DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA … Lara.pdf · A todos os professores do curso de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
Laboratoacuterio de Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia LAFIP-NANOTEC
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Aluno Lara Ferreira Paraiso
Orientadora Profa Dra Ana Graci Brito Madurro
Co-orientador Prof Dr Joatildeo Marcos Madurro
Uberlacircndia - MG
2011
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Dissertaccedilatildeo apresentada ao
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Geneacutetica e Bioquiacutemica do Instituto
de Geneacutetica e Bioquiacutemica da
Universidade Federal de Uberlacircndia
como requisito agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo
de mestre em Geneacutetica e
Bioquiacutemica
Orientadora Profa Dra Ana Graci Brito Madurro
Co-orientador Prof Dr Joatildeo Marcos Madurro
Uberlacircndia - MG
2011
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo na Publicaccedilatildeo (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU MG Brasil
P222d
Paraiso Lara Ferreira 1986- Desenvolvimento de biossensor enzimaacutetico para diagnoacutestico de lesatildeo no tecido hepaacutetico [manuscrito] Lara Ferreira Paraiso ndash 2011 62 f il Orientadora Ana Graci Brito Madurro Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Universidade Federal de Uberlacircndia Progra- ma de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica Inclui bibliografia
1 1 Eletroquiacutemica - Teses 2 Fiacutegado ndash doenccedilas ndash Teses 3 Biossensores - Teses I Madurro Ana Graci Brito II Universidade Federal de Uberlacircndia Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica III Tiacutetulo CDU 5446
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Comissatildeo Examinadora
Presidente Ana Graci Brito Madurro
Examinadores Roney Santos Coimbra Sheila Cristina Canobre
Data da Defesa 26 07 2011 As sugestotildees da Comissatildeo Examinadora e as Normas PGGB para o formato da DissertaccedilatildeoTese foram contempladas
________________________________ Ana Graci Brito Madurro
iv
Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus
utiliza para mostrar a estrada
PPaauulloo CCooeellhhoo
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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chemical sensors and arrays Analytica Chimica Acta 614(1) 2008 1-26
72 Franco D L ldquoDesenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos utilizando
matriz polimeacuterica modificada com biomoleacuteculas para o diagnoacutestico de
26
cacircncer de proacutestata e hepatite Crdquo Tese de doutorado Universidade Federal
de Uberlacircndia Uberlacircndia 2011
73 Vieira SN Ferreira L F Franco DL Afonso AS Goncalves RA
Brito-MadurroAG Madurro JM ldquoElectrochemical modification of
graphite electrodes with poly(4-aminophenol)rdquo Macromolecular
Symposia2006 236-242
74 Franco DL Afonso AS Vieira SN FerreiraLF Goncalves RA Brito-
Madurro AG MadurroJM ldquoElectropolymerization of 3-aminophenol on
carbon graphite surfaceElectric and morphologic propertiesrdquo Materials
Chemistry and Physics 1072008 404-409
75 CastroM VieiraSN Gonccedilalves RA Brito-Madurro AG Madurro
JMrdquoElectrochemical and morphologic studies of nickel incorporation on
graphite electrodes modified with polytyraminerdquo Journal of Materials
Science432008 475-482
76 Ferreira LF Boodts JFC Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoGold
electrodes modified with poly (4-aminophenol) incorporation of
nitrogenated bases and an oligonucleotiderdquo Polymer International 57
2008 644-650
77 Ferreira LF Vieira SN Filho LRG Brito-Madurro AG Madurro
JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo
Journal of Materials Science 422007 3238-3243
78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC
Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
Engineering and Science 482008 2043-2050
79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG
Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Dissertaccedilatildeo apresentada ao
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Geneacutetica e Bioquiacutemica do Instituto
de Geneacutetica e Bioquiacutemica da
Universidade Federal de Uberlacircndia
como requisito agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo
de mestre em Geneacutetica e
Bioquiacutemica
Orientadora Profa Dra Ana Graci Brito Madurro
Co-orientador Prof Dr Joatildeo Marcos Madurro
Uberlacircndia - MG
2011
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo na Publicaccedilatildeo (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU MG Brasil
P222d
Paraiso Lara Ferreira 1986- Desenvolvimento de biossensor enzimaacutetico para diagnoacutestico de lesatildeo no tecido hepaacutetico [manuscrito] Lara Ferreira Paraiso ndash 2011 62 f il Orientadora Ana Graci Brito Madurro Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Universidade Federal de Uberlacircndia Progra- ma de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica Inclui bibliografia
1 1 Eletroquiacutemica - Teses 2 Fiacutegado ndash doenccedilas ndash Teses 3 Biossensores - Teses I Madurro Ana Graci Brito II Universidade Federal de Uberlacircndia Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica III Tiacutetulo CDU 5446
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Comissatildeo Examinadora
Presidente Ana Graci Brito Madurro
Examinadores Roney Santos Coimbra Sheila Cristina Canobre
Data da Defesa 26 07 2011 As sugestotildees da Comissatildeo Examinadora e as Normas PGGB para o formato da DissertaccedilatildeoTese foram contempladas
________________________________ Ana Graci Brito Madurro
iv
Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus
utiliza para mostrar a estrada
PPaauulloo CCooeellhhoo
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo na Publicaccedilatildeo (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU MG Brasil
P222d
Paraiso Lara Ferreira 1986- Desenvolvimento de biossensor enzimaacutetico para diagnoacutestico de lesatildeo no tecido hepaacutetico [manuscrito] Lara Ferreira Paraiso ndash 2011 62 f il Orientadora Ana Graci Brito Madurro Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Universidade Federal de Uberlacircndia Progra- ma de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica Inclui bibliografia
1 1 Eletroquiacutemica - Teses 2 Fiacutegado ndash doenccedilas ndash Teses 3 Biossensores - Teses I Madurro Ana Graci Brito II Universidade Federal de Uberlacircndia Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica III Tiacutetulo CDU 5446
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Comissatildeo Examinadora
Presidente Ana Graci Brito Madurro
Examinadores Roney Santos Coimbra Sheila Cristina Canobre
Data da Defesa 26 07 2011 As sugestotildees da Comissatildeo Examinadora e as Normas PGGB para o formato da DissertaccedilatildeoTese foram contempladas
________________________________ Ana Graci Brito Madurro
iv
Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus
utiliza para mostrar a estrada
PPaauulloo CCooeellhhoo
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA
INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR
ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO
TECIDO HEPAacuteTICO
Lara Ferreira Paraiso
Comissatildeo Examinadora
Presidente Ana Graci Brito Madurro
Examinadores Roney Santos Coimbra Sheila Cristina Canobre
Data da Defesa 26 07 2011 As sugestotildees da Comissatildeo Examinadora e as Normas PGGB para o formato da DissertaccedilatildeoTese foram contempladas
________________________________ Ana Graci Brito Madurro
iv
Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus
utiliza para mostrar a estrada
PPaauulloo CCooeellhhoo
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
iv
Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus
utiliza para mostrar a estrada
PPaauulloo CCooeellhhoo
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
7 REFEREcircNCIAS
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
v
A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo
exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila
humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor
e por estarem sempre presentes
AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
vi
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse
Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas
forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria
Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem
esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas
capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave
dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs
Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me
amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada
compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me
incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu
crescimento profissional Amo muito vocecirc
Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga
Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos
ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho
A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo
incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs
A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de
tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando
em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua
paciecircncia e compreensatildeo
Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees
cientiacuteficas deste trabalho
Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e
paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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graphite electrodes modified with polytyraminerdquo Journal of Materials
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nitrogenated bases and an oligonucleotiderdquo Polymer International 57
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77 Ferreira LF Vieira SN Filho LRG Brito-Madurro AG Madurro
JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo
Journal of Materials Science 422007 3238-3243
78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC
Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
Engineering and Science 482008 2043-2050
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Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
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AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
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detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
vii
muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas
Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos
inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que
fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho
A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana
Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas
Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus
amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo
seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos
sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram
paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e
orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre
A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento
compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo
Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei
A Capes pelo apoio financeiro
Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o
aprimoramento deste trabalho
A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por
contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento
profissional o MEU MUITO OBRIGADO
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
viii
IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2 xi
APRESENTACcedilAtildeO 1
CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2
1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3
2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS
RELACIONADAS 6
3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8
4BIOSSENSORES 8
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A
CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14
6OBJETIVOS 18
61 OBJETIVO GERAL 18
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18
7REFEREcircNCIAS 19
CAPIacuteTULO 2 28
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified
with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28
Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30
1 Introduction 31
2 Experimental Section 32
21 Apparatus 32
22 Chemical 32
23 Electrode surface modification 33
24 Thermal stability of the modified electrode 33
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
ix
26 Interference studies 33
27 Bioelectrode stability 34
3 Results and Discussion 34
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-
aminophenol) 34
32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic
force microscopy35
34 Detection of alanine aminotransferase 35
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36
36 Interference study 36
37 Electrode stability 37
4 Conclusion 37
Acknowledgments 37
References 38
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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Systems 292009 539-545
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Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
Acta 53 (2008) 6202-6208
[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
x
ABREVIATURAS
AGL Aacutecidos graxos livres
4-APP 4-aminoantypirine
AA Ascorbic acid
AFM Atomic force microscopy
ALT Alanina aminotransferase
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica
FAD Flavin adenine dinucleotide
Glu Glucose
Glut Glutamate
GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica
NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica
PyO Piruvato oxidase
RI Resistecircncia a insulina
SM Siacutendrome metaboacutelica
TAG Triacilgliceroacuteis
TPP Pyrophosphate
UA Uric acid
VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade
α ndashKG α-ketoglutarate
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada 14
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15
IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 2
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)
containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine 46
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence
or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
xii
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of
interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic
acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs
Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
1
APRESENTACcedilAtildeO
Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de
mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo
gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo
abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto
que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees
hepaacuteticas
O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na
detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser
realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se
destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico
de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes
dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta
sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter
dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para
detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor
eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite
modificado com poli (4-aminofenol)
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
2
CAPIacuteTULO 1
FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
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Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
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Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
3
1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO
O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo
Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do
diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos
cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de
sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do
coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes
satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)
As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como
ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do
volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que
constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de
revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]
Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a
metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama
de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]
Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado
exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos
desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe
sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as
drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na
circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo
do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos
carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]
A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas
desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo
alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e
siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
4
Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]
Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas
relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas
externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas
hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte
[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de
751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas
ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]
Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro
de 2011 nos estados brasileiros
RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade
TOTAL
4225
751
1778
Regiatildeo Norte 264 41 1553
Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713
Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992
Regiatildeo Sul 749 99 1322
Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066
Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS
(SIHSUS) [9]
Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um
modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
5
patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo
descritas e caracterizadas a seguir
Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar
acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente
triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos
os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de
aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto
que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de
proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose
pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute
relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento
incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2
(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]
Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais
comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de
epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do
peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e
natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica
induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA
geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)
hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]
Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da
EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de
inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A
predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante
proeminente em pacientes com NASH [15]
Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e
alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do
acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica
alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de
ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila
hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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72 Franco D L ldquoDesenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos utilizando
matriz polimeacuterica modificada com biomoleacuteculas para o diagnoacutestico de
26
cacircncer de proacutestata e hepatite Crdquo Tese de doutorado Universidade Federal
de Uberlacircndia Uberlacircndia 2011
73 Vieira SN Ferreira L F Franco DL Afonso AS Goncalves RA
Brito-MadurroAG Madurro JM ldquoElectrochemical modification of
graphite electrodes with poly(4-aminophenol)rdquo Macromolecular
Symposia2006 236-242
74 Franco DL Afonso AS Vieira SN FerreiraLF Goncalves RA Brito-
Madurro AG MadurroJM ldquoElectropolymerization of 3-aminophenol on
carbon graphite surfaceElectric and morphologic propertiesrdquo Materials
Chemistry and Physics 1072008 404-409
75 CastroM VieiraSN Gonccedilalves RA Brito-Madurro AG Madurro
JMrdquoElectrochemical and morphologic studies of nickel incorporation on
graphite electrodes modified with polytyraminerdquo Journal of Materials
Science432008 475-482
76 Ferreira LF Boodts JFC Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoGold
electrodes modified with poly (4-aminophenol) incorporation of
nitrogenated bases and an oligonucleotiderdquo Polymer International 57
2008 644-650
77 Ferreira LF Vieira SN Filho LRG Brito-Madurro AG Madurro
JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo
Journal of Materials Science 422007 3238-3243
78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC
Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
Engineering and Science 482008 2043-2050
79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG
Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
6
desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-
20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]
Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma
resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose
estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus
infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como
o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]
Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo
terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool
desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade
substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite
viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem
cronicamente [19]
Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de
hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking
de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento
outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada
hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]
A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da
avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um
meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das
enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel
e relevante para diagnosticar estas patologias
2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS
As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo
baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase
glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas
transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os
processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
7
mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em
outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo
comparado com a AST [22]
A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em
menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No
fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a
transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo
de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)
Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT
Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites
crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute
encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas
tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica
colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia
obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis
alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras
doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]
Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas
hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento
destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue
resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima
[26]
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
8
Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para
diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute
utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo
existente com as mesmas
3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT
A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no
plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado
os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal
sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]
As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem
de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a
espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser
realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-
de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos
anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos
minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos
simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade
nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos
com essas vantagens
4 BIOSSENSORES
Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no
campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento
financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um
sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica
variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a
anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]
O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um
