UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LEONARDO GOMES SOUZA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE

NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO

TOPOTECANO

Goiânia 2010

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LEONARDO GOMES SOUZA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE

NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO TOPOTECANO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Goiás, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto

Goiânia 2010

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

S729d

Souza, Leonardo Gomes.

Desenvolvimento e caracterização de nanopartículas

lipídicas contendo topotecano [manuscrito] / Leonardo

Gomes Souza. - 2010.

85 f. : il., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,

Faculdade de Farmácia, 2010.

Bibliografia.

Inclui lista de figuras e abreviaturas.

1. Microemulsão – diluição. 2. Nanopartículas lipídicas

sólidas. 3. Carreadores lipídicos nanoestruturados. 4.

Cloridrato de topotecano. 5. Fármacos hidrofílicos. I. Título.

CDU: 615.014.6

LEONARDO GOMES SOUZA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS

LIPÍDICAS CONTENDO TOPOTECANO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Goiás, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

Aprovada em Goiânia no dia 29 de outubro de 2010.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Luís Alexandre Pedro de Freitas Universidade de São Paulo

Profa. Dra. Marize Campos Valadares Bozinis Universidade Federal de Goiás

Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto Universidade Federal de Goiás

A Deus, por ser o meu Tudo. Aos meus pais, José e Celeste, e à minha irmã Lorenna, por sempre acreditarem em mim. Às minhas sobrinhas, Andrya e Lavinnya, por tornarem meus dias mais alegres.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, por me ensinar a ser um

pesquisador. Obrigado pelo apoio incondicional e pelas palavras de incentivo.

À Emmanuelle, por assumir comigo este desafio e não medir esforços para a

realização deste trabalho. Obrigado pelo carinho, comprometimento e amizade.

Ao André Luís, por estar presente em todos os momentos. Obrigado pelo

comprometimento e amizade.

À Stephânia, pelas trocas de conhecimento e por estar sempre disposta a ajudar.

Obrigado pelo carinho e pelas palavras de estímulo.

À Mariana Mota, pela realização dos estudos de citotoxicidade.

Ao Rodolpho Braga, pela realização dos estudos de espectrometria de massas.

À Marilisa, por manter a organização do laboratório permitindo o bom andamento

dos experimentos e pelas risadas na sala do Massas.

À Fernanda Bellato, pelos atenciosos “bons-dias” e por cuidar de todos nós com

carinho de mãe.

À Profa. Dra. Danielle Guimarães Almeida Diniz, por me ensinar a dar os primeiros

passos no uso do HPLC.

À Profa. Dra. Eliana Martins Lima, pelas contribuições no trabalho.

A todos da família FarmaTec, pelos momentos de descontração e contribuição na

realização deste trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo

auxílio financeiro concedido a este projeto.

Pedras no caminho? Guardo todas, um

dia vou construir um castelo...

Fernando Pessoa

RESUMO

O cloridrato de topotecano (TPT), derivado semi-sintético hidrofílico da camptotecina, é um fármaco antineoplásico inibidor da topoisomerase I. A encapsulação do TPT em nanocarreadores pode protegê-lo da inativação no pH plasmático, além de contornar o problema da resistência celular mediada pela glicoproteína-P (P-gp). No presente trabalho foram produzidas nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo TPT por três técnicas diferentes: homogeneização sob alta pressão a frio (HAPF), preparo de emulsão múltipla (PEMM) e diluição de microemulsão (DMM). Sistemas derivados das NLS, os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) foram produzidos apenas por DMM. A temperatura mostrou-se como fator limitante na produção de nanopartículas contendo TPT, devendo ser rigorosamente controlada. As nanopartículas (NLS e CLN) produzidas por DMM apresentaram melhor eficiência de encapsulação (EE%), distribuição de tamanho de partícula e carga de fármaco. Essas nanopartículas apresentaram tamanho médio em torno de 150 nm, PdI 0,2 e potencial zeta médio de -45 mV. Apesar da encapsulação de fármacos hidrofílicos em matrizes lipídicas ser tarefa difícil, as nanopartículas lipídicas contendo TPT apresentaram carga de fármaco em torno de 6% com EE% maior que 95%. A encapsulação do TPT em nanopartículas lipídicas prolongou sua liberação por 12 horas e protegeu o fármaco da degradação em pH 7,4 a 37°C. A nanoencapsulação do TPT também aumentou sua citotoxicidade em células leucêmicas K562 nos períodos de 2 e 24 horas. Não houve diferenças entre os CLN e as NLS nos estudos de liberação, citotoxicidade e estabilidade. A trealose foi um crioprotetor eficaz na liofilização dos CLN e das NLS contendo TPT. As NLS e os CLN liofilizados com 15% de trealose permaneceram estáveis por pelo menos 30 dias. Os carreadores lipídicos nanoestruturados e as nanopartículas lipídicas sólidas contendo topotecano obtidos no presente trabalho apresentam potencial para melhorar a resposta clínica associada à administração parenteral deste importante fármaco citotóxico. Palavras-chave: Diluição de microemulsão. Nanopartículas lipídicas sólidas. Carreadores lipídicos nanoestruturados. Cloridrato de topotecano. Fármacos hidrofílicos.

ABSTRACT Topotecan (TPT), hydrophilic semisynthetic analogue of camptothecin, is a topoisomerase I inhibitor anticancer agent. Encapsulation of TPT in nanocarriers can protect him from inactivation on plasmatic pH and P-glycoprotein (P-gp) mediated resistance. In this study, solid lipid nanoparticles (SLN) were produced by three different methods: cold high pressure homogenization (CHPH), double emulsion prepare (DEMP) and microemulsion dilution (MMD). Derivative systems from NLS, nanostructured lipid carriers (NLC) were produced only by MMD. Temperature proved to be a limiting factor in producing nanoparticles loaded TPT and must be strictly controlled. Nanoparticles produced by MMD (SLN and NLC) presented best encapsulation efficiency, drug loading and particle size distribution. These particles presented 150 nm average diameter, 0.2 PdI and -45 mV average zeta potential. Despite the hydrophilic drugs encapsulation to be a hard work, lipid nanoparticles loaded TPT presented 6% drug loading and an encapsulation efficiency biggest then 95%. Encapsulation of TPT in lipid nanoparticles sustained drug release by 12 hours and protected the drug from degradation at pH 7,4 at 37°C. Drug nanoencapsulation also increased his citotoxicity on K562 leucemic cells at 2 and 24 hours. There weren’t differences between NLC and SLN on release, citotoxicity and stability studies. Threalose was an efficient cryoprotector on lyophilization of SLN and NLC loaded TPT. Lyophilizates NLC and SLN with 15% of threalose stayed stable almost for 30 days. Nanostructured lipid carriers with high topotecan chloridrate loading obtained in this work presented potential to improve clinical efficacy associated with parenteral administration of this important citotoxic drug. Key-words: Microemulsion dilution. Solid lipid nanoparticles. Nanostructured lipid carriers. Topotecan chloridrate. Hydrophilic drugs.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema representativo do mecanismo de ação da glicoproteína-P. O fármaco que entra na célula é bombeado para o meio extracelular por um mecanismo ATP-dependente. Fonte: adaptado de Krishna e Mayer, 2000................................................................................... 20

