.

Keywords: Apricot, phenolics, antioxidant, fatty acids and tocopherols.

xi

SUMÁRIO

RESUMO GERAL....................................................................................................vii

ABSTRACT..............................................................................................................ix

INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................................1

REFERÊNCIAS................................................................................................3

CAP I: Revisão bibliográfica

1.1. Diversidade Amazônica....................................................................7

2.2. Abricó (Mammea americana)............................................................8

1.3. Compostos fenólicos.........................................................................9

1.3.1. Extração.......................................................................................11

1.3.2. Métodos de ánálise......................................................................12

1.3.3. Hidrólise.......................................................................................14

4. Capacidade antioxidante...................................................................15

5. Ácidos graxos....................................................................................18

6. Tocoferóis..........................................................................................20

REFERÊNCIAS.....................................................................................23

CAP II: Otimização da extração dos compostos fenólicos assistida por

ultrassom utilizando metodologia de superfície de resposta e determinação

da capacidade antioxidante em abricó (Mammea americana)

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................39

2. MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................43

2.1. Amostras.......................................................................................43

2.2. Caracterização dos frutos de abricó..............................................43

2.3. Reagentes e solventes..................................................................44

2.4. Extração assistida por ultrassom..................................................44

2.5. Delineamento experimental para otimização da extração usando

um planejamento composto central (PCC) através de uma

metodologia de superfície de resposta (MSR)..............................44

2.6. Determinação dos Compostos Fenólicos Totais...........................46

2.7. Determinação do potencial antioxidante in vitro............................46

xii

2.7.1. Capacidade antioxidante pelo radical livre DPPH...................46

2.7.2. Ferric Reducing Antioxidant Power – FRAP…………………...48

2.7.3. Oxygen Radical Absorbance Capacity – ORAC………………48

2.8. Análise Estatística.............................................................................52

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................49

3.1. Características Físicas dos Frutos de Abricó................................49

3.2. Otimização da extração para análise de fenólicos totais..............51

3.3. Capacidade antioxidante dos extratos de abricó..........................57

3.4. Sequestro do radical DPPH•…………………………………………57

3.5. Ferric Reducing Antioxidant Power – FRAP……………………….58

3.6. Oxygen Radical Absorbance Capacity – ORAC…………….........59

4. CONCLUSÃO...........................................................................................62

REFERÊNCIAS........................................................................................63

CAP. III. Análise dos compostos fenólicos presentes na Mammea americana

por cromatografia líquida (UHPLC/DAD-MS-MS) através da otimização da

hidrólise utilizando uma técnica estatística multivariada

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................73

2. MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................76

2.1. Amostras.......................................................................................76


2.3. Determinação dos compostos fenólicos por UHPLC/DAD-MS-

MS.................................................................................................77

2.3.1. Otimização da hidrólise...........................................................77

2.3.2. Análise cromatográfica ..........................................................78

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................79

3.1. Otimização das condições de hidrólise.........................................78

3.2. Identificação dos compostos fenólicos por UHPLC/DAD-MS-

MS.................................................................................................85

4. CONCLUSÃO...........................................................................................89

REFERÊNCIAS........................................................................................90

Anexos.....................................................................................................93

xiii

CAP. IV. Estudo da composição dos ácidos graxos e tocoferóis presentes na

polpa do abricó (Mammea americana), fruta da região amazônica brasileira

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................103

2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................105

2.1. Amostras.......................................................................................105


2.3. Extrações......................................................................................106

2.3.1 Lipídios Bligh-Dyer........................................................................106

2.3.2. Ésteres metílicos de ácidos graxos..............................................106

2.3.3. Tocoferóis....................................................................................107

2.4. Determinação dos ácidos graxos CG-FID......................................107

2.5. Confirmação da identidade por CG-MS..........................................108

2.6. Análise de Tocoferóis......................................................................109

2.7. Análise estatística...........................................................................109

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................109

3.1. Composição de ácidos graxos........................................................109

3.2. Composição de tocoferóis...............................................................114

4. CONCLUSÃO........................................................................................117

REFERÊNCIAS.....................................................................................118

CONCLUSÃO GERAL.........................................................................................123

xv

“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos

mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.”

(Fernando Pessoa)

“A força não provém da capacidade física e sim de uma vontade indomável.” (Mahatma Gandhi)

http://pensador.uol.com.br/autor/Fernando_Pessoa/

xvii

Dedico este trabalho aos meus familiares pelo incentivo

em especial aos meus pais Fátima e Rubens, principalmente

a minha mãe por todo o seu amor, dedicação e apoio

incondicional ao longo de toda a minha vida; a minha tia

Alice que sempre me apoiou nos momentos mais difíceis; a

minha Tia Mitze pelo seu enorme carinho mesmo depois de

anos; ao meu irmão Thyago; in memória de minha avó

Noêmia, que nos deixou saudades, e onde quer que esteja sei

que estará sempre torcendo por mim.

xix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por não me deixar desistir dos meus objetivos nos momentos

difíceis e de desanimo, pela forca, benção e fé.

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), instituição na qual, lutamos para

fazer parte do seu corpo de alunos, onde tive o privilégio de cursar um curso de pós

graduação. Esta que nos ensinou não somente os conteúdos a nível intelectual, mais

também a sermos pessoas melhores; lugar em que no convívio do dia-a-dia aprendemos que

as dificuldades podem ser superadas com esforço, humildade e dedicação.

Agradeço a minha orientadora, Profª. Drª. Helena Teixeira Godoy pela atenção,

ensinamentos e paciência de sempre.

À banca examinadora, Dra. Daniele Rodrigues, Dra. Cláudia Kowalski, Dra.

Merenice Sobrinho e a Dra Juliana Pallone, pelas contribuições, sugestões e atenção

dedicada ao aperfeiçoamento deste trabalho.

A todos do Laboratório de Análise superior e inferior pelos momentos de risadas que

pude compartilhar com todos vocês e é claro a imensa ajuda e conhecimentos transmitidos

durante todo desenvolvimento deste trabalho. Em especial a Maria Rosa (simplesmente

uma pessoa iluminada), o Wellington (companheiro de todas as horas) a Thais (fofinha), a

Dani, a Tayse, ao Marcus, o Mateus, Danilo, Janclei, Alane, Elenice, Léo.

Não podia faltar aqueles amigos que mesmo não estando mais presente no convívio

diário do laboratório, também foram fundamentais para a efetivação deste. Minha querida

amiga Elede e Merê, obrigada pelo carinho, contribuição e auxílio em todos os momentos.

Aos meus grandes amigos (mesmo que não saibam) Renan, que mesmo distante sei

que devo imensamente e sempre estará nos meus agradecimentos, a minha amiga do peito

Fêr Mandelli e é claro a minha Xará do coração (Poli), que sempre vou guardar como

exemplo de pessoa Feliz!

E por fim minhas amigas de longa data, que mesmo tão longe se fazem tão presente

Karlinha, Paulinha, Beta, Rose e Sol.

À CAPES pela concessão da bolsa de doutorado

Em geral, a todos que aqui não citei, mas que de certa forma colaboraram e estiveram

presentes ao longo deste trabalho com os quais vivi momentos maravilhosos durante o

decorrer de todo o tempo que aqui estive em fim a todos o meu sincero, MUITO

OBRIGADA!

1

INTRODUÇÃO GERAL

A América Tropical é considerada centro de origem de muitas árvores

frutíferas, algumas das quais foram domesticadas ao longo do tempo pelos povos

nativos. A sua riqueza se dá também pela situação geográfica, a heterogeneidade

e a mistura de duas floras, a da América do Norte e a da Amazônia, as quais se

estendem até as áreas baixas da América Central (RUFINO et al., 2010).

O consumo de frutas tropicais está aumentando no mercado interno e nos

mercados internacionais, devido ao crescente reconhecimento da sua função

nutricional e funcional, além do seu valor terapêutico (RUFINO et al., 2010).

No Brasil, diversas espécies não-tradicionais vêm sendo utilizadas pelas

populações locais, pelo grande potencial para exploração no mercado de consumo

in natura e/ou industrializado. No entanto, essas espécies necessitam ser

preservadas, cultivadas racionalmente e caracterizadas através do estudo de suas

propriedades, visando sua utilização no mercado de alimentos funcionais. Além

disso, existe uma demanda cada vez maior nos mercados interno e externo por

novos sabores, cores e texturas (LORENZI et al., 2002).

Neste sentido o abricó (Mammea americana L.), pertencente à família do

garcinia (Clusiaceae), uma fruta originalmente das Índias Ocidentais e do norte da

América do Sul, atualmente é encontrada principalmente na Amazônia

(CAVALCANTE, 1991). Torna-se uma fruta interessante por se tratar de uma fruta

ainda silvestre, ou seja, a colheita ainda tem caráter extrativista e dados

relacionados à sua produção e comercialização ainda são escassos.

As frutas, de um modo geral, desempenham um papel de grande destaque

pelos benefícios à saúde que nos proporcionam, traduzindo no aumento da

expectativa de vida, vitalidade, prevenção de inúmeras doenças, como também

pela presença de nutrientes (vitaminas, minerais e fibras) (LORENZI et al., 2006).

Segundo Madhavi et al. (1997), as principais doenças relacionadas a

peroxidação lipídica são: hemocrematose, doença de Keshan, artrose, reumatismo

e outros processos inflamatórios, aterosclerose e doenças cardiovasculares em

geral, carcinogêneses, etc. O saldo dos efeitos negativos causados pela

2

peroxidação lipídica pode ser demonstrado em números populacionais, já que

doenças cardiovasculares matam mais do que todas as formas de câncer juntas.

O aumento significativo, nos últimos anos, das enfermidades crônicas e

degenerativas converteu-se em um dos principais problemas de saúde nos países

desenvolvidos e em desenvolvimento. Isto tem aumentado o interesse da ciência

em descobrir fatores preventivos destes processos. Neste sentido, estudos tem

demonstrado que o consumo de frutas e verduras vem sendo apontado como

fundamental na prevenção de enfermidades, devido à presença de diferentes

compostos bioativos nesses alimentos. (COSTA & ROSA, 2006).

Segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia (2004) os distúrbios

cardiovasculares são responsáveis, no mundo, por um terço do total de mortes.

No Brasil especificamente, estas doenças situam-se como a mais importante na

causa de mortes. Essa alta incidência de doenças cardiovasculares é

frequentemente correlacionada ao alto consumo de alimentos ricos em colesterol

e gorduras saturadas, ao baixo consumo de fibras dietéticas e principalmente de

biocompostos com capacidade antioxidante, tais como os compostos fenólicos

(LIM et al., 2007).

Tendo em vista a importância de se investigar novas fontes de nutrientes e

compostos funcionais, o estudo para caracterização da Mammea americana,

conhecida popularmente como abricó, mostra-se de grande relevância, já que

dados relacionados à sua composição físico-química ainda são bastante

escassos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial desta fruta ainda

pouco explorada e proporcionar informações a respeito de substâncias benéficas

à saúde. Para isso o conteúdo total de compostos fenólicos e a capacidade

antioxidante por diferentes métodos, foram avaliados. A identificação e a

quantificação os compostos fenólicos majoritários presentes na polpa e o perfil dos

ácidos graxos e tocoferóis presentes na fruta foram realizadas através de técnicas

cromatográficas. A divulgação desses resultados é um incentivo para o início de

muitos outros trabalhos que podem ser realizados para aumentar a demanda e

incentivar a produção e comercialização desta fruta, além da possibilidade de

inserção da mesma em outras áreas industriais.

3

REFERÊNCIAS

COSTA, N. M. B.; ROSA, C. O. B. (Ed.). Alimentos funcionais. Viçosa: Ed.

Folha de Viçosa, 202p. 2006.

LIM, Y. Y.; LIM,T.T.; Tee, J. J. Antioxidant properties of several tropical

fruits: A comparative study. Food Chemistry 103. 1003–1008. 2007.

LORENZI, H. et al. Frutas brasileiras e exóticasss cultivadas (de

consumo in natura). São Paulo: Instituto Plantarum de Estudos da Flora, 672p.

2006.

LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e

exóticas cultivadas. Nova Odessa: Instituto Plantarum, p, 544, 2002.

MADHAVI, D. L.; SINGHAL, R. S.; KULKARNI, P. R. Technological aspects

of food antioxidants. In: MADHAVI, D.L.; DESHPANDE, S.S.; SALUNKHE, D.K.

Food antioxidants – technological, toxicological and health perspectives.

New York: Marcel Dekker, Inc., 1997.

RUFINO, M. S. M.; ALVES, R.; BRITO, E. S.; PÉREZ-JIMÉNEZ, J.;

SAURA-CALIXTO. F.; MANCINI-FILHO. J. Bioactive compounds and antioxidant

capacities of 18 non-traditional tropical fruits from Brazil. Food Chemistry 121

996–1002, 2010.

5

Cap I

Revisão bibliográfica

Pollyane da Silva Port’s1, Helena Teixeira Godoy1

1 Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CEP 6121, 13083-862, Campinas, SP, Brasil.

7

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. Diversidade Amazônica

A região Amazônica possui uma grande variedade de frutas com aromas e

sabores diversificados, muitas vezes desconhecidas ou pouco utilizadas, que

podem apresentar potencialidade econômica, trazendo maior perspectiva de

valorização da região.

Quando se buscam informações sobre frutíferas não ou pouco comerciais,

depara-se com um número muito grande de espécies. Somente das Américas são

citadas cerca de mil espécies nativas, distribuídas em 80 famílias, sendo que pelo

menos 400 são de origem ou ocorrem no Brasil. Entre as frutíferas tropicais de

alguma importância, cerca de 300 espécies, das quais apenas 10% são do Brasil

e estas possuem um grande potencial de exploração (DONADIO et al., 2002).

O Brasil possui um grande número de frutas exóticas ainda pouco

exploradas, frutas essas que além do grande potencial para a agroindústria podem

se tornar uma fonte de renda futura para a população local. Esses frutos

representam uma oportunidade para os produtores locais ganharem acesso a

mercados especiais, onde os consumidores enfatizam não só o caráter exótico

também a presença de nutrientes capazes de prevenir doenças degenerativas não

transmissíveis (ALVES, et al., 2008). Nos últimos anos o consumo de frutas já não

é simplesmente um resultado de gosto e preferência pessoal, mas se tornou uma

preocupação de saúde, devido ao vital conteúdo de nutrientes que elas carregam.

Além dos nutrientes essenciais, a maioria dos frutos apresentam quantidades

consideráveis de micronutrientes, como minerais, vitaminas, e compostos

fenólicos secundários (VASCO, et al., 2008)

Das espécies conhecidas como frutas exóticas, poucas apresentam dados

sobre a sua caracterização. Quando apresentam, estes dados contêm geralmente

a porcentagem total de gordura, fibras, proteínas e minerais, carecendo, contudo

de um aprofundamento mais específico de sua composição nutricional e funcional.

Em especial, as frutas e sementes oleaginosas, que além de contribuírem muito

para a alimentação das populações locais, também são utilizadas para fins

8

medicinais sendo que várias partes das plantas são utilizadas (casca, sementes e

polpa) (NASCIMENTO et al., 2008).

A bacia amazônica é rica em recursos genéticos de frutas e plantas

oleaginosas e sua exploração econômica é potencialmente de grande importância

para a região. Entre as frutas e oleaginosas extraídas na Amazônia, muitas são

excepcionalmente ricas em micronutrientes, principalmente em antioxidantes, tais

como carotenoides, antocianinas e outros polifenóis (ROSSO & MERCADANTE,

2007).

1.2. Abricó (Mammea americana)

O abricó (Mammea americana L.), como pode ser visualizado na Figura 1,

pertencente à família da garcinia (Clusiaceae) é uma fruta originária das Índias

Ocidentais e do norte da América do Sul, atualmente encontrada principalmente

na Amazônia e algumas outras poucas regiões (CAVALCANTE, 1991). O

abricoteiro foi introduzido na Amazônia Brasileira no início do século XIX, sendo

inicialmente cultivado no então Jardim Botânico da capital da Província do Pará e

utilizado na arborização de ruas. Os primeiros pomares comerciais de abricoteiro

foram estabelecidos em meados da década de 1980, implantados com mudas

oriundas de sementes, advindo desse fato, grande proporção de plantas do sexo

masculino e expressivas variações fenotípicas. O fruto é muito popular no estado,

sendo conhecido em outras regiões do Brasil como abricó-do-pará

(CAVALCANTE, 1996).

Figura 1. Mammea americana, conhecida comumente como abricó

9

Estudos desenvolvidos na Embrapa Amazônia Oriental evidenciaram que

na microrregião de Belém a frutificação do abricoteiro ocorre de junho a dezembro

(NASCIMENTO et al., 2008). Para a cidade de Manaus não foram encontrados, na

literatura, estudos relacionados a época de floração e frutificação do abricó.

Por se tratar de uma fruta ainda silvestre, ou seja, a colheita ainda tem

caráter extrativista, dados relacionados à sua produção e comercialização ainda

são escassos, sabe-se porém que, depois da coleta os frutos são repassados para

intermediários a um baixo custo e revendidos em mercados maiores a um valor

mais elevado. No atual cenário, a demanda é pequena e destinada apenas aos

consumidores locais (BRAGA et al., 2010).

Os frutos de abricó se apresentam na forma de drupas globosas e

volumosas, de 12 – 18cm de diâmetro, contendo de uma a quatro sementes,

podendo o fruto chegar ao peso de até 1kg. Possui casca rugosa, coriáceo-flexível

de cor pardo-alaranjada, mesocarpo (parte comestível) constituído de uma polpa

brilhante, compacta, firme, fibrosa, de coloração alaranjado intenso, de um

agradável sabor e aroma perfumado. O fruto é consumido cru e usado também

para produção de conservas, doces e pastas. Suas sementes são ovaladas,

planoconvexas, com 6 – 8cm de comprimento, imersas na polpa e envolvidas pelo

endocarpo rugoso, em geral são amargas, resinosas e utilizadas como um agente

vermífugo (CAVALCANTE, 1991; MORALES & DUQUE 2002). Contudo, dados

sobre a sua composição ainda são excassos.

1.3. Compostos fenólicos

Atualmente, os compostos fenólicos ganharam bastante destaque em

função de sua capacidade antioxidante trazendo grandes benefícios à saúde

(CAVALCANTE, 1991; BRAGA et al., 2010). Alguns frutos tipicamente amazônicos

apresentam consideráveis concentrações de compostos fenólicos, como é o caso

do açaí, bem como de outros frutas (ROSSO & MERCADANTE, 2007; YANG,

2009).

Os compostos fenólicos são considerados um dos grupos de compostos

bioativos responsáveis pelos efeitos benéficos à saúde. Embora existam outros

10

mecanismos, o modo de ação mais citado é a capacidade antioxidante pela

habilidade de sequestrar espécies reativas de oxigênio e quelar íons metálicos. O

conhecimento do conteúdo de compostos fenólicos presentes nos alimentos a

base de vegetais é uma importante ferramenta para o entendimento do seu papel

na saúde humana, assim como para programas que visam o aumento do seu

consumo. Acredita-se que a atividade biológica destes compostos está

diretamente relacionada com a sua estrutura química (MONTEIRO et al., 2007;

MOLLER & LOFT, 2006).

Os compostos fenólicos são metabólitos secundários presente nas plantas

e são amplamente distribuídos no reino vegetal. Englobam desde moléculas

simples até outras com alto grau de polimerização, e podem estar presentes na

forma livre (aglicona), ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas em diversas

partes das plantas (comestíveis e não comestíveis), como nas sementes, frutos,

folhas, casca do caule e também na raiz. Atualmente são conhecidas mais de

8.000 estruturas, cujas origens orgânicas são ligadas ao caminho metabólico do

ácido chiquímico e ao metabolismo dos fenil propanoides (ANTOLOVICH et al.,

2000; DREOSTI, 2000).

Em sua estrutura básica, possuem um anel aromático com um ou mais

substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais que os confere poder

antioxidante, podendo ser naturais ou sintéticos. Dentre eles, destacam-se os

flavonoides, os ácidos fenólicos, os taninos e os tocoferóis considerados os

antioxidantes fenólicos mais comuns de fonte natural (ADOLFO LUTZ, 2007).

Tais substâncias ocorrem naturalmente em frutas, vegetais, nos chás e

vinhos (SCALBERT et al., 2005). A importância dos compostos fenólicos está

diretamente relacionada com a atividade fisiológica, a habilidade de capturar

espécies reativas de oxigênio, quelar íons metálicos, inibir a nitrosação, inibir o

potencial de auto-oxidação, além de apresentar a capacidade de modular certas

enzimas celulares ativas (ANTOLOVICH et al., 2000).

Pesquisas indicam uma grande variação na produção de metabólitos

secundários pelas plantas, isto é, plantas pertencentes a mesma espécie podem,

ao longo dos anos, sofrer variações quanto a sua constituição genética e atividade

11

fisiológica, condicionadas pelo processo de seleção ambiental. Esta diversidade

genética ocorre devido ao processo metabólico de cada organismo (HERAS,

1998).

Essas interferências ambientais são os principais precursores no estímulo

para produção desses metabólitos. A concentração desses componentes químicos

nas plantas dependerá do controle genético e dos estímulos proporcionados pelo

meio. Os genes biossintéticos podem ser ativados para estimular a superprodução

de substâncias defensivas, como em casos, por exemplo, de agressão por micro-

organismos e/ou pragas, solo pobre em nutrientes, clima, ferimentos, exposição à

luz UV, etc. Dentre estas substâncias encontram-se os compostos fenólicos, que

também podem atuar nas plantas como antimicrobianos, fotorreceptores, atrativos

visuais e repelentes de predadores (NICHENAMETLA et al., 2006; PIETTA, 2000).

1.3.1. Extração.

O objetivo na extração de compostos fenólicos é liberar estes compostos a

partir das estruturas vacuolares onde eles são encontrados, quer através de

ruptura do tecido da planta ou através de um processo de difusão (COOPER,

2004; KRINSKY E JOHNSON, 2005)

Para isso o preparo da amostra é um fator de grande relevância sobre a

eficiência de extração. A estabilização por meio de congelamento e liofilização são

recursos muito utilizados para a preservação da amostra no período prévio à

análise. A maceração e a redução do tamanho das partículas da amostra são

medidas que aumentam a superfície de contato entre amostra e solvente

facilitando a extração e a reprodução do método (ZHANG et al., 2008).

Assim, vários métodos são referidos na literatura para extração desses

compostos. As técnicas mais utilizadas na literatura são a extração líquido-líquido

(LLE) ou extração sólido-líquido (SLE), para o caso de matrizes sólidas, e a

extração em fase sólida (SPE) (LIMA et al., 2004; TURA & ROBARDS, 2002).

Entretanto, dentre os métodos mais utilizados, a extração assistida por

ultrassom é frequentemente usada para a extração de material vegetal. Este

processo de extração é mais rápido e mais completo em comparação com os

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814608009655#bib2


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18211028

12

métodos tradicionais, tais como maceração/agitação, porque a área de superfície

em contato entre as fases de sólidos e líquidos é muito maior. O tempo de

extração varia e depende da preparação prévia da amostra. Algumas extrações

podem ser realizadas completamente em pouco menos que 30 minutos (KRINSKY

E JOHNSON, 2005). Compostos fenólicos solúveis são geralmente extraídos

utilizando água, metanol, etanol ou acetona. A presença de açúcares anexados

faz com que os compostos fenólicos fiquem mais solúveis em água. Combinações

dos solventes orgânico, como por exemplo, os acima citados com água são,

portanto, solventes melhores para glicosídeos. Em contraste, agliconas menos

polares, tais como isoflavonas, flavanonas e flavonas altamente metoxilados e

flavonóis tendem a ser mais solúvel em solventes não-aquosos (COOPER, 2004;

KRINSKY E JOHNSON, 2005).

O metanol é normalmente o solvente mais empregado. Ele tem sido

utilizado para extrair flavanonas, flavonas, flavonas metoxiflavonas e dímeros de

flavona. O uso de metanol 70-80% apresentou bom rendimento na extração de

hidroxicinâmico e derivados, flavonas, flavonóis e catequinas de frutas,

leguminosas, uva, sementes e bagaço de vinho. A maioria dos flavonoides ocorre

naturalmente como glicosídeos. Os flavo-glicosídeos mostram solubilidade em

água quando comparado com as correspondentes agliconas. O uso de

metanol/água (50:50) é geralmente suficiente para produzir uma boa extração de

glicosídeos em plantas. No entanto, quando o objetivo do trabalho é a avaliação

quantitativa do teor dos compostos fenólicos os solventes de extração são os

orgânicos e não a água somente (MATSUBARA & RODRIGUEZ-AMAYA, 2006).

Para a preservação dos compostos fenólicos a eliminação de água através

de liofilização, que normalmente é empregada nas amostras antes da extração,

geralmente não degrada os compostos fenólicos excessivamente, o que permite

que as amostras sejam mantidas por longos períodos. Congelar a amostra antes

da extração é também aconselhável uma vez que cristais de gelo podem produzir

lesões na estrutura celular e, consequentemente, facilitar a saída dos

componentes celular facilitando, assim o processo de extração (BOCHI et al.,

2015).


13

Por isso diversas pesquisas tem sido realizadas para a otimização do

processo de extração com solventes e com o uso de alternativas mais recentes,

como a utilização de ultrassom e fluído supercrítico e subcrítico. Nesses trabalhos

são utilizados planejamentos experimentais fatoriais, como o delineamento

experimental composto central rotacional (DCCR), a qual possibilita o estudo das

variáveis de extração simultaneamente. Dessa maneira, além da avaliação de

cada variável individualmente, é possível também a determinação de possíveis

efeitos sinérgicos e antagônicos resultantes de interações entre as variáveis

estudadas (FERREIRA et al., 2007).

1.3.2. Métodos de análise

A determinação dos níveis de compostos fenólicos totais em tecidos

vegetais é a etapa inicial de qualquer investigação de funcionalidade fisiológica. A

capacidade redutora desses compostos pode ser uma das propriedades utilizadas

para nortear a quantificação inicial, porém, em tecidos vegetais, a presença de

carboidratos e outros interferentes com as mesmas características requer

metodologias confiáveis para tais avaliações (ANTOLOVICH et al., 2000).

Para realização da análise de compostos fenólicos totais, métodos

colorimétricos e enzimáticos podem ser utilizados. No entanto, grande parte dos

trabalhos determina o teor de fenólicos por métodos colorimétricos com o reagente

Folin-Ciocalteu, utilizando o ácido gálico como padrão de referência, onde os

resultados são expressos em mg de ácido gálico equivalente por grama de peso

seco (mgEAG/mg) (ASSOLINI et al., 2006).

Estudos relacionados à separação, identificação, quantificação e utilização

dos compostos fenólicos em alimentos, enfrenta uma série de dificuldades, devido

à diversidade de substâncias (fenóis simples, ácidos fenólicos, cumárinas,

flavonoides, taninos e ligninas), a grande polaridade e reatividade, e a

susceptibilidade à ação de enzimas (SOARES, 2002).

Vários métodos são utilizados para a determinação dos compostos

fenólicos majoritários em produtos naturais, no entanto, é de significativa

importância que sejam desenvolvidos métodos capazes de determinar,

14

simultaneamente, uma grande gama de compostos, com rapidez, custos

relativamente baixos e com resultados de qualidade. Seguindo esse objetivo,

diversos procedimentos já foram otimizados para identificar e quantificar fenólicos

em alimentos, incluindo Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),

Cromatografia Gasosa (CG), Eletroforese Capilar (EC) e Eletrocromatografia

Capilar (CEC) (MOLNÁR-PERL & FÜZFAI, 2005). Essas técnicas são de extrema

importância na separação, na identificação e na quantificação dos polifenólicos

(STALIKAS, 2007).

Entre as técnicas cromatográficas para determinação de constituintes

fenólicos biologicamente ativos, a mais utilizada com essa finalidade é o método

por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa com eluição por

gradiente. Quanto à identificação dos compostos, é muito comum utilizar a

detecção por espectrofotometria de absorção na região UV-visível. (BUIARELLI et

al., 1995; KOO et al., 2000; LOPEZ et al., 2001). Neste caso, a identificação é feita

por comparação dos tempos de retenção e dos perfis de espectros de absorção

obtidos de padrões isolados. No entanto, a forma mais conclusiva de identificação

é a utilização de técnicas como a espectrometria de massas e a ressonância

magnética nuclear. Normalmente, os flavonoides são os compostos de maior

ocorrência em folhas, frutos e outras partes aéreas de vegetais, dentre alguns

estão a quercetina, kaempferol e miricetina (SCHIEBER et al., 2001; HÄKKINEN

et al., 1998; PEREZ-MAGARIÑO et al., 1999).

1.3.3. Hidrólise

A determinação quantitativa de flavonoides glicosilados em materiais

vegetais se torna bastante difícil, devido ao seu grande número impossibilitando

assim, a aquisição de padrões. Portanto, os glicosídeos são normalmente

hidrolisados nas agliconas correspondentes, as quais podem ser identificadas e

quantificadas.

Métodos para a hidrólise ácida de flavonoides a partir de vegetais e frutos

foram publicadas por Hertog et al. (1993) e por Hakkinen et al. (1998).

Normalmente, a hidrólise de glicosídeos flavonoides exige concentrações

15

relativamente elevadas (1-2 mol.L-1) de minerais ácidos em condições de refluxo.

Todavia, as condições para realização da hidrólise desses glicosídeos podem ser

rigorosas para alguns dos outros compostos fenólicos presentes, como no caso

das catequinas, que são miricetinas parcialmente degradadas (MERKEN &

BEECHER, 2000; HAKKINEN et al., 1998; HERTOG et al., 1995).

Dessa forma, estudos devem ser realizados e avaliados de acordo com

cada matéria-prima empregada, a fim de desenvolver os melhores procedimentos

e condições de preparação e hidrólise das amostras para a formação de agliconas

de flavonoides, sem que as mesmas sejam degradadas (NUUTILA et al., 2002).

1.4. Capacidade antioxidante

Os estudos relacionados à capacidade antioxidante são de extrema

necessidade frente ao estresse oxidativo que sempre ocorre em nosso organismo.

Esse estresse oxidativo nada mais é do que o desequilíbrio entre o sistema pró e

antioxidante ocorre devido a uma produção descontrolada de radicais livres ou

uma deficiência nos mecanismos de defesa, o que acarreta prejuízo à célula

como, oxidação de lipídios de membrana, proteínas, enzimas, carboidratos e DNA,

que se acumulam com o passar dos anos contribuindo para a degeneração das

células somáticas e indução de doenças crônico-degenerativas, especialmente

associadas com o avanço da idade (HALLIWELL, 1994; FINKEL & HOLBROOK,

2000; LANGSETH, 2000; PIETTA, 2000; SCALBERT et al., 2005; VALKON et al.,

2007).

Os compostos fenólicos, incluindo flavonoides e xantonas, são conhecidos

por inibir a peroxidação lipídica e as lipoxigenases in vitro, através da capacidade

em sequestrar radicais livres, tais como hidroxílicos, superóxidos e peroxílicos, os

quais reconhecidamente promovem o estresse oxidativo celular (LEONG & SHUI,

2002; MOONGKARNDI et al., 2004; OKONOGI, et al., 2007;

TACHAKITTIRUNGROD et al., 2007; LEONTOWICZ et al., 2007). Numerosos

estudos mostram que tais compostos, presentes nos alimentos, estão associados

com ações anticarcinogênica (inibição do câncer de cólon, esôfago, pulmão,

fígado, mama e pele), anti-inflamatória, anti-hepatotóxica, antiviral, antialérgica e

16

antitrombótica (MAZZA & GIRARD, 1998). Além disso podem prevenir a oxidação

de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), diminuindo os riscos da aterosclerose,

atuando na prevenção de doenças cardiovasculares e na absorção de produtos

tóxicos oriundos da peroxidação lipídica (GORELIK et al., 2008; MATSUMOTO et

al., 2003; CHIANG et al., 2004; DUBICK & OMAYE, 2001). Ação antibacteriana

(CHANARAT et al., 1997), antifúngica, anti-inflamatória, antitumoral e atividade

antileucêmica também já foram atribuídas às xantonas (HO et al., 2002).

A maioria dos organismos teve seus sistemas de defesa (antioxidantes)

evoluído para protegê-los contra danos oxidativos, no entanto, estes sistemas são

insuficientes para impedir totalmente o dano (SIMIC, 1988). Por tais motivos,

devido a alta capacidade antioxidante e importância nutricional, os compostos

fenólicos e carotenoides têm se destacado dentre os compostos bioativos

presentes na natureza, fazendo com que a procura por esses antioxidantes

aumentassem significativamente nesta última década (BECKER, 2004; LEE, 2004;

TURA & ROBARDS, 2002; YANG, 2009).

Os compostos fenólicos presentes nos materiais vegetais estão

intimamente associados a sua capacidade antioxidante, efeito este que está

principalmente ligado à sua propriedade de redução-oxidação, atuando por meio

de vários mecanismos: atividade sequestradora de radicais livres, atividade de

transição metal-quelante, e/ou capacidade de desativar o oxigênio singlete. Além

disso, são conhecidos por desempenharem um papel importante na estabilização

da peroxidação lipídica e inibir vários tipos de enzimas responsáveis pela oxidação

no organismo. Estes mecanismos múltiplos do potencial antioxidante tornam o

grupo dos compostos fenólicos um alvo interessante na busca de fitoquímicos

benéficos à saúde (SHAN et al., 2005; SRINIVASAN, 2005; ZHENG et al., 2001).

Para a determinação da capacidade antioxidante, ou da capacidade de

moléculas impedirem reações radiculares e oxidativas, muitos métodos têm sido

aplicados, porém como a informação gerada por cada método varia, torna-se

necessária à aplicação de mais de um método para esta determinação (SILVA et

al, 2007). Para os diversos métodos espectrofotométricos in vitro, alguns são

baseados na captura de radicais livres (ORAC - Oxygen Radical Absorbance

17

Capacity, captura do radical ABTS•, captura do radical DPPH•), outros no Poder

de Redução do Ferro (FRAP) ou na quantificação de produtos formados durante a

peroxidação de lipídios (TBARS, oxidação do LDL) (PAIXÃO et al., 2007;

ANTOLOVICH et al., 2002).

Frente à diversidade da estrutura química dos compostos antioxidantes e

de seus mecanismos de ação, vários ensaios têm sido desenvolvidos para avaliar

a capacidade antioxidante de diferentes amostras. Baseado nas reações químicas

envolvidas, a maior parte dos métodos usados para avaliar a capacidade

antioxidante pode ser dividida em duas categorias: (1) baseados na reação de

transferência de elétrons, representados pelo método de Folin-Ciocalteu e

sequestro de radicais livres, que simulam as espécies reativas de oxigênio, tais

como o DPPH• (1,1 difenil- 2-picrilhidrazil) e o ABTS+• [2,2’-azino-bis(3-etil-

benzolina-6-sulfonado)] e (2) baseados na reação de transferência de átomos de

hidrogênio, representado pelo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e

sistema β-caroteno/ácido linoléico (ARNAO, 2000; HUANG et al., 2005).

Muitos destes métodos avaliam a eficácia de moléculas em impedir as

reações radiculares e oxidativas. Como a informação gerada por cada método

varia, torna-se necessária a aplicação de mais de um método para avaliar de

modo mais completo, a capacidade de antioxidante (BRAGA et al., 2010; PRIOR

et al., 2005).)

Antioxidantes naturais, especialmente em frutas e legumes, têm ganhado

interesse crescente entre os consumidores e a comunidade científica, visto que os

estudos epidemiológicos indicam que o consumo frequente de antioxidantes

naturais está associado com um menor risco de doença cardiovascular e câncer

(LANGSETH, 2000). Os efeitos de defesa de antioxidantes naturais em frutas e

vegetais estão relacionados a três grandes grupos: vitaminas, compostos fenólicos

e carotenoides. O ácido ascórbico e os compostos fenólicos pertencem a classe

de antioxidantes hidrofílicos, enquanto carotenoides pertencem a classe de

antioxidantes lipofílicos (HALLIWELL, 1994).

É importante salientar que apenas a identificação e a quantificação destes

compostos não são parâmetros suficientes para avaliar o quanto um alimento ou

18

um determinado composto é benéfico à saúde, uma vez que tais compostos nunca

estão sozinhos e pode haver reações sinérgicas ou antagônicas entre eles. Assim,

a verificação destas interações também é importante, bem como a verificação da

capacidade antioxidante do alimento como um todo (IACOPINI et al., 2008).

1.5. Ácidos graxos

Cada vez mais tem aumentado a procura por óleos vegetais com

composição especial, tais como óleos de oliva, de girassol, de palma e de linhaça,

que demonstraram um elevado valor comercial devido à presença dos

componentes funcionais (FOSTER & WILLIAMSON, 2009; AQUINO et al., 2012).

As propriedades funcionais dos óleos vegetais também têm sido

amplamente estudadas devido aos seus benefícios a saúde e à sua utilização na

indústria de alimentos. A estabilidade oxidativa de um óleo vegetal pode ser

influenciada pela quantidade de antioxidantes naturalmente presentes ou

adicionados a este produto (ARAIN et al., 2009).

Por definição, ácidos graxos são compostos alifáticos monocarboxílicos

derivados ou contidos na forma esterificada proveniente de uma gordura, óleo ou

cera vegetal ou animal, os quais, comumente, apresentam uma cadeia de 4 a 28

carbonos, saturados ou insaturados (IUPAC, 1997)

Os ácidos graxos (AGs) são os componentes básicos naturalmente

presentes em plantas e animais. A diversidade do comprimento da cadeia, grau de

insaturação, geometria e posição das ligações duplas determinam as

características destes lípidos e a sua origem (LIMA, et al., 2002). As propriedades

dos óleos são muito dependentes do perfi AGs, que fornecem informações sobre o

comprimento da cadeia, porcentagem de saturação, monoinsaturação e poli-

insaturação. Com base nestas informações a determinação do perfil AGs

insaturados presente nos alimentos é de extrema importância, já que sua ingestão

possui impactos benéficos a saúde como, por exemplo, na prevenção de doenças

cardiovasculares (ATTAR-BASHI, et al., 2004; GROOTVELD, et al., 2001).

O método mais utilizado para a análise de AGs envolve a determinação dos

ésteres metílicos correspondentes (FAMEs), utilizando cromatografia gasosa (CG)

acoplado com detector de ionização de chama (FID) (FIRESTONE, 1987). Para

19

lipídios, gorduras e óleos muitas vezes um procedimento de transesterificação

envolvendo a conversão direta dos AGs, para ésteres de alquilo (especificamente

metil ésteres) por álcool na presença de um catalisador é realizada. O

procedimento de derivatização (especialmente para os AGs de cadeia longa) é

obrigatório para aumentar a volatilidade e superar adsorção dos grupos polares

funcionais para a coluna CG (LACAZE et al., 2007). Os AGs termicamente lábeis

também pode ser separada através da cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC), eletroforese capilar (CE) e cromatografia com fluido supercrítico

(BRONDZ, 2002). Antes da determinação analítica, os FAS ou os FAMEs

precisam ser isolados a partir da amostra. Isto é comumente realizado usando

extração líquido-líquido (LLE), procedimento este, utilizado nos métodos oficiais

recomendados pelos órgãos reguladores, como por exemplo, a American Oil

Chemists Society (AOCS) e o Malaysian Palm Oil Board (MPOB) (SIANG, et al.,

2010).

Os principais problemas da técnica LLE são o consumo bruto de solvente

orgânico, a falta de seletividade, tempo longo de análise, além da etapa de

evaporação, que se faz necessário antes da análise para remover o excesso de

solvente. Isto pode conduzir a problemas de contaminação e possível perda de

analítos (BERRUETA, et al., 1993; WU & LEE, 2006). Para superar estes

problemas e para atender à crescente demanda de determinações analíticas, um

esforço considerável tem sido direcionado para abordar estas questões. No início

dos anos 1970, a técnica de extração em fase sólida (SPE) foi introduzida

(BERRUETA, et al., 1993) e muitos trabalhos utilizando esta técnica para a análise

de AGs, foram publicados por exemplo, a determinação da composição de FAs de

cadeia longa no azeite de dendê transesterificado (PUAH, et al., 2006), a

determinação de metil linolenate e metil linoleato na soja derivada de biodiesel (LI,

et al, 2009) e a determinação de AG livre na cerveja (HORÁK, et al., 2009). Mais

recentemente, a microextração trouxe a minimização do uso de vários solventes

utilizados na extração, tais como a microextração em fase sólida (SPME) e

microextração em fase líquida (LPME) que foram introduzidas por Bjergaard e

Rasmussen, (1999).

20

Assim, a análise de ácidos graxos é considerada de rotina em muitos

laboratórios de química de alimentos e controle de qualidade. Após a extração

com solventes orgânicos, a composição em ácidos graxos é determinada

realizando-se a derivatização da amostra, produzindo ésteres metílicos de ácidos

graxos. Os ésteres são separados por cromatografia em fase gasosa, geralmente

utilizando-se detecção por ionização em chama (VENKATACHALAM & SATHE,

2006; VISENTAINER & FRANCO, 2006; FARKAS et al., 2008).

1.6. Tocoferóis

Grãos, vegetais, óleos vegetais e frutas contêm um amplo espectro de

antioxidantes lipofílicos incluindo os tocoferóis. Estudos epidemiológicos e clínicos

indicam que um aumento da ingestão de cereais, vegetais e frutas pode resultar

em uma concentração plasmática mais elevada desses antioxidantes, os quais

têm sido associados com o risco reduzido de doenças degenerativas crônicas, tais

como o cancro, doenças cardiovasculares, leucoplasia oral, danos da pele, e

também estão associadas a diminuição envelhecimento ocular (HAO et al., 2005).

A vitamina E, termo genérico utilizado para designar diferentes compostos

ocorrem em uma variedade de isômeros que se diferem na estrutura de acordo

com o número e a localização de grupos substituintes no anel cromanol. Possui

oito isômeros: α-, β-, γ-, δ-tocoferol (T) e α-, β-, γ-, δ-tocotrienol (T3) (GUINAZI et

al., 2009). E dentre os tocoferóis, especialmente α- e γ-tocoferol, são

particularmente os mais abundantes (BRAUNRATH et al., 2010).

Estes compostos têm sido extensivamente estudados em diversas áreas do

conhecimento, assim com os ácidos graxos, uma vez que desempenham papeis

especialmente importantes na reprodução e em mecanismos antioxidantes de

tecidos animais e vegetais. A ingestão de vitamina E tem despertado interesse e

preocupação principalmente nesta última década, uma vez que compõe

juntamente com a vitamina C, carotenoides, selênio, enzimas (catalase,

peroxidase de glutationa e superóxido dismutase) e flavonoides, o grupo

denominado antioxidantes alimentares (DO et al., 2015; GUINAZI et al., 2009).

Os tocoferóis fazem parte dos micronutrientes lipofílicos que desempenham

um papel importante na saúde humana. Entre os compostos do tocoferol, o α-

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969806X10001416

21

tocoferol é apontado como sendo o mais potente em sua ação antioxidante. No

entanto, alguns trabalhos indicam que outros isômeros como γ- e δ-tocoferol são

melhores antioxidantes que o α-tocoferol (CHAUVEAU-DURIOT et al., 2010;

GUINAZI et al., 2009)

Essas controvérsias, em relação a qual isômero possui maior ação

antioxidante, podem ocorrer devido a diferenças entre os métodos testados, os

substratos utilizados, o nível de oxidação empregado e as metodologias

empregadas para monitoramento da oxidação. Por isso, métodos confiáveis e

sensíveis são essenciais para a determinação da ação antioxidante dos tocoferóis

presentes em alimentos (CHAUVEAU-DURIOT et al., 2010; GUINAZI et al., 2009;

MEHMOOD, 2015). Por isso, se faz importante realizar estudos para avaliar a

presença desses isômeros uma vez que estes podem possuir além de

características químicas diversas podem também atuar de diferentes formas

(LIMA, 1997).

Diversas técnicas têm sido aplicadas para separação, purificação e

quantificação de tocoferóis nas mais variadas matrizes orgânicas e podem ser

utilizadas de acordo com os objetivos da análise e da natureza da amostra. De um

modo geral, um bom método analítico e prático deve ter uma combinação ideal de

extração, separação por cromatografia e funcionalidade do detector. Com base

nas suas propriedades químicas, os tocoferóis podem ser extraídos com solventes

hidrofóbicos tais como clorofórmio ou hexano, separados por coluna usando fase

normal ou fase reversa e quantificado por detectores acoplados a cromatógrafo

como UV, fluorescência, espectrometria de massas (MS) e Ressonância

Magnética Nuclear (RMN). Entre outras técnicas empregadas, podem-se citar as

colorimétricas, cromatografia em camada delgada, a cromatografia gasosa, além

de algumas ainda em desenvolvimento, como a eletroforese capilar (HAO et al.,

2005; GUINAZI et al., 2009).

Porém, desde que foi utilizada para a análise de antioxidantes lipídicos, a

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem sido extensivamente aplicada

e é a técnica preferida pela grande maioria dos pesquisadores da área para a

22

análise de compostos presentes em pequenas quantidades em matrizes

complexas (PINHEIRO-SANT’ANA et al., 2011; GUINAZI et al., 2009).

A fluorescência é a técnica de detecção cromatográfica utilizada para a

análise de tocoferóis e tocotrienóis na maioria dos estudos realizados com HPLC.

Esta preferência para a detecção por fluorescência é atribuída à sua seletividade

mais elevada, a sensibilidade e especificidade em comparação com a detecção

por absorbância (PINHEIRO-SANT’ANA et al., 2011).

Poucos trabalhos têm pesquisado a composição completa dos isômeros da

vitamina E em alimentos, sendo que a maioria tem relatado apenas o conteúdo do

α-tocoferol. Além disso, as tabelas brasileiras de composição de Alimentos ainda

não contemplam os diferentes isômeros da vitamina E, o que torna importante

pesquisas envolvendo a composição completa em alimentos brasileiros (GUINAZI

et al., 2009).

Desta forma, considerando a enorme biodiversidade encontrada no Brasil e

o apelo comercial cada vez maior de ingredientes naturais e funcionais, o objetivo

deste trabalho foi obter extratos caracterizados quanto à composição de fenólicos

totais, capacidade antioxidante, ácidos graxos e tocoferóis dos frutos de Mammea

americana de dois diferentes estados brasileiros (Pará e Amazônia), além de 2

acessos cedidos pela EMBRAPA – Amazônia Oriental.

23

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Cap II

Otimização da extração dos compostos fenólicos

assistida por ultrassom utilizando metodologia de

superfície de resposta e determinação da capacidade

antioxidante em abricó (Mammea americana)


Artigo em preparação para ser publicado no periódico Food Reserch International

1 Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CEP 6121, 13083-862, Campinas, SP, Brasil

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RESUMO

O Brasil é um país com grande diversidade em espécies de frutas tropicais, no

entanto ainda pouco exploradas, mas com um enorme potencial agroindustrial.

Neste contexto a Mammea americana, conhecida popularmente como abricó,

torna-se interessante, por apresentar dados escassos quanto a sua capacidade

antioxidante bem como o seu conteúdo de fenólicos totais. Este estudo visou

avaliar a fruta M. americana, obtida de dois estados brasileiro (Belém/PA e

Manaus/AM) e de 2 acessos fornecidos pela EMBRAPA – Amazônia Oriental,

quanto a presença de substâncias antioxidantes. Foi realizada inicialmente uma

caracterização física dos frutos para obtenção de maiores dados relacionados a

esta fruta. Também foi realizado uma otimização , utilizando metodologia de

superfície de resposta, para avaliar a melhor condição de extração, onde as

variáveis estudadas foram % de solvente (metanol), tempo de extração e número

de extrações . A resposta para o planejamento foi o teor de compostos fenólicos

totais (CFT). A melhor condição encontrada para extração destes compostos foi

com porcentagem de metanol igual a 52%, com 5 extrações consecutivas, no

tempo de 10 minutos cada. Nestes extratos também foi avaliada a capacidade

antioxidante, através dos métodos in vitro do radical livre estável DPPH• (2,2-

difenil-1-picrilidrazila), pelo Método de Redução de Ferro (FRAP), e pelo método

de ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) que mede a capacidade

sequestradora de um antioxidante frente à formação de um radical peroxila. A

faixa dos resultados obtidos para a análise de CFT foi de 3,53 a 7,12 EAG µg.g-1,

para DPPH não se obteve resultados nas concentrações estudadas, para FRAP a

faixa dos resultados ficou entre 18,05 EAG e 39,05 µg.g-1 e ORAC de 19,74 e

164,92 μM equivalente em trolox/g, sendo que estes resultados variaram de

acordo com cada lote e com cada localidade de onde foram obtidos. Os resultados

demonstraram que o abricó apresentou uma significativa capacidade antioxidante

para o método de ORAC, entretanto apresentou baixo teor para fenólicos totais e

reduzida capacidade antioxidante quando foram utilizados os métodos DPPH e

FRAP.

Palavras-chave: Abricó, antioxidantes, compostos fenólicos.

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ABSTRACT

Brazil is a country with great diversity in tropical fruit species, which are still largely

unexplored, but with enormous agroindustrial potential. In this context the

Mammea ammericana, popularly known as apricot is interesting, since it has

sparse data as its antioxidant capacity and its contents of total phenolics. This

study aimed to evaluate the presence of antioxidants in the American M. fruit,

obtained from two Brazilian states (Belém/PA and Manaus/AM) and 2 accesses

provided by EMBRAPA - Eastern Amazon. It was initially performed a physical

characterization of fruits to obtain more data related to this fruit. It was also

conducted an optimization, using the response surface methodology, to evaluate

the best extraction condition where the variables studied were% solvent

(methanol), extraction time and number of extractions. The answer to experimental

design was the content of phenolic compounds (CFT). The best condition found for

these compounds extraction was 5 consecutive extractions of 10 minutes each

with a solution of 52% methanol. In these extracts was also evaluated the

antioxidant capacity by in vitro methods of the stable free radical DPPH• (2,2-

diphenyl-1-picrilidrazila), the iron reduction method (FRAP), and the method ORAC

(Oxygen Radical Absorbance Capacity) which measures the ability of a scavenging

antioxidant opposite the formation of a peroxyl radical. The results range obtained

from CFT analysis was 3,53 to 7,12 mgGAE.mL-1 to DPPH was not obtained

results at the concentrations studied, to FRAP the range of results was between

18,05 and 39,05 EAG mg.g-1 and to ORAC 19,74 and 164,92 uM Trolox

equivalent/g, and those results varied with each batch and each location from

which they were obtained. The results demonstrated that the apricot has a

significant antioxidant ability to ORAC method, however has a low level of total

phenolics and a small antioxidant capacity when it was measured by DPPH and

FRAP.

Keywords: Apricot, antioxidants, phenolic compounds

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1. INTRODUÇÃO

A América Tropical é considerada como centro de origem de muitas árvores

frutíferas, algumas das quais foram domesticadas ao longo do tempo pelos povos

nativos. A sua riqueza se dá também pela situação geográfica, pela

heterogeneidade e pela mistura de duas floras, a da América do Norte e a da

Amazônia, as quais vão até as áreas baixas da América Central (RUFINO et al.,

2010).

O abricó é uma fruta pertencente à família da garcinia (Clusiaceae) e é uma

fruta originalmente das Índias Ocidentais e do norte da América do Sul,

atualmente encontrada principalmente na Amazônia e em algumas outras poucas

regiões (CAVALCANTE, 1991).

É um fruto grande com 7-15 cm (3-6 polegadas) de diâmetro, coberto com

uma casca espessa e resistente, contém uma polpa amarela e brilhante de um

agradável sabor e aroma perfumado que é comido cru e também usado para

conservas. Suas sementes (1-4) em bruto são grandes amargas e resinosas e são

utilizadas como um agente vermífugo (MORALES & DUQUE, 2010).

Levando em consideração o fato do abricó (Mammea americana) se tratar

de uma fruta ainda silvestre, ou seja, a colheita ainda tem caráter extrativista,

dados relacionados à sua produção e comercialização ainda são escassos. No

atual cenário, a demanda é pequena e destinada apenas aos consumidores locais

(BRAGA et al., 2010).

ALVES, et al. (2008), definem as frutas oriundas das espécies consideradas

não-tradicionais como um conjunto de produtos agrícolas nativos ou exóticos de

uma determinada região, pouco conhecidas no mercado pelos consumidores. Nos

países desenvolvidos são conhecidas simplesmente por sua origem como

produtos exóticos, tropicais ou especialidades. A maior parte dos produtos

agrícolas não-tradicionais que são conhecidos, resultam de esforços, inovação e

criatividade na diversificação de produtos mais rentáveis, agregando valor as

matérias-primas locais.

No Brasil, diversas dessas espécies não-tradicionais vêm sendo utilizadas

pelas populações locais, pelo grande potencial para exploração no mercado de

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consumo in natura e/ou industrializado. No entanto, necessitam serem





Contudo o consumo dessas frutas tropicais está aumentando no mercado

interno e mercados internacionais, devido ao crescente reconhecimento da sua

função nutricional e funcional, além do seu valor terapêutico (RUFINO et al.,

2010).

Assim as frutas desempenham papel de grande destaque, seja pelo simples

prazer de consumi-las; seja pelo benefício à saúde que nos proporcionam,

traduzida no aumento da expectativa de vida, vitalidade, prevenção de inúmeras

doenças, como também pela presença de nutrientes (vitaminas, minerais e fibras).

Tudo isso as tornam um alimento essencial, salutar e sem precedentes em nossas

vidas (LORENZI et al., 2006).

Por isso, dados relacionados tanto a suas funcionalidade como as suas

características físicas (como massa, comprimento, textura, diâmetro transversal e

coloração) também se fazem importante pois influenciam na aceitabilidade dos

frutos pelo consumidor bem como no seu rendimento industrial. Esses atributos

fazem-se importante para a qualidade dos frutos de maneira geral, já que estão na

dependência de suas características físicas e químicas e são peculiares a cada

espécie e cultivar, variando também com o clima, solo e época de maturação

(CHITARRA & CHITARRA, 1994; ALVARENGA & FORTES, 1985).

Em relação aos benefícios a saúde, dados científicos mostram que a

ingestão de frutas e outros vegetais estão associados a efeitos anti-

carcinogênicos. Alguns flavonoides têm demonstrado suprimir a carcinogênese em

vários modelos animais (YANG et al., 2001). A propriedade antioxidante dos

flavonoides foi o primeiro mecanismo de ação estudado, em especial no que diz

respeito ao seu efeito protetor contra as doenças cardiovasculares. Os mesmos

têm se mostrado eficientes captadores da maioria dos tipos de moléculas

oxidantes, incluindo o oxigênio singlete e vários radicais livres, envolvidos em

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diversas doenças crônico-degenerativas. Dessa forma, o mecanismo de ação

antioxidante pode agir suprimindo a formação de espécies reativas de oxigênio,

seja por inibição de enzimas ou por quelação oligoelementos envolvidos na

produção de radicais livres, assim como no combate de espécies reativas e/ou

aumentando os mecanismos de defesas (MONTORO et al., 2005; BRACA et al.,

2003).

Geralmente, esses fitoquímicos presentes nas frutas são extraídos usando

diferentes técnicas de extração bem como diferentes tipos de solvente sob

diferentes condições de interações com as matrizes. Métodos como prensagem a

frio, aquecimento sob refluxo (soxhlet) e extração com solventes tem sido

amplamente utilizados para extrair compostos bioativos a partir de produtos

naturais (CONTINI et al., 2008; Du et al., 2007; MANDAL et al., 2007; WANG et

al., 2008). No entanto, as desvantagens, incluindo riscos de segurança, baixa

qualidade do produto, riscos ambientais e os efeitos toxicológicos foram sempre

encontradoa durante a extração (CONTINI et al., 2008; MANDAL et al., 2007).

Portanto, melhorar os métodos de extração é necessário. Recentemente, novos

métodos de extração, tais como, assistida por ultrassom, assistida por micro-

ondas, fluido supercrítico e a extração assistida por enzimas têm sido

desenvolvidos para a extração destes compostos (SPORRING et al., 2005;

VILKHU et al., 2008). Entre eles, a extração assistida por ultrassom é conhecida

como sendo um dos mais econômicos e eficientes meios de extração. Portanto, a

extração ultrassônica pode ser um potencial meio para extrair os compostos com

bioatividade tanto quanto outras técnicas de extração modernas (CHEN, 2015).

A determinação destes compostos fenólicos totais em tecidos vegetais é a

etapa inicial de qualquer investigação de funcionalidade, avaliação biológica e

estímulo ao consumo e sua quantificação em diferentes extratos normalmente é

feita empregando o reagente de Folin-Ciocalteau, que apesar de abundante na

literatura em alimentos, poucos são os trabalhos que descrevem adaptações do

procedimento para extração em matrizes específicas e/ou condições críticas de

preparo de amostra para a quantificação. Cabe ressaltar que o processo de

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extração para distintas matrizes e analitos é fundamental para a estimativa mais

exata de compostos fenólicos para diferentes fins (SAIKIA, 2015; CHEN, 2015).

A otimização de metodologia de extração de um analito em especial é

fundamental, visto que pequenos detalhes podem resultar em efeitos que

comprometem a confiabilidade dos resultados. Para atingir esta meta com o

mínimo de experimentos, uma ferramenta matemática e estatística, que é a

metodologia de superfície de resposta (MSR), comumente usado para otimizar os

parâmetros do processo durante a extração de fitoquímicos das fontes vegetais

como as frutas, pode ser aplicada. A MSR geralmente aplicada é o delineamento

composto central rotacional, que vem sendo utilizada largamente nas indústrias

alimentares para desenvolvimento de novos produtos, bem como otimizar os

processos que têm dois ou mais fatores que influenciam nas respostas do produto

final, já que através dele pode-se avaliar o impacto de diferentes parâmetros,

avaliar as variáveis críticas, observando seus respectivos efeitos e possíveis

interações de fatores nas respostas desejadas e simultaneamente otimizar as

condições experimentais. Este meio de otimização também vêm sendo largamente

empregado na otimização de metodologias analíticas (SAIKIA, et al., 2015; PENA

et al., 2014; JORGE et al., 2013; ELLENDERSEN et al., 2012; LI et al., 2012; YIM

et al., 2012; CHEN, et al., 2015; SOUZA et al., 2009).

Sabendo que os compostos fenólicos são metabólitos secundários e estão

envolvidos em, praticamente, qualquer interação da planta com o ambiente

abiótico (irradiação solar, luz UV, períodos de seca, excesso ou escassez de

nutrientes, índices pluviométricos, estações do ano e poluição), o que pode

ocasionar alterações no metabolismo da planta, modificando a produção destes

compostos e adicionalmente, considerando o fato de que a região amazônica

apresenta grandes variações nos mais diferentes fatores abióticos, a presente

pesquisa teve como objetivo, determinar as condições ideais para a extração dos

compostos fenólicos, a partir da polpa liofilizada de abricó, utilizando uma

metodologia de superfície de resposta e determinar a capacidade antioxidante por

vários métodos in vitro, no extrato otimizado, o que proporcionará informações a

respeito dessa fruta ainda pouco estudada. Além disso, foi observado, se há

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diferença na concentração destes compostos em função dos diferentes locais de

origem das frutas, já que para este estudo obteve-se amostras de dois Estados

brasileiros (Belém e Manaus),além de dois acessos fornecidos pela EMBRAPA no

intuito de investigar a influência da variação genética, sobre a composição da

mesma.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Amostras

As frutas provenientes de acessos (Kamatá 1 e Kamatá 2), utilizadas neste

trabalho foram fornecidas pela Embrapa Amazônia Oriental, Belém/ Pará, in

natura em um único lote para cada um dos acessos, as demais foram obtidas no

comércio local de Belém/PA e em Manaus/AM, em três lotes, para cada um dos

anos, 2011-2012-2013 especificamente no mês de julho. Sendo que cada lote foi

formado por 3 a 4 frutos.

Os frutos dos acessos obtidos juntamente com os frutos dos lotes dos dois

Estados foram descascados, cortados, congelados e liofilizados. As amostras

após serem liofilizadas foram então moídas e acondicionadas em sacos metálicos

(ao abrigo de luz) e seladas a vácuo (livre de O2) e posteriormente guardadas em

freezer (-18 ºC) até o momento das análises.

2.2. Caracterização dos frutos de abricó

A massa dos frutos foi determinada utilizando uma balança eletrônica Marca

Bel M2202 (mark 2200) de precisão (0,01g). Os diâmetros longitudinal e

transversal foram medidos utilizando um paquímetro de 150 mm (MEB 6,

STARRETT). Tais medições foram realizadas em cada fruto, individualmente,

obtendo-se, posteriormente, o valor médio. Os teores de umidade foram

determinados de acordo com o método nº 7.003 da AOAC (1984). Os sólidos

solúveis foram determinados em refratômetro digital à temperatura ambiente,

sendo os valores expressos em graus Brix (ºBrix). O pH dos frutos de abricó foi

medido com um potenciômetro (Bel, modelo W3B), previamente calibrado.

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2.3. Reagentes e solventes

O reagente Folin Ciocalteu foi fornecido pela Dinâmica (Brasil); o padrão

ácido gálico, o padrão Trolox (Ác. 6-idroxi-2,5,7,8-Tetrametilcromano-2-

Carboxílico), o AAPH (Dicloridrato de 2,2-Azobis (2-Metilpropionamidina), o TPTZ

2,4,6-Tri (2-pyridil)-5-triazine) e o radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazina, D-9132)

foram fornecidos pela Sigma (St Louis, MO, USA); o carbonato de sódio anidro, o

perssulfato de potássio, acetato de sódio, o fosfato de potássio bibásico, o fosfato

de potássio monobásico, a fluoresceína sódica e o solvente metanol (grau

analítico) foram fornecidos pela Synth (Brasil).

