CONTAGEM ESPECIFICA DE CLULAS DO LIQUIDO CFALO RAQUIDEANO EM CMARA USANDO COLORAO SUPRAVITAL

SYDNEY F. DE MORAES-RG0 * ANA LUCILA RODRIGUES ** KTIA G. DE MORAES-RGO **

RESUMO Oa autores adaptaram ao estudo da citologia do LCR o liqido diluidor de Anguiano e Ancira, proposto para realizao do hemograma em cmara de contagem. O procedimento tcnico varia conforme o aspecto do LCR e de acordo com o nmero global de clulas. A morfologia das clulas tcnica de colorao supravital (TCSV) descrita pormenorizadamente. Utilizando a tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes os autores determi-naram os desvios padres para cada tipo de clulas e tabularam o percentual de clulas determinado na lmina corada em cada caso. Demonstraram que os valores obtidos pela TCSV caram dentro dos limites de tolerncia calculados sendo, portanto, os valores das contagens equivalentes aos encontrados nas contagens feitas em lminas, tomadas,) estas, como padro. Com a experincia adquirida durante 5 anos de utilizao da TCSV, os autores a recomendam como tcnica de eleio para a contagem diferencial da clula do LCR.

Specific count of cerebrospinal fluid cells in counting-chamber using supravital staining.

SUMMARY The authors adapted to the cerebrospinal fluid (CSF) the staining technic developed by Anguiano and Ancira to perform differential leucocyte counts in the counting chamber. The formula they used is the following: methyl alcohol 1 ml, destilled water 2 ml. To this mixture are added: 6 drops of Leishman stain filtered in Whatman paper number 42; toluidine blue 0.25% aqueous solution (filtered in the same manner), 1 drop; acetate buffer 0.1 M, pH 5.4, 1 drop. The technic varies according to the intensity of pleocytosis. If the CSF is turbid or contains more than 100 cells per c.m. 1 drop is dripped in the botton of a 10X75 test tube and then 2 drops of the staining fluid are added; the mixture is then snaked; after one or two minutes 1 drop is placed in the Fuchs -Rosenthal counting chamber. If the number of total cells is less than 100 per c.m. (Table 1), different CSF volumes are centrifuged at the rate of 2000r.p.m., during 6 minutes; the supernatant fluid is poured off and the sedimented cells are suspended in 2 drops of the staining fluid. The morphology of the cells as they appear after they are stained by the supravital staining technic (SVST) is described and illustrated in photomicrographies. By using the technic described by Moraes-Rgo and Fernandes the authors enumerated the first 200 cells encountered in each of 10 smears of the same samples of CSF containing 250 cells per c.m., and calculated the standard desviation (SD) for each (Table 2). In another experiment they counted 200 cells in 10 samples of CSF with different levels of pleocytosis, by both technics. By applying the SD to the cell counts in stained smears they determined the accetable superior and inferior limits for each count (Table 3). There one verifies that the corresponding counting by SVST fell between the maximum and minimum accetable values. With the experience acquired in 5 years of intensive countings by the SVST the authors consider this technic the most adequate for differential counts of leucocytes in the CSF.

Sidney F. de Moraes-Rgo Patologia Clinica e Hematologia: * Mdico; ** Farma cutica-Bioquimica, Seco de LCR: *** Mdica Residente (Faculdade Federal de Biomedicina, Uberlndia MG).

Dr. Sydney F. de Moraes-Rgo Rua Amrico Brasiliense 284, 3 andar - 14/100 Ribeiro Preto SP Brasil.

A contagem global de clulas do liquido cfalo raquideano (LCR) no apresenta maiores dificuldades tcnicas, podendo ser feita em amostras da ordem de 20 micro-litros. J a contagem especfica, realizada sobre sedimento corado, esbarra com limi-taes s vezes intransponveis. Tais limitaes referem-se a pequenos volumes da amostra disponvel e a pteocitoses de pequena monta. As dificuldades tcnicas atingem seu grau mximo quando estas duas condies se associam. Considerando-se que a centrifugao, especialmente se realizada mais de uma vez no mesmo material, e a transferncia das clulas sedimentadas para a lmina de colorao so procedimentos traumatizantes, que levam destruio de grande nmero delas, seria altamente dese-jvel que se pudesse utilizar uma tcnica de colorao a fresco, que permitisse o reconhecimento dos vrios tipos de clulas do LCR em preparaes midas, sem prvia centrifugao. Nos casos de amostras com discreto aumento de clulas, no sendo possvel a colorao direta, uma nica centrifugao seria desejvel. Em nosso labo-ratrio, usando o lquido diluidor proposto por Anguiano e Ancira * para a realizao do hemograma em cmara de cpntagem e fazendo adaptaes especficas pafa o estudo da citologia do LCR, Conseguimos testar aquela hiptese de trabalho, tornando-a exeqvel na prtica. Nossa experincia com a tcnica de colorao supravital (TCSV) na contagem diferencial das ciulas do LCR vem-se acumulando por mais de 5 anos, com excelentes resultados.

