Crescimento mirobiano

8/6/2019 Crescimento mirobiano

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Crescimento mirobiano

Curva de crescimento

(cultura descontnua)

Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado,pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida emdiferentes etapas: lag, log, estacionria e de declnio.

Curva de Crescimento Padro, em um sistema fechado

Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo dapopulao. Ao contrrio, um perodo onde o nmero de organismospermanece praticamente inalterado. Esta fase apenas observada quando oinculo inicial proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorreporque as clulas de fase estacionria encontram-se depletadas de vriascoenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio.

A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos(choque trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so

transferidas de um meio rico para outro de composio mais pobre, devido anecessidade de sntese de vrias enzimas. Assim, durante este perodoobserva-se um aumento na quantidade de protenas, no peso seco e notamanho celular.

Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas,absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e seduplicando. Deve ser levado em conta tambm que neste momento, aquantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa decrescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do

organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamenteque eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas de tempo de gerao.Geralmente, ao final da fase log, as bactrias passam a apresentar fentipos


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novos, decorrentes do processo de comunicao denominado "quorumsensing".

Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos

txicos esto tornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h umcrescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na fase estacionria queso sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos ealgumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias.Foram detectados alguns genes (sur) que so necessrios sobrevivnciadas clulas na fase estacionria. Alm destes, existem outros genes (fatores alternativos da RNA polimerase, protenas protetoras contra danooxidativo).

Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outrasainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamenteconstante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lisecelular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podemrepercutir na populao como um todo. As prprias condies ambientaistendem a promover variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas.

Efeito dos fatores ambientais no crescimento

O crescimento dos microrganismos grandemente afetado pelas condiesfsicas e qumicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podeminfluir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo emquesto.

Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais queinfluenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que h um aumento da

temperatura, as reaes qumicas e enzimticas na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, emdeterminadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao deprotenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular.Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura ondedesenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemosdeterminar as temperaturas mnima, tima e mxima (temperaturascardeais), para cada microrganismo. A temperatura mxima provavelmentereflete os processos de desnaturao mencionados acima, enquanto osfatores que determinam a temperatura mnima ainda no so bem

conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatoresdeterminantes destes nveis trmicos baixos.


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Temperaturas cardeais dos microrganismos(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade defaixas de temperatura, onde para alguns o timo encontra-se entre 5 e 10C,enquanto para outros de 90 a 100C. Assim, os microrganismos podem serclassificados em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura:psicrfilos (0 a 20C, timo de 15C - Flavobacterium), mesfilos (12 a45C, 37C - E. coli), termfilos (42 a 68C, 62C - Thermococcus), ehipertermfilos (80 a 113C, 105C - Pyrodictium brockii).

Tipos de bactrias em relao temperatura(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Psicrfilos: os ambientes frios so predominantes na Terra (oceanos, polos,solos) entretanto este grupo (bactrias, fungos e algas) muito pouco

estudado. Destes, os mais conhecidos so as algas que crescem sob o geloou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando colorao vermelha.H os microrganismos psicrotolerantes que so aqueles cujo timo


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encontra-se entre 20 e 40C e que sobrevivem a 0C. So um grupo amplo(bactrias, fungos, algas e protozorios) que podem contaminar alimentos eoutros substratos refrigerados.

Mesfilos: crescem numa faixa de 20 a 40C, com um timo em torno de

37C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais desangue quente.

Termfilos e Hipertermfilos: timos de 45 e 80C, respectivamente.So encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo ocenico, emfontes. Geralmente so procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes,apresentando enzimas e protenas termoestveis, provavelmente devido substituio de aminocidos, conferindo um novo folding. Tm tambm umamaior concentrao de cidos graxos saturados na MC. As Archaea no temcidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentescomprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas aglicerol fosfato, por ligao ter.

Os termfilos e hipertermfilos tem grande interesse biotecnolgico porquetendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminao poroutros microrganismos e possuem enzimas mais termoestveis.

pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta ocrescimento de diferentes tipos de microrganismos. Bactrias - faixa entre 7,com algumas acidfilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com timo entre 2 e 3,5) eoutras alcaliflicas (Bacillus eArchaea). Fungos - tendem a ser mais acidfilos

que as bactrias (pH


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Tenso de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez queos microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendoclassificados como aerbios, anaerbios facultativos, anaerbios estritos,anaerbios aerotolerantes e microaerfilos (requerem concentraes baixas

de O2).As condies de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentesredutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sdio, que reagecom o oxignio, formando gua; pela remoo mecnica do oxignio, sendosubstitudo por nitrognio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo"GasPak", que gera hidrognio e CO2 com um catalisador de paldio.Adiciona-se gua ao sistema, a qual gera hidrognio, que reage com ooxignio na superfcie do catalisador, formando gua; ou ainda pelo uso de"glove box" anaerbias ou a mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.

Classes de organismos, em relao tenso de oxignio(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

gua: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejamvariadas. o solvente universal, mas sua disponibilidade varivel (soluescom acares ou sais tm menos gua disponvel).

Aw: presso do vapor em equilbrio com a soluo/ pv da gua, variando de 0a 1. Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de gua baixa desenvolvem mecanismos para extrair gua do ambiente, peloaumento da concentrao de solutos internos, seja bombeando ons para ointerior ou sintetizando ou concentrando solutos orgnicos (solutoscompatveis), que podem ser aucares, lcoois ou aminocidos (prolina,betaine, glicerol).

Presso osmtica: Fator extremamente importante, principalmente a partirdo maior conhecimento sobre as Archaea, visto que vrios membros destedomnio requerem altas concentraes de sais para seu desenvolvimento.