2.4. Extração assistida por ultrassom

Extração assistida por ultrassom foi realizada em um equipamento

ultrassônico (Microsonic SX-20, Arruda Ultra-sons LTDA, Brasil). As polpas

liofilizadas e moídas do abricó foram pesadas (0,5 g) e colocadas em tubos Falcon

(50 ml), as quais foram acrescidas inicialmente de 10 mL de uma solução

metanol/água em seguida foram levadas para o ultrassom, onde permaneceram

por tempo específico. A porcentagem de solvente e o tempo de extração bem

como o número de extrações foram determinados de acordo com cada ponto do

planejamento. Após cada etapa de sonicação os tubos foram levados à centrífuga

por um período de 5 minutos a 5000 g-1, este processo se deu por vezes

consecutivas de acordo com o número de vezes de re-extração especificadas no

planejamento que pode ser visualizado da Tabela 3. Por fim todos os extratos, de

cada ensaio, foram combinados e filtrados em papel filtro (Whatman) e

posteriormente armazenados em frascos de vidro âmbar com tampa selante, sob

refrigeração até o momento das análises.

2.5. Delineamento experimental para otimização da extração usando um

planejamento composto central (PCC) pela metodologia de superfície de

resposta (MSR)

Inicialmente foram realizados testes para determinar a melhor proporção

entre sólido-líquido, ou seja, volume de extrato suficiente para realização das

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análises. Depois de fixada a melhor proporção entre sólido e líquido, a

porcentagem de solvente, o número de extrações e o tempo necessário de

extração foram otimizados através de um planejamento experimental, onde os

níveis estudados podem ser visualizados na Tabela 1. No intuito de se agilizar as

etapas seguintes à otimização, foi realizada apenas com a mistura dos primeiros

lotes, adquiridos em 2011, dos frutos obtidos de Manaus e Belém.

Tabela 1. Níveis e variáveis estudadas.

Variáveis Cód. Níveis

-1,68 -1 0 +1 +1,68

Solvente (%) X1 20 28,09 40 51,90 60

Extrações (nº) X2 1 2 3 4 5

Tempo (min) X3 10 14,05 20 25,95 30

Para obter a máxima extração dos compostos fenólicos totais (Y1) foi

realizado um Planejamento Composto Central em 5 níveis diferentes (-, -1, 0, +1,

+). Um fatorial completo 23 incluindo 6 ponto axiais (±a = (2k)1/4,onde k = número

número de variáveis independentes) e 3 repetições no ponto central (para avaliar

a repetibilidade da análise e determinar o erro puro do modelo), totalizando assim

17 ensaios independentes (BOX et al, 1978; RODRIGUES & IEMMA, 2012). Após

o desenvolvimento do planejamento um modelo de segunda ordem foi obtido (Eq.

1), para prever a extração máxima destes compostos, com as variáveis

estatisticamente significativas em seguida, este modelo foi utilizado para otimizar o

extração dos CFT para todos os lotes.

A equação quadrática para o referido sistema é:

(Eq. 1)

Onde у é a resposta prevista (para CFT em mg EAG / g), β0 é a média global, βJ é o

coeficiente linear, βij é o coeficiente de interação, βjj é o coeficiente quadrático, ε é o erro do modelo, Xi e XJ são os valores codificados das variáveis independentes.

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2.6. Determinação dos Compostos Fenólicos Totais

A determinação dos compostos fenólicos totais dos extratos foi realizada

espectrofotometricamente, utilizando um espectrofotômetro da marca Pró-

análise/Modelo–UV-1600, de acordo com o método colorimétrico de Folin-

Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão (SINGLETON et al., 1999). Em

ambiente escuro foram adicionados em tubos de ensaio 0,5 mL de extrato de

abricó obtidos a partir do planejamento. Em seguida, foram adicionados 2,5 mL da

solução de Folin-Ciocalteau 10% e após 5 minutos 2,0 mL e uma solução de

Na2CO3 7,5%. Os tubos foram agitados e incubados por 2 horas no escuro.

Depois deste tempo foi feita a leitura de absorbância em comprimento de onda

760 nm. Um branco foi conduzido sob as mesmas condições, substituindo o

extrato pela mesma quantidade de uma solução com a porcentagem de metanol

específica de cada ponto. Uma curva padrão com ácido gálico (concentração de

10 µg.mL-1) foi elaborada da mesma maneira como foi descrito para as amostras,

sendo os resultados obtidos expressos em mg equivalente de ácido gálico por

grama de amostra em base seca. Cada amostra foi analisada em triplicata.

2.7. Determinação da capacidade antioxidante in vitro.

O ponto otimizado da extração para análise de fenólicos totais foi utilizado

para as análises de capacidade antioxidante. Todas as análises foram realizadas

em triplicata. Não foram encontrados dados na literatura para nenhum dos ensaios

realizados, fato este que impossibilitou qualquer análise comparativa.

2.7.1. Capacidade antioxidante pelo radical livre DPPH•

A capacidade antioxidante foi determinada nos extratos metanólicos obtidos

através da redução do radical DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazila), de acordo com

metodologia descrita por Scherer & Godoy (2009) e Brand-williams et al., (1995).

Este é um método bastante utilizado e tecnicamente rápido que se baseia na

capacidade de antioxidantes sequestrarem radicais livres, no caso o radical 2,2-

difenil-1-picril-hidrazida (DPPH•), de cor púrpura e com banda de absorção

máxima em solução metanólica centrada em 517 nm. Este radical, após receber

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um átomo de hidrogênio dos compostos antioxidantes é reduzido adquirindo

coloração amarela. Desta forma, é possível medir a descoloração do radical

espectrofotometricamente e estimar o poder antioxidante de uma amostra

(SCHERER & GODOY, 2009; MOLYNEUX, 2004; BRAND-WILLIAMS et al.,

1995).

Em tubos de ensaio foram adicionados 0,1 mL dos extratos em diferentes

concentrações que variaram para cada amostra e 3,9 mL de uma solução

metanólica de DPPH (31,6 μg.mL-1). Os tubos foram agitados e incubados por 90

minutos. Depois desse tempo foi realizada a leitura de aborbância à 517 nm.

Como composto de referência utilizou-se o ácido gálico que foi substituido pelo

extrato para realização da curva (concentração de 100 µg.mL-1). Para o cálculo da

capacidade antioxidante cada absorbância foi transformada em % Inibição através

da Equação 2:

% Inibição Extrato/Padrão = [(Ab0 - Absi.)/ Abs0] x 100 (Eq. 2)

Onde Abs0 é a absorbância do branco (0,1 mL de água substituindo a amostra) e Absi é a

absorbância da solução reativa contendo a amostra.

Depois de se obter para cada amostra a curva de I DPPH % (que foi

construída a partir de dez concentrações distintas) versus a concentração de

amostra dentro do tubo com DPPH•, utilizou-se a equação do modelo gerado para

encontrar o IC50 (mg.mL-1), ou seja, a concentração necessária de amostra para

neutralizar 50% dos radicais livres de DPPH• presentes no meio reativo. Com esse

valor calculou-se o IAA (índice de atividade antioxidante), que é o parâmetro

utilizado para classificar uma amostra em relação ao seu potencial antioxidante. O

cálculo pode ser visualizado na Equação 3 (SCHERER & GODOY, 2009).

IAA = Concentração de DPPH• (µg.mL-1) (Eq. 3)

IC50 (µg.mL-1)

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2.7.2. Ferric Reducing Antioxidant Power - FRAP

Este método baseia-se na habilidade dos antioxidantes presentes na

amostra reduzirem, em pH baixo, o complexo Fe3+ /tripiridiltriazina (TPTZ), para

Fe2+, de intensa cor azul e absorção máxima a 593 nm. O ensaio foi realizado

conforme método proposto por Benzie e Strain (1996), com pequenas modificações. Em

tubos de ensaio foram adicionados 90 μL do extrato. Em seguida, foram adicionados 270

μL de H2O destilada e 2700 μL do reagente FRAP. Os tubos foram agitados e logo depois

deixados a 37 °C por 15 minutos. Passado esse tempo os tubos foram retirados e

deixados a temperatura ambiente e após 5 minutos a leitura de absorbância foi feita a 593

nm no escuro. Uma curva padrão com ácido gálico foi elaborada, a partir da concentração

de 63 µg.mL-1, da mesma maneira como foi descrito para as amostras, sendo os

resultados obtidos expressos em mg equivalente de ácido gálico por grama de amostra

em base seca (mg EAG/g).

2.7.3. Oxygen Radical Absorbance Capacity – ORAC

Os ensaios foram realizados conforme o método descrito por Dávalos et al.

(2004) com algumas modificações. Este método verifica a capacidade

sequestradora de um antioxidante frente à formação de um radical peroxila que é

formado após o 2,2‟-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloreto (AAPH) sofrer

decomposição térmica a 37 ºC. Os radicais peroxila formados degradam a

estrutura química da fluoresceína sódica, levando a perda da conformação inicial

com o consequente decréscimo da emissão de fluorescência (OU et al., 2001).

Todos os reagentes foram preparados em tampão fosfato 75 mM, pH 7,4.

Neste ensaio 20 µL de amostra foram misturados a 120 µL de uma solução de

fluoresceína (Sigma Chemical Co.,St Louiz, EUA) a 70 nM e incubados a uma

temperatura constante de 37 ºC por 15 minutos, em seguida foi adicionado 60 µL

da solução de AAPH - 2,2´-azobis (2-methylpropionamidine dihydrochloride), a 24

mM, que dá início à reação.

O experimento foi realizado no leitor de fluorescência (FLUOstar Omega,

BMG Labtechnologies) em microplacas de 96 poços de cor preta. A leitura foi

realizada a cada 1 minuto, durante 80 minutos, com emissão a 520 nm e excitação

à 485 nm e temperatura controlada à 37°C.

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O cálculo da perda de fluoresceína foi efetuado com o auxílio da seguinte

fórmula.

AUC = 1 + f2/f1 + f3/f1 + f4/f1 +…+ fn/f1 (Eq. 4)

Onde: AUC = Área sob a curva, f1 = leitura da fluorescência no tempo 1 minuto, f2 = leitura da

fluorescência no tempo 2 minutos e fn = leitura da fluorescência no tempo de 80 minutos.

O AUC foi calculado para todas as amostras, diferentes concentrações do

Trolox, composto usado como referência (concentração de 100 µM), e para o

branco. O AUC do branco foi subtraído do AUC de todas as amostras em

diferentes concentrações de Trolox (PRIOR & CAO, 1999; CAO & PRIOR, 1998).

2.8. Análise Estatística

O tratamento estatístico dos dados foi realizado através da Análise de

Variância (ANOVA), e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível

de 95% de confiança. O Software Statistica 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, EUA)

também foi utilizado para analisar os dados e gerar as superfícies de resposta. O

valor de ajuste da equação do modelo estatístico foi expresso pelo coeficiente de

determinação (R2) e a sua significância estatística foi determinada por um teste F

(análise de variância)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Características físico-química inicial dos Frutos de Abricó

De acordo com a Tabela 2, pode-se observar os valores para a

caracterização inicial obtidas para a fruta de abricó.

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Tabela 2. Caracterização dos frutos de abricó.

Lotes Diâmetro (mm)

Peso (g) Rendimento (g) Brixº pH Umidade (%) Transv. Long.

BELÉM (médias de cada lote)

1º lote (2011) 94,50 ± 2,38b 96,50 ± 4,20a 544,09 ± 42,87a 464,92 ± 118,12a 14,40 ± 0,06a 3,15 ± 0,13a 85,96 ± 1,27a

2º lote (2012) 96,5 ± 5,45ab 96,01 ± 4,90a 569,94 ± 23,41a 528,48 ± 15,51a 13,10 ± 0,10b 3,33 ± 0,15a 87,28 ± 1,05a

3º lote (2012) 108,50 ± 9,15a 105,75 ± 6,70a 597,31 ± 110,50a 470,92 ± 10,12a 14,40 ± 0,04a 3,22 ± 0,17a 86,87 ± 1,10a

MÉDIA 99,83 ± 7,57A 99,42 ± 5,49A 570,45 ± 26,61A 486,11 ± 36,70A 13,97 ± 0,75A 3,23 ± 0,09A 86,70 ± 0,68A

MANAUS (médias de cada lote)

1º lote (2011) 85,02 ± 6,58a 89,75 ± 5,56a 456,65 ± 22,91ab 403,82 ± 15,04a 14,40 ± 0,08b 3,18 ± 0,26b 85,24 ± 1,57a

2º lote (2012) 84,25 ± 6,75a 84,5 ± 7,14ab 467,33 ± 37,94a 406,62 ± 29,87a 12,57 ± 0,52c 3,60 ± 0,08a 84,13 ± 1,28a

3º lote (2012) 78,25 ± 6,13a 75,5 ± 3,87b 398,29 ± 27,88b 335,40 ± 37,06b 16,62 ± 0,15a 3,51 ± 0,21ab 87,17 ± 1,34a

MÉDIA 82,51 ± 3,71B 83,25 ± 7,21A 440,76 ± 37,16B 381,95 ± 40,33B 14,53 ± 2,03A 3,43 ± 0,22A 85,51 ± 1,54A

EMBRAPA (médias de cada lote)

Lote 1* (K1) (2012) 75,75 ± 14,93a 76,75 ± 11,41a 365,71 ± 17,20a 351,48 ± 72,60a 15,00 ± 0,72a 3,62± 0,14a 85,90 ± 1,11a

Lote 1* (K2) (2012) 85,00 ± 6,58a 89,75 ± 5,56a 456,65 ± 22,91a 403,82 ± 15,04a 13,86 ± 1,05a 3,45 ± 0,13a 86,14 ± 0,59a

MÉDIA 80,38 ± 6,54B 83,25 ± 9,19A 411,18 ± 64,30B 377,65 ± 37,01B 14,43 ± 0,81A 3,54 ± 0,12A 86,02 ± 0,17A

MÉDIA GERAL 88,47 ± 10,76 89,31 ± 10,27 482,00 ± 81,87 419,93 ± 63,65 14,29 ± 1,23 3,38 ± 0,19 86,09 ± 1,06

*Valores representam a média de triplicata e/ou quadruplicata ± o desvio padrão, seguidas de letras diferentes, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas colunas em relação às MÉDIAS obtidas de cada localidade, diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

51

Nota-se que os valores referentes ao Brixº, não se diferenciaram

estatísticamente (p<0,05), os frutos apresentaram valores em torno de 14 ºBrix,

independente da localidade e época de colheita, o que mostra que os frutos

encontravam-se maduros, já que os frutos são coletados ao caírem quando

atingem o ápice da maturação. Para os valores de umidade os mesmos

mostraram-se também homogêneos para os diferentes lotes dos diferentes

lugares de obtenção do fruto.

Os dados de caracterização dos frutos encontrados neste trabalho estão de

acordo com os fornecidos por Braga et al. (2010), que encontraram para polpa do

abricó, resultados semelhantes de pH (3,47), ºBrix (12,20) e umidade (85%) aos

obtidos neste trabalho. Aguiar et al. (1980), também encontrou teor de umidade no

abricó de 85%.

Alguns resultados se diferenciaram estatisticamente como, por exemplo, os

obtidos para o 3º lote proveniente de Manaus que foram os menores, para

diâmetro longitudinal, peso e rendimento, quando comparados aos demais obtidos

da mesma localidade nos outros anos. Essas diferenças ocorrem devido às frutas

terem sido coletadas em anos diferentes e, além disso, sofrerem ação de fatores

abióticos naturais como a radiação solar, raios UV, períodos de seca ou chuva,

nutrientes e estações do ano o que pode influenciar em diversas características

das frutas (DEGÁSPARI & WASZCZYNSKYJ, 2004).

3.2. Otimização da extração, assistida por ultrassom para análise de

fenólicos totais

Para otimização da extração dos compostos fenólicos presentes na polpa de

abricó, foi realizado um planejamento experimental com três variáveis (23),

totalizando 17 ensaios, onde se avaliou a porcentagem de solvente em solução

aquosa (% de metanol), o número de extrações e o tempo (em minutos) no

ultrassom. Os ensaios foram realizados em triplicata e em ordem aleatória e a

resposta considerada foi o teor total de fenólicos (Folin-Ciocalteau). A tabela com

as variáveis estudadas bem como os valores de cada nível estão descritas na

52

Tabela 1 (material e métodos). Testes univariados realizados anteriormente

mostraram serem essas as melhores faixas a serem estudadas.

A partir dos níveis estudados obteve-se a matriz (Tabela 3), e os resultados

obtidos foram dados em mg por grama de equivalente em ácido gálico (mg EAG/g)

de amostra liofilizada.

Tabela 3. Matriz do planejamento fatorial 23 com pontos axiais e pontos centrais.

Ensaios Valores codificados Valores reais Resposta*

CFT mg EAG/g**

X1 X2 X3 Sol. (%) Ext. (n°) Tempo

1 -1 -1 -1 28 2 14 1,78 ± 0,03

2 +1 -1 -1 52 2 14 3,06 ± 0,04

3 -1 +1 -1 28 4 14 2,07 ± 0,08

4 +1 +1 -1 52 4 14 3,41 ± 0,05

5 -1 -1 +1 28 2 26 1,70 ± 0,03

6 +1 -1 +1 52 2 26 2,94 ± 0,03

7 -1 +1 +1 28 4 26 2,05 ± 0,05

8 +1 +1 +1 52 4 26 3,43 ± 0,08

9 -1,68 0 0 20 3 20 2,12 ± 0,05

10 +1,68 0 0 60 3 20 3,11 ± 0,07

11 0 -1,68 0 40 1 20 2,18 ± 0,02

12 0 +1,68 0 40 5 20 3,72 ± 0,15

13 0 0 -1,68 40 3 10 3,18 ± 0,05

14 0 0 +1,68 40 3 30 3,27 ± 0,03

15 0 0 0 40 3 20 3,15 ± 0,05

16 0 0 0 40 3 20 3,16 ± 0,04

17 0 0 0 40 3 20 3,33 ± 0,03

*Média de triplicata/ **CFT = fenólicos totais/ EAG = Equivalente em ácido gálico

Os valores de CFT variaram entre 1,7 a 3,7 mg EAG/g, de acordo com a

faixa avaliada (Tabela 3). Dentre os ensaios realizados, o ensaio 12 (com

concentração de metanol de 40% v/v, com 5 extrações no tempo de 20 minutos)

53

foi o que proporcionou a maior extração de fenólicos (3,72 mgEAG/g). A

concentração de metanol (%) e o número de extrações realizadas foram as

variáveis mais relevantes para a extração. Uma maior extração dos compostos

fenólicos foi conseguida quando ocorreu uma combinação entre um maior número

de vezes de re-extrações e o aumento da porcentagem de metanol utilizado.

A partir dos resultados obtidos (FT), foi realizada uma análise de regressão

(Tabela 4) nos dados experimentais e os coeficientes do modelo foram avaliados

em relação às suas significâncias. Assim, ao obter-se os coeficientes de

regressão as variáveis estatisticamente não significativas foram retiradas para

obtenção do modelo reparametrizado. Nota-se que os resultados obtidos para

regressão mostram um modelo de 2º ordem para as variáveis codificadas. O nível

de significância utilizado para avaliar os efeitos foi ajustado para 5%.

Tabela 4 Coeficientes de regressão para o modelo matemático, já

reparametrizados.

Fatores Coeficiente de

regressão t (13) p*

Média 2,990301 0,110930 0,000000

% Solvente (L) 0,505804 0,091190 0,000094

% Solvente (Q) -0,233161 0,093361 0,026719

N° de extrações (L) 0,297817 0,091190 0,006137

*p = nível de significância a 5%

Os resultados da ANOVA encontram-se apresentados na Tabela 5. No

presente estudo, o valor de R2 foi de 0,83, o que segundo Joglekar & Maio (1987)

implica na adequação do modelo aplicado. A falta de ajuste foi considerada não

significativa (p ≥ 0,05). Portanto, o comportamento verificado permitiu construir

modelo preditivo para extração dos compostos fenólicos, e também pode ser

utilizado para a otimização da extração dos compostos fenólicos presentes no

abricó.

54

Tabela 5. Valores da ANOVA

Soma

Quadrátic

a

Graus de

liberdade

Média

quadrática

F

calculado P

(1)Solvente(L) 3,493934 1 3,493934 339,5894 0,002932

Solvente(Q) 0,708304 1 0,708304 68,8428 0,014217

(2)nº extrações(L) 1,211292 1 1,211292 117,7303 0,008387

Falta de ajuste 1,455754 11 0,132341 12,8628 0,074295

Erro puro 0,020577 2 0,010289

Total 6,889862 16


A partir dos resultados obtidos foi possível gerar a curva de contorno e a

superfície de resposta para o rendimento de compostos fenólicos totais (Figura 1

e 2).

