Desenvolvimento e otimização de marcadores microssatélites ... · eluiÇÃo dos fragmentos de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS – UNIMONTES

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - PPGCB

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Desenvolvimento e otimização de marcadores microssatélites (SSRs) em

Mauritia flexuosa (L. f.)

WILKER FRED SANTOS SOUTO

Montes Claros – Minas Gerais

Novembro – 2009

ii




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros como requisito necessário para a conclusão do curso de Mestrado em Ciências Biológicas.

Orientador: Dr. Marcio Antonio Silva Pimenta Coorientadora: Dra. Ana Yamaguishi Ciampi Coorientadora: Dra. Elytania Veiga Menezes

Montes Claros – Minas Gerais

Novembro – 2009

iii




.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros como requisito necessário para a conclusão do curso de Mestrado em Ciências Biológicas.

APROVADA:

___________________________________________ Prof. Dr. Marcio Antonio Silva Pimenta

Orientador/UNIMONTES

___________________________________________ Prof. Dr. Henrique Maia Valério

UNIMONTES

___________________________________________ Dra. Vânia Cristina Rennó Azevedo

EMBRAPA/DF

iv

A Deus,

Aos meu pais,

Aos meus amigos Nilo Santos, Ana Paula Silva e Flávia França,

DEDICO

A Martha, meu amor, paixão e vida,

OFEREÇO

v

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a DEUS por ser a fonte da vida, o pai criador, meu suporte, minha força, por

ter guiado meus passos e de meus companheiros dentro do programa de mestrado, e por estar

comigo em todos os momentos da minha vida. A ele tudo agradeço.

A minha noiva Martha por estar do meu lado, ser o PILAR que me sustenta, por dizer sempre

para NÃO DESISTIR nos momentos em que pensei que fosse cair. Ela que me apara sempre,

sempre e sempre! A ti tudo agradeço meu bem.

Aos meu pais, Raimundo Nonato Souto Cardoso e Maria Creusa Santos Cardoso, que sempre

me fizeram acreditar e mesmo que o sonho estivesse longe, me disseram pra continuar. A

vocês devo absolutamente tudo.

A minha avó Maria Júlia de Miranda Souto (in memorian), que apesar de não estar presente

fisicamente, sempre esteve em meus pensamentos, sonhos e de certa forma me mostrando o

verdadeiro caminho.

Ao meu orientador Marcio, por ser uma pessoa perseverante, amigo, por ter compreendido

cada momento que passei dentro da pesquisa, por ter me ajudado, aconselhado e até mesmo

nos “puxões de orelha”, sem ele este trabalho não seria possível.

À Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES), e especialmente ao programa de

pós-graduação strictu sensu em Ciências Biológicas, representados por todos os professores e

funcionários, pela oportunidade de realização deste curso.

vi

Ao CNPq pelo apoio financeiro que tornou possível a realização deste trabalho.

A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), em especial a Dra. Vânia

Cristina Rennó Azevedo, por ter cedido o espaço onde boa parte da pesquisa foi realizada, por

ser paciente e compreensiva.

À Dra. Ana Yamaguishi Ciampi pelo explêndido conhecimento divido e por ter se disposto a

ajudar e coorientar.

À Dra. Elytania Veiga Menezes por ter sido as minhas mãos nos momentos em que não pude,

por ter me ensinado, guiado e coorientado.

Aos meus eternos amigos, a quem nunca poderia esquecer, sem eles meus caminhos seriam

cheios de pedras. Vocês que me fizeram acreditar, me fizeram ver com olhos que acho que

sem a ajuda de vocês nunca os teria. A Nilo José Santos, Ana Paula Silva, Flávia França e

mesmo aqueles que não foram citados.

Ao pessoal do laboratório de métodos analíticos, ao Paulo, ao Márcio Guedes que me

ajudaram muito nos momentos de coleta do material, nas infinitas idas a campo, mas que de

certa forma foram proveitosas e hilárias, a Lígia, a Leide e todos que diretamente ou

indiretamente fizeram parte dessa pesquisa e com certeza possuem créditos neste trabalho.

A todos vocês, sem exceções, o meu muito OBRIGADO!!

vii

BURITI

Árvore da vida. Solene, solitária, solidária.

Nas entranhas da terra e em cúpula celeste:

ramificações estranhas, demarcando várzeas celebrando oásis matinais.

Óleo e copa, alimento e proteção de vida.

Das entranhas da terra ao firmamento, uma simetria de volumes

invertidos: no espaço aberto e no solo contido, ampulheta de vida.

Buritizais descendo geografias aquáticas no roteiro dos pássaros e tropeiros.

Escamas córneas lustrosas avermelhadas.

Não se sabe se é a palmeira que passa ou o tropeiro que fica.

Testemunhas silentes mas não indiferentes pois o buriti é dadivoso

umbrátil altaneiro.

Enquanto houver buritizais, enquanto houver mananciais enquanto houver chuvas lodaçais

enquanto e portanto o milagre da existência, entretanto, vida e pranto.

(Antônio Miranda)

Porque a palavra de Deus é viva, e eficaz, e mais cortante do que qualquer espada de dois gumes, e penetra até ao ponto de dividir alma e espírito, juntas e medulas, e é

apta para discernir os pensamentos e propósitos do coração.

(Hebreus 4:12)

viii

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................. x

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...................................................................... xiii

RESUMO................................................................................................................................ xiv

ABSTRACT ............................................................................................................................ xv

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 3

3. OBJETIVOS......................................................................................................................... 4

4. REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 5

4.1. ORIGEM E DIVERSIDADE GENÉTICA EM PLANTAS......................................................... 5

4.2. EFEITOS GENÉTICOS DO EXTRATIVISMO.......................................................................5

4.3. CONSERVAÇÃO DE ESPÉCIES ARBÓREAS TROPICAIS.................................................... 6

4.4. A ESPÉCIE MAURITIA FLEXUOSA................................................................................... 8

4.4.1. ASPECTOS TAXONÔMICOS E BOTÂNICOS............................................................. 8

4.4.2. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DO BURITI............................................................... 10

4.4.3. UTILIZAÇÃO DO BURITI....................................................................................... 12

4.5. A ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE PLANTAS............................................... 13

4.6. MARCADORES MOLECULARES PARA ANÁLISE GENÉTICA............................................. 15

4.6.1. MARCADORES MICROSSATÉLITES....................................................................... 18

4.6.2 APLICAÇÕES DE MARCADORES NA CONSERVAÇÃO AMBIENTAL........................... 22

5. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 24

5.1. ÁREAS DE ESTUDO....................................................................................................... 24

5.2. MATERIAL BIOLÓGICO PARA ESTUDOS GENÉTICOS....................................................... 25

5.3. EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA......................................................................... 25

5.4. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA.............................................. 26

5.4.1. SELEÇÃO DA ENZIMA PARA DIGESTÃO DO DNA.................................................. 27

5.4.2. ELUIÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA EM GEL DE AGAROSE............................... 29

5.4.3. LIGAÇÃO DO DNA AOS ADAPTADORES E LIGAÇÃO DE BIOTINA AOS

OLIGONUCLEOTÍDEOS................................................................................................... 30

5.4.4. ENRIQUECIMENTO DA BIBLIOTECA - PREPARO DAS CONTAS MAGNÉTICAS PARA

HIBRIDIZAÇÃO .............................................................................................................. 31

ix

5.4.5. HIBRIDIZAÇÃO DO DNA+ADAPTADOR AO COMPLEXO BIO-OLIGOS-CONTA E

PCR PARA CONTROLE DO ENRIQUECIMENTO DA BIBLIOTECA....................................... 32

5.4.6. PURIFICAÇÃO DAS REAÇÕES DE PCR APÓS A HIBRIDIZAÇÃO............................... 34

5.4.7. LIGAÇÃO DO DNA AO PLASMÍDEO PGEM-T, TRANSFORMAÇÃO E REPICAGEM

DE COLÔNIAS.............................................................................................................. 35

5.4.8. SELEÇÃO DE CLONES POSITIVOS PARA SSR....................................................... 36

5.4.9. PCR DOS INSERTOS............................................................................................. 37

5.4.10. REAÇÃO DE EXO/SAP........................................................................................ 38

5.4.11. PCR E REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO.............................................................. 39

5.4.12. DESENHO DOS INICIADORES.............................................................................. 40

5.4.13. OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DOS LOCOS SSR.................................................... 42

5.5. METODOLOGIA DE ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS..................................................44

5.5.1. ESTIMATIVA DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS.......................................................... 44

5.5.2. ESTIMATIVA DO TAMANHO DOS FRAGMENTOS.................................................... 44

5.5.3. ESTIMATIVA DOS ÍNDICES DE DIVERSIDADE GENÉTICA....................................... 45

5.6. TRANSFERIBILIDADE PARA A ESPÉCIE ORBIGNYA OLEIFERA (BUR.)............................... 47

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 48

6.1. DESENVOLVIMENTO DE BIBLIOTECAS ENRIQUECIDAS COM LOCOS MICROSSATÉLITES 48

6.2.ENRIQUECIMENTO E REENRIQUECIMENTO DA BIBLIOTECA GENÔMICA DE

MICROSSATÉLITES......................................................................................................... 49

6.3.SEQUENCIAMENTO, ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS E VALIDAÇÃO DOS PRIMERS.................. 49

6.4. ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA...................................................................... 53

6.4.1. ESTIMATIVA DO TAMANHO E DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS................................ 53

6.4.2. ESTIMATIVA DOS ÍNDICES DE DIVERSIDADE GENÉTICA........................................58

6.5.TRANSFERIBILIDADE DOS MARCADORES SSRS DE M. FLEXUOSA....................................62

7. CONCLUSÃO...................................................................................................................... 63

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 64

x

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - (A) ÁRVORE DE MAURITIA FLEXUOSA NA APA PANDEIROS; (B) VISTA DA REGIÃO

ABAXIAL DAS FOLHAS DA PALMEIRA ; (C) CACHO DE FLORES MADUROS E

SECOS............................................................................................................................................ 9

FIGURA 2 - VEREDA DA ÁREA DE PRESERVAÇÃO AMBIENTAL (APA) - PANDEIROS COM VISÃO

DOS BURITIS (MAURITIA FLEXUOSA)................................................................................................ 11