material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos
DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
9
identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal
quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]
Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para
diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]
controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na
induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os
meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo
miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de
detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica
particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser
raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]
Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o
estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta
para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA
antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]
Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande
versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das
caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3
demonstra o esquema representativo de um biossensor
Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]
O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica
fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os
transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o
eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
10
ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos
processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes
de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do
analito [28]
Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos
biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados
como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as
suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e
grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie
O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute
denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste
material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores
(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos
aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]
Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute
imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo
divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e
Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos
biossensores pode ser entendido da seguinte maneira
Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de
funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)
ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores
pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando
a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento
direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]
Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou
oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de
hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo
das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores
reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio
[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
11
etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo
simples e duplas fitas [44]
Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage
especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do
receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para
aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por
exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos
cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]
Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o
transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das
funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito
que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]
reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no
monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos
similares
41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS
Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea
cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina
sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar
elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos
materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e
estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-
48]
Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos
cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para
desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros
ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados
substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de
aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo
responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
12
estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras
necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de
cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas
(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute
denominado de holoenzima [5051]
Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT
diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos
envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que
dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios
Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de
ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo
L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)
Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)
H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)
42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO
As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de
formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de
ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados
[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como
Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der
Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as
biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica
PyO
ALT
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
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cacircncer de proacutestata e hepatite Crdquo Tese de doutorado Universidade Federal
de Uberlacircndia Uberlacircndia 2011
73 Vieira SN Ferreira L F Franco DL Afonso AS Goncalves RA
Brito-MadurroAG Madurro JM ldquoElectrochemical modification of
graphite electrodes with poly(4-aminophenol)rdquo Macromolecular
Symposia2006 236-242
74 Franco DL Afonso AS Vieira SN FerreiraLF Goncalves RA Brito-
Madurro AG MadurroJM ldquoElectropolymerization of 3-aminophenol on
carbon graphite surfaceElectric and morphologic propertiesrdquo Materials
Chemistry and Physics 1072008 404-409
75 CastroM VieiraSN Gonccedilalves RA Brito-Madurro AG Madurro
JMrdquoElectrochemical and morphologic studies of nickel incorporation on
graphite electrodes modified with polytyraminerdquo Journal of Materials
Science432008 475-482
76 Ferreira LF Boodts JFC Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoGold
electrodes modified with poly (4-aminophenol) incorporation of
nitrogenated bases and an oligonucleotiderdquo Polymer International 57
2008 644-650
77 Ferreira LF Vieira SN Filho LRG Brito-Madurro AG Madurro
JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo
Journal of Materials Science 422007 3238-3243
78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC
Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
Engineering and Science 482008 2043-2050
79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG
Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
13
causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade
requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]
Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais
terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos
da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme
polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente
bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus
siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]
Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado
em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando
assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute
separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a
retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser
puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]
Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do
componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees
covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta
teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais
(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar
A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial
porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e
metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as
diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
14
Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo
de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)
Ligaccedilatildeo Cruzada [54]
Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para
melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem
procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente
melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros
condutores
5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO
DE BIOSSENSORES
Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos
rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como
proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser
definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar
formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas
(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros
orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
15
Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de
comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas
deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja
importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os
membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo
possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo
da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse
evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um
semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]
Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para
poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de
condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas
aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em
funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para
poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]
Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor
por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre
apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material
condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do
material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC
Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
Engineering and Science 482008 2043-2050
79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG
Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
16
ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num
elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]
O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A
capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada
pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)
e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p
(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas
cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo
localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]
Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de
eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na
superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo
Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua
crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se
destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do
material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica
e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de
grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na
construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a
sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]
Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes
polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos
Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em
eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de
Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o
estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina
[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis
[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo
de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-
hidroxi-fenilaceacutetico [82]
Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de
grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
17
desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados
na literatura com este propoacutesito
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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Engineering and Science 482008 2043-2050
79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG
Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
Molecular Science 2008 1173-1188
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
18
6 OBJETIVOS
61 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de
alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com
filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol
62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero
derivado de 4-aminofenol
Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico
Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo
modificado com filme polimeacuterico
Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador
4-aminoantipirina (4-APP)
Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido
Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie
19
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
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CAPIacuteTULO 2
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Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
20
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JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo
Journal of Materials Science 422007 3238-3243
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Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with
polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer
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Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A
Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of
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27
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immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
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81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
21
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
22
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CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
23
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
24
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
25
61 Chaubey A Gerard M Singhal R Singh VS Malhotra BD
Immobilization of lactate dehydrogenase on electrochemically prepared
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
26
cacircncer de proacutestata e hepatite Crdquo Tese de doutorado Universidade Federal
de Uberlacircndia Uberlacircndia 2011
73 Vieira SN Ferreira L F Franco DL Afonso AS Goncalves RA
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27
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28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
27
80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro
AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for
immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48
2008 1963-1970
81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro
AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence
detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo
Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and
Systems 292009 539-545
82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL
Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and
morphological studies of an electroactive material derived from 3-
hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo
Journal of Materials Science 452010 475-482
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
28
CAPIacuteTULO 2
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry
(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio
ndescription)
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
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Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
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thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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40
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novel L-glutamate oxidase and its application to flow injection analysis systemrdquo J
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optimizing the composition of the redox hydrogelrdquo Anal Chem 77 (2005) 5520-
5528
41
[24] Jamal M Worsfold Oliver McCormac T Dempseya E M A stable and
selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
(ALT) Biosens Bioelectron 24 (2009) 2926ndash2930
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2928
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Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
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Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
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amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
29
Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) for detection of alanine aminotransferase
Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2
Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1
1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia
Uberlacircndia Brazil
2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil
Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203
Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
30
Abstract
High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate
hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using
pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The
characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force
microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was
successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode
obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about
200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response
after 4 weeks)
The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-
aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit
for hepatic disease using electrochemical detection
Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase
poly(4-aminophenol)
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
31
1 Introduction
Liver diseases are a growing public health problem that affects million
people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the
diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis
steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine
aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these
diseases or only to evaluate the liver function
ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the
heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible
conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate
Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but
when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a
signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found
alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]
insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the
measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of
these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood
and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the
normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash
960 ULminus1 [17]
Some of the main detection strategies such as colorimetry
chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been
employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional
spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories
require complex reagents are costly and require trained operators Therefore
there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and
electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]
A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using
electrode without modification or on modified platforms [19] based on the
glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on
electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were
developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
References
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hepatitis C virus infection in cirrhosis Clinical Therapeutics 32 (2010) 2117-2138
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amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
32
Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages
in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the
target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric
films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study
using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming
at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way
we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-
aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator
2 Experimental Section
21 Apparatus
All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH
Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface
morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu
SPM 9600)
22 Chemical
All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol
and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained
from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine
pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine
aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were
purchased from Sigma
Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell
using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm
diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum
plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride
reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System
Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
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[13] SaelyCH VonbankA ReinP WoessM BeerSAczelS JankovicV
BoehnelC RischL DrexelH ldquoAlanine aminotransferase and gamma-glutamyl
transferase are associated with the metabolic syndrome but not with
angiographically determined coronary atherosclerosisrdquo Clin Chim Acta 397
(2008) 82ndash86
[14] GoesslingW MassaroJM VasanRS DrsquoAgostinoRB EllisonRC
FoxCS ldquo Aminotransferase levels and 20-Year risk of metabolic syndrome
diabetes and cardiovascular diseaserdquo Gastroenterology 135 (2008) 1935ndash1944
[15] Wang C-C WuW-W Hsu C-S WangP-C LinHH KaoJ-H
ldquoAssociation of insulin resistance with alanine aminotransferase activity in patients
with nonalcoholic fatty liver diseaserdquo Tzu Chi Medical Journal 20 (2008) 275-279
40
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Jeon W-K Kim B-I Son B-H Shin J-H ldquoThe association between increased
alanine aminotransferase activity and metabolic factors in nonalcoholic fatty liver
diseaserdquo Metabol Clin Experiment 55 (2006) 1604ndash1609
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5528
41
[24] Jamal M Worsfold Oliver McCormac T Dempseya E M A stable and
selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
(ALT) Biosens Bioelectron 24 (2009) 2926ndash2930
[25] Song M-J Yun D-H Min N-K Hong S-I ldquoElectrochemical biosensor
array for liver diagnosis using silanization technique on nanoporous silicon
electroderdquo Journal of bioscience and bioengineering 103 (2007) 32-37
[26] Suman S Singhal R Sharma AL Malthotra BD Pundir CS
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2928
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Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
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hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
Acta 53 (2008) 6202-6208
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Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
33
23 Electrode surface modification
Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was
mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with
deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with
ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer
4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous
cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the
electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to
remove non-reacting monomers
24 Thermal stability of the modified electrode
The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1
degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between
+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days
25 Immobilization of the PyO and detection of ALT
For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the
graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to
successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M
until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6
microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at
room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the
detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of
4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for
25 minutes
26 Interference studies
Common substances found in serum or urine were studied for the
evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM
glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added
to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
References
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Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
34
27 Bioelectrode stability
To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO
were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days
3 Results and Discussion
31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)
Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from
4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the
stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the
stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days
at 8C
The electrode modified with polymer film submitted to low temperature
(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance
of the structure of the polymer after this treatment
32 Immobilization of PyO on the modified electrode
One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of
transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair
potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium
chloride (positive probe) [32 33]
In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the
modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using
K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized
onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization
the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of
the redox probes
Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple
in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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immobilization of purines and pyrimidines Polym Eng Sci 48 (2008) 2043-2050
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Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
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2928
[31] Vieira S N Afonso A S Madurro A G B Ferreira L F Ariza R G
Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
Acta 53 (2008) 6202-6208
[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
35
was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of
the redox couple to the electrode
33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force
microscopy
AFM measurements were carried out to characterize the morphological
changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows
representative 2D and 3D AFM images of these surfaces
Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-
aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm
respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare
electrode That provides a significant increase of the electrode surface area
interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness
of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed
formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully
incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the
voltammetric studies (see Fig2)
34 Detection of alanine aminotransferase
The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for
the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction
(Fig 4)
The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme
ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which
is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be
converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-
APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of
ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5
Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current
oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
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thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
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cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
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amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
36
competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to
the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current
These results are consistent with the amperometric response obtained in the
presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was
obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the
bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by
chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current
was stable (Figure 5B)
35 Sensitivity of bioelectrode for ALT
The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer
phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)
Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can
be determined from the decrease in the current oxidation values in the
bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of
the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic
plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of
00003UL to 3UL
36 Interference studies
In the analysis of biological fluids background signals due to physiological
levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create
selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT
determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-
aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)
Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was
calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode
response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent
respectively [34] The results obtained indicate that the response of the
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to
thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
References
[1] Vezali E Aghemo A ColomboM A review of the treatment of chronic
hepatitis C virus infection in cirrhosis Clinical Therapeutics 32 (2010) 2117-2138
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5528
41
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selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
(ALT) Biosens Bioelectron 24 (2009) 2926ndash2930
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array for liver diagnosis using silanization technique on nanoporous silicon
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[28] Brito-Madurro A G Ferreira L F Vieira S N Goulart Filho L R
Madurro J M Immobilization of purine bases in a poly-4-aminophenol matrix J
Mater Sci 42 (2007) 3238-3243
[29] Franco D L Afonso A S Ferreira L F Gonccedilalves R A Boodts J F C
Madurro A G B Madurro J M Electrodes modified with polyaminophenols
immobilization of purines and pyrimidines Polym Eng Sci 48 (2008) 2043-2050
[30] Afonso A S Goulart L R Goulart I M B Machado A E H Madurro J M
Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
leprae immobilized onto poly(4-aminophenol) J Appl Pol Sci 118 (2010) 2921ndash
2928
[31] Vieira S N Afonso A S Madurro A G B Ferreira L F Ariza R G
Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
Acta 53 (2008) 6202-6208
[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
37
bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents
indicating high selectivity towards the determination of ALT
37 Electrode stability
The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of
potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability
of the bioelectrode for ALT stored in dry state
Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial
value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication
that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO
immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological
activity
4 Conclusion
The present work describes the development of a new ALT biosensor
obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix
Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented
high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage
Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT
detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the
surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a
favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The
detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high
selectivity of bioelectrode and fast response
The system is very promising for the clinical requirements for measurement
of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in
diagnostic and home use
Acknowledgments
The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
38
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thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript
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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243
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Madurro A G B Madurro J M Electrodes modified with polyaminophenols
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Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
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2928
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with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
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cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
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Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