Figura 1. Curva de contorno mostrando os efeitos dos parâmetros, número de extrações e porcentagem de metanol, em relação ao conteúdo do teor de fenólicos totais.

55

Figura 2. Superfície de resposta mostrando os efeitos dos parâmetro,s número de extrações e porcentagem de metanol, em relação ao conteúdo do teor de fenólicos totais

Ao analisar as 2 figuras pode-se observar que o conteúdo de FT extraídos do

abricó aumentou com o aumento da porcentagem de metanol, até 52%. O número

de extrações apresentou um efeito positivo em relação à extração dos FT. Como a

variável tempo não foi estatisticamente significativa (p ≤ 0,05), optou-se pelo

menor tempo (10 minutos)

A confirmação experimental do modelo foi realizada sob as condições ótimas

de 52% de metanol, com 5 extrações consecutivas, no tempo de 10 minutos cada,

resultando em uma concentração de fenólico totais de 3,7 mgEAG/g-1.

As condições ótimas obtidas através do planejamento experimental foram

aplicadas para a extração de todas as amostras de abricó. Os resultados dos

compostos fenólicos totais podem ser visualizados na Tabela 6

56

Tabela 6. Análise de fenólicos totais das amostras de abricó para diferentes lotes.

Amostras

CFT (mg EAG/g)**

1° lote (2011) 2° lote (2012) 3º lote (2013)

Abricó Belém 3,53 ± 0,07cB 4,45 ± 0,05bB 7,12 ± 0,06aA

6,03 ± 0,30aB

-

-

Abricó Manaus 4,05 ± 0,36aA 5,82 ± 0,35aA

Kamatá 1* 5,60 ± 0,23A -

Kamatá 2* 5,17 ± 0,12B -

*Lote único, adquirido em 2012 **Resultados expressos em base seca/ Valores representam a média de triplicata ± o desvio padrão, seguidas de letras diferentes, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Através dos resultados obtidos para os 1ºs lotes (Belém e Manaus), pode-se

observar que os dados encontram-se dentro dos valores preditos pelo modelo

para otimização da extração. Ao realizar-se a comparação, através do teste de

Tukey, entre as médias, observou-se que houve diferença estatística entre os

lotes obtidos de Belém, o que não aconteceu para os lotes provenientes de

Manaus.

Poucos são os dados na literatura para análise de FT em abricó. Braga et al.

(2010) foi de 0,25 mg EAG/g de amostra fresca, valor este inferior ao encontrado

no presente estudo que foi de 1,32 mg EAG/g de amostra fresca, quando

colocados na mesma base, tal valor pode ser explicado devido os autores terem

utilizado condições de extração fixa, onde foi utilizado uma mistura de diferentes

solventes (acetona:água:ácido acético - 70:29,5:0,5; v:v), enquanto que neste

trabalho foi realizado um planejamento, onde uma ferramenta estatística foi

utilizada para encontrar as melhores condições para extração dos compostos

fenólicos presentes na polpa do abricó.

Naczk & Shahidi, (2006) ressaltam a importância em se realizar estudos da

melhor condição de extração de fenólicos em frutas, já que este depende de

vários fatores como a polaridade do solvente utilizado, a solubilidade dos fenólicos

presentes, a interação destes fenólicos com outros compostos presentes na matriz

que podem ser solúveis ou insolúveis em um determinado solvente. Portanto, é

57

muito difícil desenvolver um método de extração padrão que seria adequado para

todos os compostos fenólicos em matrizes alimentares. Por isso, o conteúdo de

fenólico de uma amostra pode variar com a utilização de diferentes condições de

solvente e de extração (SAIKIA, 2015).

Rufino e colaboradores (2010) juntamente com Chirinos et al. (2010) e

Pompeu et al. (2009) encontraram para frutas tropicais não-tradicionais como o

açaí, camu-camu, murici, acerola, caju, bacuri, muruci e o ingá valores de 32,68

mg EAG/g; 0,12 mg EAG/g; 23,80 mg EAG/ g; 0,10 mg EAG/g; 8,30 mg EAG/g;

13,65 mg EAG/g; 2,90 mg EAG/g e 2,40 mg EAG/g de amostra seca

respectivamente. Estes valores são superiores aos encontrados no presente

estudo, para a polpa de abricó liofilizada, com exceção do camu-camu, acerola,

murucí e ingá que foram inferiores.

Pode-se observar através dos dados obtidos que a extração assistida por

ultrassom foi eficaz para a extração dos compostos fenólicos (GHAFOOR et al.,

2009). De acordo com a literatura (CHEN, 2015; VILKHU et al., 2008;TOMA et al.,

2001), a explicação para a eficiência da extração assistida por ultrassom é que a

sonicação pode facilitar a transferência de massa dos componentes solúveis para

o solvente de extração. Assim, pode-se afirmar que a extração por ultrassom pode

proporcionar resultados interessantes.

3.3. Capacidade antioxidante dos extratos de abricó.

3.3.1. Sequestro do radical DPPH•

Para partir de um parâmetro de comparação a capacidade antioxidante, o

padrão de ácido gálico foi testado pelo método de sequestro do radical DPPH•. O

valor IC 50 encontrado foi 1,09 μg/mL e o índice de capacidade antioxidante foi 27,

semelhante ao relatado na literatura por Scherer & Godoy (2009). Entretanto, para

as amostras estudadas nenhuma apresentou atividade perante a este radical

mesmo quando mais concentrados, o que impossibilitou a realização desta

análise. Resultado este que pode ser explicado pela quantidade reduzida de

compostos fenólicos presente na amostra como pode ser visto na Tabela 6,

compostos estes capazes de diminuir a ação do radical DPPH•.

58

3.3.2. Ferric Reducing Antioxidant Power - FRAP

Os resultados obtidos nesta análise são apresentados na Tabela 7. Assim

como para a análise de FT, os valores encontrados são estimativas do poder

antioxidante de redução do ferro em equivalente de ácido gálico. Não foram

encontrados dados na literatura sobre capacidade antioxidante em abricó

utilizando essa metodologia

Tabela 7. Capacidade redutora do complexo Fe3+ -TPTZ à Fe2+ -TPTZ para as

diferentes amostras.

Amostras

FRAP (EAG µg.g-1)**

1° lote (2011) 2° lote (2012) 3º lote (2013)

Belém 18,05 ± 1,47cB 27,52 ± 2,00bA 39,05 ± 1,40aB

Manaus 32,92 ± 2,03aA 28,42±1,96bA 34,63 ± 0,83aA

Kamatá 1* - 24,03 ± 1,39B -

Kamatá 2* - 29,00 ± 2,21A -

*Lote único, adquirido em 2012 **Resultados expressos em base seca/ Valores representam a média de triplicata ± o desvio padrão, seguidas de letras diferentes, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Observa-se que houve uma variação entre os resultados, sendo que o 3º

lote, proveniente de Belém, foi o que obteve o maior resposta para este método,

valor este de 39,05 EAG µg.G-1. Os lotes provenientes de cada Estado bem como

os do mesmo Estado foram submetidos ao teste de tukey ao nível de 95% de

confiança e este mostrou que entre os lotes de Belém todos os lotes

diferenciaram-se estatisticamente. Para os lotes provenientes de Belém e Manaus,

o 1º e o 3º se diferenciaram estatisticamente, resultado já esperado, já que as

frutas foram obtidas de locais diferentes e em anos diferentes, além disso, efeitos

edafoclimáticos também podem influenciar nos compostos responsáveis pela ação

antioxidante presentes nas frutas.

59

3.3.3. . Oxygen Radical Absorbance Capacity – ORAC

Neste ensaio a presença de antioxidantes nas amostras resulta na inibição

dos danos causados pelos radicais livres ao composto fluorescente. Os resultados

obtidos nesta análise estão apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. Capacidade antioxidante pelo método ORAC para as diferentes

amostras.

Amostras

ORAC (μM equivalente em trolox/g)**

1° lote (2011) 2° lote (2012) 3º lote (2013)

Belém. 19,74 ± 0,93cB 65,16 ± 2,57bB 138,03 ± 8,19aB

164,92 ± 5,94aA

-

-

Manaus 152,11 ± 5,51abA 142,14 ± 4,90bA

Kamatá 1* - 139,58 ±10,59A

Kamatá 2* - 23,27 ± 1,73C

*Lote único, obtido em 2012 **Resultados expressos em base seca/ Valores representam a média de triplicata ± o desvio padrão, seguidas de letras diferentes, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Observa-se através dos resultados apresentados na Tabela 8 que houve

diferenças significativas para as amostras e mesmo entre os lotes, provavelmente

devido à diferentes épocas e localidades de colheita que influenciam na

constituição química das frutas.

Braga et al. (2010), encontraram para frutos de abricó (30,97 µMol ET/g)

valor este inferior aos encontrados na presente pesquisa, com exceção do 1º lote

de Belém, valores estes que podem estar relacionados ao equivalente químico

utilizado pelos autores, já que estes utilizaram como padrão de referência o trolox

(ET), o que impossibilita a comparação. Além disso, os autores utilizaram

diferentes tipos de solventes para extração (solução de acetona:água:ácido

acético -70:29,5:0,5; v/v).

Para análise de ORAC os resultados foram bem superiores quando

comparados às demais, o que mostra uma possível ação antioxidante por parte de

algum outro composto, que não os fenólicos, que podem ter sido extraídos

60

juntamente com os fenólicos. Um provável composto para tal ação seria a

presença de carotenoides na amostra, que são conhecidos devido as suas

propriedades antioxidantes e estão associadas à capacidade de capturar radicais

(El-Agamey, 2004). Estes resultados também mostram a importância do uso de

diferentes tipos de metodologias para análise da capacidade antioxidante, já que

cada uma deles possui diferentes mecanismos de reação o que

consequentemente acaba dificultando a comparação entre elas.

Foi aplicado um teste de correlação para determinar se havia alguma

correlação entre os compostos fenólicos e as análises de capacidade antioxidante.

Através deste teste, observou-se haver uma correlação significativa entre os CFT

e a análise de FRAP (r = 0,83). Contudo, quando a correlação foi feita entre os

CFT e a metodologia de ORAC uma baixa correlação foi observada (r = 0,61),

corroborando com ideia de que além dos fenólicos presentes outros compostos

podem estar atuando como antioxidantes.

Um gráfico ilustrativo (figura 3) com as médias das respostas obtidas para

todos os lotes de cada Estado mais os acessos, obtidos da Embrapa, foi

construído no intuito de se observar visualmente os resultados obtidos para cada

análise realizada. Cheung et al. (2003) relatam que a capacidade antioxidante de

materiais vegetais normalmente é bem correlacionada com seus compostos

fenólicos, entretanto no caso do presente estudo tal fato não foi observado. Por

isso, é sempre importante considerar o efeito do conteúdo total de fenólicos na

capacidade antioxidante dos extratos.

61

Figura 3. Gráfico ilustrativo comparativo das análises realizadas na polpa liofilizada de

abricó.

Pode-se visualizar que para todas as amostras obtidas dos diferentes

Estados e os acessos obtiveram valores baixos de CFT. Para a análise de FRAP

todas as amostras obtiveram resultados semelhantes como podem ser destacado

na Fig. 3, já para a análise de DPPH, como foi relatado anteriormente os extratos

da polpa liofilizada de abricó não obteve resposta nas concentrações estudadas, e

para as análises de ORAC as amostras obtiveram resultados bastante

significativos quando comparado as outras análises com destaque principalmente

para as amostras obtidas de Manaus e o acesso Kamata 1. Resultados estes que

mostram que possivelmente a atividade exercida neste método não provém

apenas dos fenólicos existentes na polpa, já que para esta análise os resultados

foram relativamente baixos, mas sim de outros compostos presentes na polpa,

possivelmente os carotenoides. É extremamente difícil comparar ensaios

diferentes que medem a capacidade antioxidante de uma amostra, uma vez que

eles diferem entre si em termos de substrato, condições de reação e método de

quantificação (HUANG et al., 2005). Além disso, um levantamento na literatura

revelou que não há muitos estudos sobre o potencial antioxidante do abricó, o que

dificultou a comparação com outros trabalhos.

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

Belém Manaus Kamata 1 Kamata 2

Fenólicos totais e capacidade antioxidante

CFT

FRAP

ORAC

62

4. CONCLUSÃO

Obteve-se através do planejamento realizado para otimizar a etapa de

extração um resultado satisfatório, já que permitiu construir o modelo preditivo

dentro da faixa ótima para a extração de compostos fenólicos a partir da

combinação das variáveis (número de extração, tempo de extração e a

porcentagem de solvente utilizado). As condições otimizadas deu-se com 5

extrações e a porcentagem de solvente igual a 52%, porém a variável tempo não

foi estatisticamente significativa, (p ≤ 0,05), sendo assim utilizou-se o menor tempo

dentro da faixa no planejamento que foi de 10 minutos. Os resultados mostraram

que a polpa de abricó não possui grandes quantidades de fenólicos quando

comparadas a outras frutas tropicais, entretanto para uma das análises realizadas

para avaliação do potencial antioxidante (ORAC), o mesmo obteve resultados

bastante promissores quando comparado aos demais métodos. Os resultados

obtidos na presente pesquisa podem incentivar maiores investigações, no intuito,

de caracterizar os compostos antioxidantes presentes na polpa de abricó, fruta

comumente consumida na região norte, bem como os seus modos de ação.

63

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69

Cap III

Análise dos compostos fenólicos presentes na Mammea

americana por cromatografia líquida (UHPLC/DAD-MS-MS)

através da otimização da hidrólise utilizando uma técnica

estatística multivariada


Artigo em preparação para ser publicado no periódico Food Reserch International

1 Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de

Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CEP 6121, 13083-862, Campinas, SP, Brasil.

71

RESUMO




torna-se interessante para o estudo proposto, por apresentar dados escassos

quanto ao perfil desses bioativos presentes na polpa. Essas informações tornam-

se relevantes para o conhecimento dos seus constituintes e suas propriedades

funcionais. Então, este trabalho visou avaliar a polpa da fruta M. americana, obtida

de dois estados brasileiro (Belém/Pa e Manaus/AM) e de 2 acessos (Kamatá 1 e

Kamatá 2) fornecidos pela EMBRAPA – Amazônia Oriental quanto a presença de

compostos fenólicos. Foi realizada, uma otimização da etapa de hidrólise para

posterior determinação dos compostos presentes na polpa, utilizando a

metodologia de superfície de resposta (0,5M de ácido clorídrico, temperatura de

95 ºC por 30 minutos). Os fenólicos presentes na polpa foram avaliados através

da técnica de cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) acoplada a um

detector de arranjo de diodos (DAD) e de massas (MS) Ion Trap, operando no

modo negativo e equipado com uma fonte de ionização ESI (electron spray

ionization) e analisador de massas Ion-Trap. Foi utilizada uma coluna do tipo fase

reversa, C18 (150 x 2.1 mm) e tamanho de partícula de 1,9 µm, na qual foi aplicado

um gradiente utilizando como fase móvel uma solução aquosa 0,1% ácido fórmico

e acetonitrila. Foram identificados, ácido gálico, ácido caféico, ácido 3,4

dihidroxibenzoico, p-coumárico, quercetina e o kaepmferol. O ácido 3,4

dihidroxibenzoico foi o único composto fenólico quantificado, apresentando

resultados na faixa de 109,53 à 195,95 µg/g de amostra liofilizada. Os resultados

mostraram que a fruta do abricó apresentou baixo teor para os compostos

fenólicos estudados, o que demonstra que esta fruta possui poucos constituintes

desta natureza.

Palavras-chave: Abricó, antioxidantes, compostos fenólicos.

72

ABSTRACT


unexplored, but with enormous potential agroindustrial. In this context the a

Mammea ammericana, popularly known as apricot, becomes interesting for the

proposed study, due to its scarce data on the profile of these bioactive in the pulp.

This information is relevant to the knowledge of their constituents and their

functional properties. So, this work aimed to evaluate the pulp of the fruit, obtained

from two Brazilian states (Belém/PA and Manaus/AM) and 2 accesses (Kamata 1

and Kamata 2) provided by EMBRAPA - Eastern Amazon for the presence of

compounds phenolic. It was carried out an optimization for the hydrolysis stage for

subsequent determination of the compounds present in the pulp using the

response surface methodology (0.5 mol.L-1 hydrochloric acid, temperature of 95 °C

for 30 minutes). The phenolics present in the pulp were analyzed by the liquid

chromatography technique for ultra high efficiency (UHPLC) coupled with a diode

array detector (DAD) and mass (MS) Ion Trap operating in negative and fitted with

an ionization source ESI mode (electron spray ionization), and analyzer Ion-Trap

mass. It was used a reverse phase column of type C18 (150 x 2.1 mm) and 1,9 uM

particle size, in which was applied a gradients with a aqueous solution 0,1% formic

acid and acetonitrile as the mobile phase. It was identified, gallic acid, caffeic acid,

3,4 dihydroxybenzoic acid, p-coumaric, quercetin and kaepmferol. The 3,4

dihydroxybenzoic acid was the only phenolic compound measured, with results in

the range of 109,53 to 195,95 mg.g-1 of freeze-dried sample. The results showed

that the fruit apricot has low level of studied phenolic compounds, which indicates

that this fruit has few components of this nature.

Keywords: Apricot, antioxidants, phenolic compounds

73

1. Introdução

Frutas são fontes potencialmente ricas em muitos compostos bioativos e

estudos científicos mostram que estes compostos desempenham um papel

importante na prevenção de muitas doenças inflamatórias e oxidativas, entre

outras, devido sua ação antioxidante, anti-cancro, antimicrobianos, antimaláricos,

e propriedades hipoglicemiantes (CAVALCANTI et al., 2011).

A bacia amazônica é rica em recursos genéticos de frutas e oleaginosas, e

sua exploração econômica é de grande importância para a região. Entre os frutos

e oleaginosas extraídos na Amazônia, muitos são excepcionalmente ricos em

micronutrientes, em particular antioxidantes, tais como carotenoides, antocianinas

e outros polifenóis (ROSSO & MERCADANTE 2007).

Assim, muitas dessas frutas, em especial, as que possuem sementes

oleaginosas contribuem consideravelmente para a alimentação das populações

locais, além disso, também são utilizadas devido as suas propriedades medicinais,

sendo que várias partes dessas plantas são utilizadas para este fim como a casca,

polpa e sementes (NASCIMENTO et al., 2008). Existem poucos estudos sobre a

maioria das frutas exóticas que, além de apresentarem grande potencial para a

agroindústria, podem se tornar uma fonte de renda futura para a população local.

Esses frutos representam uma oportunidade para os produtores locais ganharem

acesso a mercados especiais, onde os consumidores enfatizam não só o caráter

exótico, mas também a presença de nutrientes capazes de prevenir doenças

degenerativas não transmissíveis (ALVES, et al., 2008).

Neste sentido o abricó (Mammea americana L.), pertencente à família do

garcinia (Clusiaceae) e originalmente proveniente das Índias Ocidentais e do norte

da América do Sul, atualmente encontrada principalmente na Amazônia e algumas

outras poucas regiões (CAVALCANTE, 1991). Pode medir entre 7-15 cm (3-6

polegadas) de diâmetro, é coberto com uma casca espessa e resistente, contém

uma polpa amarela e brilhante de um agradável sabor e aroma perfumado que é

comido cru e também usado para conservas. Suas sementes (1-4) em bruto são

grandes amargas e resinosas e são utilizadas como um agente vermífugo

(MORALES & DUQUE, 2010), o que torna uma fruta interessante como fonte de

74

estudos, já que pesquisas relacionadas à sua composição são escassas na

literatura.

Entre os vários grupos de compostos bioativos presentes nessas frutas, os

compostos fenólicos se destacam em função de sua capacidade antioxidante. Os

fenólicos são produtos secundários do metabolismo vegetal, constituem um amplo

e complexo grupo de fitoquímicos, de natureza hidrofílica, com mais de 10.000

estruturas conhecidas e estão distribuídos fisicamente entre os seus vários

compartimentos: frutas, folhas, cascas, sementes e raízes. Em geral, uma menor

fração dos ácidos fenólicos permanece de forma não associada, ao passo que

uma quantidade maior está ligada à celulose, lignina, proteínas, ou conjugada com

açúcares, flavonoides e terpenos, entre outras substâncias. Por isso a

determinação quantitativa de flavonoides glicosídicos é difícil, devido ao seu

grande número. Neste sentido, estes compostos glicosilados são normalmente

hidrolisados e as agliconas resultantes são identificadas e quantificadas. Os

métodos para a hidrólise ácida de flavonoides a partir de vegetais e frutas foram

publicados inicialmente por Hertog et al. (1992a) e por Häkkinen (1998).

