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FURG

DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PROTEÍNA DE ANCHOITA (Engraulis anchoita) MODIFICADA

ENZIMATICAMENTE

KELLY DE MORAES

Prof. Dr. WALTER AUGUSTO RUIZ ORIENTADOR

Prof. Dr. LUIZ ANTÔNIO DE ALMEIDA PINTO CO-ORIENTADOR

RIO GRANDE, RS 2007

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

MESTRADO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PROTEÍNA DE ANCHOITA (Engraulis anchoita) MODIFICADA

ENZIMATICAMENTE

Enga. de Alimentos Kelly de Moraes

Prof. Dr. Walter Augusto Ruiz

Orientador

Prof. Dr. Luiz Antônio de Almeida Pinto

Co-orientador

RIO GRANDE, RS 2007

Dissertação apresentada para

obtenção do título de Mestre em

Engenharia e Ciência de Alimentos

ii

Aos meus pais, Alberto e Hildegard.

Aos meus avós, Walter e Regina.

In memorian

Dedico.

iii

“Se fossem escolher entre alternativas, as decisões seriam fáceis. Uma

decisão inclui a seleção e a formulação de alternativas”.

Kenneth Burke

iv

AGRADECIMENTOS

A DEUS Por estar presente me proporcionando a vida, força de vontade e saúde para conquistar

mais esta etapa.

Ao Eduardo Pelo apoio, paciência, confiança, carinho e incentivo em todos os momentos, os quais foram

importantíssimos para realização deste trabalho.

A minha família Pelo apoio, confiança, dedicação e compreensão da minha ausência.

Ao meu orientador Dr. Walter Augusto Ruiz Pela paciência, colaboração e oportunidade de realizar este trabalho.

Ao meu Co-Orientador Dr. Luiz Antônio de Almeida Pinto Pela orientação, amizade, companheirismo, carinho, paciência, dedicação e colaboração

para meu crescimento pessoal e profissional.

Aos colegas de laboratório Maria, Jaques e Rogério Pela ajuda, amizade e convivência que tornaram possível a realização deste trabalho.

Aos Professores da Pós-Graduação Pelo conhecimento e aprendizado adquiridos.

À Professora Dra. Marta M. Marquezan Augusto Pelo apoio, amizade e empréstimo de laboratório e reagentes

Aos Professores de Pós-Graduação da Oceanografia Lauro Saint Pastour Madureira e Gilberto Henrique Griep

Pela amizade, colaboração, paciência e oportunidade de realizar este trabalho.

Aos colegas de programa de Pós-Graduação Pelo agradável convívio ao longo desses dois anos.

Às amigas Vivian, Elizangela, Catariana e Jaqueline Pela amizade, companheirismo, paciência e colaboração.

Às secretárias Islanda e Gicelda Pela atenção, carinho e amizade ao longo deste período.

Às futuras engenheiras de alimentos Cibele, Kellen e Luiza Pelo auxílio e disponibilidade imprescindíveis para a realização do trabalho.

À Fundação Universidade Federal do Rio Grande Pela formação profissional.

Ao Governo Federal representado pela Capes e CNPq e ao povo Brasileiro Pelo incentivo à pesquisa.

v

SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................viii LISTA DE TABELAS...............................................................................................................ix NOMENCLATURA....................................................................................................................x RESUMO GERAL....................................................................................................................xi GENERAL ABSTRACT..........................................................................................................xii CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................1 1 Introdução Geral................................................................................................................2 2 Objetivos.......................................................................................................................... .4

2.1 Objetivo Geral............................................................................................................ .4 2.2 Objetivos Específicos............................................................................................. ..4

CAPÍTULO II - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................5 2 Revisão Bibliográfica 6

2.1 Composição e Valor Nutricional do Pescado........................................................... 6 2.2 Estrutura e Composição do Músculo de Pescado ................................................... 6

2.2.1 A Anchoita Como Matéria Prima...................................................................... 7 2.3 Hidrólise Enzimática das Proteínas ......................................................................... 9

2.3.1 Enzimas Proteolíticas..................................................................................... 12 2.3.2 Propriedades dos Hidrolisados Enzimáticos de Proteínas ............................ 15

2.3.2.1 Solubilidade................................................................................................ 16 2.3.2.2 Capacidade Retenção de Água e Óleo...................................................... 17 2.3.2.3 Propriedades de Emulsificação.................................................................. 18 2.3.2.4 Propriedades de Formação de Espuma .................................................... 19 2.3.2.5 Digestibilidade in vitro ................................................................................ 19

2.4 Secagem em Leito de Jorro................................................................................... 20 2.4.1 Secagem de Pastas em Leito de Jorro .......................................................... 23 2.4.2 Secagem de Hidrolisados Protéicos .............................................................. 25

CAPÍTULO III – DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO.................................................... ..26 ARTIGO 1: Efeito da extensão da hidrólise sobre características do músculo de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente ...........................................27 RESUMO..................................................................................................................................27 ABSTRACT...............................................................................................................................28 1 Introdução........................................................................................................................29 2 Material e Métodos..........................................................................................................30

2.1 Matéria-Prima. .......................................................................................................30 2.2 Preparo da Matéria Prima ......................................................................................30 2.3 Modificação Enzimática................. ........................................................................30 2.4 Composição Proximal .... ........................................................................................32 2.5 Determinação da Atividade Enzimática ........... ......................................................32 2.6 Hidrólise Enzimática......................... ..................... ................................................33

2.6.1 Determinação do Grau de Hidrólise (GH) ........ ..............................................33 2.7 Digestibilidade in vitro ...... ......................................................................................33 2.8 Solubilidade ..... ......................................................................................................34 2.9 Capacidade Emulsificante .... .................................................................................34 2.10 Capacidade de Formação de Espuma ....... ...........................................................34 2.11 Planejamento Experimental ...... .............................................................................34

vi

3 Resultados e Discussão................................................................................................. 35 3.1 Composição Proximal .............................................................................................35 3.2 Atividade Enzimática ..............................................................................................36 3.3 Hidrólise Enzimática do Músculo de Anchoita.. ..................... ................................37 3.4 Planejamento Experimental.............................. .....................................................38

3.4.1 Grau de Hidrólise ...........................................................................................40 3.4.2 Produção no Leito de Jorro ............................................................................41 3.4.3 Digestibilidade in vitro. ....................................................................................42 3.4.4 Solubilidade ....................................................................................................43 3.4.5 Capacidade de Emulsificação ........................................................................44 3.4.6 Capacidade de Formação de Espuma ...........................................................46

4 Conclusões......................................................................................................................47 5 Agradecimentos...............................................................................................................47 6 Referências......................................................................................................................48 ARTIGO 2: Efeito da temperatura de secagem em leito de jorro nas características do músculo de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente.......................51 RESUMO.................................................................................................................................51 ABSTRACT..............................................................................................................................521 Introdução........................................................................................................................53 2 Material e Métodos...........................................................................................................54

2.1 Matéria-Prima .........................................................................................................54 2.2 Enzima................... ................................................................................................54 2.3 Preparo e Acondicionamento da Matéria-Prima.... ................................................55 2.4 Processo Enzimático............................. .................................................................55 2.5 Secagem....................................................... .........................................................55 2.6 Determinação da Composição Proximal........ ........................................................56 2.7 Determinação do Grau de Hidrólise (GH) ........... ..................................................56 2.8 Determinação da Digestibilidade in vitro........... .....................................................57 2.9 Determinação das Propriedades Funcionais............................................................57

2.9.1 Determinação da Capacidade de Retenção de Água e Óleo.............. ..........57 2.9.2 Determinação da Solubilidade.................................................... ...................56 2.9.3 Determinação das Propriedades Emulsificantes........................ ....................58 2.9.4 Determinação das Propriedades de Espuma............. ....................................58

2.10 Tratamento Estatístico.................................................... .......................................58 3 Resultados e Discussão..................................................................................................58

3.1 Composição Proximal.............................................................. ..............................58 3.2 Produção no Leito de Jorro................................................... .................................59 3.3 Digestibilidade in vitro............................................................... .............................61 3.4 Propriedades Funcionais.......................................................... ..............................62

3.4.1 Solubilidade........................................................................... .........................62 3.4.2 Capacidade de Retenção de Água e Óleo......................... ............................63 3.4.3 Propriedades Emulsificantes................................................ ..........................65 3.4.4 Propriedades de Espuma.................................................... ...........................66

4 Conclusões......................................................................................................................69 5 Agradecimentos...............................................................................................................70 6 Referências......................................................................................................................70

ARTIGO 3: Elaboração de uma sopa desidratada com músculo de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente..............................................................................74 RESUMO.................................................................................................................................74 ABSTRACT..............................................................................................................................75 1 Introdução........................................................................................................................76

vii

2 Material e Métodos..........................................................................................................77 2.1 Matéria Prima....................................................................................................... ..77 2.2 Preparo da Matéria Prima.................................................................................... ..77 2.3 Modificação Enzimática ...................................................................................... ...77 2.4 Determinação da Composição Centesimal......................................................... ...79 2.5 Determinação do Grau de Hidrólise (GH) ........................................................... ...79 2.6 Determinação da Digestibilidade in vitro............................................................ ....80 2.7 Determinação da Solubilidade ............................................................................ ...80 2.8 Formulação da Sopa Desidratada ...................................................................... ...80

2.8.1 Modo de Preparo da Sopa ......................................................................... ...81 2.9 Avaliação Sensorial da Sopa Desidratada......................................................... ....81

2.9.1 Avaliação de Preferência pelo Teste de Ordenação................................... ...81 2.9.2 Avaliação Hedônica pelo Consumidor. ........................................................ ..82 2.9.3 Cálculo do Índice de Aceitação.................................................................... ..83

2.10 Determinação do Valor Calórico Total.. ................................................................ .84 2.11 Avaliação Microbiológica.. ..................................................................................... 84 2.12 Tratamento Estatístico... ....................................................................................... .84

3 Resultados e Discussão..................................................................................................84 3.1 Composição Proximal e Grau de Hidrólise.. ........................................................ ..84 3.2 Digestibilidade in vitro e Solubilidade.. ................................................................ ..85 3.3 Elaboração da Sopa Desidratada.. ...................................................................... ..86 3.4 Avaliação Sensorial... ........................................................................................... .86

3.4.1 Avaliação da Preferência pelo Consumidor.. .............................................. ...86 3.4.2 Avaliação Hedônica pelo Consumidor. ....................................................... ...88

3.5 Composição Centesimal e Valor calórico Total do Produto Final .......................... 90 3.6 Avaliação Microbiológica ....................................................................................... 90

4 Conclusões......................................................................................................................91 5 Agradecimentos........................................................................................................ ......92 Referências..............................................................................................................................92 CAPÍTULO IV – CONCLUSÃO GERAL..................................................................................95 4 Conclusão Geral...............................................................................................................96 4.1 Sugestões para Futuros Trabalhos............................................................................97 CAPÍTULO V – REFERÊNCIAS ............................................................................................98 5 Referências Bibliográficas...............................................................................................99 CAPÍTULO IV – ANEXOS.....................................................................................................109

viii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA FIGURA 1: Anchoita (Engraulis anchoita). .............................................................................. 7 FIGURA 2: Estimativa da composição proximal de pescados gordos, incluindo a Anchoita, em função do conteúdo de água nas migrações..................................................................... 9 FIGURA 3: Mecanismo de ação das endopeptidases........................................................... 14 FIGURA 4: Diagrama esquemático de um leito de jorro tronco cone-cilíndrico .................... 21 FIGURA 5: Curva fluidodinâmica genérica – Perda de Carga x Velocidade......................... 22 CAPÍTULO III - DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ARTIGO 1 FIGURA 1: Diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo modificado enzimaticamente.................................................................................................................... 31 FIGURA 2: Atividade da enzima em diferentes temperaturas............................................... 37 FIGURA 3: Evolução da hidrólise enzimática de músculo do anchoita utilizando a enzima Neutrase®.. ........................................................................................................................... 38 FIGURA 4: Superfície de resposta para grau de hidrólise. ................................................... 40 FIGURA 5: Superfície de resposta para produção de MME no leito de jorro........................ 42 FIGURA 6: Superfície de resposta para solubilidade. ........................................................... 43 FIGURA 7: Superfície de resposta para capacidade de emulsificação................................. 45 FIGURA 8: Superfície de resposta para capacidade de formação de espuma..................... 46 ARTIGO 2 FIGURA 1: Produção de pó (MME90 e MME110) no secador em leito de jorro. .................. 59 FIGURA 2: Temperatura do ar de entrada e saída no secador: a) MME90 e b) MME110. .. 60 FIGURA 3: Digestibilidade in vitro para BSA, MME90, MME110 e MNM. ............................ 61 FIGURA 4: Solubilidade protéica do MME90, MME110 e MNM em diferentes meios. ......... 62 FIGURA 5: CRA e CRO para o MNMS, MME90 e MME110................................................. 64 FIGURA 6: Capacidade de emulsificação do MME, BSA e MNM. ........................................ 65 FIGURA 7: Estabilidade da emulsão para MME, BSA e MNM.............................................. 65 FIGURA 8: Capacidade de formação de espuma para MME90, MME110, MNM e BSA. .... 67 ARTIGO 3 FIGURA 1: Diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo modificado enzimaticamente.................................................................................................................... 78 FIGURA 2: Modelo de ficha aplicada no teste de ordenação................................................ 82 FIGURA 3: Modelo da ficha para avaliação hedônica........................................................... 83 FIGURA 4: Músculo (proteína) modificado enzimaticamente (MME) seco em leito de jorro. 85 FIGURA 5: Resultados da avaliação hedônica obtida a partir de 80 consumidores. ............ 89 FIGURA 6: Atitude do consumidor em relação ao consumo de sopa. 89 CAPÍTULO VI - ANEXOS FIGURA B1: Curva da atividade enzimática da Neutrase®. ............................................... 113 FIGURA B2: Curva da atividade residual da Neutrase®. .................................................... 113 FIGURA B3: Efeitos estimados das variáveis E/S, tempo e sua interação. ........................ 114 FIGURA B4: Temperatura de entrada e saída do ar no secador para os experimentos do planejamento experimental.................................................................................................. 115 FIGURA C1: Captura da anchoita (Engraulis anchoita) ...................................................... 116 FIGURA C2: Esquema do equipamento para secagem em leito de jorro. .......................... 116 FIGURA C3: Secador de leito de jorro, geometria cônica. .................................................. 117

ix

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO III - DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ARTIGO 1 TABELA 1: Matriz do planejamento experimental – variáveis independentes codificadas e não codificadas.................................................................................................................... ..35 TABELA 2: Composição proximal do Músculo não Modificado (MNM)................................. 36 TABELA 3: Composição proximal do Músculo Modificado Enzimaticamente (MME) em função da variação E/S e Tempo. ......................................................................................... 36 TABELA 4: Planejamento experimental da modificação enzimática do músculo de anchoita................................................................................................................................................ 38 TABELA 5: Coeficientes de regressão obtidos para GH, PLJ, D, S, CE e CFE.................... 39 TABELA 6: Análise de variância para GH, PLJ, D, S, CE e CFE, na modificação enzimática do músculo de Anchoita ..........................................................................................................39 ARTIGO 2 TABELA 1: Composição proximal do músculo modificado enzimaticamente (MME)............ 58 TABELA 2: Estabilidade de espuma para BSA, MME90 e MME110 a) 30min b) 60min ..... 68 ARTIGO 3 TABELA 1: Composição da formulação da sopa desidratada............................................... 81 TABELA 2: Composição proximal e grau de hidrólise do músculo não modificado (MNM) e modificado enzimaticamente (MME). .................................................................................... 84 TABELA 3: Digestibilidade e solubilidade para o MNM e MME. ........................................... 86 TABELA 4: Ordem de preferência atribuída pelos julgadores............................................... 87 TABELA 5: Módulo das diferenças entre as somas das ordens, obtidas a partir de 30 julgadores, para as três diferentes formulações de sopa . .................................................... 88 TABELA 6: Composição centesimal da sopa desidratada enriquecida com proteína de anchoita modificada enzimaticamente (Formulação B)......................................................... 90 TABELA 7: Avaliação microbiológica da sopa desidratada................................................... 91

x

NOMENCLATURA

MNM – Músculo não modificado;

MNMS – Músculo não modificado seco;

MME – Músculo (proteína) modificado enzimaticamente;

MME90 – Músculo (proteína) modificado enzimaticamente seco em leito de jorro a

90ºC;

MME110 - Músculo (proteína) modificado enzimaticamente seco em leito de jorro a

110ºC;

GH – Grau de hidrólise;

PLJ – Produção de MME no leito de jorro;

S – Solubilidade;

D – Digestibilidade in vitro;

CE – Capacidade de emulsificação;

CFE – Capacidade de formação de espuma;

CRA – Capacidade de retenção de água;

CRO – Capacidade de retenção de óleo;

xi

RESUMO GERAL

A modificação enzimática de proteínas utilizando enzimas cada vez mais específicas vem

sendo amplamente estudada com o intuito de agregar valor ao pescado de baixo valor

comercial, que normalmente é descartado no processamento industrial. A anchoita é uma

espécie pelágica distribuída desde o norte do Rio de Janeiro até o centro da Patagônia.

Nesta área foi verificado que há três populações e as mais abundantes são a Patagonian e

Bonaerense. Esta última poderia ser explorada sazonalmente no sul do Brasil

desenvolvendo uma nova pescaria num futuro próximo. O principal objetivo deste trabalho foi

desenvolver um processo para obtenção de um modificado protéico a partir de um pescado

de baixo valor comercial (Engraulis anchoita), visando à elaboração de um produto para

consumo humano. Foi avaliado, através da metodologia de superfície de resposta, o efeito

da extensão da modificação enzimática do músculo (proteína) de anchoita, por Neutrase®,

sobre a produção no secador, digestibilidade in vitro, solubilidade, capacidade de

emulsificação e formação de espuma. Também foi avaliado o efeito da temperatura do ar de

entrada do secador (90ºC e 110ºC) sobre a produção de músculo modificado

enzimaticamente (MME), digestibilidade in vitro e propriedades funcionais de capacidade de

retenção de água e óleo, solubilidade, propriedades de emulsão e espuma. Visando o

consumo humano, foi elaborada e avaliada uma sopa desidrata enriquecida com MME. Com

o aumento do grau de hidrólise, houve um aumento significativo na solubilidade e

capacidade de emulsificação. Entretanto, ocorreu uma diminuição na produção de MME e na

capacidade de formação de espuma. A digestibilidade in vitro permaneceu inalterada. O

músculo de anchoita modificado enzimaticamente por Neutrase® e seco em leito de jorro

apresentou características funcionais semelhantes aos de hidrolisados protéicos reportados

na literatura, tendo uma melhora significativa na digestibilidade in vitro e propriedades

funcionais, comparado com o músculo não modificado. A temperatura do ar de entrada do

secador de 110ºC não influenciou significativamente na produção e capacidade de retenção

de água do MME. Entretanto, a digestibilidade in vitro, capacidade de retenção de óleo,

propriedades de emulsão e espuma diminuíram. Com as características apresentadas pelo

MME, o mesmo pôde ser aplicado na formulação de um produto alimentício tipo sopa

desidrata. A formulação da sopa preferida pelo consumidor foi a que continha 7,5% de MME,

a qual apresentou um “Índice de Aceitação” de 86%. Uma sopa desidratada enriquecida com

proteína de anchoita modificada pode ser um produto promissor no mercado brasileiro, visto

que 71% dos julgadores consumiriam a sopa pelo menos de 15 dias a uma vez ao mês.

Palavras chave: hidrólise enzimática; proteína de pescado; secador em leito de jorro;

propriedades funcionais; subprodutos de pesca; espécies pelágicas.

xii

GENERAL ABSTRACT

The enzymatic modification of proteins utilizing enzymes even more specifics has been

widely studied with the aim of aggregate value to the fish of low commercial value, which is

normally discarded by industrial processing. The anchoita (Engraulis anchoita) is a pelagic

species distributed from the north of the Rio de Janeiro to the center of Patagonia. In this

area it has been assumed that there are three populations and the most abundant ones are

the Patagonian and Bonaerense. The last one is seasonally available in the south of Brazil

where a new fishery can start in the near future. The main objective of this work was to

develop a process for obtaining a modified protein starting from a fish of low commercial

(Engraulis anchoita) value, seeking to the elaboration of a product for human consumption. It

was evaluated, through the surface response methodology, the effect of the extension of the

enzymatic modification of the anchoita muscle (protein), by Neutrase®, about the production

in the spouted bed dryer, in vitro digestibility, solubility, emulsification capacity and foam

formation. It was also evaluated the effect of the temperature of the dryer entrance air (90ºC

and 110ºC) on the production of muscle (protein) enzimatically modified (MME), digestibility

in vitro and functional properties of water and oil holding capacity, solubility, emulsifying

properties and foam. Seeking the human consumption, it was elaborated and appraised a

dehydrated soup enriched with MME. With the increase of the hydrolysis degree, there was a

significant increase in the solubility and emulsification capacity. However, there was a

decrease in the production of MME and in the capacity of foam formation. The in vitro

digestibility stayed unaffected. The anchoita muscle (protein) enzimatically modified for

Neutrase® and dried in spouted bed presented functional characteristics similar to the protein

hydrolysate moderated in the literature and tended to a significant improvement in the in vitro

digestibility and functional properties, compared with the unmodified muscle. The

temperature of dryer entrance air of 110ºC didn't influence significantly in the production and

water holding capacity of MME. However, the in vitro digestibility, oil holding capacity,

emulsion properties and foam decreased. With the characteristics presented by MME, the

same could be applied in the formulation of a nutritious product like dehydrated soup. The

formulation soup favorite by consumers was the one that contained 7,5% of MME, which

presented an "Index of Acceptance" of 86%. The dehydrated soup enriched with anchoita

modified protein can be a promising product in the Brazilian market, because 71% of the

judges would consume the soup at least 15 days to once a month.

Keywords: enzymatic hydrolysis; fish protein; spouted bed dryer; functional properties, fish

byproducts; pelagic species.

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL 2

1 INTRODUÇÃO GERAL

O Brasil ocupa uma posição privilegiada tanto em termos de biodiversidade quanto à

sua capacidade de gerar recursos renováveis em grande escala. Em relação ao

desenvolvimento de novos produtos, existe abundante matéria prima a ser utilizada, e uma

enorme quantidade de biomassa a ser transformada em processos diversificados e de maior

valor agregado.

O pescado é uma importante parte da dieta diária de muitos países, contribuindo

com um quarto da oferta mundial de proteína de origem animal. Em grande número de

países o pescado é uma fonte relevante de emprego, lucro e moeda externa (SANTOS,

2006).

No atendimento à crescente demanda de alimentos, os recursos pesqueiros podem

contribuir significativamente para melhorar a qualidade nutricional da dieta, especialmente

nos países em desenvolvimento. De mais de 22000 espécies de peixes, somente algumas

centenas estão sendo utilizadas como alimento, sendo um terço da captura mundial de

pescado destinada à elaboração de ração animal ou desperdiçada como resíduo. A

subutilização de recursos pesqueiros pode ser atribuída a inúmeros fatores, que vão desde

a falta de tecnologia para a captura até a baixa disponibilidade de produtos aceitáveis ao

consumidor, a custo compatível com as demais fontes protéicas (CASTELLO, 2007).

O setor pesqueiro encontra dificuldades para o desenvolvimento de tecnologias

alternativas, ocasionando o declínio da capacidade produtiva na maioria das empresas

processadoras de produtos pesqueiros. Como o ocorrido em empresas do setor na cidade

do Rio Grande-RS, que nos últimos dez anos foram desativadas ou praticamente

paralisadas pela escassez de matéria-prima ou pela falta de inovações tecnológicas.

A diversificação para espécies menos populares, como pequenos peixes pelágicos é

uma realidade que necessita de pesquisas quanto a sua composição e aprimoramento

tecnológico para seu maior aproveitamento, gerando produtos de maior valor agregado.

A anchoita (Engraulis anchoita) é uma espécie pelágica amplamente distribuída

desde o norte do Rio de Janeiro até o centro da Patagônia. Nesta área foi verificado que há

três populações e as mais abundantes são a Patagonian e Bonaerense. Esta última poderia

ser explorada sazonalmente no sul do Brasil desenvolvendo uma nova pescaria num futuro

próximo. Sua biomassa pode variar de 800.000 a 1.900.000 toneladas e seu potencial de

pesca sustentável pode chegar a 100.000 toneladas/ano disponível para a produção de

novos produtos através de alterações nutricionais de ingredientes, controle de qualidade e


melhoria das técnicas de manejo de resíduos, e ainda constituem alternativas ao processo

tradicional (PANYAM & KILARA, 1996; CASTELLO, 1997; KRISTINSSON & RASCO, 2000ª;

MADUREIRA et al., 2004).

Avanços recentes nas áreas de Tecnologia e Engenharia de alimentos têm

demonstrado os benefícios potenciais da utilização de enzimas no processamento

principalmente de alimentos protéicos. Aumentando assim as possibilidades de

aproveitamento de matéria-prima, como pescados de baixo valor comercial. (PANYAM &

KILARA, 1996; KRISTINSSON & RASCO, 2000ª; GUAN et al., 2007; SINHÁ et al., 2007).

Proteínas hidrolisadas enzimaticamente surgem como uma nova tendência na

nutrição humana devido a facilidade de digestão e absorção gastrontestinal, especialmente,

pela presença de di- e tri-peptídeos e aminoácidos livres. Hidrolisados protéicos são

utilizados na elaboração de produtos geriátricos, suplementos energéticos, controladores de

peso e dietas terapêuticas ou entéricas (CLEMENTE et al., 1999).

A adição de enzimas para hidrolisar proteínas de alimentos é um processo de

considerável importância, pois pode melhorar a biodisponibilidade de nutrientes, as

propriedades funcionais e sensoriais das proteínas nativas sem prejudicar o seu valor

nutricional (KRISTINSSON & RASCO, 2000a). Tais propriedades dependem em grande

parte do tamanho molecular dos peptídeos gerados (grau de hidrólise) e são influenciadas

pela especificidade da enzima, natureza física e química da proteína intacta e da condição

de hidrólise (SURÓWKA et al., 2004).

Hidrolisados protéicos podem ser desidratados através de liofilização (SINHA et al.,

2007), freeze-drying (SHAIDI et al., 1995) ou secos em secadores do tipo spray (ABDUL -

HAMID et al., 2002). A secagem de alimentos é uma prática importante, utilizada

principalmente para aumentar o tempo de conservação dos mesmos, levando um melhor

aproveitamento da produção pesqueira.

A secagem em leito de jorro é uma técnica utilizada para a secagem de pastas e

suspensões devido, principalmente, ao grande grau de mistura das partículas,

proporcionando altas taxas de transferências de calor e de massa, e um alto número de

colisões (FREIRE, 1992). O secador em leito de jorro tem-se mostrado boa alternativa ao

secador spray, por fornecer produtos de qualidade similar, a custos significativamente

inferiores (SPITZNER & FREIRE, 2002). Como é o caso de proteínas modificadas

enzimaticamente e hidrolisados, viabilizando a obtenção de produtos com características

satisfatórias para o consumo direto, ou uso como matéria-prima para alimentos

desidratados.


2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

• Desenvolver um processo para obtenção de um modificado protéico a partir de

pescado de baixo valor comercial (Engraulis anchoita), visando o consumo humano

direto.

2.2 Objetivos Específicos

• Verificar a viabilidade de utilização do leito de jorro na secagem de modificados

protéicos de pescado;

• Estudar a influência da extensão da modificação enzimática (grau de hidrólise), por

Neutrase®, sobre a produção de músculo modificado enzimaticamente desidratado

no leito de jorro, digestibilidade in vitro e propriedades funcionais de solubilidade,

propriedades de emulsão e espuma;

• Avaliar o impacto da temperatura de secagem em leito de jorro sobre a produção do

secador, digestibilidade in vitro e propriedades funcionais do músculo modificado

enzimaticamente.

• Elaborar uma sopa desidratada enriquecida com músculo (proteína) de anchoita

modificado enzimaticamente e avaliá-la sensorialmente.

CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Composição e Valor nutricional do Pescado

Sob o aspecto nutricional, o pescado é uma das principais fontes de proteínas de alta

qualidade, com bom balanço de aminoácidos essenciais, fonte energética, pelo seu teor de

lipídeos (0,6-36%)e de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3. O pescado pode ser

considerado uma boa fonte de minerais (0,8-2%) fisiologicamente importantes, tais como o

magnésio, manganês, zinco e cobre, com conteúdos relativamente elevados, principalmente

em alguns moluscos e crustáceos. Considerado teor de vitaminas hidrossolúveis do

complexo B, porém as vitaminas lipossolúveis A e D estão presentes em maior

concentração (OGAWA & MAIA, 1999). O teor de proteínas no músculo do pescado varia

entre 15-26%, carboidratos entre 0,3-1%, água 70-80%, lipídeos de 1-10% e minerais 1-

1,5% (YAHNKE, 2001).

2.2 Estrutura e Composição do Músculo de Pescado

O músculo do pescado é dividido em dois grupos principais; músculo ordinário ou

branco e músculo escuro ou sangüíneo. A diferença em coloração ocorre em razão do alto

conteúdo de mioglobina hemoglobina e citocromo do músculo escuro. Os músculos brancos

compreendem a maioria da musculatura do corpo, já os músculos escuros, subcutâneos,

estão localizados perifericamente ao longo do eixo central do corpo do animal e sua

concentração aumenta em direção à cauda do pescado. O músculo branco é muito uniforme

em composição, indiferente da sua localização (OGAWA & MAIA, 1999).

O músculo escuro, no entanto, varia sua composição em função da sua localização,

contendo mais lipídeos na parte anterior do peixe e mais água e proteína na parte posterior.

Uma fração maior de tecido de músculo escuro está presente em peixes que vivem em

ambientes de baixa temperatura. Quando os peixes nadam, normalmente não movimentam

nenhuma fração do músculo branco (CONTRERAS, 1994).

Os músculos do pescado são um tecido heterogêneo, composto por uma mistura de

tipos de fibras, uma matriz extracelular, macrófagos e sangue. É constituído por vários

grupos de proteínas: - as que formam a fração sarcoplasmática, que desempenham funções

bioquímicas nas células; - as proteínas miofibrilares do sistema contrátil; - as proteínas dos

tecidos conjuntivos, responsáveis principalmente pela integridade dos músculos

(OETTERER, 2007).


As proteínas sarcoplasmáticas encontram-se no líquido extracelular em pequenas

porções do sarcoplasma e têm a propriedade de ser solúveis em água e em soluções

salinas diluídas. Estas proteínas compreendem 30% do total das proteínas do músculo do

pescado (OETTERER, 2007).

O grupo das albuminas é composto por mais de 100 proteínas diversas, com ampla

variedade de pesos musculares e pontos isoelétricos, sendo que a maioria tem atividade

enzimática. Aqui estão incluídas as proteínas ligadas a ácidos nucléicos, os componentes

das lipoproteinas e as cromoproteinas do músculo e do sangue. Peixes de águas geladas

têm glicoproteinas anticongeladoras (OETTERER, 2007).

As proteínas miofibrilares compreendem 40 a 60% do total protéico. São

basicamente a miosina e a actina. Estas proteínas é que se complexam , formando a

actomiosina, no momento do “rigor mortis”, são também responsáveis pela capacidade do

pescado em reter água, pelas propriedades organolépticas e pela capacidade de formação

de gel. A miosina constitui de 50 a 60% da fração miofibrilar e a actina, 15 a 20%

(OETTERER, 2007).

2.2.1 A Anchoita Como Matéria Prima

A Engraulis anchoita (Figura 1) é uma espécie da família Engraulidae, do gênero

Engraulis, também comumente chamada de Anchovy, Atlantic-anchovy, Argentinian-

anchovy (CASTELLO, 1997, DINARA, 2005).

FIGURA 1: Anchoita (Engraulis anchoita).

Fonte: DINARA (2005).

A anchoita tem uma posição relevante no ecossistema pelágico da região sul -

sudeste do Brasil por sua abundância e posição como consumidor secundário na cadeia

trófica. A função ecológica da anchoita como predadora e presa e, sua dinâmica

populacional, são aspectos importantes para o estudo do ecossistema da plataforma

continental da região S-SE do Brasil. A anchoita apresenta-se amplamente distribuída no

Atlântico SW, desde o Cabo de São Tomé no Rio de Janeiro (22ºS) até o centro da


Patagônia – Golfo de São Jorge (47°S) na Argentina (BAKUN & PARRISH, 1991;

CASTELLO, 2003; CASTELLO, 2007).

O gênero Engraulis é provavelmente o clupeiforme mais largamente distribuído e, é

encontrado em águas costeiras de várias plataformas continentais com uma amplitude de

temperatura superficial compreendida entre 6 e 22°C. Os sub-adultos toleram baixas

salinidades podendo ser encontrados em águas estuariais. E. anchoita sustenta apenas

pescarias de cunho artesanal com volumes muito abaixo do potencial de sua biomassa

comprovada, que pode variar de 800.000 a 1.900.000 toneladas (LIMA & CASTELLO, 1995;

CASTELLO, 1997; MADUREIRA et al., 2004).

Das oito espécies do gênero, seis sustentam importantes pescarias industriais,

principalmente como fonte de matéria prima para a fabricação de farinhas destinadas à

produção de rações animais. Em alguns casos, particularmente na pescaria de Engraulis

encrasicholus no Mar Mediterrâneo e Mar Negro, o principal destino é o consumo fresco,

principalmente na primavera e verão, e a produção de diversas conservas e produtos, como

marinados em vinagre e maturados em salmouras (CASTELLO, 20075; PONS-SÁNCHEZ-

CASCADO, et al., 2006)

A elevada exploração dos estoques demersais tradicionais no sul e sudeste do Brasil

e uma falta de política pesqueira nacional e estadual, têm levado a uma queda sensível na

oferta de matéria prima local para a indústria de processamento de pescado. Em princípio, a

anchoita é um estoque alternativo virgem, que poderia ser explorado sazonalmente

desenvolvendo uma nova pescaria na região. Entretanto, verificam-se dificuldades para que

a anchoita torne-se uma alternativa viável economicamente em uma indústria, em parte pelo

desconhecimento do produto e pela sua fragilidade ao manuseio (LIMA & CASTELLO, 1995;

CASTELLO, 20075)

A composição química dos peixes varia de uma espécie e de um indivíduo a outro

dependendo de fatores como idade, sexo, ambiente e estações do ano. A Engraulis

anchoita é considerada um espécie “gorda”, por apresentar uma grande variação no teor de

lipídeos dependendo da época do ano (Figura 2), sendo este teor inversamente proporcional

ao conteúdo de água. No outono o teor de lipídeos pode variar de 12-16%. O conhecimento

da composição proximal do pescado é de grande importância na aplicação de diferentes

processos tecnológicos. Além de influenciar na qualidade da matéria-prima e estabilidade do

produto (YANNES & ALMANDOS, 2003).


FIGURA 2: Estimativa da composição proximal de pescados gordos, incluindo a anchoita,

em função do conteúdo de água nas migrações.

Fonte: YANNES (2004).

2.3 Hidrólise Enzimática das Proteínas

A modificação de proteínas de alimentos para o melhoramento das propriedades

sensoriais e estabilidade durante a estocagem dos recursos de proteína disponível é uma

tecnologia antiga. Hidrolisados protéicos podem ser definidos como proteínas que foram

química ou enzimaticamente quebradas em peptídeos menores e de diferentes tamanhos.

Proteínas hidrolisadas são produzidas para uma ampla variedade de usos na indústria de

alimentos, incluindo substitutivos do leite, suplementos protéicos, estabilizantes em bebidas

e realçadores de flavor em produtos de confeitaria (KRISTINSSON & RASCO, 2000ª).

A hidrólise de proteínas pode ser realizada por método químico (ácido ou álcalino) ou

biológico (enzimático). O método enzimático é mais indicado ao invés de métodos químicos

rigorosos para a produção de hidrolisados em aplicações nutricionais. A hidrólise enzimática

pode produzir hidrolisados com o perfil de peptídeos bem definido, enquanto que as

hidrólises ácida e alcalina podem destruir L-aminoácidos, produzindo D-aminoácidos e ainda

formar substâncias tóxicas como lisino-alanina. Isso é especialmente crítico em hidrolisados

protéicos, onde as proporções de aminoácidos, dipeptídeos e tripeptídeos são importantes

para absorção efetiva (LAHL & BRAUN, 1994; KRISTINSSON & RASCO, 2000ª).

Proteínas de pescado podem ser hidrolisadas com enzimas vegetais e/ou

microbianas que atuam como catalisadores, e aceleram a hidrólise das proteínas. Esse

processo é diferenciado da elaboração da silagem de pescado, que ocorre pela ação de


enzimas presentes naturalmente no próprio pescado, e é mais lento. A ação proteolítica no

processo hidrolítico é acelerada pela adição de enzimas à matéria-prima, controle do pH, da

temperatura e de outras variáveis. (SHAIDI & KAMIL, 2001; OETTERER & FURLAN, 2002).

A hidrólise enzimática das proteínas de pescado é um método alternativo, que

objetiva a recuperação de proteínas de espécies subtilizadas ou de resíduos de

processamento, que seriam desperdiçados, através do emprego de enzimas proteolíticas

para solubilização da proteína do pescado. No processo de hidrólise, as enzimas

proteolíticas são utilizadas para solubilizar a proteína muscular do pescado, em uma

hidrólise extensiva. O resultado será a separação em duas fases distintas, a solúvel e a

insolúvel. Geralmente, a fração insolúvel é utilizada como ração animal, enquanto que a

solúvel pode ser convertida em ingredientes alimentares e incorporada em sistemas

alimentícios. O hidrolisado solúvel é submetido à desidratação, resultando numa forma mais

estável, em pó, com alta concentração protéica. Tal produto é conhecido como hidrolisado

protéico de pescado (DINIZ & MARTIN, 1996).

Entretanto, os aminoácidos presentes nos hidrolisados são semelhantes aos da

proteína original quando não é separada a fração insolúvel, e a qualidade protéica da

proteína hidrolisada de pescado é um pouco inferior, se for considerada somente a fração

solúvel. Nesse caso, a composição em aminoácido depende do grau de hidrólise obtido

(SHAIDI et al., 1994).

Não existem dados que possibilitem determinar com clareza qual a espécie de pescado

mais adequada ao processo hidrolítico. A eleição da matéria-prima depende da

disponibilidade do fabricante e das especificações exigidas pelo cliente. A matéria-prima

atualmente utilizada são os descartes comestíveis de processamento de pescado magro,

visto que espécies com alto teor de gordura promovem o desenvolvimento de aromas

intensos no produto elaborado (OETTERER & FURLAN, 2002).

Espécies magras é o substrato de escolha para a hidrólise enzimática, já que

problemas com oxidação lipídica podem ser reduzidos. Do ponto de vista econômico, o

pescado do tipo pelágico, que é mais abundante, seria o preferido. Os peixes pelágicos

compreendem 23% da pesca mundial, dos quais somente 42% é utilizado para alimentação

humana. A maioria destes pelágicos são de espécies gordas, tais como arenque, sardinha

ou anchova, e o hidrolisado protéico de pescado preparado com estes pescados pode

conter alto conteúdo de lipídeos, o que requer tratamentos adicionais, tais como alta

centrifugação, para remoção do excesso de gordura (DINIZ & MARTIN, 1996).


Segundo Hall e Ahmad (1992), citado por Oetterer & Furlan (2002), hidrolisados

protéicos de pescado freqüentemente apresentam sabor amargo, e sua intensidade

depende do grau de hidrólise e da especificidade da protease, ou seja, do tamanho dos

peptídeos gerados e da intensidade da quebra das ligações. Acredita-se que o sabor

amargo decorra da exposição de aminoácidos hidrofóbicos ao ambiente aquoso, pois o peso

molecular dos peptídeos é tal que eles não podem se esconder dentro da molécula protéica,

o que ocorreria normalmente na proteína intacta. A composição dos hidrolisados protéicos

de pescado em geral reflete a composição da matéria-prima que lhe deu origem. A

composição típica de um hidrolisado protéico produzido a partir de um peixe magro (não

gorduroso) com base no peso seco é de 85-90% de proteína, 2-4% de lipídios e 6-7% de

cinza.

A hidrólise enzimática tem sido empregada em uma variedade de diferentes

proteínas, como da pecuária (bovinos e aves), leite e seus derivados (soro), plantas e

sementes. A hidrólise de pescado e outros alimentos aquáticos estão sendo visto com maior

freqüência na literatura.

• Aspmo et al. (2005) estudaram a hidrólise enzimática em vísceras de Gadus

morhua L. utilizando diferentes enzimas comerciais;

• Shaidi et al. (1995) estudaram a produção e características de hidrolisados

protéicos de Mallotus villosus utilizando enzimas comerciais como Neutrase®,

Alcalase® e papaína;

• Lalasidis et al. (1978) estudou a composição e o valor nutritivo de hidrolisados de

pescado tratados com Alcalase® e Pancreatina;

• Kristinsson & Rasco (2000b), c estudaram as propriedades funcionais e a cinética

de hidrolisados do músculo de Salmo salar utilizando enzimas comerciais;

• Quaglia & Orban (1990) estudaram as propriedades de emulsificação de hidrolisado

de Sardina pilchardus;

• Abdul-Hamid et al. (2002) estudaram a influencia da temperatura de secagem em

hidrolisados de tilápia – Oreochromis mossambicus;

• Benjakul & Morrissey (1997) estudaram hidrolisados protéicos obtidos a partir de

Merluccius productus utilizando Neutrase® e Alcalase®;

• Cândido & Sgarbieri (2003) estudaram o efeito nutricional e nas propriedades

hidrofílicas das proteínas miofibrilares de Tilapia do Nilo (Oreochromus niloticus);


• Diniz & Martin (1996) estudaram os efeitos combinados do pH, temepratura e razão

E/S sobre a hidrólise de Squalus acanthias;

• Fonkwe & Singh (1995) estudaram a hidrólise enzimática de resíduos de peru

mecanicamente separados;

• Guérard et al. (2002) estudaram a produção de hidrolisados de resíduos de atum

preparados a partir de proteases neutras;

• Guan et al. (2007) estudou algumas propriedades funcionais de proteína

concentrada de farelo de aveia modificado por tripsina;

• Sinha, et al. (2007) estudaram as propriedades funcionais e a qualidade nutricional

de proteína de soro de leite hidrolisada com tripsina e protease fúngica, sendo este

hidrolisado aplicado em formulação de uma bebida;

• Synowiecki et al. (1996) estudaram a hidrólise de sangue bovino e a diminuição de

seu gosto amargo através de reação com plasteína;

• Drago & González (2001) estudaram as propriedades de espuma de glúten

modificado enzimaticamente;

• Diniz & Martin (1997) verificaram o efeito da extensão da hidrólise de músculo de

tubarão (Squalus acanthias) nas propriedades funcionais;

• Bombara et al. (1997) estudaram as propriedades funcionais de farinha de trigo

modificada enzimaticamente por proteases;

• Surówka et al. (2004) estudaram propriedades funcionais de proteína de soja

extrusada e modificada enzimaticamente;

• Nilsang et al. (2005) otimizaram as condições de reação de hidrólise em

subprodutos de atum enlatado;

• Roman & Sgarbieri (2005) estudaram as propriedades funcionais de caseína bovina

modificada enzimaticamente.

2.3.1 Enzimas Proteolíticas

As enzimas utilizadas pela indústria e na pesquisa em alimentos são

predominantemente as hidrolases. As mais utilizadas são as carboxilases seguido das

proteases e lipases. As proteases são as mais caracterizadas dentre as enzimas.

Preparados de enzimas proteolíticas são, sob o ponto de vista econômico, o grupo mais


importante de enzimas e seu uso já é bastante conhecido na indústria de alimentos (LAHL &

BRAUM, 1994; KRISTINSSON & RASCO, 2000a)

As proteases são classificadas de acordo com a especificidade de ataque à ligação

peptídica e pelo mecanismo de hidrólise. Em termos de especificidade se classificam em:

serino-, thiol-, carboxi- e metallo-protease. Pelo mecanismo de hidrólise em endoproteinases

ou exopeptidases. As endoproteinases clivam as ligações peptídicas no interior da molécula

da proteína produzindo, normalmente, peptídeos relativamente grandes. As exopeptidades

sistematicamente removem os aminoácidos dos grupos N-terminal (aminopeptidades) ou C-

terminal (carboxipeptidases). Geralmente a hidrólise de proteínas alimentícias sempre são

usadas endoproteinases, entretanto, ocasionalmente essas enzimas são combinadas com

exopeptidases para o alcance de uma degradação mais complexa (ADLER-NISSEN, 1976).

A hidrólise enzimática, para a produção de hidrolisados de pescado ou de outras

proteínas alimentares, pode ser realizado com enzimas das vísceras e músculo do próprio

pescado (enzimas endógenas), ou adicionando enzima de outras fontes. O uso direto de

células microbianas na hidrólise de proteínas é um procedimento alternativo que tem sido

investigado (FONKWE & SINGH, 1996; KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

Com a adição de enzimas exógenas o processo hidrolítico pode se processar de

maneira mais reprodutível e controlada. Diferentes proteases comerciais têm sido testadas

em diferentes pescados e os resultados indicam uma enzima para cada tipo de substrato e

método de processamento (ASPMO et al., 2005).

As proteases comerciais mais comumente empregadas na hidrólise de proteína de

pescado, são de origem vegetal (Papaína, Bromelina e Ficina), animal (Pepsina,

Quimiotripsina ou Tripsina) e enzimas de origem microbiana (Alcalase, Neutrase®, Protease

N, Protamex, entre outras). Em comparação com enzimas de origem vegetal e animal, as

enzimas microbianas oferecem vantagens, inclusive uma ampla variedade de atividades

catalíticas disponíveis, maiores pH e estabilidade de temperatura. Geralmente, reações com

Alcalase® têm sido mais favoráveis para a hidrólise de pescado devido ao alto grau de

hidrólise que pode ser alcançado em um tempo relativamente curto e condições moderadas

se comparadas com enzimas neutras e ácidas (GUÉRARD et al., 2002; OETTERER &

FURLAN, 2002; ASPMO et al., 2005).

O mecanismo de hidrólise enzimática das proteínas musculares do pescado é

caracterizado por uma rápida fase inicial, durante a qual, várias ligações peptídicas são

hidrolisadas, a velocidade da reação decresce até atingir uma fase estacionária. A taxa de

clivagem das ligações peptídicas controla a taxa global de hidrólise, ao mesmo tempo, o


substrato disponível diminui com o avanço do tempo (SHAIDI et al., 1995; GUÉRARD et al.,

2001).

As endopeptidases, como a Neutrase® e Alcalase®, atacam as ligações peptídicas

de acordo com o esquema a apresentado na Figura 3.

FIGURA 3: Mecanismo de ação das endopeptidases.

Fonte: NOVO INDUSTRI (1980)

Segundo Guérard et al. (2002), a proteólise pode operar de modo sequencial,

liberando um peptídeo de cada vez, ou pela formação de intermediários que são

hidrolisados em pequenos peptídeos com o progresso da hidrólise. Dependendo da

especificidade da enzima, das condições ambientais e da extensão da hidrólise, uma larga

variedade de peptídeos serão gerados. O hidrolisado protéico resultante possuirá

propriedades peculiares de acordo com os novos peptídeos gerados.

A hidrólise das ligações peptídicas conduz a um aumento no número de grupos

ionizáveis (NH3+ e COO-) e concomitante aumento na hidrofobicidade e rede de carga, uma

diminuição no peso molecular da cadeia polipeptídica com uma alteração na estrutura

molecular conduzindo a uma maior exposição do interior hidrofóbico para o meio aquoso

(MAHMOUD, 1994).

A especificidade da enzima é um fator chave que influencia as características do

hidrolisado e a natureza e composição dos peptídeos produzidos. A especificidade enzima

substrato é importante para as propriedades funcionais do hidrolisado, pois influencia


fortemente no peso molecular e no balanço hidrofóbico/hidrofílico dos produtos de hidrólise.

Quanto mais ampla a especificidade, os peptídeos produzidos são de menor tamanho e

mais complexo o seu perfil. (KRISTINSSON & RASCO, 2000b; CÂNDIDO & SGARBIERI,

2003).

A especificidade não é o único fator que afeta o perfil do produto final. Fatores do

meio como, temperatura e pH, podem afetar a cinética de reação enzimática, e o efeito

desses fatores é diferente para cada enzima. Geralmente há uma combinação entre

temperatura e pH onde a enzima é mais ativa. Temperatura e pH extremos podem desativar

a enzima desnaturando-a (LINDER et al. 1995) A escolha da protease, do substrato

empregado e o grau de hidrólise da proteína também podem afetar grandemente o resultado

das propriedades físico-químicas dos hidrolisados (MULLALY et al., 1995).

O parâmetro que permite medir a extensão da hidrólise é o grau de hidrólise (GH).

Ele determina as propriedades de um hidrolisado protéico para um dado sistema proteína-

enzima e variáveis do processo: substrato, proporção enzima-substrato, temperatura e

tempo, devem ser controladas a efetiva medida do GH (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

Após atingir o GH máximo ou desejado, é necessário terminar a reação através de

métodos químicos e/ou térmicos. Geralmente o meio de reação é transferido para um banho

com temperatura controlada podendo variar de 75 a 100ºC por 5 a 30 minutos para que

ocorra a inativação enzimática (HOYLE & MERRIT, 1994).

Proteínas desnaturam com o calor, principalmente proteínas do músculo de pescado,

as quais trabalham em baixas temperaturas. A desnaturação protéica é indesejada, pois

resulta na alteração das propriedades físico-químicas, inclusive na perda de solubilidade.

Assim como a temperatura, extremos de pH também podem ter efeitos negativos sobre as

proteínas e peptídeos. Muitas proteínas se desdobram em pH menores que 5 e maiores que

10 (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

2.3.2 Propriedades dos Hidrolisados Enzimáticos de Proteínas

Uma das maiores vantagens e objetivos de hidrolisar enzimaticamente a proteína de

pescado é modificar ou melhorar suas propriedades funcionais e nutricionais. As

propriedades funcionais dos hidrolisados protéicos de pescado são importantes

particularmente quando são utilizados como ingredientes em produtos alimentícios

(GILDBERG, 1993).

A hidrólise enzimática da proteína de pescado gera uma mistura de aminoácidos

livres, di-, tri-, e oligopeptídeos, aumenta o número de grupos polares e a solubilidade do


hidrolisado e, portanto, modifica as características funcionais das proteínas, melhorando-as

e melhorando também a biodisponibilidade. A natureza do substrato, das proteases e o grau

de hidrólise afetam diretamente as propriedades físico-químicas do hidrolisado (MULLALY et

al., 1995).

As propriedades físico-químicas que governam a funcionalidade da proteína incluem

tamanho, formato, composição e seqüência de aminoácidos, sistema de cargas e

distribuição de cargas, hidrofobicidade, estruturas dos peptídeos, flexibilidade molecular e a

habilidade de interagir e reagir com outros componentes (KRISTINSSON & RASCO,

2000ª,b,).

A manipulação das condições de reação durante a hidrólise enzimática de proteínas

interfere nas propriedades funcionais de solubilidade, dispersibilidade, capacidade de

retenção de água, emulsificação e propriedades de espuma do produto final. Um aumento

no tempo de hidrólise ou na relação enzima/substrato resultará em uma diminuição do

comprimento médio da cadeia de peptídeos na fração solúvel (proteína hidrolisada). Porém,

uma proteólise prolongada poderá resultar na formação de peptídeos extremamente

solúveis com propriedades funcionais indesejáveis o que poderá promover a formação do

gosto amargo (DINIZ & MARTIN, 1999).

2.3.2.1 Solubilidade

A solubilidade é uma das mais importantes propriedades físico-química e funcional

das proteínas hidrolisadas. Uma baixa solubilidade pode causar uma aparência não muito

atrativa e uma textura arenosa no produto final (KRISTINSSON & RASCO, 2000a,b,

MAHMOUD et al., 1992).

Interações hidrofóbicas e iônicas são fatores de maior influência nas características

de solubilidade das proteínas. Interações hidrofóbicas promovem interações proteína-

proteína e resultam em uma diminuição da solubilidade, enquanto interações iônicas

promovem interações proteína-água e resultam em um aumento da solubilidade. Resíduos

iônicos na superfície dos peptídeos e proteínas introduzem a uma repulsão eletrostática

entre as moléculas de proteína e repulsão entre as cargas hidratadas ao redor dos grupos

iônicos, ambos são os maiores contribuidores para o aumento da solubilidade das proteínas

(KRISTINSSON & RASCO, 2000c).

Uma hidrólise extensiva leva o substrato a um maior grau de hidrólise, pode

aumentar a solubilidade, mas isto pode ter efeitos negativos em outras propriedades

funcionais (MULLALLY, 1995). Kristinsson & Rasco (2000c), ao estudar a solubilidade de


hidrolisado enzimático do músculo de salmão, com GH de 5, 10 e 15%, encontraram um

resultado de 99,7%, 98,7% e 95,2%, respectivamente, mostrando que o menor GH

apresentou uma maior solubilidade. Entretanto, Diniz & Martin (1997) encontraram uma

maior solubilidade com o aumento do GH em proteína hidrolisada de tubarão. Kong et al.

(2007), ao avaliar a solubilidade do glúten de trigo modificado enzimaticamente, reportaram

um aumento desta com o aumento do GH.

2.3.2.2 Capacidade Retenção de Água e Óleo

A capacidade de retenção de água (CRA) refere-se à habilidade da proteína em

absorver água e retê-la contra a força gravitacional dentro da matriz protéica, como tal um

gel protéico ou um músculo bovino ou de pescado e isto está positivamente correlacionado

com a capacidade de ligação da água (DAMODARAN, 1996).

A CRA das proteínas é de grande importância para indústria de alimentos, pois é

uma das principais propriedades funcionais das proteínas no sistema alimentício,

dependem em parte da interação água–proteína, e depende muito de como as ligações das

proteínas retém a água no alimento. Hidrolisados protéicos são altamente higroscópicos, e

isto deve ser considerado ao produzi-los. O conteúdo máximo de água indicado para

hidrolisados protéicos de pescado é de 15% (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

Vários métodos para medir a capacidade de retenção de óleo (CRO) foram descritos.

Comumente, os hidrolisados e/ou proteínas modificadas são misturados a uma quantidade

específica de óleo por um determinado tempo e então centrifugados a uma baixa velocidade

e a CRO é expressa em mL de óleo absorvido por grama de proteína. O mecanismo de

absorção de óleo, como calculado por este método, é atribuído predominantemente pela

ligação física do óleo, e consequentemente quanto maior a densidade da proteína, maior a

absorção de óleo, estando relacionado com a hidrofobicidade da superfície protéica (SHAIDI

et al. 1995).

Diniz & Martin (1997) não observaram diferenças na CRA com o aumento do GH, em

hidrolisado protéico de tubarão, entretanto esta propriedade piorou com a hidrólise, se

comparada com o controle. Isto pode ser atribuído à degradação hidrolítica da estrutura da

proteína. Entretanto, Guan et al. (2007) reportaram um aumento na CRA com o aumento do

GH e uma diminuição na CRO com o aumento do GH. Roman & Sgarbieri (2005) reportaram

uma diminuição significativa na CRA com o aumento do GH em caseína hidrolisada.


2.3.2.3 Propriedades de Emulsificação

As propriedades de emulsificação dos hidrolisados protéicos de pescado estão

diretamente ligadas com suas propriedades de superfície, ou seja, efetivamente o

hidrolisado diminui a tensão superficial entre componentes hidrofóbicos e hidrofílicos dos

alimentos. Os hidrolisados promovem a emulsão de óleo em água porque possuem grupos

funcionais hidrofílicos e hidrofóbicos e são solúveis em água. Os hidrolisados orientam seu

lado hidrofóbico para a fase apolar do óleo, enquanto que os segmentos polares se

estendem para a fase aquosa (DAMODARAN, 1996, DEMETRIADES et al., 1997)

Hidrolisados protéicos possuem três atributos importantes: (1) habilidade de

rapidamente se absorver-se a uma interface; (2) habilidade de rapidamente de desdobrar e

reorientar-se a uma interface; (3) habilidade, de uma vez na interface, de interagir com as

moléculas da vizinhança e formar um filme forte, coeso e viscoelástico resistente a

movimentos térmicos e mecânicos (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

O controle da extensão da hidrólise é importante, pois uma hidrólise extensa pode

resultar em drásticas perdas nas propriedades de emulsão do hidrolisado. Isso ocorre

devido que peptídeos menores não conseguem se “retorcer” e reorientar-se como as

proteínas de alto peso molecular. Hidrolisados com baixo grau de hidrólise possuem uma

hidrofobicidade de superfície maior demonstrando serem melhores que emulsificantes

comerciais (QUAGLIA & ORBAN, 1990; KRISTINSSON & RASCO, 2000a,b).

Uma hidrólise extensiva das proteínas resulta em uma drástica perda das

propriedades emulsificantes. O que pode ser observado na literatura é que hidrolisados

protéicos com elevados GH e somente a fração solúvel, que contém peptídeos de menor

peso molecular, apresentam propriedades emulsificantes prejudicadas. Entretanto, proteínas

modificadas, com baixos GH e as duas frações (solúvel e insolúvel) presentes, apresentam

uma melhora em suas propriedades emulsificantes (PANYAM & KILARA, 1996; ROMAN &

SGARBIERI, 2005).

De acordo com Panyam & Kilara (1996) diferentes propriedades moleculares das

proteínas, como a hidrofobicidade, flexibilidade e composição de aminoácidos, estão

envolvidas nas propriedades de emulsão, entretanto não se sabe a contribuição exata de

cada uma.

O que pode ser observado na literatura é que hidrolisados protéicos (fração solúvel),

com elevados GH, que contém peptídeos de menor peso molecular, apresentam

propriedades emulsificantes prejudicadas. Entretanto, proteínas modificadas (fração solúvel


e insolúvel), com baixos GH, apresentam uma melhora em suas propriedades emulsificantes

(PANYAM & KILARA, 1996; GUAN et al., 2007).

2.3.2.4 Propriedades de Formação de Espuma

As espumas em alimentos consistem em bolhas de ar dispersas e envolvidas por um

líquido contendo um surfactante solúvel que abaixa a tensão superficial e interfacial do

liquido. As proteínas de natureza anfótera fazem isso possível: a porção hidrofóbica da

proteína se estende no ar e a porção hidrofílica na fase aquosa. As propriedades

moleculares relevantes para a formação de espuma são: solubilidade (possibilita uma rápida

difusão na interface); anfipaticididade (para aumentar a tensão interfacial); flexibilidade nos

segmentos (para facilitar o desdobramento na interface); segmentos interativos (para

possibilitar interações secundárias nas fases gasosa e aquosa da interface); disposição de

cargas e grupos polares (para prevenir a aproximação das bolhas e permitir a hidratação).

Uma proteólise limitada produz peptídeos que melhoram as propriedades de formação de

espuma (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

Segundo resultados reportados por Stine & Kuehler (1978), citado por Panyam &

Kilara (1996), a habilidade de formar espuma das proteínas do leite melhoraram com a

hidrólise limitada, entretanto a estabilidade de espuma diminuiu. Althouse & Kilara (1995),

citado por Panyam & Kilara (1996), quando hidrolisaram proteínas do soro em pequenos

peptídeos e os separaram por ultrafiltração, reportaram uma capacidade de formação de

espuma e estabilidade comparadas à clara do ovo. Estes resultados indicaram que

peptídeos de maior tamanho e proteínas não hidrolisadas tiveram um efeito inibitório nas

propriedades de espuma.

Kong et al. (2007) observou uma diminuição na capacidade de formação de espuma

e sua estabilidade com o aumento do grau de hidrólise, sugerindo que a hidrolise parcial

permitiu uma maior incorporação de ar.

2.3.2.5 Digestibilidade in vitro

A digestibilidade de uma proteína deve ser entendida como sendo a parte ou porção

da proteína que pode ser hidrolisada pelas enzimas digestivas até aminoácidos e que,

portanto estaria disponível biologicamente, desde que não houvesse nenhuma interferência

na absorção dos aminoácidos pelo organismo animal ou humano. In vitro, a digestibilidade

de uma proteína é estimada utilizando-se enzimas proteolíticas que agem normalmente na

digestão procurando-se imitar, inclusive, as condições de acidez, ou de pH, características

do estômago e do intestino onde a digestão das proteínas se processa. (SGARBIERI, 1996).


Abdul-Hamid et al. (2002) reportaram um aumento na digestibilidade in vitro com a

hidrólise enzimática por Alcalase®, e conseqüente aumento em aminoácidos livres, como a

leucina, metionina e lisina, que são essenciais.

2.4 Secagem em Leito de Jorro

A técnica do leito de jorro foi estabelecida inicialmente por Gishler e Mathur em 1955,

visando a secagem de trigo. Atualmente ocupa um lugar relevante nas operações

envolvendo contato entre as partículas sólidas e o fluido. Aplica-se eficientemente à

secagem de cereais, granulados, recobrimento de partículas, cristalização, produtos de

reações químicas e ultimamente, à secagem de pastas e suspensões (FREIRE, 1992).

O princípio de funcionamento do leito de jorro consiste em injetar o fluído

no leito de partículas através de um orifício, geralmente centralizado na base da

coluna. O jato fluído quebra o leito na região central e arrasta as partículas em direção

ao topo da coluna, formando-se, aí, o jorro ou região de baixa concentração de sólidos

(ε>0,7). As partículas arrastadas são desaceleradas em sua trajetória ascendente até alcançar a

fonte, região acima do leito caracterizada pela mudança de direção no movimento das

partículas sólidas. Estas partículas caem então na região anular, ou região de alta concentração

de sólidos (ε < 0.7), iniciando seu movimento lento e descendente de retomo ao jorro,

favorecendo o contato sólido/fluído e qualquer processo de transferência de massa e ou energia

entre esta duas fases (FREIRE, 1992).

Segundo Freire (1992) e Massarani (1997) o sistema de secagem de leito de jorro é

mais eficientemente aplicável a grãos. O regime do jorro é estabelecido em um leito de

partículas através da injeção de um fluido por um orifício cujo diâmetro é reduzido em

relação ao diâmetro do leito, ocorrendo à formação de canal preferencial como

conseqüência das regiões distintas que estão ilustradas na Figura 4.


FIGURA 4: Diagrama esquemático de um leito de jorro tronco cone-cilíndrico

(CSB).

Fonte: FREIRE (1992).

1) Região central (canal preferencial): ocorre o transporte pneumático das partículas

devido à grande velocidade do fluido.

2) Região anular (deslizante): nesta região as partículas caem da região de jorro e

deslizam para baixo, operando como um leito deslizante. Muitos autores, no entanto,

definem como região de jorro ao conjunto região central – região de jorro.

3) Região de jorro (fonte): região acima do leito onde as partículas advindas da

região central movimentam-se em regime desacelerado, como em uma fonte, caindo na

região anular.

Existem basicamente três geometrias de secadores de jorro: a cônica, a cone-

cilíndrica e a retangular. Nem todo leito de jorro apresenta as três regiões (Figura 4) bem

definidas (MATHUR & EPSTEIN, 1974).

Os secadores de jorro dividem-se em dois grupos principais: o JSB (Jet Spouted

Bed) e o CSB (Conventional Spouted Bed). A diferença entre estes dois grupos esta na

porosidade do leito (ε), que para o CSB é inferior a 85% e para o JSB é superior (FREIRE,

1992).

A estabilidade de um leito de jorro depende das dimensões do leito e das

propriedades das partículas. Para cada tipo de partícula e cada leito de jorro é possível

determinar experimentalmente o seu diagrama de fase. Existem inúmeras correlações para

a previsão da perda de carga no jorro estável. Do ponto de vista fluidodinâmico, os

principais parâmetros ligados ao projeto de secador de leito de jorro são: a perda de carga

no leito, em função da vazão de fluído, a perda de carga máxima, a perda de carga no jorro

estável, a velocidade de jorro mínimo e a altura máxima de jorro estável. Além destes


parâmetros, é conveniente ter uma idéia do perfil de velocidade do gás no leito, do

movimento das partículas e de sua circulação (FREIRE,1992).

Velocidade de Jorro Mínimo: Definiu-se como o jorro que ocorre com menor

velocidade superficial do qual o jorro ainda existe. Este parâmetro depende da geometria do

sistema bem como das características físicas do fluido e das partículas.

Altura de Jorro Estável: Define-se como a altura máxima de jorro estável, a altura de

leito que qualquer valor superior a ela prejudicara a estabilidade do jorro. A importância

desta informação esta no fato de poder estimar a quantidade total de material que será

processada em cada corrida de um determinado equipamento.

Perda de Carga no Jorro Estável: É a queda de pressão que ocorre durante o

funcionamento estável do leito. A estabilidade de um leito de jorro depende das dimensões

do leito e das propriedades das partículas.

Queda de Pressão Máxima: É a perda que ocorre um pouco antes do jorro ser

estabelecido. Esta perda de carga, juntamente com o valor da velocidade de jorro mínimo,

fornece dados necessários para a especificação do soprador.

Para determinar as características de cada equipamento de secagem em particular,

é necessário fazer-se uso da curva fluidodinâmica característica, que é uma representação

gráfica da relação entre a velocidade de escoamento do fluído de secagem e a perda de

carga na célula de secagem.

A Figura 5 apresenta uma curva fluidodinâmica genérica característica com a perda

de carga no leito em função da velocidade.

FIGURA 5: Curva fluidodinâmica genérica – Perda de Carga x Velocidade.

Fonte: FREIRE (1992).


Analisando a curva fluidodinâmica (Figura 5) pode-se verificar os seguintes

destaques:

• Ponto B – onde ocorre a velocidade mínima de fluidização (vmf) e a de

pressão máxima (ΔPm);

• Ponto C – é o ponto de fluidização incipiente;

• Ponto D – ponto de início do jorro;

• Ponto C’ – representa as condições mínimas de velocidade para existir o

jorro (Vjm).

2.4.1 Secagem de Pastas em Leito de Jorro

A secagem de pastas é uma operação extremamente complexa devido a grande

diversidade de tipo de pastas, com características bastante distintas. A escolha da técnica a

ser utilizada, para a secagem, está diretamente relacionada às características do material a

ser seco, cada pasta requer um estudo mais específico para a determinação do método

mais adequado para a secagem, (FREIRE, 1992).

A secagem de pastas e suspensões utilizando secadores de leito de jorro com

partículas inertes, tem sido bastante estudada nos últimos vinte e cinco anos. Este secador

tem-se mostrado boa alternativa ao secador spray, por fornecer produtos de qualidade

similar, a custos significativamente inferiores (PHAM, 1983; MEDEIROS et al., 2001).

O leito de jorro com partículas inertes é usado como secador de pastas devido,

principalmente, ao grande grau de mistura das partículas; ao efetivo contato entre fluido e

partículas sólidas, que proporciona altas taxas de transferência de calor e de massa; e à alta

energia e número de colisões entre as partículas, (SPITZNER & FREIRE 2002).

As principais características físicas do material a ser seco são suas propriedades

físicas e reológicas e sua resistência térmica. Assim como a pasta é encontrada em diversas

formas, o produto final também. A forma final pode variar desde um pó finamente disperso

(partículas de tamanho menores do que 10 μm), pós granulados grosseiros (partículas com

tamanho entre 10-200 μm), grânulos (partículas entre 0,2-5 mm) até pós aglomerados

(FREIRE, 1992).

O grande número de variáveis envolvidas na caracterização da pasta e a grande

variação de granulométrica do produto final implicam na possibilidade de um grande número

de tipos de secadores a serem utilizados. Segundo a literatura, o leito de jorro cônico pode

ser modelado como se possuísse vários segmentos, onde cada seguimento se comporta


como um leito fluidizado, exceto o segmento que se localiza próximo do orifício de entrada

de ar do leito, orifício inferior (PHAM, 1983).

No secador de leito de jorro, a atomização da pasta ou suspensão sobre o leito

reveste as partículas com uma fina camada de material. À medida que seca, a película se

torna frágil, fragmentando-se devido aos efeitos de colisões interpartículas. O material na

forma de pó é então arrastado para fora pela corrente de ar. Um ciclone conectado ao

secador promove a separação e recolhimento do pó; entretanto, muitas vezes as taxas de

remoção da película são muito baixas, promovendo acumulação do material no leito, sendo

este um dos graves problemas deste secador, chegando até mesmo a inviabilizar sua

utilização na secagem de diversos materiais (FREIRE, 1992; MEDEIROS et al., 2001).

Diversos trabalhos apresentados na literatura utilizam o leito de jorro para a secagem e

enriquecimento de produtos alimentícios: como sangue (PHAM, 1983); secagem de plasma

bovino (GOULART, 2000); enriquecimento de farelo de arroz desengordurado com sangue

bovino (MASSARO, 2002); secagem de polpa de frutas, (LIMA, 2000); gêneros alimentícios

e fitofarmacêuticos (PEIXOTO, 2004); secagem de sopa obtida a partir de resíduos de

hortifrutigrangeiros (FLORO, 2004).

Oliveira & Passos (1997), simularam a secagem de suspensões em leito de jorro

cônico. Diversos trabalhos relacionados com a secagem de polpa de frutas em leito de jorro

vêm sendo apresentados nos últimos dez anos; Lima et al. (1992), citado por Medeiros et al.

(2001), estudou a secagem da polpa de umbu, encontrando resultados bastante

satisfatórios. Os estudos foram ampliados para a secagem em leito de jorro de polpa de

cajá, manga, pinha, cajá-manga, serigüela e acerola, dentre outros (LIMA et al., 2000).

Nestes trabalhos, os autores relatam problemas de acúmulo de material, com

comprometimento das condições fluidodinâmicas e estabilidade do leito.

Lima et al. (2000) relacionaram a composição de uma série de frutas tropicais com a

eficiência de produção do pó, cujos resultados mostraram que havia influências isoladas dos

teores de gordura, fibras e açúcares redutores. Observaram, ainda, o efeito combinado

desses constituintes, no desempenho da secagem em leito de jorro.

Segundo Martinez et al. (1995), citado por Medeiros et al. (2001), apresentaram uma

discussão detalhada sobre o comportamento do leito de jorro na secagem de produtos

vegetais, relacionando os problemas de aderência das partículas e interrupção do jorro com

as características aderentes do suco de frutas e vegetais, provocadas pelos elevados

conteúdos de açúcar. Na conclusão do trabalho enfatizaram a necessidade de se

aprofundar os estudos sobre os processos físico-químicos que ocorrem durante o


processamento no secador de leito de jorro, com a finalidade de esclarecer as razões pelas

quais ocorre a adesão do produto sobre as partículas inertes.

2.4.2 Secagem de Hidrolisados Protéicos

Hidrolisados protéicos frequentemente são secos por atomização (Spray-dried)

(ABDUL-HAMID, 2002; NILSANG et al. 2005; GUAN et al. 2007), freeze drying (SHAIDI et

al., 1995; GOVINDARAJU & SRINVAS, 2006) ou liofilização (SINHA et al. 2007)

Abdul-Hamid, et al. (2002) avaliaram a qualidade nutricional, através da

digestibilidade in vitro, de proteína hidrolisada de tilápia (Oreochromis mossambicus) seca

em spray dried, onde as temperaturas de secagem testadas foram 150ºC de entrada com

76% saída e 180º com 90ºC de saída e encontraram rendimentos médios do produto seco

de 9,6%, sendo rendimento típico de hidrolisados, utilizando peixe fresco, em torno de

10,5%. O conteúdo de aminoácidos foi significativamente menor na temperatura de 180ºC

de entrada e 90ºC de saída do secador. A digestibilidade in vitro foi alta em ambas

temperaturas (88,4 e 92%, respectivamente).

CAPÍTULO III - DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

CAPÍTULO III – ARTIGO 1 27

ARTIGO 1: Efeito da extensão da hidrólise sobre características do músculo de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi estudar, através da metodologia de superfície de resposta, a

influência da proporção enzima/substrato e do tempo na extensão da modificação

enzimática (grau de hidrólise), por Neutrase®, do músculo de anchoita e conseqüente

impacto na produção do secador em leito de jorro, digestibilidade in vitro, e nas

propriedades funcionais de solubilidade, capacidade de emulsificação e formação de

espuma. O GH máximo foi de aproximadamente 7,5%. As propriedades funcionais de

solubilidade (S) e capacidade de emulsificação (CE) foram melhoradas significativamente

pela extensão da hidrólise enzimática (GH). Entretanto, a produção do músculo modificado

enzimaticamente no leito de jorro (PLJ) e a capacidade de formação de espuma (CFE)

pioraram com extensão da hidrólise. A digestibilidade in vitro (D), não sofreu alteração com

a extensão da hidrólise, apresentando uma média de aproximadamente 85%. A maior

produção de MME no leito de jorro foi na região entre 30-60 minutos e razão E/S de 0,01%.

Nesta região o GH atingido foi de aproximadamente 4%, a solubilidade, capacidade de

emulsificação e capacidade de formação de espuma em água foram de aproximadamente

83%, 54% e 26%, respectivamente.

Palavras chave: hidrólise enzimática; grau de hidrólise; proteína de pescado; planejamento

experimental; secador em leito de jorro; propriedades funcionais.


ABSTRACT

The aim of this work was to study, through response surface methodology, the influence of

the proportion enzyme/substrate and time of the extension enzymatic modification

(hydrolysis degree), by Neutrase®, of the anchoita muscle and consequent impact in the

production of spouted bed dryer, in vitro digestibility, and in the functional properties of

solubility, emulsification capacity and foam formation. The hydrolysis degree was of

approximately 7.5%. The functional properties and emulsification capacity were gotten better

by the extension of the enzymatic hydrolysis. However the production of the muscle

enzymatically modified in spouted bed dryer and the foam capacity formation worsened by

extension of hydrolysis. The in vitro digestibility didn’t suffer alteration with the hydrolysis

extension, presenting average of approximately 85%. The highest production in the spouted

bed was at the region between 30-60 minutes and the ratio E/S of 0.01%. At this region the

reached hydrolysis degree was approximately 4%, the solubility, the emulsification capacity

and the capacity of foam formation in water were approximately 83%, 54% and 26%,

respectively.

Keywords: enzymatic hydrolysis; fish protein; experimental design; spouted bed dryer;

functional properties.


1 INTRODUÇÃO

A anchoita (Engraulis anchoita) é uma espécie pelágica amplamente distribuída no

Brasil desde o norte do litoral do Rio de Janeiro até o Chuí. Em princípio, a anchoita é um

estoque alternativo virgem no Brasil, que poderia ser explorado sazonalmente

desenvolvendo uma nova pescaria na região sul do Rio Grande do Sul. Seu potencial de

pesca sustentável pode chegar a 100.000 toneladas/ano (MADUREIRA et al., 2004).

Proteínas além de fornecerem aporte nutricional, crescentemente vêm sendo

utilizadas para executar papéis de funcionalidade, juntamente com carboidratos e gorduras,

na formulação de alimentos. Comumente as proteínas em alimentos possuem propriedades

funcionais como solubilidade, gelatinização, emulsificação e de espuma. A modificação

enzimática de proteínas alimentícias por hidrólise controlada pode melhorar estas

propriedades funcionais em uma larga escala de pH e outras condições de processamento.

Para o melhoramento destas propriedades funcionais são fundamentais a escolha da

enzima, condições do meio de hidrólise e o grau de hidrólise a ser alcançado. O

conhecimento das propriedades moleculares requeridas para funcionalidade das proteínas e

o desenvolvimento de estratégias para as alcançarem é crítico para desenvolver e utilizar a

proteína modificada como ingrediente (SHAIDI et al., 1995; PANYAM & KILARA, 1996,

DINIZ & MARTIN, 1997; KRISTINSSON & RASCO, 2000ª).

Hidrolisados protéicos de pescado são tradicionalmente manipulados na forma

líquida e frequentemente são secos por atomização (Spray-dried) (ABDUL-HAMID, 2002;

NILSANG et al. 2005; GUAN et al. 2007), freeze-dried (SHAIDI et al., 1995; GOVINDARAJU

& SRINVAS, 2006) ou liofilização (SINHA et al. 2007), com intuito de converter esta forma

líquida em forma de pó, que apresenta maior estabilidade e melhor aparência.

A secagem de pastas e suspensões utilizando secadores de leito de jorro com

partículas inertes, tem sido bastante estudada nos últimos vinte anos. Este secador tem-se

mostrado uma boa alternativa ao secador spray, por fornecer produtos de qualidade similar

a custos significativamente inferiores. O leito de jorro com partículas inertes é usado como

secador de pastas devido, principalmente, ao grande grau de mistura das partículas; ao

efetivo contato entre fluido e partículas sólidas, que proporciona altas taxas de transferência

de calor e de massa; e à alta energia e número de colisões entre as partículas, (SPITZNER &

FREIRE 2002).

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da proporção enzima/substrato e do

tempo na extensão da modificação enzimática (grau de hidrólise) do músculo de anchoita e


conseqüente impacto na digestibilidade in vitro, produção no secador em leito de jorro e nas

propriedades funcionais de solubilidade, capacidade de emulsificação e capacidade de

formação de espuma.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Matéria-Prima

A matéria-prima utilizada para a modificação enzimática foi a polpa de anchoita

(Engraulis anchoita). A anchoita foi capturada em cruzeiro pelo “Navio Oceanográfico

Atlântico Sul”, no período de agosto e setembro de 2005, utilizando rede de arrasto de meia

água, na plataforma continental da região sul do Brasil. A mesma foi armazenada a bordo

em uma parte de gelo, uma de água e duas de anchoita (1:1:2 – relação em massa) por 24

horas. A captura da anchoita está ilustrada na Figura C1 do Anexo C.

2.2 Preparo da Matéria Prima

A anchoita foi lavada em água clorada (5ppm de cloro residual livre) e eviscerada,

onde se descartou cabeça e vísceras. O material restante foi despolpado nas instalações da

Indústria de Pescados “Pescal S.A.”, de Rio Grande – RS, obtendo-se a polpa e

descartando o resíduo. A polpa da anchoita foi submetida a três lavagens consecutivas,

sendo duas lavagens com água corrente (de aproximadamente 2 minutos cada), com auxilio

de uma tela, e terceira e última lavagem com uma solução de NaCl 3% (p/v). Retirou-se o

excesso de água através de centrifugação à g×3000 e a mesma foi armazenada em sacos

de polietileno de 0,250kg, a -18ºC. A polpa congelada permaneceu armazenada até o

momento de sua utilização.

2.3 Modificação Enzimática

A enzima utilizada no processo foi a Neutrase® 0.8L, uma endoprotease produzida

pelo Bacillus amyloliquefaciens, com atividade declarada 0.8AU/g (Novozymes A/S -

Bagsvaerd, Denmark) e cumpre com as especificações de pureza recomendada para

enzimas de grau alimentício pela FAO/WHO Expert Committe on Food Additives (JECFA) e

Food Chemicals Codex (FCC) (NEUTRASE®, 2006).

A Figura 1 ilustra o diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo

modificado enzimaticamente.


FIGURA 1: Diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo (proteína) modificado

enzimaticamente.

A polpa congelada foi descongelada em refrigerador a 7ºC por 6 a 8 horas, sendo

denominado de músculo não modificado enzimaticamente (MNM). A hidrólise foi realizada

em biorreator encamisado, sob agitação contínua de 200rpm, a uma temperatura de 55ºC,

utilizando uma razão sólido/líquido 1:1 (polpa:tampão fosfato pH7,0). As condições de

proporção enzima:substrato (%NTotal x 6,25) e tempo estabelecidas no planejamento

experimental.

O controle do pH foi realizado mediante adição de NaH2PO4.H2O (0,20M) e/ou

Na2HPO4.7H2O (0,20M). A inativação enzimática foi realizada a 90ºC por 10 minutos. Estas

condições foram determinadas experimentalmente. O resfriamento foi realizado em banho

de gelo até atingir temperatura de 15ºC±2. Para a retirada de espinhas residuais e alguma

material não solubilizado, a suspensão foi passada em peneira 32 mesh (500mm). A diluição

foi realizada com adição de água em função da concentração de sólidos na suspensão até

chegar a 7,5% p/v.

A secagem do músculo modificado enzimaticamente foi realizada em um leito de

jorro cônico, constituído de: soprador radial (4kW), placa de orifício, aquecimento elétrico

(2,4kW), célula de secagem, medidores de pressão (manômetros do tipo tubo em U),

medidores de temperatura (termopares do tipo cobre-constantam) e ciclone (tipo Lapple)


para recolhimento do produto seco. A alimentação do secador foi utilizado bomba

peristáltica com atomização do tipo duplo com ar comprimido (200kPaabs). O secador está

apresentado na Figura C2 e C3 do Anexo C.

A célula de secagem do leito de jorro utilizada era cônica, com diâmetro de entrada

de 0,026m e diâmetro de célula de 0,18m, com ângulo interno de 60º.

O leito de partículas de inertes era constituído de polietileno em forma lentilhas

(diâmetro 3mm, esfericidade 0,7 e densidade de 0,96). Foram utilizados 0,5kg de inertes,

que correspondem à altura de leito de 0,135m.

A vazão de alimentação da suspensão foi de 300mL/h, concentração de sólidos de

7,5%, velocidade do ar 100% acima da velocidade de jorro mínimo. A temperatura do ar de

entrada foi de regulada na faixa de 90º, mantendo-se a saída a 70ºC a fim de garantir a

qualidade do produto final. A produção do leito de jorro (PLJ) foi verificada através de

retiradas quatro amostras de 30 em 30 minutos, durante um tempo de operação de 150

minutos, após o jorro entrar em regime permanente. Sua estabilidade foi verificada através

da temperatura de entrada e saída do secador, apresentada na Figura B3 do Anexo B.

2.4 Composição Proximal

Teor de umidade, resíduo mineral (cinzas), lipídeos e proteína do foram

determinados com os procedimentos da AOAC (1995). O teor de lipídeos totais no músculo

não modificado foi determinado segundo Bligh & Dyer (1959).

2.5 Determinação da Atividade Enzimática

A atividade enzimática da Neutrase® foi determinada pelo método de Anson segundo

Augusto-Ruiz (1985), utilizando Albumina de Soro Bovino (BSA) a pH 7,0 (tampão fosofato),

a temperatura de 40ºC, 45º, 50º e 55ºC, num tempo de 15 minutos. A inativação foi

realizada com adição de 10mL TCA 5%. Uma alíquota foi centrifugada a g×3000 por 5

minutos a fim de precipitar as proteínas. A tirosina liberada no sobrenadante foi determinada

pela reação de Lowry et al. (1951). Para determinar a atividade residual da enzima, a

mesma foi tratada a 90ºC nos tempos 0, 1, 2,5 5, 10, 15, 20 e 30 minutos e posteriormente

determinou-se a sua atividade conforme método descrito acima. A atividade enzimática,

segundo União Internacional de Bioquímica, citado por Whitaker (1972), é a quantidade de

produto formado durante a reação, no caso tirosina (meq), pela quantidade de enzima por

um dado tempo. A atividade enzimática foi calculada utilizando a Equação 1.


Tempo.de.EnzimaQuantidade

.de.TyQuantidadeEnzimáticaAtividade.×

= (1)

Onde a quantidade de tirosina foi dada em miliequivalentes; a quantidade de enzima em

gramas de Nitrogênio; o tempo em minutos.

2.6 Hidrólise Enzimática

A hidrólise enzimática foi realizada a pH 7,0 e temperatura de 55ºC, utilizando como

substrato o músculo de anchoita não modificado (MNM), com razão sólido/líquido (S/L) 1:1 e

1:1,5; variando a razão enzima/substrato (E/S -NTotal x 6,25) 0,01%, 0,05% e 0,1% e tempo

de hidrólise de 0 a 100 minutos.

2.6.1 Determinação do Grau de Hidrólise (GH)

Na determinação do grau de hidrólise (GH) foi utilizado o método proposto por Adler-

Nissen (1979). O GH, segundo este mesmo autor, é definido como o número de ligações

peptídicas clivadas ou número de grupos amino livres formados durante o processo de

hidrólise. O progresso da hidrólise foi seguido através de retiradas periódicas de alíquotas

do meio de reacional e conseqüente inativação térmica da enzima (90ºC por 5 minutos),

seguido de reação com TNBS (ácido trinitrobenzeno sulfônico) para a determinação do

número de ligações peptídicas clivadas. O GH foi calculado segundo a expressão

apresentada na Equação 2:

100(%) ×=totalhhGH (2)

Onde h é o número de ligações peptídicas clivadas na hidrólise (meq Leucina/g proteína) e

totalh é o número total de ligações peptídicas (meq Leucina /g proteína). O totalh adotado

para pescado, foi de 8,6 meq Leucina/g proteína, segundo Nielsen, et al. (2001). A

metodologia detalhada encontra-se do item 1 do Anexo A.

2.7 Digestibilidade in vitro

A digestibilidade in vitro (D) foi determinada conforme Akeson & Stahmann (1964).

Cerca de 250mg de proteína foram hidrolisados com pepsina e pancreatina a 37ºC em

agitação contínua. O conteúdo de tirosina liberada no sobrenadante foi determinado pela

reação de Lowry et al. (1951), utilizando uma curva padrão de tirosina. A digestibilidade foi

calculada segundo a Equação 3.


.(%)idadeDigestibil = 100][][

xTy

Ty

total

liberada (3)

Onde: ][ liberadaTy : concentração de tirosina liberada no sobrenadante após a digestibilidade

expressa em miliequivalentes (meq); ][ totalTy é a concentração de tirosina total expressa em

miliequivalentes. A ][ totalTy foi obtida da amostra após hidrólise ácida (HCl 6N) a 100ºC

durante 22 horas, quantificada pela reação de Lowry et al. (1951), utilizando uma curva

padrão de tirosina. A metodologia detalhada encontra-se no item 2 do Anexo A.

2.8 Solubilidade

A solubilidade (S) da proteína foi determinada de acordo com o método de Morr et al

(1985), que consiste em uma modificação do método de determinação do índice de

nitrogênio solúvel. Foi estudada a solubilidade em água. A porcentagem de solubilidade foi

determinada através da relação entre conteúdo de proteína solúvel pelo conteúdo de

proteína total na amostra. O conteúdo de proteína solúvel e proteína total foi determinado

por Kjeldahl. A metodologia detalhada encontra-se no item 3 do Anexo A.

2.9 Capacidade Emulsificante

A capacidade emulsificante (CE) foi determinada, segundo Shahidi et al. (1995). A

capacidade de emulsificação foi calculada através do volume da porção emulsificada pelo

volume total. A metodologia detalhada encontra-se no item 4 do Anexo A.

2.10 Capacidade de Formação de Espuma

A capacidade de formação de espuma da proteína (CFE) foi determinada conforme

Fernandez & Macaruela modificado por Guan et al. (2007). A capacidade de formação de

espuma foi estudada em água. A habilidade de formação de espuma foi calculada como

sendo a porcentagem de aumento no volume da dispersão protéica após homogeneização.

A metodologia detalhada encontra-se no item 5 do Anexo A.

2.11 Planejamento Experimental

A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para analisar a influência das

variáveis do processo de modificação enzimática do músculo de anchoita. Os ensaios

experimentais foram feitos de acordo com um planejamento fatorial 22, com 4 pontos

fatoriais (níveis ±1) e 2 pontos centrais (nível 0), totalizando 6 ensaios (Tabela 1), os quais


foram feitos em réplica e as análises das respostas em duplicata. Este planejamento teve

como objetivo avaliar os efeitos da razão Enzima/Substrato (E/S) e tempo de hidrólise

(tempo) (variáveis independentes) para verificar se a extensão da hidrólise promoveu ou não

uma melhora nas respostas: grau de hidrólise (GH), produção do MME no leito de jorro

(PLJ), digestibilidade in vitro (D), solubilidade (S), capacidade de emulsificação (CE) e

capacidade de formação de espuma (CFE). Para avaliação dos dados foi utilizado o

software Statistica for windows 5.0.

O tempo mínimo e máximo, assim como E/S, apresentados na Tabela 1, foram

escolhidos com base na evolução da hidrólise realizada experimentalmente.

TABELA 1: Matriz do planejamento experimental – variáveis independentes codificadas e

não codificadas.

E/S

Tempo Experimento

codificada % codificada min

1 -1 0,01 -1 20

2 1 0,1 -1 20

3 -1 0,01 1 60

4 1 0,1 1 60

5 0 0,05 0 40

6 0 0,05 0 40

As respostas experimentais comentadas foram ajustadas, através da análise de

regressão linear, para obter um modelo teórico estatístico de cada resposta, conforme

apresentado na Equação 4.

ijrijr eXXXXY ++++= 211222110

^ββββ (4)

Onde nβ são os coeficientes de regressão, ^Y é a resposta para GH, PLJ, D, S, CE e

CFE; 1X e 2X são as variáveis codificadas (E/S e Tempo), respectivamente.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO


O MNM apresentou um conteúdo de lipídeos, em base seca, de 7,8% (Tabela 2), que

em base úmida equivale a aproximadamente 1,7%. Este teor é menor ao reportado para


anchoita Argentina que chega próximo a 6% (b.u.), entre o inverno e primavera (YANNES &

ALMADOS, 2003). A anchoita foi capturada entre Rio Grande e Chuí, em um cruzeiro no

final do inverno, e este menor conteúdo lipídico pode ser devido ao enfraquecimento das

correntes das Malvinas na costa do Rio Grande do Sul, que conforme avança para o Norte

do litoral brasileiro o conteúdo de nutrientes é menor.

TABELA 2: Composição proximal do Músculo não Modificado (MNM).

Amostra Umidade (%)

Proteína Total(%)b.u

Lipídeos Totais(%)b.u

Cinzas (%)b.u

MNM 78,2±1,8 18,4±0,1 1,7±0,1 1,3±0,1

b.u – base úmida; média e desvio padrão de 8 repetições.

A umidade de todos os experimentos realizados (Tabela 3), seco em leito de jorro,

ficou abaixo dos 10%, mostrando-se adequado pela legislação para “Pós para Preparo de

Alimentos”, segundo RDC (Resolução da Diretoria Colegiada) Nº 273, da Agência Nacional

de Vigilância Sanitária, de 22 de setembro de 2005, que estabelece regulamento técnico.

TABELA 3: Composição proximal do Músculo Modificado Enzimaticamente (MME) em

função da variação E/S e Tempo.

Amostra - MME (Experimento)*

Umidade (%)

Proteína Total (%)b.u

Lipídeos Totais (%)b.u

Cinzas (%)b.u

1 6,1±0,2 81,9±1,0 8,1±1,0 3,8±0,4

2 4,8±0,8 79,8±0,3 9,2±0,8 5,1±0,2

3 5,8±0,5 80,1±0,4 8,9±1,1 4,3±0,2

4 6,2±0,3 79,2±0,2 8,6±0,9 4,7±0,1

5 5,3±0,6 80,5±0,6 9,1±0,6 4,8±0,2

6 5,2±0,4 80,8±0,7 9,0±0,4 4,7±0,2

b.u.- base úmida; Média e erro padrão de 3 repetições.*a razão E/S e Tempo dos experimentos estão apresentados na Tabela1.

3.2 Atividade Enzimática

A enzima Neutrase® apresentou maior atividade enzimática (Figura 2) a uma

temperatura de 55º, a pH 7,0. Resultado similar reportado por Benjakul & Morrissey (1997)

na hidrólise de Merluccios productus, utilizando Neutrase® em pH7,0 e temperatura de

55ºC. Esta enzima também foi utilizada por ASPMO et al. (2005) na hidrólise de vísceras de

pescado, em pH7,0 e temperatura de 55ºC.


FIGURA 2: Atividade da enzima em diferentes temperaturas.

A atividade da enzima Neutrase® a pH 7, temperatura de 55ºC e tempo de 15

minutos, foi de 7,12meqTirosina/gNenzimatico.min.. A inativação da enzima a 90ºC por 10 minutos,

resultou em uma diminuição de 95 pontos percentuais na sua atividade. Quanto menor o

tempo de exposição da proteína a elevadas temperaturas, menor será sua desnaturação e

menor será a perda de compostos nitrogenados voláteis. A curva da atividade enzimática e

atividade residual estão apresentadas na Figura B1 e B2, respectivamente, do Anexo B.

Com base nos resultados observados a modificação enzimática do músculo de

anchoita foi realizada a 55º, pH 7,0 e a inativação da enzima a 90º por 10 minutos.

3.3 Hidrólise Enzimática do Músculo de Anchoita

A hidrólise do músculo de anchoita (Figura 3) evolui progressivamente com a

tendência a se estabilizar após 60 minutos, sendo que nos primeiros 10 minutos a taxa de

conversão apresenta a tendência de uma reação de hidrólise com a cinética de primeira

ordem, característica de reações enzimáticas, que neste caso, indica a liberação de grupos –

NH2 livres, caracterizado pela presença de peptídeos a uma taxa de conversão compatível

com a insaturação da enzima pelo substrato. Quando a reação tende a estabilizar (reação de

cinética de ordem zero) em função da saturação da enzima pelo substrato, se atinge a

velocidade máxima que equivale a um GH de 8,6% com 100 minutos de reação. Shaidi et al.

(1995) estudando o perfil da hidrólise enzimática de “Mallotus villosus” utilizando a enzima

Neutrase®, encontraram um perfil semelhante e um grau de hidrólise próximo 10% em 100

minutos de reação.


FIGURA 3: Evolução da hidrólise enzimática de músculo do anchoita utilizando a enzima

Neutrase®. Média de 3 repetições.

3.4 Planejamento Experimental

Os dados experimentais, para geração dos modelos teóricos estatísticos, das

variáveis dependentes estão apresentados na matriz do planejamento experimental

(Tabela4).

TABELA 4: Planejamento experimental da modificação enzimática do músculo de anchoita.

Exp. E/S Tempo

GH %

PLJ *gss(MME)/0,5h

D %

S %

CE %

CFE %

1 -1 -1 2,87±0,14 3,37±0,15 85,65±1,92 81,25±0,77 51,7±1,36 27,12±0,47

2 1 -1 5,86±0,13 2,85±0,10 84,37±1,39 84,92±0,12 64,97±022 17,25±0,64

3 -1 1 4,18±0,07 4,12±0,17 84,67±0,67 82,8±0,34 53,05±1,25 24,5±0,40

4 1 1 7,54±0,05 1,97±0,14 84,77±1,22 86,47±0,46 68,67±0,68 12,75±0,64

5 0 0 5,65±0,05 2,86±0,10 84,67±0,79 83,87±0,09 61,0±0,18 19,75±0,64

6 0 0 5,81±0,12 2,81±0,10 84,40±0,90 83,82±0,33 61,05±0,26 19,37±0,85

Exp.= experimento; GH=grau de hidrólise; D= digestibilidade in vitro; S= solubilidade; CE= capacidade de emulsificação; CFE= capacidade de formação de espuma; PLJ= produção no secador (leito de jorro). Média e erro padrão de 4 repetições. *gss = gramas de sólido seco na saída do secador.

Os valores dos coeficientes de regressão, que geram o modelo estatístico estão

apresentados na Tabela 5. Eliminado os fatores não significativos, verificou-se a

significância da regressão (p≤0,05), pelo teste F, na análise de variância (ANOVA) (Tabela

6). Os efeitos estimados, das variáveis independentes e sua interação, sobre as respostas

estão apresentados no gráfico de pareto na Figura B3 do Anexo B.


TABELA 5: Coeficientes de regressão obtidos para GH, PLJ, D, S, CE e CFE.

Coeficientes GH PLJ D S CE CFE

0β 5,313 3,004 84,789 83,880 60,103 20,125

1β 1,574 -0,660 NS 1,827 7,225 -5,406

2β 0,760 NS NS 0,765 1,271 -1,781

12β 0,103 -0,403 NS NS 0,586 -0,468

NS: Não significativos (p>0,05)

TABELA 6: Análise de variância para GH, PLJ, D, S, CE e CFE, na modificação enzimática

do músculo de anchoita.

SQ GL MQ Fcalculado Ftabelado* Fontes de Variação Grau de Hidrólise - GH

Regressão 49,08 3 16,36 143,29 3,10

Resíduo 2,28 20 0,11 - -

Total 51,37 23 - - R2=0,955

Produção no Leito de Jorro - PLJ

Regressão 9,60 2 4,80 163,32 3,47

Resíduo 0,61 21 0,03 - -

Total 10,22 23 - - R2=0,936

Digestibilidade in vitro – D

Regressão 3,44 3 1,14 0,87 3,10

Resíduo 26,25 20 1,31 - -

Total 29,69 23 - - R2=0,115

Solubilidade – S

Regressão 62,79 2 31,40 207,01 3,47

Resíduo 3,18 21 0,15 - -

Total 65,98 23 - - R2=0,951

Capacidade de Emulsificação – CE

Regressão 866,56 3 433,28 384,28 3,10

Resíduo 22,55 20 1,12 - -

Total 889,12 23 - - R2=0,974

Capacidade de Formação de Espuma - CFE

Regressão 521,92 3 173,97 310,67 3,10

Resíduo 11,20 20 0,56 - -

Total 533,12 23 - - R2=0,978

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática; * valores tabelados de F a p≤0,05.

De acordo com a Tabela 6 os modelos obtidos para GH, PLJ, S, CE e CFE

(Equações 5, 6, 7, 8 e 9, respectivamente) apresentaram regressão significativa (p≤0,05).


Os coeficientes de determinação (R2) obtidos para estas respostas foram superiores a 0,93,

indicando um bom ajuste dos dados a estes modelos e permitindo a geração de superfície

de resposta. Um modelo teórico pode ser considerado preditivo quando apresenta um valor

Fcalculado superior a pelo menos 3 vezes o valor de Ftabelado RODRIGUES & IEMMA (2005).

A Digestiblidade in vitro não apresentou significância (p>0,05) no modelo, pois

Ftabelado foi maior que Fcalculado, e o coeficiente de determinação baixo (0,113), indicando que a

porcentagem de variação explicada pela regressão é de 11,3% e, portanto, não haveria um

bom ajuste dos dados experimentais ao modelo. Além disso, a soma quadrática dos

resíduos foi alta, representando 88,4% do valor total, ao contrário das outras respostas

estudadas.

3.4.1 Grau de Hidrólise

As variáveis estudadas E/S, tempo e a interação entre eles produziram um efeito

positivo significativo (p≤0,05) sobre o grau de hidrólise, sendo que a E/S foi a variável que

exerceu maior influência sobre a resposta, seguido do tempo e interação entre elas, que

pode ser observado através dos efeitos (em Anexo) e através do modelo teórico construído

(Equação 5).

GH(%)= 5,313 + 1,574*E/Scod + 0,76*Tempocód + 0,103*E/Scod*Tempocod (5)

A superfície gerada pelo modelo (Figura 4) indica que um aumento na concentração

da enzima (razão E/S) e tempo de hidrólise, faz com que haja um incremento no GH.

Segundo o modelo, o maior GH atingido, de aproximadamente 8%, foi em 60 minutos e E/S

de 0,1%. Nesta região há uma maior liberação de grupos amino-livres.

FIGURA 4: Superfície de resposta para grau de hidrólise.


O resultado do estudo foi semelhante ao encontrado por Shaidi et al. (1995),

estudando a hidrólise de Mallotus villosus por Neutrase®, onde foi observado um aumento

no GH com o tempo até aproximadamente 60 minutos, atingindo um GH de 9%, a partir

deste ponto a hidrólise tendeu a permanecer constante chegando a um máximo de 10%

aproximadamente, em 120 minutos de reação. Benjakul & Morrissey (1997), estudando a

hidrólise de Merluccius productus por Neutrase® também observaram um aumento no GH

com o aumento da E/S e o tempo. Entretanto, a partir dos 20 minutos a hidrólise tendeu a

ficar constante.

Outros autores como Govindaraju & Srinivas (2006), Nilsang et al. (2005), Pedroche

et al. (2004), Guerard et al. (2002) observaram um comportamento semelhante, com o

aumento da E/S e tempo, houve um aumento no GH, estudando suas respectivas enzimas e

substratos.

3.4.2 Produção no Leito de Jorro

A variável E/S e a interação entre E/S e o tempo foram significativas na produção no

leito de jorro, sendo que a E/S apresentou maior influência na resposta, sendo esta

negativa. Isto pode ser observado no modelo teórico (Equação 6) construído com base nos

dados experimentais.

PLJ (gss9MME)/0,5h) = 3,004 - 0,660E/Scod – 0,403*E/Scod*Tempocód (6)

Observando a superfície de resposta (Figura 5), gerada pelo modelo, verifica-se a

tendência da diminuição na produção de MME com o aumento do GH, ou seja, o aumento

da E/S e tempo diminuiu a produção do secador. Entretanto, uma menor E/S associado a

um maior tempo de hidrólise, onde o GH foi em média de 4,18%, obteve-se uma maior

produção de MME.


FIGURA 5: Superfície de resposta para produção de MME no leito de jorro.

A produção no secador, aos 60 minutos, utilizando uma razão E/S de 0,01%, foi o

dobro se comparado com E/S de 0,1%, portanto ao utilizar uma concentração de enzima

dez vezes menor a produção dobra. Um aumento no grau de hidrólise a partir de 4 %

causou uma maior retenção no leito de jorro, e esta retenção, em um maior tempo de

secagem, poderia comprometer o funcionamento do secador, principalmente no

experimento 4, que apresentou o maior GH. Uma causa provável para este fato seria a

interação entre peptídeos de baixo peso molecular com os inertes através de ligações de

superfície. A extensão da hidrólise afeta o comportamento do secador, isso sugere a adoção

de diferentes condições de processo no leito de jorro, tais como, concentração de sólidos e

vazão de alimentação, para diferentes GH.

Portanto, observando a superfície de resposta (Figura 5), gerada pelo modelo

(Equação 6), a tendência para uma maior produção no leito de jorro foi a partir dos 30

minutos utilizando uma razão E/S de 0,01%.

O jorro permaneceu estável em todos os experimentos e esta estabilidade pôde ser

verificada através da temperatura de entrada e saída do secador, não apresentadndo

grandes oscilações. As temperaturas podem ser observados na Figura B4 do Anexo B.

3.4.3 Digestibilidade in vitro

Os fatores E/S, tempo e a interação entre eles não promoveram um efeito

significativo na digestibilidade in vitro, entretanto com a modificação enzimática houve um

aumento desta digestibilidade do músculo da anchoita seco em leito de jorro em relação ao

músculo não modificado (in natura). Não houve diferença significativa (p>0,05) na


digestibilidade entre o mínimo (2,87%) e o máximo (7,54%) GH atingido. Portanto, a faixa da

extensão da hidrólise estudada não foi suficiente para causar uma diferença significativa na

digestibilidade.

3.4.4 Solubilidade

As variáveis estudadas E/S e tempo produziram um efeito positivo significativo

(p≤0,05) sobre a solubilidade. A E/S foi a variável que apresentou maior influência sobre a

solubilidade, seguido do tempo. A interação entre as variáveis apresentou um efeito não

significativo (p>0,05). Isto pode ser observado através dos efeitos (em Anexo) e através do

modelo teórico, apresentado na Equação 7.

S(%)=83,88 + 1,827*E/Scod + 0,765*Tempocód (7)

A superfície de resposta (Figura 6), gerada pelo modelo (Equação 7), mostra que um

aumento na variável E/S, assim como na variável tempo, promoveu um aumento na

solubilidade, conseqüência do aumento no grau de hidrólise. Uma das principais

conseqüências da hidrólise enzimática é o aumento da solubilidade, e normalmente este

aumento está associado ao grau de hidrólise, pois diminuem o tamanho das moléculas

(peso molecular) e correspondente exposição de grupos hidrofílicos amino e carboxil

ionizáveis (PANYAM & KILARA, 1996 ; GUAN et al., 2007).

FIGURA 6: Superfície de resposta para solubilidade.

Os resultados encontrados concordam com Guan et al. (2007) que, estudando a

modificação enzimática de concentrados protéicos de farelo de aveia, também observou um


aumento na solubilidade com o aumento do GH. Diniz & Martin (1997) estudando hidrolisado

de Squalus acanthias, também observou um aumento na solubilidade com o aumento do

grau de hidrólise. Entretanto, este mesmo autor avaliou a fração hidrolisada solúvel,

atingindo 90% de solubilidade com um GH de 6,5%. Já no presente estudo, com um GH de

6,5%, a solubilidade foi de 85%, o que indica um bom resultado, visto que não foram

separadas as frações solúvel e insolúvel.

Trabalhando na região de maior tendência a produção no leito de jorro (a partir de 30

minutos e razão E/S de 0,01%), a solubilidade é de aproximadamente 83%, e trabalhando

neste mesmo tempo, porém utilizando 0,1% de E/S a solubilidade aumentará para

aproximadamente 86%. Este resultado mostra uma pequena diferença na solubilidade,

porém a produção cai pela metade com o aumento em 10 vezes na concentração da

enzima, acarretando em maiores custos ao processo. Portanto, é preferível uma solubilidade

3,5% inferior a uma produção no leito de jorro 50% menor.

3.4.5 Capacidade de Emulsificação

Observando o modelo teórico proposto, com base nos dados experimentais

(Equação 8), as variáveis E/S, tempo e a interação entre elas exerceram um efeito positivo

significativo (p≤0,05) sobre a capacidade de emulsificação, sendo que a razão E/S exerceu

maior influência na resposta.

CE(%)= 60,103 + 7,225*E/Scod + 1,271*Tempocód + 0,586*E/Scod*Tempocod (8)

Um aumento no tempo de hidrólise e na razão E/S, promoveu um aumento na

capacidade de emulsificação, observado na superfície de resposta (Figura 7), gerada pelo

modelo (Equação 8), conseqüência de um maior grau de hidrólise. O aumento na CE pode

ser explicado pelo fato que a hidrólise enzimática de uma proteína ocasiona a maior

exposição do seu interior hidrofóbico e os hidrolisados promovem a emulsão de óleo em

água porque possuem grupos funcionais hidrofílicos e hidrofóbicos e são solúveis em água.

Estes orientam seu lado hidrofóbico para a fase apolar do óleo, enquanto que os segmentos

polares se estendem para a fase aquosa. De acordo com Panyam & Kilara (1996)

diferentes propriedades moleculares das proteínas, como a hidrofobicidade, flexibilidade e

composição de aminoácidos, estão envolvidas nas propriedades de emulsão, entretanto não

se sabe a contribuição exata de cada uma.


FIGURA 7: Superfície de resposta para capacidade de emulsificação.

Os resultados encontrados concordam com os observados por Guan et al. (2007),

que avaliando as propriedades funcionais das proteínas de farelo de aveia modificado

enzimaticamente, observou um aumento do índice de atividade emulsificante com o

aumento do GH. Mahmoud (1994) também observou resultados semelhantes aos do

presente estudo e relatou o aumento da capacidade emulsificante (CE) até determinado

grau de hidrólise. Shaidi et al. (1995), utilizando a mesma metodologia, encontrou uma CE

de 50,9% para hidrolisados de pescado (Mallotus villosus), com GH de 12%, utilizando a

enzima Alcalase®.

Trabalhando na região de maior produção de MME no leito de jorro, a CE encontra-

se em torno de 52 a 56%, entretanto ao utilizar uma maior concentração de enzima (E/S de

0,1%) a CE aumenta para 66-69%, portanto dependendo do tipo de aplicação do MME,

deve-se analisar o custo benefício comprometendo a produção.

O controle da extensão da hidrólise é importante, pois uma hidrólise extensa pode

resultar em drásticas perdas nas propriedades de emulsão do hidrolisado. Isso ocorre

devido que peptídeos menores não conseguem se retorcer e reorientar-se como as

proteínas de alto peso molecular. Hidrolisados com baixo grau de hidrólise possuem uma

hidrofobicidade de superfície maior demonstrando serem melhores que emulsificantes

comerciais (QUAGLIA & ORBAN, 1990; DINIZ & MARTIN, 1997; KRISTINSSON & RASCO,

2000a,b).


3.4.6 Capacidade de Formação de Espuma

Proteínas em dispersão causam um abaixamento na tensão na interface água-ar, o

que cria a capacidade de formação de espuma (KONG et al., 2007). As variáveis estudadas

e sua interação exerceram um efeito negativo significativo (p≤0,05) sobre a capacidade de

formação de espuma, o que pode ser pelo modelo teórico proposto, apresentado na

(Equação 9). Aumentando a E/S assim como o tempo, a CFE diminui. A razão E/S exerceu

a maior influência sobre a CFE.

CFE(%)= 20,125 – 5,406*E/Scod – 1,781*Tempocód – 0,468*E/Scod*Tempocod (9)

FIGURA 8: Superfície de resposta para capacidade de formação de espuma.

Observando a superfície de resposta (Figura 8), gerada pelo modelo (Equação 9), a

capacidade de formação de espuma (CFE) diminuiu com o aumento da E/S e tempo, ou

seja, ela diminuiu com o aumento do GH.

Diniz & Martin (1997) estudando a CFE de hidrolisados de pescado (Squalus

acanthias) também observaram uma diminuição da CFE com o aumento do GH. A

diminuição da CFE também foi observada por Kong et al. (2007), com o aumento do GH,

estudando a modificação enzimática do glúten de trigo. A explicação para isto

provavelmente é devido à baixa atividade surfactante de pequenas cadeias polipeptídicas

geradas com a extensão da hidrólise. Entretanto, Panyam & Kilara (1996) afirmam que uma

hidrólise limitada melhora as propriedades de formação de espuma, o que não foi observado

no estudo. Guan et al. (2007) observaram um aumento na CFE com o aumento do GH em

proteína de farelo de aveia modificado enzimaticamente, porém seus resultados foram

avaliados em tampão fosfato, o que pode interferir na habilidade de formar espuma.


Segundo Furtado et al. (2001) não somente fatores relacionados ao grau de hidrólise podem

influir no desempenho das propriedades de espuma, mas também o pH e outros aspectos

relacionados à composição do hidrolisado. No presente estudo não foi considerado o efeito

do pH.

Shaidi et al. (1995) encontrou uma CFE em água de 90% para hidrolisado de

pescado (Mallotus villosus) com GH de 12%. O resultado do presente estudo indica que o

MME de anchoita não apresenta uma boa CFE em água.

4 CONCLUSÕES

A razão enzima/substrato e tempo de hidrólise exerceram um efeito positivo sobre a

extensão da hidrólise (GH), ou seja, um aumento na razão E/S e no Tempo aumentou o GH,

atingindo um máximo de aproximadamente 7,5% aos 60 minutos e utilizando 0,1% E/S.

As propriedades funcionais de solubilidade (S) e capacidade de emulsificação (CE)

foram influenciadas positivamente pela extensão da hidrólise enzimática (GH). Entretanto, a

produção no leito de jorro (PLJ) e a capacidade de formação de espuma (CFE) foram

influenciadas negativamente pela extensão da hidrólise. A digestibilidade in vitro (D), não

sofreu alteração com a extensão da hidrólise, nas condições estudadas, apresentando uma

média de aproximadamente 85%.

A maior produção de MME no leito de jorro ocorreu no intervalo de 30-60 minutos

com uma razão E/S de 0,01%. Nesta região o GH atingido foi de aproximadamente 4%, e a

solubilidade, capacidade de emulsificação e capacidade de formação de espuma em água

foram de aproximadamente 83%, 54% e 26%, respectivamente.

A melhor região para a capacidade de emulsificação foi aos 60 minutos e E/S 0,1%,

onde atingiu-se o maior GH, entretanto nesta região a produção de MME no leito de jorro

diminui pela metade, o que implica na escolha do maior custo benefício para aplicação do

MME em sistemas alimentícios.

5 AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).


6 REFERÊNCIAS

1 ABDUL-HAMID, A.; BAKER, J.; BEE, G.H.; Nutritional quality of spray dried protein

hydrolysate from Black Tilapia (Oreochromis mossambicus). Food Chemistry, v.78, n. 1,

p.69-74, 2002.

2 ADLER-NISSEN, J.; Determination of the degree of hydrolysis of food protein by

trinitobenzenesulfonic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.27, n.6, p.

1256-1262, 1979.

3 AKESON, W.R. & STAHMANN, M.A.A. Pepsin-pancreatin digest index of protein quality

evaluation. The Journal of Nutrition, v. 83, n.1, p. 257-261, 1964.

4 A.O.A.C. Official Methods of Analysis, 16th edn. Arlington Virginia, USA: Association of

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ARTIGO 2:Efeito da temperatura de secagem em leito de jorro nas características do músculo de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção no secador, digestibilidade in vitro e as

propriedades funcionais do músculo de anchoita não modificado (MNM) e modificado

enzimaticamente (MME) por Neutrase®, seco em leito de jorro a 90º (MME90) e a 110ºC

(MME110). As propriedades funcionais avaliadas foram a capacidade de retenção de água

e óleo, solubilidade e propriedades de emulsificação e propriedades de espuma. O grau de

hidrólise alcançado foi de 3% e a umidade final do MME90 e MME110 foi de 6% e 4%,

respectivamente. A produção no secador e a capacidade de retenção de água não se

alteraram com o aumento da temperatura de secagem de 90ºC para 110ºC, entretanto, a

capacidade de retenção de óleo, propriedades de emulsificação e espuma tiveram uma

diminuição significativa. A solubilidade melhorou com o aumento da temperatura. A

modificação enzimática do músculo de anchoita, seco através em leito de jorro, promoveu

uma melhora em todas as propriedades funcionais avaliadas, comparado com o músculo

não modificado. Sendo estes resultados indicadores da potencialidade do uso do músculo

anchoita modificado enzimaticamente como ingrediente em sistemas alimentícios.

Palavras-chave: leito de jorro; processamento de secagem; proteínas hidrolisadas,

funcionalidade das proteínas, subprodutos de pesca.


ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the dryer production, in vitro digestibility and the

functional properties of the anchoita unmodified muscle (MNM) and enzymatically modified

(MME) by Neutrase®, dried in spouted bed dryer at 90° (MME90) and 110°C (MME110).

The functional properties evaluated were the water holding capacity and oil holding capacity,

solubility, and emulsifying and foaming properties. The hydrolysis degree reached was of 3%

and the final moisture of MME90 and MME110 was 6% and 4%, respectively. The production

at the dryer and the water holding capacity didn’t alter with the increase in the drying

temperature from 90°C to 100°C, while, the oil holding capacity, emulsification properties and

foam had a significant decrease. The solubility improved with the temperature increase. The

enzymatic modification of the anchoita muscle, dried by the spouted bed, promoted improve

in all the functional properties evaluated, compared with the unmodified muscle. Being these

results an indicator of the potentiality of the use anchoita muscle enzymatically modified as

an ingredient at food systems.

Keywords: spouted bed; drying process; fish protein hydrolysate, protein functionality, fish

byproducts.


1 INTRODUÇÃO

A crescente tendência na formulação e produção de alimentos tem sido aumentar a

utilização de ingredientes nutritivos, como as proteínas. Estas que, devido a sua importância

nutricional e características físico-químicas. Propriedades importantes em muitos sistemas

alimentícios. As propriedades funcionais das proteínas são influenciadas por diversos

parâmetros intrínsecos, além de fatores relacionados às metodologias utilizadas no seu

estudo. Os dados disponíveis em relação a estas propriedades são bastante variáveis e

muitas vezes conflitantes, devido a fatores interferentes como pH, força iônica, concentração

de proteína e temperatura (DUARTE et al., 1998).




desenvolvendo uma nova pescaria na região sul do Rio Grande do Sul. (MADUREIRA et al.,

2004).

Vários produtos podem ser elaborados a partir de pescado, para suprir a

necessidade de proteínas animais da crescente população mundial, o que exige a correta

utilização de tecnologias de conservação e processamento. A adição de enzimas para

hidrolisar proteínas de alimentos é um processo de considerável importância, pois podem

melhorar a biodisponibilidade de nutrientes, propriedades funcionais e propriedades

sensoriais das proteínas nativas sem prejudicar o seu valor nutricional (SHAIDI et al., 1995,

DINIZ & MARTIN, 1997; KRISTINSSON & RASCO, 2000a GUAN et al., 2007). Tais

propriedades dependem em grande parte do tamanho molecular dos peptídeos gerados

(grau de hidrólise) e são influenciadas pela especificidade da enzima proteolítica utilizada, a

natureza física e química da proteína intacta, e da condição de hidrólise (SURÓWKA et al.,

2004).

As proteínas são modificadas pelas condições de processamento do produto.

Tratamentos térmicos comumente afetam sua estrutura e solubilidade. A insolubilização é

um dos maiores obstáculos na inclusão de proteínas em sistemas alimentares. Solubilidade

elevada pode ser considerada um indicador de sua funcionalidade, já que esta propriedade

é requerida para a aplicação das proteínas em sistemas alimentares (JACOB-LOPEZ et al.,

2006).

A secagem de alimentos de origem marinha é uma prática importante, utilizada

principalmente para de aumentar o tempo de conservação dos mesmos, levando um melhor


aproveitamento da produção pesqueira. Hidrolisados protéicos são desidratados através de

liofilização ou em secadores spray (ABDUL - HAMID et al., 2002)

O leito de jorro com partículas inertes é usado como secador de pastas e

suspensões devido, principalmente, ao grande grau de mistura das partículas,

proporcionando altas taxas de transferências de calor e de massa, e um alto número de

colisões. Este secador tem-se mostrado boa alternativa ao secador spray, por fornecer

produtos de qualidade similar, a custos significativamente inferiores (SPITZNER & FREIRE,

2002). Como é o caso de proteínas modificadas enzimaticamente e hidrolisados,

viabilizando a obtenção de produtos com características satisfatórias para o consumo direto,

ou uso como matéria-prima para alimentos desidratados.

Em busca de alternativas viáveis tecnologicamente, para aproveitar o potencial de

pesca da anchoita, a hidrólise enzimática de proteínas de pescado e a técnica de secagem,

podem ser utilizadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da temperatura de

secagem (90ºC e 110º) na produção do músculo modificado enzimaticamente (MME) no

leito de jorro, a digestibilidade in vitro e as propriedades funcionais de capacidade de

retenção de água (CRA) e óleo (CRO), solubilidade, propriedades de emulsão e espuma do

músculo (proteína) de anchoita não modificado (MNM) e modificado enzimaticamente

(MME) por Neutrase®.


2.1 Matéria-Prima

A matéria prima utilizada para a modificação enzimática foi a polpa de anchoita

(Engraulis anchoita). A anchoita (Engraulis anchoita) foi capturada em cruzeiro pelo “Navio

Oceanográfico Atlântico Sul”, utilizando rede de arrasto de meia água, na plataforma

continental da região sul do Brasil. A mesma foi armazenada abordo em uma parte de gelo,

uma de água e duas de anchoita (1:1:2 – relação em massa) por 24 horas. A captura da

anchoita está ilustrada na Figura C1 do Anexo C.

2.2 Enzima

A enzima utilizada no processo foi a Neutrase® 0,8L, que é uma endoprotease

produzida pelo Bacillus amyloliquefaciens , com atividade declarada 0,8AU/g e produzida

pela Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark). Esta enzima cumpre com as especificações de

pureza recomendada para enzimas de grau alimentício pela FAO/WHO Expert Committe on


Food Additives (JECFA) e Food Chemicals Codex (FCC) (Neutrase®, 2006). A Neutrase®

0,8L é uma metalloproteinase (Zn) com atividade em uma faixa de pH de 5,5-7,5 e

temperatura de 45-55ºC (ASPMO et al., 2005).

2.3 Preparo e Acondicionamento da Matéria-Prima

A anchoita (Engraulis anchoita) foi capturada em cruzeiro pelo “Navio Oceanográfico

Atlântico Sul”, utilizando rede de arrasto de meia água, na plataforma continental da região

sul do Brasil. A mesma foi armazenada abordo em uma parte de gelo, uma de água e duas

de anchoita (1:1:2 – relação em massa) por 24 horas. A anchoita foi então lavada em água

clorada (5ppm de cloro residual livre) e eviscerada, onde se descartou cabeça e vísceras. O

material restante foi despolpado, obtendo-se a polpa e descartando o resíduo. Para a

utilização da polpa da anchoita, a mesma foi submetida a três lavagens consecutivas, sendo

duas lavagens com água corrente (de aproximadamente 2 minutos cada), com auxilio de

uma tela, e terceira e última lavagem com uma solução de NaCl 3% (p/v). Retirou-se o

excesso de água através de centrifugação à g×3000 e armazenou-se a polpa em sacos de

polietileno, contendo aproximadamente 0,250kg, a -18ºC. A polpa congelada permaneceu

armazenada até o momento de sua utilização.

2.4 Processo Enzimático

A polpa congelada de anchoita foi descongelada em refrigerador a 7ºC de 6 a 8

horas, obtendo-se o músculo não modificado (MNM). A hidrólise foi realizada em biorreator

encamisado, sob agitação contínua de 200rpm, utilizando uma proporção de 1:1 de músculo

e tampão fosfato de sódio pH 7,0. A proporção enzima/substrato foi de 0,01% (NTotal x 6,25),

temperatura de 55ºC e tratamento de 30 minutos. Este tratamento teve o objetivo de se

atingir a maior solubilização das proteínas, porém com um mínimo de grau de hidrólise. O

controle do pH foi realizado mediante adição de NaH2PO4.H2O (0,2M) e/ou Na2HPO4.7H2O

(0,2M). A inativação enzimática foi realizada a 90ºC por 10 minutos, sendo estas condições

determinadas em ensaios preliminares. O resfriamento foi realizado em banho de gelo até

atingir uma temperatura de 15ºC±2. Para a retirada de espinhas e alguma material não

solubilizado, a suspensão foi passada em peneira (500mm). A diluição foi realizada com

adição de água em função da concentração de sólidos na suspensão, até 7,5% (p/v).

2.5 Secagem

A secagem do músculo modificado enzimaticamente foi realizada em um leito de

jorro cônico. O equipamento era constituído dos seguintes componentes: soprador radial


(4kW), placa de orifício, aquecimento elétrico (2,4kW),, célula de secagem, medidores de

pressão (manômetros do tipo tubo em U), medidores de temperatura (termopares do tipo

cobre-constantam) e ciclone (tipo Lapple) para recolhimento do produto seco. Para a

alimentação do secador foi utilizada bomba peristáltica com atomização do tipo duplo com ar

comprimido (200kPa abs). O secador está apresentado na Figura C2 e C3 do Anexo C.

A célula de Leito de Jorro utilizada era cônica, com diâmetro de entrada de 0,026m e

diâmetro de célula de 0,18m, com ângulo interno de 60º.





7,5%, velocidade do ar 100% acima do jorro mínimo. As temperaturas do ar de entrada

foram de 90º e 110ºC. A estabilidade do jorro foi verificada através de retiradas de quatro

amostras de 30 em 30 minutos, durante um tempo de operação de 150 minutos, após

estabilização do jorro (nos primeiros 30 minutos), e através das medidas de temperaturas do

ar de entrada e saída do secador.

2.6 Determinação da Composição Proximal

O teor de umidade, resíduo mineral (cinzas), lipídeos totais e proteína do foram

determinados de acordo com os procedimentos da AOAC (1995). O teor de lipídeos totais

no músculo não modificado foi determinado segundo Bligh & Dyer (1959). Foi avaliado o

músculo modificado enzimaticamente seco a 90º e 110ºC (MME90 e MME110,

respectivamente) e o músculo não modificado (MNM).

2.7 Determinação do Grau de Hidrólise (GH)

Para a determinação do grau de hidrólise (GH) foi utilizado o método proposto por

Adler-Nissen (1979). O GH foi calculado segundo a expressão apresentada na equação 1


Onde h é o número de ligações peptídicas clivadas na hidrólise (meq Leucina/g

proteína) e totalh é o número total de ligações peptídicas (meq Leucina /g proteína). O totalh

adotado para pescado, foi de 8,6 meq Leucina/g proteína, segundo Nielsen, et al. (2001).

Metodologia detalhada encontra-se no item 1 do Anexo A.


2.8 Determinação da Digestibilidade in vitro

A digestibilidade da proteína in vitro foi determinada conforme Akeson & Stahmann

(1964). O conteúdo de tirosina liberada no sobrenadante foi determinado pela reação de

Lowry et al. (1951), utilizando uma curva padrão de tirosina. A digestibilidade expressa

segundo a equação 2


xTy

Ty

total

liberada (2)


expressa em miliequivalentes (meq); ][ totalTy : concentração de tirosina total expressa em

miliequivalentes (meq). A ][ totalTy foi obtida da amostra após hidrólise ácida (HCl 6N) a

100ºC durante 22 horas. A metodologia detalhada encontra-se no item 2 do Anexo A.

2.9 Determinação das Propriedades Funcionais

2.9.1 Determinação da Capacidade de Retenção de Água e Óleo

A capacidade de retenção de água e de óleo foi determinada segundo metodologia

descrita por Diniz & Martin (1997). A capacidade de absorção de água ou óleo foi expressa

como a quantidade de água ou óleo absorvida por grama de proteína. Foram avaliados os

músculos modificado enzimaticamente seco a 90º e 110ºC (MME90 e MME110,

respectivamente) e o não modificado (MNM). Entretanto, para a análise do MNM, o mesmo

teve que ser desidratado em secador de bandeja a 50ºC por 8 horas (até atingir umidade

inferior a 10%), o qual foi denominado como músculo não modificado seco (MNMS). A

metodologia detalhada está apresentada no item 6 do Anexo A.

2.9.2 Determinação da Solubilidade

A solubilidade da proteína foi determinada de acordo com o método de Morr et al

(1985), que consiste em uma modificação do método de determinação do índice de

nitrogênio solúvel. Foram estudadas as solubilidades em pH 3, 5, 7, 9 e em água. A

porcentagem de solubilidade foi determinada através da relação entre conteúdo de proteína

solúvel pelo conteúdo de proteína total na amostra. A metodologia detalhada está

apresentada no item 3 do Anexo A.


2.9.3 Determinação das Propriedades Emulsificantes

A capacidade emulsificante e sua estabilidade foram determinadas segundo

SHAHIDI et al. (1995). A metodologia detalhada encontra-se no item 4 do Anexo A.

2.9.4 Determinação das Propriedades de Espuma

A capacidade de formação de espuma e sua estabilidade foram determinadas

conforme Fernandez & Macaruela modificado por Guan et al. (2007). A capacidade de

formação de espuma e sua estabilidade foram estudadas em tampão fosfato de sódio pH 3,

5, 7 e 9. A habilidade de formação de espuma foi calculada como sendo a porcentagem de

aumento no volume da dispersão protéica após homogeneização. A estabilidade da

espuma foi estimada como a porcentagem de espuma remanescente após 30 e 60 minutos.

A metodologia detalhada encontra-se no item 5 do Anexo A.

2.10 Tratamento Estatístico

Os resultados obtidos para produção no secador, digestibilidade in vitro e

propriedades funcionais do MME90, MME110, BSA e MNM foram avaliados através de

análise de variância (ANOVA) e as diferenças entre médias pelo teste de Tukey a 5% de

significância, utilizando o Software Statisitca 5.0 for Windows.



O teor protéico do MME90 e MME110 (Tabela 1) não apresentou diferença

significativa (p≤0,05) em relação ao MNM. A temperatura de secagem também não

influenciou significativamente (p>0,05) no conteúdo de proteína total do MME.

TABELA 1: Composição proximal do músculo não modificado e modificado enzimaticamente

Grau de

Hidrólise (%)

Umidade

(%)

Proteína

Total (%)b.s.

Lipídeos

Totais (%)b.s.

Cinzas

(%)b.s.

MNM** - 78,2a ± 1,8 84,3a ± 0,6 7,8a ± 0,3 5,9a ± 0,6

MME90* 3,01 ± 0,16a 6,1b ± 0,2 85,8a ± 1,0 8,8b ± 0,2 4,3b ± 0,2

MME110* 3,11 ± 0,24a 4,3c ± 0,2 85,7a ± 0,9 8,9b ± 0,3 4,5b ± 0,1

*Média e erro padrão de 3 repetições; ** Média e desvio padrão de 8 repetições; b.s. – base seca. MNM – músculo não modificado; MME90 e MME110 – músculo modificado enzimaticamente e seco a 90ºe 110ºC, respectivamente. Letras minúsculas diferentes, mesma coluna, apresentam diferença significativa (p≤0,05).


A diminuição significativa (p≤0,05) do conteúdo de cinzas no MME90 e MME110, em

relação ao MNM, foi devido à etapa de peneiramento no processo, pois o material não

solubilizado (pequenas espinhas) ficou retido sendo descartado, em conseqüência o teor de

lipídeos aumentou significativamente. O conteúdo de umidade do MME90 e MME110

encontraram-se abaixo dos 10%, demonstrando que as condições utilizadas na secagem

em leito de jorro mostraram-se adequadas para alcançar a umidade exigida comercialmente

para “Pós para Preparo de Alimentos”, segundo Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) Nº

273, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 22 de setembro de 2005, que

estabelece regulamento técnico.

3.2 Produção no Leito de Jorro

Uma maneira de verificar a estabilidade do secador de leito de jorro é através de

medidas da sua produção (Figura 1) e controle da temperatura de entrada e saída do

secador (Figura 2). O secador de leito de jorro apresentou um comportamento estável

durante a secagem tanto para músculo modificado enzimaticamente seco a 90º (MME90),

como para o seco a 110ºC (MME110). Isto pôde ser constatado pelo controle de produção

de pó em 4 amostras, que foram coletadas em um intervalo de 30 em 30 minutos, em um

tempo de processo de 150 minutos, que não apresentaram diferença significativa (p>0,05)

entre os tempos coletados.

FIGURA 1: Produção de pó (MME90 e MME110) no secador em leito de jorro. Média e erro padrão de 3 repetições. Letras minúsculas diferentes, em uma mesma amostra, apresentam diferença significativa (p≤0,05) nos diferentes tempos de coleta de amostra. Letras maiúsculas diferentes, nas diferentes amostras, apresentam diferença significativa (p≤0,05) em um mesmo tempo de coleta de amostra.

A secagem do músculo modificado enzimaticamente, a uma temperatura de ar de

entrada de 110ºC, não causou aumento significativo (p>0,05) na produção, em todos os


tempos avaliados, o que pode ser verificado comparando as duas amostras em cada tempo

(Figura 1).

A estabilidade do jorro também pôde ser verificada através das temperaturas de

entrada e saída do ar do secador (Figura 2). Oscilações muito grandes de temperatura

indicam problemas no funcionamento do secador. A temperatura do ar de entrada para

MME90 ficou em torno dos 91±2ºC, sendo que a temperatura de saída também permaneceu

estável no jorro atingindo 71±2ºC (Figura 2a). Para o MME110, a temperatura do ar de

entrada foi de 111±2ºC e a saída 89±2ºC (Figura 2b).

a

b

FIGURA 2: Temperatura do ar de entrada e saída no secador: a) MME90 e b) MME110.


3.3 Digestibilidade in vitro

A digestibilidade in vitro do músculo modificado enzimaticamente seco a 90ºC

(MME90) não diferiu significativamente (p>0,05) da proteína padrão albumina de soro bovino

(BSA) (Figura 3). Entretanto, a temperatura do ar de entrada do secador afetou a

digestibilidade, visto que a mesma para o MME110 foi estatisticamente inferior (p≤0,05) ao

MME90 e à proteína padrão (BSA), esta que foi semelhante ao reportado por Prata &

Sgarbieri (2005).

FIGURA 3: Digestibilidade in vitro para BSA, MME90, MME110 e MNM. Média e desvio padrão de 6 repetições; Letras diferentes apresentam diferença significativa (p≤0,05).

A modificação enzimática aliada à secagem em jorro (90ºC) promoveu um acréscimo

significativo (p≤0,05) de 32 pontos percentuais na digestibilidade do músculo não modificado

(MNM), sendo que o produto da digestão são aminoácidos livres, di, tri-peptídeos. Os

resultados do presente estudo foram semelhantes aos reportados por Abdul-Hamid et al.

(2002), que estudaram a qualidade nutricional de hidrolisado protéico de Tilápia

(Oreochromis mossambicus) seco em Spray dried a temperatura de ar de entrada/saída do

secador de 150ºC/76ºC e 180º/90º, sendo que o hidrolisado seco a 180ºC apresentou uma

menor digestibilidade (88,4%) se comprado com o seco a 150ºC (92,1%), ocorrendo

também uma diminuição no conteúdo de alguns aminoácidos essenciais como a Leucina e a

Lisina. É importante observar que o referido autor avaliou somente a fração solúvel

(hidrolisado – Grau de hidrólise 14%) e no presente estudo foi avaliado a fração solúvel e

insolúvel (modificado – Grau de hidrólise 3%), indicando que a modificação enzimática

tornou a proteína do músculo de anchoita facilmente digerível e com um custo


aparentemente menor, devido a menor concentração de enzima utilizada, menor tempo de

hidrólise e não requerendo a operação unitária de separação. Portanto a anchoita

apresenta-se como um bom substrato para ser utilizado na produção de proteínas

modificadas, pois mesmo em baixos graus de hidrólise (GH), sua digestibilidade é

semelhante à de hidrolisados com GH mais elevados.

Segundo Diniz & Martin (1999) o tecido do pescado, quando hidrolisado

enzimaticamente sob condições controladas, retém a qualidade nutricional do substrato

original, e/ou melhora a disponibilidade de alguns aminoácidos essenciais, os quais podem

ser comparados ao da proteína referência sugerida pela FAO/WHO (OETTERER, 2002).

3.4 Propriedades Funcionais

3.4.1 Solubilidade

A solubilidade do MME90, MME110 e MNM (Figura 4), em água, foi estatisticamente

superior aos demais meios, provavelmente devido à presença de sais, pois os pHs foram

ajustados com tampões fosfato de sódio.

FIGURA 4: Solubilidade protéica do MME90, MME110 e MNM em diferentes meios.

Média e erro padrãode 4 repetições. Letras minúsculas diferentes, em uma mesma amostra, apresentam diferença significativa (p≤0,05) nos diferentes meios aquosos avaliados. Letras maiúsculas diferentes, nas diferentes amostras, apresentam diferença significativa (p≤0,05) em um mesmo meio aquoso.

A solubilidade do MME110, em todos os meios avaliados foi estatisticamente

superior (p≤0,05) ao MME90 e MNM, o que indica que a temperatura de ar de entrada do

secador de 110ºC melhorou esta propriedade. A secagem afeta a solubilidade, esta que

geralmente aumenta com o aumento da temperatura, entretanto isto não pode ser


generalizado, pois um estudo realizado por Murueta et al. (2007), em concentrados

protéicos de pescado, observou uma diminuição da solubilidade com o aumento da

temperatura de secagem. Em geral a solubilidade das proteínas é incrementada na faixa

entre 40 e 50ºC (JACOB-LOPES et al., 2006). No jorro, o produto sai a uma temperatura em

torno de 5ºC acima da temperatura de bulbo úmido, no caso da secagem do MME110, a

temperatura de bulbo úmido ficou em torno de 41ºC e o produto saindo então a 46ºC. Já

para o MME90 a temperatura de bulbo úmido ficou em torno dos 35ºC, e produto saiu a

40ºC, este fato pode explicar o aumento da solubilidade.

A modificação enzimática do músculo ocasionou um aumento significativo na

solubilidade se comparado com o músculo não modificado. O MNM apresentou uma

solubilidade média, em água, de 22,5%, se compararmos com o MME90 (81,6%), e

MME110 (87,4%) houve um acréscimo na solubilidade de 261 e 288 pontos percentuais,

respectivamente. Este aumento na solubilidade é devido a uma maior exposição de resíduos

iônicos na superfície dos peptídeos e proteínas, devido a modificação e/ou hidrólise

enzimática, sendo que estes resíduos iônicos causam repulsão eletrostática entre as

moléculas de proteínas e repulsão entre cargas hidratadas ao redor dos grupos iônicos

(KRISTINSSON & RASCO, 2000c). Shaidi et al. (1995), Fonkwe & Singh (1996) Diniz &

Martin (1997), estudando a solubilidade de hidrolisados de pescado, encontraram resultados

em torno dos 90%. Deve-se salientar que estes autores avaliaram somente a fração

hidrolisada (solúvel), as quais apresentaram graus de hidrólise (GH) superiores ao do

presente estudo, indicando que a modificação enzimática do músculo de anchoita promove

uma solubilidade semelhante à de hidrolisados, como o resultado reportado por Guan et al.

(2007), que avaliaram a solubilidade em farelo de aveia modificado enzimaticamente (GH

de 4,1%) e encontraram 90% de solubilidade em pH 9,0.

Tanto para MME90 quanto para MNM a menor solubilidade encontrada foi em pH 5,

já para o MME110 as menores solubilidades foram encontradas em pH 3 e 5. A solubilidade

do MME90, MME110 e MNM aumentou conforme aumentava o pH. Este aumento ocorre

porque a solubilidade é maior em pH alcalino, devido ao número de resíduos de cargas

negativas em pH acima do ponto isoelétrico ser maior que o resíduo de cargas negativas

abaixo do ponto isoelétrico. No ponto isoelétrico, o número de cargas positivas e negativas é

igual, portanto elas se neutralizam intramolecularmente (CHEFTEL et al., 1993).

3.4.2 Capacidade de Retenção de Água e Óleo

Observando a capacidade de retenção de água e óleo (Figura 5) para o músculo

modificado enzimaticamente seco a 90ºC e 110ºC (MME90 e MME110, respectivamente) e


para o músculo não modificado seco (MNMS), verifica-se que a CRA para MME90 foi

semelhante estatisticamente (p>0,05) ao MME110, não havendo alteração nesta

propriedade funcional com o aumento de temperatura. A modificação enzimática ocasionou

um acréscimo significativo na CRA em comparação com o MNMS. Este aumento na CRA

pode ser justificado pela alteração do tamanho molecular dos peptídeos e da capacidade de

formação da rede protéica (KRISTINSSON & RASCO, 2000a).

FIGURA 5: CRA e CRO para o MNMS, MME90 e MME110. Média e erro padrão de 4 repetições. Letras diferentes, tanto na CRA quanto na CRO apresentam diferença significativa (p≤0,05). A CRA (g água/g proteína) e a CRO (g óleo/g proteína).

A CRO para MME90 foi estatisticamente superior (p≤0,05) ao MNMS e ao MME110,

provavelmente devido à capacidade da proteína de reter o óleo está relacionada com a

hidrofobicidade da sua superfície, portanto, como a modificação enzimática de uma proteína

promove uma maior exposição de grupos hidrofóbicos, consequentemente há um aumento

na hidrofobicidade superficial. Tais interações hidrofóbicas promovem interações proteína-

proteína o que aumenta a rede protéica. O que também pôde ser observado foi que a

temperatura afetou a CRO (KINSELLA, 1976).

Resultados semelhantes aos ilustrados na Figura 5 foram reportados por Kristinsson

& Rasco (2000b), onde a CRA e CRO foram estatisticamente superiores em produtos

empanados com polpa de salmão hidrolisada do que produtos controle, e por Sathivel et al.

(2004), que encontrou uma CRO, para pós elaborado a partir das partes reprodutivas de

diferentes pescados, de 3,9 mL de óleo/g de proteína.


3.4.3 Propriedades Emulsificantes

A capacidade emulsificante é um índice geralmente utilizado para medir a habilidade

de emulsões formadas por proteínas e peptídeos. A capacidade de emulsificação e sua

estabilidade, para a proteína padrão (BSA), MME90, MME110 e MNM, estão apresentadas

na Figura 6 e 7, respectivamente.

FIGURA 6: Capacidade de emulsificação do MME, BSA e MNM. Média e erro padrão de repetições; Letras diferentes apresentam diferença significativa (p≤0,05).

FIGURA 7: Estabilidade da emulsão para MME, BSA e MNM. Média e erro padrão de 4 repetições; Letras diferentes apresentam diferença significativa (p≤0,05).

Verifica-se (Figura 6) que o MNM apresentou uma capacidade emulsificante

estatisticamente inferior (p≤0,05) as demais amostras avaliadas e o MME90 apresentou uma


capacidade emulsificante semelhante à proteína padrão, não diferindo entre si

estatisticamente (p>0,05). Pôde-se também observar que a condição de secagem no leito

de jorro afetou significativamente a capacidade de emulsificação (Figura 6) e a estabilidade

da emulsão (Figura 7), pois estas, para MME110, foram estatisticamente inferiores ao

MME90, isto ocorreu devido intensidade do tratamento térmico, que afetou as propriedades

de emulsão, já que em condições inadequadas de secagem pode ocorrer a exposição dos

grupos reativos originalmente localizados em seu interior e estes grupos reativos aumentam

a interação atrativa entre as proteínas, alterando a susceptibilidade da emulsão à

coalescência (CHEFTEL et al., 1993). De acordo com Guo et al. (1996), as alterações físico-

químicas causadas pelo processamento térmico ocasionam a redução da capacidade

emulsificante devido à alteração na estrutura da proteína, resultando em um decréscimo na

concentração de proteína disponível para a emulsificação.

Observando a Figura 7, a estabilidade da emulsão do MME90 e o padrão BSA foram

estatisticamente superiores (p≤0,05) ao MME110 e MNM. Sendo que o MME90 e BSA

apresentaram resultados semelhantes não diferindo entre si. Houve uma diminuição

significativa (p≤0,05) na estabilidade da emulsão do MME110 em comparação com MME90,

o que indica que o tratamento térmico também foi prejudicial à estabilidade.

A modificação enzimática, aliada à secagem a 90ºC (MME90), promoveu um

acréscimo significativo (p≤0,05) de 398 pontos percentuais na capacidade de emulsificação,

e melhorou a estabilidade da emulsão. Este aumento na capacidade emulsificante do

MME90 em comparação com o MNM pode ser explicado, pelo fato que, a hidrólise parcial

das proteínas geralmente aumenta o número de grupos polares hidrofílicos, diminui o peso

molecular e altera a estrutura globular das proteínas podendo expor maior número de

grupos hidrofóbicos alterando as propriedades emulsificantes (ROMAN & SGARBIERI,

2005). Segundo Kristinsson & Rasco (2000ª), um estudo realizado por realizado por Spinelli

et al. (1972), em hidrolisados produzidos a partir de proteínas miofibrilares de filés pescado,

também mostrou um aumento na capacidade emulsificante e estabilidade comparado com a

proteína intacta.

A capacidade emulsificante e sua estabilidade, encontrados para o MME90 (53,3% e

80%, respectivamente), foram semelhantes aos reportados por Shaidi et al. (1995),

estudando hidrolisados (fração solúvel) de pescado (Mallotus villosus).

3.4.4 Propriedades de Espuma

Espuma é um sistema com uma fase líquida ou aquosa e uma fase dispersa de gás

ou ar (PANYAM & KILARA, 1996). Proteínas em dispersão causam o abaixamento da


tensão superficial na interface água-ar, o que causa a formação da espuma (SURÓWKA &

FIK, 1992). Verifica-se (Figura 8) que o MNM apresentou, estatisticamente (p≤0,05), a

menor expansão de espuma em todos os meios avaliados. A capacidade de formação de

espuma da proteína padrão BSA (proteína de referência) foi estatisticamente superior

(p≤0,05) as demais amostras em todos os meios avaliados. O tratamento térmico prejudicou

a habilidade de formar espuma do músculo modificado enzimaticamente e seco a 110ºC,

pois esta propriedade diminuiu significativamente em comparação com o músculo

modificado enzimaticamente seco a 90ºC, nos pHs 3, 5 e 7. Entretanto, em pH 9, a

capacidade de formação de espuma não sofreu influencia do tratamento térmico. Uma

causa provável para a diminuição da capacidade de formação de espuma, é alteração de

propriedades físico-químicas, causadas pelo processamento térmico, devido à alteração na

estrutura da proteína, resultando em um decréscimo na concentração de proteína disponível

para a formação espuma (GUO et al. 1996).

FIGURA 8: Capacidade de formação de espuma para MME90, MME110, MNM e BSA.

Média e erro padrão de 3 repetições. Letras minúsculas diferentes, em uma mesma amostra, apresentam diferença significativa (p≤0,05) nos diferentes pHs. Letras maiúsculas diferentes, nas diferentes amostras, apresentam diferença significativa (p≤0,05) em um mesmo pH.

A modificação enzimática promoveu um aumento significativo na capacidade de

formação de espuma, visto que o MME90 e MME110 foram estatisticamente (p≤0,05)

superiores ao MNM. Este resultado sugere um aumento na atividade superficial,

provavelmente devido ao grande número de cadeia polipeptídicas que surgiram com a

modificação enzimática (hidrólise parcial) da proteína, que permitiu uma maior incorporação

de ar.


Os menores valores de formação de espuma para o MME90 foram encontrados em

pH 5 e 7, estando de acordo com estudo realizado por Guan et al. (2007) em proteína de

farelo de aveia modificado enzimaticamente (GH 4,1%), onde a formação de espuma foi

menor em pH 5. Os resultados encontrados por este autor, em pH 3, 5, 7 e 9 foram,

respectivamente, 146,6%, 114,8%, 163,4% e 171,5%, inferiores aos encontrados para

MME90 de anchoita. Regiões ácidas e alcalinas apresentam uma maior formação de

espuma, e isto pôde ser observado para o MME90 e MME110, entretanto a formação da

espuma em pH 3 para a proteína padrão (BSA) foi estatisticamente inferior aos demais pHs.

Em estudos anteriores realizados, a capacidade de formação de espuma para o MME90, em

água, foi de 18%, já em pH7 foi de aproximadamente 230%, indicando que o tampão fosfato

influenciou na formação da espuma. Segundo Furtado et al. (2001) não somente fatores

relacionados ao grau de hidrólise podem influir no desempenho das propriedades de

espuma, mas também o pH e outros aspectos relacionados à composição do hidrolisado.

Segundo Drago e González (2000) o efeito do pH na capacidade de formação de espuma

está relacionado com a modificação de cargas na rede protéica.

Shaidi et al. (1995) e Diniz & Martin (1997) observaram uma capacidade de formação

de espuma de 170% e 140%, em hidrolisados (fração solúvel) de pescado, com graus de

hidrólise superiores ao presente estudo. Um aumento na capacidade de formação de

espuma de proteínas alimentares modificadas também foi reportado por Adler-Nissen

(1986), citado por Diniz & Martin (1997) e Kong et al. (2007).

TABELA 2: Estabilidade de espuma para BSA, MME90 e MME110. a)30min. b) 60min.

a) 30 minutos

pH BSA MME90 MME110 3 43,3Aa±1,0 43,1Aa±1,1 8,76Ba±0,3

5 21,5Ab±0,5 46,4Bb±0,5 11,3Cb±0,3

7 25,9Ac±0,7 36,7Bc±0,6 5,60Cc±0,1

9 45,7Ad±0,3 28,3Bd±0,3 21,3Cd±0,7

b) 60 minutos

pH BSA MME90 MME110 3 36,4Aa±0,5 33,1Ba±0,3 6,4Ca±0,5

5 14,2Ab±0,4 33,7Ba±0,8 10,5Cb±0,4

7 18,6Ac±0,4 35,9Bb±0,9 4,80Cc±0,2

9 26,2Ad±0,9 15,1Bc±0,4 0,66Cd±0,2

Letras maiúsculas diferentes na mesma linha apresentam diferença significativa (p≤0,05) num mesmo pH. Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna apresentam diferença significativa (p≤0,05) nos diferentes meios.

O MNM não apresentou estabilidade de espuma nos tempos e meios avaliados.

Observando a Tabela 2, o MME90 e a proteína padrão (BSA) apresentaram a

mesma estabilidade de espuma em pH 3, nos primeiros 30 minutos, entretanto a maior

estabilidade, aos 60 minutos, foi apresentada pela BSA. O MME90 apresentou maior

estabilidade aos 30 minutos e em pH 5, sustentando 46,4% da espuma inicial (verificada na


capacidade de formação de espuma), sendo esta estatisticamente superior a proteína

padrão BSA e ao MME110. Aos 60 minutos a maior estabilidade do MME90 foi encontrada

em pH 7,0. Pôde-se observar também que o tratamento térmico afetou significativamente a

estabilidade de espuma, pois em todos os meios avaliados para o MME110, esta

propriedade foi inferior ao MME90 e à BSA.

4 CONCLUSÕES

O grau de hidrólise foi de aproximadamente 3%, e a umidade final do MME90 e

MME110, de 6,1% e 4,2%, respectivamente.

O secador permaneceu estável durante os 150 minutos de secagem. A temperatura

do ar de entrada do secador de 110ºC não ocasionou um aumento na produção,

permanecendo igual à condição de 90ºC;

A modificação enzimática do músculo de anchoita aliada à secagem em leito de jorro

a 90ºC ocasionou um acréscimo de 32 pontos percentuais na digestibilidade in vitro

(aproximadamente 90%), e todas as demais propriedades funcionais apresentaram uma

melhora significativa.

A temperatura de secagem de 110ºC influenciou significativamente na digestibilidade

in vitro e demais propriedades funcionais. A digestibilidade, em comparação com o músculo

modificado enzimaticamente seco a 90ºC, diminuiu, assim como a capacidade de retenção

de óleo, propriedades de emulsão e espuma. Entretanto a solubilidade, em todos os meios

avaliados, aumentou e a capacidade de retenção de água permaneceu inalterada.

A maior solubilidade foi encontrada em água, atingindo 81,6% e 87,4% para o

MME90 e MME110, respectivamente. Estes resultados foram semelhantes aos reportados

na literatura para hidrolisados protéicos de pescado.

Os resultados encontrados indicam a potencialidade para o uso do músculo de

anchoita modificado enzimaticamente (baixos GH), seco em leito de jorro, em sistemas

alimentícios. O secador em leito de jorro é uma alternativa de menor custo na secagem

deste tipo de material, pois, a qualidade encontrada do produto foi semelhante à de

hidrolisados secos através de secadores “spray dried”, “freeze dried” e “liofilizadores”,

reportados na literatura.


5 AGRADECIMENTOS



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ARTIGO 3: Elaboração de uma sopa desidratada enriquecida com músculo (proteína) de anchoita (Engraulis anchoita) modificado enzimaticamente

RESUMO

A modificação enzimática de proteínas utilizando enzimas cada vez mais específicas vem

sendo amplamente estudada com o intuito de agregar valor ao pescado de baixo valor

comercial, que normalmente é descartado pelo processamento industrial ou não é

aproveitado, como é o caso da anchoita (Engraulis anchoita), que no Brasil não é

comercializada. Este trabalho teve como principal objetivo elaborar e avaliar um produto

alimentício, tipo sopa desidratada enriquecida com músculo (proteína) de anchoita

modificado enzimaticamente (MME), seco através da técnica de leito de jorro. O músculo

modificado enzimaticamente (MME) apresentou um grau de hidrólise (GH) de 3% e umidade

final de 6,1%. A modificação enzimática do músculo de anchoita promoveu um acréscimo de

32 e 261 pontos percentuais na digestibilidade in vitro e solubilidade, respectivamente. A

sopa desidratada preferida pelo consumidor, continha 7,5% de músculo modificado

enzimaticamente (MME), a qual apresentou um “Índice de Aceitação” de 86%. Segundo

teste de atitude, 71% dos consumidores comeriam a sopa pelo menos de 15 dias a uma vez

ao mês.

Palavras chave: proteína de pescado; hidrólise enzimática; Neutrase®; propriedades

funcionais; processamento de alimentos; fish byproducts


ABSTRACT

The enzymatic modification of proteins utilizing enzymes even more specifics it has been

widely studied with the aim of aggregate value to the fish of low commercial value, which is

normally discarded by industrial processing or it is not taken advantage, as it is the case of

the anchoita (Engraulis anchoita), that is not marketed in Brazil. This work had as main

objective to elaborate a food product, as dehydrated soup enriched with anchoita muscle

(protein) enzymatically modified (MME), dried in spouted bed and sensory evaluated. The

MME presented a hydrolysis degree (GH) of 3% and final moisture content, after the drying

in spouted bed, of 6.1%. The enzymatic modification promoted an increase of 32 and 261

points percents in the in vitro digestibility and solubility, respectively, in relation to the

unmodified muscle (MNM). The dehydrated soup preferred by the consumers was the one

who has 7.5% of MME, being its “Acceptation Index” of 86%. According to the attitude test

71% of the consumers would eat the soup unless 15 days to once a month.

Keywords: fish protein, enzymatic hydrolysis, Neutrase®, functional properties, processed

foods.


1 INTRODUÇÃO

Apesar da imensa área de costa do Brasil e do expressivo volume de água doce de

seus rios e lagos, o país é o 25º produtor mundial de pescado. Este é o reflexo de cerca de

20 anos de abandono, sem incentivos. Com a criação da Secretaria Especial da Aqüicultura

e Pesca da Presidência da República do Brasil voltou-se a tratar o assunto como prioridade.

Toda uma estrutura de desenvolvimento da produção está sendo criada visando promover

um desenvolvimento gradativo e sustentável, com amplo impacto em questões como a

geração de empregos e renda. O país está dando início a uma revolução já chamada de

“revolução azul”, que surge num momento em que a carência alimentar a nível mundial

cresce exponencialmente e o pescado se apresenta como uma solução saudável e de alto

rendimento (FRITSCH, 2004).

No atendimento à crescente demanda de alimentos, os recursos pesqueiros podem

contribuir significativamente para melhorar a qualidade nutricional da dieta, especialmente

nos países em desenvolvimento. De mais de 22000 espécies de peixes, somente algumas

centenas estão sendo utilizadas como alimento, sendo um terço da captura mundial de

pescado destinada à elaboração de ração animal ou desperdiçada como resíduo. A

subutilização de recursos pesqueiros pode ser atribuída a inúmeros fatores, que vão desde

a falta de tecnologia para a captura até a baixa disponibilidade de produtos aceitáveis ao

consumidor, a custo compatível com as demais fontes protéicas (CASTELLO, 2007).




desenvolvendo uma nova pescaria na região sul do Rio Grande do Sul. (MADUREIRA et al.,

2004).

Avanços recentes nas áreas de Tecnologia e Engenharia de alimentos têm

demonstrado os benefícios potenciais da utilização de enzimas no processamento

principalmente de alimentos protéicos. Aumentando assim as possibilidades de

aproveitamento de matéria prima, como pescados de baixo valor comercial. A adição de

enzimas para hidrolisar proteínas de alimentos é um processo de considerável importância,

pois podem melhorar a biodisponibilidade de nutrientes, as propriedades funcionais e

sensoriais das proteínas nativas sem prejudicar o seu valor nutricional (KRISTINSSON &

RASCO, 2000ª; GUAN et al., 2007).


Hidrolisados protéicos podem ser desidratados através de liofilização (SINHA et al.,

2007), freeze-drying (SHAIDI et al., 1995) ou secos em secadores do tipo spray (ABDUL -

HAMID et al., 2002). A secagem em leito de jorro é uma técnica utilizada para a secagem

pastas e suspensões e tem-se mostrado boa alternativa ao secador spray, por fornecer

produtos de qualidade similar, a custos significativamente inferiores (SPITZNER & FREIRE,

2002).

Este trabalho teve como objetivo elaborar e avaliar um produto alimentício, tipo sopa

desidratada enriquecida com músculo (proteína) de anchoita modificado enzimaticamente,

seco através da técnica de leito de jorro.


2.1 Matéria Prima

A matéria prima utilizada para a modificação enzimática foi a polpa de anchoita

(Engraulis anchoita). Esta que foi capturada em cruzeiro pelo “Navio Oceanográfico Atlântico

Sul”, no período de agosto e setembro de 2005, utilizando rede de arrasto de meia água, na

plataforma continental da região sul do Brasil. A mesma foi armazenada abordo em uma

parte de gelo, uma de água e duas de anchoita (1:1:2 – relação em massa) por 24 horas. A

captura da anchoita está ilustrada na Figura C1 do Anexo C.

2.2 Preparo da Matéria Prima

A anchoita foi lavada em água clorada (5ppm de cloro residual livre) e eviscerada,

onde se descartou cabeça e vísceras. O material restante foi despolpado nas instalações da

Indústria de Pescados “Pescal S.A.”, de Rio Grande – RS, obtendo-se a polpa e

descartando o resíduo. A polpa da anchoita foi submetida a três lavagens consecutivas,

sendo duas lavagens com água corrente (de aproximadamente 2 minutos cada), com auxilio

de uma tela, e terceira e última lavagem com uma solução de NaCl 3% (p/v). Retirou-se o

excesso de água através de centrifugação à g×3000 e a mesma foi armazenada em sacos

de polietileno de 0,250kg, a -18ºC. A polpa congelada permaneceu armazenada até o

momento de sua utilização.

2.3 Modificação Enzimática

A enzima utilizada no processo foi a Neutrase® 0.8L, uma endoprotease produzida

pelo Bacillus amyloliquefaciens, com atividade declarada 0.8AU/g (Novozymes A/S -


Bagsvaerd, Denmark) e cumpre com as especificações de pureza recomendada para

enzimas de grau alimentício pela FAO/WHO Expert Committe on Food Additives (JECFA) e

Food Chemicals Codex (FCC) (NEUTRASE®, 2006).

A Figura 1 ilustra o diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo

modificado enzimaticamente.

FIGURA 1: Diagrama de blocos do processo de obtenção do músculo modificado

enzimaticamente.

A polpa congelada foi descongelada em refrigerador a 7ºC por 6 a 8 horas, sendo

denominado de o músculo não modificado enzimaticamente (MNM). A hidrólise foi realizada

em biorreator encamisado, sob agitação contínua de 200rpm, a uma temperatura de 55ºC,

utilizando uma razão sólido/líquido 1:1 (polpa:tampão fosfato pH7,0). As condições de

proporção enzima:substrato (%NTotal x 6,25) e tempo estabelecidas no planejamento

experimental.

O controle do pH foi realizado mediante adição de NaH2PO4.H2O (0,20M) e/ou

Na2HPO4.7H2O (0,20M). A inativação enzimática foi realizada a 90ºC por 10 minutos. Estas

condições foram determinadas experimentalmente. O resfriamento foi realizado em banho

de gelo até atingir temperatura de 15ºC±2. Para a retirada de espinhas e alguma material

não solubilizado, a suspensão foi passada em peneira 32 mesh (500mm). A diluição foi


realizada com adição de água em função da concentração de sólidos na suspensão até

chegar a 7,5% p/v.

A secagem do músculo (proteína) modificado enzimaticamente foi realizada em um

leito de jorro cônico, constituído de: soprador radial (4kW), placa de orifício, aquecimento

elétrico (2,4kW), célula de secagem, medidores de pressão (manômetros do tipo tubo em

U), medidores de temperatura (termopares do tipo cobre-constantam) e ciclone (tipo Lapple)

para recolhimento do produto seco. A alimentação do secador foi utilizado bomba

peristáltica com atomização do tipo duplo com ar comprimido (200kPaabs). O secador está

apresentado na Figura C2 e C3 do Anexo C.

A célula de secagem do leito de jorro utilizada era cônica, com diâmetro de entrada

de 0,026m e diâmetro de célula de 0,18m, com ângulo interno de 60º.





7,5%, velocidade do ar 100% acima da velocidade de jorro mínimo. A temperatura do ar de

entrada foi de regulada na faixa de 90º, mantendo-se a saída a 70ºC a fim de garantir a

qualidade do produto final.

2.4 Determinação da Composição Centesimal

Teor de umidade, resíduo mineral (cinzas), lipídeos e proteína do foram

determinados de acordo com os procedimentos da AOAC (1995). O teor de lipídeos totais

no músculo não modificado foi determinado segundo Bligh & Dyer (1959).O teor de

carboidratos na sopa em creme desidratada foi determinado por diferença.

2.5 Determinação do Grau de Hidrólise (GH)

Para a determinação do grau de hidrólise (GH) foi utilizado o método proposto por

Adler-Nissen (1979). O GH foi calculado segundo a expressão apresentada na Equação 1


Onde h é o número de ligações peptídicas clivadas na hidrólise (meq Leucina/g

proteína) e totalh é o número total de ligações peptídicas (meq Leucina /g proteína). O totalh


adotado para pescado, foi de 8,6 meq Leucina/g proteína, segundo Nielsen, et al. (2001).

Metodologia detalhada encontra-se no item A1 do Anexo A.

2.6 Determinação da Digestibilidade in vitro


(1964). O conteúdo de tirosina liberada no sobrenadante foi determinado pela reação de

Lowry et al. (1951), utilizando uma curva padrão de tirosina. A digestibilidade expressa

segundo a equação 2


xTy

Ty

total

liberada (2)




100ºC durante 22 horas. A metodologia detalhada encontra-se no item A2 do Anexo A.

2.7 Determinação da Solubilidade

A solubilidade da proteína foi determinada de acordo com o método de Morr et al (1985),

que consiste em uma modificação do método de determinação do índice de nitrogênio

solúvel. A solubilidade foi determinada em água. A porcentagem de solubilidade foi

determinada através da relação entre conteúdo de proteína solúvel pelo conteúdo de

proteína total na amostra. A metodologia detalhada encontra-se no item A3 do Anexo A.

2.8 Formulação da Sopa Desidratada

Foram elaboradas três formulações para um produto tipo de sopa desidratada

enriquecida com músculo (proteína) modificado enzimaticamente, variando a quantidade de

abóbora desidratada em pó e músculo modificado enzimaticamente (MME) de anchoita em

pó. A quantidade dos demais ingredientes adicionados foi sugerida por Monteiro et al.

(2001), os quais foram testados previamente a fim de verificar a concentração a ser

adicionada, através de testes a nível laboratorial utilizando escalas de medida sensorial, e

permaneceram constantes nas três formulações (Tabela 1).


TABELA 1: Composição da formulação da sopa desidratada.

Quantidade (g/100g)

Ingredientes

A B C

Abóbora desidratada em pó 48 45,5 43 Maltodextrina 15,3 15,3 15,3

Fécula de batata 14,6 14,6 14,6

Leite em pó integral 5,9 5,9 5,9

Creme de leite em pó 5,3 5,3 5,3

MME de anchoita em pó 5 7,5 10 Sal 3 3 3

Açúcar 0,5 0,5 0,5

Salsinha desidratada 0,5 0,5 0,5

Cebolinha desidratada 0,5 0,5 0,5

Cebola em pó 0,4 0,4 0,4

Alho em pó 0,4 0,4 0,4

Noz moscada 0,3 0,3 0,3

Realçador de sabor (glutamato monossódico) 0,3 0,3 0,3

2.8.1 Modo de Preparo da Sopa em Creme

Os ingredientes da sopa desidratada foram pesados de modo a obter 17g por

porção. Seu modo de preparo consiste na dissolução de uma porção em 200mL de água

fervente seguido de agitação, estando pronta para o consumo.

2.9 Avaliação Sensorial da Sopa Desidratada

2.9.1 Avaliação de Preferência pelo Teste de Ordenação

As três formulações de sopa (Tabela 1) foram submetidas a avaliação por 30 julgadores

mediante aplicação de um teste de ordenação segundo ABNT – NBR 13170 (1994). Cada

julgador examinou as amostras codificadas de sopa e ordenou de ordem crescente de

acordo com sua preferência. Os resultados foram estatisticamente avaliados pelo teste de

Friedman, conforme descrito por Holander & Wolfe (1973), ao nível de significância de 5%,

utilizando a ficha de avaliação da Figura 2.


FIGURA 2: Modelo de ficha aplicada no teste de ordenação.

2.9.2 Avaliação Hedônica pelo Consumidor

A formulação preferida foi submetida à apreciação, através de “teste a nível

doméstico”, que consiste no preparo e prova do produto juntamente com o consumidor,

segundo LAFISE (Núcleo de Análises Físicas Sensoriais e Estatística) do Instituto de

Tecnologia de Alimentos (ITAL), citado por Faria & Yotsuyanagi (2002). Uma parcela da

comunidade (80 julgadores), com idade de 15 a 65 anos, da cidade de Rio Grande,

provaram a sopa no período de junho à agosto de 2006, utilizando uma escala hedônica

verbal de 9 pontos. Juntamente com a ficha de avaliação hedônica, foi aplicada uma escala

de atitude, a fim de verificar a freqüência em que consumidor viria a consumir a sopa em

questão. Os modelos da escola hedônica e atitude estão apresentados na Figura 3.


FIGURA 3: Modelo da ficha para avaliação hedônica.

2.9.3 Cálculo do Índice de Aceitação

O índice de aceitação (IA) percentual foi obtido, através dos valores retirados do

teste de escala hedônica, multiplicando-se a média dos pontos por 100 e dividindo o valor

resultante pela pontuação máxima, conforme citado por Bispo et al. (2004) e apresentado na

Equação 3.

B

AIA 100×= (3)

Onde A é a nota média obtida para o produto e B é a nota máxima dada ao produto. O

critério de decisão para o índice ser de boa aceitação é de igual ou superior a 70%,

conforme sugerido por Dutcosky (1996).


2.10 Determinação do Valor Calórico Total

O valor calórico total expresso em Kcal/100g de amostra foi calculado pelos fatores

de Atwater, para o produto final (sopa em creme desidratada), conforme Equação 4, citada

por Chizzolini et al. (1999).

)9(%)4(%)4(% ×+×+×= lipídeosproteínasoscarboidratVCT (4)

2.11 Avaliação Microbiológica

As análises microbiológicas foram determinadas no produto final (sopa em creme) de

maior preferência pelo consumidor. A amostragem foi realizada conforme APHA (2001) e

Institute of Food Science and Technology (1999). Foram avaliados a enumeração

Staphylococcus coagulase positiva, Coliformes a 45ºC e detecção de Salmonella sp.,

segundo a APHA (2001). A amostra foi avaliada em triplicata. As metodologias detalhadas

estão apresentadas nos Itens 1, 2, 3, e 4, do Anexo D.

2.12 Tratamento Estatístico

Os resultados obtidos para digestibilidade in vitro e solubilidade do MNM e MNM

avaliados através de análise de variância (ANOVA) a 5% de significância, utilizando o

Software Statisitca 5.0 for Windows.


3.1 Composição Proximal e Grau de Hidrólise

Os dados de composição proximal do músculo não modificado (MNM) e modificado

enzimaticamente (MME), juntamente com o grau de hidrólise (GH), estão apresentados na

Tabela 2.

TABELA 2: Composição proximal e grau de hidrólise do músculo não modificado (MNM) e

modificado enzimaticamente (MME).

. Grau de Hidrólise (%)

Umidade (%)

Proteína Total (%)b.s.

Lipídeos Totais (%)b.s.

Cinzas (%)b.s.

MNM* - 78,1 ± 1,8 84,3 ± 0,6 7,80 ± 0,3 5,90 ± 0,6

MME** 3,01 ± 0,36 6,1 ± 0,2 85,8 ± 1,0 8,8 ± 0,2 4,3 ± 0,2

b.s - base seca; *média e desvio padrão de 8 repetições; **Média e erro padrão de 3 repetições;


Observando a Tabela 2, a umidade do MME encontrou-se abaixo dos 10%,

demonstrando que as condições utilizadas na secagem em leito de jorro mostraram-se

adequadas pela legislação para “Pós para Preparo de Alimentos”, segundo RDC (Resolução

da Diretoria Colegiada) Nº 273, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 22 de

setembro de 2005, que estabelece regulamento técnico. O MME pode ser observado na

Figura 4.

FIGURA 4: Músculo (proteína) modificado enzimaticamente (MME) e seco em leito de jorro.

3.2 Digestibilidade in vitro e Solubilidade

Os resultados para a digestibilidade e a solubilidade do MME foram estatisticamente

superiores (p≤0,05) ao MNM (Tabela 3). Houve um acréscimo de 32 e 261 pontos

percentuais na digestibilidade e solubilidade, respectivamente. Este resultado foi próximo ao

reportado por Abdul-Hamid et al.(2002), que avaliou esta propriedade em hidrolisado

protéico obtido de Tilápia, seco em spray dried, obtendo um resultado de 92,1%. É

importante observar que o referido autor avaliou somente a fração solúvel (hidrolisado – GH

14%) e no presente estudo foi avaliado a fração solúvel e insolúvel (modificado – GH 3%),

indicando que a modificação enzimática tornou a proteína do músculo de anchoita

facilmente digerível e com um custo menor, devido a menor concentração de enzima

utilizada, tempo não requerendo a operação unitária de separação. A solubilidade também

foi relativamente elevada em comparação com hidrolisados reportados por outros autores

como Diniz & Martin (1997), que estudou esta propriedade em hidrolisados de Squalus

acanthias.


TABELA 3: Digestibilidade e solubilidade para o MNM e MME.

Amostra Digestibilidade in vitro (%)

Solubilidade (%)

MNM 67,4a±1,3 22,6a±1,4

MME 88,9b±1,6 81,6b±0,6

Média e erro padrão de 3 repetições; Letras minúsculas em uma mesma coluna apresentam diferença significativa (p≤0,05).

3.3 Elaboração da Sopa Desidratada

A abóbora desidratada em pó foi adicionada a fim de se obter o sabor base da sopa.

A escolha da abóbora desidratada foi feita mediante testes laboratoriais, onde foi avaliado a

preferência entre espinafre, abóbora e cebola. A maltodextrina, fécula de batata, leite em pó,

e creme de leite em pó foram acrescentados para proporcionar maior valor energético e

textura mais cremosa à sopa. Esta formulação proporcionou ao produto uma textura de

creme, de aspecto e sabor agradável. O músculo modificado enzimaticamente (MME) de

anchoita em pó, seco em leito de jorro, foi adicionado a fim de enriquecer a sopa,

aumentando o seu valor protéico.

3.4 Avaliação Sensorial

3.4.1 Avaliação da Preferência pelo Consumidor

A ordem de preferência atribuída pelos julgadores está apresentada na Tabela 4 e na

Tabela 5 está apresento os módulos de diferença entre as somas das ordens obtidas

mediante o teste de ordenação, submetido a 30 julgadores, que avaliaram a preferência das

três formulações de sopa desidratada, contendo as proporções de abóbora/MME, em

porcentagem, de: 48/5, 45,5/7,5 e 43/10.


TABELA 4: Ordem de preferência atribuída pelos julgadores.

Formulação Julgadores

A B C

1 2 1 3

2 1 2 3

3 3 1 2

4 2 1 3

5 2 1 3

6 1 2 3

7 3 2 1

8 3 1 2

9 1 2 3

10 3 1 2

11 3 1 2

12 3 1 2

13 1 3 2

14 3 2 1

15 3 1 2

16 3 1 2

17 3 1 2

18 3 1 2

19 1 2 3

20 3 2 1

21 3 1 2

22 3 1 2

23 3 2 1

24 3 1 2

25 1 2 3

26 3 1 2

27 2 1 3

28 3 2 1

29 3 2 1

30 2 1 3


TABELA 5: Módulo das diferenças entre as somas das ordens, obtidas a partir de 30

julgadores, para as três diferentes formulações de sopa.

Formulações

A B C

Total 73 43 64

Diferenças versus A - 30 9

Diferenças versus B - 21

Foi tomado como base a comparação do “valor crítico” (sugerido por Hollander &

Wolfe (1973), que para 30 julgadores e 3 amostras, a um nível de significância de 5%,

corresponde a 18,2) com os módulos das diferenças entre as somas de ordens fornecidas

pelo teste de Friedman, que estão expressas na Tabela 5, podemos afirmar que a

formulação preferida pelo consumidor foi a B, apresentando diferença estatística (p≤0,05),

conforme teste (30>18,2 assim como 21>18,32), de A e C. Entretanto, A e C (9<18,2) foram

iguais (p>0,05). A menor soma na pontuação indica a mais preferida pelo consumidor. O

MME apresenta um sabor característico, que se adicionado em grandes concentrações

levou o consumidor a uma menor apreciação do produto o que pode ser confirmado pelo

teste, pois a formulação B apresentou uma concentração intermediária. A formulação A,

segundo comentários dos consumidores apresentados na avaliação, tinha um sabor muito

forte a abóbora e muito fraco a pescado, já a formulação C um sabor forte a pescado, o qual

deixava um sabor residual na boca. Este sabor residual foi descrito por alguns consumidores

como sendo metálico adstringente e um pouco amargo, o que não é desejável. Segundo

Diniz & Martin (1999) uma causa provável para a presença de gosto amargo em hidrolisados

é a presença de peptídeos extremamente solúveis

3.4.2 Avaliação Hedônica pelo Consumidor

A Figura 5 expressa os resultados da avaliação hedônica realizada por 80

representantes da comunidade que provaram a “sopa desidratada enriquecida com proteína

de anchoita modificada enzimaticamente” (formulação B). A Figura 6 expressa os resultados

da atitude do consumidor em relação ao consumo de sopa.


FIGURA 5: Resultados da avaliação hedônica obtida a partir de 80 consumidores.

FIGURA 6: Atitude do consumidor em relação ao consumo de sopa.

Os resultados nos permitem afirmar que o produto contendo 7,5% de MME e 45% de

abóbora em pó (Formulação B) foi aceito pela população-alvo, com uma estimativa média

de 7,7. Considerando que 91% dos julgadores, conforme Figura 5, expressaram seu grau de

apreciação entre “Gostei moderadamente” a “Gostei extremamente”. O Índice de Aceitação

( IA ) do produto foi de aproximadamente 86%, sendo que o critério de decisão para o índice

ser de boa aceitação é de igual ou superior a 70%, conforme sugerido por Dutcosky (1996).

Este resultado é muito favorável, levando em conta ainda que o brasileiro não tenha o hábito


de consumo de sopa, o que pode ser observado na Figura 6, onde 11% dos consumidores

consomem sopa uma vez por semana. Dessa maneira, mesmo com a falta de consumo de

sopa, que é um fator fundamental para aceitação de um produto pelo consumidor, uma sopa

desidratada enriquecida com proteína de anchoita modificada enzimaticamente pode ser um

produto promissor de ser lançado ao mercado brasileiro, visto que 71% dos julgadores

comeriam sopa pelo menos de 15 dias a uma vez ao mês. Nenhuma consumidor afirmou

que não consumiria a sopa.

3.5 Composição Centesimal e Valor calórico Total do Produto Final

Observando a Tabela 6, que apresenta a composição centesimal da sopa

desidratada preferida pelo consumidor (Formulação B), a umidade ficou abaixo dos 10%,

mostrando-se adequado pela legislação para “Pós para Preparo de Alimentos”, segundo

RDC (Resolução da Diretoria Colegiada) Nº 273, da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária, de 22 de setembro de 2005, que estabelece regulamento técnico.

TABELA 6: Composição centesimal da sopa desidratada enriquecida com proteína de

anchoita modificada enzimaticamente (Formulação B).

Umidade (%)

Lipídeos (%) b.u

Proteínas (%) b.u

Carboidratos* (%) b.u

Cinzas (%) b.u

7,81 ± 0,45 2,94 ± 0,57 11,76 ± 0,89 73,51 ± 0,72 3,98 ± 0,97

Média e erro padrão de 3 repetições; *Carboidratos foram medidos por diferença; .b.u.-base úmida.

O valor calórico total encontrado para 100g de sopa desidratada foi de 367,5Kcal.

Cada porção de sopa desidratada, contendo 17g, apresentou 62,5Kcal. Algumas sopas

instantâneas de abóbora, vendidas comercialmente, apresentam 17g por porção e, contém

57Kcal e 5,9% de proteína aproximadamente. Ao acrescentar MME à sopa desidratada, o

conteúdo protéico teve um acréscimo de aproximadamente 100 pontos percentuais.

3.6 Avaliação Microbiológica

Durante o processamento e manipulação da matéria prima, bactérias podem ser

transferidas para a matéria-prima, podendo ser um risco para o produto final. Na Tabela 7,

pode ser observado os resultados da avaliação microbiológica da formulação B da sopa em

creme desidrata de anchoita.


TABELA 7: Avaliação microbiológica da sopa desidratada.

Enumeração

Microbiota 1 2 3

Staphylococcus coagulase positiva (NMP/g) 15 20 20

Coliformes a 45ºC (NMP/g) 4 11 7

Salmonella sp. (em 25g de amostra) Ausente Ausente Ausente

A enumeração de Staphylococcus coagulase positiva é utilizada como indicador de

contaminação pós-processo ou das condições de sanificação das superfícies operacionais.

Os valores encontrados de Staphylococcus coagulase positiva mostraram um número de

células reduzidas o que indica que foram seguidas as boas práticas de fabricação durante o

processamento.

A presença de Coliformes é considerada como indicador de condições higiene

insatisfatórias na produção e/ou manipulação do alimento. O número elevado de Coliformes

pode não significar contaminação direta com material fecal, mas sim manipulação

inadequada, como higiene do manipulador, transporte e acondicionamento inadequados. As

bactérias do gênero Salmonellas situam-se entre os agentes patogênicos mais

freqüentemente encontrados em surtos de toxinfecção de origem alimentar (CHISTÉ et al.,

2006) Em todas as amostras, a presença de Coliformes a 45ºC e Salmonella sp.

encontraram-se dentro dos limites exigidos para “Produtos a serem consumidos após adição

de liquido, com emprego de calor (min. 75ºC durante 20 segundos)” pela RDC (Resolução

da Diretoria Colegiada) Nº 12, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 02 de janeiro

de 2001, que estabelece padrões microbiológicos para alimentos. Sendo estes limites de 102

para coliformes a 45ºC e ausência de Salmonella sp. em 25g de amostra. A contagem de

Bacillus cereus não foi realizada no presente estudo.

4 CONCLUSÕES

O músculo modificado enzimaticamente (MME) apresentou um grau de hidrólise

(GH) de 3,01% e umidade final, após secagem em leito de jorro, de 6,1%.

A modificação enzimática promoveu um acréscimo de 32 e 261 pontos percentuais

na digestibilidade in vitro e solubilidade, respectivamente, em relação ao músculo não

modificado (MNM).

A formulação de sopa desidratada enriquecida com proteína de anchoita modificada

enzimaticamente preferida pelo consumidor foi a que continha 7,5% de MME, a qual


apresentou uma boa aceitação pelo público alvo, sendo o seu “Índice de Aceitação” de 86%.

Segundo teste de atitude, pelo menos 71% dos consumidores comeriam a sopa pelo menos

de 15 dias a uma vez ao mês.

De acordo com a Resolução RDC (Resolução da Diretoria Colegiada) Nº 12, da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 02 de janeiro de 2001, a “sopa desidratada

enriquecida com proteína de anchoita modificada enzimaticamente” apresentou-se dentro

dos padrões aceitáveis de contaminantes microbiológicos.

5 AGRADECIMENTOS



6 REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO IV – CONCLUSÃO GERAL

CAPÍTULO IV – CONCLUSÃO GERAL 96

4 CONCLUSÃO GERAL

A modificação enzimática por Neutrase®, aliada à secagem em leito de jorro a 90ºC

(temperatura do ar de entrada), ocasionou um acréscimo de 32 pontos percentuais na

digestibilidade in vitro, e uma melhora significativa nas propriedades funcionais de

capacidade de retenção de água e óleo, solubilidade, propriedades de emulsão e espuma,

em comparação com o músculo não modificado. Sendo as características apresentadas

pelo modificado protéico de anchoita semelhantes às reportadas por hidrolisados protéicos.

O leito de jorro apresentou-se viável tecnicamente, nas condições experimentais,

para a secagem de músculo (proteína) de anchoita modificado enzimaticamente, pois,

permaneceu estável e a umidade final, de todos os produtos de secagem (MME),

permaneceu abaixo dos 10%.

As propriedades funcionais de solubilidade (S) e capacidade de emulsificação (CE)

melhoraram significativamente com a extensão da hidrólise (GH) enzimática. Entretanto, a

produção no leito de jorro (PLJ) e a capacidade de formação de espuma (CFE) pioraram. A

digestibilidade in vitro (D), não sofreu alteração com o aumento do grau de hidrólise.

A maior produção no leito de jorro foi a partir dos 30 minutos e razão E/S de 0,01%.

Nesta região o GH atingido foi de aproximadamente 4%. Um aumento no grau de hidrólise a

partir de 4 % causou uma maior retenção no leito de jorro, e esta retenção, em um maior

tempo de secagem, poderia comprometer o funcionamento do secador.

A temperatura do ar de entrada de 110ºC, na secagem do músculo modificado

enzimaticamente (GH 3%), em comparação com o seco a 90º, não influenciou

significativamente na produção e capacidade de retenção de água. Entretanto, diminuíram a

digestibilidade in vitro, capacidade de retenção de óleo, propriedades de emulsão e espuma.

Com as características apresentadas pelo músculo de anchoita modificado

enzimaticamente (MME), o mesmo pôde ser aplicado na formulação de um produto

alimentício tipo sopa desidrata.

A formulação de sopa desidratada preferida pelo consumidor continha 7,5% de MME,

a qual apresentou uma boa aceitação pelo público alvo, sendo o seu “Índice de Aceitação”

de 86%. Uma sopa desidratada enriquecida com proteína de anchoita modificada

enzimaticamente pode ser um produto promissor de ser lançado ao mercado brasileiro, visto

que 71% dos julgadores consumiriam a sopa pelo menos de 15 dias a uma vez ao mês.

CAPÍTULO IV – CONCLUSÃO GERAL 97

4.1 SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS

• Traçar o perfil de aminoácidos e avaliar o peso molecular das proteínas da anchoita

modificadas enzimaticamente;

• Realizar a contagem de Bacillus cereus na “sopa em creme de anchoita”;

• Avaliar a vida de prateleira da “sopa em creme de anchoita”;

• Realizar uma Análise Descritiva Quantitativa (ADQ) na “sopa em creme de

anchoita”;

• Otimizar o processo de aproveitamento da anchoita para produção de proteínas

modificadas enzimaticamente, utilizando a técnica de secagem em leito de jorro,

avaliando as características funcionais e nutricionais do produto final;

• Estudar a influência de diferentes condições de secagem em diferentes graus de

hidrólise, do músculo de anchoita modificado enzimaticamente, sobre a qualidade

do produto final;

• Estudar a secagem do MME com maltodextrina;

• Estudar a transição vítrea no leito de jorro;

• Modificar o músculo de anchoita através de enzimas extraídas e purificadas das

vísceras do próprio pescado;

• Extrair os ácidos graxos das vísceras de anchoita e traçar o seu perfil;

• Caracterizar as frações protéicas do músculo de anchoita não modificado e

modificado enzimaticamente;

CAPÍTULO V – REFERÊNCIAS

CAPÍTULO V - REFERÊNCIAS 99

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96. SGARBIERI, W. C. Proteínas em Alimentos Protéicos: propriedades, degradações,

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2003.

CAPÍTULO VI – ANEXOS

CAPÍTULO VI - ANEXOS 110

ANEXO A

Item A1: Medida do Grau de Hidrólise

O GH foi determinado segundo Adler-Nissen (1979) e é definido como o número de

ligações peptídicas clivadas ou número de grupos amino livres formados durante o processo

de hidrólise, expresso em equivalentes de hidrólise )(h . O número total de ligações

peptídicas antes da hidrólise )( totalh adotado para pescado (8,6 meq Leucina/g proteína) foi o

proposto por Nielsen, et al. (2001). O GH foi calculado segundo a expressão:

100(%) ×=totalhhGH

O processo foi seguido através de retiradas periódicas de alíquotas do meio de

reação, as quais eram diluídas a 10mL de dodecil-sulfado de sódio (SDS) 1% (p/v) e

conseqüente inativação térmica da enzima (90ºC por 10 minutos estudados previamente),

seguido de reação com TNBS (ácido trinitrobenzeno sulfônico) para determinação do

número de ligações peptídicas clivadas. Após inativação térmica as amostras foram

centrifugadas a g×3000 por 15 minutos. Alíquotas de 1mL foram retiradas do sobrenadante

e diluídas a 10mL SDS 1% (p/v). Para a reação com TNBS, alíquotas de 0,25mL da amostra

reagiram com 2mL de TNBS 0,1% (p/v) e 2mL de tampão fosfato de sódio pH 8,2 a 50ºC, 1

hora e no escuro. A reação foi parada com a adição de 4mL de HCl 0,1N por 30 minutos.

Realizou-se a quantificação espectrofotométrica a 340nm, utilizando a Leucina como

padrão, cuja concentração variou de (0,2-2,0x10-3 meq Leucina/L).

Item A2: Digestibilidade in vitro


(1964) com pequenas modificações. Cerca de 250mg de proteína foram hidrolisados com 10

mL de pepsina (1,5mg/mL em HCl 0,1N) a 37ºC e sob agitação constante (90rpm) por 3

horas. Após elevou-se o pH a 7,0 com solução de NaOH 0,3N (anotar o volume gasto).

Adicionou-se ao sistema 10mL de solução de pancreatina (1,5mg/mL em tampão fosfato pH

8,0). Levou-se a agitação contínua (130rpm) a 37ºC por 24 horas. Centrifugar o sistema a

6000g por 10 minutos e filtrar. Tomar uma alíquota de 10mL do filtrado e adicionar TCA

(ácido tricloro-acético) 10%. Deixar em repouso por 1 hora a 7ºC. Centrifugar (5000g, 5

minutos) e filtrar. O conteúdo de tirosina liberada no sobrenadante foi determinado pela

reação Lowry et al. (1951), utilizando uma curva padrão de tirosina (y=3,84236x;

R2=0,98). A digestibilidade expressa segundo a Equação 1.


Digestibilidade 100][][

xTy

Ty

total

liberada




100ºC durante 22 horas, quantificada por reação de Lowry et al. (1951), utilizando uma

curva padrão de tirosina.

Item A3: Solubilidade

A solubilidade da proteína foi determinada de acordo com o método de Morr et al.

(1985), com variação de pH (3, 5, 7 e 9) e/ou em água. Foram pesados aproximadamente

200mg de proteína de cada amostra em bécker de 50mL, adicionou-se 2mL de solução de

NaCl 0,1M obtendo-se uma pasta homogênea. Em seguida foi adicionada a solução ao pH

correspondente até o volume de 40mL. A dispersão protéica foi mantida sob agitação, em

agitador magnético, por 45 minutos. A dispersão foi transferida para um balão volumétrico

de 50mL, completando-se o volume com solução ao pH correspondente. A dispersão

protéica foi centrifugada a 6000xg por 30 minutos. Alíquotas do sobrenadante foram

tomadas para identificar o conteúdo de proteína solúvel pelo método Kjeldahl. O conteúdo

de proteína total na amostra foi determinado pelo método Kjeldahl. A porcentagem de

solubilidade foi determinada através da relação entre conteúdo de proteína solúvel pelo

conteúdo de proteína total na amostra.

Item A4: Propriedades de Emulsificação

A capacidade emulsificante e sua estabilidade foram determinadas segundo Shahidi

et al. (1995), utilizando amostras na mesma proporção. Para 1g de proteína foram

adicionados 20mL de água destilada e 20mL de óleo de soja. A mistura foi homogeneizada

a 10.000rpm por 30 segundos e posteriormente centrifugada a g×2000 por 5 minutos. A

capacidade de emulsificação foi calculada como o volume da porção emulsificada pelo

volume total. A estabilidade das amostras foi determinada aquecendo a mistura por 30

minutos a 80ºC e posteriormente centrifugada a g×2000 por 5 minutos. O volume da fração

emulsificada e o volume total foram registrados. A estabilidade da emulsão foi expressa

como a porcentagem da capacidade emulsificante após aquecimento.

Item A5: Propriedades de Espuma


As propriedades de espuma foram determinadas conforme Fernandez & Macaruela

modificado por Guan et al. (2007). Porções de 40mL de solução contendo 20mg de

proteína/mL, variando pH (3, 5, 7 e 9 – tampão fosfato de sódio) ou em água foram

misturadas completamente usando um homogeneizador a 10.000rpm por 3 minutos. A

habilidade de formação de espuma foi calculada como o volume da fração de espuma pelo

volume de solução protéica inicial (40mL), ou seja, a porcentagem de aumento no volume

da dispersão protéica após mistura. A estabilidade da emulsão foi estimada como a

porcentagem de espuma remanescente após 30 e 60 minutos.

Item A6: Capacidade de retenção de água (CRA) e óleo (CRO)

A capacidade de retenção de água e de óleo foi determinada segundo metodologia

descrita por Diniz & Martin (1997), com pequenas modificações. Foi adicionado 500mg de

proteína em bécker de 50mL onde foram acrescentados 10mL de água. Para a capacidade

de retenção de óleo foram acrescentados 10mL de óleo de soja. As amostras foram

agitadas em agitador magnético por 20 minutos a temperatura ambiente (25ºC±2) e

transferidos para tubos de centrífuga previamente pesada, onde permaneceram 6 horas em

repouso à temperatura ambiente (25ºC±2) antes de serem centrifugados a 2000xg por 30

minutos. O excesso de água e de óleo foi descartado por inversão dos tubos em papel

absorvente. A diferença entre o peso da amostra antes e após a absorção de água ou de

óleo foi tomada como a quantidade de água e óleo absorvida. A capacidade de absorção de

água ou óleo foi expressa como a quantidade de água ou óleo absorvida por grama de

proteína.


ANEXO B

FIGURA B1: Curva da atividade enzimática da Neutrase®.

FIGURA B2: Curva da atividade residual da Neutrase®.


FIGURA B3: Efeitos estimados das variáveis E/S, tempo e sua interação. A) Grau de Hidrólise; B) Digestibilidade; C) Solubilidade; D) Capacidade de

Emulsificação; E) Capacidade de Formação de Espuma; F) Produção no Leito de Jorro.


A

B

C D

E

FIGURA B4: Temperatura de entrada e saída do ar no secador para os experimentos do

planejamento experimental. A) Experimento 1; B) Experimento 2; C) Experimento 3; D) Experimento 4; E) Experimento 5;


ANEXO C

FIGURA C1: Captura da anchoita (Engraulis anchoita) pelo Navio Oceanográfico Atlântico

Sul – FURG

FIGURA C2: Esquema do equipamento para secagem em leito de jorro.


FIGURA C3: Secador de leito de jorro, geometria cônica.


ANEXO D

Item D1: Amostragem

Foram avaliadas amostras com 25g da sopa em creme desidratada. De maneira

asséptica, 25 g de amostras foram homogeneizadas, durante 2 minutos com 225ml de

solução de diluição de água peptonada 0,1% (10-1) utilizando o Stomacher. Foram

executadas homogeneizações uniformes com a menor aeração possível. Utilizando-se a

diluição 1:10, realizou-se uma série de diluições sucessivas de 10-1 a 10-6. Cada diluição foi

adequadamente agitada antes de cada transferência. Para a detecção de Salmonella sp.,

foram utilizadas 25g da amostra, adicionada diretamente ao caldo de pré- enriquecimento.

As avaliações foram efetuadas em triplicata (IFST, 1999; APHA, 2001).

Item D2: Contagem de Staphylococcus coagulase positiva

Como meio seletivo para a enumeração de Staphylococcus coagulase positiva foi

utilizado o Baird-Parker Ágar . O meio combina o telurito de potássio (0,01%), glicina (1,2%)

e o cloreto de lítio (0,5%) como agentes seletivos e, a redução do telurito e a hidrólise da

gema de ovo, como características diferenciais. Adicionalmente o meio contém 15% de

piruvato de sódio como agente reparador de células injuriadas. A enumeração foi

determinada por plaqueamento direto com espalhamento do inóculo com o auxílio da alça

de Drigalsky, inversão e incubação das placas a 37 ºC por 48 horas. Foram enumeradas

todas as colônias de estafilococos presuntivos (típicas e atípicas). Posteriormente, colônias

características foram replicadas no caldo de enriquecimento Brain Heart Infusion – BHI. O

meio foi incubado a 37 ºC por 24 horas. A confirmação das colônias típicas foi

bioquimicamente comprovada através da produção de coagulase com plasma de coelho

(incubação a 37 ºC por 1-4 horas), reação de termoresistência em meio D’NAse (100 ºC por

15 minutos) e presença da catalase pelo desdobramento de peróxido de hidrogênio. O

cálculo dos resultados (NMP) considerou como culturas de Staphylococcus coagulase

positivo, aquelas que apresentaram reações positivas de coagulase, termonuclease e

catalase (APHA, 2001).

Item D4: Enumeração de coliformes a 45ºC

Utilizou-se a técnica do Número Mais Provável (NMP), indicada para a detecção de

baixas concentrações de coliformes e por apresentar maior sensibilidade do que os métodos

de plaqueamento. No teste presuntivo, foi avaliada a fermentação da lactose. Como meio de

cultura seletivo, utilizou-se o Lauryl Sulfate Broth – LSB. Este meio oferece como fonte de

carbono apenas a lactose, a qual é fermentada com produção de ácido e gás, que é


evidenciado no tubo de Durhan. O meio contém, ainda, o reagente lauril sulfato, que inibe o

crescimento da microbiota acompanhante. A incubação foi verificada a 37 ºC por 48 horas.

Para o teste confirmativo utilizou-se o meio seletivo EC Broth, com incubação a 45 ºC por 24

horas (APHA, 2001).

Item D4: Detecção de Salmonella sp.

A técnica de análise foi executada através do pré-enriquecimento de 25g da amostra

por diluição em 225ml de Lactose Broth. O meio inoculado foi incubado a 37 ºC por 24

horas. A seguir realizou-se o enriquecimento seletivo; alíquotas correspondentes a uma

alçada foram inoculadas em Selenite Cystine Broth – SC Broth e em Tetrathionate

Enrichment Broth – TTB. Os meios foram incubados a 42 ºC em banho-maria por 24 horas.

A partir do enriquecimento seletivo foram feitas estrias, com o auxílio de alça de Henly, no

Hektoen Enteric Ágar. Após incubação a 37 ºC por 24 horas, colônias de coloração azul ou

verde, com ou sem centro escuro, foram consideradas como Salmonella sp. Após o

plaqueamento seletivo, foi realizada a identificação bioquímica das colônias típicas em Triple

Sugar Iron Agar – TSI Ágar e em Lysin Iron Agar – LIA a 37 ºC por 24 horas (APHA, 2001).

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