Figura 2 – Esquema representativo da permeabilidade aumentada em tumores. O tecido saudável é caracterizado por um endotélio contínuo onde somente o fármaco livre consegue permear. No tecido tumoral o endotélio vascular fenestrado permite o extravasamento das nanopartículas. Fonte: adaptado de Gaumet et al., 2008.............................. 21

Figura 3 – Esquema representativo de uma nanoemulsão (A) e uma nanopartícula lipídica sólida (B). Fonte: Müller et al, 2000............................ 22

Figura 4 – Esquema representativo dos carreadores lipídicos nanoestruturados e das nanopartículas lipídicas sólidas. Os cristais lipídicos das NLS adquirem um arranjo mais perfeito durante o período de armazenamento acarretando na expulsão do fármaco, o que não ocorre com os CLN. Fonte: Müller et al., 2002......................................................... 23

Figura 5 – Estrutura química da camptotecina............................................. 24

Figura 6 – Obtenção do topotecano a partir da camptotecina. A síntese do topotecano foi realizada adicionando-se um grupo dimetilamino e uma hidroxila no anel A da camptotecina.............................................................. 25

Figura 7 – Conversão da forma ativa (lactona) do topotecano em sua forma inativa (carboxilato).............................................................................. 26

Figura 8 – Esquema ilustrando a encapsulação de um fármaco catiônico hidrofílico em uma nanopartícula híbrido polímero-lipídio (PLN). D+ representa o fármaco catiônico e a linha curva representa o polímero aniônico. O complexo é formado pela neutralização das cargas das moléculas, que é encapsulado na nanopartícula lipídica. Fonte: Wong et al., 2007......................................................................................................... 28

Figura 9 – Fluxograma do processo de obtenção de NLS por homogeneização sob alta pressão a quente e a frio. Fonte: adaptado de Mehnert e Mäder, 2001..................................................................................

30

Figura 10 – Esquema representativo da encapsulação de fármacos hidrofílicos em NLS pela técnica de emulsão múltipla. As cabeças polares do lipídeo formam uma camada externa ao redor de toda partícula. O fármaco (F) fica inserido no meio aquoso formado pelas micelas reversas e as caudas hidrofóbicas dos tensoativos (Tens.) ficam ancoradas nas longas cadeias alquilas do lipídeo. Fonte: adaptado de Liu et al, 2007............................................................................................................... 31

Figura 11 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas por homogeneização sob alta pressão a frio. Adição do TPT à mistura de lipídeos fundidos (A). Resfriamento da mistura em nitrogênio líquido após adição do fármaco (B). Cominuição da massa sólida formada em gral e pistilo (C). Preparo de suspensão do material sólido cominuído em solução aquosa de poloxamer, sob resfriamento em banho de gelo (D). Microfluidização da suspensão obtida (E)..................................................... 39

Figura 12 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas por preparo de emulsão múltipla. Gotejamento da solução de TPT sobre a solução acetônica de lipídios em banho ultrassônico, formação da primeira emulsão (A). Adição da solução de poloxamer 2,0% sobre a primeira emulsão, formação da emulsão múltipla (B). Adição da solução de poloxamer 1,6% sobre a emulsão múltipla e agitação mecânica para eliminação do solvente orgânico e formação das NLS por precipitação dos lipídios em meio aquoso (C).......................................................................... 40

Figura 13 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados por diluição de microemulsão. Adição de água à mistura fundida de lipídeos e tensoativos, seguida da formação da microemulsão (A). Adição do fármaco à microemulsão formada (B). Gotejamento da mistura (microemulsão + fármaco) em água gelada sob cisalhamento em ultra-turrax (C).................................................................... 41

Figura 14 – Sistema de ultrafiltração Vivaspin 2, Sartorius. Fonte: Manual Vivaspin, Sartorius......................................................................................... 43

Figura 15 – Célula de fluxo estático tipo “Franz”. Fonte: Adaptado do manual Microette, Hanson Research............................................................. 46

Figura 16 – Células de fluxo estático tipo “Franz” acopladas em equipamento de coleta automatizada, Hanson Research. Fonte: Manual Microette, Hanson Research.......................................................................... 46

Figura 17 – Espectro de absorbância do cloridrato de topotecano na região do ultravioleta...................................................................................... 49

Figura 18 – Perfil cromatográfico do cloridrato de topotecano obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min... 50

Figura 19 – Perfil cromatográfico do cloridrato de topotecano na presença dos excipientes da formulação obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min...................................................... 51

Figura 20 – Curva de calibração do cloridrato de topotecano...................... 52

Figura 21 – Eficiência de encapsulação das formulações NLS1, NLS2 e NLS4. NLS1 – produzida por homogeneização sob alta pressão a frio. NLS2 – produzida por preparo de emulsão múltipla. NLS4 – produzida por diluição de microemulsão............................................................................... 57

Figura 22 – Distribuição de tamanho em função da intensidade de espalhamento de luz das nanopartículas produzidas por homogeneização sob alta pressão a frio (NLS1), preparo de emulsão múltipla (NLS2) e diluição de microemulsão (NLS3).................................................................. 57

Figura 23 – Cromatograma da amostra de fármaco total da formulação NLS3. Corrida de 45 minutos. Obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min...................................................... 58

Figura 24 – Cromatograma da formulação NLS3 branca. Corrida de 30 minutos. Obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min........................................................................................ 59

Figura 25 – Cromatograma dos picos base da amostra de topotecano degradado. Obtido por LC-MS/MS (m/z 300-900) utilizando coluna C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), fase móvel: Solvente A (água com 10mM amônia pH 4,3) e solvente B (acetonitrila). Gradiente: 0 min, 0%B; 0,25 min, 0%B; 9 min 25% B; 11 min, 25%B; Stop time, 11 min; Post time, 5 min. Volume de injeção: 1 µL. Fluxo: 0,4 mL/min............................………… 59

Figura 26 – Reação de degração do topotecano quando submetido ao aquecimento de 100-120°C em lipídeo fundido. O topotecano (1) sofre reação de desalquilação levando a formação de um dímero (2). Depois por reação de desaminação é formada a 10-hidroxicamptotecina (3), que perde um grupo hidroxila originando a camptotecina (4)............................... 60

Figura 27 – Recuperação do topotecano das formulações NLS3 e NLS4. NLS3 – produzida por diluição de microemulsão na faixa de temperatura 100-125°C. NLS4 – produzida por diluição de microemulsão na faixa de temperatura 50-70°C..................................................................................... 61

Figura 28 – Representação esquemática do equipamento para produção de NLS em larga escala a partir de microemulsões. Fonte: Marengo et al., 2000............................................................................................................... 61

Figura 29 – Recuperação de fármaco das formulações CLN5 e CLN6. CLN5 – 8% de carga de TPT. CLN6 – 10% de carga de TPT....................... 63

Figura 30 – Estabilidade do TPT em solução aquosa pH 4,5 a temperatura de 25 e 37°C.............................................................................. 65

Figura 31 – Estabilidade do TPT à temperatura de 25°C em solução aquosa pH 7,4 e nas formulações CLN3 e NLS5 com pH ajustado para 7,4.................................................................................................................. 66

Figura 32 – Estabilidade do TPT à temperatura de 37°C em solução aquosa pH 7,4 e nas formulações CLN3 e NLS5 com pH ajustado para 7,4.................................................................................................................. 67

Figura 33 – Perfil de difusão do TPT a partir da solução aquosa pH 4,5 e perfis de liberação in vitro a partir das formulações CLN3 e NLS5.............. 69

Figura 34 – Porcentagem de viabilidade celular de células K562, segundo o método azul de tripano, após incubação com o fármaco livre e com as formulações CLN3 e NLS5 por um período de 2 e 24 horas......................... 72

Figura 35 – Diâmetro médio e PdI dos CLN e das NLS liofilizadas durante 30 dias............................................................................................................ 75

Figura 36 – Recuperação de fármaco e eficiência de encapsulação dos CLN e das NLS liofilizadas durante 30 dias................................................... 75

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN Acetonitrila

CF% Carga de Fármaco

CLN Carreador Lipídico Nanoestruturado

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-UV Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acopla a Detector UV

DMM Diluição de Microemulsão

DPa Desvio Padrão do intercepto com o eixo x de três curvas de calibração

DPR Desvio Padrão Relativo

EE% Eficiência de Encapsulação

HAPF Homogeneização sob Alta Pressão a Frio

HAPQ Homogeneização sob Alta Pressão a Quente

IC Inclinação da Curva

LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplacada a detector de massas

LD Limite de Detecção

LQ Limite de Quantificação

MeAc Metanol Acidificado com 8,5% de ácido fosfórico

NLS Nanopartículas Lipídicas Sólidas

PdI Índice de Polidispersividade

PEMM Preparo de Emulsão Múltipla

P-gp Glicoproteína-P

Rec% Recuperação de Fármaco

TFS Tampão Fosfato de Sódio 0,2M pH 7,4

TPA Tampão Acetato pH 5,5 com 2,5% de trietilamina

TPT Cloridrato de Topotecano

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 16

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 17

2.1 A NANOTECNOLOGIA NA TERAPIA DO CÂNCER........................................ 17

2.2 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS

NANOESTRUTURADOS........................................................................................ 22

2.3 TOPOTECANO: HISTÓRICO, FARMACOLOGIA E INSTABILIDADE IN

VIVO........................................................................................................................ 24

2.4 INCORPORAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS EM MATRIZES

LIPÍDICAS............................................................................................................... 27

3 OBJETIVOS......................................................................................................... 32

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................. 32

4 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 33

4.1 MATERIAIS....................................................................................................... 33

4.1.1 Substâncias e reagentes............................................................................. 33

4.1.2 Equipamentos e utensílios diversos.......................................................... 33

4.2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA........ 35

4.2.1 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do

cloridrato de topotecano por espectrofotometria.............................................. 35

4.2.2 Quantificação do cloridrato de topotecano por cromatografia líquida

de alta eficiência................................................................................................... 35

4.2.3 Validação da metodologia analítica........................................................... 35

4.2.3.1 Seletividade................................................................................................ 35

4.2.3.2 Linearidade................................................................................................. 36

4.2.3.3 Limite de quantificação e detecção............................................................. 36

4.2.3.4 Precisão e Exatidão.................................................................................... 36

4.2.3.5 Robustez..................................................................................................... 37

4.2.4 Cromatografia líquida acoplada a detector massa/massa (LC-MS/MS).. 37

4.3 PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO

CLORIDRATO DE TOPOTECANO........................................................................ 37

4.3.1 Homogeneização sob alta pressão a frio.................................................. 39

4.3.2 Preparo de emulsão múltipla...................................................................... 40

4.3.3 Diluição de microemulsão........................................................................... 41

4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS............................ 42

4.4.1 Avaliação da distribuição de tamanho de partícula por espalhamento

dinâmico de luz..................................................................................................... 42

4.4.2 Avaliação do potencial zeta........................................................................ 42

4.4.3 Análise da eficiência de encapsulação do cloridrato de topotecano

nas NLS e CLN...................................................................................................... 43

4.4.3.1 Validação do sistema de ultrafiltração........................................................ 44

4.4.4 Carga de Fármaco........................................................................................ 44

4.4.5 Recuperação de Fármaco........................................................................... 44

4.5 ESTUDO DE SOLUBILIDADE.......................................................................... 44

4.6 ESTUDO DE ESTABILIDADE.......................................................................... 45

4.7 PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO................................................................. 45

4.8 ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE .................................................................. 46

4.8.1 Cultura celular.............................................................................................. 46

4.8.2 Avaliação da citotoxicidade do topotecano livre e nanoencapsulado

pelo teste de exclusão do azul de tripano.......................................................... 47

4.9 LIOFILIZAÇÃO.................................................................................................. 47

4.9.1 Estabilidade após liofilização..................................................................... 47

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................. 48

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................... 49

5.1 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA........ 49

5.1.1 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do

cloridrato e topotecano........................................................................................ 49

5.1.2 Quantificação do topotecano por cromatografia líquida de alta

eficiência................................................................................................................ 49

