Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise ...

Projeto de iniciação científica

Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a

partir de resíduos lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)

Relatório Final

Bolsista: Verônica Maria Fadário Frade

Orientador: Prof. Dr. Luis Fernando P. Ferreira

Co-orientador: Prof. Dr.a Adriana Célia Lucarini

Departamento: Engenharia Química

Fevereiro/2011

Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI _______________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________ Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos

lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)

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Resumo

Os resíduos lignocelulósicos são fontes abundantes em carboidratos e a sua

bioconversão tem recebido grande atenção. Tais resíduos são formados por: celulose,

hemicelulose e lignina. Em uma das linhas de estudo está a hidrólise desse resíduo, que

pode ser ácida ou enzimática, visando a obtenção de açúcares fermentescíveis. A ação

das enzimas é influenciada por fatores físicos e químicos do meio reacional, tais como

temperatura, pH e velocidade de agitação. No desenvolvimento e otimização desse

processo é de fundamental importância o conhecimento dos fatores que afetam a

biocatálise. O objetivo desse estudo foi verificar o efeito da rotação e da quantidade de

enzima empregada na hidrólise enzimática de bagaço de cana previamente tratado,

utilizando as celulases. Como resultado disso, obteve-se uma máxima concentração de

2,81 g/L de glicose, com uma rotação de 280 rpm e utilizando-se 0,1 g de celulase para

volume reacional total de 40 mL.




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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema ilustrativo da formação da celulose .................................................. 8

Figura 2: 0-acetil-4-metilglicouranoxilana de folhosas ................................................ 10

Figura 3: arabino-4-0-metilglicouranoxilana de coníferas ............................................ 11

Figura 4: Unidades do polímero de β-1,4-glicano-piranosil ......................................... 17

Figura 5: Componentes obtidos a partir da celulose ..................................................... 20

Figura 6: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados .... 27

Figura 7: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios

realizados ........................................................................................................................ 28

Figura 8: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados .... 30

Figura 9: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios

realizados ........................................................................................................................ 30

Figura 10: Curva de calibração do Método Enzimático ................................................ 39

Figura 11: Curva de calibração do Método DNS .......................................................... 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Conteúdo médio celulósico em plantas ........................................................... 9

Tabela 2: Composição química aproximada do bagaço integral, fração fibra e medula

para diferentes regiões geográficas em % (calculados sobre o bagaço seco) ................. 19

Tabela 3: Composição do reativo de DNS em porcentagem em peso .......................... 23

Tabela 4: Planejamento estatístico para 40 mL ............................................................. 26

Tabela 5: Planejamento estatístico para 400 mL ........................................................... 26

Tabela 6: Resultados obtidos para volume de 40 mL ................................................... 27

Tabela 7: Resultados obtidos para volume de 400 mL ................................................. 29

Tabela 8: Dados para a curva de calibração .................................................................. 38

Tabela 9: Absorbância obtida para cada concentração de glicose ................................ 38

Tabela 10: Dados para curva de calibração ................................................................... 39

Tabela 11: Absorbância obtida para cada concentração de glicose .............................. 40




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SUMÁRIO

1 – Introdução ................................................................................................................... 5

2 – Etanol a partir de materiais lignocelulósicos .............................................................. 6

3 – A celulose ................................................................................................................... 8

3.1 – Principais fontes de celulose ................................................................................ 9

3.2 – Hemicelulose ..................................................................................................... 10

3.2.1 – Xilanas ......................................................................................................... 10

3.2.2 – Mananas ...................................................................................................... 11

3.2.3 – Galactanas ................................................................................................... 11

3.3 – Lignina ............................................................................................................... 11

3.4 – Importância do bagaço de cana como fonte lignocelulósica ............................. 12

4 – Enzimas .................................................................................................................... 13

4.1 – Enzimas como catalisadores .............................................................................. 14

4.2 – Substrato dependente ......................................................................................... 14

4.3 – Sítio ativo ........................................................................................................... 15

4.4 – Efeito da temperatura ......................................................................................... 15

4.5 – Efeito do pH ....................................................................................................... 15

4.6 – Cinética de uma reação enzimática .................................................................... 16

4.7 – A enzima Celulase ............................................................................................. 16

4.8 – Reação hidrólise ................................................................................................. 17

5 – Objetivos ................................................................................................................... 20

6 – Materiais e Métodos ................................................................................................. 21

6.1 – Matérias-primas ................................................................................................. 21

6.2 – Equipamentos ..................................................................................................... 21

6.3 – Métodos ............................................................................................................. 21

6.3.1 – Preparação da solução aquosa enzimática ................................................... 21




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6.3.2 – Preparação da solução tampão de Mcllvaine (fosfato citrato) .................... 22

6.3.3 – Determinação da concentração de Glicose - Método Enzimático ............... 22

6.3.4 – Determinação da concentração de Açúcares Redutores – Método DNS .... 23

6.3.5 – Preparação e polpação da cana .................................................................... 24

6.3.6 – Sacarificação enzimática da celulose contida no bagaço de cana ............... 24

6.4 – Planejamento estatístico ..................................................................................... 25

6.4.1 – Planejamento estatístico para volume de 40 mL ......................................... 25

6.4.2 – Planejamento estatístico para volume de 400 mL ....................................... 26

7 – Resultados e discussões ............................................................................................ 26

7.1 – Primeira etapa – volume de 40 mL .................................................................... 26

7.2 – Segunda etapa – volume de 400 mL .................................................................. 28

8 – Conclusão ................................................................................................................. 32

9 – Referencias ............................................................................................................... 33

Anexos ............................................................................................................................ 37




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1 – Introdução

A dependência cada vez maior de energia, a possibilidade do esgotamento das

fontes de combustíveis fósseis num futuro não muito distante e um sentimento

ambiental cada vez mais forte, fundamentado pelas drásticas mudanças climáticas,

compreendem fatores que pressionam a procura por alternativas energéticas. Nesse

contexto surgem o etanol e o biodiesel como opções viáveis. O etanol, produzido no

Brasil a partir da cana-de-açúcar, é o exemplo de maior êxito dentre os biocombustíveis,

sendo utilizado por grande parte da frota de veículos automotores, de maneira pura ou

misturada à gasolina. Contudo, o aumento da demanda por esse combustível de origem

vegetal, além de seu apelo ambiental, fez com que se procure aperfeiçoar e aumentar as

possibilidades de produção do etanol. É nesse ponto que surge o etanol celulósico

(Lima, 2009).

Uma matéria-prima em potencial para uma boa relação custo-benefício na

produção de etanol é o material lignocelulósico, o qual é acessível e de baixo custo por

ser um resíduo de vários processos. O Brasil atualmente produz o etanol mais viável e

rentável do mundo, mas a produção ainda não é suficiente para obter a quantidade

necessária para atender as necessidades mundiais. Os países interessados na tecnologia

do etanol estão desenvolvendo a tecnologia do etanol celulósico, que utiliza a matéria-

prima fibrosa de todos os resíduos gerados pelo país (Fuentes et al., 2007).

A produção desse tipo de biocombustível encontra entraves no seu

desenvolvimento, sendo necessária pesquisa para a geração de tecnologias para

produção industrial do combustível. Inúmeras pesquisas biotecnológicas são realizadas

(Sticklen, 2008; Rubin, 2008; Lynd et al., 2008, citado por Lima, 2009), abrangendo os

três principais pilares da produção do etanol celulósico: a produção de biomassa viável,

o desenvolvimento de degradadores de parede celular e a otimização da fermentação

dos açúcares formados (Doe us, 2006, citado por Lima, 2009).

A escolha da espécie produtora de biomassa é um passo fundamental na

produção do etanol celulósico. Deve ser levada em conta sua produtividade, a

produtividade de celuloses e hemiceluloses e a produtividade e tipo de lignina presente.

Além disso, há o potencial do uso dos restos culturais das mais diversas espécies para a

produção do álcool, como é o caso da cana, que se extrai o caldo e o restante de sua

biomassa é rica em celulose (Lima, 2009).




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Materiais lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar, são os mais

abundantes complexos orgânicos de carbono na forma de biomassa de planta e

consistem principalmente de três componentes: celulose, hemicelulose e lignina

(Badhan, 2009, citado por Santos et al., 2010). A utilização de resíduos agroindustriais,

como o bagaço de cana-de-açúcar, tem aumentado em processos como, geração de

eletricidade, produção de polpa e papel e produtos de fermentação, como etanol e

enzimas (Carrillo, 2005, citado por Santos et al., 2010). A produção de etanol

celulósico, a partir do bagaço de cana-de-açúcar, requer a hidrólise da celulose, que

pode, após pré-tratamento, ser realizada por celulases e β-glicosidases (Jan, 2003; Lima,

2005, citado por Santos et al., 2010).

2 – Etanol a partir de materiais lignocelulósicos

Com exceção da cana, as tecnologias comercialmente disponíveis na atualidade

para a produção de bioetanol por meio do amido e de açúcares, como no caso do milho

e da beterraba, envolvem ganhos energéticos e ambientais bastante estreitos. Além

disso, essas matérias-primas apresentam uma limitada vantagem econômica e

encontram, em geral, mercados alternativos mais remuneradores, como alimentos ou

insumos para outros fins. Entretanto, apesar de suas destacadas vantagens, a cana de

açúcar não é uma opção viável para todas as regiões do planeta. Por esse motivo, os

países do hemisfério norte vêm procurando incessantemente rotas tecnológicas que

permitam a produção de um biocombustível eficiente, tanto do ponto de vista ambiental

quanto do ponto de vista econômico. Atualmente, predomina a idéia de que, para o

futuro próximo, entre cinco e dez anos, a tecnologia de produção de bioetanol por meio

da hidrólise de materiais celulósicos venha a representar essa sonhada alternativa.

Porém, existem grandes obstáculos por superar e é difícil predizer com confiança o

tempo que, efetivamente, vai levar esse desenvolvimento (BNDES e CGEE, 2008).

O bioetanol vem sendo produzido pela hidrólise e fermentação de materiais

lignocelulósicos desde o fim do século XIX, mas somente nos últimos 20 anos essa

tecnologia tem sido proposta para atender o mercado de combustíveis. Os principais

programas de pesquisa e desenvolvimento são conduzidos nos Estados Unidos e na

Europa, basicamente em escalas experimentais de produção, mas seu sucesso poderia

transformar o bioetanol em um biocombustível passível de ser produzido em quase

todas as regiões do mundo, aproveitando a alta disponibilidade de resíduos orgânicos de




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diversas fontes (Macedo, 2005, citado por BNDES e CGEE, 2008). Praticamente todos

os resíduos de biomassa, produzidos nas atividades agrícolas e industriais, e mesmo o

lixo urbano apresentam elevados teores de materiais lignocelulósicos.

As tecnologias para a obtenção de bioetanol com base em materiais

lignocelulósicos envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares

fermentescíveis e sua posterior fermentação para a produção do bioetanol. Para executar

essa tarefa, a hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, com base no uso de

rotas ácidas e/ou enzimáticas para a separação dos açúcares e remoção da lignina

(BNDES e CGEE, 2008).

Nos processos enzimáticos, a composição e a estrutura da biomassa têm forte

influência na natureza e nos rendimentos dos processos de hidrólise e fermentação. Na

realidade, muito esforço de pesquisa deverá estar focado no melhor entendimento da

formação dos componentes da estrutura vegetal e como seria possível modificá-la para

aumentar os rendimentos do processo de hidrólise (DOE, 2006, citado por BNDES e

CGEE, 2008), já que a hidrólise somente é eficiente, de fato, após alguma separação das

frações da biomassa.

A biomassa lignocelulósica é composta por polissacarídeos (celulose e

hemicelulose) e pela lignina, polímero complexo de grupos metoxi e fenilpropânicos,

que mantém as células unidas. A fração celulósica (40%-60% da matéria seca) é um

polímero linear do dímero glicose-glicose (celobiose), rígido e difícil de ser quebrado;

sua hidrólise gera glicose, um açúcar de seis carbonos, cuja fermentação com

Saccharomyces cerevisiae já é bem conhecida. Por sua vez, a fração hemicelulósica

(20%-40%), em geral, é constituída de uma cadeia principal de xilose (ligações β-1,4)

com várias ramificações de manose, arabinose, galactose, ácido glicurônico etc. A

hemicelulose é muito mais fácil de ser hidrolisada do que a celulose, mas a fermentação

dos açúcares de cinco carbonos (pentoses) ainda não é tão desenvolvida quanto os

processos envolvendo a glicose. Já a estrutura bioquímica da fração de lignina (10%-

25%) não está relacionada a moléculas simples de açúcar, não sendo pretendida para a

produção de bioetanol por rotas fermentativas. Essa fração, no entanto, desempenha um

papel fundamental para o sucesso da tecnologia de hidrólise. Apesar de ser possível

produzir diversos produtos com base na lignina, atualmente o foco dos estudos tem se

voltado para o uso desse material como fonte de energia para os processos, o que

garantiria a auto-suficiência e, eventualmente, até a possibilidade de exportar alguma

energia elétrica excedente. Naturalmente, essa situação é positiva tanto para a




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viabilidade econômica da tecnologia quanto para os quesitos ambientais, já que

reduziria a dependência por recursos energéticos fósseis externos (BNDES e CGEE,

2008).

De forma geral, a primeira etapa do processo consiste no pré-tratamento

mecânico da matéria-prima, que visa à limpeza e à “quebra” do material, a fim de

causar a destruição da sua estrutura celular e torná-la mais acessível aos tratamentos

químicos ou biológicos posteriores. A etapa seguinte consiste na remoção da lignina e

na hidrólise da hemicelulose, que também pode ser denominada pré-tratamento. Para

essa etapa, existem diversos tipos de processos, com diferentes rendimentos e efeitos

distintos sobre a biomassa e conseqüente impacto nas etapas subseqüentes (BNDES e

CGEE, 2008).

3 – A celulose

A celulose é o composto orgânico mais comum na natureza. Ela constitui entre

40 e 50% de quase todas as plantas. Há estimativas de que cerca de 50 bilhões de

toneladas deste composto químico são produzidas por ano. Ela está presente também em

bactérias e algas, mas em pequenas proporções, estando localizada principalmente na

parede secundária das células vegetais (Klock et al., 2005).

O estudo da química da celulose iniciou em 1838 com Payen, que mostrou por

análise elementar que o tecido de plantas contém um componente majoritário com

44,4% de carbono; 6,2% de hidrogênio e 49,3% de oxigênio, o que é equivalente a uma

fórmula empírica de C6H10O5 e um peso molecular de 162 g/mol. Evidências

conseguidas após 1930, provaram que a celulose é um polímero composto por um

grande número de unidades repetidas. (Figura 1). Posteriormente foi provado que estas

unidades derivam-se da condensação da D-glicose, (um açúcar simples -

monossacarídeo hexose C6H12O6) (Klock et al., 2005).

Figura 1: Esquema ilustrativo da formação da celulose Fonte: Klock et al., 2005




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3.1 – Principais fontes de celulose

Com relação às principais fontes de celulose, ela é o componente majoritário,

perfazendo aproximadamente a metade das madeiras tanto de coníferas, como de

folhosas sendo outras possíveis fontes de celulose:

⇒ Algas marinhas, exemplo: valônia que possui longas microfibrilas.

⇒ Pêlos de frutos - pericarpo, exemplos: algodão, casca de coco. No algodão é

encontrada a celulose mais pura 98%.

⇒ Fibras de floema-líber, exemplos: juta, linho, cânhamo, rami, etc.

⇒ Gramíneas-monocotilêdoneas, exemplos: esparto, bagaço de cana, bambu, palhas de

cereais, etc.

⇒ Fibras do xilema-lenho, exemplos: madeiras utilizadas comercialmente, de fibras

longas (coníferas), e de fibras curtas (folhosas).

⇒ Celulose artificial, exemplo: rayon, viscose, etc.

