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ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS RANK, RANKL E OPG EM DENTES DE RATOS REIMPLANTADOS Natal / RN 2014 CONCEIÇÃO APARECIDA DORNELAS MONTEIRO MAIA
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ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS RANK, RANKL E OPG
EM DENTES DE RATOS REIMPLANTADOS
Natal / RN
2014
CONCEIÇÃO APARECIDA DORNELAS MONTEIRO MAIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS RANK,
RANKL E OPG EM DENTES DE RATOS REIMPLANTADOS
ORIENTADORA: Prof.a Dr.a Hebel Cavalcanti Galvão
Natal/RN
2014
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-
graduação em Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para obtenção do grau
de Doutor em Patologia Oral.
Maia, Conceição Aparecida Dornelas Monteiro.
Análise imuno-histoquímica das proteínas rank, rankl e opg em dentes de ratos reimplantados / Conceição Aparecida Dornelas Monteiro Maia. – Natal, RN, 2014.
76 f. : il.
Orientador: Profª. Drª. Hébel Cavalcanti Galvão.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de
Pós-Graduação em Patologia Oral.
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Antônio Mendonça Monteiro e Elinora Dornelas
Monteiro, em especial minha mãe, por ter se dedicado intensamente
durante tantos anos da sua vida para que eu tivesse acesso à educação
de qualidade. Dedico e Agradeço de coração.
AGRADECIMENTOS
À DEUS
Autor da minha VIDA!
Aos meus familiares, Américo Maia Neto (marido), meus filhos Américo
Maia Segundo Neto, Tiago Monteiro Maia e Marcelo Monteiro Maia e minha neta
linda e queridíssima Maria Clara Melo Maia, pelo incentivo e compreensão,
durante a minha ausência nos momentos de estudo nesse período tão árduo e
longo.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Hebel Cavalcanti Galvão, por ter aceito
esse desafio. Meu muito obrigada.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral do
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte:
Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Prof.ª Dr.ª Éricka Janine Dantas da
Silveira, Prof.ª Dr.ª Hebel Cavalcanti Galvão, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Prof.ª
Dr.ª Lélia Batista de Souza, Prof.ª Dr.ª Lélia Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr.
Manuel Antonio Gordón Nuñes, Prof.ª Dr.ª Márcia Cristina da Costa Miguel e
Prof.ª Dr.ª Roseana de Almeida Freitas pela dedicação, ensinamentos e esforços
para contribuir da melhor forma possível para nossa formação profissional.
A Prof.ª Dr.ª Aurigena Antunes de Araújo Ferreira, do Curso de Farmácia
da UFRN, pela gentileza e preocupação em ceder material para realização desta
pesquisa. Sua colaboração foi decisiva para que o processamento imuno-
histoquímico pudesse ter acontecido. São atitudes como a sua que fazem as
pesquisas acontecerem. Meu muitíssimo obrigada.
Aos funcionários Gracinha, Idelzuíte, Sandrinha, Lurdinha, Canindé,
Ricardo e Evil pela presteza, disponibilidade, amizade e carinho. Vocês são
muito importantes na Patologia Oral da UFRN.
Aos colegas da minha turma de doutorado: Cyntia, Emeline, Felipe,
Fernando, Joabe, Keyla e Maiara, e das demais turmas: em especial Águida,
Ana Luiza e Denise por terem contribuído grandemente para mais uma etapa da
minha formação com amizade e conhecimentos.
Aos alunos de iniciação científica da UnP, especialmente Ciro Dantas,
pela disponibilidade, determinação e trabalho. A pesquisa precisa de alunos
como você. Meu muito obrigada.
À Prof.ª Irene Valério pela contribuição e dedicação por esse grupo de
pesquisa.
À Prof.ª Rosângela D’Ávila Lustosa Pinheiro Daniel pelo seu carinho,
contribuição e sobretudo amizade nas horas mais difíceis. Rô, você é como uma
irmã. Muito obrigada.
À Prof.ª Maria Alice Pimentel Fuscella pelo apoio e incentivo nessa
jornada tão árdua. Obrigada também pela sua amizade e compreensão.
À Universidade Federal do rio Grande do Norte, Universidade Potiguar e
Universidade de São Paulo pela parceria, contribuindo enormemente para essa
integração interinstitucional.
Aos professores da Odontologia UnP pelo incentivo e carinho durante
esse período, em especial o grupo da “Endo e Imagem” (Cícero Romão Gadê
Neto, Hanieri Gustavo de Oliveira, Betânia Fachetti, Rosângela D’Ávila Lustosa
Pinheiro Daniel e Lílian Karine Cardoso Guimarães Carvalho) quando
assumiram as aulas das disciplinas no momento em que não podia estar
presente. Muito Obrigada.
À CAPES/CNPq por ter financiado parte dessa pesquisa.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À Prof.ª Dr.ª Rejane Andrade de Carvalho por ter proporcionado grande
parte da realização dessa pesquisa. Sem a sua força e incentivo não conseguiria
concluir mais essa etapa da minha vida profissional. Obrigada por você ser
minha eterna mestra e, também, amiga.
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS RANK,
RANKL E OPG EM DENTES DE RATOS REIMPLANTADOS
RESUMO
O sistema RANK/RANKL/OPG participa da formação e reabsorção do osso, e sua descoberta tem sido um dos maiores avanços na compreensão da biologia óssea com relação à osteoclastogênese. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão dos marcadores RANKL/RANK/OPG em dentes de ratos reimplantados, bem como observar a relação entre a expressão desses marcadores com o processo de reabsorção dentária e óssea. Foram utilizados 30 incisivos superiores direitos de 30 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus). Os dentes foram avulsionados e divididos em dois grupos: G1 (n=15) – 5 minutos extra-alveolar e G2 (n=15) – 60 minutos extra-alveolar, permaneceram durante esse período em ar seco, e em seguida, reimplantados e analisados nos intervalos de 1, 3 e 7 dias. Para pesquisa de RANK, RANKL e OPG, mediante a utilização de anticorpos primários para ratos, os cortes histológicos foram submetidos à reação imuno-histoquímica. Os resultados demonstraram que o sistema RANK/RANKL/OPG participa ativamente, tanto do processo de reparo de dentes de ratos reimplantados, quanto das reabsorções dentárias e ósseas; o tempo extra-alveolar de 60 minutos antes do reimplante ocasionou menores expressões de RANKL e OPG, não influenciando na expressão de RANK; RANKL apresentou maior imunomarcação em ambos os grupos, quando comparado aos outros biomarcadores, participando em todas as fases da reabsorção óssea e dentária; RANKL esteve associado tanto ao processo de osteoclastogênese, como de proliferação celular, sendo expresso em ambos os grupos. Palavras-chave: Ligante RANK, Osteoprotegerina, reimplante dentário, reabsorção radicular, imunohistoquímica.
ANALYSIS IMMUNOHISTOCHEMISTRY OF RANK, RANKL AND OPG IN TEETH’S RATS REIMPLANTED
ABSTRACT
The RANK / RANKL / OPG system plays an important role in bone formation and resorption. This finding has been regarded as one of the most important advances in the understanding of bone biology with respect to osteoclastogenesis. The aim of this study was to investigate the expression of RANKL / RANK / OPG markers in reimplanted teeth of rats, and to observe the relationship between the expression of these markers and tooth and bone resorption. Thirty male Wistar rats (Rattus norvegicus albinos) had their maxillary right incisors extracted, and were divided into 2 groups according to the period that the extracted teeth were kept in dry air before reimplantation: G1 (n = 15) - 5 minutes, and G2 (n = 15) - 60 minutes. After reimplantation, teeth were analyzed at intervals of 1, 3 and 7 days. After these experimental periods, the animals were euthanized. Longitudinal sections with 5μm thick were obtained and stained with Hematoxylin and Eosin for histological analysis, while 3μm thick sections were subjected to immunohistochemical analysis of OPG, RANK and RANKL. The results showed that the RANK / RANKL / OPG system actively participates in both the repair process, as well as tooth and bone resorption. Extra-alveolar time of 60 minutes before replantation caused minor expressions of RANKL and OPG, not influencing the expression of RANK; RANKL immunostaining showed higher in both groups when compared to other biomarkers, participating in all phases of bone and tooth resorption; RANKL was associated to both osteoclastogenesis and cellular proliferation, and was expressed in both groups. Key words: RANK ligand, osteoprotegerin, tooth replantation, root resorption, immunohistochemistry.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Mecanismo da reabsorção óssea (CONSOLARO et al., 2012).............................................................................................
22
Figura 2 Esquema do processo de diferenciação osteoclástica (KUMAR et al., 2010)...................................................................................
26
Figura 3 Expressão imuno-histoquímica em G1 (1 dia) das proteínas RANK - Imunomarcação discreta de RANK em células inflamatórias polimorfonucleares (A), RANKL - Células do ligamento periodontal e osteoclastos expressam RANKL (B) e OPG - Imunomarcação de OPG em osteoblastos (C).................................................................................................
46
Figura 4 Expressão imuno-histoquímica em G1 (3 dias) das proteínas RANK - Células do ligamento periodontal em proliferação, imunomarcação ausente para RANK (A), RANKL - Imunomarcação de RANKL em fibroblastos e células inflamatórias mononucleares. Terço apical (B) no LP, e OPG - Ausência de imunomarcação de OPG no tecido ósseo (C)..........
47
Figura 5 Expressão imuno-histoquímica em G1 (7 dias) das proteínas RANK - Ausência de imunomarcação de RANK em área de anquilose alvéolo-dentária (A), RANKL - Imunomarcação forte em área de início de anquilose: Reabsorção dentária (dentinoclastos) e neoformação óssea (osteoblastos) (B) e OPG - Imunomarcação de OPG em tecido ósseo e células do ligamento periodontal (C) .............................................................
48
Figura 6 Expressão imuno-histoquímica em G2 (1 dia) das proteínas RANK - Ausência de imunomarcação de RANK no ligamento periodontal que exibe necrose e pouca celularidade (A), RANKL - Reação inflamatória no ligamento periodontal. Imunomarcação moderada de RANKL (B) e OPG - Imunomarcação ausente no ligamento periodontal, que apresenta fibrose (C) ........................
50
Figura 7 Expressão imuno-histoquímica em G2 (3 dias) das proteínas RANK - Reação inflamatória próxima ao cemento. Imunomarcação inexpressiva de RANK (A), RANKL - Imunomarcação de RANKL em fibroblastos e células inflamatórias mononucleares próximo ao cemento íntegro. Terço Médio (B) e OPG - Imunomarcação discreta de OPG em células inflamatórias próximo ao dente (C).................................................................................................
51
Figura 8 Expressão imuno-histoquímica em G2 (7 dias) das proteínas
RANK - Ausência de imunomarcação de RANK em área de
neoformação óssea (A), RANKL - Imunomarcação de RANKL em
área de neoformação óssea. Terço Médio/Apical (B) e OPG - Não
52
houve imunomarcação para OPG nas células do ligamento
periodontal (C) ............................................................
Figura 9 Expressão de RANK, RANKL e OPG em G1 e G2 quanto a
influência do tempo e a expressão dos marcadores imuno-
histoquímicos .............................................................................
54
Figura 10 Expressão de RANKL comparado com os outros marcadores
com relação ao período experimental ..........................................
