Aula 4PCR e Primer DesignAgradecimento: Alguns destes slides foram modificados da palestra ministrada por Li Liu, M.D. Centro Interdisciplinar para Pesquisas em Biotecnologia. Universidade da Florida 10 de Junho de 2003

PCR

PCR

PCR

PCR

Caractersticas desejveis em um Primer Temperatura de melting (Tm) na faixa de 52 C a 65 C. Ausncia da capacidade de dimerizao. Ausncia significativa da formao de grampos (>3 bp). Inexistncia de stios secundrios de anelamento dos primers. Baixa especificidade na ligao na extremidade 3' (ie. Menor contedo de GC para promover mispriming).

Uniqueness- Deve existir somente um stio de pareamento no DNA molde onde ocorra a ligao do primer, o que significa que a seqncia dos primers nica na seqncia do DNA molde. - No devem existir stios de anelamento em possveis fontes de contaminao, tais como o ser humano, rato, cobaia, etc. (busca BLAST no genoma correspondente). Template DNA5...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 A TGCT AGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCTAAGTTG

Primer candidate 1 Primer candidate 2

5-TGCTAAGTTG-3 5-CAGTCAACTGCTAC-3

NOT UNIQUE! UNIQUE!

Comprimento- O comprimento do primer influencia a uniqueness e as temperaturas de melting e anelamento. - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores sero as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer no deve ser inferior a 15 bases para assegurar a uniqueness. Geralmente, ns sintetizamos primers com 17-28 bases de comprimento. - A existncia desta faixa est baseada no fato de se buscar unique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.

Composio de Bases- A composio de bases afeta a especificidade da hibridizao, as temperaturas de melting e anelamento, e a estabilidade interna. - Composio de bases randmica prefervel. Sempre que possvel devem ser evitadas longas regies ricas em (A+T) e (G+C).Template DNA 5...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3TGCCCG ATCATGC GCCCG T

- Geralmente, a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60% para assegurar-nos as temperaturas de melting e anelamento adequadas reao de PCR, e, desta forma, fornecer estabilidade na hibridizao. Porm, as temperaturas de melting e anelamento e a estabilidade na hibridizao so afetadas por outros fatores, os quais ns discutiremos mais tarde. Therefore, (G+C) content is allowed to change.

TGCCCG GCCCGATCATGCT

Temperatura de Melting-Temperatura de Melting, Tm a temperatura na qual metade das fitas de DNA est na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hlice. - Tm dependente da composio do DNA, de modo que aumento do contedo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior nmero de ligaes de H. Determinao (Composio de Base): Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) - 600/comprimento Outros mtodos mais precisos so disponveis.

Temperatura de AnelamentoTemperatura de anelamento, Tanneal a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm .

Tanneal = Tm_primer 4CPara assegurar que o pareamento dos primers ao DNA molde ocorra antes que as duas fitas se liguem uma a outra, necessrio que: Tm_product Tanneal 30 C .

Estringncia no Anelamento do Primer-A estringncia determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado. -Tanneal o fator mais significante que afeta a estringncia no anelamento do primer. Tanneal : muito baixa em qualquer lugar. parear. muito alta menor estringncia maior estringncia primer pareia primer pode no

Outros fatores: GC%: pares de GC so mais estringntes que pares de AT. Concentrao de sais & tampo.

Estrutura InternaSe os primers puderem parear com eles mesmos, ou parearem um com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, ento a eficincia do PCR ir ser reduzida significativamente. Primers com estas caractersticas devem ser evitados.

Entretanto, s vezes estas duas estruturas no so problemticas, uma vez que a ocorrncia destas pode ser restringida atravs da determinao da temperatura de anelamento. Por exemplo, alguns dmeros ou grampos so formados a 30 C, enquanto que durante o ciclo do PCR a temperatura mais baixa seja de 60 C.

Primer Pair Matching- Primers trabalham em pares forward primer e reverse primer. Uma vez que eles so usados na mesma reao de PCR, ser preciso que as condies do PCR estejam adequadas ao funcionamento de ambos. - Um ponto crtico so suas temperaturas de anelamento, as quais devero ser compatveis entre si. A mxima diferena que pode ser obervada entre elas de 3 C. The closer their Tanneal are, the better.

Resumo ~ Quando um primer um primer?5 5 3 3

5

3 3

5

Resumo ~ Critrios para Primer Design1. 2. 3. Uniqueness: assegurar o pareamento correto dos primers; Comprimento: 17-28 bases. Esta faixa varivel; Composio de bases: a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60%; se possvel devem ser evitadas longas regies ricas em (A+T) e (G+C); Otimizando o pareamento de bases: crtico que a estabilidade da extremidade 5 seja maior que a da 3 para minimizar erros no pareamento. Tm entre 55-80 C desejvel; Esteja certo que os primers a serem usados em uma mesma reao de PCR tenham temperaturas de anelamento com uma diferena entre elas que no seja superior a 2 3 C. Minimizar estruturas secundrias internas: grampos e dmeros no so desejveis.

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Computer-Aided Primer DesignPrimer design is an art when done by human beings, and a far better done by machines. machines Alguns programas para primer design que ns utilizamos: - Oligo: Life Science Software, standalone application. - GCG: Accelrys, ICBR maintains the server. - Primer3: MIT, standalone / web application http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi - BioTools: BioTools, Inc. ICBR distributes the license. - Others: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program, etc. Software para determinao da temperatura de melting:- BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm

TaskDesenhar um par de primers para a seqncia NM_203378 no NCBI GenBank, ento a seqncia que codifica a human myoglobin ser amplificada usando PCR. Entre 156..620

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Primers UniversaisPrimers podem ser desenhados para amplificarem apenas um produto. Primers tambm podem ser desenhados para amplificarem mltiplos produtos. Ns chamamos tais primers de primers universais. Por exemplo, os primers desenhados para amplificarem todos os genes HPV. Estratgia: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Alinhar grupos de seqncias que voc quer amplificar. Encontrar a regio mais conservada entre as extremidades 5 e 3. Desenhar o forward primer na regio conservada na poro 5. Desenhar o reverse primer na regio conservada na poro 3. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par. Garantir uniqueness em todas as seqncias molde. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.

Primers Semi-UniversaisPrimers podem ser desenhados para amplificarem apenas um subgrupo de seqncias-molde pertencentes a um grande grupo de seqncias similares. Por exemplo, desenhar um primer para amplificar o gene HPV tipos 1e 6, e no amplicar os demais. Estratgia: 1. Alinhar todos os tipos de genes HPV. 2. Identificar um subgrupo de genes que so mais similares entre si que em relao a outros subgrupos. Neste caso, os tipos 1 e 6. 3. Encontrar as regies 5 e 3 que so mais conservadas entre o tipo 1 e o tipo 6, mas que sejam variveis nos outros tipos. 4. Desenhar forward primers na regio 5 e reverse primers na regio 3. 5. 6. 7. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par. Garantir uniqueness em todas as seqncias molde. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.

Primers Degenerados /Guessmer- Em alguns casos, as seqncias de DNA no esto disponveis ou so difceis de serem alinhadas. Ento, uma ou um grupo de protenas podem ser escritas como uma seqncia de nucleotdeos e utilizadas como molde para desenhar primers/probes. Ns denominamos estes primers de guessmer. - Transcrever protenas em nucleotdeos problemtico e, ao mesmo tempo, o recurso disponvel em alguns casos. Uma vez que o cdigo gentico degenerado, diferentes organismos apresentam preferential biases no cdon correntemente usado, os quais podem ser usados para minimiz-los quando da converso da seqncia de aminocidos na de nucleotdeos.

GuessmerEstratgia: Transcrever protenas em nucleotdeos usando o cdigo correspondente da tabela de cdons. Identificar regies 5 e 3 que apresentem a menor variabilidade possvel. Design e match forward/reverse primers como visto anteriormente. Os primers devero possuir em torno de 30 bases de comprimento em contrapartida das bases mismatched reduzirem a especificidade na hibridizao. Utilize elevada temperatura de anelamento para aumentar a estringncia do primer durante o pareamento.

Resumo ~ Primer Design AvanadoPrimers podem ser desenhados no intuito de serem empregados com diferentes propsitos. Primer universal, primer semi-universal e guessmers so alguns deles. Existem outras vrias situaes onde a experincia em primer design so requeridas, tais como real-time PCR (PCR em tempo real), estudo de polimorfismo em populaes (microsatellite, AFLP, SNP ), e internal probe design, dentre outros. Entretanto, as regras bsicas a serem sempre empregadas so: Conseguir que a estabilidade e a especificidade na hibridizao sejam adequadas.