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Cromatografia em Fase Gasosa e
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Aplicabilidade e Requisitos
Instrumentação Básica
Colunas e Detectores
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos da Cromatografia. Campinas, SP: Unicamp, 2006. capítulo 8.
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel Separação
Cromatografia
Detecção
Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à
temperaturas controladas
Fase móvel: gás inerte
Detector: submetido à temperatura controlada
Injetor: submetido à temperatura
controlada
Cromatografia em Fase Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos
oxida / hidrolisa algumas FE
incompatíveis com DCE H2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC
Cromatografia em Fase Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito
caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:
He , H2 DCT
DIC N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CUSTO
PUREZA
A B
C A = 99,995 %
B = 99,999 %
C = 99,9999 %
Cromatografia em Fase Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea
Injeção lenta
t = 0
t = x
t = 0
t = x
Cromatografia em Fase Gasosa
Injetor “on column”
1
2
3
4
1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica
Cromatografia em Fase Gasosa
Injetor “on column”
1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.
2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.
3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
Cromatografia em Fase Gasosa
Parâmetros de injeção
Cromatografia em Fase Gasosa
Temperatura do injetor: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
Volume da injeção: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.
COLUNA Amostras Gasosas
Amostras Líquidas
empacotada = 3,2 mm (1/4”)
0,1 mL ... 50 mL 0,1 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 1 L ... 100 L 0,01 L ... 3 L
Sólidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a solução
Cromatografia em Fase Gasosa
Colunas
EMPACOTADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do
recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de
FE líquida ou sólida
Cromatografia em Fase Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
p0 = f Estrutura química do analito
Temperatura da coluna
Temperatura da
coluna
Pressão de
vapor
Velocidade de
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)
Cromatografia em Fase Gasosa
Temperatura da coluna
AU
ME
NT
O D
A
TE
MP
ER
AT
UR
A D
A C
OL
UN
A
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia em Fase Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
Componentes mais voláteis são separados;
Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos.
TCOL ALTA:
Componentes mais voláteis não são separados;
Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente.
Cromatografia em Fase Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
Consegue-se boa separação dos
componentes da amostra em menor
tempo
TEMPO
TEM
PERATURA
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
TINI - Temperatura Inicial
TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotérmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia em Fase Gasosa
Programação linear de temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Cromatografia em Fase Gasosa
Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes da amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
Cromatografia em Fase Gasosa
Fase estacionária sólida
O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
• Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
ADSORÇÃO
Cromatografia em Fase Gasosa
Fase estacionária líquida
O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
• Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
ABSORÇÃO
Cromatografia em Fase Gasosa
Fase estacionária quirais
As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos.
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
Cromatografia em Fase Gasosa
Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais: 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC. 5. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 8. Não destrutivo.
Cromatografia em Fase Gasosa
Detectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
REGISTRO DE
SINAL
ANALÓGICO Registradores XY
DIGITAL Integradores Computadores
Cromatografia em Fase Gasosa
Detectores
UNIVERSAIS: Geram sinal para
qualquer substância eluída.
SELETIVOS: Detectam apenas
substâncias com determinada
propriedade físico-química.
ESPECÍFICOS: Detectam
substâncias que possuam
determinado elemento
ou grupo funcional em suas
estruturas
DCT (condutividade térmica)
DCE (captura eletrônica)
DNP
(nitrogênio e fósforo)
Detector por Ionização de Chama
O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.
Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica.
Quase todos os compostos orgânicos podem ser detectados pelo DIC (detector mais usado em CG)
Cromatografia em Fase Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.
Detecção TIC
(cromatograma íons totais)
Universal
Similar a DCT
SIM (cromatograma de íons selecionados)
Seletivo
Maior Sensibilidade
Cromatografia em Fase Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC
Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.
Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia em Fase Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
Cromatograma de íons selecionados: SIM
Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.
MASSA / CARGA
CONTAGENS
Oferece a vantagem de registrar
somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os
demais.
Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia em Fase Gasosa
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG EM
Vácuo
Separador Molecular O gás de arraste leve
(He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado
para o vácuo.
Câmara de Ionização
Coluna Capilar
Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de
arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.
Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia em Fase Líquida
30
SHIMADZU
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL: É aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia em Fase Líquida
Tipos e
Aplicações da
Cromatografia
Líquida
Insolúvel em água Solúvel em água
Aumento de polaridade
Polar não iônico
Apolar Iônico
Mas
sa m
olecu
lar
102
103
104
105
106
Troca iônica
Partição
Partição em fase reversa
Partição em fase normal
Exclusão Permeação
em gel Filtração em gel
Adsorção
Componentes típicos - CLAE
Cromatografia em Fase Líquida
Cromatografia em Fase Líquida Esquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia em Fase Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de
bombas de pistão ou de diafragma)
Cromatografia em Fase Líquida
Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 L
Microamostragem: 0,5 a 5 L
Sistemas de injeção de amostras
Eluição isocrática: Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante;
Eluição com gradiente: São utilizados dois ou três sistemas
de solventes que diferem bastante entre si em polaridade; Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é
variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.
Cromatografia em Fase Líquida
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.
Fase móvel para CLAE
Cromatografia em Fase Líquida Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa
Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia em Fase Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre sí no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia em Fase Líquida
Colunas para CLAE
Pré-coluna
Remoção de material particulado
Contaminantes do solvente
Contaminantes da amostra
Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna
COLUNAS TÍPICAS
Material: aço inox
Comprimento: 10 a 30 cm
Diâmetro: 4 a 10 mm
FE: Partículas de 5 a 10 m
Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
Cromatografia em Fase Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
- 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 m
Coluna de alta velocidade e
alta eficiência
FM: 4,1% AcOEt em n-Hexano
100.000 pratos/metro
• Pelicular: Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: Sílica Alumina Resina de poliestireno-divinil-benzeno Resina trocadora de íons
• Partícula porosa: Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de
3 a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia em Fase Líquida
Basicamente são dois tipos de FE:
Fase estacionária para CLAE
Cromatografia em Fase Líquida
Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante
dielétrica). Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais: 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6. Similaridade de resposta para todos os solutos. 7. Não destrutivo. 8. Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Cromatografia em Fase Líquida
Detectores
Absorbância - UV/Vis – S: 10-9g/mL
Fluorescência – S: 10-9 a 10-12g/mL;
Índice de refração (universal)–S: 10-7g/mL
Cromatografia em Fase Líquida
Detectores
Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL
Cromatografia em Fase Líquida
Detectores Espectrometria de massas - universal
Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação
Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
Cromatografia em Fase Líquida
Detectores • Espectrometria de massas
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TEMPO
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TIC SIM
Cromatografia em Fase Líquida
Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia em Fase Líquida
Tipos de CLAE
PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar FM apolar O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar FM polar O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da
polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Cromatografia em Fase Líquida
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
Cromatografia em Fase Líquida
Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos