Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do

Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no

Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador.

Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara

Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro

Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos

1. Caracterização molecular do genoma proviral (U3-LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos polimorfismos destas regiões relacionando os mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM;

2. Caracterização molecular de genes do hospedeiro envolvidos no mecanismo de transativação por Tax (promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos infectados assintomáticos e com TSP/HAM;

3. Determinar a carga proviral nos indivíduos infectados, assintomáticos e com TSP/HAM, correlacionando estes resultados com as alterações genotípicas do hospedeiro.

QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NA

REGIÃO LTR VIRAL?

LTR GAG POL ENV X LTR

5’

3’

3’

5’

•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença.

•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes provirais envolvidos na patogenicidade de Tax.

•Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

U3 R U5

21-pb enhancer

ATT

TATA box

ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-IESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I

Sinal deSinal de poliadenilaçãopoliadenilação

3’ 5’

LTR GAG POL ENV X LTR

5’ 3’

TAX

CREB/ATF

TAX/CREB

5’

3’ 5’

3’

U3 R U5

LTR

TR

E 1

TR

E 2

TR

E 3

Transcrição

9032 pb

TRE - Elemento de resposta a TAX

Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da

Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ - 2005 )

POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 )

CHTLV n= 6

TSP/HAM total= 36 FNN n= 30

CHTLV n= 34 ASSINTOMÁTICOS POPULAÇÃO GERAL n=3 total= 52 FNN n=12 ACRE n= 3

CHTLV n= 18

Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32

ASSINTOMÁTICOS FNN n= 9 ACRE n= 2

Maior 45 anos CHTLV n=16 FNN n=3 total=20 ACRE n=1

RESULTADOS

Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb)

*A significance level p<0.05 value was calculated by x2 test

Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group. Comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).

Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: the -631-632C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017).

* A significance level p <0.05 value was calculated by x2 test

RESULTADOS PRELIMINARES

Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb)

• A mutação -632C>T está presente no grupo assintomático (19,2%; p=0.024).

• Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior que 45),

uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com maior idade (25%,

p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações entre variações gênicas específicas

e as diversas manifestações clínicas como ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000).

• Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do HTLV-1

poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de transcrição viral e

desenvolvimento da TSP/HAM.

• Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo

Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições –632 e –

452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas fora deste

grupamento.

QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS PROMOTORES DAS CITOCINAS?

•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença.

•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax.

• Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a patogenicidade do vírus;

•Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

IL-6

Células B

Células T

Células T citotóxicas

Células tronco hematopoiéticas

Diferenciação e secreção de anticorpos

Produção de IL-2 e de receptor de IL-2

Atividade estimuladora

de colônia

Potencializa a diferenciação na presença de IL-2 e IFN-

Co-estimulante

IL-6

http://adams.mgh.harvard.edu/Reeves/Research%20Images/Cytokinealign.jpg6

http://www.nature.com/emboj/journal/v16/n5/thumbs/7590092f1.jpg

IL-6

IL-1

TNF-

fator de crescimento

derivado de plaquetas

endotoxinas

infecção viral

+

+

+

-

glicocorticóides

esteróides

Ativação de macrófagos e células T

Crescimento e diferenciação de

células B

Resposta de fase aguda

Hematopoiese+

+

Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos.

Infeçção, estresse, trauma: níveis

Menopausa e andropausa: níveis

Ershler WB & Keller ET, 2000

Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/ resistência a algumas doenças lupus, artrite reumatóide, diabetes, artrite juvenil

Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP podem afetar a transcrição e a produção de citocinas

fenótipos alto, intermediário e baixo produtor.

Fishman et al, 1998

A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002; Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002).

ORIGEM GENÉTICA Susceptibilidade a várias doença

ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS

-174 -145 -73 -26 +1

-634 -597 -572 -174

NF-B TATA

NFIL6

-158 -145

G CG C

Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois

polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição

MRE

Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6

induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como

IL-1 e TNF-

Adaptado de Terry et al, 2000

G C

G A

A freqüência de –174G/C IL-6 é altamente heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al. 1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002; Yamada et al. 2003).

http://www.icviacilea.it/pagine/giornalino/giornale

SNP –174 (GC): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998), mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000), desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002).

SNP -634 (GC): progressão da nefropatia diabética (Kitamura et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al, 2001).

Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados com HTLV-I

População do Japão

diferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6 na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).

Pergunta:

Existe associação desses Polimorfismos com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia, Brazil?

G A GG

GC CC T ?

Resultado 1: 3 populacões brasileiras

293 amostras coletadas entre 1997 e 2001:

100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003);

94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de Joinville (Grimaldi et al. 2002);

99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al. 2002)

http://www.giemmegi.org/images/indios-1.jpg

http://www.nippobrasil.com.br/3.turismo.br/

http://www.firststudy.ch/schools/images_gross/Baiana.jpg

ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN-6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC GROUPS.

Gadelha, S.R. 1; Alcântara, L.C.J. 1,2; Costa, G.C.S. 1; Rios, D.L. 1; Galvão-Castro, B. 1,2

1 Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Ba;

2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências.Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations

Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições –634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras.

GGN (%)

GCN (%)

GCN (%)

GN (%)

CN (%)

-634

Salvador 68 (68.0) 30 (30.0) 02 (2.0) 166 (83.0) 34 (17.0)

Tiriyó 18 (18.2) 52 (52.5) 29 (29.3) 88 (44.4) 110 (55.6)

Joinville 87 (92.6) 7 (7.4) - 181 (96.3) 07 (3.7)

-174

Salvador 71 (71.0) 25 (25.0) 04 (4.0) 167 (85.2) 29 (14.8)

Tiriyó 94 (94.9) 5 (5.1) - 193 (97.5) 5 (2.5)

Joinville 43 (45.75) 33 (35.1) 18 (19.15) 119 (63.3) 69 (36.7)

*2: 147.648, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica)

2: 76.100, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).

Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil    Salvador

(n*=200)%

Tiriyó (n*=198)

%

Joinville (n*=188)

%

       

-634G/-174G 66.5 42.8 59.1

-634G/-174C 16.5 1.6 37.2

-634C/-174G 17.0 54.8 3.7

-634C/-174C - 0.8 -

 *n= número de cromossomosSalvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001

 •Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002; ## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998

Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C nos principais grupos étnicos

Africanos/

Afro-descendentes%

Asiaticos/ Ameríndios

%

Europeus/ Europeus-

descendentes %

IL-6-174

G 89.7 - 90.7*,#

(83.5) 95.5 – 100#,**,##,&

(97.5)61.7#

(63.3)

C 9.3 - 10.3*,# (16.5)

0.2 - 4.5#,**,##,&

(2.5)

38.3#

(36.7)

As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três

populações.

As frequências dos haplótipos variaram significativamente (p<0.0001) (Tabela 2).

A maior frequência do alelo C na posição –174 em descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela 3).

Resultados e Discussão

Polimorfismos X Grupos étnicos

A frequência do alelo C na posição –174 em amostras de Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com dados históricos que mostram a importância da contribuição africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS 2003; Alcantara et al., AIDS 2006).

A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa observada para populações de origem asiática (Tabela 3). Estes dados são consistentes com a teoria da origem asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga et al. 2001).

Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G C no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em populações asiáticas.

Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo nestes grupos étnicos.

Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634 GC e -174GC).

Resultados 2

Polimorfismos nos promotores dos genes da interleucina-6 em indivíduos infectados de

SALVADOR. Existe associação com o desenvolvimento de doença neurológica?

Manuscrito em fase final

de preparação

Tipo de estudo: Corte-transversal

População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), confirmadamente positivos.

Número de amostras analisadas:

Indivíduos assintomáticos: 84

Pacientes com HAM/TSP: 26

Sintomáticos: 23

Soronegativos: 100

Idade (Mediana)

HAM/TSPOligosintomáticos

52.5 anos51 anos

Assintomáticos 38 anos

Gênero

HAM/TSP: 26MasculinoFeminino

Assintomáticos: 84

09 (34.6%)17 (65.4%)

MasculinoFeminino

31 (36.9%)53 (63.1%)

Oligosintomáticos: 24

MasculinoFeminino

09 (39.1%)14 (60.9%)

Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia.

HTLV-1 positivoN (%)

HTLV-1 negativoN (%)

Posição –634

Alelo G 246 (89.1) 166 (83)

Alelo C 30 (10.9) 34 (17)

Posição –174

Alelo G 240 (87.0) 167 (85.2)

Alelo C 36 (13.0) 29 (14.8)p>0.05

AssintomáticoN (%)

HAM/TSPN (%)

Posição –634

Alelo G 152 (90.5) 41 (78.8)

Alelo C 16 (9.5) 11 (21.2)

Posição –174

Alelo G 145 (86.3) 49 (94.2)

Alelo C 23 (13.7) 03 (5.8)

Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em indivíduos soronegativos

-174GC - do alelo G e do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X assintomáticos: p=0.14

-634GC - Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5

Oligosintomático

N%

43 (93.5)

06 (6.5)

36 (78.3)

10 (21.7)

Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. 

HAM/TSP

n(%)

OLIGOSSINTOMÁTICOS

n(%)

ASSINTOMÁTICOS

n(%)

-634GG/-174GG* 13 (50) 13 (56.5) 52 (61.9)

-634GG/-174GC 01 (3.8) 05 (21.7) 13 (15.5)

-634GG/-174CC - 02 (8.7) 03 (3.6)

-634GC*/-174GG* 10 (38.5) 02 (8.7) 13 (15.5)

-634GC*-174GC 02 (7.7) 01 (4.4) 02 (2.4)

-634GC*/-174CC - - 01 (1.1)

*genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP

-597 G/A

Monomórfico: todas as amostras foram GG

-572 G/C

A três genótipos G/A (3.8%).

Todos os demais G/G (96.2%)

Promotor de IL-2:

20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região onde NF-B se liga

10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado

Carga proviralhttp://www.monografias.com

http://www.tthhivclinic.com/

14 pacientes HAM/TSP

53 assintomáticos

Carga proviral (número de cópias/106cels)

HAM/TSP X Assintomáticos

núm

ero

de c

ópia

s/10

6 cel

s

Mann-Whithney: p=0.0001

Mann-Whithney: p=0.66

-634 G/C

Mediana GG: 28665 cópias/106 céls

GC: 20624 cópias/106 céls

Carga proviral X Genótipo na posição -634 do promotor de IL-6

Mann-Whithney: p=0.97

Carga proviral X Genótipo na posição -174 do promotor de IL-6

-174 G/C

Mediana GG: 22189 cópias/106 céls

GC: 20945 cópias/106 céls

núm

ero

de c

ópia

s/10

6 cel

s

núm

ero

de c

ópia

s/10

6 cel

s

Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador)

Sandra Rocha Gadelha (Doutorado)

Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado)

Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado)

Cinara Carvalho(Apoio técnico);

Simone Kashima (Colaborador)

Anne-Mieke Vandamme (Colaborador)

Ceuci Nunes (Clínica)

Rodrigo Gaspar (Administração do projeto)

Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP)

FAPESB