FIGURA 3 - ESQUEMA DE ANÁLISE EM GEL DE MARCADOR MICROSSATÉLITE EM TRÊS GENÓTIPOS

DIPLÓIDES DE PLANTAS (P1, P2 E F1).............................................................................................. 19

FIGURA 4 - LOCALIZAÇÃO DO MUNICÍPIO DE JANUÁRIA ............................................................ 24

FIGURA 5 - ESQUEMA REPRESENTATIVO ADAPTADO DAS ETAPAS DE EXTRAÇÃO DE DNA PELO

MÉTODO CTAB 2%....................................................................................................................... 26

FIGURA 6 - ESQUEMA REPRESENTATIVO DAS ETAPAS DA CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA

ENRIQUECIDA COM MICROSSATÉLITES........................................................................................... 27

FIGURA 7 - GEL DE ELETROFORESE DO ENSAIO DE DIGESTÃO ENZIMÁTICA COM AS ENZIMAS

MSEI, SAU3A E TSP509............................................................................................................. 28

FIGURA 8 - PRIMEIRA QUANTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA DO BURITI............................ 29

FIGURA 9 - (A) SEGUNDA QUANTIFICAÇÃO FEITA COM O PENTE DE 4 POÇOS UNIDOS, UTILIZANDO

OS MARCADORES KB E ØX174 (B) QUANTIFICAÇÃO DA ELUIÇÃO DOS FRAGMENTOS DE 200 A 800

PB UTILIZANDO O MARCADOR KB.................................................................................................. 30

FIGURA 10 - NA SETA AZUL O IMÃ UTILIZADO PARA SEPARAR AS CONTAS MAGNÉTICAS (BEADS)

DAS SOLUÇÕES AQUOSAS. NA SETA VERDE O EPPENDORF COM A SOLUÇÃO................................... 32

FIGURA 11 - RESULTADO DA PCR PARA CONTROLE DO ENRIQUECIMENTO DA BIBLIOTECA....... 33

FIGURA 12 - QUANTIFICAÇÃO DA PCR DAS BEADS.................................................................... 34

FIGURA 13 - REPRESENTAÇÃO DO VETOR DE CLONAGEM PGEM............................................... 35

FIGURA 14 - CUBA DE ELETROPORAÇÃO UTILIZADA NO PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO

BACTERIANA.................................................................................................................................. 36

FIGURA 15 - PLACA DEEPWELL COM FUNDO EM U.................................................................... 37

FIGURA 16 - RESULTADO DA ELETROFORESE DA PCR DAS AMOSTRAS DE INSERTO.................. 38

FIGURA 17 - ESQUEMA DA REAÇÃO DE EXOSAP UTILIZADA NO PROCESSO................................ 39

FIGURA 18 - SEQUENCIADOR DE DNA CAPILAR ABI 3100 DA APPLIED BIOSYSTEMS................ 40

xi

FIGURA 19 - SCREEN DO TAMANHO DOS FRAGMENTOS (MF18) DO GEL DE POLIACRILAMIDA A 5%

FEITA PELO PROGRAMA BIORAD QUANTIFY..................................................................................... 44

FIGURA 20 - REPRESENTAÇÃO DE UMA PLACA DE PETRI CONTENDO AS BACTÉRIAS ESCHERICHIA

COLI XL1-BLUE TRANSFORMADAS.............................................................................................. 49

FIGURA 21 - PORCENTAGEM DOS MOTIVOS MICROSSATÉLITES PERFEITOS E COMPOSTOS E AS

FREQUÊNCIAS DE MOTIVOS DINUCLEOTÍDEOS E TRINUCLEOTÍDEOS............................................... 50

FIGURA 22 - ELETROFEROGRAMA (MF9) CONTENDO REGIÃO MICROSSATÉLITE RICA EM AG DO

DNA DE BURITI (M. FLEXUOSA)..................................................................................................... 50

FIGURA 23 - PORCENTAGEM DE REDUNDÂNCIA NOS PRIMERS FORWARD E REVERSE................. 51

FIGURA 24 - PORCENTAGEM DE REDUNDÂNCIA NOS PRIMERS FORWARD................................... 51

FIGURA 25 - MOTIVOS MICROSSATÉLITES MAIS FREQUENTES IDENTIFICADOS EM MAURITIA

FLEXUOSA....................................................................................................................................... 52

FIGURA 26 - HISTOGRAMA DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS DOS SEIS LOCOS MICROSSATÉLITES,

ESTIMADOS PARA 24 INDIVÍDUOS DA POPULAÇÃO 1 DE MAURITIA FLEXUOSA. O EIXO Y INDICA A

FREQUÊNCIA ALÉLICA E O EIXO X INDICA O NÚMERO DO ALELO, EM PARES DE BASE. AS

RESPECTIVAS FREQUÊNCIAS SE ENCONTRAM ACIMA DE CADA COLUNA......................................... 56

FIGURA 27 - HISTOGRAMA DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS DOS SEIS LOCOS MICROSSATÉLITES,

ESTIMADOS PARA 20 INDIVÍDUOS DA POPULAÇÃO 2 DE MAURITIA FLEXUOSA. O EIXO Y INDICA A

FREQUÊNCIA ALÉLICA E O EIXO X INDICA O NÚMERO DO ALELO, EM PARES DE BASE. AS

RESPECTIVAS FREQUÊNCIAS SE ENCONTRAM ACIMA DE CADA COLUNA......................................... 57

xii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - POTENCIAL ANUAL DE GERAÇÃO DE ENERGIA ELÉTRICA A PARTIR DO ÓLEO DE

BURITI NO ESTADO DO PARÁ..................................................................................................... 13

TABELA 2 - REAGENTES UTILIZADOS NO TESTE DA DIGESTÃO ENZIMÁTICA APÓS A EXTRAÇÃO

DO DNA................................................................................................................................... 28

TABELA 3 - AMOSTRAS UTILIZADAS NA QUANTIFICAÇÃO DO DNA DE BURITI...................... 29

TABELA 4 - REAGENTES UTILIZADOS NO PREPARO DA BIOTINA............................................ 31

TABELA 5 - REAGENTES UTILIZADOS NA REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DAS SETE SOLUÇÕES NA

HIBRIDIZAÇÃO ........................................................................................................................... 33

TABELA 6 - PARÂMETROS ESPECÍFICOS SELECIONADOS PARA OS DESENHOS DOS PRIMERS SSR

NO PROGRAMA STADEN........................................................................................................... 41

TABELA 7 - RELAÇÃO DOS 30 PRIMERS DESENHADOS PARA O TESTE DE VALIDAÇÃO........... 42

TABELA 8 - RELAÇÃO DOS PRIMERS VALIDADOS QUE APRESENTARAM POLIMORFISMO PARA M.

FLEXUOSA.................................................................................................................................. 43

TABELA 9 - ESTIMATIVA DA FREQUÊNCIA ALÉLICA NA POPULAÇÃO 1 (PANDEIROS –

VILA )........................................................................................................................................ 54

TABELA 10 - ESTIMATIVA DA FREQUÊNCIA ALÉLICA NA POPULAÇÃO 2 (PANDEIROS –

PINDAIBAL )............................................................................................................................... 55

TABELA 11 - ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE GÊNICA DOS SEIS LOCOS SSR DE M. FLEXUOSA

PELA ANÁLISE DE 25 INDIVÍDUOS (POPULAÇÃO 1)..................................................................... 59

TABELA 12 - ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE GÊNICA DOS SEIS LOCOS SSR DE M. FLEXUOSA

PELA ANÁLISE DE 20 INDIVÍDUOS (POPULAÇÃO 2)..................................................................... 59

TABELA 13 - ESTIMATIVA DO ÍNDICE DE FIXAÇÃO ALÉLICA NA POPULAÇÃO 1 (PANDEIROS –

VILA )........................................................................................................................................ 61

TABELA 14 - ESTIMATIVA DO ÍNDICE DE FIXAÇÃO ALÉLICA NA POPULAÇÃO 2 (PANDEIROS –

PINDAIBAL )............................................................................................................................... 61

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% PORCENTAGEM

°C GRAU CELSIUS

µG MICROGRAMA

µL MICROLITRO

µµµµM MICROMOLAR

λ LAMBDA

G GRAMA

BEW TAMPÃO DE LIGAÇÃO E LAVAGEM

BSA ALBUMINA DE SORO BOVINA

CIA CLOROFÓRMIO-ÁLCOOL ISOAMÍLICO

CTAB CETIL TRIMETIL-AMONIO BROMETO

DNA ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO

DNTP DESOXIRRIBONUCLEOTÍDEO

TRIFOSFATO

DTT DITIOTREITOL

EDTA ÁCIDO ETILENO DIAMINO

TETRA-ACÉTICO

H2OBIDEST ÁGUA BIDESTILADA

IPTG ISOPROPIL-Β-

DTIOGALACTOPIRANOSIDA

KB KILOBASE

LA ADAPTADOR LONGO

LB MEIO LURIA-BERTANI

M MOLAR

MG MILIGRAMA

MGCL2 CLORETO DE MAGNÉSIO

MM MILI MOLAR

MSE I MICROCOCCUS SPECIES

NACL CLORETO DE SÓDIO

NM NANÔMETRO

PB PARES DE BASE

PCR REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE

PH POTENCIAL HIDROGENIÔNICO

RAPD POLIMORFISMO DE DNA

AMPLIFICADO AO ACASO

RNASE RIBONUCLEASE

RPM ROTAÇÕES POR MINUTO

SA ADAPTADOR CURTO

SAU 3A STAPHYLOCOCCUS AUREUS 3A

SDS DODECIL SULFATO DE

SÓDIO

SSC CITRATO SALINO DE SÓDIO

SSPE SODIO, SAL, FOSFATO E EDTA

SSR SEQUÊNCIAS SIMPLES REPETIDAS

TAQ THERMUS AQUATICUS

T4 DNA L IGASE TERMINAL TRANSFERASE

TE TRIS-EDTA

TRIS TRIS-(HIDROXIMETIL )-AMINOMETANO

TRIS-CL TRIS HCL

TSP509 THERMUS SPECIES 509

U UNIDADE

UV RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

X-GAL 5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL -Β-

DGALACTOPIRANOSIDEO

xiv

RESUMO

O buriti (Mauritia flexuosa L. f.) é uma palmeira amplamente distribuída no território

nacional, ocorrendo desde as veredas do cerrado até os estuários de rios e áreas alagadas da

floresta amazônica. A espécie contém importância do ponto de vista natural, ecológico e

sócio-econômico, além de alimentício e medicinal, sendo extremamente exploradas por

populações locais. O conhecimento acerca da estrutura genética de uma população tem

grande aplicação na conservação e no manejo da biodiversidade e pode ser obtido com o uso

de marcadores moleculares microssatélites, os quais representam poderosa ferramenta na

averiguação de parâmetros genéticos, como diversidade genética, fluxo gênico, deriva, entre

outros. Este trabalho teve como objetivo a construção de biblioteca enriquecida com locos

microssatélites visando o desenvolvimento e validação de iniciadores (primers) para a

utilização em futuras análises genéticas do buriti e possível transferibilidade desses

marcadores para espécies correlacionadas. Foram desenvolvidos a partir de uma biblioteca

genômica enriquecida um total de 160 iniciadores, sendo testados 30, dos quais seis se

apresentaram altamente polimórficos. Duas populações com uma distância média de 40 km

entre elas, localizadas na APA – Pandeiros, município de Januária, foram avaliadas quanto

ao nível de polimorfismo existente em seus indivíduos. Para o estudo da diversidade

genética foram avaliadas 44 árvores adultas (24 indivíduos na população 1 – Vila e 20

indivíduos na população 2 – Pindaibal) no total. Estes indivíduos foram analisados

utilizando os 6 locos microssatélites polimórficos, avaliados em gel de poliacrilamida a 5% e

corados com brometo de etídio. Os resultados indicaram o aparecimento de alelos raros tanto

na população 1 quanto na 2 e uma média de 11,5 alelos por loco. Os valores de Ho

observados na população 1 tiveram uma média de 0,277 e de Ĥe = 0,883, já na população 2

foram encontrados valores de Ĥo=0,408 e Ĥe=0,877. Os índices de fixação se apresentaram

ligeiramente superiores na população 1 (Vila) em relação a população 2. Os resultados

encontrados neste estudo fornecem informações importantes que auxiliarão nos futuros

estudos da estrutura genética do buriti, podendo ser utilizadas para o planejamento adequado

de práticas de manejo sustentável de suas populações, principalmente as exploradas pelas

comunidades locais.

Palavras-Chave: Mauritia flexuosa, SSR, diversidade genética.

xv

ABSTRACT

The buriti (Mauritia flexuosa L. f.) is a single-stemed palm tree with wide national

distribution, occurring from the sidewalks of the savannah to the estuaries of rivers and

flooded areas of the amazon forest. The species contains natural, ecological and

socioeconomic importance, besides nutritious and medicinal, being extremely explored by

local populations. The knowledge concerning the genetic structure of a population has great

application in the conservation and in the management of the biodiversity and it can be

obtained with the use of microssatélite molecular markers, which represent powerful tool in

the verification of genetic parameters, as genetic diversity, gene flow, genetic drift, among

others. This work had as objective the construction of library enriched with microsatellite

loci seeking the development and validation of primers for the use in future genetic analyses

of the buriti and possible transference of those markers for correlated species. There were

developed, from a enriched genome library a total of 160 primers, 30 were tested, of those

six were highly polimorphic. Two populations with a medium distance of 40 km between

each other, located in APA - Pandeiros, municipal district of Januária, they were evaluated

with relationship at the level of existent polimorphism in your individuals. For the study of

the genetic diversity there were evaluated 44 adult trees (24 individuals in the population 1 -

Vila and 20 individuals in the population 2 - Pindaibal) in the total. These individuals were

analyzed using the six polymorphic microssatelite loci, evaluated in polyacrylamide gel and

stained with ethidium bromide. The results indicated the emergence of rare alleles in both

populations and an average of 11.5 alleles per locus. The values of Ho observed in

population 1 had an average of 0.277 and of Ĥe = 0.883, in the population 2, values of

Ĥo=0.408 and Ĥe =0.877 were detected. The fixation index were lighter in population 1

(Vila) in relation to population 2. The results found in this study supply important

information and will aid in the futures studies of the genetic structure of the buriti, and could

be used for the appropriate planning of practices of population sustainable management,

especially of those which are explored by the local communities.

Keywords: Mauritia flexuosa, SSR, gentic diversity.

1

1. INTRODUÇÃO

Nos trópicos, nas localidades mais inacessíveis, as populações que residem em

florestas limpam áreas para sua moradia, cultivo e colheita de produtos florestais não

madeireiros (NTFPs) nas próprias florestas. Consequentemente a conservação de recursos

genéticos envolve, necessariamente, o manejo desses recursos no contexto do uso humano

(Ratnam & Boyle, 2000).

A preocupação com as consequências da degradação dos diversos ecossistemas vem

sendo objeto de discussões e estudos nos últimos anos, tanto por parte de instituições

governamentais, quanto pela comunidade científica (Telles, 2000).

Populações de vida selvagem no século XXI são deparadas com muitas ameaças

antropogênicas. Mudanças climáticas, fragmentação e perda de hábitat, perturbação, poluição,

competição de espécies invasoras, utilização demasiada do solo e patógenos tudo constituem

riscos de extinção e principais desafios para condução evolucionária da vida selvagem

sustentável (Ashley et al., 2003). A taxa anual comum de perda de populações de planta e

habitats calculadas estão próximas de 1% (Balmford et al. 2003).

A redução das florestas e a fragmentação florestal são duas das principais ameaças às

populações naturais de espécies arbóreas tropicais (Heywood et al., 1994; Young e Boyle,

2002). Vários estudos detectaram que a redução do habitat natural e subsequente isolamento

espacial das populações têm consequências negativas sob o sucesso reprodutivo e o fluxo

gênico das espécies arbóreas tropicais (McCauley, 1995; Nason e Hamrick, 1997; Seoane et

al., 2000). Isto pode levar à redução da variabilidade genética e ao aumento de efeitos

deletérios da endogamia nas progênies, resultante na depressão por endogamia (Charlesworth

e Charlesworth, 1987; Ellstrand, 1992; Ellstrand e Ellan, 1993). Estudos de genética de

populações indicam que as progênies de populações fragmentadas são as mais propensas a

terem sido geradas por autofecundação ou polinizadas por poucos indivíduos (Hall et al.,

1996; Aldrich e Hamrick, 1998; Seoane et al., 2000; Cascante et al., 2002; Fuchs et al.,

2003). O cruzamento entre indivíduos parentes e autofecundações causa redução na

heterozigosidade e aumento na expressão de alelos recessivos deletérios.

A fragmentação florestal leva à redução do tamanho populacional, criando gargalos

genéticos (“bottlenecks”), pois os indivíduos que restam contêm apenas uma pequena amostra

do conjunto gênico original. Quando se têm poucas gerações, os resultados observados se

devem ao efeito de gargalo genético (Young et al., 2000), mas a pequena população

remanescente, caso permaneça isolada por muitas gerações, terá contínua perda de alelos

2

devido à deriva genética aleatória, diminuindo a variabilidade dentro de populações e

aumentando a diferenciação entre populações (Barret & Kohn, 1991; Seoane et al., 2000).

Poucas são as espécies estudadas do ponto de vista genético, sendo este tipo de estudo

indispensável à conservação dos recursos da floresta tropical. Devido a restrições ao estudo de

um grande número de espécies, tem-se procurado amostrar aquelas que o representem ou que

sirvam de modelo para representar determinados biomas (Kageyama et al. 2003) ou até

mesmo determinado ecossistema (ex. veredas - formações vegetais) dentro de um bioma.

Neste contexto encontram-se as palmeiras, com espécies, de importância social e econômica

pouco estudada.

Existe no Brasil uma grande variedade de palmeiras que, se devidamente exploradas,

poderão desempenhar no futuro um papel destacado na economia nacional pelo valor e

diversidade de seus produtos (Silva et al., 1986).

Entre as palmeiras mais utilizadas a Mauritia flexuosa L. f. conhecida popularmente

como buriti, é encontrada no seu estado silvestre em várias formações vegetais,

principalmente em áreas de inundação permanente ou periódica, em agrupamentos mais ou

menos homogêneos, sobre solos hidromórficos, formando populações quase mono-

específicas, às quais se dá o nome de miritizais ou buritizais (Storti, 1993; De Paula

Fernandes, 2001).

O buriti é uma palmeira amplamente distribuída no território nacional, ocorrendo desde

as veredas do cerrado até os estuários de rios e áreas alagadas da floresta amazônica (Pott,

2004). Buriti é um nome derivado do tupi-guarani e significa “o que contém água”. A planta

cresce dentro das veredas, áreas permanentemente úmidas no cerrado, com palmeiras e

arbustos espalhados (Ribeiro & Walter, 1998).

Nas regiões onde se encontra, o buriti é a planta mais importante, de onde o homem local

aprendeu a retirar parte essencial do seu sustento. Por isso é considerada pelos nativos como a

Árvore da Vida ("life tree"), pois dela tudo se aproveita, servindo como alimento, remédio e

material para a construção de casas, utensílios domésticos e também utilizados para

artesanato. Mais recentemente descobriu-se que o óleo de buriti tem a capacidade de filtrar e

absorver raios ultravioletas podendo, portanto, evitar o surgimento de câncer de pele (Pott,

2004).

O processo contínuo da destruição do buriti (M. flexuosa) como matéria prima no

artesanato, queimadas e construções de novos bairros, resultam na degradação da espécie.

Traça-se um panorama que ameaça desaparecer por não ser valorizado e preservado como

deveria: a plasticidade do buriti e do seu uso popular tradicional. (Fearnside & Ferraz, 1995).

3

No entanto, esta espécie ainda continua pouco conhecida com relação a estudos que

viabilizem o manejo de suas populações (Cavalcante, 1991; De Paula Fernandes, 2001). Já o

estudo genético destas populações depende de ferramentas como marcadores moleculares que

devidamente desenvolvidos, poderão influenciar na conservação, manejo e manutenção,

evitando assim a sua extinção (Pinto; Souza e Carvalho, 2004).

Para a definição de programas de manejo eficientes, fatores genéticos como perda da

heterozigosidade, variação no índice de fixação e tamanho efetivo populacional devem ser

considerados em conjunto com os dados dendrométricos. Para estudos genéticos nesse nível,

os marcadores moleculares como microssatélites têm sido intensamente utilizados, pois são

uma ferramenta muito eficiente no estudo de estrutura genética de populações, fluxo gênico,

paternidade, viabilidade populacional e na definição dos efeitos de fragmentação, sendo úteis

nas definições de estratégias de conservação (Collevatti, et al., 1999).

Finalmente, os dados moleculares podem ser utilizados para melhor compreender a

dinâmica dos alelos nas populações de uma determinada espécie, fornecendo subsídios para o

maior entendimento dos processos microevolutivos que estão atuando na diferenciação destas

populações (Reis, 1996; Avise, 2000).

2. JUSTIFICATIVA

No Norte do Estado de Minas Gerais, as populações tradicionais exploram a

diversidade da flora nativa, principalmente como fonte alimentar e medicinal. Deste modo, a

região, caracterizada pela baixa renda destas famílias, demanda, com urgência, a obtenção de

informações sobre sua biodiversidade e utilização sustentável dessa flora. Dentre as espécies

utilizadas, o buriti fornece vários produtos economicamente importantes para as famílias de

baixa renda.

Até o presente momento, os fatores genéticos não são considerados em qualquer

atividade, extrativista ou não. Sabe-se que tais fatores, além do ambiente, são responsáveis

por diferenças em produtividade, adaptação e reprodução entre indivíduos. Antes que a

espécie possa perder genes importantes para sua perpetuação, é imprescindível o

conhecimento da estrutura genética. Com os resultados obtidos nesse trabalho espera-se a

obtenção de informações que possam contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis

a futuras análises genéticas da espécie e assim o uso sustentável.

Este trabalho foi elaborado em âmbito regional para áreas de abrangência da Bacia do

Rio São Francisco no Estado de Minas Gerais, e mais especificamente no médio São

4

Francisco, na área de abrangência da bacia do rio Pandeiros localizada na região Norte do

Estado de Minas Gerais e envolve a Universidade Estadual de Montes Claros

(UNIMONTES), Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN) e financiado

pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Para este

trabalho foi proposto o desenvolvimento de marcadores microssatélites a partir de uma

biblioteca genômica enriquecida para o dinucleotídeo AG/TC do genoma de Mauritia

flexuosa, espécie de grande importância econômica para a região. Após a conclusão de todas

as etapas do trabalho, os primers microssatélites contribuirão para futuros estudos de

diversidade genética da espécie, a qual poderá melhor ser avaliada quanto a sua conservação.

Isto decorre da importância da utilização do buriti, contribuindo para a

sustentabilidade de atividades econômicas, como a agricultura familiar de caráter

eminentemente extrativista, bem como para as atividades industriais a que o buriti se destina.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Este trabalho teve como objetivo construir uma biblioteca genômica enriquecida para

sequências microssatélites para a espécie M. flexuosa de modo a gerar uma ferramenta para

estudos de genética de populações, visando fornecer subsídios aos programas de manejo

sustentável da espécie que é intensamente explorada pelas comunidades rurais.

3.2 Objetivos específicos

� Isolar e sequenciar regiões microssatélites do genoma de buriti (Mauritia flexuosa L. f.);

� Desenhar primers específicos visando à amplificação dos locos de microssatélites

isolados e selecionados;

� Otimizar os primers desenhados;

� Caracterizar cada loco de microssatélite com relação ao tipo de repetição, número e

tamanho de alelos amplificados para futuros estudos de diversidade genética da

espécie;

� Testar a transferibilidade dos marcadores SSR entre espécies da mesma família: de

buriti (M. flexuosa) para babaçu (Orbignya oleifera).

5

4. REFERENCIAL TEÓRICO

4.1. Origem e Diversidade Genética em Plantas

Embora as plantas com flores (Angiospermae) tenham sido originadas provavelmente

no período Jurássico (145 a 206 milhões de anos atrás), a maior parte da diversificação e

dominância destas na Terra tem sido atribuída ao período Cretáceo (90 a 140 milhões de anos

atrás) (Crane et al., 1995).

A diversidade biológica ou biodiversidade é frequentemente relacionada com a

diversidade de espécies, embora apresente um profundo relacionamento ecológico e

evolucionário (Falk, 1990). De fato, biodiversidade é a variabilidade apresentada pelos

organismos vivos, dentro de espécies, entre espécies e ecossistemas (Unep, 1992).

Consequentemente é a variação que ocorre sob três enfoques: genes, espécies e ecossistemas

(McNeely et al., 1990). Assim, diversidade genética é o somatório da informação genética

existente nos organismos que constituem a flora, a fauna e a microbiota que, se

adequadamente identificada e capturada, passa a constituir os recursos genéticos, fonte da

variação genética disponível ou variabilidade genética (Vilela-Morales e Valois, 2000).

Em relação ao potencial oferecido pela biodiversidade, o Brasil é um dos poucos países

do mundo que possuem altos níveis de diversidade biológica ou megadiversidade, e como

efeito da diversidade apresentada pelos seus diferentes biomas e ecossistemas ao longo do seu

território. Em número de espécies, Mcneely et al. (l990) consideram os seguintes valores: (a)

55.000 de plantas superiores, com destaque para palmeiras; (b) 3.010 de vertebrados

terrestres; 428 de mamíferos; 516 de anfíbios; 467 de répteis; 1.622 de aves e 3.000 de peixes

de água doce; e (c) 10 a 15 milhões de insetos, muitos deles de famílias ainda não descritas.

Isto tudo sem contar com o enorme potencial oferecido pela microbiota que poderá constituir

fonte de recursos genéticos de valor inestimável.

4.2. Efeitos genéticos do extrativismo

Atualmente, no Brasil, existe um número extenso de variedades de palmeiras que, se

exploradas adequadamente, poderão desempenhar no futuro um papel destacado na economia

nacional pelo valor e diversidade de seus produtos, destacando-se, dentre elas, o buriti (Silva

et al., 1986).

Apesar da abundância de buriti na maior parte do território brasileiro (Henderson et

al. 1995) e o intenso uso de muitas partes dessa palmeira para alimentação, extração de óleo,

cobertura, e habilidades manuais (Balick, 1986; Castro, 2000), poucos estudos focalizaram na

6

ecologia de espécies (Cardoso et al. 2002; Ponce Calderón 2002; Ponce et al. 1999) e não

foram avaliados os efeitos de colheita em populações de buriti previamente avaliadas.

Os efeitos de colheita de produtos florestais não madeireiros podem ser avaliados

comparando a sobrevivência, crescimento, e taxa de reprodução de indivíduos propensos a

intensidades diferentes na extração de produtos (Kathriarachchi et al. 2004; Uma Shaanker et

al. 2002). Mudanças nestas taxas podem afetar a estrutura das populações. Foram feitas

comparações de estrutura entre populações propensas a intensidades diferentes de extração e

podem revelar com o passar do tempo potenciais impactos (Murali et al. 1996).

Uma redução drástica no tamanho das populações, através do corte seletivo, pode levar

à deriva genética caracterizada pela perda e fixação aleatória de alelos, aumento do parentesco

e endogamia dentro das populações (Futuyma, 1992), colocando em risco a sustentabilidade

do manejo. Considera-se que, a extração de folhas maduras aumenta a mortalidade, reduz o

crescimento e a taxa reprodutiva em algumas espécies de palmeiras (Endress et al. 2004;

Ratsirarson et al. 1996).

O extrativismo resulta em pressões diretas e indiretas nas populações, devido à

competição entre humanos e animais por recursos. Embora animais mostrem diferentes

habilidades para resistir às pressões, de acordo com o grupo taxonômico, aqueles que tendem

a ser mais fortemente afetados pela caça e outras atividades humanas incluem os mais

importantes predadores e dispersores de sementes. A redução ou remoção das populações

animais podem rapidamente influenciar características tais como composição e estrutura da

vegetação. Finalmente, o extrativismo pode afetar a diversidade genética das populações

exploradas, especialmente quando da extração de flores e frutos que mostram diferentes

características, resultando em diferentes graus de pressão (Peters et al., 1989).

4.3. Conservação de Espécies Arbóreas Tropicais

As florestas brasileiras são consideradas entre as de maior biodiversidade do mundo.

Segundo as proposições na 8a Conferências das Partes (COP-8), no Brasil, encontram-se de

15% a 20% do total de espécies do planeta. A diversidade da flora brasileira é representada

por mais de 55 mil espécies descritas (Implementação, 2006).

No entanto, Barreto e colaboradores (2005) relatam que 11% da Floresta Amazônica,

que se estende por 4,1 milhões de km2, já se encontrava desmatada. Ainda assim, a

intensidade de destruição tem se acirrado nos últimos anos, atingindo a taxa de 2 milhões de

hectares anuais. No cerrado, dos 204 milhões de hectares originais do bioma, estima-se que

57% tenham sido completamente destruídos, com a metade do remanescente já

7

descaracterizada e com a biodiversidade comprometida A taxa de desmatamento nesse bioma

chega a 3 milhões de hectares ao ano, tendo como principal motivo a exploração da vegetação

para produção de carvão vegetal e a abertura de áreas para a agropecuária (Cerrado, 2004).

A redução no tamanho dos fragmentos e o seu isolamento em forma de ilhas

desencadeiam alguns processos ecológicos e genéticos populacionais com consequências

potencialmente desastrosas. Do ponto de vista genético, isso leva à redução no número efetivo

de indivíduos da população, reduz a densidade de indivíduos reprodutivos, aumenta a

distância entre coespecíficos reprodutivos e, com isso, aumenta a taxa de autofecundação e o

risco de perda de alelos em decorrência da homozigose e da deriva genética (processo

estocástico, atuante sobre as populações, modificando a frequência dos alelos e a

predominância de certas características na população) (Hall et al., 1996; Sebbenn et al., 2001;

Cascante et al., 2002; Srikwan; Woodruff et al., 2003; Fuchs et al., 2003; Lowe et al., 2005).

Desse modo, os efeitos negativos da endogamia incidem diretamente sobre o valor adaptativo

da espécie (Charlesworth & Charlesworth, 1987), que podem ser evidenciados quanto à

quantidade de pólen, número de óvulos, quantidade de sementes, proporção de germinação e

crescimento e capacidade competitiva (Frankham et al., 2002). O resultado disso é conhecido,

também, como “erosão genética”, que é caracterizada pela perda de alelos e,

conseqüentemente, da variabilidade genética e da capacidade das espécies de reagir às

múltiplas pressões ambientais para sobreviver e continuar gerando descendentes viáveis

(Tarazi, 2007).

Com a fragmentação das formações florestais, decresce o número de espécies

remanescentes, à medida que se reduz o tamanho dos fragmentos (Harris, 1984),

caracterizando o que se poderia considerar como extinções locais dessas espécies. Quanto

menores e mais isoladas forem às populações remanescentes, maiores são os riscos de sua

extinção (Holsinger, 2003). Em contraste, altos níveis de fluxo gênico entre populações

fragmentadas foram propostos como um atenuante para a perda de diversidade genética por

deriva genética, tendo como resultado populações fragmentadas que preservam uma alta

proporção da variabilidade genética das populações originais (White et al., 1999).

A conservação da biodiversidade depende da disponibilidade de ecossistemas

funcionais que, por sua vez, requerem diversidade de espécies, cada uma com funções

distintas e indispensáveis no ecossistema. Cada espécie deve estar representada por

populações viáveis e isso depende da existência de ampla variabilidade genética que

possibilite ajustes às mudanças ambientais ao longo das gerações (Shimizu, 2007).

Na conservação da variação genética duas ações podem ser enfatizadas: (i)

conservação da diversidade genética in situ (variação genética potencial), por meio de

8

reservas genéticas isoladas ou preferencialmente localizadas dentro de unidades de

conservação ambiental, como parques, reservas, santuários, refúgios etc.; e (ii) conservação

da variabilidade genética ex situ (variação genética capturada ou disponível), em coleções de

recursos genéticos localizadas em jardins botânicos, arboretos, zoológicos e bancos de

germoplasma (Vilela-Morales e Valois, 2000).

4.4. A espécie Mauritia flexuosa

4.4.1. Aspectos taxonômicos e botânicos

Estas palmeiras estão incluídas em uma das maiores famílias (Arecaceae) de plantas

(Ribeiro et al., 1999). De um modo geral, têm um alto valor econômico, ornamental e seu

estudo tem despertado o interesse de pesquisadores pelas peculiaridades que está família

apresenta (Fonseca & Silva, 1998). A família Arecaceae é composta de 200 gêneros,

distribuídos em seis subfamílias: I Coryphoideae (39 gêneros), II. Phytelephantoideae (3

gêneros), III. Nypoideae (1 gênero), IV. Ceroxyloideae (11 gêneros), V. Arecoideae (124

gêneros) e VI. Calamoideae (22 gêneros) (Uhl & Dransfield, 1988).

A espécie Mauritia flexuosa pertencente à família Arecaceae, subfamília Calamoideae, e

apresenta diversos nomes populares: miriti, moriti, muriti, boriti, buriti, coqueiro-buriti,

carandá-guaçu, carandaí-guaçu ou palmeira-dos-brejos. É uma palmeira robusta e elegante de

20-30 m de altura, com tronco (estipe) solitário e ereto, sem ramificação, cor cinza quase

branco, liso e com anéis uniformemente espaçados, de 30-60 cm de diâmetro, com uma

grande massa de raízes na base e pneumatóforos visíveis. No ápice do estipe encontra-se uma

coroa de 20 folhas de até 4 m de comprimento (Figura 1). É uma planta dióica ou polígamo

dióica, ou seja, existem indivíduos com flores masculinas e indivíduos com flores femininas e

hermafroditas. O fruto é uma drupa globoso-alongada de 4-7 cm de comprimento, constituída

de epicarpo (casca mais externa) formado de escamas rombóides de cor castanho-

avermelhada; mesocarpo (parte comestível) representado por uma massa espessa de cor

alaranjada; endocarpo esponjoso que envolve a semente muito dura. Uma única planta pode

conter até 7 cachos de frutos, com uma média anual de produção de 5000 frutos (Pott, 2004).

Há normalmente uma semente por fruto, podendo ocorrer casos de duas de forma geralmente

sub-globosa; endosperma homogêneo; embrião basal; germinação adjacente ligular (Ferreira,

2006). O gênero Mauritia caracteriza-se pelo porte arbóreo e está incluído entre as palmeiras

mais altas do Brasil. Possui espácides axilares grandes, pendentes com numerosas aspatas

sobre o eixo das ramificações (Reitz, 1974).

9

Figura 1 – (A) Árvore de Mauritia flexuosa na APA Pandeiros; (B) Vista da região abaxial das folhas da palmeira; (C) Cacho de flores maduros e secos.

Na literatura há divergências quanto à espécie do buriti, ora considerada como Mauritia

flexuosa, ora como Mauritia vinifera. Segundo Rizzini & Mors (1995), Mauritia vinifera e

Mauritia flexuosa são espécies diferentes com áreas de ocorrência também diferentes: a

primeira ocorre nos pontos mais úmidos do cerrado e a segunda na Amazônia. Mas Duke,

citado por Rizzini & Mors (1995), considerou ambas como formas diferentes da mesma

espécie, e esta opinião está atualmente aceita (Uhl & Dransfield, 1998; Padoch, 1988; Kahn,

1990; Henderson et al., 1991; Henderson, 1995; Storti, 1993).

Apesar de todo o conhecimento que se tem sobre sua sistemática, ecologia, usos e

potencial econômico, pouco foi investido em trabalhos que abordassem as características

agronômicas de M. flexuosa, como, por exemplo, o estudo de sua variabilidade genética,

métodos de propagação, definição de espaçamento e adaptação a diferentes tipos de solos,

início da produção, principais pragas e doenças, produtividade, tecnologias de armazenamento

e processamento (Ferreira, 2006). Fao (1983), além de fazer um balanço sobre a situação da

espécie em relação à pesquisa e desenvolvimento, propôs linhas de ações a serem

implementadas com o objetivo de superar estas deficiências, garantindo um futuro promissor

para a espécie tanto no aspecto da sua conservação, quanto econômico.

B

C

A

10

4.4.2. Distribuição geográfica do buriti

O buriti (Mauritia flexuosa) é uma palmeira de grande porte que forma populações

oligárquicas, os “buritizais”, e possui uma distribuição natural muito ampla, sendo uma

espécie restrita à América do Sul (Cavalcante, 1991; De Paula Fernandes, 2001). Sua

ocorrência já foi registrada na Bolívia (Beni, Santa Cruz), Colômbia, Equador, Guiana, Peru

(Loreto, Madre de Dios), Suriname, Trinidad (Caribe), Venezuela e Brasil (Acre, Amazonas,

Rondônia, Mato Grosso, Goiás, Pará, Minas Gerais, São Paulo, Piauí e Maranhão) (Ferreira et

al., 2005).

O buriti ocorre em toda a Amazônia, Nordeste, Centro Oeste e Brasil Central, atingindo

seu limite austral no norte do Estado de São Paulo. É a palmeira mais amplamente distribuída

no país, formando populações naturais homogêneas tão amplas que chega a ser detectada por

imagens de satélite. São famosos os "buritizais" das ilhas do estuário do Baixo Tocantins no

Pará, ou as veredas ao longo de córregos no oeste da Bahia. Na Região dos cerrados, ele

aparece nas regiões baixas e úmidas, denominadas popularmente por veredas (Pott, 2004).

As veredas são formações fitogeográficas contornadas pelo cerrado, situados em

numerosos pontos quase sempre bastante isolados entre si ou separados por vários

quilômetros. Constituem uma importante fitofisionomia do Cerrado, pelo significado

ecológico, sócio-econômico e estético-paisagístico que lhes conferem um grande valor

regional, principalmente por serem refúgios fauno-florísticos e ambientes de nascedouros das

fontes hídricas (Ferreira, 2003). Seus maciços ocupam as suaves depressões dos terrenos cujas

áreas possuem grande umidade permanente, sendo muitas vezes pantanosas, encharcadas,

com pequenos cursos d’água e não raro com nascentes de água que formam cursos. Outro

fator que contribui para o seu aspecto é o solo rico em húmus, com intensa umidade ao longo

do ano (Castro, 1980; Brandão et al., 1992).

Normalmente sua ocorrência está associada às áreas periódica ou permanentemente

inundadas ou com drenagem deficiente, às vezes próxima a rios, ao longo de florestas de

galerias e savanas (Brasil central e Venezuela). Padoch (1985) cita um estudo (Onern, 1976)

que estima em 1.900.000 ha de áreas pantanosas nas cercanias de Iquitos, no Peru, com 80%

das árvores sendo representada por M. flexuosa e Euterpe precatória.

Ocorre exclusivamente em áreas alagadas ou brejosas, como em beira de rios, igapós,

lagos e igarapés, onde é geralmente encontrado em grandes concentrações. Segundo Ramirez

e Brito (1990), os buritizais definem as áreas tropicais brejosas, já que diferem facilmente da

vegetação de cerrado que os cerca. Nesta espécie, a sua distribuição tem ligação com locais

úmidos, pois, parte do seu tronco fica imersa em água por longos períodos, sem que isso lhe

11

cause dano (Miranda et al., 2001; Valente & Almeida, 2001). Á água tem importante papel na

disseminação de suas sementes. É até possível encontrá-lo em solo seco, contudo, em alguma

época este local foi muito úmido ou encharcado. Para cultivá-lo em terreno seco deve receber

muita água na sua fase juvenil (Pott, 2004).

Todavia, esta palmeira ocorre nas veredas (Figura 2), tanto em alinhamentos como em

formações e associações mais densas que se destacam no meio dos cerrados adjacentes

(Castro, 1980). As veredas são ambientes de grande importância no domínio do cerrado,

sendo responsáveis pela perenidade e regularidade dos rios, e funcionando também como

locais para pouso de aves, onde estas pernoitam, descansam, alimentam-se e reproduzem-se.

São locais de fonte de alimento e de reprodução também para outros elementos da fauna

terrestre e aquática. Estes ambientes são muito sensíveis às alterações ambientais e foram

considerados ecossistemas de conservação permanente em 13/12/1986, pelo governo do

estado de Minas Gerais (Brandão et al., 1992) e também pelo Ato Declaratório Ambiental do

IBAMA, em seu anexo I, artigo 2° do Código Florestal (IBAMA, 1988).

Em estudos sobre a resistência de plantas jovens à deficiência de água em M. flexuosa,

Calbo & Moraes (1997) verificaram que está espécie possui mecanismos para tolerar um

estresse moderado de falta de água.

Figura 2 – Vereda da Área de Proteção Ambiental (APA) - Pandeiros com visão dos buritis (Mauritia flexuosa).

12

4.4.3. Utilização do buriti

Inúmeros produtos úteis do buritizeiro são aproveitados pelas populações ribeirinhas de

sua região de ocorrência, tanto na sua alimentação como em outras necessidades diárias,

destacando, dentre elas, a produção de bebida natural ou fermentada, sabão caseiro, material

para enfeite e construção de casas, óleo e doces dos frutos (Pott, 2004).

Usos como os de folhas para cobertura de habitações rústicas; frutos para elaboração de

bebidas, fermentadas ou não, doces, sorvetes, sucos e geléias; fibras da epiderme das folhas

novas para confecção de tecidos, cordas, redes, chapéus, bolsas e na extração de óleo rico em

vitamina A (Pittier, 1926; Braga, 1960; Dugand, 1961; Moses, 1962; Braun, 1968; Schultes,

1977; Hoyos & Braun, 1984; Padoch et al., 1985; Braun & Chitty, 1987; Padoch, 1988;

Cavalcante, 1991; Henderson, Beck & Scariot, 1991; Galeano, 1991; Almeida & Silva, 1994;

Miranda et al., 2001).

A seiva do tronco do buriti é tão rica em açúcar que é possível extrair da mesma a

sacarose cristalizada como da cana-de-açúcar. Para a sua obtenção, faz-se um furo no tronco e

recolhe-se a seiva num recipiente, produzindo em média 8-10 litros por árvore. Cavalcante

(1991), citando Pesce (1941), afirma que é possível obter açúcar (97% sacarose) da seiva do

tronco, depois de submetê-la ao mesmo processo adotado na extração de açúcar de cana.

Aproveitamentos mais "exóticos" estão relacionados com a cultura indígena Sul-Americana.

Galenano (1991) e Hoyos & Braun (1984) citam o uso de estipes de plantas mortas como

criatórios de larvas de coleopteros da família dos Curculionidae, ricos em gordura e como

complemento da dieta protéica de indígenas na Venezuela e Colombia. Devez (1932), em

estudo realizado na Guiana Francesa, identificou o uso do endocarpo para confecção de

botões, em processo similar ao realizado com o de Jarina (Phytelephas macrocarpa).

Finalmente, a extração de um tipo de "amido" da medula do estipe para fabricação de pão por

tribos indígenas na Venezuela é citada em Hoyos & Braun (1984). Estudos indicam que

apenas as plantas do sexo masculino (que não dão frutos) do buriti que possuem seiva

açucarada (Ferreira et al., 2005).

A madeira do buritizeiro é moderadamente pesada e dura, porém de baixa durabilidade

natural. Mesmo assim é muito utilizada regionalmente em construções rurais e construção de

trapiches em beira de rios. A árvore é uma das palmeiras mais ornamentais da nossa flora,

contudo, pouco utilizada por paisagistas. O único que ousou usá-la pela primeira fez foi o

famoso paisagista Roberto Burle Marx nos jardins do Palácio Itamarati em Brasília (Ferreira

et al., 2005).

13

O óleo de buriti também apresenta um bom potencial para a geração de energia elétrica.

Em cada hectare podem ser encontradas de 200 a 500 buritizeiros (Brasmazon, 1998).

Considerando que cada palmeira de buriti produz cinco cachos, com 650 frutos por cacho em

média por ano, tem-se uma produção anual de 21 a 54 toneladas de frutos frescos por hectare.

Admitindo-se as produtividades mencionadas do óleo de buriti, o potencial anual por

hectare colhido para a geração de energia elétrica a partir desse óleo pode variar de 0,9 a 8,0

MWh (Tabela 1).

Tabela 1 – Potencial anual de geração de energia elétrica a partir do óleo de buriti no estado do Pará. Fonte: Silvia, M. V. M, 2005.

O buriti possui importância estratégica na preservação da fauna de várias espécies de

vertebrados e invertebrados que se alimentam ou que se reproduzem em suas folhas, estipe

(caule), raízes, folhas e frutos. Muitas dessas espécies não se alimentam de outras plantas,

dependendo do buriti para sobreviver (Valente & Almeida, 2001).

A importância do buriti transcende a sua utilidade econômica, tornando-se uma das

plantas mais estimadas pelas populações de muitas regiões do país, sentimento este traduzido

pelo uso de seu nome para designar várias cidades no interior do país: Buritizal (SP), Buriti

(MA), Buritis (MG), Buriti Alegre (GO), Buriti Bravo (MA), Buritama (SP), Buriti dos Lopes

(PI), Buritirama (BA), Buritizeiro (MG) (Pott, 2004).

4.5. Estrutura Genética de Populações de Plantas

Uma população, do ponto de vista genético, é definida como um conjunto de indivíduos

de uma mesma espécie, que compartilham o mesmo pool gênico, isto é, indivíduos que

compartilham seus genes através de reprodução (Falconer & Mackay, 1989).

As plantas, diferentemente dos animais, são fixas, vivem em ambientes heterogêneos e,

portanto, apresentam uma maior plasticidade fenotípica na resposta às adversidades

ambientais. Ao longo do tempo, forças evolutivas, como aquelas resultantes da presença de

TIPOS DE ÓLEO EFICIÊNCIA NA GERAÇÃO

DE ENERGIA (MWh)- 25%

EFICIÊNCIA NA GERAÇÃO DE

ENERGIA (MWh) – 30%

IN NATURA

Produtividade 0,34 t/ha 0,9 1,1


TRANSFERIFICADO



14

metais pesados no solo, promovem modificações na constituição genética das populações

naturais, no sentido de se promover um aumento do valor adaptativo dessas populações. A

seleção natural atua sobre essas mudanças favorecendo indivíduos que apresentam maior

valor adaptativo. Modificações genéticas que não afetam o valor adaptativo podem, no

entanto, ser acumuladas e virem a se fixar, diferenciando as populações geneticamente, sem

que essa diferença se expresse fenotipicamente. Desse modo, se ocorre uma alteração nas

condições ambientais ou genéticas que favoreçam organismos mutantes, eles passam a ser

fenotipicamente superiores, mudando o caminho evolutivo dessas populações (Coelho &

Valva, 2001).

O desenvolvimento e a manutenção da estrutura genética ocorrem devido às interações

de um conjunto complexo de fatores evolutivos, como variação no conjunto gênico,

organização desta variação dentro de genótipos, distribuição espacial dos genótipos, sistema

de reprodução que controla a união dos gametas para a formação das progênies, seleção,

deriva, mutação, eventos casuais e processos de crescimento, mortalidade e reposição dos

indivíduos que darão origem às populações futuras (Hamrick, 1989).

O conhecimento da estrutura populacional é importante para se evitar perdas adicionais

de diversidade genética em populações que são ameaçadas por atividades madeireiras,

desmatamento e fragmentação de hábitat. A fragmentação de áreas de floresta, pelo avanço da

agricultura e de outras atividades antrópicas, leva ao isolamento de subpopulações e,

conseqüentemente, à deriva genética e à endogamia (Hall et al. 1996, Nason et al. 1997).

As informações sobre a variabilidade genética em populações naturais são fundamentais

para o progresso de duas áreas de grande interesse atual: especiação em florestas tropicais e

conservação de recursos genéticos (Buckley et al. 1988).

Os parâmetros descritivos para avaliar a estrutura genética de uma população são as

frequências alélicas e genotípicas, que se referem, respectivamente, à quantidade observada

de um determinado alelo frente ao total de alelos da população e a quantidade observada de

indivíduos com um determinado genótipo frente ao total de indivíduos da população. As

heterozigosidades esperada (He) e observada (Ho) são as medidas da variabilidade genética

da população, que permitem identificar o número de indivíduos heterozigotos, bem como a

quantidade de indivíduos homozigotos diferentes. O número de alelos por loco e a

percentagem de locos polimórficos tem sido empregados como índice de diversidade em

populações naturais, no sentido de caracterizar e comparar os níveis de variação genética

nestas populações (Weir, 1996).

Forças evolutivas tais como: mutação, migração, seleção e deriva genética atuam dentro

do contexto de cada espécie influenciando a estrutura genética da população, ou seja,

15

interferindo na distribuição heterogênea (não aleatória) dos alelos e genótipos no espaço e

tempo (Hamrick, 1992).

As populações de plantas não têm seus genótipos arranjados aleatoriamente, mas sim

estão estruturadas no espaço e no tempo. A estrutura espacial refere-se à distribuição espacial

dos indivíduos, sendo característica de cada espécie e determinada principalmente pelo

sistema de reprodução e pelos padrões de dispersão do pólen, sementes ou outros propágulos.

Já, a estrutura genética temporal refere-se à subdivisão de gerações, por exemplo, entre pais e

filhos, plântulas e jovens, jovens e adultos, ou ainda, pode referir-se às diversas gerações

contidas em um banco de sementes ou de germoplasma (Hamrick, 1989).

Nesse sentido, o estudo da diversidade e da estrutura genética em populações arbóreas é

importante para que se entenda como esta diversidade é distribuída e quais as características

do ambiente ou da espécie que influenciam essa distribuição. Nestes estudos, a principal

ferramenta que alavancou o estudo da genética de populações, possibilitando a caracterização

da estrutura genética entre e dentro de populações é o uso de marcadores moleculares

(Sebbenn, 2001).

4.6. Marcadores Moleculares para Análise Genética

O conhecimento a respeito da genética iniciou-se com os trabalhos de Mendel em 1865.

Trabalhando com as ervilhas, Mendel postulou a existência de fatores, hoje conhecidos como

genes, que controlavam a manifestação de determinadas características. Ao cruzar plantas

puras e contrastantes para cor das sementes, Mendel concluiu que as plantas heterozigotas

(F1) produzem dois gametas distintos na mesma proporção e que ambos segregam para a

formação dos zigotos. Neste caso, ¼ dos indivíduos da geração F2 é igual ao fenótipo de um

dos genitores, ½ dos indivíduos são iguais à geração F1 e ¼ é igual ao outro genitor,

resultando no que se conhece como primeira lei de Mendel.

Mendel ainda realizou experimentos para descobrir como a forma e a cor da semente era

herdada em conjunto, concluindo que cada genitor possuía duas cópias de um gene, e que

transmitia cada uma das cópias para seus descendentes de forma independente. Desse modo,

elaborou a segunda lei da herança que é a lei da segregação independente, a qual postula que

durante a formação dos gametas, a segregação de um par de genes ocorre de forma

independente do outro par.

Com a redescoberta dos trabalhos de Mendel, no final do século XIX, por Hugo de

Vries, Carl Correns e Erick von Tschermak-Seysenegg, posteriormente realizaram-se

inúmeras pesquisas a fim de esclarecer os mecanismos básicos da herança. Esses trabalhos

16

culminaram na formulação da Teoria Cromossômica da Herança por W. Suton e T. Boveri,

em 1902, que estabeleceram a relação entre cromossomos e fatores mendelianos (genes),

segundo a qual os cromossomos são elementos celulares portadores dos genes (Lander e

Weinberg, 2000).

Com a descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick (1953) e do código genético

por Nirenberg e Matthaei (1961), descobertas subseqüentes permitiram o desenvolvimento de

metodologias para descobrir a sequência de bases de uma determinada região do DNA

(Sanger, 1975), a visualização de fragmentos específicos gerados por restrição enzimática

(Southern, 1975) e, posteriormente, a amplificação de fragmentos específicos da molécula

(Mullis e Faloona, 1987).

Os cientistas descobriram o DNA satélite em 1960, quando centrifugavam o DNA em

um gradiente de densidade, verificando que ele apresentava-se em duas ou mais camadas:

uma principal contendo os genes e bandas secundárias, que foram chamadas de bandas

satélites. As bandas satélites mostraram-se como sendo constituídas de sequências de DNA

repetidas e muito longas (Griffiths et al., 2000).

A partir da década de 70, com a descoberta das enzimas de restrição na década anterior,

surgiu o primeiro marcador molecular que possibilitou detectar diferenças entre indivíduos

através de cortes no DNA estudado, o RFLP – Restriction Fragment Lenght Polymorphism

(polimorfismo no tamanho de fragmentos de restrição). Com esta técnica, o DNA genômico

de um indivíduo pode ser isolado e digerido com enzimas de restrição, os fragmentos obtidos

são separados em um gel num processo denominado eletroforese, gerando fragmentos de

tamanho e número variáveis que evidenciam o polimorfismo genético. Os fragmentos são

transferidos para uma membrana de náilon ou nitrocelulose – técnica denominada Southern

blot. A próxima etapa consiste na hibridização do DNA das amostras já imobilizado em

membranas com uma sonda radioativa de DNA complementar ao fragmento de interesse. A

última etapa é a autoradiografia, ou seja, exposição da membrana hibridizada com a sonda

radioativa a um filme de Raios-X, revelando a presença de bandas, que são os marcadores

RFLP (Helentjaris et al., 1986).

Na década de 80, foi desenvolvido pelo pesquisador Kary Mullis uma tecnologia simples

e eficiente que é a reação em cadeia da polimerase – PCR (Polymerase Chain Reaction). Por

meio deste processo é possível multiplicar in vitro e em escala exponencial cópias de um

segmento específico de DNA, na presença da enzima DNA polimerase. A reação de PCR se

baseia na reassociação e extensão enzimática de um par de primers que delimitam a sequência

de DNA de fita dupla, os primers são sintetizados artificialmente e são complementares às

regiões que flanqueiam a região alvo. Cada ciclo de PCR envolve três etapas, desnaturação

17

através da elevação da temperatura para 92°C a 95°C, hibridização, em que a temperatura é

rapidamente reduzida para 35°C a 60°C, e extensão que ocorre quando a temperatura é

elevada para 72°C. Este ciclo é repetido por várias vezes e, ao final da reação, há uma grande

quantidade de DNA de uma sequência específica de interesse. Os produtos da PCR podem ser

visualizados num gel de agarose. Esta visualização é possível com auxílio do brometo de

etídeo, que quando presente no gel se intercala entre as bases nitrogenadas do DNA e o torna

visível com absorção de um comprimento de onda menor e emissão de um comprimento de

onda maior de luz ultravioleta (Mullis & Faloona, 1987). A técnica de PCR promoveu

também o surgimento de novos marcadores moleculares, como por exemplo, os marcadores

RAPD, AFLP, RFLP e microssatélites.

Historicamente, os marcadores moleculares tiveram seu marco em meados da década de

60 com o desenvolvimento de marcadores isoenzimáticos. Até então, todos os estudos de

genética se baseavam no controle por genes associados ou em caracteres morfológicos

(Ferreira & Grattapaglia, 1996). Em níveis populacionais, estudos baseados na eletroforese de

aloenzimas têm provido inúmeras informações sobre a variabilidade genética dentro e entre

populações. Entretanto, por razões concernentes à obtenção de baixos níveis de detecção de

polimorfismo ou condições de estocagem, as aloenzimas nem sempre são consideradas

apropriadas para tais estudos (Scribner et al., 1994).

Com o avanço das técnicas de biologia molecular, foram estabelecidos métodos de

detecção de polimorfismo em nível de DNA. Inicialmente, foram desenhados os marcadores

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Grodzicker et al., 1974) e mais

recentemente técnicas baseadas na amplificação em cadeia utilizando uma DNA polimerase

(PCR – Polymerase Chain Reaction) (Mullis & Faloona, 1987). O surgimento da técnica de

PCR, na década de 80, possibilitou a síntese enzimática de 15 milhões de cópias de

determinados fragmentos de DNA. O desenvolvimento desta técnica viabilizou a concepção

de diversos marcadores, como RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) (Williams et

al., 1990), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Vos et al., 1995) e

microssatélites (Simple Sequence Repeats) (Tautz, 1989). Desde então, os avanços no campo

da biologia molecular vêm promovendo uma verdadeira revolução para estudos de

variabilidade genética (Avise, 2004), cujos resultados contribuem expressivamente para o

estabelecimento de estratégias de conservação de recursos genéticos e manejo de espécies

(Soulé & Wilcox, 1980).

Os microssatélites envolvem o desenvolvimento de primers específicos, que é um

processo elaborado e caro. Mas uma vez que estes estejam disponíveis, o custo da técnica

assemelha-se ao de RAPD, com exceção de que os géis para resolver os fragmentos de DNA

18

devem ser de policrilamida e esses são de custo mais elevado. Uma das maiores vantagens

dessa técnica é o polimorfismo revelado, o que a torna uma das melhores opções para uso na

caracterização de cultivares, especialmente em germoplasma aparentado (Grise et al. 2006).

Segundo Matioli & Passos-Bueno (2001), a variabilidade genética é um instrumento de

investigação muito importante para os pesquisadores em seus estudos quando desejam

verificar afinidades e limites entre as espécies, detectar modos de reprodução e estrutura

familiar, estimar níveis de migração e dispersão nas populações e até mesmo para ajudar na

identificação de espécies ameaçadas de extinção. Os dados básicos para esses estudos, com a

utilização de marcadores moleculares, são locos gênicos que apresentam alguma

variabilidade.

Estudos de diversidade genética em populações naturais têm sido continuamente

desenvolvidos na tentativa de se mensurar o nível de informações herdáveis em indivíduos,

espécies e populações (Lowe et al., 2004). Esses estudos comumente empregam informações

provenientes de marcadores moleculares para estimar os níveis de diversidade e estrutura

genética para um grande número de plantas e animais (Bachmann, 1993). Além disso, o uso

de marcadores moleculares tem permitido o estudo da extensão e distribuição da variação

genética entre espécies e de investigações taxonômicas e evolutivas (O'Hanlon et al., 2000).

Os marcadores moleculares são um recurso muito útil em análises genéticas. Coelho

(2000) ressalta a importância de se considerar o conteúdo informativo dos marcadores de

natureza codominante (RFLPs e SSRs) em relação aos marcadores dominantes (RAPDs e

AFLPs), além de aspectos como custo, tempo necessário para a realização das avaliações, e

dificuldades práticas inerentes à execução de cada técnica.

4.6.1. Marcadores Microssatélites

Os genomas eucariotos são densamente povoados por sequências simples repetidas, as

quais consistem de 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem e que estão espalhadas pelo

genoma de um indivíduo. Tais repetições curtas em tandem (STR - Short Tandem Repeat) ou

SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphisms) ou STMS (Sequence Tagged Microsatellite

Sites) são também denominadas de microssatélites (Nybom et al., 1992). São altamente

polimórficos em plantas, animais e microorganismos. Em plantas seria mais fácil utilizar

microssatélites GA (ou CT) e GT (ou CA). No entanto, os dinucleotídeos AT/TA são também

instáveis em condições de PCR por formarem estrutura hairpin. Assim, cada região

genômica que contenha um determinado número de repetições de uma destas sequências

19

constitui-se num loco genético, altamente variável entre indivíduos e multialélico, portanto,

altamente informativo, figura 3 (Ferreira e Grattapaglia, 1998).

Comparativamente aos RFLPs, os microssatélites proporcionam 3 a 4 vezes mais

polimorfismo ou informação. Entretanto, para o uso rotineiro dos microssatélites, há a

necessidade de primeiro amplificar uma região, posteriormente sequenciá-la e em terceiro

lugar, sintetizar os iniciadores específicos para cada loco. Uma vez feito isto, o loco marcador

pode ser utilizado indefinidamente naquela espécie. Desta forma, existe um custo elevado e

trabalhoso no início, mas o custo subsequente é baixo e a simplicidade a posteriori, é muito

grande. O mapeamento genético e a caracterização varietal para fins de proteção de

germoplasma e conservação de várias espécies estão sendo feitos com o uso dos marcadores

microssatélites (Dantas e Nodari, 2006).