5.1.3 Validação da metodologia analítica........................................................... 50

5.1.3.1 Seletividade................................................................................................ 50

5.1.3.2 Linearidade................................................................................................. 51

5.1.3.3 Limites de detecção e quantificação........................................................... 52

5.1.3.4 Precisão e exatidão.................................................................................... 53

5.1.3.5 Robustez..................................................................................................... 53

5.2 VALIDAÇÃO DO SISTEMA DE ULTRAFILTRAÇÃO....................................... 54

5.3 PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO

CLORIDRATO DE TOPOTECANO........................................................................ 54

5.3.1 Avaliação do potencial zeta........................................................................ 63

5.4 ESTUDO DE SOLUBILIDADE.......................................................................... 65

5.5 ESTUDO DE ESTABILIDADE.......................................................................... 65

5.6 PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO................................................................. 65

5.6.1 Verificação da condição sink...................................................................... 67

5.6.2 Liberação in vitro......................................................................................... 68

5.7 ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE................................................................... 71

5.8 LIOFILIZAÇÃO.................................................................................................. 73

5.8.1 Estabilidade após liofilização..................................................................... 74

6 CONCLUSÕES.................................................................................................... 76

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 77

16

1 INTRODUÇÃO

Apesar do constante desenvolvimento de novos agentes citotóxicos e regimes

terapêuticos, o grau de sucesso clínico da terapia antineoplásica permanece

insatisfatório (WONG et al., 2007). O fenômeno da resistência aos agentes

citotóxicos, sua ampla biodistribuição e toxicidade elevada nos tecidos normais,

representam algumas das principais limitações do uso desses agentes terapêuticos

(BRIGGER et al., 2002).

A incorporação dos agentes citotóxicos em carreadores nanoestruturados é

uma estratégia promissora para aumentar a eficácia e segurança do tratamento

medicamentoso (WONG et al., 2007). O uso de nanocarreadores dificulta o

reconhecimento do fármaco pela glicoproteína P (P-gp), intimamente ligada ao

aparecimento do fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (BRIGGER et al.,

2002). Além disso, os nanocarreadores podem ser passivamente direcionados para

a massa tumoral sólida com redução dos efeitos tóxicos do fármaco sobre os tecidos

normais (BRIGGER et al., 2002; WONG et al., 2007).

O uso dos nanocarreadores no tratamento do câncer pode ainda resultar na

diminuição da biotransformação do fármaco (BRIGGER et al., 2002), no aumento de

sua estabilidade química e no controle de sua biodisponibilidade (FENG E CHIEN,

2003; MULLER et al., 2000).

Nanoemulsões, lipossomas, micelas e nanopartículas poliméricas são

exemplos de nanocarreadores avaliados para a veiculação de fármacos citotóxicos,

entretanto, alguns desses sistemas possuem certas limitações quanto a sua

aplicação industrial (MULLER et al., 2000). As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)

são sistemas obtidos por técnicas simples e escalonáveis compostos por lipídeos

biocompatíveis que são sólidos sob temperatura ambiente e corporal. Esses

sistemas apresentam, em geral, menor custo de produção quando comparados aos

lipossomas, assim como melhor retenção do fármaco e estabilidade física frente às

nanoemulsões e lipossomas (MEHNERT e MADER, 2001; MULLER et al., 2000).

Em relação às nanopartículas poliméricas, as NLS apresentam menor toxicidade e

maior viabilidade de produção industrial (MEHNERT e MADER, 2001; MULLER et

al., 2000).

O cloridrato de topotecano (TPT), derivado hidrofílico semi-sintético da

camptotecina, é um potente agente citotóxico, cujo regime terapêutico para a via

17

parenteral e oral já foi estabelecido (GERRITS et al., 1998; HAO et al., 2005). A

incorporação do TPT em nanocarreadores pode melhorar seu desempenho clínico,

devido à diminuição dos mecanismos de resistência descritos para esse fármaco,

assim como pelo controle de sua variabilidade farmacocinética e, principalmente,

pela redução de sua instabilidade química in vivo (GARCIA-CARBONERO e

SUPKO, 2002).

O cloridrato de topotecano é administrado na dose de 4 mg/dia, que é

bastante reduzida quando comparada com a dose requerida para a maioria dos

agentes citotóxicos (GERRITS et al., 1998). A elevada potência do TPT é uma

característica importante para sua incorporação em nanopartículas lipídicas, pois as

mesmas apresentam, em geral, reduzida capacidade de incorporação de fármacos

(WESTESEN et al., 1997). A inclusão de fármacos hidrofílicos, como o topotecano,

em NLS é especialmente desafiadora, visto que seu particionamento na fase lipídica

fundida é um pré-requisito para a obtenção de sistemas com elevada carga e

eficiência de encapsulação (MÜLLER et al., 2000).

É válido ressaltar ainda que o anel lactônico do topotecano, cuja integridade é

fundamental para a atividade da molécula, apresenta importante instabilidade

química devido a uma rápida e intensa hidrólise pH-dependente. Em pH ácido a

forma lactônica predomina, mas uma rápida conversão acontece (para a forma

carboxilato) em pH neutro ou alcalino, como encontrado no plasma (FASSBERG e

STELLA, 1992). A conversão para a forma carboxilato deve ser controlada, uma vez

que ela é cerca de 10 vezes menos ativa, pouco absorvível e rapidamente eliminada

do organismo. A incorporação do TPT em sistemas lipídicos consiste em uma

estratégia para aumentar a estabilidade in vivo desse fármaco, visto que a imersão

do mesmo na matriz lipídica impede o acesso de moléculas de água e

conseqüentemente, impede a hidrólise do anel lactônico (GARCIA-CARBONERO e

SUPKO, 2002).

Existem inúmeras vantagens econômicas e tecnológicas associadas ao

desenvolvimento de NLS e a escolha apropriada da técnica de preparo desses

sistemas pode resultar em sistemas que apresentem elevada capacidade de

incorporação de fármacos hidrofílicos, como o TPT (MEHNERT e MÄDER, 2001). As

técnicas de diluição de microemulsão, emulsão múltipla e homogeneização sob alta

pressão foram empregadas neste trabalho visando obter formulações estáveis, com

elevada eficiência de encapsulação e controle adequado de liberação, que em última

18

instância apresentem elevado potencial para gerar benefícios clínicos na utilização

desse importante agente citotóxico.

19

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A NANOTECNOLOGIA NA TERAPIA DO CÂNCER

O câncer hoje se configura como um problema de saúde pública, ocupando o

segundo lugar das causas de morte, perdendo apenas para as doenças

cardiovasculares. No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 apontam para

ocorrência de aproximadamente quinhentos mil novos casos da doença. Os tipos

mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os

cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e do colo do útero no sexo

feminino (INCA, 2009).

O câncer resulta de um crescimento desordenado e disseminado de células

neoplásicas. Embora os mecanismos de formação e disseminação do câncer não

estejam ainda completamente elucidados, fatores externos (tabaco, produtos

químicos, radiação e infecções) e internos (distúrbios metabólicos hereditários,

hormônios e condições imunes) são relevantes. Esses fatores podem atuar juntos ou

seqüencialmente para iniciar e promover a carcinogênese (FENG e CHIEN, 2003).

A quimioterapia para o câncer é entendida como o uso específico de agentes

quimioterápicos para matar células cancerosas (FENG e CHIEN, 2003). Porém, a

baixa especificidade apresentada por esses fármacos em termos de distribuição e

farmacodinâmica constitui uma limitação à terapia. Os pacientes que recebem o

tratamento apresentam inúmeros efeitos adversos decorrentes da ação desses

agentes em tecidos saudáveis. Diante disso, o principal objetivo da quimioterapia do

câncer consiste em matar quantas células tumorais for possível preservando as

células saudáveis, o que constitui um grande desafio no tratamento dessa

enfermidade (WONG et al., 2007).

Outro entrave para o sucesso da terapia antineoplásica é a resistência

apresentada pelas células tumorais a um grande número de fármacos citotóxicos.

Dentre os principais mecanismos de resistência, ressalta-se aquele mediado pela

glicoproteína-P (P-gp), uma importante proteína de membrana que bombeia o

fármaco para fora da célula por um mecanismo ATP dependente, conforme ilustrado

na Figura 1. Duas propriedades marcantes dessa proteína merecem ser destacadas:

apresenta elevada inespecificidade, incluindo muitos antineoplásicos, e está

presente em muitas barreiras farmacológicas essenciais, como na membrana do

20

epitélio apical do intestino, nos túbulos proximais dos rins, no canalículo biliar das

membranas dos hepatócitos, na membrana das células endoteliais do lúmem da

barreira hematoencefálica e na membrana apical dos trofoblastos da placenta.

Muitas células tumorais apresentam super-expressão de P-gp (BRIGGER et al.,

2002; SCHELLENS et al., 2000).

Figura 1 – Esquema representativo do mecanismo de ação da glicoproteína-P. O fármaco que entra na célula é bombeado para o meio extracelular por um mecanismo ATP-dependente. Fonte: adaptado de Krishna e Mayer, 2000.

O uso de nanocarreadores consiste em estratégia para eliminar os efeitos da

P-gp e obter uma terapia alvo específica no tratamento do câncer. O antineoplásico

localizado dentro de uma nanopartícula pode entrar na célula sem ser reconhecido

pela P-gp, aumentando assim sua ação citotóxica (BRIGGER et al., 2002).

Através do mecanismo de permeabilidade e retenção aumentada (EPR,

“enhanced permeability and retention”), pode-se obter o direcionamento passivo das

nanopartículas para o tecido tumoral. Durante o crescimento tumoral, o processo de

neovascularização é caracterizado pela formação de um endotélio descontínuo com

fenestrações largas (na faixa entre 20 a 780 nm), permitindo a passagem das

nanopartículas. Além disso, o sistema linfático apresenta-se bastante comprometido

em tumores, ocasionando a retenção das nanopartículas no interstício do tumor.

Como resultado, as nanopartículas tendem a entrar e permanecer no tecido tumoral

21

mais que em outros tecidos (MATSUMURA e MAEDA, 1986 apud WONG et al.,

2007). A Figura 2 ilustra o mecanismo de permeabilidade aumentada em tumores.

Figura 2 – Esquema representativo da permeabilidade aumentada em tumores. O tecido saudável é caracterizado por um endotélio contínuo onde somente o fármaco livre consegue permear. No tecido tumoral o endotélio vascular fenestrado permite o extravasamento das nanopartículas. Fonte: adaptado de Gaumet et al., 2008.

Ao explorar o mecanismo EPR, as nanopartículas promovem o

direcionamento passivo do fármaco para a massa tumoral. Também é possível

promover o direcionamento ativo de fármacos para as massas tumorais pela

modificação das características de superfície dos nanocarreadores, como por

exemplo, pela inserção de anticorpos que reconhecem proteínas que são

intensamente expressas nas membranas de células tumorais (BRIGGER et al.,

2002). Para conseguir realizar de forma eficiente o direcionamento ativo ou passivo

dos fármacos incorporados, os nanocarreadores devem apresentar revestimentos

apropriados em sua superfície, de forma a não serem reconhecidos pelo sistema

reticuloendotelial. Além disso, é importante garantir liberação prolongada do fármaco

para que o mesmo só seja liberado dentro do tecido ou das células tumorais (FENG

e CHIEN, 2003).

22

2.2 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS

NANOESTRUTURADOS

As nanopartículas lipídicas sólidas foram desenvolvidas no início da década

de noventa por diferentes grupos de pesquisa que buscavam obter sistemas

compostos por lipídeos sólidos sob temperatura ambiente e corporal. Esses

sistemas se assemelham as nanoemulsões empregadas na nutrição parenteral, no

entanto, o lipídeo líquido é substituído por um lipídeo sólido, como ilustrado na

Figura 3 (MÜLLER et al, 2000).

Figura 3 – Esquema representativo de nanoemulsão (A) e nanopartícula lipídica sólida (B). Fonte: Müller et al, 2000

É importante ressaltar que esses sistemas combinam as vantagens de

lipossomas, nanocápsulas poliméricas e nanoesferas, ao mesmo tempo em que

minimizam os problemas associados a esses nanocarreadores (instabilidade física,

toxicidade dos componentes, dificuldade de escaloneamento) (WISSING et al.,

2004). A veiculação de fármacos citotóxicos em NLS vem sendo realizada e

inúmeros trabalhos já foram publicados (CAVALLI et al., 2000; CHEN et al., 2001;

HU et al., 2004; PELTIER et al., 2006; WILLIAMS et al., 2003; YANG et al., 1999;

ZHANG et. al., 2008).

Dentre as várias vantagens que as NLS oferecem, ressalta-se a possibilidade

de obter liberação prolongada e sítio-específica de fármacos, o aumento da

estabilidade desses fármacos, a reduzida toxicidade dos seus componentes, além

da facilidade de produção em larga escala e de esterilização (MEHNERT e MÄDER,

2001). Contudo, esse sistema apresenta baixa capacidade de carga e elevada

expulsão do fármaco durante o armazenamento, devido a transições polimórficas

dos lipídeos (WISSING et al., 2004).

Os componentes usuais das NLS são lipídeos sólidos, tensoativos e água. Os

lipídeos mais utilizados são os triglicerídeos (triestearina), ácidos graxos (ácido

23

esteárico), esteróides (colesterol) e ceras (cetilpalmitato). Todas as classes de

tensoativos têm sido utilizadas para estabilizar a dispersão lipídica, sendo que a

combinação de tensoativos é mais eficiente em prevenir a agregação das partículas

(MEHNERT e MÄDER, 2001).

As NLS podem ser produzidas por diferentes técnicas, entre elas a

homogeneização sob alta pressão a quente ou a frio, diluição de microemulsão,

preparo de emulsão múltipla, emulsificação/evaporação de solvente ou difusão de

solvente (LIPPACHER et al., 2001; MEHNERT e MÄDER, 2001). Algumas dessas

técnicas serão abordadas com mais detalhes adiante.

Objetivando-se aumentar eficiência de encapsulação das NLS, assim como

diminuir ou evitar a expulsão do fármaco durante o período de armazenamento, foi

desenvolvido um sistema derivado das NLS, denominado carreador lipídico

nanoestruturado (CLN). Os CLN são produzidos da mesma forma que as NLS e

possuem as mesmas vantagens. Entretanto, possuem porcentagens variáveis de

lipídeos líquidos em sua composição. Isso leva a mais imperfeições na matriz

lipídica, o que aumenta os espaços para acomodar o fármaco acarretando em maior

eficiência de encapsulação (SOUTO et al., 2004; WISSING et al., 2004). Segundo

Müller e colaboradores (2002), os CLN são sólidos, mas amorfos, o que poderia

evitar ou diminuir a expulsão do fármaco durante o período de armazenagem, visto

que isso acontece devido a modificações nas formas polimórficas dos cristais

lipídicos das NLS. A Figura 4 apresenta a diferenciação entre NLS e CLN durante o

período de armazenamento.

Figura 4 – Esquema representativo dos carreadores lipídicos nanoestruturados e nanopartículas lipídicas sólidas. Os cristais lipídicos das nanopartículas lipídicas sólidas adquirem arranjo mais perfeito durante o período de armazenamento acarretando na expulsão do fármaco, o que não ocorre com os CLN. Fonte: Müller et al., 2002.

24

2.3 TOPOTECANO: HISTÓRICO, FARMACOLOGIA E INSTABILIDADE IN VIVO

O cloridrato de topotecano (TPT) é um análogo semi-sintético da

camptotecina desenvolvido para contornar o problema da reduzida solubilidade

aquosa do composto protótipo (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002). O

protótipo, camptotecina (Figura 5), é um alcalóide quinoleínico, cuja estrutura

química consiste em um anel pentacíclico que inclui um pirrol, um anel quinolona e

um centro assimétrico com um anel α-lactona em configuração S (SRIVASTAVA, et

al., 2005). Esse alcalóide de ocorrência natural é encontrado na madeira, casca e

frutos da Camptotheca acuminata (PIZZOLATO e SALTZ, 2003), arbusto que cresce

nas províncias do sudeste asiático (HATEFI e AMSDEN, 2002). A camptotecina foi

isolada durante o período de 1950-1959 através de triagem realizada por Wall e

Wani em mais de mil extratos etanólicos de plantas (WALL e WANI, 1996). Na

medicina tradicional chinesa, a Camptotheca acuminata é utilizada na forma de

infusão no tratamento de várias doenças, incluindo tumores (POTMESIL, 1994).

Figura 5 – Estrutura química da camptotecina

Em 1966, o Instituto Nacional do Câncer dos EUA identificou a camptotecina

como antineoplásico, sendo que até o ano de 2004 já haviam sido publicados mais

de 3000 trabalhos sobre o fármaco (SRIVASTAVA et al., 2005). Como a

camptotecina era pouco solúvel, começou a se utilizar o seu sal sódico contendo a

forma carboxilato (menos potente) do fármaco. No entanto, eram necessárias doses

muito altas que causavam efeitos tóxicos nos pacientes, como granulocitopenia e

trombocitopenia (GERRITS et al., 1998). Estudos em fase II apresentaram efeitos

adversos graves (mielosupressão, vômitos, diarréia e cistite hemorrágica) e não

puderam ser continuados. Para contornar esse problema foram sintetizados

análogos hidrossolúveis da camptotecina. O TPT, 9-dimetilamino-10-

25

hidroxicamptotecina, foi o primeiro análogo a ser aprovado para uso clínico pela

Food and Drug Administration (FDA). Sua maior solubilidade em água deve-se ao

grupo dimetilamino no carbono nove do anel A (Figura 6) (PIZZOLATO e SALTZ,

2003; SRIVASTAVA, et al., 2005).

Figura 6 – Obtenção do topotecano a partir da camptotecina. A síntese do topotecano foi realizada adicionando-se um grupo dimetilamino e uma hidroxila no anel A da camptotecina.

A ação antineoplásica do TPT, assim como de todas as camptotecinas, deve-

se a sua ligação à enzima topoisomerase I. Essa enzima está ligada ao processo de

replicação do DNA, sendo responsável pelo desenovelamento da dupla fita no

momento da replicação, permitindo assim a atuação de outras enzimas envolvidas

no processo. Durante o desenovelamento a topoisomerase cliva uma das fitas de

DNA, formando um complexo de clivagem, para depois ligá-la novamente. Isso

permite que uma fita gire sobre a outra, desenovelando-se. O TPT liga-se

covalentemente a essa enzima impedindo a religação da fita através da

estabilização do complexo de clivagem, descontinuando o processo de replicação.

Esses eventos levam a ativação de caspases e morte celular (GERRITS et al., 1998;

GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002; POTMESIL, 1994).

Como a replicação do DNA ocorre na fase de síntese (S) do ciclo celular, as

camptotecinas são fase S específicas. Células na fase S são cem a mil vezes mais

sensíveis à camptotecina que células na fase G1 ou G2. Isso leva a implicações

importantes para o uso clínico desses fármacos, pois a eficácia terapêutica ótima de

agentes citotóxicos fase S específicos geralmente é alcançada com aumento da

freqüência de exposição das células tumorais ao agente citotóxico (PIZZOLATO e

SALTZ, 2003). A meia-vida biológica do TPT varia de 2,4 a 4,3 horas, muito mais

26

curta que o sal sódico da camptotecina e outros análogos. Conseqüentemente, a

dose de acumulação do fármaco não ocorre quando doses diárias são administradas

em infusões de trinta minutos por 5 dias (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002).

O TPT se liga às proteínas plasmáticas em uma fração de 7 a 35%, sua

eliminação é predominantemente resultante da conversão à forma carboxilato

seguida pela excreção renal (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002). Após vinte e

quatro horas do início do tratamento 40% do fármaco são excretados na urina

(POTMESIL, 1994).

Como acontece com outros antineoplásicos, muitas células apresentam

resistência ao TPT ligada ao fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (MDR)

associada à glicoproteína-P (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002; LI et al.,

2006).

O TPT sofre hidrólise pH-dependente, em meio neutro a alcalino, traduzida

pela conversão reversível da sua forma ativa (lactona) em sua forma inativa

(carboxilato) pela abertura do seu anel lactônico (anel E) (Figura 7) (BURKE et al.,

1993). A conversão do fármaco em sua forma carboxilato diminui sua ligação às

membranas, assim como sua difusão pela bicamada lipídica e sua afinidade pela

topoisomerase I (HATEFI e AMSDEN, 2002). O equilíbrio na conversão plasmática

entre a forma lactônica e a forma carboxilato é atingido entre 5 a 10 minutos após o

término de uma infusão intravenosa de trinta minutos, e a fração lactônica no

equilíbrio é de apenas 30 a 40% da dose administrada. Comportamento similar é

observado após a administração oral do TPT (GARCIA-CARBONERO e SUPKO,

2002).

Figura 7 – Conversão da forma ativa (lactona) do topotecano em sua forma inativa (carboxilato).

27

A encapsulação em lipossomas tem sido uma estratégia investigada para

estabilizar o cloridrato de topotecano in vivo. O uso de técnicas que exploram a

complexação com metais de transição e o gradiente de pH transmembrana têm

aumentado a eficiência de encapsulação desse fármaco em lipossomas (ABRAHAM

et al., 2004; HAO et al., 2005; LALOO et al., 2006; ZHANG et al., 2008; TAGGAR et

al., 2006; DRUMOND et al., 2010; GRAHN et al., 2009; TARDI et al., 2000). Até o

presente momento, não existem relatos da incorporação desse fármaco em sistemas

lipídicos sólidos.

O TPT é atualmente comercializado pela empresa Glaxo-SmithKline com o

nome comercial de Hycamtin® em apresentações farmacêuticas injetáveis de 4 mg e

cápsulas para administração oral de 0,25 e 1 mg (Hycamtin®, GSK). Esse

medicamento é indicado como terapia de segunda linha no tratamento do câncer de

ovário e de células pequenas do pulmão. Contudo, o fármaco tem demonstrado

atividade interessante contra tumores hematológicos, como leucemia

mielomonocítica crônica e síndromes mielodisplásicas e tumores pediátricos, como

rabdomiosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, osteosarcoma e sarcoma de

tecidos moles (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002).

2.4 INCORPORAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS EM MATRIZES LIPÍDICAS

A obtenção de formulações de NLS com elevada eficiência de encapsulação

é especialmente difícil quando o fármaco possui natureza hidrofílica, pois depende

da solubilidade ou miscibilidade adequadas do fármaco no lipídeo fundido (LIU et al.,

2007). Dessa forma, as NLS carregadas com fármacos hidrofílicos apresentam, em

geral, eficiência de encapsulação reduzida (WONG et al., 2007), pois estes fármacos

tendem a se particionar para a fase externa aquosa do sistema em formação (XIE et

al., 2008).

No entanto, é possível melhorar a eficiência de encapsulação de fármacos

hidrofílicos em nanosistemas lipídicos pelo emprego de estratégias que aumentam a

lipofilicidade do fármaco ou impedem sua partição para a fase aquosa do sistema

(MÜLLER et al., 2002; GARCÍA-FUENTES et al., 2002; CAVALLI et al. 1995; WONG

et al., 2004).

A utilização de contra-íons orgânicos para formar pares iônicos com fármacos

hidrofílicos foi uma estratégia utilizada pelo grupo de Gasco e colaboradores para

28

aumentar a lipofilicidade desses fármacos (MOREL et al., 1996; CAVALLI et al.,

1995; CAVALLI et al., 2002). A lipofilicidade da tobramicina, um fármaco hidrofílico,

foi aumentada pela complexação com o contra-íon hexadecil fosfato de sódio, o que

permitiu sua encapsulação em NLS com uma carga de fármaco de 2,5% (CAVALLI

et al., 2002).

A formação de pares iônicos de fármacos com polímeros, como o sulfato de

dextrana, é outra estratégia utilizada pelo grupo de Wu e colaboradores, originando

uma nova partícula chamada de “nanopartícula híbrido polímero-lipídeo” (PLN)

(WONG et al., 2004; WONG et al., 2007; LI et al., 2008; LI et al., 2006). Nesse tipo

de sistema a carga do fármaco iônico é neutralizada por cargas do polímero e o

complexo fármaco-polímero é então incorporado ao lipídeo para a produção das

nanopartículas, como pode ser observado na Figura 8 (WONG et al., 2007). Com

este método, a eficiência de encapsulação de fármacos hidrofílicos como o

verapamil e doxorubicina em NLS aumentou de 20 a 35% para mais de 80%

(WONG et al., 2004).

Figura 8 – Esquema ilustrando a encapsulação de um fármaco catiônico hidrofílico em uma nanopartícula híbrido polímero-lipídio (PLN). D+ representa o fármaco catiônico e a linha curva representa o polímero aniônico. O complexo é formado pela neutralização das cargas das moléculas, que é encapsulado na nanopartícula lipídica. Fonte: Wong et al., 2007.

Por fim, a conjugação de fármacos hidrofílicos com lipídeos também tem sido

empregada com o intuito de aumentar a lipofilicidade desses fármacos. A

conjugação pode ser realizada por ligações covalentes ou simplesmente pela

formação de um sal com um ácido graxo, no caso de fármacos que possuem

grupamentos adequados. Nessa técnica, as nanopartículas podem ser produzidas

somente com o conjugado fármaco-lipídeo ou pode-se adicionar o conjugado a um

lipídeo (WISSING et al., 2004; MUCHOW et al., 2008).

29

É importante ressaltar que a eficiência de encapsulação de fármacos

hidrofílicos em nanosistemas lipídicos também pode ser melhorada pelo

aperfeiçoamento das técnicas de preparo e composição da formulação.

Homogeneização sob alta pressão a frio (HAPF), preparo de emulsão múltipla

(PEMM) e diluição de microemulsão (DMM) são exemplos de técnicas de preparo

que podem ser trabalhadas para melhorar a encapsulação de fármacos hidrofílicos.

A homogeneização sob alta pressão em suas modalidades “a frio” (HAPF) ou

“a quente” (HAPQ) é um dos processos mais interessantes para a obtenção de

nanopartículas, pois já é empregada há algum tempo na indústria para o preparo de

emulsões para nutrição parenteral. Na HAPQ, o lipídeo encontra-se fundido em

todas as etapas de produção, o que permite maior migração do fármaco para a fase

aquosa. Por outro lado, na HAPF, o fármaco é incorporado no lipídeo fundido, mas a

mistura é rapidamente solidificada em nitrogênio líquido, triturada para obtenção de

micropartículas lipídicas e somente então é misturada a uma solução aquosa de

tensoativos, sob cisalhamento. A pré-suspensão obtida é, em seguida, submetida à

homogeneização sob alta pressão, onde ocorre a formação das NLS. A temperatura

das etapas de cisalhamento e homogeneização deve ser controlada para evitar a

fusão do lipídeo e, por conseguinte, a perda do fármaco para a fase aquosa

(MEHNERT e MÄDER, 2001; WISSING et al., 2004; MÜLLER et al., 2000). A Figura

9 apresenta um fluxograma resumindo as duas técnicas de homogeneização sob

alta pressão.

30

Figura 9 – Fluxograma do processo de obtenção de NLS por homogeneização sob alta pressão a quente e a frio. Fonte: adaptado de Mehnert e Mäder, 2001.

Na técnica de preparo de emulsão múltipla (PEMM), o fármaco hidrofílico é

encapsulado na fase interna de uma emulsão múltipla A/O/A. Ao contrário das

outras técnicas, aqui o lipídeo não é fundido, mas solubilizado em um solvente

orgânico. As NLS se formam quando o solvente orgânico é eliminado por difusão ou

evaporação e o lipídeo precipita no meio aquoso (WISSING et al., 2004; LIU et al.,

2007). A Figura 10 apresenta uma representação esquemática da incorporação de

um fármaco hidrofílico em NLS por meio dessa técnica.

31

Figura 10 – Esquema representativo da encapsulação de fármacos hidrofílicos em NLS pela técnica de emulsão múltipla. As cabeças polares do lipídeo formam uma camada externa ao redor de toda partícula. O fármaco (F) fica inserido no meio aquoso formado pelas micelas reversas e as caudas hidrofóbicas dos tensoativos (Tens.) ficam ancoradas nas longas cadeias alquilas do lipídeo. Fonte: adaptado de Liu et al, 2007.

A técnica de diluição de microemulsão (DMM) foi desenvolvida pelo grupo de

Gasco e colaboradores (GASCO, 1993). Nessa técnica uma microemulsão é

preparada a quente por agitação, sendo depois diluída mediante agitação em um

excesso de água gelada (WISSING et al., 2004). A microemulsão deve ser

composta por lipídeos com baixo ponto de fusão, de forma que, quando a mesma

entra em contato com a água gelada os lipídeos sofrem cristalização, formando as

NLS (MARENGO et al., 2000). Quando a velocidade e forma de resfriamento da

microemulsão são controladas, a precipitação do fármaco pode ocorrer antes da

recristalização do lipídeo. Isso significa que o fármaco estará concentrado mais na

região interna das NLS e, conseqüentemente, a perda do fármaco para a fase

aquosa será menor (MÜLLER et al., 2000).

Muitas variáveis dessa técnica podem afetar as características das NLS

obtidas. Os lipídeos utilizados para a obtenção da microemulsão, a técnica de

preparo (agitação, temperatura), a velocidade de adição da microemulsão na água

gelada, assim como o volume de água são exemplos destas variáveis (WISSING et

al., 2004).

A encapsulação do TPT em NLS constitui-se, portanto, em um desafio

tecnológico relevante. A escolha da técnica de preparo e dos componentes da

formulação é bastante relevante para a obtenção de nanosistemas com elevada

eficiência de encapsulação e que apresentem liberação controlada do fármaco

incorporado.

32

3 OBJETIVOS

O objetivo do presente trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a

estabilidade e citotoxicidade de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores

lipídicos nanoestruturados contendo cloridrato de topotecano.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver e validar metodologia analítica para quantificação do

topotecano nas nanopartículas.

Produzir nanopartículas lipídicas contendo topotecano pelos métodos de

homogeneização sob alta pressão a frio, diluição de microemulsão e preparo de

emulsão múltipla.

Caracterizar os nanosistemas obtidos quanto ao diâmetro médio,

polidispersividade, eficiência de encapsulação, carga de fármaco e recuperação de

fármaco.

Determinar a solubilidade do topotecano em tampão acetato pH 4,5.

Avaliar a estabilidade do topotecano nas nanopartículas lipídicas e em

soluções aquosas pH 4,5 e 7,4.

Selecionar duas formulações promissoras e comparar seus perfis de

liberação in vitro, citotoxicidade em células K562 e estabilidade após liofilização.

76

6 CONCLUSÕES

- A metodologia analítica para quantificação do topotecano nas nanopartículas

lipídicas foi desenvolvida e validada;

- A técnica de diluição de microemulsão mostrou-se bastante adequada para a

produção de nanopartículas lipídicas contendo topotecano. As nanoparticulas

obtidas por esta técnica apresentaram elevada eficiência de encapsulacão e carga

de fármaco. O tamanho das partículas e os valores de PdI foram considerados

satisfatórios;

- As temperaturas de 25 e 37°C demonstraram ser um fator limitante na produção de

nanopartículas lipídicas contendo TPT e, portanto, deve ser rigorosamente

controlada;

- O topotecano é estável em solução aquosa pH 4,5 a temperatura ambiente e

quando submetido ao aquecimento de 37°C. Em solução aquosa pH 7,4 o

topotecano se mostrou instável, principalmente quando submetido ao aquecimento;

- A nanoencapsulação do topotecano reduziu sua instabilidade em pH 7,4 a 37°C, o

que sugere melhora de sua estabilidade in vivo com ganho em sua eficácia clinica

- A adição de ácido oléico às formulações não resultou em alteracões significativas

em nenhum dos parâmetros estudados;

- A nanoencapsulação do TPT sustentou a liberação do fármaco por 12 horas e

aumentou sua citotoxicidade em células leucêmicas K562 no período de 2 e 24

horas;

- A liofilização das nanoparticulas contendo TPT permitiu sua reconstituição em

suspensões com baixo PdI e manteve as nanopartículas estáveis por pelo menos 30

dias;

77

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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