Controle Químico na Fermentação

8/19/2019 Controle Químico na Fermentação

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MANUAL DE MÉTODOS

ANALÍTICOS

CONTROLE QUÍMICO

DA FERMENTAÇÃO

CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA

LABORATÓRIO DE ANÁLISES

2011 (02)


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SUMÁRIO

1 Terminologia

2 Métodos Analíticos

3 Preparação de Reagentes

Tabelas


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MANUAL CONTROLE QUíMICO DA FERMENTAÇÃO

CTC - Centro de Tecnologia CanavieiraFazenda Santo Antonio s/nº - Bairro Santo AntonioCaixa Postal 162 - 13400-970 - Piracicaba SPFone ++ 19 3429-8164 e Fax ++ 19 3429-8100

Fermentação2011 (02)

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1 Terminologia

1.1 Acidez sulfúricaQuantidade de ácidos totais presentes no vinho, mosto ou pé-de-cuba expressos em g/l deácido sulfúrico.

1.2 Açúcares fermentescíveis

Denominação dos açúcares que podem ser transformados em álcool pela fermentação.

1.3 Açúcares redutores

Substâncias redutoras da cana-de-açúcar e seus produtos, constituídas principalmente por

glucose e frutose, que tem a propriedade de reduzir o íon cúprico para óxido cuproso do licorde Fehling e expressos como açúcar invertido.

1.4 Açúcares redutores residuais

Substâncias redutoras presentes no vinho que podem não ser aproveitadas pelo processo defermentação, as quais recebem a denominação de não fermentescíveis.

1.5 Açúcares redutores residuais totais

Substâncias redutoras totais presentes no vinho que podem não ser aproveitadas pelo processode fermentação, as quais recebem a denominação de não fermentescíveis.

1.6 Brix

Porcentagem em massa de sólidos solúveis contida em uma solução de sacarosequimicamente pura.

1.6.1 Brix areométrico

Unidade da escala de um areômetro que por densidade expressa a porcentagem em massa dossólidos dissolvidos em uma solução açucarada a 20°C.

1.6.2 Brix refratométrico

Unidade da escala de um refratômetro que através do índice de refração da luz, expressa aporcentagem em massa dos sólidos dissolvidos em uma solução açucarada a 20°C.

1.7 Dióxido de enxofre

Produto da queima do enxofre na fabricação do açúcar, que quando dissolvido no caldo, mel,mosto ou vinho encontra-se na forma de ânions (bissulfito, sulfito) ou gás (SO2).

1.8 Glicerol

Glicerol é um triálcool, produto resultante da atividade das leveduras.


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1.9 Grau Gay-Lussac (°GL)

Porcentagem em volume de álcool presente numa mistura hidroalcoólica.

1.10 Infermentescíveis

Substâncias redutoras que não são transformadas em álcool através do processo fermentativo.

1.11 Mel final

Mel retirado da massa cozida final e do qual não se retira mais açúcar economicamente.

1.12 Mosto

Líquido açucarado capaz de sofrer fermentação.

1.13 Pé-de-cuba

Suspensão de leveduras suficientemente concentrada para garantir a fermentação de um dadovolume de mosto.

1.14 Vinho

Líquido obtido após fermentação do mosto e separação de levedura.

1.15 Sólidos insolúveis

Porcentagem em peso de sólidos não dissolvidos em uma solução e que podem ser removíveispor processos químicos ou físicos.

1.16 Massa seca total

Material remanescente após secagem do produto examinado até peso constante sob condiçõestais que não hajam alterações químicas, expresso em porcentagem.

1.17 Massa seca levedura

Porcentagem em peso de levedura contida na amostra após separação dos sólidos insolúveis.

1.18 Teor de levedura

Porcentagem em volume de sólidos decantáveis após centrifugação da amostra a 3.000rpmsendo formado por leveduras mais insolúveis.

1.19 Teor alcoólico

Termo utilizado para designar a quantidade de álcool presente em uma mistura hidroalcoólica.


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2 Métodos Analíticos

2.1 Mosto

2.1.1 Brix refratométrico

Material

• Refratômetro ótico ou digital com aferição a 20°C;• Banho termostático (opcional);• Algodão;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Técnica

• Filtrar em algodão cerca de 100mL da amostra;• Limpar os prismas do refratômetro com água destilada e enxugar com papel absorvente;• Com auxílio do bastão plástico, colocar algumas gotas da amostra sobre o prisma; Não utilizarbastão de vidro e não tocar nos prismas do aparelho;• Aguardar alguns segundos para que a temperatura da amostra atinja a temperatura dosprismas;• Com a leitura do Brix, obtém-se diretamente o Brix%amostra.

Observação:Não utilizar bastão de vidro e não tocar nos prismas do aparelho;

2.1.2 pH

Material

• pHmetro;• Agitador magnético;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Soluções tampão pH 4 e 7.

Técnica

• Resfriar a amostra até temperatura ambiente;• Lavar o eletrodo com água destilada e imergir na amostra até cobrir o bulbo, tomando ocuidado de manter o nível da amostra abaixo do nível do eletrólito contido no eletrodo;• Fazer a leitura da temperatura e corrigir através do botão compensador de temperatura;

• Fazer a leitura do pH;• Limpar o eletrodo com água destilada.


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Observações:

• Manter sempre o bulbo do eletrodo em água destilada quando não em uso;• Recomenda-se guardar as soluções tampão de pH em geladeira.

2.1.3 Acidez sulfúrica

Material

• pHmetro;• Agitador magnético;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução de hidróxido de sódio 1mol/L (Padronizada).

Técnica

• Pipetar 50mL da amostra e transferir para béquer de 100mL;• Imergir o eletrodo na amostra até cobrir o bulbo tomando o cuidado de manter o nível daamostra abaixo do nível do eletrólito contido no eletrodo;• Titular com solução de hidróxido de sódio 1mol/L, gota a gota e sob agitação até pH 8,7;• Anotar o volume gasto (V).

Cálculo:

Acidez sulfúrica (g H2SO4 /l) = V * 0,98 * f

Onde:

V = Volume gasto (mL);f = fator da padronização do hidróxido de sódio 1 mol/L.

Exemplo:

• V = 1,0 mL• f = 0,9910• Acidez sulfúrica = 0,97 g H2SO4 /l


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2.1.4 Açúcares Redutores Totais (ART)

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Banho-maria termostatizado;• Bureta de Mohr, 50mL;• Termômetro de 0 a 100°C, div. 1°C;• Pérolas de vidro;• Tela de ferro galvanizado com centro de amianto, 200 x 200mm;• Tripé de ferro;• Bico de gás, tipo Mecker ou Redutec;

• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução de Fehling A;• Solução de Fehling B;• Solução de azul de metileno 1%;• Solução de ácido clorídrico 6,34 mol/L (24,85°Brix);• Solução de ácido clorídrico 0,5 mol/L;• Solução de hidróxido de sódio 20% (6 mol/L);

• Solução de hidróxido de sódio 1 mol/L;• Solução de EDTA 4%;• Solução de fenolftaleína 1%;• Solução de açúcar invertido 1%;• Solução de açúcar invertido 0,2%.

Técnica

• Pesar 50g ± 0,1 g do mosto, previamente filtrado em algodão e transferir quantitativamentepara balão volumétrico de 200mL;

• Completar o volume com água destilada e homogeneizar;• Pipetar 10mL para outro balão volumétrico de 200mL e adicionar água destilada suficientepara cobrir o bulbo do termômetro introduzido no balão e aquecer em banho-maria até atingir65°C;• Retirar do banho-maria e adicionar 10mL de ácido clorídrico 6,34 mol/L, ao mesmo tempoque se retira o termômetro;• Agitar o balão com movimentos rotatórios e deixar em repouso por 30min;• Neutralizar com solução de hidróxido de sódio 20%, utilizando como indicador 3 gotas defenolftaleína 1% até a coloração levemente rósea;• Adicionar 4 mL da solução de EDTA 4%, caso persista a coloração rósea, adicionar 1 ou 2gotas de HCl 0,5 mol/L suficiente para eliminar a cor rósea e retornar a incolor;• Resfriar, completar o volume com água destilada e homogeneizar;


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• Lavar a bureta com a solução invertida antes de enchê-la e acertar o zero;

Utilizando o Bico de Gás

• Transferir com auxilio de pipetasvolumétricas para erlenmeyer de250mL: 5mL da solução deFehling B e 5 mL da solução deFehling A;

• Colocar algumas pérolas de vidrono erlenmeyer;

• Adicionar da bureta 15 mL dasolução;

• Aquecer a mistura até atingir aebulição, o que deve serconseguido em 2 min. e 30 seg.

Utilizando o Redutec

• Transferir com auxílio de pipetasvolumétricas para o Redutec:5mL da solução de Fehling B e 5mL da solução de Fehling A;


• Aquecer a mistura até atingir aebulição.