Geralmente, a hidrólise de glicosidos de flavonoides requer concentrações

relativamente elevadas de ácidos (1-2 M) sob condições de refluxo (HERTOG et

al., 1992b; MERKEN & BEECHER, 2000). Contudo, as condições ótimas para sua

obtenção acabam sendo muito drásticas para alguns dos outros compostos

fenólicos presentes no mesmo material da planta. (BRAGA et al., 2010; NUUTILA

et al., 2002). Por esta razão, a extração e as condições de hidrólise têm sido

sistematicamente otimizadas para cada amostra de alimento, principalmente em

relação à concentração de ácido utilizado e o período de reação, e o efeitos

dessas variáveis sob as agliconas obtidas na hidrólise normalmente é investigada

(HERTOG et al., 1992b).

A grande diversidade estrutural, as interações com outros componentes da

amostra, a susceptibilidade a ação de enzimas assim como, as características

físicas do fruto são alguns dos fatores responsáveis pela complexidade da

extração e análise (separação, identificação e quantificação) de compostos

fenólicos, não existindo uma metodologia universal de análise.

75

Consequentemente, diferentes métodos de extração de compostos fenólicos são

relatados na literatura, assim como, trabalhos de otimização da extração para uma

amostra em específico (FUKUJI et al., 2010; NACZK & SHAHID, 2006).

A metodologia de superfície de resposta (MSR) é uma técnica estatística e

matemática que vem sendo bastante utilizada para a melhoria e otimização de

processos, podendo ser aplicada quando uma resposta ou conjunto de respostas

são afetados por múltiplas variáveis, como é o caso da extração de compostos

fenólico e da hidrólise (MEHMOOD, 2015).

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa, acoplado

a um detector de arranjo de diodos (DAD) e a um espectrômetro de massas (MS),

através de ionização por electrospray (ESI) tem sido uma ferramenta importante

na caracterização de compostos fenólicos em frutas e produtos naturais. Além

disso, outras técnicas também vem sendo bastante utilizadas como a eletroforese

capilar de zona (Capillary Zones Electrophoresis, CZE) e em alguns casos

ressonância magnética nuclear (Nuclear Magnetic Ressonance, NMR) (FUKUJI et

al., 2010).

Recentemente, a cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC)

tornou-se uma técnica amplamente difundida por apresentar uma maior eficiência

de separação, devido ao tamanho menor das partículas permitindo trabalhar com

colunas menores, e tempo de análises reduzido. Sistemas UHPLC tem

demonstrado serem benéficos no desenvolvimento de produtos farmacêuticos

(WREN & TCHELITCHEFF, 2006), no monitoramento de drogas (YUAN et al.,

2008), no perfil de metabolitos (WONG et al., 2008), em proteômica (EVERLEY &

CROLEY, 2008), em química ambiental (GERVAIS et al., 2008) e química de

alimentos (HUNG et al., 2011). Neste sentido novos métodos em UHPLC vêm

sendo desenvolvidos nos últimos anos para a determinação de flavonoides e

ácidos fenólicos em diversas matrizes alimentícias (NOVAKOVA et al., 2010).

Tendo em vista a importância de se investigar novas fontes de compostos

fenólicos, a caracterização da Mammea americana. é de grande relevância, já que

estudos no que diz respeito a sua composição fenólica ainda não existem. Assim,

o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições de hidrólise ácida (para


76

liberação das agliconas), utilizando o método de superfície de resposta e

identificar os compostos fenólicos presentes na polpa através da técnica

cromatográfica líquida de ultra eficiência acoplada a detectores de DAD e

espectrometria de massas.


2.1. Amostras



natura em um único lote para cada um dos acessos, as demais foram obtidas no

comércio local de Belém/PA e em Manaus/AM, em três lotes, para cada um dos

anos, 2011-2012-2013 especificamente no mês de julho. Sendo que cada lote foi

formado por 3 a 4 frutos.

Os frutos dos acessos obtidos juntamente com os frutos dos lotes dos dois

Estados foram descascados, cortados, congelados e liofilizados. As amostras

após serem liofilizadas foram então moídas e acondicionadas em sacos metálicos

(ao abrigo de luz) e seladas a vácuo (livre de O2) e posteriormente guardadas em

freezer (-18 ºC) até o momento das análises.


Metanol, grau cromatográfico, foi adquirido da J.T.Baker (Phillipsburg, USA).

Para análises cromatográficas foram utilizadas acetonitrila de grau cromatográfico

da JT Baker (Phillipsburg, USA), o ácido fórmico, da marca MERCK, o ácido

clorídrico foi adquirido da Synth. A água utilizada para o preparo das fases móveis

foi purificada em sistema Milli-Q (Millipore Corporation). As fases móveis foram

filtradas em filtros politetrafluoroetileno (PTFE) da Millipore, com poros de 0,22 μm

de diâmetro. Os padrões de ácido gálico, ácido 3,4 dihidroxibenzoico, (+)-

catequina, (-)-epicatequina, ácido caféico, rutina, ácido p-coumárico, miricetina,

quercetina e kaempferol, foram adquiridos da Sigma Chemicals Co. (St. Louis,

EUA).

77

2.3. Determinação dos compostos fenólicos por UHPLC/DAD-MS-MS

Para obtenção do perfil dos compostos fenólicos por UHPLC, foi

selecionada, inicialmente, a melhor condição apresentada no Capítulo II,

composta por 5 extrações consecutivas, metanol 52%, no tempo de 10 minutos

cada. Na tentativa de otimizar a etapa de hidrólise. Entretanto, para a identificação

dos compostos agliconas foi necessário realizar uma nova otimização da etapa de

hidrólise dos fenólicos glicosídicos.

2.3.1. Otimização da hidrólise

A otimização da hidrólise foi feita através de um Planejamento Composto

Central (PCC) em 5 níveis diferentes (-, -1, 0, +1, +). Um fatorial completo 22

incluindo 4 ponto axiais (± α = (2k)1/4,onde k = número de variáveis independentes)

e 3 repetições no ponto central (para avaliar a repetibilidade da análise e

determinar o erro puro do modelo), totalizando 11 ensaios independentes

(RODRIGUES & IEMMA, 2012). As variáveis estudadas foram a concentração em

mol.L-1 do ácido clorídrico (HCl) e a temperatura para realização da hidrólise. Os

níveis podem ser visualizados na Tabela 1. As faixas estudadas foram baseadas

naquelas mais encontradas na literatura para hidrólise (NUUTILA et al., 2002;

TOYODA et al., 1997; HERTOG et al., 1993).

Tabela 1. Variáveis independentes e seus respectivos níveis.

Variáveis Código Níveis

-1,41 -1 0 +1 +1,41

Conc. de HCl (mol.L-1) X1 0,5 0,9 2,0 3,0 3,5

Temperatura (°C) X2 65 69 80 91 95

A concentração do ácido 3,4-dihidroxibenzoico foi à resposta avaliada, em

três tempos diferentes (Y1 – 30 min, Y2 – 120 min e Y3 – 180 min), devido este

ser o único composto encontrado acima do limite de quantificação. A faixa de

tempo estudado também foi selecionada de acordo com a literatura. A equação

78

quadrática para o referido sistema é: Y= 0 + 1A + 2B + 11A2 + 22B

2 + 12AB +

ε, onde Y é a resposta prevista, 0 a intersecção; 1 e 2 coeficientes lineares; 11

e 22 coeficientes quadráticos; 12, interação entre os coeficientes; e A, B, A2, B2,

AB variáveis independentes.

Foi utilizado o Software Statistica 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, EUA) para

analisar os dados e gerar a superfície de resposta. O valor de ajuste da equação

do modelo estatístico foi expresso pelo coeficiente de determinação (R2) e a sua

significância estatística foi determinada por um teste F (análise de variância)

Para a realização dessa etapa utilizou-se a metodologia descrita por Hertog

(1992b). Em um balão de fundo redondo onde foram adicionados 0,5 g de amostra

de abricó liofilizada, 25 mL de solução extratora metanol-água (1:1 v/v) e ácido

clorídrico, com a molaridade de acordo com cada ponto do planejamento. O

sistema foi mantido sob refluxo em banho-maria em diferentes tempos (30, 120 e

180 minutos) e temperatura controlados para a hidrólise dos compostos fenólicos

de acordo com cada ponto do planejamento. Após a etapa de hidrólise, os extratos

foram resfriados em banho de gelo e neutralizados com NaOH (40%) e filtrados, e

em seguida foram acondicionados em frascos âmbar e armazenados sob

refrigeração -18 ºC até o momento da análise.

2.3.2. Análise cromatográfica

A análise dos compostos fenólicos, dos extratos hidrolisados, foi realizada

empregando-se um cromatógrafo líquido de ultra eficiência, da marca Thermo,

com injetor automático, alça de amostragem de 20 µL e bomba quaternária,

acoplado a um detector de arranjo de diodos (DAD) e um espectrômetro de

massas equipado com fonte de ionização por electrospray (ESI) e analisador de

massas Ion-Trap. O equipamento foi operado à temperatura ambiente (25 ± 2°C) e

os dados cromatográficos foram obtidos e processados pelo software Xcalibur. A

coluna cromatográfica utilizada foi do tipo fase reversa, C18 (150 x 2.1 mm) e

tamanho de partícula de 1,9 µm (Thermo, hypersil gold). O método cromatográfico

foi baseado em Novakova et al. (2010), com pequenas modificações. A fase móvel

constituiu de solução aquosa ácido fórmico a 0,1% em água (A) e acetonitrila (B).

79

O gradiente de eluição iniciou-se na proporção 95:5 em um fluxo de 0,32 mL.min-1.

A concentração de “A” decresceu até chegar aos 5 minutos na condição de 50:50,

e a partir dos 6 minutos voltou gradativamente para a condição inicial 95:5 em 20

minutos e permaneceu nesta condição por mais 2 minutos p ara que as condições

iniciais fossem restabelecida. A detecção dos compostos foi realizada com ajuda

do DAD (operando a 210, 260, 300 e 325 nm) e um espectrômetro de massas com

uma fonte de electrospray operando no modo negativo (temperatura do capilar

350 ºC, voltagem capilar de 2,5 kV, tensão do cone de 5 kv). Gás hélio (He) foi

utilizado como gás de colisão e o nitrogênio (N2) foi usado como gás nebulizador

70 (unidade arbitraria)

Para a identificação dos compostos presentes nas amostras foram

utilizados o tempo de retenção, os espectros de absorção e a co-cromatografia

comparando com os dos padrões e espectro de massas, que auxiliou na

confirmação da estrutura química dos compostos, através da comparação das m/z

e os fragmentos de cada composto com os dos seus respectivos padrões. A

quantificação dos fenólicos foi feita por padronização externa.

Para avaliar a faixa linear de trabalho, foi construída uma curva de

calibração para o composto 3,4 diidroxibenzóico. A concentração empregada para

o preparo da curva, partiu de uma solução de 5 µg.g-1. A repetitividade do método

foi avaliada, utilizando padrão, em três níveis de concentração (nos pontos baixo,

médio e alto da curva) em 10 injeções cada nível (mesmo dia). A precisão

intermediária foi avaliada nos mesmos níveis utilizados para avaliar a

repetibilidade, porém em três dias diferentes. Os limites de detecção (LD) e de

quantificação (LQ) foram calculados a partir da relação sinal-ruído que foi de 3:1 e

10:1, respectivamente (BRASIL 2003).


3.1. Otimização das condições de hidrólise

Dos compostos investigados nas amostras na etapa de hidrólise, apenas o

3,4 diidroxibenzoico quantificado, por isso foi selecionado como resposta do

80

planejamento. A matriz com as especificações de cada ensaio bem como suas

respectivas respostas pode ser visualizada na Tabela 2

Tabela 2. Matriz do planejamento fatorial 22, com pontos axiais e pontos centrais.

Ensaios

Valores

codificados

Valores

decodificados Resposta µg.g-1*

X1 X2 Molaridade

(mol/L) T (°C)

Y1

30

(min)

Y2

120

(min)

Y3

180

(min)

1 -1 -1 0,9 69 24,89 70,86 53,66

2 +1 -1 3,0 69 67,97 48,12 44,38

3 -1 +1 0,9 91 108,61 35,86 49,78

4 +1 +1 3,0 91 49,82 69,15 74,78

5 -1,41 0 0,5 80 44,17 128,09 40,36

6 +1,41 0 3,5 80 48,35 21,25 46,05

7 0 -1,41 2 65 53,74 69,25 57,33

8 0 +1,41 2 95 54,32 39,99 43,97

9 0 0 2 80 53,42 31,54 52,23

10 0 0 2 80 55,41 35,62 60,54

11 0 0 2 80 39,17 47,81 52,09

* Resposta do ácido 3,4 diihroxibenzóico em µg.g-1

Ao analisar as concentrações obtidas para cada ensaio nos diferentes

tempos observou-se que o estudo do tempo como resposta é de extrema

importância garantindo que não haja degradação dos compostos. Hertog et al.

(1992b) já mencionava a importancia de se investigar o efeito desse parâmetro.

Com o intuito de avaliar a integridade dos compostos durante a etapa de hidrólise

para cada matriz.

Para avaliar melhor o efeito da hidrólise, para o 3,4 dihidroxibenzóico, nos

respectivos tempos estudados, um gráfico (Figura 1) foi construído com as

resposta obtidas, para cada tempo. A partir dele pode-se observar que no ensaio

5, no tempo de 120 minutos, obteve-se a maior resposta (139,62 µg.g-1),

81

possivelmente devido a baixa concentração de ácido utilizada, porém em seguida

houve uma queda brusca em sua concentração, fato este que pode estar

relacionado a exposição deste ácido fenólico a elevada temperatura por um longo

período. Já no ensaio 7 o valor da área encontrado manteve-se praticamente

constante no decorrer de todo o tempo, isto ocorreu mesmo em temperatura

elevadas, devido ao fato deste ensaio conter concentração mais baixa de ácido, o

que permitiu a hidrólise sem uma degradação significativa deste composto.

Figura 1. Gráfico das respostas (em µg.g-1

) para o composto 3,4 dihidroxibenzóico para cada um dos tempos estudado 30, 120 e 180 minutos.

No gráfico também nota-se que o ensaio 6, onde a concentração de ácido é

máxima (axial = + 1,41), juntamente com uma temperatura mais elevada foi a que

obteve a menor concentração para o composto estudado, o que pode ser atribuído

a degradação do composto no decorrer do tempo.

Os resultados indicaram que é necessário um equilíbrio entre a concentração

de ácido (HCl) utilizado e a temperatura (ºC), para obtenção das agliconas, sem

que haja degradação da mesma. Segundo Toyoda et al. (1997), as condições

destas variáveis dependerá principalmente do tipo ou grupo de composto que se

pretende hidrolisar ou seja do grau de complexidade relacionados a sua estrutura

molecular.

A partir das concentrações obtidas dos picos cromatográficos referentes ao

ácido 3,4 dihidroxibenzóico, calculou-se o efeito das 2 variáveis estudadas para

cada um dos tempos, e a partir dos resultados obtidos, verificou-se que de acordo

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

30 (min) 120 (min) 180 (min)

Res

po

sta

em µ

g/g

Ensaio 1

Ensaio 2

Ensaio 3

Ensaio 4

Ensaio 5

Ensaio 6

Ensaio 7

Ensaio 8

Ensaio 9

Ensaio 10

82

com os tempos estudados algumas das variáveis (Tabela 3) foram significativas (p

≤ 0,10). A partir dos efeitos obteve-se os coeficientes de regressão para cada

tempo 30, 120 e 180 minutos e as variáveis estatisticamente não significativas

foram retiradas para obtenção do modelo reparametrizado. O nível de significância

utilizado para avaliar o efeito de cada variável sobre a hidrólise na amostra do

composto 3,4 dihidroxibenzoico foi ajustado para 10%, com objetivo de minimizar

o risco de se excluir qualquer variável importante (Rodrigues & Iemma, 2012).

Tabela 3. Coeficientes de regressão para os modelos matemáticos, já

reparametrizados.

Fatores

Coeficiente de

Regressão t (9) p*

30

Min

Média 54,5334 15,03866 0,000000

Molaridade (L) 8,9369 2,10176 0,068749

X1 (L) e X2 (L) -25,4673 -4,23510 0,002856

12

0

Min

Média 54,3209 6,82106 0,000077

Molaridade (L) -17,5676 -1,88124 0,092622

18

0

Min

Média 52,28850 20,78638 0,000001

X1 (L) e X2 (L) 8,56963 2,05432 0,070122


Nos tempos de 30 e 120 minutos ocorreu a inclusão no modelo de uma

variável (molaridade linear), e no tempo de 180 minutos da interação X1 (L) e X2

(L), todas não foram estatisticamente significativas, porém, devido as mesmas

encontrarem-se com valores muito próximo ao p-valor (0,1), estas foram inclusas.

Isto foi realizado no intuito de não se excluir nenhuma variável considerada

importante. A partir dos resultados para o coeficiente de regressão nos respectivos

tempos estudado os modelos ajustados foram submetidos ao teste de significância

(ANOVA).

83

Os resultados da ANOVA obtidos para as respostas nos diferentes tempos

(30, 120 e 180 min), encontram-se apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Valores da ANOVA nos respectivos tempos.

Fatores Soma

Quadrática G.L

Média

quadrática F calculado p

30

min

Molaridade(L) 638,950 1 638,950 8,14433 0,103984

X1 (L) e X2 (L) 2594,336 1 2594,336 33,06852 0,028934

Falta de ajuste 1000,242 6 166,707 2,12492 0,354126

Erro puro 156,907 2 78,453

Total 4390,435 10

120

min

Molaridade(L) 2468,960 1 2468,960 34,48041 0,027798

Falta de ajuste 6135,434 7 876,491 12,24068 0,077581

Erro puro 143,209 2 71,605

Total 8747,604 10

180

min

X1 (L) e X2 (L) 293,7540 1 293,7540 12,56577 0,071188

Falta de ajuste 579,7003 7 82,8143 3,54251 0,237749

Erro puro 46,7546 2 23,3773

Total 920,2089 10


As análises de variância (ANOVA) mostraram que de todos os modelos,

apenas o de 120 minutos não foi adequado para representar os dados

experimentais. Já que a adequação do modelo proposto foi verificada através de

análise estatística que revelou que houve falta de ajuste para este modelo neste

tempo. Myers e Montgomery (2002) afirmam que a falta de ajuste mede a falha do

modelo para representar dados no domínio experimental que não estão incluídas

na regressão. Portanto, apenas os modelos de 30 e 180 minutos puderam ser

utilizados para realizar a previsão do ponto ótimo das condições de hidrólise e

liberação do ácido 3,4-dihidroxibenzóico presente na polpa do abricó.

84

Os modelos reparametrizados estão apresentados nas equações 1 e 2.

MODELO CODIFICADO (30 MINUTOS)

y = 54,53 + 8,94X1 – 25,47X1.X2 Eq. 1

MODELO CODIFICADO (180 MINUTOS)

y = 52,29 + 8,57X1.X2 Eq. 2

Onde, y é a área do pico cromatográfico do composto fenólico avaliado (ácido 3,4 dihidroxibenzóico), X1 é a molaridade do ácido clorídrico, e X2 é a temperatura.

A partir dos resultados obtidos para a análise de variância foi possível

construir as superfícies de resposta e suas respectivas curvas de contorno para

cada um dos tempos (30 e 180 minutos), que encontram-se representados na

Figura 2.

Figura 2. Superfícies de resposta e curvas de contorno para a concentração do ácido 3,4

dihidroxibenzóico em função da molaridade do HCl e a temperatura de hidrólise para os tempos de 30 e 180 minutos, (A) e (B) respectivamente.

(A)

(B)

85

Nota-se através da Figura 2A que foi obtido um efeito antagônico, ou seja,

as melhores condições de hidrólise no tempo de 30 minutos se davam ou quando

uma alta temperatura era combinada com uma concentração de ácido mais baixa

ou quando uma temperatura mais baixa era combinada com uma concentração de

ácido mais elevada. Já que, temperaturas muito elevadas e altas concentrações

de ácido (HCl) possivelmente levam a degradação dos compostos, assim como

baixas temperaturas e concentração de ácido (HCL) elevada há uma hidrólise

ineficiente

Para o tempo de 180 minutos (Figura 2B), observou-se que com o emprego

de ácido clorídrico na concentração de 0,5 mol.L-1 e temperaturas menores (entre

65 ºC e 69 ºC), resultaram nas maiores concentrações do ácido 3,4

dihidroxibenzóico, este resultado mostra que por longos períodos expostos a

condições mais drásticas a temperatura e a molaridade precisam ser as menores

possíveis do contrário ocorre à degradação do composto.