55
Figura 11 Média da expressão de RANK, RANKL e OPG em G1 e G2
quanto a intensidade do processo inflamatório no LP e
reabsorção no osso e cemento (Teste Kruskall-Wallis) ...............
56
Figura 12 Expressão comparativa de RANKL e OPG nos subgrupos de
acordo com o tempo extra-alveolar no terço apical......................
57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição do número de dentes de acordo com os grupos
experimentais e períodos de avaliação.......................................
38
Tabela 2 Distribuição dos anticorpos primários ........................................ 41
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ATF4: Fator transcricional de ativação 4
BMP2: Proteína morfogenética óssea 2
BMP4: Proteína morfogenética óssea 4
BMU: Unidade osteorremodeladora
Cbfa-1: Fator α-1
CD: Cisto dentígero
CR: Cisto radicular
EGF: Fator de crescimento epidérmico
FA: Fibroma ameloblástico
GaAIAs: Laser de diiodo gálio-alumínio-arsenato
IGF-1: Fator de crescimento semelhante à insulina-1
IL-1: Interleucina-1
LBI: Laser de baixa intensidade
LP: Ligamento periodontal
M-CSF: Fator estimulante de colônias de macrófagos
MO: Mixoma odontogênico
NC: Necrose por coagulação
NL: Necrose por liquefação
OA: Osso alveolar
OPG: Osteoprotegerina
Osx: Osterix
PGE2: Prostaglandina E2
PMN: Leucócitos polimorfonucleares
PpgPO-UFRN: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN
PTH: Hormônio paratireoide
RANK: Receptor Ativador do fator nuclear kappa-B
RANKL: Ligante de RANK
REM: Restos epiteliais de Malassez
ROA: Reabsorção óssea ativa
ROR: Reabsorção óssea reparada
TGF-β: Fator transformador de crescimento β
TNF: Fator de necrose tumoral
TOA: Tumor odontogênico adenomatóide
TOCC: Tumor odontogênico cístico calcificante
TOEC: Tumor odontogênico epitelial calcificante
TRAF: Fator associado ao TNF
TRAP: Fosfatase ácida resistente ao tartarato
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UnP: Universidade Potiguar
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 17
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................... 19
2.1 TRAUMA DENTAL – AVULSÃO DENTAL...................................... 19
2.2 REABSORÇÃO ÓSSEA ALVEOLAR E RADICULAR ................... 20
2.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG ....................................................... 25
2.4 RANK .............................................................................................. 26
2.5 RANKL ............................................................................................ 27
2.6 OPG ................................................................................................ 29
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................ 35
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................... 36
4.1 ASPECTOS BIOÉTICOS ................................................................ 36
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ................................................ 36
4.3 ANIMAIS ......................................................................................... 36
4.4 PROCESSO DE AMOSTRAGEM ................................................... 37
4.4.1 Seleção e Tamanho da Amostra .................................................. 37
4.4.2 Critérios de inclusão .................................................................... 37
4.4.3 Critérios de exclusão .................................................................... 37
4.5 CONSTITUIÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ..................... 37
4.6. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................... 38
4.7. ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO................................................. 40
4.8 ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS .............................. 42
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................. 43
5 RESULTADOS ............................................................................... 44
5.1 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA ................................................ 44
5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................. 53
6 DISCUSSÃO ................................................................................... 58
7 CONCLUSÃO ................................................................................. 65
REFERÊNCIAS .............................................................................. 66
ANEXOS ......................................................................................... 74
17
1 INTRODUÇÃO
O trauma dental ocorre frequentemente e compreende 5% das injúrias
pelas quais as pessoas procuram tratamento, o que configura um complexo
particular devido à variedade de estruturas e tecidos que podem ser envolvidos
(ANDREASEN; ANDREASEN; ANDERSSON, 2007), sendo responsável por um
elevado número de dentes perdidos (RODRIGUES; RODRIGUES; ROCHA,
2010), principalmente quando ocorre a avulsão dos mesmos (TROPE, 2002).
O reimplante imediato é o tratamento de escolha da avulsão dentária.
Entretanto, o tempo de permanência extra-alveolar, o meio de armazenamento
do dente avulsionado, a preservação da vitalidade do ligamento periodontal em
condições assépticas, a regeneração do ligamento periodontal e o tipo de
reabsorção radicular influenciam no sucesso do tratamento e,
consequentemente, no prognóstico para os dentes reimplantados (BLOMLÖF,
1981; BLOMLÖF; OTTESKOG, 1980; ANDREASEN, 1981; CARVALHO et al.,
1999; TROPE, 2002; LUSTOSA-PEREIRA et al., 2006; FLORES et al., 2007;
KHADEMI et al., 2008; CONSOLARO et al., 2012).
As reabsorções patológicas dentárias são bastante frequentes e se
caracterizam como consequência e/ ou complicação de algumas situações
clínicas, dentre elas os traumatismos dentários, principalmente nos casos de
avulsão dentária, e constitui uma causa comum de perda de dentes. Os
cementoblastos e restos epiteliais de Malassez (REM), ao serem eliminados, dão
início a essas reabsorções (CONSOLARO, 2002; 2011).
O mecanismo biomolecular de reabsorção radicular tem sido pesquisado,
especialmente através da avaliação da expressão das proteínas RANK
(Receptor Ativador do fator nuclear kappa B), RANKL (Ligante de RANK) e OPG
(Osteoprotegerina) (LOSSDORFE; GOTZ; JAGGER, 2002; LOSSDORFE et al.,
2003; OGASAWARA, 2004), bem como seu envolvimento em potenciais
alterações em doenças metabólicas ósseas (KHOSLA, 2001; BOYCE, XING,
2007 (1); 2008; MILANOVA; IVANOVSKA; DIMITROVA, 2014).
18
Um grande avanço da biologia óssea ocorreu com a identificação do
sistema RANK/RANKL/OPG como mediador dominante da osteoclastogênese
(KHOSLA, 2001) e o equilíbrio entre as expressões desses componentes
fornece informações importantes sobre o metabolismo do osso (HALLEN et al.,
2006; SAITO et al. 2011; SILVA; BRANCO, 2011). Estas proteínas pertencem a
família do fator de necrose tumoral (TNF) (KARTSOGIANINNIS et al., 1999;
ANDERSON et al., 1997; HEYMANN et al., 2008; SILVA; BRANCO, 2011).
Várias vias de sinalização importantes têm sido estudadas com relação
aos mecanismos de controle da reabsorção óssea, os quais não são conhecidos
completamente (KUMAR et al., 2010).
Pesquisas procuraram desvendar o mecanismo da reabsorção radicular e
demonstraram o envolvimento do sistema RANK/RANKL/OPG nesse processo
(MANFRIN, 2007; SAITO et al., 2011; MANFRIN et al., 2013; PANZARINI et al.,
2013), fornecendo informações sobre a expressão e localização de cada uma
dessas proteínas envolvidas na cicatrização de dentes reimplantados. No
entanto, a influência do tempo extra-alveolar na expressão dessas proteínas
relacionada à reabsorção do dente não foi totalmente explicado, nem tampouco
o meio eficaz de impedir essa reabsorção progressiva da raiz após o reimplante
dental (TROPE et al., 1992; KIRAKOZOVA et al., 2009). Para entender melhor
esses fenômenos é relevante estudá-los.
Diante do exposto, o objetivo da presente pesquisa foi investigar a
expressão das proteínas RANK/RANKL/OPG em dentes de ratos reimplantados,
bem como observar a relação entre a expressão dessas proteínas com o
processo de reabsorção alveolar e dentária.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TRAUMA DENTAL – AVULSÃO DENTAL
Uma revisão de 12 anos de literatura mostra que crianças em idade
escolar (25%) e adultos (33%) sofrem trauma dental na dentição permanente,
compreendendo a maioria das lesões antes dos 19 anos (GLENDOR, 2008).
No Brasil esses traumatismos estão contemplados no Caderno de
Atenção Básica nº 17 – Saúde Bucal - Ministério da Saúde, em 4º lugar,
configurando um problema de saúde pública (MINISTÉRIO DA SAÚDE).
Dentre essas injúrias, a avulsão dental (1-16%) é a mais complexa e seu
prognóstico depende da tomada de decisão no momento do acidente ou do
tempo decorrido imediatamente após o trauma (ANDREASEN; ANDREASEN;
ANDERSSON, 2007; FLORES et al., 2007).
Avulsão dental é o deslocamento total do dente de seu alvéolo, tem maior
incidência no sexo masculino, sendo os incisivos centrais superiores os dentes
mais comumente afetados. Os fatores etiológicos são: prática de esportes,
acidentes automobilísticos e quedas na infância (ANDREASEN, 1970; MOURA;
PROKOWITSCH; DAVIDOWICZ, 1994).
Após o trauma, a dentina, o cemento, o osso alveolar e a gengiva
geralmente se regeneram, enquanto a polpa e o ligamento periodontal podem
se regenerar ou reparar através da formação de tecido de conjuntivo fibroso ou
tecido ósseo. Os tecidos dentais têm excelente capacidade regenerativa e
características especiais (ANDREASEN; ANDREASEN; ANDERSSON, 2007).
O dente avulsionado pode sofrer danos na superfície da raiz quando o
reimplante não for imediato ou se o dente avulsionado não for armazenado em
meio adequado. Assim, tecido pulpar, células do ligamento periodontal e
cemento sofrem necrose, o que aumenta a possibilidade de reabsorção
radicular, que é a principal causa de perda de dentes reimplantados (TROPE,
2002).
20
2.2 REABSORÇÃO RADICULAR E ÓSSEA ALVEOLAR
As reabsorções dentárias podem ser do tipo: fisiológica e patológica. As
fisiológicas ocorrem nos dentes decíduos no processo de esfoliação; enquanto
as patológicas podem ocorrer tanto nos decíduos quanto nos permanentes,
como consequência de processos patológicos, movimentação ortodôntica e
traumatismos dentários, e dividem-se em: inflamatória e por substituição ou
anquilose (TROPE, 2002; TYROVOLA, et al., 2008; CONSOLARO, 2011;
CONSOLARO et al., 2012).
O mecanismo da reabsorção inflamatória inicia quando há a remoção dos
cementoblastos da superfície radicular levando à exposição da mesma. A
reabsorção radicular, mesmo que temporária, é causada pelos osteoclastos que
se encontram próximos a superfície radicular. Com relação ao mecanismo da
reabsorção por substituição, ao mesmo tempo em que há a reabsorção das
estruturas desmineralizadas há também a formação contínua do osso ou
remodelação óssea. Quando não existe mais a presença dos restos epiteliais de
Malassez, que liberam o fator de crescimento epidérmico (EGF), dar-se-à a
anquilose alveolodentária (ANDREASEN; ANDREASEN, 2007; CONSOLARO,
2011).
Nos dentes permanentes, a reabsorção de tecidos mineralizados deve ser
considerada patológica, devido a ausência de qualquer contribuição para a
manutenção das estruturas normais do órgão dentário afetado ou para que suas
funções tenham um melhor desempenho (CONSOLARO et al., 2012). A
reabsorção na superfície radicular externa normalmente acompanha reações
simultâneas dentro do osso alveolar (GUNRAJ, 1999).
A remodelação do osso ocorre nas fases de ativação, reabsorção,
reversão e formação através do equilíbrio entre a atividade osteoblástica e
osteoclástica. As crateras formadas no osso, pelos osteoclastos, são
preenchidas pelos osteoblastos promovendo a deposição de uma nova matriz
óssea (BOYCE; XING, 2008).
Os osteoblastos são células mononucleares originadas de células
mesenquimais pela ação de fatores de transcrição como o fator α1 (Cbfa-1) ou
Runx2, osterix (Osx), fator transcricional de ativação 4 (ATF4) e proteína
21
morfogenética óssea (BMP), como BMP4, que depositam a matriz óssea e
regulam os osteoclastos (CAETANO-LOPES; CANHÃO; FONSECA, 2007).
Os osteoclastos são células multinucleadas, com atividade de reabsorção
óssea, que desempenham um papel crucial na remodelação do osso
(TAKAHASHI; UDAGAWA; SUDA, 1999) e derivam de precursores
mononucleares da linhagem mielóide e de células hematopoiéticas, que também
originam monócitos e macrófagos (BOYCE; XING, 2008). A diferenciação e
maturação osteoclástica são reguladas pelas citocinas e fatores de crescimento
que incluem o fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), as
interleucinas-1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF). Ligam-se a superfície
óssea das integrinas, onde a lacuna de reabsorção é formada e, juntamente com
os fatores produzidos, regulam a homeostase óssea (KUMAR et al., 2010). No
processo de reabsorção óssea, a IL-1 β é a citocina mais ativa, a qual é
produzida por monócitos, macrófagos e osteoblastos, participando como
mensageiro de sinais de reabsorção aos osteoclastos (ANDREASEN;
ANDREASEN, 2007).
A reabsorção e formação óssea ocorrem pelas mesmas células que
atuam em situações anormais sobre os dentes durante o processo de
reabsorção. A ação dos osteoclastos interagindo com os mediadores locais,
liberados pelos osteoblastos e células mononucleares da linhagem dos
macrófagos, distribuídos próximos à superfície onde estão instalados os
osteoclastos, promove a reabsorção, tanto normal quanto patológica, dos tecidos
mineralizados (CAETANO-LOPES; CANHÃO; FONSECA, 2007; CONSOLARO
et al., 2012).
Os osteoblastos e macrófagos são modulados por mediadores locais e
sistêmicos (RODAN; MARTIN, 1981), porém de origem extrínseca à unidade
osteorremodeladora (BMU), que é um conjunto celular responsável pela
reabsorção do tecido mineralizado, formada pelos osteoclastos, osteoblastos e
macrófagos. Para que a BMU se forme é necessário que os macrófagos se
diferenciem em osteoclastos, e sua instalação se dá quando há a migração dos
osteoclastos e o seu acoplamento na superficie óssea sem osteóide, os quais
podem ter sido precedidos por uma ativação exercida pela interação dos
mediadores intrínsecos da BMU em receptores de superfície, como o M-CSF e
RANKL, mobilizando-os para a área e induzindo a osteoclastogênese no local
22
Os osteoblastos liberam mediadores próprios, assim que são ativados, como
RANKL, para qual os osteoclastos apresentam receptores específicos, ou
RANK. Os osteócitos influenciam no tamanho da reabsorção (Figura 1)
(CONSOLARO et al., 2012).
Figura 1 – Mecanismo da reabsorção óssea (CONSOLARO et al., 2012).
Os osteoclastos apresentam, em sua maioria, receptores de superfície
para os mediadores extrínsecos da remodelação óssea, sejam locais
(prostaglandinas, citocinas – IL-1 e TNF, EGF) ou sistêmicos (paratormônio,
calcitonina e estrógenos) (LÖWIK et al., 1985), os quais se acoplam na superfície
óssea desnuda, de maneira firme, aderindo suas bordas e apresentando-se
como uma ventosa (face ativa) e seus prolongamentos citoplasmáticos variam
de 1 a 2µm. Nesse microambiente eles descarregam ácidos (láctico e cítrico),
promovendo um pH muito baixo, que atua diretamente na porção mineralizada
do osso e do dente, constituindo as lacunas de Howship. Também são liberadas
enzimas, como a fosfatase ácida e colagenases (VAES, 1988; PARFITT, 1984;
CONSOLARO et al., 2012).
23
A formação das lacunas de Howship promove na superfície dentária a
exposição dos canalículos dentinários no espaço periodontal, por onde chegam
os produtos necróticos ou microbianos e medicamentos, no caso de necrose
pulpar e/ou pulpectomia, devido a fina e delicada camada de cemento,
principalmente nos terços médio e cervical do dente. Ao ocorrer a liberação de
citocinas e fatores de crescimento, além de outros componentes, da matriz óssea
mineralizada para o meio tecidual periférico, estes atuam e exercem seus efeitos
indutores e inibidores de fenômenos biológicos. Por exemplo, os osteoclastos
acabam tendo sua apoptose inibida por alguns desses mediadores, como a
osteopontina, e outros como as BMPs, estimulam a síntese de matriz óssea na
área vizinha. Na reabsorção que envolve o cemento e a dentina ocorre o mesmo
mecanismo (ANDREASEN; ANDREASEN, 2007; CONSOLARO et al., 2012).
A atividade dos osteoclastos cessa quando os mediadores sistêmicos
diminuem sua concentração plasmática e tissular, e aumenta a concentração de
peptídeos e proteínas com capacidade de inibir a atividade reabsortiva óssea, e
provavelmente, do cemento e dentina. Esse processo de reabsorção não cessa
subitamente quando os osteoclastos se desacoplam das superfícies
mineralizadas, especialmente da superfície dentária radicular. O descolamento
parcial das bordas em escova da porção ativa ocorre, com subsequente perda
do conteúdo ácido do microambiente. A osteopontina e outras proteínas são
produzidas e depositadas pelos osteoclastos, nas lacunas de Howship, antes de
se desacoplarem, e podem ser importantes na atração dos osteoblastos e seus
progenitores, com a finalidade de retomarem a deposição de novo tecido ósseo
sobre as superfícies reabsorvidas, dando continuação ao processo de
remodelação óssea (CONSOLARO et al., 2012). O desacoplamento e a
migração dos osteblastos para a região próxima à superfície óssea ocorre pelas
condições favoráveis do pH ácido e da ação colagenolítica local intensa. Um
efeito quimiotático para os osteoclastos parece ser exercido pelos cristais de
hidroxiapatita expostos (PIERCE, 1989).
Para se diferenciar em osteoclastos, uma célula precursora da linhagem
macrofágica necessita de mediadores disponíveis como RANK, RANKL, OPG e
M-CSF para a osteoclastogênese. RANKL tem se revelado como importante
fator na atividade dos osteoclastos e na inibição de sua morte por apoptose. OPG
representa um receptor sóluvel para RANKL (um “decoy” para essa molécula),
24
que ao reagir com ele impede que o mesmo se ligue a RANK (receptor fixo nas
células). A reabsorção óssea e a diferenciação de células pré-osteoclásticas em
osteoclastos maduros é inibida se não houver interação entre RANK e RANKL.
O índice de reabsorção pode ser aumentado quando os osteócitos liberam
mediadores (M-CSF e RANKL) que estimulam os precursores dos osteoclastos,
ou osteoclastogênese, que se diferenciam e dão origem a novos osteoclastos
(NAKASHIMA et al., 2011; CONSOLARO et al., 2012).
A osteoclastogênese é um processo de interações complexas entre
células, receptores e seus respectivos ligantes, citocinas e fatores de
crescimento, caracterizando-se por ser uma resposta tanto imunológica como
mediada por inflamação. A IL-17 está implicada nesse processo e seu efeito tem
sido acreditado não por ser diretamente exercido nos processos osteoclásticos,
mas por ser indiretamente realizado através da indução de RANKL, o qual exerce
efeito nos precursores osteoclásticos. Assim, há participação da população
transitória e permanente do tecido na formação, proliferação e ativação dos
osteoclastos (OTA et al., 2014).
Em uma revisão da literatura sobre tratamentos de superfície radicular
executadas em casos de reimplante tardio com necrose de ligamento periodontal
cementário, observou-se que, quando não há o ligamento periodontal e a
contaminação está sob controle, a reabsorção por substituição e anquilose são
os melhores resultados e que, apesar destes eventos levarem à perda de dente,
isso irá ocorrer lentamente, sem perda da altura do alvéolo, fundamental para o
planejamento da futura prótese (PANZARINI et al., 2008).
Os ligamentos periodontais de dentes de ratos foram estudados
utilizando-se laser de baixa potência (InGaAl, 685 nm, 50 J/cm²), nos períodos
de 15, 30 e 60 dias após reimplante. Os cortes histológicos foram analisados em
relação às áreas de reabsorção externa e aspectos histológicos. No grupo
controle, comparado ao grupo do laser, observou-se um aumento da reabsorção
radicular (p<0,05) em 15, 30 e 60 dias, demonstrando que o grupo do laser
desenvolveu menos áreas de reabsorção do que no grupo controle. Células
inflamatórias e áreas necróticas foram reveladas, em menor número, na análise
histológica no grupo do laser (VILELA et al., 2012).
2.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG
25
O sistema RANK/RANKL/OPG contribuiu, em meados de 1990, para a
descoberta da chave de sinalização entre as células do tecido conjuntivo e
osteoclastos (BOYCE; XING, 2007). A interação entre RANK e RANKL
desempenha um papel crítico, promovendo a ativação e diferenciação de
osteoclastos, levando à reabsorção óssea (WITTRANT et al., 2004).
Enquanto OPG, RANK e RANKL são produzidos por numerosos tipos de células
e uma variedade de tecidos, o seu padrão de expressão atinge três principais
sistemas biológicos, onde a tríade molecular pode ser mais especificamente
envolvida: os sistemas osteoarticular, imunológico e vascular (THEOLEYRE et
al., 2004).
No mecanismo de controle da reabsorção óssea está envolvido o sistema
RANK/RANKL/OPG. A sinalização de RANK ativa o fator transcricional NF-kB,
essencial para a formação e sobrevivência dos osteoclastos, ao ser estimulado
por RANKL, o que constitui uma das vias de reabsorção óssea. O
osteoblasto/célula estromal ao expressar RANKL liga-se a RANK, que está
localizada na superfície celular dos precursores de osteoclastos. Na presença
do M-CSF, essa interação faz com que os osteoclastos funcionais sejam
produzidos por células precursoras. As células do tecido conjuntivo também
secretam OPG, a qual impede que se ligue a RANK nos precursores de
osteoclastos, impedindo a sua diferenciação, consequentemente, prevenindo a
reabsorção óssea (Figura 2) (KUMAR et al., 2010).
26
Figura 2 – Esquema do processo de diferenciação osteoclástica. Adaptada de
KUMAR et al. (2010).
Mais estudos vem sendo realizados atualmente com o propósito de
investigar a participação do sistema OPG/RANK/RANKL em diversas patologias,
na tentativa de descobrir uma terapêutica eficaz (ROSKAMP; VAZ; LIMA, 2006;
ANDRADE, et al., 2008; MOHAMMADPOUR et al., 2012; GUO et al., 2013;
FENG et al., 2013; NIMERI et al., 2013; MILANOVA; IVANOVSKA; DIMITROVA,
2014) .
2.4 RANK
RANK é um receptor transmembrana, composto de 616 aminoácidos
(KATAGIRI; TAKAHASHI, 2002), localizado nos precursores hematopoiéticos de
osteoclastos (macrófagos e monócitos), osteoclastos, linfócitos T e B, células
dendríticas e fibroblastos (HSU et al., 1999; AUBIN; BONNELYE, 2000;
STEJSKAL et al., 2000; KHOSLA, 2001; LOSSDORFE; GOTZ; JAGGER, 2002;
KUMAR et al., 2010).
27
A ativação de RANK por RANKL é seguida por sua interação com o
membro da família do receptor associado a TNF (TRAF), ativação do NF-kB, c-
Fos, JNK e c-src (ANDERSON et al., 1997; HSU et al., 1999). Sua expressão
está em diferentes tecidos: músculo esquelético, timo, fígado, colon, glândulas
mamárias, próstata, pâncreas e células da linhagem monócitos/macrófagos
(precursores de osteoclastos e osteoclastos maduros), células T e B, células
dendríticas e fibroblastos (BOYCE, XING, 2008; CAETANO-LOPES; CANHÃO;
FONSECA, 2007; GEUSES, 2009; TAT et al., 2009).
2.5 RANKL
RANKL é um peptídeo de 317 aminoácidos que estimula a diferenciação,
proliferação, fusão e ativação de células da linhagem osteoclástica, na presença
de concentrações do M-CSF, resultando em aumento do número de osteoclastos
ativos e reabsorção óssea (LACEY et al., 1998; TEITELBAUM, 2000).
Receptor da superfamília do TNF, RANKL existe em três isoformas:
RANKL 1, 2 e 3 e encontra-se no osso, medula óssea, pulmão e tecidos linfóides.
O tipo 2 pode, diferencialmente, regular a osteoclastogênese e é sintetizado nas
formas associada à membrana citoplasmática e solúvel por células da linhagem
osteoblástica, células imunes e algumas células neoplásicas malignas
(NAKASHIMA et al., 2000; WHYTE, MUMM, 2004; BOYCE; XING; 2007(1);
2008; VEGA; MAALOUF; SAKHAEE, 2007; CAETANO-LOPES; CANHÃO;
FONSECA, 2007; TAT et al., 2009), sendo expresso por osteoblastos e células
estromais da medula (KUMAR et al., 2010) e linfócitos T (HOFBAUER et al.,
1999; KONG et al., 1999). Exerce seus efeitos biológicos ao ativar RANK (HSU
et al., 1999), sendo a proteína humana que tem homologia de 87% com o RANKL
do rato (LACEY et al., 1998).
A reabsorção óssea pode ser prevenida com a preservação dos
osteócitos e, sabendo dessas informações o clínico deve cuidar e tratar melhor
as superfícies ósseas e margens cirúrgicas ósseas (CONSOLARO et al. 2012).
Os osteócitos morrem ao serem geradas microlesões no osso, igualmente como
se resseca ou esquenta o tecido ósseo. RANKL, então, pode ser gerado, como
28
no caso das microfraturas (CROCKETT et al., 2011). A preservação do periósteo
aderido na superfície óssea, na técnica do retalho dividido em tratamentos
periodontais, contribui para a manutenção dos osteócitos vivos, impedindo que
a sua morte induza a reabsorção da fina cortical óssea alveolar e promova uma
deiscência ou fenestração indesejável no local. A morte dos osteócitos mais
superficiais da cortical é gerada ao rebater o periósteo. No caso dos implantes,
essas superfícies devem ser preservadas do calor excessivo ou de manipulação
indevida para não atrapalhar a osseointegração (CONSOLARO et al. 2012).
RANKL e OPG tiveram suas dinâmicas de expressão avaliadas em cultura
de fibroblastos sinoviais humanos sadios e de ratos com artrite estimulados com
citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-17 e TNF-α) ou citocinas
antiosteoclastogênicas (IL-4 e IFN Ɣ), isoladas ou combinadas. A IL-4 suprime a
expressão de RANKL e aumenta a de OPG, enquanto a IL-17 causou um
pequeno efeito na expressão de RANKL e OPG. O aumento da razão
RANKL:OPG mostrou extensa destruição na articulação e a deficiência de IL-17
não aumentou a artrite ou reduziu a reabsorção óssea (TUNYOGI-CSAPO et al.,
2008).
Outro estudo investigou a proliferação, secreção de citocinas pró-
inflamatórias e expressão de PADI4 e RANKL em cultura de fibroblastos
sinoviais em artrite reumatoide e osteartrite (FAN et al., 2012). Observaram que
fibroblastos sinoviais podem contribuir de forma significativa para a ativação de
reabsorção óssea por meio da modulação de RANKL e OPG em um ambiente
rico em citocinas nas articulações com processo inflamatório.
Células endoteliais expressaram RANKL, em modelo experimental in
vitro, induzindo a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMNs), que
contém grânulos e vesículas de RANK em seu citoplasma, e quando ativados ou
estimulados o RANK é translocado para a membrana celular. Dessa forma, os
neutrófilos podem mediar o processo de formação e ativação de osteoclastos. A
regulação da expressão de RANK contribui para um estreito ajuste da migração
de PMN (RIEGEL et al., 2012).
A interação dos osteoclastos/osteoblastos tem sido associada com a
mobilização de células osteoprogenitoras levando a mais uma investigação do
papel das estatinas no metabolismo ósseo. RANKL está expresso em células
progenitoras e sua estimulação aumenta a proliferação celular in vitro e in vivo,
29
e é essencial para o aumento mediado nos níveis das estatinas de células
progenitoras, mas predominantemente devido a uma estimulação induzida por
RANKL de proliferação celular (STEINMETZ et al., 2013).
A habilidade dos neutrófilos em expressar RANKL e OPG, e produzir IL-
17, foi investigada em artrite e observaram que o seu desenvolvimento estava
associado com o aumento da secreção de IL-17, RANKL e OPG no soro e líquido
sinovial, e a neutralização da IL-17 inibe a reabsorção óssea e lesão da
cartilagem (FUTOSI; FODOR; MÓCSAI, 2013; MILANOVA; IVANOVSKA;
DIMITROVA, 2014).
2.5 OPG
OPG foi identificada por dois grupos distintos de pesquisadores: Amgen,
Inc. (USA), que a descreveu como uma molécula fascinante, identificada em uma
pesquisa em cDNAs, em intestino de ratos (SIMONET et al., 1997; KHOSLA,
2001) e Snow Brand Milk (Japão) que identificou essa mesma molécula por um
caminho diferente do grupo anterior (YASUDA et al, 1998). Outra hipótese foi
levantada sugerindo que o osteoblasto desempenharia um papel central na
mediação do controle hormonal da osteoclastogênese e reabsorção óssea
(RODAN; MARTIN, 1981).
OPG é um receptor solúvel ou receptor “isca” que atua como um
antagonista para RANK, ligando-se a RANKL, bloqueando a formação de
osteoclastos pela inibição da ligação deste com RANK (SIMONET et al., 1997;
WITTRANT et al., 2004). É um peptídeo de 380 aminoácidos (SIMONET et al.,
1997; YAMAGUCHI et al., 1998; YASUDA et al, 1998), produzido pelo cérebro,
estômago, fígado, medula espinhal, glândula tireóide (SIMONET et al., 1997;
YASUDA et al., 1998), osso, intestino, sistema cardiovascular (coração, artérias,
vasos), rim, pulmão, e células hematopoiéticas (SIMONET et al., 1997; TAN et
al., 1997; YUN et al., 1998).
Várias citocinas, peptídeos, hormônios e drogas regulam sua expressão,
como vitamina D3, TNF-α, TNF-β, IL-1α, IL-1β, fator transformador de
30
crescimento β (TGF-β), proteína morfogenética óssea 2 (BMP2) e hormônios
esteroides como o estradiol-17β (HOFBAUER et al., 1998; 1999; MIZUNO et al.,
1998), e a via de sinalização Wnt que aumentam a sua expressão; enquanto a
prostaglandina E2 (PGE2), hormônio paratireóide (PTH), glucocorticóides e fator
de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) diminuem sua expressão
(VEGA; MAALOUF; SAKHAEE, 2007).
No efeito in vitro da OPG, observa-se a inibição da diferenciação, da
sobrevivência, da fusão e da ativação de osteoclastos, bem como a estimulação
de apoptose dessas células, reduzindo, então, a quantidade de osteoclastos
ativos com capacidade de reabsorção óssea (SIMONET et al., 1997).
Pesquisas vem sendo realizadas com o propósito de investigar a
aplicação clínica da OPG como um agente antireabsortivo na terapêutica de
diversas doenças, caracterizadas pelo aumento da atividade osteoclástica,
devido sua presença no plasma sanguíneo que é fator determinante para a
manutenção da massa óssea, tornando insuficiente a quantidade de RANKL
(BEKKER et al., 1999; TENG et al., 2000).
A osteoclastogênese ocorre quando a razão RANKL/OPG está
desregulada, ou seja, a expressão de RANKL é super-regulada e a expressão
de OPG é sub-regulada ou não induzida com a mesma intensidade como RANKL
(BOYCE; XING, 1998). As células pré-osteoblásticas expressam essa razão
RANKL/OPG maior do que nas células maduras, contribuindo para a ativação e
maturação dos osteoclastos. O tecido ósseo é regulado através das vias de
sinalização RANKL/RANK, Wnt/β-catenina e Jagged1/Notch1 pelos
osteoblastos (BOYCE; XING, 2008).
Novas funções da tríade RANK/RANKL/OPG vem sendo reveladas em
outras patologias e tecidos, sugerindo que os osteócitos regulam o recrutamento
do local da reabsorção óssea em resposta às forças mecânicas, pela indução da
expressão de RANKL nessa área por células osteoblásticas (BOYCE; XING,
2007 (1); 2008; VEGA; MAALOUF; SAKHAEE, 2007).
A expressão de reguladores da reabsorção óssea, RANK, RANKL, e OPG
foi avaliada através de estudo imuno-histoquímico, em tumor odontogênico
cístico calcificante (TOCC), tumor odontogênico adenomatóide (TOA), tumor
odontogênico epitelial calcificante (TOEC), mixoma odontogênico (MO) e fibroma
ameloblástico (FA). Os resultados demonstraram imunorreatividade para todos
31
os reguladores em todas as amostras. O epitélio revelou um padrão similar de
expressão para RANKL e OPG em TOCC, TOA, TOEC e FA. As células do
estroma/mesenquimal apresentaram uma elevada expressão de OPG e RANKL,
na maioria dos casos de TOA e CCOT, enquanto CEOT, MO, FA revelaram uma
maior expressão de RANKL que OPG. Os constituintes celulares dos TOCC,
TOA, TOEC, MO e AF expressam reguladores chave do metabolismo ósseo
(ANDRADE et al., 2008).
As proteínas RANKL e OPG tiveram sua expressão investigada durante a
remodelação do osso in vivo para determinar a relação entre a estimulação da
osteoclastogênese e a diferenciação de osteoblastos. Através da expressão de
marcadores de formação óssea, que foi ativada na fase de formação do osso,
confirmou-se que essas moléculas são fatores chave na ligação da formação e
reabsorção óssea durante a remodelação do osso (TANAKA et al., 2011).
A expressão de RANK, RANKL e OPG nos cistos radiculares (CR) e
dentígeros (CD) foi investigada como fatores reguladores dos osteclastos na
expansão cística. A expressão imuno-histoquímica desses marcadores foi
avaliada e mensurada no epitélio de revestimento e cápsula fibrosa dos cistos.
Em todas as lesões observou-se uma expressão semelhante no epitélio de
revestimento. Os resultados demonstraram que: a cápsula fibrosa do CD
mostrou mais alta positividade de RANKL e RANK do que nos CR; no epitélio de
revestimento a razão RANKL/OPG demonstrou maior número de células
positivas para OPG do que para RANKL; no entanto a cápsula fibrosa
apresentou expressão similar em ambos os cistos. Dessa forma, há presença de
RANK, RANKL e OPG nos cistos radiculares e dentígeros. A atividade diferencial
da reabsorção óssea nessas lesões poderia ser devido a expressão aumentada
de OPG quando comparada a RANKL no epitélio de revestimento (MORAES et
al., 2011).
Pesquisas foram realizadas para analisar a expressão do sistema
RANK/RANKL/OPG na cronologia do processo de reparo após reimplante
imediato e tardio em dentes de ratos (MANFRIN, 2007; SAITO et al., 2011;
PANZARINI et al., 2013; MANFRIN et al., 2013).
A imunomarcação das proteínas OPG, RANK, e RANKL foi avaliada em
28 dentes reimplantados de ratos (Rattus norvegicus albinus). Os grupos
formados foram: Grupo Controle – sem reimplante; Grupo I - reimplante imediato;
32
Grupo II - reimplante tardio sem tratamento endodôntico; Grupo III - reimplante
tardio com tratamento endodôntico (ressecção da polpa dentária e
preenchimento do canal radicular com pasta de hidróxido de cálcio) e tratamento
da superfície radicular (raspagem mecânica do ligamento periodontal necrosado
e imersão em solução de flúor fosfato acidulado de sódio a 2,5%). Os cortes
histológicos com 6 μm de espessura foram submetidos à reação imuno-
histoquímica utilizando-se anticorpos primários para OPG, RANK e RANKL. Os
resultados demonstraram, em todos os grupos e períodos estudados, que a
imunomarcação de OPG e RANKL ocorreu, embora RANKL não tenha sido
observada no grupo do reimplante imediato após 60 dias. Apenas RANK foi
observada apenas aos 10 dias em todos os grupos. Sugere-se, assim, a efetiva
participação, no início do processo de reabsorção radicular, do sistema
OPG/RANK/RANKL pela marcação evidente no reimplante tardio, uma vez que
aos 60 dias sua imunomarcação foi discreta. No entanto, a expressão de OPG e
RANK foi significativamente maior imediatamente e 3 dias após o reimplante. A
diminuição dos fatores locais, tais como as citocinas inflamatórias, devido
regeneração do ligamento periodontal e revascularização pulpar reduz a
expressão destas proteínas, em 10 e 60 dias (MANFRIN, 2007).
O efeito do laser de baixa intensidade (LBI) no processo de cicatrização
de dentes de ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), reimplantados imediata e
tardiamente, foi avaliado por meio da histomorfometria e imuno-histoquímica,
após diferentes períodos extra-alveolares. Os grupos constituídos foram C
(Controle – sem laser) e L (Laser): C4 e L4 (4min – imediato), C30 e L30 (30min
– demorado), e C45 e L45 (45min – retardado). Os incisivos direitos tiveram as
superfícies da raiz e as feridas alveolares irradiadas com laser de diodo gálio-
alumínio-arsenato (GaAIAs) antes do reimplante. Após 60 dias, os animais foram
sacrificados e as peças anatômicas contendo os dentes processadas para a
análise histomorfométrica e para expressão imuno-histoquímica das proteínas
RANK, RANKL, OPG e TRAP. Observaram áreas de substituição externa e
reabsorção radicular inflamatória em todos os grupos, sem diferenças
estatisticamente significativas (P>0,05). A anquilose estava mais presente no
grupo L30 que no C30 (P<0,05). RANKL predominou sobre RANK e OPG em
ambos os grupos com reimplante imediato (P<0,05). Verificaram maior evidência
de RANK comparando com RANKL, no período de 45min extra-alveolar, para os
33
grupos controle e o tratado com laser (P<0,05). Concluíram que o tratamento da
superfície da raiz e do alvéolo com esse tipo de laser não melhorou o processo
de cura após reimplante de dentes de ratos, imediato e tardio (SAITO et al.,
2011).
Um estudo avaliou a cronologia do processo de reparo após reimplante
imediato de dentes de ratos, através das análises histológica e imuno-
histoquímica em um período de 60 dias. Incisivos direitos de 36 ratos Wistar
machos foram extraídos e reimplantados 15 min após terem sido armazenados
em solução salina. Após o reimplante, os animais foram sacrificados
imediatamente em 3, 7, 15, 28 e 60 dias. A ruptura do ligamento periodontal e
formação de um coágulo de sangue, que passou a ser substituído por um tecido
conjuntivo após 3 dias foram revelados através da análise histológica. Aos 7 dias,
o epitélio da mucosa gengival foi reinserido e áreas de reabsorção radicular
vistos. Aos 15 dias, o ligamento periodontal foi reparado. Aos 3 dias, a polpa
apresentou uma ausência da camada de odontoblastos, a qual começou a ser
substituída por um tecido conjuntivo, sofrendo calcificação gradual, e
preenchendo o canal radicular em 28 e 60 dias. A maior expressão das proteínas
OPG e RANK ocorreu nos períodos iniciais (0 e 3 dias), enquanto que a
expressão da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) predominou aos 28
e 60 dias (P < 0,05). No reimplante dentário tardio, há grande atividade de
formação óssea nos períodos anteriores ao processo de reparo, e uma
predominância de reabsorção e remodelação óssea em períodos mais
avançados. A proliferação celular e a apoptose ocorrem em diferentes padrões
e em diferentes tempos para manter o espaço do ligamento periodontal regular
após reimplante dentário (PANZARINI et al., 2013).
A expressão imuno-histoquímica das proteínas OPG, RANK e RANKL
foi avaliada no reparo de dentes de ratos após reimplante imediato e tardio.
Cinquenta e seis ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus) tiveram seus incisivos
laterais direito extraídos e reimplantados, e divididos em grupos: G1 Grupo
Controle (n=8) dentes não extraídos; G2 (n=16) reimplante imediato; G3 (n=16)
reimplante tardio sem tratamento; G4 (n=16) reimplante tardio após tratamento
da superfície radicular (remoção do ligamento periodontal e imersão em fluoreto
de sódio fosfato acidulado a 2%) e preenchimento intracanal com hidróxido de
cálcio. A eutanásia dos ratos ocorreu da seguinte maneira: G1 - primeiro dia do
34
experimento e demais grupos - 10 e 60 dias após o reimplante (n=8/período). Os
espécimes foram submetidos a análise histológica e imuno-histoquímica, a qual
revelou expressão das proteínas OPG e RANKL em todos os grupos e tempos
pós-reimplante, exceto para o G2 em 60 dias. Nos grupos experimentais, a
expressão de RANK foi observada só nos 10 dias. O sistema
OPG/RANK/RANKL apresentou forte marcação no tempo de reimplante
imediato, sugerindo que no início do processo de reparo há uma participação
mais efetiva dessas proteínas, entretanto, após 60 dias houve diminuição da sua
expressão (MANFRIN et al., 2013).
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo propôs investigar a influência do tempo extra-alveolar (5
ou 60 minutos) na expressão dos marcadores RANKL/RANK/OPG em dentes de
ratos reimplantados, e avaliar a diferença de atividade de RANKL e OPG
35
correlacionando com a ocorrência de reabsorções em diferentes intervalos de
tempo.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ASPECTOS BIOÉTICOS
36
A pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Potiguar (UnP) e aprovada sob o protocolo nº 011/2013 (ANEXO 1). Os
experimentos foram conduzidos seguindo as recomendações éticas para
animais (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals - National Research
Council, 1996).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
A pesquisa consiste em um estudo experimental in vivo baseado em
análise qualitativa e quantitativa da expressão das proteínas RANK, RANKL e
OPG.
4.3 ANIMAIS
Foram utilizados ratos machos, adultos, da linhagem Wistar (Rattus
norvegicus albinus), pesando entre 250 e 300 gramas, com 60 dias de vida,
provenientes do Biotério da UnP, Natal/RN.
Os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas, forradas com
maravalha trocada diariamente e alimentados com ração sólida triturada (Ração
Ativada Produtor®, Anderson & Clayton S.A. – Laboratório Abbot do Brasil Ltda,
São Paulo, SP, Brasil) e água à vontade. A ração foi utilizada antes e durante o
experimento, com exceção das primeiras doze horas pós-operatórias, quando os
ratos tiveram dieta zero. A temperatura foi controlada e mantida em torno de 28º
C. Os ciclos de luminosidade foram de 12 em 12 horas.
4.4 PROCESSO DE AMOSTRAGEM
37
4.4.1 Seleção e Tamanho da Amostra
Foram utilizados 30 incisivos superiores direitos de 30 ratos machos da
linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus) com 60 dias de vida.
4.4.2 Critérios de Inclusão
Foram inseridos no estudo animais sadios e com dentes íntegros para as
fases do experimento.
4.4.3 Critérios de Exclusão
Foram excluídos do estudo animais que não se apresentaram sadios e
sem dentes íntegros das fases do experimento.
4.5 CONSTITUIÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os grupos experimentais foram divididos de acordo com o quadro na
página seguinte:
Tabela 1 Distribuição do número de dentes de acordo com os grupos
experimentais e períodos de avaliação.
PERÍODOS DE AVALIAÇÃO
GRUPOS
1 dia 3 dias 7 dias Total de dentes
G1 (Ratos 1 – 15) – 5 min. 5 5 5 15
G2 (Ratos 16 – 30) – 60 min.
5 5 5 15
Total de dentes 10 10 10 30
38
4.6 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Para realização dos procedimentos experimentais, foram utilizadas as
dependências físicas de dois pólos: UnP e Universidade Federal do Rio Grande
do Norte (UFRN).
Antes da intervenção cirúrgica, com a finalidade de anestesiar os animais,
empregou-se um anestésico dissociativo para uso veterinário (Zoletil® 50 –
Saúde Animal - Virbac, Carros, França), na dosagem de 0,3 mg/100mg de peso,
por via intramuscular, na região do quadríceps, utilizando-se seringas
descartáveis de 0,5ml de insulina e agulha nº 30G (CREMER® - Blumenau,
Santa Catarina, Brasil).
Após o procedimento anestésico, foi efetuada a antissepsia da porção
anterior da maxila com uma solução degermante antisséptica tópica de
clorexidina à 2% (Rioquímica® - São José do Rio Preto, SP, Brasil) com o auxílio
de cotonetes.
Com auxílio de instrumentos cirúrgicos adaptados, foram realizadas a
sindesmotomia, luxação e extração do incisivo superior direito de cada animal,
simulando a avulsão dentária. Para a sindesmotomia, foi utilizada também
espátula para cera Duflex nº 7 (S.S. White® - Rio de Janeiro, RJ, Brasil) inserida
no ângulo mésio–vestibular das tábuas ósseas dos incisivos superiores, paralela
aos seus longos-eixos, praticando-se movimentos de luxação. Com o
alveolótomo adaptado (OKAMOTO; RUSSO, 1973), executou-se a força
extrusiva acompanhando a curvatura do dente.
Os dentes extraídos permaneceram em ambiente seco por 5 minutos para
o Grupo 1 e por 60 minutos para o Grupo 2, fixados por sua coroa em uma lâmina
de cera rosa Wilson nº 7 (Polidental Indústria e Comércio Ltda., Cotia, SP, Brasil).
Antes do reimplante no alvéolo todos os dentes tiveram a superfície radicular
irrigada com solução fisiológica (Ariston Ind. Quim. E Farm. Ltda., São Paulo,
SP, Brasil). Não houve qualquer tipo de tratamento sistêmico nem local para os
dentes e alvéolos.
39
Durante o período cirúrgico, foram confeccionados leitos individualizados
para cada animal, para evitar contaminação dos mesmos. Todo esse material,
como também, o instrumental utilizado na intervenção foi esterilizado em
autoclave 19L (Dabi Atlante® - Ribeirão Preto, SP, Brasil).
Logo após o ato cirúrgico, os ratos foram colocados em gaiolas (1 por
gaiola) devidamente identificadas e assistidos no laboratório para recuperação
da anestesia. Depois foram levados ao biotério, sendo observados diariamente,
até que se completassem os períodos experimentais.
Concluído o período de teste programado, os animais foram sacrificados
em câmara de gás carbônico Modelo GSCO2 (Beira-Mar® - São Paulo, SP,
Brasil) nos respectivos períodos de um, três e sete dias.
Seguida a eutanásia dos ratos, as maxilas foram fixadas por 2 dias em
solução de formalina à 10% (Indalabor® - Ind. Lab. Farm. Ltda., Dores do Indaiá,
MG, Brasil) em temperatura ambiente e, a seguir, desmineralizadas em solução
de ácido nítrico a 7% durante 3 dias (Micro Química Prod. Lab.® - Cotia, SP,
Brasil). A maxila direita foi separada da esquerda na linha mediana com auxílio
de uma lâmina de bisturi nº 15 (Embramac Exp. e Imp., Campinas, SP, Brasil).
Um corte com tesoura reta na porção distal do 3º molar possibilitou a obtenção
da área da maxila contendo o dente reimplantado.
Após a descalcificação, as peças foram embebidas em parafina,
submetidas a cortes longitudinais de 5μm de espessura e, posteriormente,
corados pela Técnica da H/E para exame histológico de rotina sob microscopia
óptica e cortes longitudinais de 3μm de espessura para estudo imuno-
histoquímico.
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Os espécimes emblocados em parafina foram submetidos a cortes
histológicos medindo 3 μm de espessura e montados em lâminas de vidro
previamente limpas, preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxi-
silano (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, EUA).
Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos à técnica da imuno-
histoquímica, pelo método da estreptavidina-biotina (CSAB – streptoavidin biotin
40
complex), utilizando anticorpos primários para ratos como OPG (goat anti OPG
polyclonal antibody – Santa Cruz Biotechnology® – N-20, Califórnia, USA),
RANK (goat anti RANK polyclonal antibody – Santa Cruz Biotechnology® – H-
300, Califórnia, USA) e RANKL (goat anti RANKL polyclonal antibody – Santa
Cruz Biotechnology® – N-19, Califórnia, USA) (Quadro 2).
Tabela 2 - Distribuição dos anticorpos primários
*Fabricante: Santa Cruz Biothecnology®
Como controle positivo para os anticorpos foram utilizados cortes
histológicos de lesões de células gigantes e, para o controle negativo, omitiu-se
os anticorpos primários.
O protocolo do estudo imuno-histoquímico foi o mesmo utilizado no
Laboratório de Imuno-histoquímica do Programa de Pós-Graduação em
Patologia Oral – UFRN (PPgPO-UFRN), descrito a seguir:
1) Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura
ambiente (TA).
2) Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
- álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
- álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA;
- álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;
Clone Especificidade Diluição Recuperação
Antigênica
Tempo de
Incubação
H-300 Anti – RANK* 1:200 Citrato pH 6.0,
Pascal, 3min Overnight (18 h)
N-19 Anti – RANKL* 1:200 Citrato pH 6.0,
Pascal, 3min Overnight (18 h)
N-20 Anti – OPG* 1:200 Citrato pH 6.0,
Pascal, 3min Overnight (18 h)
41
3) Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol
95° por 10 minutos, à temperatura ambiente;
4) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
5) Três ou 4 passagens em água destilada;
6) Recuperação dos sítios antigênicos;
7) Lavagem em água corrente por 5 minutos e 2 passagens em água destilada;
8) Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de
peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio da
peroxidase endógena tecidual;
9) Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada.
10) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
11) Incubação dos cortes com os anticorpos primários diluídos em solução
diluente Dako (Antibody diluent with background reducing components; Dako
North America, Carpinteria, CA, USA);
12) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
13) Incubação com o anticorpo secundário biotinilado (Biotinylated link universal,
Dako North America, Carpinteria, CA, USA + System-HRP) durante 30 minutos
- TA;
14) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
15) Incubação com o complexo estreptoavidina HRP (Dako North America,
Carpinteria, CA, USA) durante 30 minutos, à temperatura ambiente;
16) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
17) Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrato,
Dako North America, Carpinteria, CA, USA), durante 7 minutos - TA.
18) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
19) Duas passagens em água destilada;
20) Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 5 minutos à temperatura
ambiente;
21) Lavagem em água corrente – 10 minutos;
22) Duas passagens em água destilada;
42
23) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
- álcool etílico 80°GL (2 minutos) TA;
- álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
24) Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
25) Montagem da lamínula em resina Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn,
NJ, USA).
4.8 ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS
Os cortes histológicos foram usados para marcação imuno-histoquímica
com a finalidade de determinar a expressão dos anticorpos OPG, RANK e
RANKL no LP.
As lâminas foram escaneadas pelo Scanner Panoramic MIDI
(3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121) e
as imagens obtidas através do programa de visualização Pannoramic Viewer
1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-
1121). Toda a extensão do espécime foi observada com o auxílio desse
programa, proporcionando a identificação da imunomarcação para cada
biomarcador.
Foi realizada a análise semi-quantitativa, apenas na face lingual, da
marcação imuno-histoquímica dos antígenos em todas as lâminas incluídas na
amostra. A imunomarcação dos biomarcadores foi avaliada em fibroblastos,
osteoblastos, células endoteliais, células inflamatórias mononucleares e
polimorfonucleares, tendo sido consideradas positivas as células que exibiram
coloração acastanhada, quer seja na membrana citoplasmática ou citoplasma.
Dessa forma, a intensidade da imunomarcação de cada proteína foi
avaliada de acordo com os escores: (0) – Marcação ausente ou inexpressiva (0-
25% das células positivas); 1 – Fraca marcação (25-50% das células positivas);
43
2 – Marcação moderada (50-75% das células positivas); 3 – Marcação forte (75-
100% das células positivas).
Todos os dados foram tabulados em planilha eletrônica Excel (Microsoft
Windows 8 Home edition®).
Os examinadores (dois) foram submetidos a uma calibração para os
parâmetros imuno-histoquímicos e os mesmos não tiveram acesso às
informações histomorfológicas dos casos analisados (estudo cego).
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise entre os grupos experimentais e da influência do tempo, os
dados foram submetidos ao teste Wilcoxon signed-rank.
Os escores obtidos, na análise imuno-histoquímica, foram submetidos aos
testes estatísticos para analisar a expressão imuno-histoquímica dos
marcadores OPG, RANK e RANKL em cada tempo e período de pós-reimplante.
Devido à ausência de distribuição normal dos dados, foi realizado o teste não
paramétrico Kruskal-Wallis e o pós-teste Dunn’s, que foram empregados com o
auxílio do software GraphPad 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA,
USA).
Para ambos os testes estatísticos admitiu-se um nível de significância de
5% (P<0,05).
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Os biomarcadores RANK, RANKL e OPG exibiram, na maioria dos
espécimes analisados, um padrão de marcação predominantemente
citoplasmática, variando quanto aos graus de expressão e localização.
44
A imunorreatividade foi observada em todas as células, tais como:
fibroblastos, células endoteliais, osteoclastos, células inflamatórias, etc. O
controle positivo exibiu forte marcação.
A frequência relativa ao escore de imunomarcação, considerando toda a
extensão do espécime, no G1 (5 min.), para: RANK foi de 12 casos apresentando
escore 0 (80%), 2 casos com escore 1 (13,3%) e 1 com escore 2 (6,7%); RANKL
foi de 2 casos com escore 0 (13,3%), 8 casos com escore 1 (53,3%) e 5 com
escore 2 (33,4%); OPG 9 casos apresentaram escore 0 (60%), 4 casos com
escore 1 (26,7%), 1 com escore 2 (6,7%) e 1 caso não pode ser analisado.
Enquanto, no G2 (60 min.): RANK foi de 12 casos apresentando escore 0 (80%),
1 casos com escore 1 (6,7%) e 2 casos não puderam ser analisados; RANKL foi
de 6 casos com escore 0 (40%), 5 casos com escore 1 (33,4%), 3 com escore 2
(20%) e 1 caso não pode ser analisado; OPG 7 casos apresentaram escore 0
(46,7%), 5 casos com escore 1 (33,4%) e 3 casos não puderam ser analisados.
A distribuição dos casos com relação a frequência dos escores,
considerando toda a extensão do espécime, mostrou-se similar para RANK e
OPG em todos os períodos experimentais e grupos, bem como o predomínio do
escore 0. Para RANKL houve um predomínio do escore 0 no G2 nos períodos
experimentais de 1 e 3 dias, e do escore 1 no G1 em todos os períodos
experimentais.
As médias dos escores de imunomarcação, considerando toda a extensão
do espécime, do RANK, RANKL e OPG no G1 e G2, nos períodos experimentais
de 1, 3 e 7 dias estão dispostas na Figura 11.
Os grupos experimentais exibiram as imunomarcações descritas a seguir:
G1 (5 minutos – 1 dia)
RANK exibiu ausência de imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva, predominantemente, no cemento e tecido ósseo, sem reabsorção
radicular e óssea, e presença de células inflamatórias polimorfonucleares.
Enquanto RANKL exibiu imunomarcação moderada em células do LP e
45
osteoclastos, áreas de reabsorção óssea também foram observadas. OPG
exibiu fraca imunomarcação em osteoblastos (Figura 5 - A, B e C).
G1 (5 minutos – 3 dias)
RANK exibiu ausência de imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva em toda extensão do espécime. Enquanto RANKL exibiu
imunomarcação moderada na maior parte do espécime e em fibroblastos e
células inflamatórias mononucleares no LP. OPG exibiu imunomarcação fraca
na maior parte do espécime, moderada no LP e ausência de imunomarcação no
tecido ósseo no terço médio do dente (Figura 6 - A, B e C).
G1 (5 minutos – 7 dias)
RANK exibiu fraca imunomarcação em toda extensão do espécime e em
áreas de anquilose alvéolo-dentária (AAA) houve ausência de imunomarcação.
Enquanto RANKL exibiu imunomarcação moderada em toda a extensão do
espécime e forte imunomarcação em área de início de AAA, onde pode-se
observar reabsorção dentária (presença de dentinoclastos) e neoformação
óssea (presença de osteoblastos). OPG exibiu fraca imunomarcação em toda
extensão do espécime, inclusive no LP e tecido ósseo (Figura 7 - A, B e C).
46
Figura 3 Expressão imuno-histoquímica, em G1 - 1 dia, das proteínas RANK – Imunomarcação
discreta em células inflamatórias polimorfonucleares (A), RANKL – Imunomarcação moderada
em células do LP e osteoclastos (B) e OPG - Imunomarcação fraca em osteoblastos (C).
C
A
B
47
Figura 4 Expressão imuno-histoquímica, em G1 – 3 dias, das proteínas RANK – Ausente
imunomarcação e células do LP em proliferação (A), RANKL - Imunomarcação moderada em
fibroblastos e células inflamatórias mononucleares. Terço apical (B) no LP, e OPG - Ausência
de imunomarcação no tecido ósseo (C).
C
B
A
48
Figura 5 Expressão imuno-histoquímica, em G1 - 7 dias, das proteínas RANK - Ausência de
imunomarcação /em área de AAA (A), RANKL - Imunomarcação forte em área de início de AAA:
Reabsorção dentária (dentinoclastos) e neoformação óssea (osteoblastos) (B) e OPG -
Imunomarcação em tecido ósseo e células do LP (C).
A
B
C
49
G2 (60 minutos – 1 dia)
RANK exibiu ausência de imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva na maior parte dos espécimes, inclusive no LP onde observa-se
áreas de necrose e pouca celularidade. No entanto, RANKL exibiu fraca
imunomarcação na maior parte do espécime e moderada em áreas de reação
inflamatória no LP no terço apical. OPG exibiu também fraca imunomarcação na
maior parte do espécime e Imunomarcação ausente no LP com fibrose (Figura
8 - A, B e C).
G2 (60 minutos – 3 dias)
RANK exibiu ausência de imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva em toda a extensão do espécime, com áreas de reação inflamatória
próxima ao cemento. Entretanto, RANKL exibiu fraca imunomarcação na maior
parte do espécime e moderada em fibroblastos e células inflamatórias
mononucleares próximo ao cemento íntegro, no terço médio. OPG exibiu fraca
imunomarcação na maior parte do espécime e moderada em células
inflamatórias próximo ao dente (Figura 9 - A, B e C).
G2 (60 minutos – 7 dias)
RANK exibiu ausência de imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva em toda a extensão do espécime, apresentando área de
neoformação óssea. Enquanto RANKL exibiu fraca imunomarcação na maior
parte do espécime e moderada em área de neoformação óssea no terço
médio/apical. OPG exibiu ausente imunomarcação ou imunomarcação
inexpressiva em toda extensão do espécime (Figura 10 - A, B e C).
50
Figura 6 Expressão imuno-histoquímica, em G2 – 1 dia, das proteínas RANK - Ausência de
imunomarcação no ligamento periodontal que exibe necrose e pouca celularidade (A), RANKL -
Imunomarcação moderada e reação inflamatória no ligamento periodontal (B) e OPG -
Imunomarcação ausente no ligamento periodontal, que apresenta fibrose (C).
B
C
A
51
Figura 7 Expressão imuno-histoquímica, em G2 – 3 dias, das proteínas RANK - Imunomarcação
inexpressiva e reação inflamatória próxima ao cemento (A), RANKL - Imunomarcação fraca em
fibroblastos e células inflamatórias mononucleares próximo ao cemento íntegro. Terço Médio (B)
e OPG - Imunomarcação discreta em células inflamatórias próximo ao dente (C).
A
B
C
52
Figura 8 Expressão imuno-histoquímica, em G2 – 7 dias, das proteínas RANK - Ausência de
imunomarcação em área de neoformação óssea (A), RANKL - Imunomarcação em área de
neoformação óssea. Terço Médio/Apical (B) e OPG - Imunomarcação ausente nas células do LP
(C).
A
B
C
53
5.2 Análise Estatística
Os eventos celulares que ocorrem nos dentes reimplantados são
complexos e distintos, por isso, optou-se por descrição sucinta dos resultados
por terços dos dentes: Cervical (C); Médio (M) e Apical (A).
O tempo extra-avelolar influenciou na imunoexpressão de RANKL e OPG,
contudo, não foram encontradas diferenças significativas na imunoexpressão de
RANK. A maior expressividade de RANKL foi no G1 (5 min. extra-alveolar), nos
terços cervical e médio, nos períodos iniciais – 1 e 3 dias – (p= 0,0496 e p=
0,0445, respectivamente), no terço apical sua maior expressividade foi no G1,
no período mais tardio (p= 0,0473). As maiores expressões de OPG também
foram no G1, no terço médio e apical, nos subgrupos de 3 e 7 dias (p= 0,0295 e
p= 0,0059, respectivamente). No terço cervical, OPG apresentou maior atividade
no período de 3 dias, no terço cervical (p= 0,0180).
RANK foi expresso predominantemente no período de 3 dias do G2,
sendo que sua expressão foi observada em células inflamatórias do tipo
polimorfonucleares (Figura 9 e Figura 11B). RANKL foi expresso em células
endoteliais e em osteoclastos (Figura 7).
A relação da imunoexpressão de RANKL e OPG foi analisada de acordo
com os subgrupos (1, 3 e 7 dias) para cada período experimental (5 e 60 min
extra-alveolar). Foi observado que no terço cervical tanto no G1 como no G2,
houve diminuição da atividade de RANKL no decorrer dos períodos
experimentais. Enquanto a imunoexpressão de OPG apresentou-se como uma
parábola, indicando maior atividade dessa proteína no período de 3 dias (p=
0,0151).
No terço médio, em 1 dia, a expressão de OPG é considerada
inexpressiva, e há aumento em 3 e 7 dias (p= 0,0295) no G1. Enquanto no G2,
níveis progressivos de RANKL foram observados, em contrapartida decréscimos
na imunoexpressão de OPG. A expressão de ambos biomarcadores, no terço
apical diminui drasticamente no G2, enquanto no G1, mantém-se estável nos
subgrupos (p= 0,0059).
54
Figura 9 – Expressão de RANK, RANKL e OPG em G1 e G2 quanto a influência do tempo extra-
alveolar. Terços radiculares: A – Cervical, B – Médio, C – Apical.
55
Figura 10 – Expressão comparativa de RANKL e OPG nos subgrupos de acordo com o tempo
extra-alveolar no terço cervical.
56
Figura 11 – Expressão comparativa de RANKL e OPG nos subgrupos de acordo com o tempo
extra-alveolar no terço médio.
57
Figura 12 – Expressão comparativa de RANKL e OPG nos subgrupos de acordo com o tempo
extra-alveolar no terço apical.
58
6 DISCUSSÃO
As reabsorções dentárias ocorrem com grande frequência e tem relevante
importância na prática clínica, por constituir-se em causa comum de perda
dentária decorrente de traumatismos, em especial, quando se trata das
reabsorções radiculares (CONSOLARO, 2012). Uma variedade de sinais é
lançada quando ocorre uma injúria nos tecidos orais, levando a respostas como
proliferação, migração e diferenciação das populações celulares próximas à área
atingida. Compreender as circunstâncias que levam ao reparo desses tecidos
tem sido um dos maiores desafios na pesquisa dental (ANDREASEN;
ANDREASEN; ANDERSSON, 2007), sobretudo com relação ao fenômeno
biológico que envolve o reimplante dental. Este estudo pode representar uma
contribuição importante para o planejamento e tratamento clínico das
reabsorções ósseas e dentárias.
Faz-se necessário entender como os eventos celulares observados,
histologicamente, ocorrem, mesmo antes das evidências clínicas ou
radiográficas, para o planejamento do tratamento adequado (MANFRIN, 2007).
Na literatura existem pesquisas que analisaram a influência do meio de
estocagem, tratamento de superfície e endodôntico com relação as reabsorções
radiculares em dentes reimplantados (TROPE, 2002; CONSOLARO, 2011;
CONSOLARO et al., 2012), mesmo assim, ainda não se tem um prognóstico
favorável. Pesquisas foram realizadas com o intuito de elucidar o mecanismo
biomolecular das reabsorções radiculares com relação aos componentes do
sistema RANK/RANKL/OPG em dentes reimplantados de ratos tratados ou não,
tanto endodonticamente como sua superfície radicular (MANFRIN, 2007; SAITO
et al., 2011; MANFRIN et al., 2013; PANZARINI et al, 2013). Portanto, o presente
estudo objetivou analisar o mecanismo dos fenômenos de reabsorção em dentes
de ratos reimplantados sem tratamento local e sistêmico através da expressão
dos marcadores RANK/RANKL/OPG em diferentes períodos de tempo.
Um dos fatores determinantes no prognóstico do reimplante dentário é a
reabsorção dentária e óssea, bem como o tempo extra-alveolar, o meio de
estocagem e antibioticoterapia. Segundo os estudos de Panzarini et al. (2013),
59
Manfrin (2007) e Manfrin et al. (2013) que também avaliaram a expressão de
RANK, RANKL e OPG em dentes reimplantados de ratos utilizando meios de
estocagem, tratamento radicular e endodôntico e antibioticoterapia, esses
fatores podem ter influenciado nos resultados. No entanto, neste estudo
procurou-se avaliar a expressão desses marcadores sem influências de
tratamentos, esclarecendo o mecanismo de expressão de marcadores
relacionando-os com ocorrência de reabsorções dentária e óssea, considerando
que o tempo extra-alveolar de 5 minutos (G1) representa bom prognóstico,
enquanto o período de 60 minutos (G2) do dente avulsionado antes do
reimplante apresenta prognóstico desfavorável, sem interferências de
medicamentos, tratamento de superfície radicular e tratamento endodôntico.
Na extensão da raiz do dente as áreas anatômicas apresentam
características distintas. Os eventos celulares e biomoleculares que ocorrem nas
reabsorções dentárias podem apresentar-se de maneira diferente nos terços da
raiz. No terço cervical, as estruturas estão em contato com o meio bucal e seus
fluidos, além de apresentarem íntima relação com os tecidos periodontais de
revestimento: epitélio juncional, gengiva, inserção conjuntiva. No terço médio a
relação do ligamento periodontal com o osso alveolar e o cemento é evidente,
assim como, comunicações eventuais com a polpa dentária por meio dos canais
acessórios. O terço apical apresenta uma dinâmica celular mais diversa,
sobretudo, porque nessa área há união dos tecidos dentários com os tecidos
periodontais, assim, denominada de região periapical. Como observado os
eventos celulares que serão decisivos para o reparo e posterior reinserção do
ligamento periodontal pode assumir diferentes e inclusive independentes
respostas nos terços do dente, considerada a distinção biológico-estrutural
dessas áreas.
O receptor RANK funciona como mediador do processo de reabsorção
dentária e óssea, quando ativado (MORAES et al., 2011). Neste estudo foi
possível constatar imunoexpressão discreta de RANK na maioria dos
espécimes, corroborando, assim, com o relato de Panzarini et al. (2013). A
imunolocalização, quando expressa, era no citoplasma e membrana de células
inflamatórias, provavelmente percussoras de osteoclastos, sugerindo que a
presença de RANK tem influência na reabsorção ativa. Porém, o tempo extra-
alveolar não alterou a expressão desse receptor em nenhum terço, para nenhum
60
dos períodos experimentais. Ou seja, as células do ligamento periodontal de
dentes reimplantados expressarão o receptor ativador do fator nuclear kappa B
independente do tempo extra-alveolar. Esse intrigante fato auxiliou para
concentração no estudo da dinâmica de imunoexpressão de RANKL e OPG de
acordo com período extra-alveolar nesse estudo, uma vez que ambas as
proteínas poderiam elucidar os eventos celulares que culminam com o
prognóstico favorável ou não do reimplante.
Em nosso estudo a imunorreatividade de RANKL foi observada,
principalmente, em células inflamatórias da linhagem monocítica e fibroblastos.
O tempo extra-alveolar influenciou na imunoexpressão de RANKL que
apresentou-se elevada no período de 1 dia no terço cervical e médio em ambos
grupos, porém maior no G1. Sugere-se que, nessas áreas, devido o trauma da
avulsão associado a uma distensão e rompimento das fibras, há indução de uma
maior expressão de RANKL, como uma tentativa de induzir a proliferação celular
para reparo da área. No terço apical, a diferença surge apenas no subgrupo de
7 dias, sendo também maior no G1. Tal evento pode ser explicado pela
persistência do processo inflamatório nessa área, que gera um efeito de
retroalimentação na produção de RANKL, enquanto no G2, todos os marcadores
diminuem sua expressão, uma vez que os processos degenerativos e de necrose
predominam.
Quanto à imunoexpressão de OPG, o tempo extra-alveolar também
influenciou na mesma, sendo que, nos terços cervical e apical foram diferentes
no subgrupo de 3 dias, no cervical maior no G2 e apical maior no G1. Porém, no
período de 7 dias foi maior no G1. Essas diferenças são essenciais para o
entendimento da diminuição da reabsorção nos casos em que o dente esteve 5
minutos fora do alvéolo.
A osteoclastogênese é um processo de interações complexas entre
células, receptores e seus respectivos ligantes, citocinas e fatores de
crescimento, caracterizando-se por ser uma resposta tanto imunológica como
mediada por inflamação. Assim, há participação da população celular transitória
e permanente do tecido na formação, proliferação e ativação dos osteoclastos
(OTA et al., 2014). O RANKL participa claramente da odontoclastogênese e da
ativação da reabsorção radicular. A intensidade clástica parece ser regulada por
61
fatores locais e sistêmicos (estrógeno, paratormônio) mediados pelo sistema
RANK/RANKL/OPG (CONSOLARO et al. 2012).
É bem descrito que, o balanço de expressão entre RANKL e OPG é um
marcador importante da remodelação óssea (TANAKA et al., 2011). Quando
correlacionamos a imunoexpressão de RANKL e OPG, podemos observar as
diferenças nas tendências e consequentemente correlacionar com o grupo em
estudo. No terço cervical, RANKL decresceu entre 1 e 7 dias, em ambos os
grupos. Isso pode ser explicado com a ocorrência do trauma durante a avulsão,
a qual ocorre de maneira semelhante em ambos os grupos. OPG apresentou
uma parábola com pico de expressão em 3 dias, podendo-se inferir que, como
os maiores níveis de expressão de RANKL foram em 1 dia, em 3 dias é ativado
um mecanismo protetor pelas células e o equilíbrio desses eventos ocorre em 7
dias. Como os grupos apresentaram-se de maneira muito semelhante, pelo terço
cervical não foi possível diferenciar a relação das expressões de RANKL e OPG
com o prognóstico do reimplante.
No G1, nos períodos de 3 e 7 dias foi possível constatar fibroplasia,
infiltrado inflamatório discreto e alterações morfológicas nos fibroblastos, que se
tornaram mais fusiformes e maiores. Em contraparte, essas células exibiam forte
marcação de RANKL demonstrando que essa proteína está relacionada não
apenas ao processo de osteoclastogênese, mas encontra-se intimamente
associada ao processo de proliferação celular, uma vez que ativa o RANK. Esses
achados são contrários aos do estudo de Panzarini et al. (2013), onde OPG e
RANK apresentaram maior expressão que RANKL, provavelmente devido ao
uso do meio de estocagem e antibioticoterapia, os quais influenciaram na
expressão dos marcadores.
O terço médio apresentou-se como o mais significativo para diferenciação
do prognóstico do reimplante. RANKL mantém-se em níveis aproximados no G1,
variando discretamente (entre 1 e 7 dias), sustentando a hipótese de sua
necessidade no processo de reparo. Porém no G2, há uma progressão em sua
imunoexpressão, estando correlacionado com a reabsorção dentária progressiva
que ocorre ao longo do tempo em reimplantes tardios. Já OPG parece ser
decisivo, sobretudo nesse terço médio, para determinar o prognóstico, uma vez
que, no G1 sua expressão inicia (1 dia) leve, aumenta em 3 dias, estabilizando
aos 7 dias. Enquanto, no G2 há um aumento aos 3 dias e depois um decréscimo
62
considerável aos 7 dias, indicando que o mecanismo protetor exercido por essa
proteína é cessado. A interpretação desses comportamentos parece ser o
achado mais relevante desse estudo.
No terço apical, os eventos predominantes no G1, aos 7 dias, é a
persistência da resposta inflamatória que, por vezes, cronifica, induzindo
inclusive o fechamento do ápice do dente. No entanto, em G2 predominam os
processos de necrose do ligamento periodontal. Esses dados estão associados
com os nossos achados imunohistoquímicos, pois no G1 a imunoexpressão de
RANKL permanece estável (entre 1 e 7 dias), explicando assim, que a resposta
reparativa e inflamatória contribui para o sucesso do reimplante nesse grupo.
Enquanto no G2 a redução significativa do número de células positivas, tanto
para RANKL como para OPG em 7 dias indicam a falência da resposta
inflamatória nesses casos, que ocasiona predominância dos processos
degenerativos e de necrose.
Steinmetz et al. (2013) investigaram o papel das estatinas na proliferação
de células osteoprogenitoras em modelo experimental, com foco no metabolismo
ósseo. Concluíram que o RANK é expresso em células progenitoras, e a
estimulação com RANKL aumenta a proliferação celular in vitro e in vivo. Mesmo
com estimulação de RANKL a reabsorção não foi aumentada. Neste estudo, o
aumento da expressão de RANKL estimulou a fibroplasia que produzirá fibras
colágenas, auxiliando na reinserção das mesmas nos períodos iniciais,
sobretudo no G1 (dente extra-alveolar por 5min). Por outro lado, ativa a via de
reabsorção, causando efeito destrutivo nos tecidos duros do dente. Isso justifica
alguns dos nossos achados tais como: a presença da fibroplasia e da reabsorção
ativa, que são os eventos marcantes observados no G1 (dente extra-alveolar por
5min), enquanto o G2 (dente extra-alveolar por 60min) se caracterizou por área
de necrose pontual e reabsorção óssea e dentinária. Esses eventos estão
relacionados também com a menor expressão de RANK em todos os períodos
experimentais.
No G1, (dente extra-alveolar por 5min) no período de 7 dias, a presença
do infiltrado inflamatório crônico e intensa fibroplasia configura a reabsorção
reparada observada nesse intervalo de tempo. Em contrapartida, o aumento da
extensão da área de necrose e a presença de reabsorções ativa e reparada
podem envolver todos os terços, sendo que o infiltrado predominantemente
63
neutrofílico é mais intenso na região apical dos incisivos dos ratos, pelo fato da
presença da rizogênese incompleta, em ambos os grupos, o que nos permite
comparar este modelo experimental utilizado nesta pesquisa com dentes
humanos. A maioria dos jovens quando sofrem um trauma dental, no caso da
avulsão dentária, deve-se a resiliência do LP e estes apresentam também
rizogênese incompleta (TROPE, 2002; ANDREASEN; ANDREASEN, 2007;
RODRIGUES et al., 2010; CONSOLARO et al., 2012).
Níveis elevados da expressão de RANKL estão relacionados com maior
intensidade do processo inflamatório, como observado no G2, o que justifica a
maior ocorrência de reabsorções radiculares e ósseas nos períodos
experimentais tardios desse grupo. Esses achados sugerem que RANKL mesmo
estando mais expressa no G1, não foi determinante para desencadear
reabsorções acima citadas. Diferente do que foi encontrado por Manfrin (2007),
em que houve predominância de RANK e OPG no período de 3 dias, podendo o
meio usado para estocagem do dente ter influenciado nessa resposta.
Foi determinado que células endoteliais em modelo experimental in vitro
expressam RANKL induzindo a migração de PMN. Esses PMN contêm grânulos
e vesículas de RANK em seu citoplasma, e quando ativados ou estimulados o
RANK é translocado para a membrana, demonstrando assim que os neutrófilos
podem mediar o processo de formação e ativação de osteoclastos (RIEGEL et
al., 2012). Este achado relevante corroborou o nosso resultado, em que PMN
apresentou alta reatividade para RANKL, principalmente nos períodos iniciais de
ambos os grupos.
Os PMN parecem desempenhar papel importante na osteoclastogênese,
por meio da liberação de lisozimas e citocinas pró-inflamatórias, como por
exemplo, a interleucina-17 (FUTOSI; FODOR; MÓCSAI, 2013; MILANOVA;
IVANOVSKA; DIMITROVA, 2014). Neste estudo, foi possível verificar que, no
terço apical, local de maior infiltrado inflamatório agudo e áreas de necrose, os
neutrófilos expressavam fortemente RANK e RANKL, sustentando que a
hipótese anteriormente apresentada também pode ser aplicada no processo de
reabsorção de dentes reimplantados.
Ficou claro que a dinâmica da expressão dos biomarcadores
RANK/RANKL/OPG participa dos eventos celulares no reimplante dental,
estando associadas não apenas a formação de osteoclastos, mas à proliferação
64
celular. Isso implica que, as terapias propostas com inibição de RANKL podem
não ser totalmente eficazes, provavelmente por inibirem tanto a reabsorção
óssea quanto a proliferação celular.
Nos períodos de 7 dias, para G1 e G2, respectivamente, a expressão de
OPG foi moderada e fraca. Esse padrão pode ser explicado como determinante
de prognóstico do reimplante. Sabe-se no reimplante imediato (5min extra-
alveolar - G1), o prognóstico é bom, e no mediato (60min extra-alveolar - G2) o
prognóstico é duvidoso. Pode-se inferir que, provavelmente a tendência de
imunomarcação de OPG no reimplante imediato é aumentar em períodos
experimentais mais tardios, enquanto no reimplante mediato tende a diminuir de
acordo com o estudo de Manfrin et al. (2013), onde observou-se até 60 dias.
A expressão elevada do RANKL em todos os grupos e períodos
analisados sugere a sua participação em todos as fases do processo de
reabsorção de dentes reimplantados. Sugerindo também uma relação com a
reabsorção reparada, tanto no osso como no cemento, sendo maior no osso.
Outras investigações dessa natureza precisam ser realizadas, incluindo
períodos tardios de reimplante dentário, a fim de contribuir para a elucidação do
processo de reparo através de achados imuno-histoquímicos.
7 CONCLUSÃO
65
Diante dos achados deste estudo é possível concluir que:
O sistema RANK/RANKL/OPG participa ativamente, tanto do processo de
reparo de dentes de ratos reimplantados, quanto das reabsorções
dentárias e ósseas.
O tempo extra-alveolar de 60 minutos antes do reimplante ocasionou
menores expressões de RANKL e OPG, não influenciando na expressão
de RANK.
RANKL apresentou maior imunomarcação em ambos os grupos, quando
comparado aos outros biomarcadores, participando em todas as fases da
reabsorção óssea e dentária;
RANKL esteve associado tanto ao processo de osteoclastogênese, como
de proliferação celular, sendo expresso em ambos os grupos.
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ANEXOS
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Anexo 1