• Se não ocorrer mudança de cor na solução indicando que o licor de Fehling não foi reduzido,continuar a adição da solução até que a cor original desapareça;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação até que a cor azuldesapareça tornando-se vermelho tijolo;• Anotar o volume gasto (V1) como valor aproximado da titulação;

• Repetir a titulação adicionando no erlenmeyer além do licor de Fehling, o volume da solução

consumida na titulação anterior menos 1mL (V1 - 1mL);• Aquecer a mistura até ebulição e então cronometrar exatamente 2min, mantendo o líquido emebulição constante;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação adicionando asolução da bureta gota a gota, até completa eliminação da cor azul;• O tempo total desde o início da ebulição até o final da titulação deve ser de 3min;• Anotar o volume gasto e corrigir com o fator do licor de Fehling anotando-o como V.

Observações:

• O volume gasto da solução necessário para completa titulação é inversamente proporcional aoteor de açúcares redutores presentes na mesma;• Não deixar escorrer a solução ou o indicador pela parede do erlenmeyer;• O licor de Fehling pode ser preparado em quantidade suficiente para realizar as análisesdiárias, misturando-se volumes iguais das soluções A e B;• Adicionar sempre a solução A sobre a solução B;• A diferença entre as duas titulações não deve ser maior que 0,2mL, caso contrário, repetir aanálise;• Não clarificar a amostra a ser analisada com subacetato de chumbo ou outro agenteclarificante, a fim de evitar a precipitação de açúcares redutores da solução.


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Cálculo:

Açúcares Redutores Totais (%) = 397,152 / Vg + 0,484

Onde:

Vg = Volume gasto corrigido (mL)

Exemplo:

• Volume gasto na titulação (mL) = 22,6• Fator do licor de Fehling = 1,0016

• Volume gasto corrigido (mL) = 22,64• Açúcares redutores totais (%) = 18,03

2.1.5 Sólidos insolúveis

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Balança analítica, legibilidade 0,1mg;• Bomba de vácuo;• Funil de Büchner desmontável diâm. 55mm;• Tela de inox, 80 x 80mm, abertura 0,037mm (ABNT 400).;• Kitassato, 500mL;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Técnica

• Pesar uma tela de inox (80 x 80mm) proveniente seca em estufa a 105°C por 30min e resfriarem dessecador (P1);

• Montar o sistema de filtração com o funil de Büchner e kitassato e encaixar a tela entre aspartes superior e inferior do funil;• Homogeneizar a amostra, pesar 200g ± 0,5 g em um béquer de 250mL e filtrar sob vácuo(PA);• Lavar o béquer 2 a 3 vezes com água destilada e transferir as porções de água para o funil defiltração;• Rinsar água sobre a tela para assegurar completa remoção de materiais solúveis;• Retirar a tela do funil contendo os insolúveis, transferir para estufa a 105°C e deixar por 2horas. Resfriar em dessecador e pesar (P2).


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Cálculo:

Sólidos insolúveis (%) = (P2 – P1) / PA * 100

Onde:P1 = Peso da tela seca e limpa (g)

P2 = Peso da tela + insolúveis (g)

PA = Peso da amostra (g)

Exemplo:

• Peso da tela (g) = 0,9838

• Peso da tela + insolúveis (g) = 1,2611• Peso da amostra (g) = 200,0• Sólidos insolúveis (%) = 0,14

2.1.6 Dióxido de Enxofre

O dióxido de enxofre ou sulfito é formado durante a queima do enxofre no processo defabricação de açúcar e quando dissolvido no caldo chega até os méis, mosto e vinho na forma deânions sulfito ou bissulfito ou gás (SO2).

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Espectrofotômetro;• Micro destilador Kjeldhal;• Cubeta, caminho ótico 10 mm;• Papel de filtro quantitativo, Whatman 41 ou equivalente;• Algodão;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução estoque de pararosanilina;• Solução de uso de pararosanilina;• Solução de formaldeído;• Solução de ácido sulfúrico 6 mol/L;• Solução padrão de sulfito 500 mg/l;• Solução de trietanolamina 1 e 10%.


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Curva padrão

Técnica

• Transferir para béquers de 50mL com auxílio de uma bureta 2, 4, 6, 8 e 10mL da soluçãopadrão de sulfito 500mg/l;• Acrescentar em cada béquer 10mL da amostra a ser analisada;• As soluções contidas nos béquers correspondem respectivamente a 10, 20, 30, 40 e 50mg/l desulfito, além da concentração de sulfito da amostra adicionada;• Destilar cada uma das soluções após adição de 10mL de solução de ácido sulfúrico 6M nosistema de dosagem do destilador;• Receber cada destilado em uma proveta graduada de 100mL ou equivalente contendo 25mL

da solução de trietanolamina 10%;• O aquecimento deve ser brando e considerar a destilação concluída quando o volume final foraproximadamente 80mL;• A seguir, transferir cada destilado para balão volumétrico de 100mL e completar o volumecom água destilada;• Em uma série de cinco tubos de ensaio colocar 10mL da solução de formaldeído, 2 mL dasolução de pararosanilina e homogeneizar;• Acrescentar 1mL de cada destilado no tubo de ensaio correspondente e homogeneizar;• Conduzir em paralelo uma prova em branco com 10mL da solução de formaldeído, 2mL dasolução de uso de pararosanilina e 1mL da solução de trietanolamina 1%;

• Deixar em repouso todas as soluções por 30 minutos para desenvolvimento da cor;• Ajustar o espectrofotômetro em 570nm e acertar o ponto zero da absorbância com a prova embranco utilizando cubeta de 10 mm;• Fazer as leituras de absorbância de cada solução (Xi) e anotar;

Obs: Para construir a curva padrão é necessário determinar também a absorbância da amostra.

Determinação

Técnica

• Filtrar a amostra em algodão;• Pipetar 10mL da amostra filtrada e transferir para o destilador e adicionar 10mL da solução deácido sulfúrico no sistema de dosagem do destilador;• Receber o destilado em uma proveta graduada contendo 25mL da solução de trietanolamina10%;• O aquecimento deve ser brando e considerar a destilação concluída quando o volume final foraproximadamente 80mL;• Transferir o destilado para balão volumétrico de 100mL e completar o volume com águadestilada;• Em um tubo de ensaio colocar 10mL da solução de formaldeído, 2mL da solução de

pararosanilina e homogeneizar;


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• Acrescentar 1mL do destilado da amostra e homogeneizar;• Deixar em repouso por 30 minutos para desenvolvimento da cor;• Efetuar a leitura da absorbância (y) usando a prova em branco como referência e anotar.

Exemplo de curva de padrão

Sejam as leituras de absorbância abaixo, encontradas para cada concentração padrão de SO2 eutilizadas para traçado da curva padrão.

AbsorbânciaVol. Sol.500mg/l

(mL)

Conc.SO2

(mg/l)Padrões

(Lp)Amostra

(La)x

2 10 0,214 0,063 0,1514 20 0,366 0,063 0,3066 30 0,512 0,063 0,4498 40 0,664 0,063 0,601

10 50 0,809 0,063 0,746

Lp = Leituras de absorbância relativaLa = Leitura absorbância da amostrax = Leituras de absorbância absoluta (Leitura relativa de cada padrão - leitura daamostra)

A partir dos valores relacionados, calcular os valores da inclinação (a), da intersecção (b) e dacorrelação (r), a partir da leitura de absorbância versus a concentração de Sulfito (mg SO 2 /l), nocaso tem-se:

a = 67,331b = -0,339r = 0,9999

Cálculo:

SO2 (mg/l) = (a * x + b) * f

Onde:

x = Leituras de absorbância absolutaf = fator de diluição da amostra (neste caso = 10)


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2.2 Vinho

2.2.1 Brix Areométrico

Material

• Areômetro, escala 0 a 10°Brix, div. 0,2° Brix;• Termômetro, escala 0 a 50°C, div. 0,5°C;• Proveta, 250mL.

Técnica

• Homogeneizar a amostra;.• Encher a proveta com a amostra e deixar em repouso por 5min;• Introduzir o termômetro;• Imergir cuidadosamente o areômetro até o ponto de afloramento evitando que a haste fiquemolhada acima deste ponto;• Aguardar 2min, fazer as leituras do Brix não corrigido e da temperatura;• Com auxílio da Tabela 1, corrigir para a temperatura padrão de 20°C e anotar como Brixcorrigido;

Exemplo:

• Leitura de Brix (%) = 2,2• Temperatura da amostra (°C) = 25,0• Fator de correção = 0,27• Brix corrigido a 20°C (%) = 2,5

2.2.2 Teor alcoólico (°GL)

2.2.2.1 Método por cromatografia gasosa

Materiais e Equipamentos

• Cromatógrafo gasoso equipado com detetor de ionização de chama;• Integrador-registrador eletrônico ou registrador potenciométrico;• Coluna com 20% de Carbowax 20M sobre Chromosorb WAW-DMCS 100/200 mesh em tubode aço de 1/8" diâmetro externo e 3m de comprimento;• Microseringa de 5 ou 10µl;• Acessórios cromatográficos;• Opcional: Microcomputador compatível com IBM-PC, carregado com linguagem Basic;• Programa em Basic para integrador eletrônico ou microcomputador.