A partir dos modelos obtidos e suas respectivas superfícies verificou-se que

o modelo que apresentou um maior valor previsto, para a determinação do 3,4-

dihidroxibenzoico na amostra, foi o modelo obtido nas condições de 30 minutos.

Assim, para a realização das análises do perfil cromatográfico dos fenólicos as

condições ótimas de hidrólise foram temperatura de 95 °C, concentração de HCl

de 0,5 mol/L e tempo de 30 minutos. Tais condições foram aplicadas a partir de

então para todas as amostras para posterior detecção e identificação por

UHPLC/DAD-MS-MS

3.2. Identificação dos compostos fenólicos por UHPLC/DAD-MS-MS

A Tabela 5 apresenta os compostos detectados e confirmados pelo

espectrômetro de massas (UHPLC/DAD-MS-MS), a partir dos extratos obtidos nas

melhores condições. Antes, porém o método foi submetido ao processo de

validação, onde apenas o composto, ácido 3,4 dihidroxibenzóico, foi validado uma

vez que foi o único a se apresentar acima dos limites de quantificação. O método

mostrou boa linearidade (r2 = 0,99) e repetitividade dentro dos limites aceitáveis

86

(<10%). Os limites de detecção e de quantificação ficaram em 0,02 µg.g-1.e 0,06

µg.g-1 respectivamente.

Tabela 5. Compostos fenólicos encontrados na polpa de abricó em seus

respectivos lotes e localidades.

Amostras Compostos [M-H]- m/z M2

B1

Ácido gálico Ácido 3,4 dihidroxibenzóico

Ácido caféico Ácido p-coumárico

Quercetina Kaempferol

[169] [153] [179] [163] [289] [285]

[169] 125 [153] 109

[179] 161, 135 [163] 119

[289] 245, 205, 179 [285] 217, 151

B2

Ácido.gálico Ácido 3,4 dihidroxibenzoico


[169] [153] [289] [285]

[169] 125 [153] 109

[289] 245, 205, 179 [285] 217, 151

B3

Ácido.gálico Ácido 3,4 dihidroxibenzoico


[169] [153] [289] [285]

[169] 125 [153] 109

[289] 245, 205, 179 [285] 217, 151

M1 Ácido 3,4 dihidroxibenzoico


[153] [289] [285]

[153] 109 [289] 245, 205, 179

[285] 217, 151



[153] [289] [285]

[153] 109 [289] 245, 205, 179

[285] 217, 151



[153] [289] [285]

[153] 109 [289] 245, 205, 179

[285] 217, 151

K1 Ácido 3,4 dihidroxibenzoico


[153] [289] [285]

[153] 109 [289] 245, 205, 179

[285] 217, 151

K2 Ácido 3,4 dihidroxibenzoico


[153] [289] [285]

[153] 109 [289] 245, 205, 179

[285] 217, 151

B1 = Belém 1 lote; B2= Belém 2 lote; B3= Belém 3 lote; M1= Manaus 1 lote; M2= Manaus 2 lote; M3= Manaus 3 lote; K1= Kamatá 1 lote único; K2= Kamatá 2 lote único.

87

O ácido 3,4-dihidroxibenzóico foi o único composto a ser quantificado, e foi

encontrado nas concentrações de: Belém (1, 2 e 3), 109,53; 160,28; 165,18

Manaus (1, 2 e 3), 150,26; 175,33; 195,95 e Kamatá-1 e Kamatá-2 175,33; 185,78

respectivamente em µg.g-1. Os compostos que apresentaram-se abaixo do limite

de quantificação foram apenas identificados com o auxílio de um espectrômetro de

massas.

Como pode ser visualizada na Tabela 5, em todas as amostras encontrou-se

os mesmos compostos (ácido 3,4 dihidroxibenzoico, quercetina e kaempferol).

Porém, apenas nos lotes obtidos de Belém encontrou-se, além destes, os ácidos

gálico, caféico e o p-coumárico. Esta diferença na composição pode estar

relacionada a fatores abióticos naturais como a radiação solar, raios UV, períodos

de seca ou chuva, nutrientes e estações do ano também influenciam no

metabolismo e na produção destes compostos e ainda, fatores artificiais, como

poluentes (DEGÁSPARI & WASZCZYNSKYJ, 2004), fatores estes característicos

de cada região. Dados do Instituto Nacional de Meteorologia (INMET) mostram

que no período de coleta das frutas para a presente pesquisa a temperatura e a

umidade nos meses de julho nos 3 anos de coleta nos dois Estados foram bem

próximos. Em Belém os valores para temperatura (ºC) e umidade (%), variaram na

faixa de 22 – 35 e 45 – 95, respectivamente. Para Manaus estes valores ficaram

na faixa de 21 – 34 ºC de temperatura e de 33 – 99 % de umidade. Contudo, os

índices de radiação nos dois Estados, sofreu uma variação considerável como, por

exemplo, em Belém nos meses de julho de cada ano, teve uma variação de 1005

a 3227 Kj/m2, enquanto que para Manaus essa variação foi de 596 a 3153 Kj/m2, a

altitude também pode estar relacionada a estas variações já que Belém localiza-se

a 10,8 metros acima do nível do mar, enquanto que Manaus está quase 10 vezes

a mais, acima do nível do mar, (92,9 metros). Essas diferenças podem influenciar

de diferentes formas na síntese de diversos compostos, além dos fenólicos,

presentes na planta, fazendo com que a mesma fruta sofra diferentes variações

em sua composição.

Com relação aos compostos encontrados na polpa da fruta do abricó, Park et

al. (2015) analisaram fenólicos em diversas frutas, adquiridas frescas e em

88

seguida liofilizadas, como a maçã, banana, uva verde, morango, durião, toranja,

caqui, mangostão, pomelo e kiwi e em todas elas encontraram os ácidos

protocatecuico (também conhecido como 3,4 dihidroxibenzóico), cafeico e p-

cumárico. Dentre os flavonoides estudados encontraram na maioria delas a

quercetina e o kaempferol, corroborando com os resultados aqui obtidos para

todos os lotes. Dentre as frutas estudadas pelos autores, o mangostão é uma das

frutas pertencentes à mesma família do abricó e nela também foram encontrados

entre outros compostos o ácido 3,4 dihidroxibenzóico.

Hertog (1993) e colaboradores, também encontraram quercetina em todos os

sucos de frutas frescas e comerciais analisados, como o suco de uva, laranja,

maçã e limão. As frutas segundo Hertog (1992b) contêm quase exclusivamente

glicosídeos de quercetina, kaempferol e miricetina, por isso normalmente são

encontrados apenas em quantidades muito pequenas.

89

CONCLUSÃO

O planejamento composto central aplicado para otimização da etapa de hidrólise

permitiu extrair e identificar o ácido 3, 4 dihidroxibenzoico. A condição ótima

estabelecida para a hidrólise foi uma concentração de 0,5 mol.L-1 de ácido

clorídrico, temperatura de 95 ºC e tempo de 30 minutos. Dos compostos

estudados apenas o ácido 3,4-dihidroxibenzoico, quercetina e o kaempferol foram

os encontrados em todas as amostras. Os baixos valores encontrados para

análise de fenólicos, através do uso da técnica de cromatografia líquida,

demonstraram que a fruta de abricó não é rica nestes compostos.

90

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study. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 13;46(4):808-

13, 2008.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2008.06.033



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yuan%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18206330

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18206330

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tu%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18206330

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peng%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18206330

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18206330

93

ANEXOS

95

Espectros obtidos dos compostos estudados na identificação dos fenólicos

em abricó utilizando um LC/MS-MS.

Fig 1. Espectro MS representativo do composto ácido gálico e seus respectivos fragmentos.

Fig 2. Espectro MS representativo do composto quercetina e seus respectivos

fragmentos.

96

Fig 3. Espectro MS representativo do composto kaempferol o e seus respectivos fragmentos.

Fig 4. Espectro MS representativo do composto ácido 3,4 dihidroxibenzoico o e

seus respectivos fragmentos.

97

Fig 5. Espectro MS representativo do composto ácido caféico o e seus respectivos

fragmentos.

Fig 6. Espectro MS representativo do composto ácido p-coumárico o e seus respectivos fragmentos.

98

Fig. 7. Perfil cromatográfico obtido no DAD para a polpa do abricó liofilizada, para

um dos lotes obtidos de Belém.

:

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time (min)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

uAU

3,4 dihidroxibenzóico

kkkkkk

99

Cap IV

Estudo da composição dos ácidos graxos e tocoferóis

presentes na polpa do abricó (Mammea americana), fruta

da região amazônica brasileira

Pollyane da Silva Port’s1, Wellington Oliveira1, Helena Teixeira Godoy1

Artigo em preparação para ser publicado no periódico food Reserch International

1 Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CEP 6121, 13083-862, Campinas,

SP, Brasil.

101

RESUMO




torna-se interessante para o estudo proposto, por apresentar dados escassos

quanto a composição de ácidos graxos e os tocoferóis presentes na polpa. Por

isso este estudo visou avaliar a fruta M. americana, obtida de dois estados

brasileiros (Belém/PA e Manaus/AM) e de 2 acessos (Kamatá 1 e 2) fornecidos

pela EMBRAPA – Amazônia. O perfil dos ácidos graxos foi obtido através de

cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama (GC-FID) e

a confirmação dos mesmos foi realizado por meio de cromatografia gasosa

acoplada a espectrômetria de massas, tipo quadrupolo, (CG-MS). Foram

analisados quatro dos isômeros da vitamina E (tocoferol) através da técnica de

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com fase normal e um detector de

fluorescência. Os resultados obtidos para a polpa de abricó mostraram que a

polpa apresenta os ácidos láurico, mirístico, palmítico, esteárico, lignocerico,

palmitoleico, oleico, linoleico e linonênico. Do total aproximadamente 60% são

insaturados. Dentre os ácidos graxos encontrados as maiores parcelas foram

atribuídos ao ácido palmitoleico com 26%, juntamente com o ácido oleico 20%, o

ácido linoleico com 20% e o ácido linolênico com 17%. Para análise dos

homólogos do tocoferol apenas o alfa-tocoferol foi detectado na concentração de

aproximadamente 1,1 µg.g-1 para todas as amostras. Os resultados obtidos são

importantes para o levantamento de dados de frutas pouco conhecidas,

provenientes da região amazônica brasileira. Além disso, os resultados mostraram

que o abricó possui quantidade significativa de ácidos graxos e tocoferóis,

compostos estes importantes na dieta.

Palavras-chave: Abricó, Vitamina E, ácidos graxos.

102

ABSTRACT


unexplored, but with enormous potential agroindustrial. In this context the

Mammea americana, popularly known as apricot, becomes interesting for the

proposed study, due to its scarce data on the composition of fatty acids and

tocopherols present in the pulp. Therefore this study aimed to evaluate the

M.ammericana fruit, obtained from two Brazilian states (Belém/PA and

Manaus/AM) and 2 accesses (Kamatá 1 e 2) provided by EMBRAPA - Eastern

Amazon. The identification and quantification of fatty acids using a gas

chromatograph coupled to a flame ionization detector (GC-FID) and confirmation of

these compounds was performed by a gas chromatograph coupled to a

quadrupole mass spectrometer (GC-MS). Four isomers of vitamin E (tocopherol)

were analyzed using the technique of high-performance liquid chromatography

(HPLC) on normal phase coupled with a fluorescence detector. The results showed

that the pulp has lauric, myristic, palmitic, stearic, lignoceric, palmitoleic, oleic,

linoleic and linonênico. Among the compounds found the larger portion were

attributed to palmitoleic acid with 26% along with 20% oleic acid, 20% linoleic acid,

and 17% linolenic acid. For analysis of the tocopherol homologues only alpha-

tocopherol was detected at a concentration of approximately 1,1 μg.g-1 for all

samples. These results are important for the data base collection of fruits that are

not well known from the Brazilian Amazon region. The results showed that apricot

has significant quantities of fatty acids and tocopherols that are important

compounds for our diet.

Keywords: Apricot, Vitamin E, fatty acids

103

1. Introdução

No Brasil, diversas espécies não-tradicionais vêm sendo utilizadas pelas

populações locais, pelo grande potencial para exploração no mercado de consumo

in natura e/ou industrializado. No entanto, são espécies que necessitam ser





A bacia amazônica é rica em recursos genéticos de frutas e oleaginosas e

sua exploração econômica é de grande importância para a região. Entre as frutas

e oleaginosas extraídas na Amazônia, há espécies excepcionalmente ricas em

micronutrientes, em particular antioxidantes, tais como carotenoides (tocoferóis),

antocianinas e outros polifenóis (ROSSO & MERCADANTE, 2007)

Neste sentido o abricó (Mammea americana L.), torna-se uma fruta

interessante para estudos uma vez que é uma fruta ainda silvestre pertencente à

família da garcinia (Clusiaceae), originária das Índias Ocidentais e do norte da

América do Sul (CAVALCANTE, 1991) sua colheita ainda tem caráter extrativista e

dados relacionados à sua produção, comercialização e aos seus constituintes

químicos ainda são escassos, sabe-se, porém que no atual cenário, a demanda é

pequena e destinada apenas aos consumidores locais (BRAGA et al., 2010).

O abricó é um fruto grande com 7-15 cm de diâmetro, coberto com uma

casca espessa e resistente, contém uma polpa amarela e brilhante de um

agradável sabor e aroma perfumado que é consumido cru e também usado para

conservas. Suas sementes (1-4) são grandes amargas e resinosas e são

utilizadas como um agente vermífugo (MORALES & DUQUE, 2010).

Tanto os ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados, quanto aos

componentes lipídicos menores, tais como tocoferóis e fitosteróis, desempenham

um papel importante na nutrição humana e saúde. Dietas ricas nestes compostos

tendem a diminuir a pressão arterial e níveis de colesterol total no sangue dos

seres humanos (TURAN et al., 2007).

104

Com base nestas informações a determinação do perfil dos ácidos graxos

insaturados presente nos alimentos é de extrema importância, já que estudos

relacionados a sua ingestão mostram que estes compostos possuem impactos

benéficos à saúde como, por exemplo, na prevenção de doenças cardiovasculares

(ATTAR-BASHI, et al., 2004; GROOTVELD, et al., 2001)

A vitamina E, termo genérico utilizado para designar diferentes compostos,

nomeados α-, β-, γ- e δ- (alfa, beta, gama e delta) tocoferóis, tem sido

extensivamente estudada em diversas áreas do conhecimento, assim como os

ácidos graxos, uma vez que desempenham papéis especialmente importantes na

reprodução e em mecanismos antioxidantes de tecidos animais e vegetais. Esse

composto tem despertado interesse e preocupação, principalmente nesta última

década, uma vez que compõe juntamente com a vitamina C, β-caroteno, selênio e

flavonoides, o grupo denominado antioxidantes alimentares. Este grupo também

tem sido frequentemente associado à prevenção de doenças neurodegenerativas,

aterosclerose, inflamação crônica, câncer e envelhecimento precoce (GUINAZI et

al., 2009).

Poucos trabalhos têm pesquisado a composição completa dos isômeros da

vitamina E em alimentos, sendo que a maioria tem relatado apenas o conteúdo do

α-tocoferol. Além disso, as tabelas brasileiras de composição de Alimentos ainda

não contemplam os diferentes isômeros da vitamina E, o que torna importante as

pesquisas envolvendo a composição completa em alimentos brasileiros (GUINAZI

et al., 2009).

Diversas técnicas têm sido aplicadas para separação e quantificação destes

compostos nas mais variadas matrizes orgânicas e podem ser utilizadas de

acordo com os objetivos da análise e da natureza da amostra. Entretanto, a

cromatografia líquida com detecção por fluorescência para tocoferóis e a gasosa

acoplada ao detector de ionização de chama para os ácidos graxos tem sido

extensivamente aplicadas e são preferidas pela grande maioria dos pesquisadores

da área (PINHEIRO-SANT’ANA et al., 2011).

Por isso se faz importante investigar a composição lipídica de novas fontes

de nutrientes e compostos bioativos para a dieta, já que estudos no que diz

105

respeito à composição química lipídica do abricó ainda não existem. Assim, este

trabalho teve como objetivo avaliar a composição dos isômeros de tocoferol assim

com obter a composição dos ácidos graxos presentes na polpa do abricó (dos

diferentes Estados) que é uma fruta ainda pouco explorada, o que proporcionará

informações a respeito de substâncias benéficas à saúde.


2.1. Amostras



natura em um único lote para cada um dos acessos. As demais foram obtidas no

comércio local de Belém/PA e em Manaus/AM, em três lotes, para cada lote foram

adquiridos 3 a 4 frutos (2011-2012-2013), especificamente no mês de julho de

cada ano.

Os frutos obtidos foram descascados, cortados e levados para liofilização. As

amostras após serem liofilizadas foram então moídas e acondicionadas em sacos

metálicos (ao abrigo de luz) e seladas a vácuo (livres de O2) e posteriormente

armazenadas em freezer (-18 ºC) até o momento das análises.


Para a preparação das amostras, foram utilizados os seguintes reagentes de

qualidade analítica: acetato de etila, hexano e isopropanol (Synth, Brasil), sulfato

de sódio (Vetec, Brasil), e butil-hidroxitolueno (BHT) (Synth, Brasil). Os padrões

utilizados (α-, β-, γ- e δ-tocoferóis) foram adquiridos a partir de Calbiochem®, EMD

Biosciences, Inc. (EUA) e armazenados a -18 ° C até a utilização. Os padrões de

ésteres metílicos do C4 ao C24 (FAME Mix), foram adquiridos da Supelco (EUA).

As fases móveis foram preparadas utilizando reagentes de grau HPLC:

hexano e isopropanol (Mallinckrodt, EUA) e ácido acético (Merck, Brasil). As

soluções de estoque padrão de tocoferol foram preparadas por dissolução em

hexano de grau HPLC contendo 0,01% de BHT nas concentrações de 100 mg.L -1.

A solução-mãe padrão de ésteres metílicos de ácidos graxos foi preparada em

106

hexano grau HPLC. Soluções de reserva dos padrões foram filtrados em filtro

Millipore de 0,45 µm (PVDF - Millipore, EUA), armazenada a -18 °C e protegidas

da luz. Os frascos contendo as soluções de trabalho foram colocados em

ultrassons durante 5 min antes da injeção.

A filtração das amostras incluiu o uso de papel de filtro Whatman n°1 (J.

Prolab, Brasil), seringas de 3 ml estéreis (Rymco, Colômbia), e unidades de filtro

de polietileno Millex HV (Millipore, 0,22 µm, Brasil).

2.3. Extrações

2.3.1 Lipídios Bligh-Dyer

Um dos procedimentos de extração mais versáteis e efetivos, é a

metodologia de Bligh & Dyer 1959, uma versão simplificada do procedimento

clássico usando clorofórmio-metanol proposto por Folch et al. (1957). Para

extração foram pesadas aproximadamente 1g de amostra em tubos de ensaio

com tampa. Em seguida foram adicionados 5 mL de clorofórmio, 10 mL de

metanol e 4mL de água, tornando a proporção 1:2:0,8, respectivamente. Os tubos

foram agitados por 15 minutos e logo em seguida, foram adicionados mais 5 mL

de clorofórmio e 5 mL sulfato de sódio (1,5%). Os tubos foram então agitados

novamente por mais 2 minutos e centrifugados a 3000 g-1 por 5 minutos. O

sobrenadante foi descartado e a fase inferior foi filtrada em papel Whatman nº 1,

com aproximadamente 1 g de Na2SO4 anidro. O filtrado foi evaporado até a secura

com N2 e armazenado a -18 ºC até o momento da análise.

2.3.2. Ésteres metílicos de ácidos graxos

Para a análise dos ésteres metílicos foi utilizado o método proposto por

Joseph & Ackman (1992) com pequenas modificações, onde o extrato obtido por

Bligh-Dyer, foi pesado em tubos com tampa e resuspendidos em 4 mL de NaOH

0,5 mol L-1 em solução com metanol. Os tubos foram levados para aquecimento

em banho a uma temperatura de aproximadamente 100 ºC por 10 minutos.

Posteriormente, foram adicionados aos tubos, 3 mL de trifluoreto de boro (BF3 -

12% em solução com metanol) e levados novamente para serem aquecidos por

107

mais 5 minutos. Depois de resfriados à temperatura ambiente, 4 mL de uma

solução saturada de NaCl foi adicionada no tubo sob agitação. Logo em seguida,

4 mL de hexano foi adicionado e toda a mistura foi submetida a agitação vigorosa

em vórtex. Os tubos ficaram em repouso até a separação das fases. A fase

superior foi recolhida e o resíduo foi lavado com 2 mL de hexano por 3 vezes. As

fases recolhidas foram então combinadas e concentradas até a secura em

evaporador rotativo e ressuspendida novamente em 2 mL de hexano. O extrato foi

armazenado a -18 ºC até o momento da análise. Todo o experimento foi

preparado em triplicata (n = 3).