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Classes de organismos, em relao salinidade(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Fatores adicionais:Fonte luminosa para fototrficos autotrficos.

Presso atmosfrica, para aqueles que vivem em profundidades.

Medidas do crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentestcnicas, tais como pelo acompanhamento da variao no nmero ou pesode clulas, por exemplo. Dentre as diferentes tcnicas utilizadas,descreveremos alguns exemplos.

Contagem total de clulas: esta metodologia envolve a contagem diretadas clulas em um microscpio, seja de amostras fixadas (e coradas) ouanalisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 l da suspenso, namaioria dos casos), utilizando-se cmaras de contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a impossibilidade de

distino entre clulas vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo usode corantes vitais, para leveduras) e contagens errneas, devido spequenas dimenses de algumas clulas, ou pela formao de agregadoscelulares.Em preparaes no coradas, deve-se utilizar microscpio de contraste defase, o qual deve ser empregado apenas quando as clulas no esto muitodiludas (


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Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

H tambm os contadores eletrnicos (do tipo Coulter) usados emhematologia, que podem ser empregados na contagem de clulasmicrobianas. Em determinadas situaes, por exemplo quando se requer

apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregara contagem proporcional, que corresponde a uma anlise comparativa dasculturas com suspenses padro. Como exemplo de uma suspenso padropodemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma srie detubos contendo uma soluo de BaSO4 em diferentes concentraes,apresentando assim, graus de turvao distintos. Desta forma, comparando-se a turvao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-seobter uma estimativa do nmero de clulas presentes na amostra.

Contagem de viveis: Procedimento tambm conhecido como contagem

em placa, que estima o nmero de clulas viveis (isto , capazes de sereproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alquotasde uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quaisso ento inoculadas em meio slido. Aps a incubao dos meios,geralmente por uma noite, o nmero de colnias contado. Como umacolnia normalmente originada a partir de um organismo, o total decolnias que se desenvolvem no meio corresponde ao nmero de clulasviveis presentes na alquota analisada. Esta tcnica deve sempre realizadaempregando-se vrias diluies (100 a 104 clulas) das amostras. Acontagem de viveis pode ser feita pela semeadura em superfcie ou em

profundidade ("pour plate"). Geralmente o volume a ser inoculado no deveultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluncia das colnias. Se a tcnica desemeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 mlde clulas. Esta tcnica precisa quando o nmero de colnias (ou placas delise, no caso de partculas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quandoas condies culturais e ambientais esto adequadas para os microrganismosanalisados. Este tipo de contagem est sujeito a grandes erros (agregados,duas clulas prximas, originando uma colnia), que podem ser minimizadospela realizao de triplicatas para cada diluio. Esta metodologia amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixosnmeros de clulas e permitindo tambm a contagem de diferentes tipos demicrorganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem ocrescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos


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e diferenciais (meios que alm de favorecerem o desenvolvimento de umtipo ou grupo de organismo, tambm permite sua distino, a partir dealguma caracterstica fenotpica). Tambm podem ser usadas membranasfiltrantes, onde os lquidos so filtrados e as membranas colocadasdiretamente sobre os meios de cultura.

Tcnica de contagem de viveis(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de clulas: pode ser determinada a partir da estimativa do pesoseco ou do peso mido de uma cultura. Este tipo de procedimento realizado quando no necessrio determinar o nmero preciso demicrorganismos presentes.

Peso seco: Muito utilizado na quantificao de fungos, onde o miclio retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido secagem. Realizam-se ento sucessivas pesagens, at o momento onde noobserva-se mais variaes. Este procedimento pode tambm ser realizadocentrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou ento secando-o (100- 150C/16 horas) e depois pesando-o.

Turbidimetria: quantificao em espectrofotmetro ou colormetro a 660

nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dosmeios de cultura no interfere com os resultados. Nestes comprimentos, aabsoro de luz por componentes celulares corados desprezvel, mas, se


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necessrio, outros comprimentos de onda podem ser usados. Talmetodologia requer a confeco de uma curva padro. Embora a anliseturbidimtrica seja menos sensvel, de rpida e fcil execuo, nodestruindo a amostra. Entretanto, no permite a determinao de clulasviveis.

Anlises qumicas: A partir da quantificao de protenas ou de nitrognio,ou por meio da anlise de diferentes atividades metablicas.

Nmero Mais Provvel (NMP): Amplamente utilizado em laboratrios demicrobiologia de alimentos ou ambiental, na quantificao demicrorganismos em gua, leite e outros produtos. Esta metodologia basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformesfecais, que so microrganismos indicadores de poluio fecal, o que pode tercomo consequncia a presena de outros organismos, tais como protozoriose vrus. Esta tcnica foi desenvolvida aps anlises estatsticas complexas. Adeterminao do NMP realizada inoculando-se 3 sries de 5 tubos, com 10,1 e 0,1 ml da gua ou do produto homogeneizado em soluo salina, emmeios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidosem seu interior. Estes so incubados por 48 hs/37C sendo ento analisadosquanto ao crescimento e presena de gs no interior dos tubos de Durham.Tal resultado considerado como positivo para a presena de coliformestotais. Amostras dos tubos positivos so ento repicados para caldosseletivos para coliforme fecais, tambm contendo tubos de Durham, os quais

so incubados por mais 24 ou 48 hs a 42C. De todos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificaobioqumica. De acordo com o nmero de tubos que apresentam gsdetermina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins(1934). Este um teste apenas presuntivo para a presena de coliformes.

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