38
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transferase are associated with the metabolic syndrome but not with
angiographically determined coronary atherosclerosisrdquo Clin Chim Acta 397
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measurement of aminotransferase activities by amperometric biosensorsrdquo
Biosens Bioelectron 22 (2007) 2914ndash2920
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Nafionglutamate oxidase biosensorrdquo Talanta 43 (1996) 1157-1162
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novel L-glutamate oxidase and its application to flow injection analysis systemrdquo J
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optimizing the composition of the redox hydrogelrdquo Anal Chem 77 (2005) 5520-
5528
41
[24] Jamal M Worsfold Oliver McCormac T Dempseya E M A stable and
selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
(ALT) Biosens Bioelectron 24 (2009) 2926ndash2930
[25] Song M-J Yun D-H Min N-K Hong S-I ldquoElectrochemical biosensor
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electroderdquo Journal of bioscience and bioengineering 103 (2007) 32-37
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Development of a lactate biosensor based on conducting copolymer bound lactate
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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243
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Madurro A G B Madurro J M Electrodes modified with polyaminophenols
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Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
leprae immobilized onto poly(4-aminophenol) J Appl Pol Sci 118 (2010) 2921ndash
2928
[31] Vieira S N Afonso A S Madurro A G B Ferreira L F Ariza R G
Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
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[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
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(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
39
[8] Karmen A ldquoTransaminase activity in human bloodrdquo J Clin Invest 34 (1955)
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Madurro A G B Madurro J M Electrodes modified with polyaminophenols
immobilization of purines and pyrimidines Polym Eng Sci 48 (2008) 2043-2050
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Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
leprae immobilized onto poly(4-aminophenol) J Appl Pol Sci 118 (2010) 2921ndash
2928
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with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
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Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
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amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
40
[16] Oh S-Y Cho Y-K Kang M-S Yoo T-W Park J-H Kim H-J Sohn C-I
Jeon W-K Kim B-I Son B-H Shin J-H ldquoThe association between increased
alanine aminotransferase activity and metabolic factors in nonalcoholic fatty liver
diseaserdquo Metabol Clin Experiment 55 (2006) 1604ndash1609
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ldquoAspartate Aminotransferase (ASTGOT) and Alanine Aminotransferase
(ALTGPT) Detection Techniquesrdquo Sensors 6 (2006) 756-782
[18] Plaxco KW Soh HT Switch-based biosensors a new approach towards
real-time in vivo molecular detectionTrends Biotechnol 29 (2011)1-5
[19] He YN Chen HY ldquoThe kinetics-based electrochemical determination of
serum glutamate pyruvate transaminase activity with a gold microelectroderdquo Anal
Chim Acta 353 (1997) 319-323
[20] Changa K-S Changa C-K Chou S-F Chen C-Y ldquoSequential
measurement of aminotransferase activities by amperometric biosensorsrdquo
Biosens Bioelectron 22 (2007) 2914ndash2920
[21] Pan S Arnold MA ldquoSelectivity enhancement for glutamate with a
Nafionglutamate oxidase biosensorrdquo Talanta 43 (1996) 1157-1162
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novel L-glutamate oxidase and its application to flow injection analysis systemrdquo J
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optimizing the composition of the redox hydrogelrdquo Anal Chem 77 (2005) 5520-
5528
41
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selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
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with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
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cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
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(2011) 3037ndash3043
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amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
41
[24] Jamal M Worsfold Oliver McCormac T Dempseya E M A stable and
selective electrochemical biosensor for the liver enzyme alanine aminotransferase
(ALT) Biosens Bioelectron 24 (2009) 2926ndash2930
[25] Song M-J Yun D-H Min N-K Hong S-I ldquoElectrochemical biosensor
array for liver diagnosis using silanization technique on nanoporous silicon
electroderdquo Journal of bioscience and bioengineering 103 (2007) 32-37
[26] Suman S Singhal R Sharma AL Malthotra BD Pundir CS
Development of a lactate biosensor based on conducting copolymer bound lactate
oxidase Sens Actuators B 107 (2005) 768-772
[27] Zhu A RomeroR Howard RP A sensitive fluorimetric assay for pyruvate
Anal Biochem 396 (2010) 146ndash151
[28] Brito-Madurro A G Ferreira L F Vieira S N Goulart Filho L R
Madurro J M Immobilization of purine bases in a poly-4-aminophenol matrix J
Mater Sci 42 (2007) 3238-3243
[29] Franco D L Afonso A S Ferreira L F Gonccedilalves R A Boodts J F C
Madurro A G B Madurro J M Electrodes modified with polyaminophenols
immobilization of purines and pyrimidines Polym Eng Sci 48 (2008) 2043-2050
[30] Afonso A S Goulart L R Goulart I M B Machado A E H Madurro J M
Brito-Madurro A G A promising bioelectrode based on gene of Mycobacterium
leprae immobilized onto poly(4-aminophenol) J Appl Pol Sci 118 (2010) 2921ndash
2928
[31] Vieira S N Afonso A S Madurro A G B Ferreira L F Ariza R G
Filho L R G Madurro J M Electrochemical modification of graphite electrodes
with poly(4-aminophenol) Macromol Symp 236 (2006) 246-242
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
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[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
42
[32] Steichen M Doneux T Buess-Herman C On the adsorption of
hexaammineruthenium (III) at anionic self-assembled monolayers Electrochimica
Acta 53 (2008) 6202-6208
[33] Janek RP Fawcett WR Ulman A Impedance Spectroscopy of Self-
Assembled Monolayers on Au(111) Sodium Ferrocyanide Charge Transfer at
Modified Electrodes Langmuir 14 (1998) 3011-3018
[34] Saxena U Chakraborty M Goswami P Covalent immobilization of
cholesterol oxidase on self-assembled gold nanoparticles for highly sensitive
amperometric detection of cholesterol in real samples Biosens Bioelectron 26
(2011) 3037ndash3043
[35] Rubio-Retama J Loacutepez-Cabarcos E and Loacutepez-Ruiz B High stability
amperometric biosensor based on enzyme entrapment in microgels Talanta 68
(2005) 99-107
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
43
Legend for figures
Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-
aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were
realized in HClO4 solution (05 molL-1)
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
44
Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-
aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01
molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
45
Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)
graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
46
Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions
involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-
aminoantypirine
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
47
Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-
aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear
voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and
presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
48
Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase
based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly
(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the
absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of
bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus
logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
49
Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence
of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)
ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100
Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode
50
Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode