Desenvolvimento de construções gênicas para a transformação de plantas Ricardo Harakava...
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Desenvolvimento de construções gênicas para a transformação de plantas
Ricardo HarakavaPesquisador CientíficoLaboratório de Bioquímica FitopatológicaInstituto Biológico
Transformação via Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens Um cromossomo linear de 2 Mb e um circular de 2.8 MbPlasmídeo Ti (tumor-inducing) de 200 Kb
Transformação via Agrobacterium
Transformação via Agrobacterium
Infecção de plantas por Agrobacterium
Transformação de plantas através de Agrobacterium
Gene Gun - Biobalística
Desenvolvido por John Sanford da Cornell University, em 1987 Particularmente útil para aquelas espécies que se mostraram previamente difíceis de transformação por Agrobacterium (monocotiledôneas) Única forma de introduzir genes em cloroplastos
Como funciona?
Cobertura de partículas de ouro ou tungstênio com o DNA de interesse Complexo partícula-DNA acelerado sob vácuo, atingindo tecido alvoAs células recebem o DNA diretamente
Trabalhando com o Gene Gun
Comparação Agrobacterium x Biobalística
Agrobacterium: DNA é integrado preferencialmente em algumas regiões do cromossomo denominadas “hot spots”; baixo número de cópias; mais eficiente em dicotiledôneas
Biobalística: integração do DNA é aleatória; elevado número de cópias; aplicável a um amplo espectro de plantas
Vetores para transformação via Agrobacterium
série pCAMBIA pBIN19, pBINPLUS pBI121 etc, etc, etc
Estrutura de um vetor
Genes de seleção
npt II – resistência a canamicina bar – resistência a herbicida PPT (phosphinothricin) hpt II – resistência a hygromicina man A – utilização de manose (seleção positiva) xyl A – utilização de xilose Revisão sobre marcadores: Aragão e Brasileiro, Braz. J. Plant Physiol., 14(1):1-10, 2002
Modelo de vetor para obtenção de plantas transgênicas sem marca de resistência
Genes reporter
uidA – GUS GFP (green fluorescent protein) luciferase
GFP direcionada ao núcleo celular
Luciferase em plântula de Arabidopsis
Estrutura de um gene eucariótico e seu promotor
Exercício: clonagem do gene, em sentido anti-senso, da capa protéica de um vírus em vetor para transformação de plantas
CaMV 35S - P CaMV 35S-T
HindIII - BamHI - EcoRI - PstI - XhoI
Região para inserção do transgene
Amplificação do gene
Desenho de primers para amplificação do gene por RT-PCR (o vírus é de RNA) Introdução de sítios de restrição nos primers para clonagem no vetor Verificar se as enzimas escolhidas não clivam o gene amplificado Verificar se as enzimas podem ser utilizadas concomitantemente Equilibrar as temperaturas de anelamento dos primers
Compatibilidade das enzimas
React 1 React 2 React 3
Hind III 55 100 20
Bam HI 100 40 100
Eco RI 100 100 100
Pst I 100 100 30
Xho I 55 100 40
Nível de atividade nos diferentes tampões (%)
Em negrito = tampão recomendado
Região codificadora da capa protéica do PFWV
1 agctgtacac agacaagaac gccagtttgg atgagctaca agaatatttg cgtgtcctag 61 attttgagca tacggaaggt tgctgtgaat ccgtgtctct ccaatcatcc actggaaaag 121 ataaagagga ggagagcaaa gatactatcg atgccggagg cgatggagga agaaaagaca 181 aagaaaaaga gaaaagaaca ggaactctgg caacccttga aaatccaaat cccattaatc 241 caaatggtgg tgacggctcg tctctaggta gagacaagga tgttaatgct ggctcgaaag 301 gcagagtagt gcctcgactg caaaagatta ccaagaaaat gaatctgcca acagtgaaag 361 gaagagtgat actcaacttg gatcatttga tcgagtacgc tccaaaccag gtagatttat 421 acaacactag agcgaccaaa tcacagttcg agtcctggta ttctgcagtc caaaaagaat 481 atgagctaga tgacaatcaa atgagcgtca tcatgaatgg tttcatggtt tggtgcattg 541 ataatggcac ctcaccaaat attaatggca tgtgggtgat gatggacgga gatgagcaga 601 ttgaataccc actaaagcca ttagttgaaa atgctcagcc cactctgaga cagataatgc 661 accatttttc tgatgcggct gaggcatata tagagatgag aaattccaaa gagccgtaca 721 tgcctaggta tggtactctg cggaatttga gggacttgag tttggctcgc tatgcttttg 781 acttttatga ggtcacatcc aaaacgccaa acagagcaag agaagcggta gctcagatga 841 aggccgctgc cctcgcgaac gtttccacta ggttgtttgg ccttgatgga aacgtttcaa 901 caaacagcga gaatactgaa aggcacactg caagggacgt taatcaaaac atgcacaccc 961 ttttgggaat gggtcctccg cagtaaaggt taggtaaact gaccacagtt agcatctcgc1021 attgccttta aatatctata gtagtatagc tttcactctc tttaagttta gtgtggttat1081 accaccttcc gtcgtgctta ttgtgatagt gtggctttgc caccagtgtc tgtgatatct1141 atagaataga gtcggggcag ggagaaccat tgcaacgccg gagctttcag agtgggtcac1201 ccacgcgcac tgaccgaggt ttggcaatgt ttgttgtcct
Desenho dos primers 1 agctgtacac agacaagaac gccagtttgg atgagctaca agaatatttg cgtgtcctag
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1021 attgccttta aatatctata gtagtatagc tttcactctc tttaagttta gtgtggttat1081 accaccttcc gtcgtgctta ttgtgatagt gtggctttgc caccagtgtc tgtgatatct1141 atagaataga gtcggggcag ggagaaccat tgcaacgccg gagctttcag agtgggtcac1201 ccacgcgcac tgaccgaggt ttggcaatgt ttgttgtcct
Desenho dos primers
F: 5’ – GAATTCTCATCCACTGGAAAAG – 3’ (sítio para Eco RI) Tm = 43.89 oC
R: 5’ – AAGCTTTTACTGCGGAGGACCC – 3’ (sítio para Hind III) Tm = 51.70 oC
Hind IIIEco RI
Acrescentar alguns nucleotídeos para digestão direta (sem pré-clonagem)
F: 5’ – AAAGAATTCTCATCCACTGGAAAAG – 3’
(sítio para Eco RI)
R: 5’ – AAAAAGCTTTTACTGCGGAGGACCC – 3’
(sítio para Hind III)
Pré-clonagem em vetor pGEM-T
AA
Produto amplificado por RT-PCR
Transferência do gene do vetor de clonagem para o vetor de tranformação
CP
CP/pGEM-T
Eco RI
Hind III
35S-P
35S-T
Eco RI
Hind III
Síntese de um gene
Genes podem ser sintetizados artificialmente acoplando-se diversos oligonucleotídeos Proteína pode ser modificada para maior atividade ou estabilidade (resistência a proteases da planta) Adição de peptídeos sinalizadores permitem direcionamento da proteína para diferentes compartimentos celulares Códons podem ser escolhidos para otimização da expressão na planta alvo
Exemplo: síntese de uma cecropina modificada
Cecropina: peptídeo bactericida produzido por insetos Eficaz em baixas concentrações Não há relatos de desenvolvimento de resistência por parte da bactéria
Sintese de gene por PCR
Sintese do gene de cecropina modificada
Promotores específicos
Controle da expressão do transgene para uma otimização de seu efeito ou redução de efeitos não desejáveis Exemplos: tecido-específico, órgão-específico, induzível por estresse hídrico, infecção por patógeno, injúria mecânica, estágio de desenvolvimento
Promotor específico ao xilema
Cortes transversais de pecíolo de folha de tabaco transgênico contendo gene GUS sob controle do promotor do gene da PAL de Arabidopsis
Objetivo: expressão de transgene para controle da bactéria Xylella fastidiosa
Passos para obter um promotor “algo”-específico
Identificar um gene que seja expresso especificamente na situação desejada (literatura: estudos de genes diferencialmente expressos, microarrays, ESTs)Verificar se seqüências do gene e seu promotor já estão disponíveis no GenBank (genomas completos de Arabidopsis e arroz estão disponíveis, cuidado com famílias multigênicas)Se o promotor não estiver disponível, utilizar uma das metodologias a seguir...
Clonagem de promotores
Screening de biblioteca genômica Busca no GenBank Gene-walking (PCR inverso ou com uso de adaptadores)
PCR inverso
Ochman et al., 1988
PCR inverso
Hin
d III
Eco
RI
Bam
HI
Região do promotor Gene com seqüênciaconhecida
Hin
d III
ATG
PCR inverso
Hin
d III
Digestão com Hind III
Hin
d III
ATG
PCR inverso
Circularização
Hind IIIATG
PCR inverso
Hin
d III
Amplificação por PCR
Região do promotorATG
Genome walker kit
Digestão com diferentes enzimas de restrição, em tubos separados
Ligação de adaptadores
1º PCR com primer específico ao gene (GSP1) e primer específico ao adaptador (AP1) - externos
2º PCR com primer específico ao gene (GSP2) e primer específico ao adaptador (AP2) - internos
Interferência de RNA
Presença de RNA dupla fita (dsRNA) na célula dispara mecanismo de degradação específicaDescrito em Caenorhabditis elegans (1998)Ocorre também em plantas, mamíferos, insetos e fungosForma de proteção do genoma do organismo contra transposons e vírus
RNA-induced silencing complex
Novina & Sharp, Nature 430:161, 2004
short interfering RNA
siRNA
21-23 nt3’ overhang de 2 ntProduto da ação de RNase tipo III (Dicer)
RNAi também atua em processos normais da célula
Foram encontradas moléculas pequenas de RNA em diferentes organismosDenominadas microRNAs (miRNAs)19-25 ntCodificados pelo próprio genoma do organismo, derivados de RNAs em forma de grampo (hairpin)Função: regulação da expressão de mRNA (particularmente em processos de diferenciação e desenvolvimento)
Em animais, miRNAs são parcialmente complementares ao mRNA alvoUm tipo de miRNA pode ter diferentes mRNAs alvosRegra geral, miRNAs ligam-se em vários trechos próximos a extremidade 3’ não traduzida do mRNAEssa ligação não leva à degradação do mRNA, mas inibide a sua tradução
miRNAs em animais
miRNAs em plantas
Em plantas, miRNAs são 100% (ou quase) complementares ao mRNA alvoUm tipo de miRNA tem somente um ou poucos mRNAs alvosA ligação do miRNA ao mRNA alvo leva à degradação do mRNA, da mesma forma que o siRNA
Exemplos de miRNA em Arabidopsis
Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002
Detecção do miRNA-5 em Arabidopsis
Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002
Comparação de construções para desencadeamento de silenciamento gênico
Vetor para expressão de mRNA em hairpin
Varsha Wesley et al., 2001
11-5549-0114