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Vidrarias

• Vidraria comum de laboratório.

Reagentes

• Álcool etílico absoluto;• Álcool n-butílico ou n-propílico;• Água destilada ou deionizada.

Procedimento

Condições cromatográficas aproximadas

• Temperaturas

⇒ Injetor = 230°C⇒ Detetor = 250°C⇒ Coluna = 100°C

• Fluxos

⇒ Nitrogênio = 30mL/min⇒ Hidrogênio = 30mL/min⇒ Ar sintético ou comprimento e seco = 300mL/min

• Volume de injeção = 2µl

Calibração

• Preparar uma série de soluções-padrão de etanol em água nas seguintes concentrações(aproximadas) em % peso/peso: 2,4; 3,9; 6,0 e 8. Converter as unidades desses padrões para %volume/volume, através da tabela IUPAC anexa (Nota 1). A concentração desses padrões em %

v/v devem ser de aproximadamente: 3,0; 5,0; 8,0 e 10;• Preparar uma solução padrão interno de 5% v/v de n-butanol ou n-propanol em água;• Preparar uma mistura de cada solução-padrão de etanol e solução-padrão interno na proporçãode 1:1 (5mL:5mL);• Injetar 3 vezes cada mistura de solução padrão de etanol e solução padrão interno;• Se o integrador eletrônico em uso for equipado com "Basic" carregar o programa quecalculará e memorizará a curva de calibração, fornecendo os coeficientes da equação da reta;• Se estiver usando microcomputador carregá-lo com o programa, obter as áreas dos picos doetanol e do n-butanol ou n-propanol e digitá-las no micro junto com as concentrações do etanol.Este também realizará os cálculos, memorizará a curva e fornecerá os coeficientes da equação.


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Nota 1: A Standardization of Methods for Determination of the Alcohol Content of Beveragesand Destilled Potable Spirits. Applied Chemistry Division Fermentation Industries Section -

International Union of Pure and Applied Chemistry. Butterwarths - London, 274 - 311.

Execução da análise

Preparar uma mistura de amostra e solução-padrão interno na proporção de 1:1 (5mL de amostra:5mL sol. padrão interno) e injetar.Se estiver usando integrador com Basic, este realizará todos os cálculos e fornecerá o resultadofinal da análise.Se estiver usando micro, obter as áreas dos picos (etanol e padrão interno) e digitá-las, que estefornecerá o resultado da análise.

Confiabilidade

Coeficiente de variação = 0,5%

Exemplo de uma calibração e análise em micro

Determinação de etanol com curva de calibraçãoMétodo de padrão interno - Preparação em volume

Padrão Repetição Concentração Área do etanol Área do P.I.

1 1 2.9600 182600.00 456126.001 2 2.9600 183009.00 456471.001 3 2.9600 182761.00 455755.002 1 4.9900 297926.00 458477.002 2 4.9900 290953.00 447174.002 3 4.9900 268445.00 409814.003 1 7.9900 483493.00 461797.003 2 7.9900 454517.00 432544.00

3 3 7.9900 360980.00 348855.004 1 10.0600 601899.00 460419.004 2 10.0600 564230.00 431477.004 3 10.0600 600377.00 459088.00

A equação da reta é Y = AX + B

O coeficiente angular [A] E = 7.800318

O coeficiente linear [B] E = -0.138732

O coeficiente de regressão linear [R] E = 0.9999500


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Determinação de etanol com curva de calibração

Método de padrão interno - Preparação em volume

Amostra Área do etanol Área do P.I. Etanol (% v/v)

1 244582.00 374709.00 4.95

2 476811.00 374881.00 9.78

3 379134.00 369704.00 7.86

Exemplo de uma calibração e análise em integrador com Basic

Digite o numero de padrões - ? 4Digite o numero de repetições por padrão - ? 1Digite a concentração do etanol (%v/v) no padrão 1 - ? 2,959953Digite a concentração do etanol (%v/v) no padrão 2 - ? 4,993732Digite a concentração do etanol (%v/v) no padrão 3 - ? 7,987773Digite a concentração do etanol (%v/v) no padrão 4 - ? 10,05502

Padrão 1

RT Área Tipo Área %

1,12150107.00

HH 28.507

2,10376448.00

HH 71.493

Padrão 2


1,11244111.00

VV 39.496

2,09374946.00

BH 60.504


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Padrão 3


1,11379134.00

VV 50.630

2,10369704.00

BH 49.370

Padrão 4


1,12476811.00

HH 55.984

2,10374881.00

HH 44.016

Equação da reta : Y = a*x±bcoeficiente angular (a) = 8,11108

coeficiente linear (b) = -0,29177coeficiente de regressão linear (r) = 0,999954

Amostra


1,12244582.00

HH 39.494

2,10

3747

09.00 HH 60.504

Concentração de etanol (%v/v) = 5,00252


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2.2.2.2 Método do Densímetro Eletrônico

Material

• Densímetro digital eletrônico;• Microdestilador Kjeldahl;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Técnica

• Pipetar 25mL de vinho e transferir para o microdestilador;• Acoplar um balão volumétrico de 50mL para receber o destilado no final do condensador (o

ponteiro deve entrar 2 a 3cm no gargalo do balão volumétrico);• Destilar o vinho até quase completar o volume do balão volumétrico;• Retirar o balão volumétrico do final do condensador e completar o volume com águadestilada;• Agitar e expulsar pequenas bolhas de ar que se formam após a agitação;• Injetar com a seringa a amostra destilada no densímetro tomando o cuidado de lavar tanto aseringa quanto o tubo do densímetro três vezes com a solução a ser lida (se for adaptado um funilpara fluxo contínuo deve-se passar também a amostra destilada por 3 vezes);• Acender a luz interna e verificar se não ficou bolha no tubo de amostra;• Esperar 2 a 3 minutos para estabilização da temperatura;

• Anotar a leitura da densidade ou da massa especifica.Cálculo:

Caso o densímetro eletrônico utilizado, forneça apenas a densidade (20/20ºC)ou apenas a massaespecífica (20/4º), fazer a conversão da densidade lida, para concentração alcoólica da soluçãoem porcentagem (v/v) utilizando as Tabelas 3 ou 4. O resultado deve ser multiplicado por 2.

Exemplo:

• Densidade do destilado (20/20°C) = 0,9934

• Teor alcoólico do destilado (% v/v) (Tabela 3) = 4,57• Teor alcoólico na amostra (% v/v) = 9,14

2.2.3 Acidez sulfúrica

Material

• pHmetro;• Bomba a vácuo;• Agitador magnético;• Microbureta, 10mL, div. 0,05mL;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.


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Reagente

• Solução de hidróxido de sódio 1mol/L (padronizada)

Técnica

• Colocar aproximadamente 100mL de vinho no kitassato e submeter a vácuo de 25"Hg comagitação durante 5 minutos para eliminar o CO2;

• A seguir, pipetar 50mL da amostra e transferir para béquer de 100mL;• Imergir o eletrodo na amostra até cobrir o bulbo, tomando o cuidado de manter o nível daamostra abaixo do nível do eletrólito contido no eletrodo;• Titular com solução de hidróxido de sódio 1 mol/L, gota a gota e sob agitação até pH 8,7;

• Anotar o volume gasto (V).Cálculo:

Acidez sulfúrica (g H2SO4 /l) = V * 0,98 * f

Onde:

V = Volume gasto (mL);F = fator da padronização do hidróxido de sódio 1 mol/L

Exemplo:

• Volume gasto de NaOH 1 mol/L (mL) = 3,50• Fator do NaOH 1 mol/L = 0,9910• Acidez sulfúrica (g H2SO4 /l) = 3,40

2.2.4 pH

A determinação do pH de uma solução, identificada pela expressão pH = -log H+, permiteconhecer a concentração de íons hidrogênio presentes na solução. O pH varia com a temperatura,com a presença de substância dissolvidas e com a solução.

Os métodos eletrométricos substituem os métodos colorimétricos na determinação do pH e são

fundamentos no princípio da medida da força eletromotriz gerada pela presença de H+ em funçãoda temperatura, utilizando para esta determinação eletrodos adequados.

Material

• pHmetro;• Agitador magnético;• Béquer, 250mL;• Pisseta, 500mL;

• Termômetro, escala 0 a 50°C, div. 0,5°C;• Lenço de papel fino e absorvente.