No presente estudo descrevemos os diferentes passos dessa tcnica, desde a preparao dos reagentes at s adaptaes feitas, de acordo com a intensidade da pleocitose do LCR e referimos os parmetros estatsticos que forneceram o grau de confiabilidade exigido para que a adotssemos na rotina de nosso laboratrio.

MATERIAL E MTODOS. RESULTADOS A. Reagentes 1. Liqido diluidor de A/A (corante) lcool metlico p.a. lml, gua

destilada 2ml; a esta mistura juntar 6 gotas da soluo stoek do corante de Leishman previamente filtrado em papel Whatman 42; acrescentar 2 gotas da soluo aauosa de azul de toluidina a 0,25%, tambm filtrada; misturar; juntar 1 gota do tampo de acetato 0,1M, pH 5,4-5,5; conservar temperatura ambiente. 2. Tampo de acetato cido actico glacial 0,8ml, acetato de sdio 7,06g; dissolver em gua destilada o acetato; juntar o cido actico; acertar o pH a 5,4-5,5, potenciometricamente; completar 1000ml com gua destilada; conservar em geladeira.

B. Tcnica de colorao supravital O procedimento varia, conforme o aspecto do LCR: 1. LCR turvo pingar 1 gota no fundo de tubo de hemlise (10X75) e acrescentar 2 gotas do corante A/A; agitar; preencher um dos lados da cmara de Fuchs-Rosenthal; esperar 1 a 2 minutos; identificar e contar as clulas. Nos casos de LCR turvo a mesma preparao serve para a contagem global e especfica; o resultado da contagem global ser multiplicado por 3, para corrigir a diluio inicial (1:3). 2. LCR lmpido procede-se inicialmente contagem global de suas clulas carregando-se a cmara com LCR puro; a orientao ser diferente conforme a contagem global se apresente superior ou inferior a 100 elulas/mm3, assim: (a) contagem global superior a 100 clulas/mm3 proceder como no caso de LCR turvo; (b) contagem global inferior a 100 clulas/mm3 Centrifugar volu-mes variveis de LCR (Tabela 1) em tubo de hemlise, a cerca de 2000 r.p.m. por 6 minutos; decantar o sobrenadante para outro tubo e pingar 2 gotas do corante no tubo com o sedimento; agitar para ressuspender as clulas; encher a cmara e contar aps 1-2 minutos. 3. LCR acidentalmente hemorrgico se o LCR apresentar leve hemorragia como por acidente de puno e leuccitos abaixo de 100/mm3, havendo portanto necessidade de centrifugao, proceder do seguinte modo: (a) aps a contagem direta em cmara, centrifugar volume de LCR indicado na tabela 1, correlacionado ao nmero de leuccitos/mm3; decantar o sobrenadante e pingar 2 gotas do corante sobre o sedimento; aguardar cerca de 1-2 minutos, aps agitao; (b) pingar 1 gota do liqido de Trk, usado para contar leuccitos, no mesmo tubo; agitar e preencher a cmara de contagem; as hemcias desaparecem e os leuccitos so facilmente identificveis.

C. Tcnica para a obteno de esfregaos das clulas do LCR Usamos em nosso laboratrio a tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes 5, cujo princpio se baseia na obteno de esfregaos suficientemente finos, que secam quase instantaneamente sobre lminas, a fin? de que a estrutura celular seja conservada.

D. Morfologia das clulas do LCR em preparaes coradas a fresco Na descrio que se faz a seguir so referidos os aspectos discrlminativos de cada tipo celular obtidos com microscpio Zeiss, usando-se 250 aumentos (ocular 10X, objetiva 25X Plan) e cmara

de Fuchs-Rosenthal, montada com lamnula fina. As observaes foram feitas entre 1 e 5 minutos aps a colorao. Ressalte-se que todos os aspectos morfolgicos tendem a se acentuar com o decorrer do tempo.

a. Neutrfilos Apresentam-se como pequenas formaes arredondadas, outras vezes gros-seiramente retangulares, de ngulos rombos, com citoplasma apresentando granulaes finas que, no conjunto, conferem tonalidade ligeiramente verde-ma clula. O ncleo, em clulas bem conservadas, ntido, lobado ou no, de cor arroxeada. Em outras preparaes nota-se apenas o contorno dos lobos dos ncleos ou, ento, a clula lembra o aspecto de um cisto de ameba: pequenos crculos que se amoldam entre si. Esta imagem ocorre quando os lobos do ncleo se unem no centro da clula e so visualizados em viso frontal, como se vistos a partir da sua poro mais dilatada (vide clula do meio, na foto 1). Em processos inflamatrios de evoluo crnica os grnulos so raros, agrupados em pequena rea de um citoplasma hialino (Fotos 1, 2 e 3). b. Linfcitos So clulas menores que os neutrfilos, com halo hialino de citoplasma e ncleo que em geral o ocupa quase inteiramente, de aspecto vesiculoso, j que s a mem-brana nuclear vem demarcada. Observam-se freqentemente nuclolos. Podem apresentar tamanhos variveis, mas a relao ncleo-citoplasmtica sempre prxima de 1. (Fotos 1, 2, 3, 4 e 7). c. Moncitos So clulas maiores que os linfcitos e facilmente identificveis quando apresentam morfologia semelhante dos moncitos do sangue perifrico: clulas maiores que os neutrfilos, com citoplasma hialino ou fracamente azulado, com ncleo grande, reni-forme, lobado ou arredondado, em geral com nuclolo. O ncleo bem demarcado nos seus contornos mas, geralmente, tenuamente corado. Outras vezes estas clulas so de porte menor, muito semelhantes aos linfcitos. O critrio que adotamos para sua identifi-cao como moncito o halo citoulasmtico bem mais abundante que o do linfcito. Duas clulas podem ter ncleos praticamente iguais: identificamos como moncitos aquela que tiver citoplasma mais evidente que o da maioria dos linfcitos, que quase sempre um halo apenas (Fotos 6 a 7). d. Eosinfilos So facilmente identificveis; seu porte igual ou ligeiramente menor que o do neutrfilo. Apresentam incluses caractersticas, grosseiras, s vezes em forma de peauenos grnulos ou de bastonetes curtos, cor de fumo, castanho-amarelado claro, que tende a se tornar castanho-escuro e at preto com o passar do tempo, por intensificao da colorao. Neste estdio a clula assume aspecto caracterstico: ncleo claro, citoplasma hialino com uma rea justa-nuclear negra, contendo grnulos compactados (Foto 5). De-corridos cerca de 3 minutos de colorao, pode-se suspeitar de eosinofilia no LCR j em exame feito com a objetiva panormica: algumas clulas tm citoplasma mais escuro que as demais. A confirmao feita ao grande aumento (Fotos 4 e 5). e. Plasmcitos Clula de fcil identificao, pois guarda na colorao supravital as caractersticas do plasmcito sangneo. Apresenta-se como clula de vasto citoplasma, sem grnulos, que se tinge em azul claro ou mais escuro, conforme o tempo de colorao, com ncleo vesiculoso, freqentemente com barras de cromatina no seu interior. Nos casos de intensa plasmocitose do LCR, temos visto clulas arredondadas, do porte de moncitos, com ncleo vesiculoso, com nuclolos e halo citoplasmtico que se coram em azul claro, as quais temos identificado como imunoblastos (Fotos 3 e 8).

f. Basfilos Estas pequenas clulas so identificadas com surpreendente facilidade: tm o ncleo vesiculoso e, no citoplasma azulado, agrupam-se grnulos metacromticos azul-arro-xeados que tm tendncia a ocupar rea restrita do citoplasma (Foto 9). g. Macrfagos Apresentam-se como clulas volumosas, s vezes em sinete, outras vezes com vasto citoplasma contendo debris celulares, como ocorre na evoluo das hemorragias; outras vezes aparecem agrupadas. Tm nuclolos evidentes e confundem-se freqentemente com clulas neoplsicas.

h. Clulas neoplsicas Apresentam-se geralmente em grupos, mas podem ocorrer isoladas, como nas meningites carcinomatosas. Deve-se levantar a suspeita de neoplasia toda vez que se encontrarem no exame com colorao supravital clulas de grande porte, isoladas ou agrupadas, com nuclolos gigantes (Foto 10). O material deve ser examinado, ento, em esfregao corado, aps centrifugao 5 ou sedimentao em cmaras apropriadas, tipo Klmel 3, ou citocentrifuga (Foto 11).

E. Comparao entre a contagem especfica de clulas do LCR em esfregaos corados e em cmara (TCSV) O estudo comparativo entre a contagem especfica de clulas do LCR em esfregaos corados pelo Leishman e a TCSV precedeu a implantao desta na rotina de nosso laboratrio. A tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes antes referida foi usada como padro. Com efeito, sua confiabilidade fora demonstrada em experincias prvias, cujos

relatrios fazern parte de trabalho em andamento. O experimento consistiu em fazer a contagem de clulas sobre 10 preparaes em pente 7 de uma mesma amostra de LCR com pleocitose de 250 clulas/mm-^. Em cada preparao fez-se a contagem diferencial das primeiras 200 clulas encontradas. O conjunto das 10 contagens foi submetido a trata-mento estatstico, calculando-se a mdia e o desvio padro (SD) paia as contagens de cada tipo celular. Esses ndices constam da tabela 2 e serviram para avaliar a confiabilidade das contagens pela TCSV. Dez amostras de LCR com pleocitoses variadas foram contadas simultaneamente pelos dois mtodos: a fresco e em lminas coradas. As contagens efetuadas constam da tabela 3, onde vm indicados os limites de tolerncia para 2 SD. Esses limites foram calculados a partir do valor percentual encontrado na contagem de cada tipo de clula na lmina. Sobre este valor, considerado padro, foi aplicado o SD do tipo de clula respectivo (Tabela 2). Desse modo pode-se verificar facilmente se o valor encontrado para TCSV caiu dentro dos limites aceitveis ou no.

F. Tcnica de preparao de LCR artificialmente meningtico Nas sesses de de-monstrao da TCSV temos preparado amostras de LCR com pleocitose acentuada, que mimetiza a pleocitose das meningites, do seguinte modo: em tubo> de hematcrito de Wintrobe centrifuga-se amostra le sangue cuia contagem global de leuccitos no seja menor que SOOO/mntf; despreza-se o plasma sobrenadante e recolhe-se cem agulha longa, montada em seringa, o creme leucocitrio; pinga-se 1 gota deste material em l-2ml de LCR lmpido. Aps homogeneizao obtm-se amostra turva, como ocorre com o LCR em meningites. Este material, uma vez tratado pela TCSV, permite treinamento de tcnicos no reconheci-mento das clulas inflamatrias do LCR; alia vantagem da disponibilidade imediata de abundante material aauela de no oferecer risco de contaminao, ao ser manuseado.

G. Documentao fotomicrogrfica A documentao fotomicogrfica apresentada foi feita com o aparelho de microfotografia da Zeiss, acoplado ao microscpio. Usou-se ocular 12.5X e objetiva da imerso 63X Planapo. Para as preparaes midas usou-se cmara de contagem de Neubauer improved e lamnula fina. As microfotograias que documentam os neutrfilos (Foto 1) e os eosinfilos (Foto 5) foram tiradas com filme branco e preto; as demais so cpias de diapositivos coloridos.

COMENTRIOS A condio de ser o LCR suspenso com baixa concentrao de clulas nuclea-

das permite obterem-se preparaes isentas de detritos em cmara ao contrrio do sangue, que apresenta contingente de elementos slidos de at 50% do volume a ser tratado. O lquido diluidor deve ter atividade hemoltica nas diluies empregadas para a feitura do hemograma em cmara, a fim de que as hemcias no interfiram na visualizao das clulas coradas. Resultam preparaes sujas que no se com-param s preparaes limpas obtidas com o LCR na diluio de 1:3, aqui preco-nizada. Em observaes piloto, nas fases de adaptao que antecederam implantao da TCSV, ao estudarmos o comportamento das clulas do LCR frente ao corante de A/A, verificamos que nas baixas diluies empregadas (1:2 e 1:3) a hemlise, em casos com hemorragia, era em mdia de 60%. Este fato tem importncia prtica nos casos de hemorragias menngeas, quando h interesse em estudar-se a reao inflamatria ou, mesmo, uma meningite associada.