⇒ Bagaço de cana-de-açúcar (Americano et al., 2006, Klock et al., 2005)

Dessas, a forma mais pura de celulose 99,8% pode ser obtida do algodão (98%)

por desengorduramento com solvente orgânico e extração com solução a quente de

hidróxido de sódio a 1% (Klock et al., 2005). O quadro a seguir exemplifica o conteúdo

médio de celulose em várias plantas (Tabela 1):

Tabela 1: Conteúdo médio celulósico em plantas

Planta Celulose (%) Algodão 95 – 99

Rami 80 – 90 Bambo 40 – 50 Madeira 40 – 50

Cascas de árvores 20 – 30 Musgos 25 - 30

Engaço de bananeira 53 - 54 Bactérias 20 - 30

Cana de açúcar 58 - 59 Fonte: Klock et al., 2005




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3.2 – Hemicelulose

A hemicelulose é uma mistura de polímeros polissacarídeos de baixa massa

molecular, onde estão associadas com a celulose nos tecidos das plantas. O termo

hemicelulose não designa um composto químico definido, mas sim uma classe de

componentes poliméricos com propriedades peculiares (D’Almeida, 1981).

Na sua composição podem aparecer condensados unidades de açúcar como β-D-

xilose, β-D-manose, β-D-glicose, α-L-arabinose, α-D-galactose e os ácidos β-D-

glucourônico, β-D-galactourônico e α -D-4-0-metilglucourônico (D’Almeida, 1981).

Algumas unidades de açúcares possuem cinco carbonos e outras seis,

denominadas respectivamente de pentose e hexose que, quando condensadas, recebem o

nome de pentosana e hexosana, com fórmula geral (C5H8O4)n e (C6H10O5)n

respectivamente, onde n é o grau de polimerização. Uma pentosana quando hidrolisada

leva apenas a unidades de xilose é denominada xilana e uma que leva unidades de

arabinose, arabinana. Uma hexosana quando hidrolisada, dependendo da sua unidade

pode ser chamada de manana ou galactana (D’Almeida, 1981).

Portanto as hemiceluloses são polímeros nos quais participam pelo menos dois

tipos de açúcares (D’Almeida, 1981).

3.2.1 – Xilanas

São polissacarídeos com um esqueleto linear formado por unidades de xilose

ligadas entre si pelos carbonos 1 e 4. No caso de folhosas, a cadeia de xilanas apresenta,

em intervalos irregulares, grupos de ácido 4-0-metilglucurônico conectados às unidades

de xilose e, muitos dos grupos hidroxilas dos carbonos 2 e 3 são substituídos por grupos

0-acetila. As xilanas de coníferas diferem das de folhosas pela ausência de grupo acetila

e pela presença de unidades de arabinofuranose (D’Almeida, 1981).

Figura 2: 0-acetil-4-metilglicouranoxilana de folhosas Fonte: D’Almeida, 1981




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3.2.2 – Mananas

São polissacarídeos com um esqueleto linear formado por unidades de manose e

glicose conectadas entre si pelos carbonos 1 e 4. No caso de folhosas, as glucomananas

formam cadeias pouco ramificadas. No caso de coníferas, estão ligados ao esqueleto de

glucomanana grupos acetila e galactose (D’Almeida, 1981).

3.2.3 – Galactanas

São polímeros bastante ramificados e solúveis em água. As galactanas possuem

um esqueleto linear de unidades de galactose conectadas entre si, e de cadeias laterais

de unidades de galactose, somente unidades de arabinose e de ácidos glucourônicos

(D’Almeida, 1981).

Figura 3: arabino-4-0-metilglicouranoxilana de coníferas Fonte: D’Almeida, 1981

3.3 – Lignina

A lignina é uma substância química que confere rigidez à parede da célula,

gerando uma estrutura resistente a impacto, compressão e dobra. A lignina também

contribui para impedir a penetração de enzimas destruidoras da parede celular e resistem

ao ataque de microorganismos. A lignina provém da polimerização dehidrogenativa dos

seguintes álcoois: álcool trans-coniferilico; álcool trans sinapilico e álcool trans-para-

cumárico. Também podem possuir, em sua estrutura, ácidos carboxílicos aromáticos, na

forma de éster. A lignina não pode ser considerada como substância única, pois existem

variações de planta para planta, e podem ser classificadas em duas classes principais

(D’Almeida, 1981):




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• Lignina guaiacil: presentes na maioria das coníferas, seus produtos de oxidação com

nitrobenzeno são, vanilina e para-hidroxibenzaldeído.

• Lignina guaiacil-siringil: presentes na maioria das folhosas, incluindo as gramíneas,

a oxidação com nitrobenzeno leva a quantidades significativas de aldeído siríngico.

Foram feitos vários modelos para a lignina, todos com falhas, porém o maior

modelo estrutural para ligninas de coníferas foi desenvolvido através de simulação em

computador por Glasser e Glasser (1974). Baseava-se principalmente na simulação de

reações de copulação de radiais dos álcoois p-hidroxicinamil (D’Almeida, 1981).

Os principais grupos funcionais encontrados nas ligninas são:

• Grupos metoxilas (-OCH3): é o grupo funcional mais característico da lignina

• Grupos hidroxilas (-OH): estes são de natureza variada, isto é, fenólicos, assim

como alifáticos primários, secundários e terciários.

• Grupos carbonilas e grupos carboxílicos.

• Grupos éter (R-O-R): podem ser aromáticos ou alifáticos.

• Duplas ligações (-C = C-)

• Grupos éster: ocorrem em algumas folhosas.

A lignina contém como elementos somente carbono, hidrogênio e oxigênio.

3.4 – Importância do bagaço de cana como fonte lignocelulósica

As fontes mais comuns de celulose industrial atualmente são a madeira e o

algodão, sendo a fibra de algodão provavelmente a fonte natural mais rica em celulose,

com cerca de 95%, como citado anteriormente. Na madeira, resíduos agrícolas,

folhagens, e outras, a celulose está associada com outras substâncias como a lignina e

hemicelulose, ambas em quantidades consideráveis, o que leva a necessidade de

desenvolvimento de tecnologias visando à eliminação desses resíduos (Silvério, 1988).

Atualmente, a produção de substâncias químicas derivadas da celulose, é realizada a

partir de celulose oriunda do línter de algodão e da madeira. A utilização destas

matérias-primas contribui significativamente com os elevados custos de processamento

industrial, decorrentes do alto valor comercial do línter e da complexidade do

processamento da madeira. No caso particular da madeira, deve-se ainda levar em

conta, os danos causados ao meio ambiente pela geração de efluentes e desmatamento.

Porém, estão sendo desenvolvidas inúmeras pesquisas visando viabilizar a

utilização de outras fontes de celulose, principalmente no que diz respeito à utilização




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de resíduos. Nesse contexto, dentre os resíduos agrícolas o bagaço de cana ocupa um

lugar de destaque em vários países, pela sua abundância, fácil acessibilidade e baixo

custo, fatores que são realidade no Brasil, devido a grande capacidade de produção de

álcool e açúcar dentro no país (Goldstein, 1995).

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma planta de grande

importância para a economia brasileira, tornando-se grande geradora de empregos e de

energia via industrialização desta em açúcar, álcool além da produção de energia, fonte

de celulose e produção de ração animal (Manzano et al., 2000). Estruturalmente, a cana

consiste de vários tipos de tecidos, tais como córtex (ou casca), tecido parenquimatoso e

hastes fibrovasculares. O córtex é composto de fibras muito lignificadas, sendo

caracterizado pela espessura da parede celular, comprimento e rigidez de suas fibras. A

parte interior do talo é constituída por um tecido parenquimatoso (medula) de caráter

fibroso o qual possui como principal função o armazenamento do suco adocicado

produzido pela planta (Machado, 2000).

De uma maneira geral, o bagaço consiste de fibras e medula, nas proporções de

aproximadamente 65 a 35 % respectivamente e assim como outros materiais

lignocelulósicos ele é constituído de celulose, polioses e lignina (Tabela 2) podendo ser

utilizado na produção de polpas celulósicas e, portanto, utilizado na produção de acetato

de celulose. A polpação pode ser realizada com a fração fibra e/ou medula cabendo

salientar que a fração medula requer maior consumo de reagentes (Machado, 2000).

4 – Enzimas

As enzimas são proteínas sintetizadas em células vivas, possuindo assim,

estruturas protéicas, as quais podem ser primárias, secundárias, terciárias ou ainda

quaternárias, dependendo da atividade catalítica para qual são destinadas. A atividade

catalítica depende da integralidade de sua conformação protéica nativa, sendo que esta

pode ser perdida caso haja a desnaturação ou dissociação das mesmas em subunidades

(Vieira, 2003, citado por Campestrini et al., 2005).

A estrutura e o centro ativo enzimático são decorrentes de sua estrutura

tridimensional, que podem ser afetados por agentes capazes de provocar alterações

conformacionais na proteína. Isso torna a atividade enzimática dependente das

características do meio, principalmente o pH e a temperatura reacionais (Marzzoco et

al., 1999).




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As enzimas catalisam reações químicas específicas sem serem consumidas, além

de não haver a formação de produtos colaterais e agem em soluções aquosas diluídas

(tampões), em condições muito suaves de temperatura e pH, sendo que cada enzima

possui uma temperatura e um pH ótimos, onde sua atividade é máxima, ou seja, a

velocidade da reação a qual está catalisando é máxima (Marzzoco et al., 1999).

4.1 – Enzimas como catalisadores

As enzimas aumentam a velocidade de reações químicas específicas que, sem o

uso de catalisadores (no caso, as enzimas), ocorreriam muito lentamente. Estas, não

podem alterar o ponto de equilíbrio das reações que catalisam, e também não são

consumidas ou transformadas em tais reações (Marzzoco et al., 1999).

Do ponto de vista termodinâmico, uma enzima é um catalisador que acelera uma

reação porque diminui sua energia de ativação, sendo que, quanto maior for a energia de

ativação, mais lenta a reação ocorrerá. O aumento na velocidade da reação ocorre

devido ao fato de a enzima aumentar o número de moléculas ativadas, ou seja, capazes

de reagir. Após terem reagido com o substrato, as enzimas se separam dos produtos,

liberando a molécula de catalisador para novas reações (Marzzoco et al., 1999).

4.2 – Substrato dependente

Algumas enzimas têm especificidade quase absoluta por um dado substrato, e

não atacará nem mesmo moléculas muitíssimo parecidas. Por outro lado, existem

enzimas que possuem uma ampla especificidade de substratos com características

estruturais semelhantes (Lehninger, 1989).

A especificidade das enzimas se deve a algumas características estruturais

distintas dos substratos, como a ligação química específica que pode ser atacada pela

enzima, ou como algum outro grupo funcional (grupo de ligação), o qual se liga à

enzima e posiciona a molécula de substrato no sítio ativo, de forma apropriada para que

a ligação suscetível fique localizada de modo preciso em relação ao grupo catalítico da

enzima (Lehninger, 1989).




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4.3 – Sítio ativo

As reações catalisadas enzimaticamente ocorrem no interior dos limites de uma

cavidade, ou fenda, na estrutura molecular da enzima, chamada de sítio ativo. Este sítio

contém aminoácidos cujas cadeias laterais criam uma superfície complementar ao

substrato, permitindo que as enzimas atuem na ruptura de uma determinada ligação

química. O sítio ativo liga-se ao substrato, formando um complexo enzima-substrato

que será convertido à enzima e produto (Campestrini et al., 2005), como demonstrado

através da seguinte reação: E + S ⇔ ES ⇔ E + P, onde E, S e P significam,

respectivamente, enzima, substrato e produto (Lehninger, 1989).

4.4 – Efeito da temperatura

Toda reação química catalisada por enzimas será afetada de acordo com a

variação da temperatura. Quando a temperatura aumenta, a velocidade de reação

inicialmente aumenta, em virtude da energia cinética aumentada entre as moléculas e o

substrato. Em temperaturas ótimas, a velocidade de destruição das enzimas causada pelo

calor, é equilibrada pelo aumento na reatividade enzima-substrato e a velocidade da

reação é máxima (Campestrini et al., 2005). Porém, devido à sua natureza protéica, em

temperaturas excessivas, ocorre a desnaturação térmica da enzima, acarretando a

diminuição de sua concentração efetiva, fazendo com que a velocidade da reação

também diminua (Lehninger, 1989).

4.5 – Efeito do pH

Como as enzimas são proteínas, as mudanças no pH afetarão profundamente o

caráter iônico dos grupos carboxila e amina na superfície da molécula, influenciando

bastante a natureza catalítica (Lehninger, 1989).

A concentração de H+ afeta a velocidade das reações químicas. Extremos de pH

podem acarretar a desnaturação das enzimas (Campestrini et al., 2005). Cada enzima

possui um pH ótimo ou uma faixa de pH ideal, no qual importantes grupos doadores ou

receptores de próton no sítio catalítico estão em seus estados de ionização adequados

(Lehninger, 1989).




16

Portanto, as enzimas possuem um pH ótimo ou uma faixa de pH ideal para que

possam desenvolver com maior eficiência sua atividade catalítica, sendo que em valores

superiores ou inferiores de pH podem suprimir ou desnaturar as enzimas (Campestrini

et al., 2005).

4.6 – Cinética de uma reação enzimática

O estudo da catalise enzimática é baseada em medidas da velocidade de reação,

que é diretamente proporcional à concentração de substrato. Reações catalisadas por

enzimas se dão em duas etapas, sendo que na primeira, a enzima liga-se reversivelmente

ao substrato, formando um complexo enzima-substrato, enquanto que na segunda etapa,

o produto é libertado e a enzima fica livre para se ligar à outra molécula de substrato.

Em uma reação enzimática típica, a velocidade da primeira fase é mais elevada que a

segunda (Marzzoco et al., 1999).

Como mencionado anteriormente, a velocidade de reação é diretamente

proporcional à concentração de substrato, devido ao fato de a concentração do

complexo enzima-substrato ser muito elevada, significando que não há enzimas em

solução em sua forma livre. Neste ponto, diz-se que a velocidade de reação é máxima, a

partir do qual, qualquer aumento na concentração de substrato não provocará efeitos

perceptíveis sobre a velocidade da reação. Contudo, a velocidade reacional também é

proporcional à concentração de enzimas presentes no meio, o que possibilita a

determinação da atividade enzimática (Marzzoco et al., 1999).

4.7 – A enzima Celulase

O complexo celulase envolve pelo menos três enzimas que apresentam modos de

ação distintos. A β-1,4-glicano-glicanoidrolase (endoglicanase), β-1,4-glicano-

celobioidrolase (exoglicanase) e β-1,4-glicosidase (celobiase). As endoglicanases

atacam, de forma randômica, ligações glicosídicas em regiões internas da molécula de

celulose, gerando oligossacarídeos de cadeias menores de celotriose, celobiose e

glicose. As exoglicanases (celobiohidrolases) atuam nas extremidades dos

oligossacarídeos produzidos pela ação das endoglicanases, formando principalmente,

moléculas de celobiose, que por sua vez, são clivadas por β-glicosidases, liberando

glicose (Beguin & Aubert, 1994; Bhat & Bhat, 1997; NG, 2004, citado por Daroit,

Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI_______________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise

lignocelulósicos do bagaço de cana (

2007). A atividade das enzimas do complexo celulase

atividade combinada das enzimas é maior do que a soma da atividade individual de cada

componente (Ortega et al., 2001; Galbe & Zacchi, 2002; Lynd et al., 2002

Daroit, 2007).

A atividade de endoglicanases e ex

celobiose. As β-glicosidases, nesse sentido, não só produzem glicose a partir de

celobiose, mas também reduzem o efeito inibitório da celobiose, permitindo a maior

eficiência tanto das endo quanto das exoglicanases (Beg

1996; Szczodrak & Fiedurek, 1996; Lau & Wong, 2001; Sun & Cheng, 2002

Daroit, 2007). A hidrólise eficiente da celobiose em glicose é, desta forma, crítica pela

completa digestão da celulose (Busto et al., 1997

glicosidases têm importante função de regulação da degradação enzimática da celulose

(Berghem & Pettersson, 1974

Figura 4

4.8 – Reação hidrólise

A celulose pode ser hidrolisada, com ácidos ou através da utilização de

processos enzimáticos a glicose sendo que a degradação microbiana da celulose é total e

específica e tem estimulado o uso dos processos de fermentações

homem (Ruegger et al., 2004), e segue a seguinte reação genérica:


_______________________________________________________________________________________________Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos


). A atividade das enzimas do complexo celulase é geralmente sinérgica, ou seja, a


componente (Ortega et al., 2001; Galbe & Zacchi, 2002; Lynd et al., 2002

A atividade de endoglicanases e exoglicanases é geralmente inibida por

glicosidases, nesse sentido, não só produzem glicose a partir de


eficiência tanto das endo quanto das exoglicanases (Beguin & Aubert, 1994; Lee et al.,

1996; Szczodrak & Fiedurek, 1996; Lau & Wong, 2001; Sun & Cheng, 2002

). A hidrólise eficiente da celobiose em glicose é, desta forma, crítica pela

completa digestão da celulose (Busto et al., 1997, citado por Daroit, 2007


(Berghem & Pettersson, 1974, citado por Daroit, 2007).

4: Unidades do polímero de β-1,4-glicano-piranosil



específica e tem estimulado o uso dos processos de fermentações celulolíticas pelo

., 2004), e segue a seguinte reação genérica:

n C6H10O5 + n H2O → n C6H12O6

_______________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________ da celulose obtida a partir de resíduos

17

é geralmente sinérgica, ou seja, a


componente (Ortega et al., 2001; Galbe & Zacchi, 2002; Lynd et al., 2002, citado por

oglicanases é geralmente inibida por

glicosidases, nesse sentido, não só produzem glicose a partir de


uin & Aubert, 1994; Lee et al.,

1996; Szczodrak & Fiedurek, 1996; Lau & Wong, 2001; Sun & Cheng, 2002, citado por

). A hidrólise eficiente da celobiose em glicose é, desta forma, crítica pela

itado por Daroit, 2007), e as β-




celulolíticas pelo




18

No processo enzimático, a hidrólise é catalisada por enzimas chamadas

genericamente de celulases, e a hidrólise da celulose por celulases resulta na produção

final de glicose. Estas, porém, por serem proteínas, não conseguem penetrar com

facilidade a barreira da lignina das células vegetais e, dessa forma, o difícil acesso

destas enzimas às fibras de celulose constitui o principal problema para

desencadeamento desse processo de degradação (Ruegger et al., 2004, Feldman et al.,

1988 e Galliano et al., 1988). Nesse contexto o trabalho de desenvolvimento de técnicas

de deslignificação para expor a celulose ao ataque das enzimas, se torna importante

visando à obtenção de biocombustíveis.

Na natureza, existe uma grande variedade de microrganismos que produzem

celulases; apenas alguns são conhecidos como verdadeiros celulolíticos, isto é, são

capazes de degradar a celulose natural. Em condições laboratoriais, algodão e papel de

filtro, dentre outros, são usados como substratos indutores para a produção de exo-

glicosidases e para medir a atividade do complexo celulolítico total (Ruegger et al.,

2004).




19

Tabela 2: Composição química aproximada do bagaço integral, fração fibra e medula para diferentes regiões geográficas em % (calculados sobre o bagaço seco)

Origem Tipo Celulose Lignina Polioses Cinzas

EUA

(Lousiana)

Integral 58,4 21,3 29,4 2,9

Fibra 61,4 20,7 30,0 2,0

Medula 54,6 21,3 29,9 4,6

Filipinas Integral 56,8 22,3 31,8 2,3

Fibra 62,9 21,8 31,2 1,2

Medula 55,4 22,5 33,2 2,6

Porto Rico Integral 50,9 18,1 29,6 3,9

Fibra 59,9 19,8 31,6 1,2

Medula 53,9 18,8 31,9 3,2

África do Sul Integral 45,3 22,1 24,1 1,6

Havaí Integral * 27,6 – 28,4 19,4 – 21,6 1,3 – 2,0

Fibra * 25,8 – 27,3 20,0 – 22,0 0,6 – 0,8

Medula * 27,6 – 28,8 19,3 – 21,5 1,8 – 2,4

Cuba Integral 46,6 20,7 25,2 2,6

Fibra 47,0 19,5 25,1 1,4

Medula 41,2 21,7 26,0 5,5

Brasil (SP) Integral 49,1 20,3 27,8 1,6

Fibra 51,1 20,8 26,7 0,8

Medula 47,5 20,2 28,5 3,0

Fonte: Machado, 2000

Através do uso de enzimas, no caso a celulase, a celulose pode ser hidrolisada a

glicose e a mesma pode ser utilizada para aumento da produção de etanol, bem como

para a produção de insumos químicos como: etileno, buteno (dimerização de etileno),

propileno (metátese de buteno com etileno), butadieno (via acetaldeído, processo da

COPERBO) e ácido acrílico (via ácido láctico) (Figura 5). Através de outros processos

de fermentação pode-se obter ainda butanol, isopropanol, 2,3-butadienol, glicerol,

acetona, ácido acético e ácido butírico. A hidrólise da glicose com ácidos diluídos leva

ainda ao hidroximetilfurfural, que pode ser clivado em ácido levulínico (ácido g-ceto-

pentanóico) e ácido fórmico. O ácido levulínico pode ser um interessante insumo para

poliésteres (Schuchardt et al., 2001, citado por Martins, 2007).




20

Figura 5: Componentes obtidos a partir da celulose Fonte: Schuchardt et al., 2001, citado por Martins, 2007

Como o processo enzimático é conduzido em condições brandas (pH 4,8 e

temperatura entre 45° e 50°C), o custo de utilidades é relativamente baixo (Sun e

Cheng, 2002, citado por BNDES e CGEE, 2008), além de permitir maiores

rendimentos, possibilitar a fermentação simultânea à sacarificação e apresentar baixo

custo de manutenção, por não se ter problemas relacionados à corrosão. Por conta de

seu grande potencial de evolução e redução de custos, muitos especialistas vêem a

hidrólise enzimática como a chave para a produção de bioetanol a um custo competitivo

no longo prazo (Dipardo, 2000 e Lynd et al., 1996, citado por BNDES e CGEE, 2008).

Contudo, uma das maiores dificuldades para que as descobertas em laboratório,

especialmente na área de bioquímica, transformem-se em benefício efetivo para a

sociedade consiste na transferência de tecnologia em mudança de escala, o chamado

scale-up.

5 – Objetivos

Estudo do aumento da escala da reação de hidrólise enzimática, visando à

obtenção de etanol a partir do bagaço de cana.

Glicose

Hidroximetilfurfural Ácido lático Etanol

Ácido levulínico

Poliésteres

Ácido acrílico Etileno

Buteno Propileno Acetaldeído

Butadieno

Meio ácido Fermentação Fermentação

Polimerização

Desidratação Desidratação

Oxidação




21

6 – Materiais e Métodos

6.1 – Matérias-primas

⇒ Material lignocelulósico: será utilizado como substrato, o bagaço de cana

(Saccharum officinarum L.) previamente polpado.

⇒ Reagentes de hidrólise: para o desenvolvimento das reações de hidrólise da celulose

serão utilizadas celulases, além de tampão fosfato citrato.

6.2 – Equipamentos

⇒ Espectrofotômetro Hexis modelo DR 2800, da Hach;

⇒ Banho de aquecimento modelo Q-215S2, da Quimis;

⇒ Manta aquecedora;

⇒ pHmetro modelo B474, da Micronal;

⇒ Pipeta automática, da Gilson;

⇒ Agitador mecânico modelo 713D, da Fisaton;

⇒ Reator com capacidade de 5 litros em batelada, da Metalquim;

⇒ Moinho de facas, da Quimis.

6.3 – Métodos

6.3.1 – Preparação da solução aquosa enzimática

Para a preparação da solução enzimática utilizada nos ensaios, dissolveu-se uma

massa correspondente a 0,125 g do composto enzimático celulase em 25 mL de água

destilada, a qual foi agitada até a total dissolução do composto, gerando uma solução de

concentração 5 g/L, de modo a ter-se uma quantidade equivalente a 0,1 g de enzima

presente no meio reacional. Para a obtenção das outras soluções utilizadas nos ensaios,

procederam-se diluições, a fim de se obter quantidades de enzimas correspondentes a

0,065 e 0,025 g, no que diz respeito à primeira etapa dos ensaios (primeiro

planejamento estatístico). Para a segunda etapa, foi utilizada a solução enzimática com

concentração de 5 g/L. Estas soluções, assim como as demais preparadas, foram

conservadas em geladeira.




22

6.3.2 – Preparação da solução tampão de Mcllvaine (fosfato citrato)

Para a preparação da solução tampão de Mcllvaine, foram preparadas

inicialmente duas soluções distintas, sendo uma de fosfato de sódio dibásico, e outra de

ácido cítrico.

A solução aquosa de fosfato de sódio dibásico (Na2PO4) foi preparada na

concentração de 0,05 M, e para tal dissolveu-se uma massa de 8,907g de Na2PO4 em 1

litro de água destilada, sendo verificado, através do pHmetro, que esta solução possui

um pH de aproximadamente 9;

A solução aquosa de ácido cítrico (C6H8O7) foi preparada na concentração de

0,05 M, e para tal dissolveu-se uma massa correspondente a 10,504g de C6H8O7 em 1

litro de água destilada, sendo verificado, através do pHmetro, que esta solução possui

um pH de aproximadamente 2.

Partindo-se de uma das soluções citadas acima como base, adicionou-se aos

poucos a outra solução, até que atingisse o pH desejado, no caso 5, o qual foi detectado

por meio do pHmetro.

6.3.3 – Determinação da concentração de Glicose - Método Enzimático

O reativo de trabalho (método enzimático) foi preparado dissolvendo-se 3 das 4

soluções que compõe o kit enzimático. As soluções utilizadas foram: Reativo enzimático CAT

nº. 02202 (glicose oxidase e peroxidase); Reativo de Cor (1) CAT nº. 02203 (4-aminofenazona

0,025 mol/L e tampão Tris 0,92 mol/L) e Reativo de Cor (2) CAT nº. 02204 (Fenol 0,055

mol/L), com pH 7,4 ± 0,1. Após devidamente dissolvidas, a solução resultante possui um

volume final de 1 litro.

A concentração de glicose é obtida por método enzimático (Laborlab cat. n°. 02200),

através da análise espectrofométrica, utilizando uma curva de calibração que correlacione a

absorbância (Abs) com a concentração de glicose ([G]). Para elaboração dessa curva, amostras

padrões de glicose foram preparadas nas seguintes concentrações: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,6 e

2,0 g/L (Lucarini, 2006).

O princípio do método é baseado em técnicas colorimétricas onde, inicialmente,

a glicose presente na amostra é oxidada a ácido glicônico e peróxido de hidrogênio, em

presença de glicose-oxidase. O peróxido de hidrogênio formado, na presença de

peroxidase e do sistema constituído por fenol e 4-aminofenazona (aceptor e oxigênio

nesta reação), reage formando um cromógeno vermelho (4-p-

benzoquinonamonoiminofenazona). A concentração desta substância, determinada por




23

métodos colorimétricos, é proporcional à concentração de glicose na amostra (Lucarini,

2006).

A análise é realizada através da adição de 50 µL da amostra hidrolisada em 5 mL

do reativo de trabalho. A mistura é então incubada em banho termostatizado a 37°C por

10 minutos, sendo em seguida resfriada em banho de gelo. Após, realizou-se a leitura

em espectrofotômetro em um comprimento de onda ajustado para 505 nm, mediante

calibração do instrumento com água destilada (branco), pois esta possui a mesma

coloração do reativo de trabalho.

O reativo foi armazenado em geladeira e em frasco escuro, pois é sensível à luz

e à temperatura, sendo de um mês seu período de validade. A partir de uma solução-mãe

de glicose (2g/L), preparou-se os correspondentes padrões cujas concentrações variaram

entre 0,2 e 2,0 mg/mL, como mostra a tabela localizada em Anexos, assim como as

curvas de calibração.

6.3.4 – Determinação da concentração de Açúcares Redutores – Método DNS

O método do DNS consiste na mistura de 1 mL da amostra com 1,5 mL da solução de

DNS. Agita-se e aquece-se a mistura em banho de água fervente por 5 minutos. A amostra é

resfriada em água ate que a temperatura ambiente seja atingida. Completa-se o volume total

para 25 mL com água destilada em tubos aferidos e agita-se. Determina-se a absorbância das

amostras a 540 nm contra um branco preparado com 1,5 mL da solução de DNS e água

destilada até completar 25ml de solução (Lucarini, 2006).

O reativo de DNS apresenta a seguinte composição em porcentagem em peso, conforme

Tabela 3:

Tabela 3: Composição do reativo de DNS em porcentagem em peso

Componente %(p/p)

Ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS) 0,6

Hidróxido de Sódio 1,13

Tartarato duplo de sódio e potássio 17,5

Fenol 0,43

Metabissulfito de sódio 0,47

Água destilada q.s.p

Fonte: Lucarini, 2006




24

Tartarato duplo de sódio e potássio, normalmente presente no reagente ácido

dinitrosalicílico pela redução de açúcar, interfere na ação protetora do metabissulfito de

sódio, mas também é essencial para a estabilidade da cor. A melhor composição de um

reagente de ácido dinitrosalicílico é dada na Tabela 3, através dos estudos realizados por

Miller, publicados no Analytical Chemistry, em 1959.

O reagente ácido dinitrosalicílico, desenvolvido por Sumner para a determinação

da redução de açúcar, é composta de ácido dinitrosalicílico, tartarato duplo de sódio e

potássio, fenol, metabissulfito de sódio e hidróxido de sódio. Segundo os autores do

ensaio, Tartarato duplo de sódio e potássio é introduzido para prevenir a dissolução do

oxigênio no reagente; fenol, para aumentar a quantidade de cores produzidas; e

metabissulfito de sódio e potássio, para estabilizar a cor obtida na presença do fenol. A

base é necessária para reduzir a ação da glicose no ácido dinitrosalicílico.

6.3.5 – Preparação e polpação da cana

Inicialmente, é necessário que o bagaço de cana passe por um processo de

lavagem, que visa a remoção de melado e possíveis impurezas. Após a lavagem, a cana

é seca em estufa e moída em um moinho de facas.

O processo de polpação é realizado em um reator batelada, o qual é carregado

com aproximadamente 230 g de bagaço de cana moída e 3 L de solução de soda a 9%

em massa. A mistura é então submetida a uma temperatura de aproximadamente 130ºC,

e um pressão entre 1,2 e 1,6 atm e agitação de 125 rpm, por 3 horas. Após este período,

a solução é descarregada, filtrada e lavada, sendo posteriormente encaminhada a estufa

para secagem.

6.3.6 – Sacarificação enzimática da celulose contida no bagaço de cana

As hidrólises enzimáticas foram realizadas com uma massa equivalente a 2 g de

cana previamente polpada inseridos em um balão de fundo redondo de uma boca, ao

qual foram adicionados 20 ml da solução enzimática de Celulase em concentrações

diferentes, de acordo com o planejamento estatístico, e 20 ml de solução tampão fosfato

citrato com pH 5. Após a adição dos reagentes, feitos sempre em duplicata, a mistura

contida no balão foi agitada manualmente, visando a homogeneização do meio reacional

para posterior tomada de pH. Em seguida, o balão foi encaminhado a um banho




25

termostatizado, o qual possuía temperatura equivalente a 50ºC, sendo submetido à

agitação variável de acordo com o planejamento estatístico, por um período de 2 horas.

Depois de decorrido o tempo de reação, a solução resultante foi filtrada a vácuo,

sendo que o pH foi novamente medido para comparações posteriores com os valores

iniciais. Analisou-se as amostras (sempre em duplicata) através do método enzimático

(item 6.3.3) e do método DNS (item 6.3.4). Em ambos os métodos, foi medida a

absorvância da solução colorida em 505 nm e 540 nm respectivamente, contra branco de

reagentes.

A concentração de glicose e de açúcares redutores nas amostras foi obtida

mediante a utilização de uma curva de calibração, preparada a partir de uma solução de

glicose em água. Vide anexos para ambas as metodologias.

6.4 – Planejamento estatístico

Como a celulose na forma de substrato é insolúvel em solução aquosa, as

enzimas terão que ser adsorvidas para poderem reagir. Assim, o processo enzimático é

heterogêneo, portanto, os efeitos difusionais das enzimas são tão importantes quanto os

efeitos cinéticos.

Baseado nisso, propôs-se um planejamento estatístico fatorial 22 de primeira

ordem, com três repetições dos pontos centrais, totalizando em 5 combinações

reacionais para ambas as etapas, sendo que a primeira refere-se a um volume total de

reagentes de 40 mL e a segunda, para um volume de 400 mL, de modo a monitorar a

conversão de celulose a glicose perante variações nas condições reacionais.

6.4.1 – Planejamento estatístico para volume de 40 mL

Com o objetivo verificar qual a melhor velocidade de agitação e a quantidade

ideal de enzima a ser empregada para obter-se a maior quantidade de glicose, propôs-se

o seguinte planejamento:




26

Tabela 4: Planejamento estatístico para 40 mL

Enzima Rotação (rpm) Ensaio Onde:

+ + 1 Enzima (g) + - 2 + - 0

- + 3 0,1 0,025 0,065

- - 4

0 0 5 Rotação (rpm) 0 0 6 + - 0

0 0 7 380 280 330

6.4.2 – Planejamento estatístico para volume de 400 mL

Com o objetivo verificar qual a melhor velocidade de agitação e o pH que

proporciona a maior quantidade de glicose, propôs-se o seguinte planejamento:

Tabela 5: Planejamento estatístico para 400 mL

pH Rotação (rpm) Ensaio Onde:

+ + 1 pH

+ - 2 + - 0

- + 3 6 4 5

- - 4

0 0 5 rotação (rpm)

0 0 6 + - 0

0 0 7 350 0 175

7 – Resultados e discussões

Após terem sido realizados os ensaios dos planejamentos estatísticos, obtiveram-se os

seguintes resultados:

7.1 – Primeira etapa – volume de 40 mL

Baseando-se no primeiro planejamento estatístico, realizaram-se seus

correspondentes ensaios, sendo obtidos os seguintes resultados:




Tabela 6:

Ensaio Enzima (g) Rotação(rpm)

1 0,1 380

2 0,1 280

3 0,025 380

4 0,025 280

5 0,065 330

6 0,065 330

7 0,065 330

Através de uma superfície de resposta

glicose e açúcares redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nos ensaios. Com

os resultados obtidos, construiu

(Figura 6) que expressa o comportamento enzimático nos meios reacionais estudados.

Porém, na primeira linha da tabela, nota

maior que o valor de açúcares redutores. Isso pode ser atribuído a erro experimental nas

análises realizadas.

Figura 6: Superfície de resposta

Observando a Figura 6,

glicose quando da diminuição da rotação, ou seja, a catálise enzimática é mais eficiente

em rotações mais baixas, pois

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

280 290 300

[G]

(g/L

)




: Resultados obtidos para volume de 40 mL

Rotação (rpm) pHinicial pHfinal

Abs. DNS

Abs. Enz.

380 5,42 5,61 1,40 0,53

280 5,41 5,72 1,64 0,57

380 5,35 5,54 0,51 0,12

280 5,52 5,95 0,43 0,13

330 5,53 5,85 1,17 0,39

330 5,58 5,71 0,96 0,28

330 5,40 5,67 0,93 0,25

Através de uma superfície de resposta, foi possível estimar as concentrações de

redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nos ensaios. Com

resultados obtidos, construiu-se a superfície de resposta da concentração de glicose

que expressa o comportamento enzimático nos meios reacionais estudados.

primeira linha da tabela, nota-se que o valor da concentração de glicose é


Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados

a Figura 6, pode-se verificar um leve aumento da concentração de

a diminuição da rotação, ou seja, a catálise enzimática é mais eficiente

pois quando elevadas podem acarretar desnaturação mecânica

0,025

0,055

0,085

300 310 320 330 340 350 360 370 380

Rotação (rpm)

_______________________________________________________________________________________________


27

Abs. Enz.

[A.R] (g/L)

[G] (g/L)

0,53 2,46 2,62

0,57 2,88 2,81

0,12 0,92 0,64

0,13 0,78 0,68

0,39 2,07 1,92

0,28 1,69 1,40

0,25 1,65 1,23

, foi possível estimar as concentrações de

redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nos ensaios. Com

da concentração de glicose

que expressa o comportamento enzimático nos meios reacionais estudados.

se que o valor da concentração de glicose é


aos ensaios realizados

o da concentração de

a diminuição da rotação, ou seja, a catálise enzimática é mais eficiente

desnaturação mecânica

0,085

En

zim

a (

g)




das enzimas, além disso, quanto maior a quantidade de enzima, maior a concentração de

glicose obtida, evidenciada pelo comportamento ascendente da superfície obtida.

Figura 7: Superfície de resposta

De acordo com os resultados mostrados

uma superfície semelhante ao da figura anterior

enzima empregada, maior a eficiência da catálise, e por conseqüência, a quantidade de

açúcares convertidos é mais elevada. Analogamente, o perfil de concentrações apresenta

um leve decaimento no que diz respeito à agitação do meio reacional.

7.2 – Segunda etapa – volume de 400 mL

Baseado no segundo planejamento estatístico

correspondentes aos ensaios

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

280 290 300

[A.

R]

(g/L

)




além disso, quanto maior a quantidade de enzima, maior a concentração de


Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios realizados

os resultados mostrados na Figura 7, verifica-se que foi gerada

semelhante ao da figura anterior, pois quanto maior a quantidade de

empregada, maior a eficiência da catálise, e por conseqüência, a quantidade de


um leve decaimento no que diz respeito à agitação do meio reacional.

volume de 400 mL

do no segundo planejamento estatístico a Tabela 7 mostra os resultados

ensaios propostos:

0,025

0,065

0,1

300 310 320 330 340 350 360 370 380

Rotação (rpm)

_______________________________________________________________________________________________


28

além disso, quanto maior a quantidade de enzima, maior a concentração de


aos ensaios realizados

se que foi gerada

, pois quanto maior a quantidade de

empregada, maior a eficiência da catálise, e por conseqüência, a quantidade de


mostra os resultados

En

zim

a (

g)




29

Tabela 7: Resultados obtidos para volume de 400 mL

Ensaio pHtampão

Rotação (rpm) pHinicial pHfinal

Abs. DNS

Abs. Enz.

[A.R] (g/L)

[G] (g/L)

1 6 350 6,19 6,25 1,14 0,34 2,01 1,68

2 6 0 6,18 6,22 1,15 0,34 2,03 1,66

3 4 350 4,23 4,19 1,46 0,69 2,57 3,39

4 4 0 4,26 4,15 1,25 0,40 2,21 1,96

5 5 175 5,28 5,08 0,31 0,49 0,56 2,42

6 5 175 5,29 5,20 1,44 0,74 2,53 3,63

7 5 175 5,29 5,14 0,87 0,62 1,55 3,03

Observando os resultados mostrados na Tabela 7, pode ser observado que para

ensaios realizados com valores de pH inicial acima de 5, ocorreu uma elevação no pH

do meio reacional durante a hidrolise. Ao passo que para valores menores ou iguais a 5,

foi observada uma diminuição deste pH, indicando que há a liberação de íons OH-

durante a reação, quer seja os íons pré existentes (provenientes da polpação) ou

resultantes da reação de hidrolise.

Através de uma superfície de resposta construída com dos resultados obtidos nos

ensaios de hidrolise, foi possível estimar as concentrações de glicose e açúcares

redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nesses ensaios. A superfície de

resposta, Figura 8, mostra o comportamento da concentração de glicose em função dos

meios reacionais estudados. Porém, no ensaio 3 e nos ensaios referentes ao ponto

central (5, 6 e 7; Tabela 7), observa-se que a concentração de glicose possui valores

maiores que os valores da concentração de açúcares redutores. Esse fato pode ter sido

causado por falha no procedimento das análises ou saturação das soluções utilizadas pra

tal.




Figura 8: Superfície de resposta da concentração de

Observando os resultados mostrados n

diferentes de 5 a concentração de glicose apresenta um declínio em relação à

concentração obtida em pH 5. Além disso, com a diminuição da rotação, a conce

de glicose também cai, contrariando os ensaios anteriores

quais a concentração de glicose aumenta com a diminuição da rotação. Esse fato pode

estar ligado maior dificuldade de transferência de massa, e distribuição da

substrato, ocasionado pelo aumento n

Figura 9: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios realizados

De acordo com a Figura

figura anterior, indicando que há alguma falha no processo de análise

140

210

280350

Rotação (rpm)

pH




Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados

os resultados mostrados na Figura 8, verifica-


concentração obtida em pH 5. Além disso, com a diminuição da rotação, a conce

de glicose também cai, contrariando os ensaios anteriores do planejamento anterior, nos

a concentração de glicose aumenta com a diminuição da rotação. Esse fato pode

maior dificuldade de transferência de massa, e distribuição da

substrato, ocasionado pelo aumento no volume feito para o segundo planejamento


De acordo com a Figura 9, verifica-se que foi gerada uma superfície

, indicando que há alguma falha no processo de análise, pois, a glicose é

4

4,5

5

5,5

6

1

1,5

2

2,5

3

0

70

140

pH

[G]

(g/L

)

Rotação (rpm)

70140

210

280

350pH

Rotação (rpm)

_______________________________________________________________________________________________


30

glicose aos ensaios realizados

-se que em pH


concentração obtida em pH 5. Além disso, com a diminuição da rotação, a concentração

do planejamento anterior, nos

a concentração de glicose aumenta com a diminuição da rotação. Esse fato pode

maior dificuldade de transferência de massa, e distribuição da enzima no

feito para o segundo planejamento.


se que foi gerada uma superfície diferente da

, pois, a glicose é

3,5

[G]

(g/L

)

1

1,5

2

2,5

0

[A.R

.] (

g/L

)

Rotação (rpm)




31

um açúcar redutor, portanto ambas as Figuras 8 e 9 deveriam apresentar um

comportamento semelhante, sendo que a concentração de açúcares redutores deve

possuir valores mais elevados, ou iguais, aos valores da concentração de glicose. Outro

fato que ressalta a possível falha é o ponto ótimo encontrado, no qual tem-se pH 4 sem a

presença de agitação sendo que ensaios anteriores demonstram que o pH ideal para tal

reação é 5. Diante do exposto, não é possível determinar qual das duas análises

apresentou a falha.

Esses resultados deveriam ter sido repetidos para que se pudesse sanar os

problemas apresentados nas analises e mostrar dados mais confiáveis, porém não havia

mais matéria-prima nem tempo hábil para realizá-los já que a aluna de iniciação se

formou e não faz mais parte do quadro discente desse centro universitário. Porém os

resultados alcançados já são de grande valia e mostram caminhos para novos ensaios e

projetos para uma nova leva de alunos interessados em pesquisa.




32

8 – Conclusão

Analisando os dados coletados nos ensaios do primeiro planejamento estatístico,

verificou-se que, dentre os meios reacionais estudados, o que fornece uma eficiência

mais elevada é aquele no qual se tem uma agitação mais baixa, cerca de 280 rpm e uma

quantidade de enzima de 0,1 g, que resulta em 2,81 g/L de glicose para 2 g de bagaço de

cana polpado. Contudo, observou-se que o pH da solução reacional elevou-se durante a

reação. Esse fato pode estar relacionado com a presença de soda ou íons Na+ adsorvidos

no bagaço, utilizada para realizar o tratamento de deslignificação (polpação), que

podem não ter sido totalmente removidos durante a lavagem efetuada após o processo.

Além disso, o tampão empregado não está mantendo o pH constante, que seria a sua

função.

Para os ensaios do segundo planejamento estatístico, optou-se por lavar o bagaço

de cana polpado com água, sendo seco em estufa antes da hidrólise. Esse procedimento

simples pareceu solucionar o problema da elevação do pH durante a reação, pois, de

acordo com as medidas de pH antes e após a hidrólise, não se verifica uma variação

significativa deste parâmetro.

Com relação ao segundo planejamento estatístico, não é possível concluir qual é

a melhor condição de trabalho, pois os resultados das análises foram divergentes e, em

virtude de falta de reagentes, não foi possível refazer-se os testes.

Para projetos futuros, sugiro um novo estudo de aumento de escala, pois não foi

possível determinar-se com precisão suas influências nesta reação, além do estudo do

uso de um evaporador rotativo para concentrar o hidrolisado, para que a fermentação se

torne possível.




33

9 – Referencias

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37

Anexos




38

Anexo 1: Curvas de calibração do espectrofotômetro

• Método Enzimático

A concentração de glicose é obtida no método enzimático através da análise

espectrofotométrica, utilizando uma curva de calibração que correlacione absorbância e

concentração de glicose. Para a elaboração dessa curva foram utilizadas amostras

padrões de concentração: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,6; 2,0. Utilizando solução mãe de

glicose 2g/L.

Tabela 8: Dados para a curva de calibração

De acordo com as análises realizadas no espectrofotômetro, obteve-se:

Tabela 9: Absorbância obtida para cada concentração de glicose

[G] (g/L) Abs. 0,2 0,034

0,4 0,086

0,8 0,168

1 0,188

1,2 0,225

1,6 0,313

2 0,418

Tubo [G] (g/L) Vsolução mãe (mL) Vágua (mL) Vtotal (mL)

1 0,2 1 9 10

2 0,4 2 8 10

3 0,8 4 6 10

4 1 5 5 10

5 1,2 6 4 10

6 1,6 8 2 10

7 2 10 0 10




39

Figura 10: Curva de calibração do Método Enzimático

• Método DNS

Para a utilização do método DNS, foi necessário o levantamento da curva de

calibração (absorbância em função da concentração de glicose). Esta curva foi elaborada

partindo-se de uma solução contendo 1 g/L de glicose (Merk D(+) Glicose anidro

180,16 g/mol) diluída em água destilada.

A partir desta solução, foram efetuadas diluições consecutivas para obter

soluções de 0,1, 0,2, 0,4, 0,5, 0,7 e 0,8 g/L. A quantidade de volume da solução de 1

g/L, denominada “volume estoque”, necessária para obter as diluições, foram calculadas

a partir da expressão: C1V1 = C2V2.

Tabela 10: Dados para curva de calibração

y = 4,8539x + 0,0356

R² = 0,992

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

[G]

(g/L

)

Absorvância

Método Enzimático

Tubo [G] (g/L) Vsolução mãe (mL) Vágua (mL) Vtotal (mL)

1 0,1 0,1 0,9 1

2 0,2 0,2 0,8 1

3 0,4 0,4 0,6 1

4 0,5 0,5 0,4 1

5 0,6 0,6 0,3 1

6 0,8 0,8 0,2 1

7 1 1 0 1




40

De acordo com as análises realizadas no espectrofotômetro, obteve-se:

Tabela 11: Absorbância obtida para cada concentração de glicose

[G] (g/L) Abs. 0,1 0,036

0,2 0,103

0,4 0,229

0,5 0,269

0,6 0,322

0,8 0,431

1 0,566

Curva de calibração

Figura 11: Curva de calibração do Método DNS

y = 1,7423x + 0,0274

R² = 0,9973

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

[G]

(g/L

)

Absorvância

Método DNS

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