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Reagente

• Soluções tampão pH 4 e 7.

Técnica

• Resfriar a amostra até temperatura ambiente;• Imergir o eletrodo na amostra até cobrir o bulbo, tomando o cuidado de manter o nível daamostra abaixo do nível do eletrólito contido no eletrodo;• Fazer a leitura da temperatura e corrigir através do botão compensador de temperatura;• Fazer a leitura do pH;• Limpar o eletrodo com água destilada.

Observações:

• Manter sempre o bulbo do eletrodo em água destilada quando não em uso;• Recomenda-se guardar as soluções tampão de pH em geladeira.

2.2.5 Açúcares Redutores Residuais (ARR)

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Bureta de Mohr, 50mL;• Pérolas de vidro;• Tela de ferro galvanizado com centro de amianto medindo 200 x 200 mm;• Tripé de ferro;• Haste longa de ferro com base e suporte para bureta;• Bico de gás tipo Mecker ou Redutec;• Cronômetro;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução de Fehling A;• Solução de Fehling B;• Solução indicadora de azul de metileno 1%;• Solução de Açúcar Invertido 1%;• Celite.


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Técnica

• Pesar 50g ± 0,5g do vinho previamente filtrado em algodão e transferir para balão volumétricode 200 mL;• Acrescentar 20 mL da solução de açúcar invertido 1% e 4mL de EDTA 4%, agitar, completaro volume com água destilada e homogeneizar;• Transferir para béquer de 250mL, adicionar de 8 a 10g de celite, agitar e filtrar em papel defiltro;• Com o filtrado encher a bureta até a marca;


• Transferir com auxilio de pipetasvolumétricas para erlenmeyer de250mL: 5mL da solução de FehlingB e 5 mL da solução de Fehling A;

• Colocar algumas pérolas de vidro noerlenmeyer;


• Aquecer a mistura até atingir aebulição, o que deve ser conseguidoem 2 min. e 30 seg.


• Transferir com auxílio de pipetasvolumétricas para o Redutec: 5mL dasolução de Fehling B e 5 mL dasolução de Fehling A;



• Se não ocorrer a mudança de cor na solução indicando que o licor de Fehling não foi reduzido,deve-se adicionar mais solução da bureta até que a cor original desapareça;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação até a mudança dacor azul para vermelho tijolo;• Anotar o volume gasto (V1) como um valor aproximado da “titulação a quente” (Vq);• Repetir a titulação adicionando no erlenmeyer além do licor de Fehling, o volume da soluçãoconsumido na titulação anterior menos 1mL (V1 - 1mL);• Aquecer a mistura até a ebulição e então cronometrar exatamente 2min, mantendo o líquidoem ebulição constante;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação adicionando asolução da bureta gota a gota, até completa eliminação da cor azul;• O tempo total desde o início da ebulição até o final da titulação deve ser de 3min;• Anotar o volume gasto e corrigi-lo com o fator do licor de Fehling anotando-o como V.

Observações

• O volume gasto da solução necessário para completa titulação é inversamente proporcional aoteor de açúcares redutores presentes na mesma;• Não deixar escorrer a solução ou o indicador pela parede do erlenmeyer;


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• O licor de Fehling pode ser preparado em quantidade suficiente para realizar as análisesdiárias, misturando-se volumes iguais das soluções A e B;

• Adicionar sempre a solução A sobre a solução B;• A diferença entre duas titulações não deve ser maior que 0,2mL, caso contrário, repetir aanálise.

Cálculo:

ARR (%) = (19,86 / (V * F) + 0,024) – 0,4

Onde:

ARR = açúcares redutores residuaisV = volume gasto corrigido (mL)F = fator do Fehling

Exemplo:

• Volume gasto (mL) = 39,2• Fator do licor de Fehling = 1,0016• Volume gasto corrigido (mL) = 39,3• Açúcares redutores residuais (%) = 0,13

2.2.6 Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT)

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Banho-maria termostatizado;• Bureta de Mohr, 50mL;• Béquer sem haste diâm. 100mm;• Pérolas de vidro;• Cronômetro;• Tela de ferro galvanizado com centro de amianto medindo 200 x 200mm;• Tripé de ferro;• Haste longa de ferro com base e suporte para bureta;• Bico de gás tipo Mecker ou Redutec;• Algodão;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.


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Reagente

• Solução de Fehling A;• Solução de Fehling B;• Solução indicadora azul de metileno 1%;• Solução de ácido clorídrico 6,34 mol/L(24,85°Brix);• Solução de hidróxido de sódio 20% (6 mol/L);• Solução de EDTA 4%;• Solução de açúcar invertido 1%;• Solução de fenolftaleína 1% ou papel de tornassol;• Celite.

Técnica

• Aquecer aproximadamente 200mL da amostra até 75°C, resfriar a temperatura ambiente efiltrar em algodão;• Pesar 50g ± 0,5g da amostra e transferir para balão volumétrico de 200mL;• Acrescentar água destilada suficiente para cobrir o bulbo do termômetro introduzido no balãoe aquecer em banho-maria até atingir 65°C;• Retirar do banho e adicionar 10mL de ácido clorídrico 6,34N, ao mesmo tempo em que seretira o termômetro;• Agitar o balão com movimentos rotatórios e deixar em repouso por 30min;

• Adicionar 20mL de solução de açúcar invertido 1%;• Neutralizar com solução de hidróxido de sódio 20%, utilizando a fenolftaleína ou papel detornassol como indicador;• Resfriar, adicionar 4mL da solução de EDTA 4%, completar o volume com água destilada ehomogeneizar;• Transferir para béquer de 250mL, adicionar de 8 a 10g de celite, agitar e filtrar em papel defiltro;


• Transferir com auxilio de pipetasvolumétricas para erlenmeyer de250mL: 5mL da solução de FehlingB e 5 mL da solução de Fehling A;

• Colocar algumas pérolas de vidro noerlenmeyer;


• Aquecer a mistura até atingir aebulição, o que deve ser conseguidoem 2 min. e 30 seg.


• Transferir com auxílio de pipetasvolumétricas para o Redutec: 5mL dasolução de Fehling B e 5 mL dasolução de Fehling A;




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• Adicionar da bureta 15mL da solução e aquecer a mistura até a ebulição, o que deve serconseguido em 2min e 30';

• Se não ocorrer mudança de cor na solução, indicando que o licor de Fehling não foi reduzido,deve-se continuar a adição de solução até que a cor original desapareça;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação até a mudança dacor azul para vermelho tijolo;• Anotar o volume gasto (V1) como um valor aproximado da titulação;

• Repetir a titulação adicionando, no erlenmeyer, além do licor de Fehling, o volume da soluçãoconsumido na titulação anterior menos 1mL (V1 - 1mL);

• Aquecer a mistura até a ebulição e então, cronometrar exatamente 2min, mantendo o líquidoem ebulição constante;• Adicionar 4 a 5 gotas da solução de azul de metileno e continuar a titulação, gota a gota, atécompleta eliminação da cor azul;• O tempo total, desde o início da ebulição até o final da titulação, deve ser de 3min;• Anotar o volume gasto e corrigi-lo com o fator do licor de Fehling anotando-o como V.

Observação:

• Se a análise for em vinho turbinado não é necessário o aquecimento da amostra à 75 °C;• O volume gasto da solução necessário para completa titulação é inversamente proporcional amesma;• Não deixar escorrer a solução ou o indicador pela parede do erlenmeyer;

• O licor de Fehling pode ser preparado em quantidade suficiente para realizar as análisesdiárias misturando-se volumes iguais das soluções A e B;• Adicionar sempre a solução A sobre a solução B;• A diferença entre duas titulações não deve ser maior que 0,2mL, caso contrário, repetir aanálise;• Não clarificar a amostra a ser analisada com subacetato de chumbo ou outro agenteclarificante, a fim de evitar a precipitação de açúcares redutores da solução.

Cálculo:

ARRT (%) = (19,86 / (V * F) – 0,024) – 0,4

Onde:

ARRT = Açúcares redutores residuais totaisV = Volume gasto corrigido (mL)F = Fator do Fehling


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Exemplo:

• Volume gasto (mL) = 36,4• Fator do licor de Fehling = 1,0016• Volume gasto corrigido (mL) = 36,5• Açúcares redutores residuais totais (%) = 0,17

2.2.7 Sólidos Insolúveis

Os sólidos insolúveis estão definidos como todo material retido após filtração em tela de inoxABNT 400, podendo ser constituído por bagacilho, terra, argila etc.

Material

• Estufa elétrica;• Balança de precisão, legibilidade 0,1g;• Balança analítica, legibilidade 0,1mg;• Bomba de vácuo;• Funil de Büchner desmontável, diâm. 55mm;• Tela de inox, 80 x 80mm, abertura 0,037mm, ABNT 400;• Kitassato, 500mL;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Técnica

• Pesar uma tela previamente seca em estufa a 105°C por 30min, resfriar em dessecador (P 1);• Montar o sistema de filtração com o funil de Büchner e kitassato e encaixar a tela entre aspartes superior e inferior do funil;• Homogeneizar a amostra, pesar 200g ± 0,5g (PA) em béquer de 250mL e filtrar sob vácuo;• Lavar o béquer 2 a 3 vezes com água destilada e transferir a água para o funil de filtração;• Rinsar água sobre a tela para assegurar completa remoção de materiais solúveis até que a águade lavagem se apresente límpida e incolor;• Retirar a tela do funil contendo os insolúveis, transferir para estufa a 105°C por 2h e resfriar

em dessecador;• Pesar e anotar (P2).

Cálculo:

Sólidos insolúveis (%) = (P2 – P1) / PA * 100

Onde:

P1 = Peso da tela seca e limpa (g)

P2 = Peso da tela + insolúveis (g)

PA = Peso da amostra (g)


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Exemplo:

• Peso da tela (g) = 1,0376• Peso da tela + insolúveis (g) = 1,3385• Peso da amostra (g) = 200,0• Sólidos insolúveis (% p/p) = 0,15

Observação:

• Para amostras de vinho centrifugado ou mosto, pesar aproximadamente 500g; ± 0,5g• Para amostras de leite de levedura e fundo de dorna, pesar aproximadamente 50g ± 0,5g.

2.2.8 Teor de Levedura

2.2.8.1 Teor de Levedura (método por centrifugação)

Material

• Centrífuga com dispositivo de indicação de rotação (rpm);• Cronômetro;• Tubos para centrífuga;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Observação:

• Para vinho centrifugado, pé-de-cuba, leite de levedura utilizar tubos para centrífuga fundocônico graduado, 10mL;• Vinho turbinado e vinho dorna volante utilizar tubo de centrífuga com fundo reto, graduado1,5%.

Técnica

• Homogeneizar a amostra e transferir para dois tubos cônicos até a marca de 10mL;

• Colocar os tubos na centrífuga em lados opostos e balanceá-los;• Centrifugar por 3 min a 3.000rpm;• Fazer a leitura do volume de sólidos decantados no fundo dos tubos.

Cálculo:

Expressar o resultado em porcentagem em volume de teor de levedura no vinho.

Teor de levedura (%) = V *10

Onde:

V = volume decantado


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Exemplo:

• Volume decantado (mL) = 1,1• Sólidos totais (% v/v) = 11,0

Nota: Quando utilizado o tubo de centrífuga com fundo reto a leitura já está expressa em %.

2.2.8.2 Teor de Levedura (método colorimétrico)

Objetivo

Determinar a concentração de levedura seca em amostras de fermentação etanólica, empregando

espectrofotometria no visível.Campo de Aplicação

Este método é aplicável à amostras de pé de cuba, vinho dorna morta, vinho dorna volante, vinhoturbinado e leite de levedura.

Resumo do Método

A levedura decantada após centrifugação é ressuspendida com solução tampão pH 1,45,medindo-se a absorbância a 670 nm e o resultado expresso em % de levedura seca.

Equipamentos e Materiais

• Balança de precisão, legibilidade 0,01 g;• Espectrofotômetro;• Centrífuga;• Cubeta de vidro ótico especial, percurso ótico 10 mm;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagentes

• Solução de KCl 0,2 mol/L• Solução de ácido clorídrico 0,2 mol/L• Solução Tampão pH 1,45

Amostra para Curva de Calibração

Antes de fazer a curva de calibração é necessário ter uma amostra com valor conhecido delevedura seca.

Para isto deve-se utilizar uma amostra de leite de levedura e determinar a % de sólidos insolúveise a massa seca total.


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Exemplo:

Leite de levedura:

Sólidos Insolúveis (% m/m) = 0,14Massa Seca Total (% m/m) = 14,99Massa Seca Levedura (% m/m) = 14,85

Curva de calibração

• Centrifugar 40 mL da amostra de leite de levedura a 3000 rpm, durante 5 min.;• Descartar o sobrenadante;

• Ressuspender o fermento com 40 mL da solução tampão pH 1,45;• Centrifugar novamente a 3000 rpm, durante 5 minutos;• Descartar o sobrenadante;• Ressuspender novamente a levedura com 40 mL da solução tampão pH 1,45;• Pesar aproximadamente 5g e transferir para um balão volumétrico de 25 mL e completar ovolume com solução tampão pH 1,45 e anotar a massa como m1;• Transferir aproximadamente 0,1; 0,3; 0,4; 0,5 e 0,7g da amostra diluída para 5 balõesvolumétricos de 50 mL e completar os volumes com a solução tampão pH 1,45, anotando asmassas como m2, respectivamente;

• Calcular as concentrações pela fórmula:

Concentração de Levedura, % m/m = MSL * m1 * m2 / 1250

Onde:

MSL = Massa Seca Levedura, expressa em % m/m.

• Medir a absorbância das soluções a 670 nm em cubeta de 10 mm, zerando oespectrofotômetro com solução tampão pH 1,45. Anotar as leituras;• Construir a curva de calibração a partir das leituras de absorbância x concentração de

levedura.

Exemplo

• MSL = 14,85 % m/m.• m1 = 5,14g


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A tabela a seguir apresenta os pontos para a curva de calibração.

BalãoVolumétrico 50

mL

m2(g)

Concentração de levedura

(%m/m)Absorbância

1 0,11 0,0067 0,0722 0,32 0,0195 0,2073 0,40 0,0244 0,2704 0,50 0,0305 0,3185 0,70 0,0427 0,432

A partir dos valores relacionados, calcular os valores da inclinação (a), da intersecção (b) e dacorrelação (r), a partir da leitura de absorbância versus a concentração de levedura (% m/m), nocaso tem-se:

a = 0,0996b = -0,0011r = 0,9979

Concentração de Levedura seca = (a * L + b) * f

Onde:

a = valor da inclinação da reta;b = valor da intercepção da reta;L = leitura de absorbância;f = fator de diluição da amostra.

Procedimento

Técnica

• Centrifugar 10 mL de amostra a 3000 rpm durante 5 min;• Descartar o sobrenadante;• Ressuspender o precipitado com 10 mL de solução tampão pH 1,45;• Centrifugar novamente a 3000 rpm durante 5 minutos;• Descartar o sobrenadante;• Ressuspender o precipitado com 10 mL de solução tampão pH 1,45;• Diluir a amostra conforme tabela abaixo e completar o volume com a solução tampão pH1,45;


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AmostraVolume amostra

(mL)

Volume balão

(mL)

Fator diluição

(f)Vinho turbinado 10 50 5

Dorna Volante 10 100 10

Dorna Morta 1 100 100

Leite Levedura 1 500 500

• Medir a absorbância das soluções a 670 nm em cubeta de 10 mm, zerando oespectrofotômetro com solução tampão pH=1,45;• Anotar as leituras.

Cálculo

Concentração de levedura seca (% m/m) = (a * L + b) * f

Onde:

a = valor da inclinação da reta obtida na curva;b = valor da intercepção da reta obtida na curva;L = Concentração de levedura na amostra diluída obtida na curva em função daabsorbância.f = Fator de diluição da amostra.

Exemplo

Seja 0,120 o valor de absorbância lido para uma amostra de vinho dorna volante:

Concentração de levedura seca (% m/m) = (0,0996 * 0,120 – 0,0011) * 10Concentração de levedura seca (% m/m) = 0,108

Resultados

Expressar o resultado em % m/m de massa seca com 3 casas decimais

Confiabilidade

Vinho turbinado/volante

A incerteza do método é ±. 0,002 % m/mO limite de detecção é 0,005 % m/m


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Referência Bibliográfica

Baxter, P. J., Christian, G. D. and Ruzicka, J. - Rapid Determination of Total Biomass from aYeast Fermentation Using Sequencial Injection - Analyst, August 1994, Vol. 119 (8) 1807-1812.

Rendimento Fermentativo

Quando a usina empregar o método de Teor de Levedura colorimétrico a equação para cálculo doKl deverá ser modificada como segue:

Substituir a equação:

Kl = (% F V.V.) x 0,33 .(ºGL V.T.) x 0,7893

Onde:

(% F.V.V.) = Teor de levedura % v/v vinho dorna volante(ºGL V.T.) = Teor alcoólico ºGL vinho turbinado0,33 = Fator de conversão do teor de levedura % v/v em massa seca0,7893 = Massa específica do álcool a 100%

Por:

Kl = % m/m V.V .ºGL V.T. x 0,7893

Onde:(% m/m.V.V.) = Concentração de levedura em massa seca % m/m vinho dorna volante(ºGL V.T.) = Teor alcoólico ºGL vinho turbinado0,7893 = Massa específica do álcool a 100%

Retirando o fator 0,33 da formula anterior que era o fator de conversão de massa úmida paramassa seca.

2.2.9 Massa seca total

Entende-se por massa seca total todo resíduo obtido após centrifugação e secagem dos sólidostotais, podendo ser levedura, bagacilho, argila, terra etc.

Material

• Estufa elétrica;• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Balança analítica, legibilidade 0,1mg;


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• Centrífuga com dispositivo de contagem de rotações (rpm), com cruzeta e porta tubos, paratubos de 100mL;• Tubo para centrífuga, fundo cônico ou redondo, com ou sem graduação, de vidro ou

polietileno, cap. 100mL;• Cápsula de alumínio, diâm. 40mm e altura 30mm;

Técnica

• Homogeneizar a amostra;• Pesar em um tubo de centrífuga 100g ± 0,5g da amostra;• Transferir o tubo para a centrífuga, balancear e centrifugar a 3.000rpm por 3min;• Desligar a centrífuga, retirar o tubo, desprezar o sobrenadante, adicionar água destilada,ressuspender o decantado e centrifugar novamente;

• Repetir o procedimento anterior;• Desligar a centrífuga, desprezar o sobrenadante e transferir quantitativamente o decantadopara a cápsula previamente tarada (P1) com auxílio de uma espátula e álcool etílico. Usar o

mínimo possível de álcool;• Transportar a cápsula para estufa a 105°C e secar até peso constante;• Retirar a cápsula da estufa e resfriar em dessecador;• Pesar e anotar (P2).

Cálculo:

(P2 - P1)Massa seca total (% p/p) = -------------- x 100

PA

Onde:

P1 = Peso da cápsula

P2 = Peso da cápsula + massa seca

PA = Peso da amostra

Exemplo:

• Peso da cápsula (g) ............................................................... 23,2832• Peso da cápsula + M.S. (g) ................................................... 26,4824• Peso da massa seca (g) ......................................................... 3,1992• Peso da amostra (g) .............................................................. 100,0• Massa seca total (% p/p) ...................................................... 3,2


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Observação:

• Para amostra de vinho centrifugado, pesar 500g ± 0,5g e evaporar em banho-maria até volumefinal de 70-80mL;• A seguir, transferir quantitativamente para tubo de centrífuga de 100mL, balancear e seguir amesma técnica descrita para vinho.

2.2.10 Massa seca levedura

Massa seca levedura em produtos da fermentação é obtida por cálculo, subtraindo-se os sólidosinsolúveis da massa seca total.

Exemplo:• Massa seca total (% p/p).............................................. 3,2• Sólidos insolúveis (% p/p)........................................... 0,15• Massa seca levedura (% p/p)....................................... 3,05

2.2.11 Glicerol

Glicerol (método enzimático)

Objetivo

Determinar glicerol em amostras de vinho por via enzimática, empregando espectrofotometria novisível.

Campo de Aplicação

Este método é aplicável para amostras do processo fermentativo.

Resumo do Método

O glicerol reage com Adenosina Trifosfato (ATP), catalisada pela Glicerol Kinase, formandoAdenosina-5-difosfato (ADP) e Glicerol-1-Fosfato (G-1-P) que é oxidado pela Glicerol FosfatoOxidase a Fosfato de Dihidroacetona (DAP) e Peróxido de Hidrogênio. Este reage com 4-Aminoantipirina (4-AAP) e n-etil-n(3 sulfopropil) m-Ansidina (ESPA), formando quinoneimina,composto colorido, cuja absorbância é medida a 540 nm.

Equipamentos e Materiais

• Espectrofotômetro;• Centrífuga;• Banho-maria com aquecimento;


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• Cronômetro;• Cubeta de vidro ótico especial, percurso ótico 10 mm;• Tubos de centrífuga cônico de 10 mL;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagentes e Soluções

• Padrão de glicerol – solução 0,1 % m/v• Padrão de glicerol – solução 0,001 % m/v• Solução EnzimáticaProceder a preparação da solução enzimática de uso conforme instruções de cada fabricante.

Obs: A diluição da solução padrão de glicerol para a construção da curva de calibração e a

diluição da amostra e cálculos é o mesmo para qualquer Kit Enzimático, variando apenas ocomprimento de onda (nm) em função do tipo de Kit.

Curva de Calibração

• Separar 6 tubos de ensaio, numerar de 0 a 5 e adicionar 2 mL da solução Enzimática em cadaum;• Adicionar na ordem 0; 1; 2; 3; 4 e 5 mL da solução padrão de glicerol 0,001 % m/v;• Adicionar 5; 4; 3; 2; 1 e 0 mL de água deionizada ou destilada, totalizando o volume de 7 mLem cada tubo;

• Calcular a concentração de glicerol em cada tubo, pela fórmula:Tuboi = Gp x Vpi / 5

onde:Gp = % m/v de glicerol sol. padrão 0,001 % m/v;Vpi= Vol. sol. padrão no tubo i.

• Homogeneizar a solução invertendo os tubos (cuidado: não agitar);• Transferir os tubos para banho-maria termostatizado a 37°C e manter nesta temperatura por5min;• Retirar os tubos do banho-maria e deixar esfriar até temperatura ambiente;• Medir as absorbâncias da solução à 540 nm em cubeta de 10 mm utilizando a prova embranco (o tubo com 0 % glicerol), para zerar o espectrofotômetro, anotar as leituras.

Exemplo

• Massa glicerol = 0,1038 g;• Pureza glicerol = 99,9%;• Conc. Sol. padrão = 0,1038x0,01x99,9/100 = 0,001037 % m/v• Conc. tubo 1 = 0,001037x1/5 = 0,000207 % m/v

• Conc. tubo 3 = 0,001037x3/5 = 0,000622 % m/v


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Padrão para curva de calibração:

Tubo Vol. Água Vol. Sol. Padrão Conc, % m/v (x 10-3) Absorbância0 5 0 0 0,0001 4 1 0,207 0,1752 3 2 0,415 0,3383 2 3 0,622 0,5044 1 4 0,830 0,6555 0 5 1,037 0,869

A partir dos valores relacionados, calcular os valores da inclinação (a), da intersecção (b) e dacorrelação (r), a partir da leitura de absorbância versus a concentração de Glicerol (% mg/l), no

caso tem-se:

a = 1,218b = 0,003r = 0,9990

Procedimento

Técnica

• Centrifugar 10 mL da amostra a 3000 rpm durante 3 minutos;• Transferir 5 mL do sobrenadante para balão volumétrico de 100 mL e completar o volumecom água deionizada ou destilada;• Transferir 2 mL do balão anterior para outro balão de 100 mL e completar o volume;• Transferir 5 mL do balão anterior para um tubo de ensaio;• Adicionar 2 mL da solução Enzimática;• Homogeneizar invertendo o tubo no sentido vertical (cuidado: não agitar);• Transferir o tubo para banho-maria a 37°C e manter durante 5 minutos;• Retirar o tubo do banho e deixar esfriar até temperatura ambiente;• Fazer em paralelo a prova em branco, substituindo a amostra por 5 mL de água deionizada ou

destilada. Zerar o espectrofotômetro com a prova em branco;• Medir a absorbância da amostra, anotando a leitura.

Cálculo

Glicerol%mv = a * L + b


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Exemplo

Seja 0,315 o valor de absorbância lido para um amostra. Com auxílio da curva de calibração,calcular o valor correspondente de glicerol presente na amostra.

Glicerol %m/v = 1,218 * 0,315 + 0,003

Glicerol %m/v = 0,39

Resultados

Expressar os resultados em % m/v de glicerol com duas decimais.

Confiabilidade

Vinho turbinado/volante

A incerteza do método é ±. 0,01 % m/vO limite de detecção é 0,10 % m/v

Referência Bibliográfica

SIGMA - Triglyceride (GPO-TRINDER), Quantitative, Enzymatic Determination of Glycerol,

True Triglycerides, and Total Triglycerides in Serum or Plasma at 540 nm )Procedure No. 337)

2.2.12 Dióxido de enxofre

O dióxido de enxofre ou sulfito é formado pela queima do enxofre no processo de fabricação deaçúcar e quando dissolvido no caldo chega até os méis, mosto e vinho na forma de ânions sulfitoou bissulfito.

Material

• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Espectrofotômetro;• Micro destilador Kjeldhal;• Cubeta, caminho ótico 10 mm;• Papel de filtro quantitativo, Whatman 41 ou equivalente;• Algodão;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução estoque de pararosanilina;• Solução de uso de pararosanilina;


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• Solução de formaldeído;• Solução de ácido sulfúrico 6 mol/L;• Solução padrão de sulfito 500 mg/l;• Solução de trietanolamina 1 e 10%.

Curva padrão

Técnica

• Transferir para béquers de 50mL com auxílio de uma bureta 2, 4, 6, 8 e 10mL da soluçãopadrão de sulfito 500mg/l;• Acrescentar em cada béquer 10mL da amostra a ser analisada;

• As soluções contidas nos béquers correspondem respectivamente a 10, 20, 30, 40 e 50mg/l desulfito, além da concentração de sulfito da amostra adicionada;• Destilar cada uma das soluções após adição de 10mL de solução de ácido sulfúrico 6 mol/L nosistema de dosagem do destilador;• Receber cada destilado em uma proveta graduada de 100mL ou equivalente contendo 25mLda solução de trietanolamina 10%;• O aquecimento deve ser brando e considerar a destilação concluída quando o volume final foraproximadamente 80mL;• A seguir transferir cada destilado para balão volumétrico de 100mL e completar o volumecom água destilada;

• Em uma série de cinco tubos de ensaio colocar 10mL da solução de formaldeído, 2 mL dasolução de pararosanilina e homogeneizar;• Acrescentar 1mL de cada destilado no tubo de ensaio correspondente e homogeneizar;• Conduzir em paralelo uma prova em branco com 10mL da solução de formaldeído, 2 mL dasolução de uso de pararosanilina e 1mL da solução de trietanolamina 1%;• Deixar em repouso todas as soluções por 30 minutos para desenvolvimento da cor;• Ajustar o espectrofotômetro em 570nm e acertar o ponto zero de absorbância com a prova embranco utilizando cubeta de 10mm;• Fazer as leituras de absorbância de cada solução (Xi) e anotar;

Obs: Para construir a curva padrão é necessário determinar também a absorbância da amostra.

Determinação

Técnica

• Filtrar a amostra em algodão;• Pipetar 10mL da amostra filtrada e transferir para o destilador e adicionar 10mL da solução deácido sulfúrico no sistema de dosagem do destilador;• Receber o destilado em uma proveta graduada contendo 25mL da solução de trietanolamina10%;


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• O aquecimento deve ser brando e considerar a destilação concluída quando o volume final foraproximadamente 80mL;• Transferir o destilado para balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água

destilada;• Em um tubo de ensaio colocar 10mL da solução de formaldeído, 2mL da solução depararosanilina e homogeneizar;• Acrescentar 1mL do destilado da amostra e homogeneizar;• Deixar em repouso por 30 minutos para desenvolvimento da cor;• Efetuar a leitura da absorbância (y) usando a prova em branco como referência e anotar.

Exemplo de curva de padrão

Sejam as leituras de absorbância abaixo, encontradas para cada concentração padrão de SO2 e

utilizadas para traçado da curva padrão.

AbsorbânciaVol. sol.500mg/l(mL)

Conc. SO2

(mg/l) Padrões (Lp) Amostra (La)x

2 10 0,274 0,125 0,1494 20 0,427 0,125 0,3026 30 0,573 0,125 0,4488 40 0,723 0,125 0,598

10 50 0,870 0,125 0,745

Lp = Leituras de absorbância relativaLa = Leitura absorbância da amostrax = Leituras de absorbância absoluta (Leitura relativa de cada padrão - leitura daamostra)

A partir dos valores relacionados, calcular os valores da inclinação (a), da intersecção (b) e dacorrelação (r), a partir da leitura de absorbância versus a concentração de Sulfito (mg SO 2 /l), nocaso tem-se:

a = 67,201

b = -0,133r = 0,99998

Cálculo:

SO2 (mg/l) = (a * x + b) * f

Onde:

x = Leituras de absorbância absoluta

f = fator de diluição da amostra (neste caso = 10)


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2.2.3 Pé-de-cuba, Leite de levedura e Vinho centrifugado

Para análise de pé-de-cuba (Brix, °GL, acidez sulfúrica e pH), leite de levedura e vinhocentrifugado (sólidos insolúveis, teor de levedura) seguir a mesma metodologia descrita paravinho.

2.2.4 Vinhaça/Flegmaça

2.2.4.1 Teor alcoólico

2.2.4.1.1 Método por cromatografia gasosa

Objetivo

Determinar álcool etílico em vinhaça, flegmaça, água fraca e outros fluidos de destilaria, porcromatografia em fase gasosa.

Campo de aplicação

Este método é aplicável à determinação de álcool etílico em amostras de destilarias, visandocontrolar perdas.

Resumo do método

Uma alíquota da amostra é injetada em um sistema de cromatografia em fase gasosa, sendo oálcool etílico separado dos demais componentes em uma coluna empacotada com ChromosorbWAW-DMCS impregnada com Carbowax 20M, detectado por ionização em chama equantificado pela técnica de padronização externa.

Materiais e equipamentos

• Cromatógrafo a gás com detetor de ionização de chama;• Integrador eletrônico ou registrador potenciométrico;

• Coluna cromatográfica: 20% Carbowax 20M sobre Chromosorb WAW-DMCS, 80/120mesh,em tubo de aço 1/8" diâmetro externo e 3m de comprimento;• Seringa de vidro de cinco ou dez microlitros;• Acessórios cromatográficos;• 2 balões volumétricos de 100mL;• 1 pipeta volumétrica de 10mL;• 1 pipeta volumétrica de 1mL.


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Materiais de consumo

Gases

• Ar sintético grau zero;• Hidrogênio ultrapuro;• Nitrogênio ultrapuro.

Reagentes

• Álcool etílico absoluto;• Água deionizada ou destilada.

Solução estoque

Transferir para um balão volumétrico de 100mL, contendo aproximadamente 50mL de águadeionizada ou destilada, com auxílio de pipeta volumétrica, 10mL de álcool etílico absoluto;homogeneizar e completar o volume com água deionizada ou destilada.

Calcular a concentração, pela fórmula:

C = 0,01 P x V

Onde:C = Concentração do álcool etílico, em % v/vP = Pureza do álcool etílico absoluto, em %V = Volume de álcool etílico, em mL.

Conservar esta solução sob refrigeração, por um período máximo de seis meses.

Solução padrão

Diluir 100 vezes a solução estoque, transferindo, com auxílio de pipeta volumétrica, 1mL da

solução estoque para um balão de 100mL contendo aproximadamente 50mL de água deionizadaou destilada.

Completar o volume com água deionizada ou destilada e homogeneizar.

A concentração dessa solução é 100 vezes menor que a solução estoque.

Conservar esta solução sob refrigeração, por um período máximo de três meses.


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Coleta e preparo da amostra

A amostra deve ser coletada na temperatura ambiente em frasco de vidro ou polietileno comtampa e conservado em lugar fresco.

Procedimento

Otimização das condições cromatográficas aproximadas

Temperaturas:

• Injetor = 200°C;

• Coluna = 100°C;• Detetor = 250°C.

Fluxos:

• Nitrogênio = 30mL/min;• Hidrogênio = 30mL/min;• Ar sintético = 300mL/min.

Calibração do cromatógrafo

Lavar dez vezes a seringa com água destilada ou deionizada e cinco vezes com a amostra a serinjetada. Encher a seringa com solução padrão, expulsar alguma bolha de ar com a seringa naposição vertical, com a agulha para cima. Calibrar dois microlitros, injetar e acionar o start dointegrador ou registrador.

Aguardar o tempo de eluição do álcool etílico e acionar o stop do integrador ou registrador.

Realizar, no mínimo, cinco injeções da solução padrão, obtendo a área ou altura dos picos deálcool etílico de cada injeção.

Realizar uma avaliação estatística dessas medidas, aceitando uma variação máxima deaproximadamente 5%. Por se tratar da etapa de calibração do instrumento, o número de medidasdeve ser no mínimo cinco, portanto, se necessário, realizar mais injeções da solução padrão.

Calcular a média das medidas de área ou altura dos picos de cada componente e determinar osfatores de resposta pela fórmula:

CFR = ----

A

Onde:


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FR = Fator de resposta do álcool etílicoC = Concentração do álcool etílico na solução padrão, em % v/vA = Área ou altura do álcool etílico na solução padrão

Programar o integrador eletrônico com esses fatores de resposta, utilizando o método depadronização externa.

Controle do método

Seguir o procedimento descrito no item 3.1.9.2, quanto à limpeza da seringa e calibração dovolume. Injetar dois microlitros da amostra de controle, que é a própria solução padrão (item3.1.7.4) como se fosse uma amostra desconhecida. Obter os resultados e calcular a exatidão dométodo, pela fórmula:

CE

Exatidão = ----- x 100CR

Onde:

CE = Concentração encontrada

CR = Concentração real

A variação máxima permitida é de 5%. Uma variação acima desse valor indica anormalidade noprocesso analítico, que pode ser deterioração da amostra de controle, alteração da resposta dodetetor, vazamentos em conexões, septo etc. Deve-se realizar uma revisão geral, iniciando-sepela preparação de uma nova solução padrão ou amostra de controle, verificar as condições emfinalmente, repetir a etapa de calibração (item 3.1.9.2).

Execução da análise

Lavar a seringa dez vezes com água destilada ou deionizada e cinco vezes com amostra. Calibrarum volume de dois microlitros, injetar e acionar o start do integrador ou registrador, aguardar otempo de eluição do álcool etílico e acionar o stop do integrador ou registrador.

No caso de se usar o registrador potenciométrico, medir a área ou altura dos picos nocromatograma.

Cálculos

Com integrador eletrônico

Os cálculos são usados por este instrumento, que fornece os resultados da análise.


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Com registrador

Calcular a concentração do álcool etílico, pela fórmula:

CA = FR . AA

Onde:

CA = Concentração do álcool etílico na amostra, em % v/v

FR = Fator de resposta do álcool etílicoAA = Área ou altura do pico do álcool etílico na amostra

Expressão do resultado

O resultado é expresso em % v/v.

Limite mínimo de detecção = 0,001% v/v

Cromatograma ilustrativo da solução padrão e amostra

Padrão

TR Área % v/v1.97 11098 0,089

Amostra de vinhaça

TR Área % v/v1.98 1530 0,012


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2.2.4.1.2 Método Químico

Material:

• Microdestilador Kjeldahl;• Balança de precisão, legibilidade 0,01g;• Vidrarias e utensílios comuns de laboratório.

Reagente

• Solução de dicromato de potássio 5,0g/l;• Solução de tiossulfato de sódio, 24,82g/l;

• Solução de iodeto de potássio 10%;• Solução indicadora de amido 1%;• Ácido sulfúrico conc. p.a.

Técnica

• Pipetar 10mL da amostra, transferir para o microdestilador e adicionar cerca de 30mL de águadestilada;• Recolher o destilado em um erlenmeyer de 250mL contendo 10mL de Dicromato de Potássio5,0g/l e 10mL de ácido sulfúrico conc. p.a.;

• Destilar aproximadamente 15mL da amostra, adicionar água destilada até 100mL e resfriar à10 - 15°C;• Adicionar 5mL da solução de iodeto de potássio;• Se após a adição da solução de iodeto de potássio não ocorrer a liberação do iodo (coloraçãovermelha), repetir a análise com 5mL da amostra;• Titular com a solução de tiossulfato de sódio até a coloração amarela, neste instante adicionar1mL da solução indicadora de amido e continuar a titulação até coloração levemente azul;• Anotar o volume gasto (PA).

Prova em branco

• Transferir 10mL da solução de dicromato de potássio para um erlenmeyer de 250mL,adicionar cuidadosamente 10mL de ácido sulfúrico conc.;• Acrescentar 100mL de água destilada e resfriar a 10 - 15°C;• Adicionar 5mL da solução de iodeto de potássio;• Titular com a solução de tiossulfato de sódio e anotar o volume gasto (PB).


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Cálculo:

Teor alcoólico (°GL) = Vr * 0,0145

Vr = Volume real gasto na amostra (mL)PB = Volume gasto na prova em branco (mL)PA = Volume gasto na amostra (mL)

Exemplo:

• PA (mL) = 6,5• PB (mL) = 9,7

• Vr (mL) = 3,2• Teor alcoólico (°GL) = 0,046

Obs: Utilizando 5mL da amostra para destilação, multiplicar o resultado final por 2.

2.2.4.1.3 Método densímetro eletrônico

Material

• Densímetro digital eletrônico;• Microdestilador Kjeldahl;• Balão volumétrico, 10mL;• Pipeta volumétrica, 50mL;• Pisseta, 500mL;• Seringa, 2mL.

Técnica

• Pipetar 50mL de vinhaça e transferir para o microdestilador;• Acoplar um balão volumétrico de 10mL para receber o destilado no final do condensador (oponteiro deve entrar 2 a 3cm no gargalo do balão volumétrico);

• Destilar a vinhaça até quase completar o volume do balão volumétrico;• Retirar o balão volumétrico do final do condensador e completar o volume com águadestilada;• Agitar e expulsar pequenas bolhas de ar que se formam após a agitação;• Injetar com a seringa a amostra destilada no densímetro, tomando o cuidado de lavar tanto aseringa quanto o tubo do densímetro três vezes com a solução a ser lida (se for adaptado um funilpara fluxo contínuo deve-se passar também amostra por 3 vezes);• Acender a luz interna e verificar se não ficou bolha no tubo de amostra;• Esperar 2 a 3 minutos para estabilização da temperatura;• Anotar a leitura da densidade ou da massa especifica.


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3 Preparação de Reagentes

3.1 Ácido clorídrico, solução 6,34 mol/L (24,85°Brix areométrico)

Uso

• Inversão da sacarose para determinação de açúcares redutores totais.

Preparação

• Medir em proveta 530mL de ácido clorídrico concentrado p.a. e transferir vagarosamente paraum béquer contendo aproximadamente 300mL de água destilada;

• Homogeneizar, esfriar, transferir para balão volumétrico de 1.000mL e completar o volume;• Armazenar em frasco âmbar com tampa rosqueável.

Segurança:

• Manusear o ácido em capela com exaustão, usar protetor facial e avental químico.

3.2 Ácido clorídrico, solução 1 mol/L

Uso

• Padronização da solução de hidróxido de sódio 1 mol/L.

Preparação

• Transferir 84,5mL de ácido clorídrico conc. p.a. para balão volumétrico de 1.000mL contendoaproximadamente a metade de água destilada;• Agitar, resfriar em água corrente até a temperatura ambiente e completar o volume;• Separar com auxílio de uma proveta limpa e seca, um volume de 100mL da solução de ácidoclorídrico 1 mol/L, que será utilizada para limpeza da bureta e na titulação para padronização.

Padronização:

• Pesar 1,060g ± 1mg de carbonato de sódio anidro p.a., previamente seco em estufa à 105°Cpor 8 horas;• Transferir para erlenmeyer de 250mL, adicionar aproximadamente 100mL de água destilada eagitar até completa dissolução;• Colocar 3 gotas de alaranjado de metila e titular com a solução de ácido clorídrico 1N até aviragem do amarelo para alaranjado;• Na titulação deverão ser gastos 20mL da solução de ácido clorídrico 1 mol/L. Se gastar maisde 20mL indica que a solução está diluída, sendo necessário adicionar mais ácido clorídrico

conc., caso contrário, se gastar menos de 20,0mL indica que a solução está concentrada, nestecaso, proceder a correção da solução como segue:


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Considerando que foram gastos 19,6mL de solução de ácido clorídrico 1 mol/L:

Fator = 20/19,6 = 1,0204

Para 1.000mL da solução original teríamos:

1,0204*1.000 = 1.020,4mL

Ou seja:

1,020,4-1.000 = 20,4mL

Esse valor significa o volume de água destilada que deve ser adicionado a 1.000mL da soluçãopara se obter uma solução exata 1 mol/L.

Portanto, para o volume restante de 900mL da solução a ser padronizada, a quantidade de águadestilada a ser adicionada para acertar a concentração a 1 mol/L será:

20,4*(900/1000)=18,4mL

Após a adição da água destilada (18,4mL) na solução restante de ácido clorídrico (900mL), agitare repetir a padronização para confirmar a normalidade.

3.3 Ácido clorídrico 0,2 mol/L, Solução de

Uso

Preparação da solução tampão pH 1,45.

• Transferir 16,6 ± 0,2 mL de ácido clorídrico conc. p.a. a 37 % para balão volumétrico de 1000mL, contendo aproximadamente a metade de água deionizada ou destilada, completar o volume ehomogeneizar; • Armazenar esta solução em frasco âmbar com tampa rosqueável;

• Validade: 3 meses.Obs: Manusear o ácido clorídrico em capela com exaustão;


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3.4 Ácido sulfúrico, solução 6 mol/L

Uso

• Determinação de dióxido de enxofre.

Preparação

• Transferir 500mL de água destilada para béquer de 2.000mL e colocá-lo em banho de águacorrente;• Lentamente adicionar 320mL de ácido sulfúrico concentrado p.a. medido em proveta;• Deixar esfriar e transferir para balão volumétrico de 1.000mL, completar o volume com água

destilada e homogeneizar;• Armazenar esta solução em frasco âmbar com tampa rosqueável.

Cuidado

• Manusear o ácido em capela com exaustão, usar protetor facial e avental químico.

3.5 Ácido sulfúrico, solução 1 mol/L

Uso

• Geral

Preparação

• Medir em proveta graduada 29mL de ácido sulfúrico concentrado p.a. e transferirvagarosamente para um béquer contendo aproximadamente 500mL de água destilada;• Homogeneizar, esfriar, transferir para balão volumétrico de 1.000mL e completar o volume;• Armazenar esta solução em frasco com

Controle Químico na Fermentação

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