2.3.3. Tocoferóis

Para a análise de tocoferóis, utilizou-se a metodologia empregada por

Pinheiro-Sant’anna et al. (2009). Os extratos obtidos por Bligh-Dyer, foram diluídos

em hexano na concentração de 10mg/mL (hexano contendo 0,01% de BHT),

filtrados através de uma membrana de PVDF de 0,22µm (Millipore, USA), e

imediatamente injetados no sistema de cromatografia líquida de alta eficiência.

2.4. Determinação dos ácidos graxos CG-FID

Para as análises cromatográficas utilizou-se o método de Ballus et al.

(2014). Foi utilizado um cromatógrafo de gás modelo 7890 (Agilent, Alemanha)

equipado com uma coluna capilar de sílica fundida com 50% de cianopropil metil

polisiloxano modificado (60 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25

mm de espessura de filme) (Part number: 122-2362, Agilent, Alemanha), um

detector de ionização de chama (FID) e um injetor tipo spli/splitless, com razão de

split 1:25. Os parâmetros utilizados para determinação foram temperatura do

injetor (250 ºC), temperatura do detector (280 ºC), H2 como gás de arraste com

taxa de fluxo de 1,0 mL min-1, e no detector (H2: N2: ar sintético – 30: 30: 300

mL.min -1). A rampa de temperatura foi iniciada com 50 ºC passando para 175 ºC

com taxa de ajuste de 25 °C/min, posteriormente aumentada para 230 ºC a uma

taxa de ajuste de 4 ºC/min, totalizando assim 35,5 minutos de corrida A

identificação dos picos foi feita por comparação dos tempos de retenção dos

108

padrões, obtidos nas mesmas condições, e os tempos de retenção dos picos

observados para as amostras. Os resultados da área são expressos em

porcentagem de área total, ou seja, área do pico de um determinado ácido graxo

em relação à área total (somatório da área de todos os picos de ácidos graxos).

As amostras foram injetadas todas em triplicata.

2.5. Confirmação da identidade dos ésteres metílicos por CG/MS

A identificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi realizada em

cromatógrafo gasoso (CG) 7890A (Agilent, Alemanaha) acoplado a um detector de

massas (MS) tipo quadrupolo. Para separação dos ésteres, utilizou-se uma coluna

HP-5 (Aginet, Alemanha) de 30 metros de comprimento x 0,32 mm de diâmetro e

fase estacionária de 0,50 µm de revestimento. Os ésteres (1µL) foram injetados

em modo split (1:25). O fluxo do gás de arraste (He) foi ajustado para 0,5 mL/min,

a temperatura do injetor foi de 250ºC, a temperatura inicial do forno foi de 50 ºC

aquecendo a uma taxa de 1 °C/ min até atingir a temperatura de 110 ºC em

seguida aumentou-se a taxa para 3 ºC/ min até atingir uma temperatura de 310 ºC

onde permaneceu por mais 3 minutos, totalizando uma corrida de 129,67 minutos.

O fluxo de saída da coluna do CG para o espectrômetro de massas foi

ajustada para uma temperatura de 250 ºC. A fonte de ionização por impacto de

elétrons (EI) do MS foi ajustado para 70 eV a uma temperatura de 200 ºC. O

quadrupolo foi operado a uma temperatura de 150 ºC no modo scan, com intervalo

de monitoramento entre 50 e 500 m/z. Os dados foram obtidos através de um

software ChemStation® (USA) utilizado para aquisição e processamento de dados.

A identificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi realizada por tentativa

em comparação com os espectros da biblioteca virtual NIST® (versão 2011) e de

forma positiva por comparação de espectros das amostras com os dos padrões

analíticos injetados.

109

2.6. Tocoferóis

As análises dos tocoferóis foram realizadas utilizando um cromatógrafo à

líquido de alta eficiência (HPLC) Agilent 1100 (Agilent Technologies, Alemanha)

acoplado a um detector de fluorescência, sistema de bomba quaternária, injetor

automático e forno para controlar a temperatura da coluna. As condições do

método foram realizadas de acordo com os trabalhos de Souza et al. (2015),

Ballus et al. (2014) e Pinheiro-Sant'ana et al. (2011). Foi utilizada uma coluna com

dimensões de 150 mm x 4,6 mm x 3,0 µm de fase normal (sílica Hypersil, Thermo,

Alemanha) foi utilizada. A fase móvel consistiu de um sistema isocrático composto

de hexano: isopropanol: ácido acético (98,9: 0,6: 0,5) com um fluxo de 1,0 mL min -

1 A temperatura foi mantida a 30 °C, e o volume de injeção foi de 100 µL. A

detecção da fluorescência foi realizada em λEx 290 nm e λEm 330 nm. Os

compostos foram identificados por comparação dos tempos de retenção dos

compostos encontrados nas amostras com o padrão dos homólogos do tocoferol

separados sob as mesmas condições bem como por co-cromatografia e a

quantificação foi realizada através de uma curva padrão (padronização externa)

contendo 10 pontos com concentração entre 10 e 55 ng.µL-1. Todas as amostras

foram injetadas em triplicata.

2.7. Análise Estatística

O tratamento estatístico dos dados foi realizado através da Análise de

Variância (ANOVA), e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível

de 95% de confiança. Todas as análises estatísticas foram realizadas no software

Statistica 7.0 (Statsoft, USA).


3.1. Composição de ácidos graxos

Na Figura 1 tem-se o perfil cromatográfico obtido para uma das amostras de

abricó proveniente de Belém. As amostras da polpa de abricó não apresentaram

diferenças representativas quanto perfil cromatográfico dos principais ésteres

metílicos.

110

O perfil dos ácidos graxos, presentes nas polpas do abricó, identificados pelo

método do CG-FID, estão apresentados na Tabela 2.

Figura 1. Cromatograma da composição de ácidos graxos por CG-FID para uma das amostras de Belém (B1). As condições cromatográficas estão descritas no texto. Os números identificam os ácidos graxos correspondentes à Tabela 1.

111

Tabela 1. Teores de ácidos graxos obtidos da polpa de abricó (média ± desvio padrão, n = 3)

Ácidos

Graxos*

Teores de ácidos graxos (% da área relativa) por ano de coleta

Belém

1º Lote

Belém

2º Lote

Belém

3º Lote

Manaus

1º Lote

Manaus

2º Lote

Manaus

3º Lote

Kamatá

1

Kamatá

2

1 12:0 4,27±0,08ª 3,99±0,40ª 5,69±0,59ª 4,91±1,53ª 4,53±0,07ª 5,59±0,14ª 4,18±0,73ª 2,97±0,35ª

2 14:0 4,29±0,05ª 3,83±0,16ª 5,98±0,72ª 4,88±1,15ª 4,96±0,25ª 5,24±0,09ª 3,96±0,62ª 2,69±0,22ª

3 16:0 28,66±2,10ª 25,31±1,08ª 29,75±2,34ª 27,91±3,20ª 28,40±1,28ª 28,88±0,88ª 22,70±2,32ª 27,55±0,59ª

4 16:1 1,13±0,25ª 0,92±0,02ª 0,96±0,20ª 1,27±0,16 ª 1,20±0,27ª 1,11±0,16 ª 0,71±0,09b nd***

5 18:1 n9c 21,05±7,23ª 30,46±2,96a 19,35±4,78b 17,77±3,79b 17,60±4,54b 13,84±3,05b 35,98±6,37 a 19,70±0,38b

6 18:2 n6c 22,95±0,40b 17,35±1,20b 16,74±3,38b 22,28±3,69b 19,61±0,84b 23,19±0,86b 12,85±0,64c 29,49±2,52ª

7 18:3 n3 17,83±2,01ª 16,95±0,41ª 20,15±2,02ª 17,64±6,46ª 21,50±2,18ª 19,79±0,03ª 18,34±2,23ª 15,82±0,30ª

8 24:0 4,57±1,44ª 1,82±0,28b 2,57±0,89 b 3,21±0,20b 2,20±0,19b 2,37±0,07b 1,98±0,37b 3,14±0,43b

Sat. 38,70%B 35,92%B 39,85%B 40,98B 40,09B 43,41B 50,35 A 35,35B

Ins. 61,30%A 64,08%A 60,15%A 57,84 A 59,91A 56,59A 49,65A 64,65A

*nomenclatura de ácidos graxos: 12:0, ácido láurico 14:0, ácido mirístico 16:0, ácido palmítico; 16:1, ácido palmitoléico; 18:1n-9, ácido oleico;

18:2n-6, ácido linoleico; 18:3n-3, ácido α-linolênico; 24:0, ácido lignocérico. **Diferenças significativas na mesma coluna são indicadas com letras maiúscula diferentes. Diferenças significativas na mesma linha são indicadas com letras minúsculas diferentes (A - B)

***nd = não detectado.

112

Dentre os compostos encontrados na polpa do abricó (Tabela 1) estão o

ácido láurico (C12:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido

palmitoléico (C16:1), ácido oléico (C18:1n9cis), ácido linoléico (C18:2-cis),

ácido linolênico (C18:3n-6cis) e o ácido lignocérico (C24:0). Apenas para o lote

K2 não foi detectado o C16:1, provavelmente pela baixa concentração deste

composto.

O perfil dos ésteres metílicos do abricó avaliado neste trabalho

apresentou os ácidos graxos insaturados oleico, linoleico e linolênico (C18:1 –

20%, C18:2 – 20% e C18:3 – 18,5%), seguido pelo ácido palmítico (C16:0 –

26%). Para todos os lotes das diferentes localidades apresentaram prevalência

de ácidos graxos insaturados, sendo a porcentagem encontrada no 3º lote de

Belém juntamente com o Kamatá 2 (64%), o que é considerado uma

característica positiva do ponto de vista nutricional. Os óleos da polpa

apresentaram elevados teores de ácido linolênico ou ômega-3 (C18:3) (18,5%),

considerado ácido graxo essencial à alimentação humana. Este ácido graxo

possui efeito hipocolesterolêmico, considerado útil na redução do risco de

várias doenças e poderá ser consumido na forma in natura, o que é uma

vantagem nutricional, posto que este ácido graxo é altamente insaturado e

suscetível à oxidação pelo aquecimento.

O ácido esteárico (C18:0) também foi encontrado para algumas das

amostras, entretanto, como a resolução não foi adequada, na maioria dos

casos não foi quantificado, em termos de porcentagem, como pode visto no

cromatograma da amostra B1 (Fig. 1) no tempo de 19 min aproximadamente

(composto X).

As amostras, como mostra a tabela 1, não apresentaram diferença

significativa para os ésteres metílicos de ácidos graxos, e as poucas variações

ocorridas, podem ser consideradas resultantes de variabilidade natural para a

espécie, principalmente por se tratar de uma espécie nativa.

Também pode ser observado dos resultados obtidos na Tabela 1 que não

houve variações significativas (p<0,05) entre as proporções de ácidos graxos

saturados e insaturados na polpa de abricó, em relação ao local e lotes. Nota-

se que a fração insaturada foi significativamente maior que a quantidade de

ácidos graxos insaturados que ficaram em torno dos 60 %. Em comparação

com a parcela saturada.

113

Dados relacionados à composição de ácidos graxos presentes no óleo da

polpa de abricó não foram encontrados. Porém, outros trabalhos, como o de

Wycoff et al. (2015), que encontraram nas polpas de outras frutas regionais tais

como açaí roxo e branco, valores de 12,7%; 7,8%; 4,1% para açaí roxo e para

o açaí branco valores de 26,7%; 6,6%; 4,6% para os C16:1+C18:1, C18:2 e

C18:3 respectivamente. Valores estes próximos aos encontrados para a polpa

de abricó. Lopes et al. (2012), também encontraram em polpas de frutas do

nordeste (araticum e pequi) além de outros compostos o C12:0, C14:0, C16:0,

C16:1, C18:1, C18:2, C18:3, assim como neste presente trabalho. Coimbra

(2012) analisou o óleo de polpa de guariroba, jerivá e macaúba e encontrou o

C12:0, C14:0, C16:0, nas mesmas proporções, entre si, aos encontrados no

respectivo trabalho.

Lutterod et al. (2011), afirmam que a qualidade do óleo está diretamente

relacionado à predominância de ácidos graxos insaturados, uma vez que o

grau de saturação está relacionado à depreciação do produto e o consumo de

óleo com alto grau de saturação está diretamente ligado ao aparecimento de

doenças no ser humano. O ácido linolênico, principalmente, é um dos ácidos

graxos polinsaturados mais importantes na dieta alimentar. Os estudos

realizados para se determinar a importância do metabolismo deste ácido graxo

no corpo humano sugere que ele tem impôrtancia vital na prevenção de

doenças como formação de prostaglandinas e eicosanoides, necessários na

liberação hormonal das glândulas do hipotálamo e da tireóide, principalmente

(BROUWER, et al., 2006).

Foi realizado em seguida a análise de GC-MS dos ésteres metílicos dos

ácidos graxos, presentes na polpa de abricó anteriormente detectados e

quantificados no GC-FID. Verificou-se que o composto que encontrava-se em

baixa concentração não pode ser confirmado, isto ocorreu devido o GC-MS ter

sido operado no modo scan fazendo com que a sensibilidade do equipamento

tenha diminuído sensivelmente. Por isso apenas o 16:1 não foi confirmado.

Notou-se que dos compostos encontrados na polpa apenas o lignocérico,

não foi encontrado em alguns lotes (B2, M2 e K1), isto se deu, talvez devido a

baixa concentração deste composto. Para os demais compostos todos foram

confirmados. Na análise por CG-MS também pode ser confirmado à presença

114

do esteárico, composto este que não pode ser quantificado pelo FID devido o

mesmo estar co-eluido com um interferente.

3.2. Composição de Tocoferóis

Dados relacionados à composição dos homólogos da vitamina E, na

polpa de abricó, não foram encontrados na literatura. A Figura 2 apresenta um

perfil cromatográfico obtido para a mistura da solução-padrão dos quatro

isômeros da vitamina E estudados. A eluição dos compostos seguiu a ordem

característica e já bem estabelecida pela literatura para análises utilizando

sistema de fase normal: α-tocoferol, β- tocoferol, γ- tocoferol e δ- tocoferol.

Figura 2. Cromatogramas da mistura de padrões de tocoferóis (A) e uma das amostra

da polpa de abricó B1. As condições cromatográficas estão descritas no texto.

De todos os isômeros estudados da vitamina E, apenas o α-tocoferol foi

encontrado na polpa. A concentração do α-tocoferol nas amostras de abricó

analisados, estão apresentada na Tabela 3.

Relevante para essa observação em relação a presença do α-tocoferol é

o fato de ele também ser conhecido por estar concentrado principalmente em

min3 4 5 6 7 8 9

LU

15

20

25

30

35

40

FLD1 A, Ex=290, Em=330 (POLLY\TOCO000117.D)

min3 4 5 6 7 8 9

LU

15

20

25

30

35

40

FLD1 A, Ex=290, Em=330 (POLLY\TOCO000089.D)

alfa

(B)

(A) beta

gama

delta

alfa

115

tecidos que metabolizam ativamente (por exemplo, nas célula cloroplastos), ao

passo que os outros tocoferóis são mais encontrados em tecidos dormentes,

como em óleos de sementes (KAMAL-ELDIN & ANDERSSON 1997).

Tabela 2. Concentração de α-tocoferol presente na polpa liofilizada do abricó

Amostras Teor de alfa tocoferol

(µg.g-1 de óleo)*

Teor de alfa tocoferol

(µg/100g de fruta)**

B1 (2011) 0,76±0,11ª 1,52±0,33ª

B2 (2012) 1,05±0,05ª 2,11±0,10ª

B3 (2013) 1,18±0,10ª 2,37±0,20ª

M1 (2011) 1,04±0,13ª 2,09±0,25ª

M2 (2012) 0,86±0,08ª 1,73±0,16ª

M3 (2013) 1,23±0,11ª 2,47±0,23ª

K1 (2012) 0,84±0,05ª 1,67±0,10ª

K2 (2012) 1,23±0,11ª 2,47±0,23ª

*Valores representam a média de triplicata ± o desvio padrão, seguidas de letras

diferentes, minúsculas na coluna, diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. **Valores dados em fruta liofilizada

Nota-se, através dos dados, que concentração do α-tocoferol da vitamina

E presente na polpa de abricó não diferiu estatisticamente (p > 0,05) em

relação ao local de procedência dos frutos bem como entre os lotes da mesma

localidade, variando de 1,52 até 2,47 µg/100g de fruta liofilizada. Esses

resultados mostraram que tanto a concentração bem como a composição não

mudaram em relação à localidade e épocas de colheita dos frutos.

Vilela et al. 2013, estudaram em 12 cultivares de manga (polpa) a

presença dos isômeros da vitamina E, e o α-tocoferol também foi o único

detectado em todas as amostras de manga estudadas.

Charoensiri et al. (2009), encontraram em uma grande variedades de

frutas frescas, totalizando 37 tipos, resultados de alfa tocoferol que variaram

desde não detectável até 1,43 mg/100g, sendo que os maiores valores foram

encontrados no durião (variedade ''chanee") e na manga verde (variedade

‘kheosawoei’).

116

Kamal-Eldin & Andersson (1997), realizaram um estudo estatístico

utilizando uma técnica multivariada de análise de componentes principais

(PCA) tentando estabelecer se havia qualquer correlação bioquímica entre

conteúdo de tocoferol e percentuais de ácidos graxos em 14 óleos vegetais e

viu que existia uma alta correlação entre os ácidos graxos insaturados,

especificamente 18:1 e 18:2, com a presença do α-tocoferol. Entretanto, os

autores afirmam que outros fatores além do grau de insaturação, também

podem influenciar nos níveis de tocoferol, tais como a natureza dos lipídios, a

estrutura dos lipídios na presença de anti e/ou pró oxidantes, além de outros

fatores como a quantidade de clorofila e/ou outros pigmentos,

fotossensibilizadores que podem está presentes no óleo.

117

CONCLUSÃO

A análise de ácidos graxos no abricó mostrou que existem quantidades

significativas de ácidos graxos insaturados (cerca de 60%). Com relação aos

resultados obtidos para os tocoferóis presentes na polpa do abricó, estes

mostraram-se importantes, já que os valores encontrados na polpa mostraram

quantidades interessantes de α-tocoferol, quando comparadas a outras frutas

exóticas, contribuindo para o consumo da vitamina E, levando em consideração

o índice de ingestão diária que é de 10 mg de α-tocoferol/dia. Os resultados

deste estudo representam uma grande contribuição para a caracterização do

abricó, uma vez que trabalhos desta natureza são escassos para a respectiva

fruta e outras ainda pouco conhecidas da região amazônica, resultados estes

que permitem refletir com maior veracidade os nutrientes consumidos por essa

população.

118

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123

CONCLUSÃO GERAL

Neste trabalho, o conteúdo dos compostos fenólicos, da capacidade

antioxidante, de tocoferóis e ácidos graxos utilizando diferentes técnicas

analíticas foram analisadas. Este estudo é o primeiro sobre a composição

química desta fruta da região amazônica. Levando em consideração que

sempre há necessidade de adaptação das metodologias, por isso o

planejamento composto central, se mostrou uma ferramenta estatística

bastante importante, tanto para a aplicação da extração como também para

obtenção das melhores condições para a etapa de hidrólise.

O abricó apresentou uma significativa capacidade antioxidante para o

método de ORAC (CAP II), o que mostra uma ação antioxidante por parte de

outros compostos, além dos fenólicos, já que para está análise os resultados

obtidos foram relativamente baixos, resultados estes corroborados no CAP III,

na qual mostra os baixos teores encontrados para estes compostos que foram

obtidos através da técnica de cromatografia líquida.

Para as análises de ácidos graxos (CAP IV) observou-se que a polpa de

abricó apresentou um perfil com um alto índice de ácidos graxos insaturados,

aproximadamente 60%, o que a torna interessante, já que a ingestão de

alimentos com este perfil possui impactos benéficos a saúde como, por

exemplo, na prevenção de doenças cardiovasculares. Com relação aos

homólogos da vitamina E, esta fruta apresentou quantidades relevantes de

alfa-tocoferol, que foi detectado na concentração de aproximadamente 1,1

µg.g-1 para todas as amostras, quantidade está significativa quando

comparadas a outras frutas da região. Assim, estes resultados além de

proporcionar maiores dados sobre essa fruta mostra também que o abricó é

uma fruta interessante como fonte de compostos bioativos.

COMPOSTOS BIOATIVOS DO ABRICÓ (Mammea americana),...

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