A relao entre a contagem global de clulas e o volume mnimo de LCR a ser centrifugado consta da tabela 1. Os volumes indicados como mnimos foram os que a experincia demonstrou serem os mais adequados. No houve preocupao de se fazer tabela relacionando cada caso estudado, porque houve grande variao entre o nmero de clulas contadas em todo o retculo da cmara quando se variava o volume de LCR centrifugado. Os volumes indicados prevem perdas celulares mximas de 35% no processo de manipulao. A previso terica das contagens obtidas mate-maticamente no correspondeu, na maior parte dos casos, ao valor obtido na prtica. Nestes estudos comparativos contvamos as clulas que caam apenas dentro do ret-culo. Na prtica, evidente que a contagem especfica feita dentro e fora do retculo. A morfologia das clulas normais e inflamatrias do LCR coradas pela TCSV de aprendizado rpido para quem est habituado ao estudo das clulas do sangue. A segurana em reconhecer as clulas com exatido deve ser baseada em estudos comparativos com esfregaos corados, como feito neste estudo. Clulas neoplsicas, especialmente em grupos, podem ser reconhecidas facilmente. Serve de exemplo o caso documentado nas fotos 9 e 10 de material de um mesmo paciente, corado suces-sivamente pela TCSV e pelo Leishman, aps sedimentao na cmara de Klmel 3.

Deve-se enfatizar que o encontro de clulas volumosas, isoladas ou em grupos, levanta a suspeita de clulas neoplsicas, obrigando o pesquisador a proceder a tcnicas espe-cificamente recomendadas para essa finalidade. Embora autores americanos 4,6 reco-mendem tcnicas semelhantes TCSV para pesquisa de clulas neoplsicas, nossa experincia ainda pequena com a aplicao da tcnica presente nesse campo.

A anlise do tabela 3 mostra claramente que, nos 10 casos estudados, as con-tagens feitas com aTCSV estiveram dentro dos limites de tolerncia estipulados, levan-do-se em conta os desvios padres encontrados para cada tipo de clula, contadas em lmina corada. Estes ndices, alis, so muito prximos daqueles encontrados por acie2 em esfregaos de sangue. Este fato se explica pela semelhana existente entre a tcnica do pente e aquela adotada para sangue pelo autor referido. No caso do LCR a distribuio de clulas certamente mais homognea, feitura do esfregao, por se tratar de suspenso concentrada de leuccitos, sem a interferncia das hemtias.

A TCSV descrita apresenta uma srie de vantagens sobre outras tcnicas usadas em laboratrios de patologia clnica, principalmente aquelas fastidiosas de dupla cen-trifugao, com suspenso em soro. Tais processos, alm de trabalhosos, condicionam a perda de grande nmero de clulas. A grande vantagem da tcnica aqui descrita permitir que se utilizem pequenos volumes: as clulas so perfeitamente identificveis em uma gota diluda de LCR, se houver pleocitose acima de 100 clulas/mm3 ou, no mximo, aps uma nica centrifugao, sem manuseio agressivo delas. A experincia adquirida em 5 anos de intensa utilizao da TCSV, examinando nmero considervel de amostras de LCR, particularmente em situaes de emergncia, com finalidade diagnostica e no controle evolutivo das meningites, autoriza-nos a recomend-la como tcnica de eleio para a contagem diferencial das clulas do LCR. A simplicidade de sua execuo, exigncia de um mnimo de material, necessidade de apenas alguns minutos para liberar resultados confiveis, so aspectos que, no conjunto, lhe conferem a condio de ser a tcnica que melhor se presta, no momento, para a contagem diferencial das clulas do LCR.

REFERNCIAS 1. Anguiano G, Ancira GV Direct simultaneous total and differential leucocyte counts

in the counting chamber. Acta Haemat 13:124, 1955.

2. Dacie JV Practical Haematology. Ed 2. Churchill, London, 1956.

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6. Naylor B The cytologic diagnosis of cerebrospinal fluid. Cancer 8:141, 1964.

7. Spriggs AI, Boddington MM The Cytology of Effusions in the Pleural, Pericardial and Peritonial Cavities and of Cerebrospinal Fluid. Ed 2. Heinemann, London, 1968.