De acordo com Weber (1990), os microssatélites podem ser classificados em: i)

Perfeitos: quando a sequência repetida não é interrompida por qualquer base que não pertença

ao motivo, por exemplo: TATATATATATATATA; Inperfeitos: quando existe entre os

motivos, pares de base que não correspondem ao mesmo, por exemplo:

TATATATAcTATATA e iii) Compostos: quando a sequência possui duas sequencias

repetidas distintas e adjacentes, por exemplo: TATATATAGTGTGTGTGTGT.

Figura 3 – Esquema de análise em gel de marcador microssatélite de três genótipos diplóides de plantas (P1, P2 e F1). Fonte: Dantas e Nodari, 2006

20

Os marcadores microssatélites têm sido apontados como marcadores extremamente

poderosos, sendo notoriamente aplicados em diversas áreas do conhecimento. Os

microssatélites apresentam características altamente desejáveis (Suganuma & Ciampi, 2005),

que são:

� são marcadores co-dominantes, ou seja, ambos os alelos de um indivíduo

heterozigoto podem ser visualizados no gel;

� estão ampla e uniformemente distribuídos pelo genoma dos eucariotos;

� são altamente multialélicos;

� são amplificados via PCR, o que facilita sua obtenção mesmo com poucas

quantidades de DNA;

� uma vez desenvolvidos os primers que amplificam tais regiões do genoma, estes

podem ser facilmente compartilhados entre laboratórios;

� primers marcados com fluorescência apresentam a vantagem de possibilitarem

sistema multiplex, o que permite avaliar rapidamente um grande número de

indivíduos para um grande número de locos em pouco tempo.

O uso de marcadores co-dominantes possibilita a obtenção de informações que fornecem

subsídios para entender a dinâmica evolutiva das espécies auxiliando na adoção de estratégias

de conservação e melhoramento genético, manejo de populações naturais, podendo

determinar o impacto da influência antrópica na variabilidade das espécies (Hamrick, 1989;

Seoane et al., 2001).

Além disso, os microssatélites são considerados bastante robustos por não apresentarem,

em geral, influências ambientais, sendo qualificados como marcadores neutros (Morgante &

Olivieri, 1993; Goldstein & Schlötterer, 1999; Avise, 2004).

Os marcadores microssatélites foram descritos em plantas pela primeira vez por Condit

& Hubbell (1991), que detectaram a presença das repetições (AC)n e (AG)n. No genoma de

plantas superiores a repetição (AC)n é geralmente menos frequente do que em mamíferos,

sendo o motivo (AT)n o mais encontrado, seguido por (A)n e (AG)n. Repetições de

trinucleotídeos e tetranucleotídeos também foram encontrados no genoma de plantas, sendo

os motivos mais frequentes (AAT)n, (AAC)n, (AGC)n, (AAG)n, (AATT)n e (AAAT)n

(Wang et al., 1994). Morgante & Olivieri (1993) constataram em 34 espécies vegetais a

presença de microssatélites, sendo o dinucleotídeo AT o elemento repetido mais comum.

Também constataram que estes marcadores estão em menor frequência que nos vertebrados,

mas em maior frequência que nos invertebrados e fungos.

21

Enquanto o número de repetições de um microssatélite geralmente varia, a sequencia de

bases adjacentes ao microssatélite pode ser única no genoma e conservada (no mesmo loco)

entre diferentes indivíduos da mesma espécie. Assim, pode-se desenhar um oligonucleotídeo

específico para as sequências adjacentes a um dado microssatélite, de forma que, através de

uma reação de PCR será possível amplificar este loco em diferentes genótipos. Como o

número de unidades repetidas em tandem em um microssatélite pode ser variável em

diferentes genótipos, os produtos de amplificação dos diferentes indivíduos mostrarão um

polimorfismo no tamanho do fragmento amplificado (Souza, 2001).

Segundo Slatkin (1995) os microssatélites são marcadores ideais para estudos de

genética e evolução de populações naturais devido ao alto poder discriminatório, à robustez,

confiabilidade, praticidade operacional e por serem marcadores altamente informativos

geneticamente.

Vários trabalhos utilizando SSR foram desenvolvidos com sucesso para avaliar a

diversidade genética entre genótipos, como o desenvolvido por Akkaya et al. (1992) que

demonstraram que SSRs estavam presentes em genótipos de soja e altos níveis de

polimorfismo foram detectados entre os grupos. Foi observada uma média de 7 alelos em cada

3 locos SSRs, permitindo assim a identificação de 43 genótipos de soja.

Outro trabalho que demonstrou a capacidade dos marcadores SSRs foi desenvolvido por

Kijas et al. (1995), mostrando que há grande variação de tamanho nos locos SSRs em

espécies de citros. Neste trabalho foram avaliados acessos provenientes de um cruzamento

intergenérico entre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) e Poncirus trifoliata. Foram

analisados dois locos SSRs quanto à variação e herança alélica, a partir da amplificação e

hibridização com a sonda TAA. Demonstrou-se com este estudo que todas as plantas da

progênie avaliada apresentaram o SSR (TAA) indicando assim que a região flanqueadora é

conservada nos diferentes genomas testados.

Em trabalho semelhante, Saha et al. (2003) avaliaram a presença de SSR em cDNA de

11 acessos de algodão e 4 gêneros próximos. Trinta e um pares de oligos SSR, dos 120

testados, amplificaram fragmentos de cDNA. A análise das sequências mostrou que 25% dos

24 clones de cDNA selecionados aleatoriamente amplificaram regiões contendo repetições e

mostraram que os SSR contendo cDNA foram conservados em duas diferentes espécies de

algodão (Gossypium barbadense e G. hirsutum). Este estudo revelou a importância dos

marcadores SSR para o mapeamento comparativo de genes transcritos.

O emprego da tecnologia dos microssatélites envolve algumas limitações, como a grande

quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento de primers específicos para os

locos de microssatélites de cada espécie. Entretanto, ocorre conservação de sítios

22

microssatélites entre espécies relacionadas, possibilitando aproveitar primers, denominados

heterólogos, que foram desenvolvidos para uma espécie e empregá-los nas demais espécies do

gênero (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

A principal limitação refere-se ao custo e ao esforço inicial requerido para a clonagem e

sequenciamento das regiões que flanqueiam a região microssatélite, para a obtenção de

primers. Os métodos atuais para descobrimento de marcadores baseados em SSR tipicamente

requerem a construção de uma biblioteca genômica, triagem de uma biblioteca para elementos

repetitivos, sequenciamento do DNA de clones positivos, desenho dos primers, seleção dos

locos informativos e caracterização da variação alélica (Zane et al. 2002, Souza, 2001 e

Grattapaglia, 2001). Porém, este custo é amplamente compensado pela ampla gama de

potencialidades de pesquisa e desenvolvimento que se abrem ao se possuir tal tecnologia para

uma determinada espécie (Grattapaglia, 2001). Além disso, uma vez desenvolvidos, o seu

custo de utilização equivale ao de outros marcadores baseados em DNA.

Devido ao alto grau de polimorfismo, os microssatélites têm sido empregados em

diferentes situações na área vegetal. Tais marcadores foram empregados com sucesso na

discriminação entre acessos e cultivares de bancos de germoplasma, detectando duplicações,

mistura de sementes, deriva e cruzamentos não controlados (Melo, 2000; Souza, 2002).

Também foram empregados na determinação do grau de parentesco de indivíduos (Yang et al,

1993 e Melo, 2000), na determinação de origem parental por teste de paternidade (Gaiotto et

al, 2003) e na construção de mapas genéticos de ligação (Wu & Tanskley, 1993, Brondani et

al, 1998). Em espécies arbóreas tropicais, os microssatélites foram descritos e empregados

com sucesso em estudos de sistema reprodutivo, fluxo gênico e estrutura genética de

populações, tais como: Pithecellobium elegans (Chaese et al, 1996), Carapa guianensis

(Dayanandan et al, 1999), Caryocar brasiliense (Collevatti, 2001), Euterpe edulis (Gaiotto, et

al, 2003).

Em genética de populações de plantas, o emprego de microssatélites teve uma grande

contribuição na melhoria das estimativas de parâmetros genéticos, especialmente em

populações com diversidade baixa ou não detectada por outros marcadores. Em estudos de

conservação ambiental, esses marcadores têm uma importância muito grande pela alta

eficiência apresentada (Paetkau, 1995).

4.6.2. Aplicações de Marcadores na Conservação Ambiental

Os estudos voltados para conservação de populações ou espécies de importância

econômica ou em risco de extinção fornecem dados que constituem uma base essencial na

23

tomada de medidas de manejo de populações selvagens ou cultivadas. A concatenação das

diversas áreas de estudos populacionais, tais como biologia, ecologia e genética é uma

tendência atual, sendo que, nesta última, o desenvolvimento de técnicas que possibilitam a

detecção da evolução de diferentes genótipos enriqueceu a gama de ferramentas utilizáveis no

suprimento de necessidades. Dentre estas necessidades estão a identificação de indivíduos e

estimativa do grau de parentesco entre eles, a delimitação de populações de interesse,

estimativa do grau de variabilidade das mesmas, bem como de sua história recente, e

estimativa do grau de similaridade entre populações e espécies, com a construção de árvores

filogenéticas (Marques, 2002).

A biologia molecular tem sido a ferramenta escolhida para os estudos de genética de

populações e que tem acumulado avanços importantes, gerando técnicas cada vez mais

precisas para o exame de segmentos de DNA. Ela tem contribuído também para a descoberta

de variados marcadores moleculares aplicáveis aos mais diversos problemas encontrados no

estudo de populações e às análises estatísticas que permitem desde a estimativa do grau de

variabilidade genética de uma dada população à construção de árvores filogenéticas,

relacionando espécies próximas e elucidando questões de parentesco (Marques, 2002).

Portanto, o sucesso de qualquer programa de conservação é dependente do conhecimento

da quantidade de variação presente na espécie de interesse. Caracteres morfológicos e

agronômicos, usados para a medição da diversidade genética em determinadas populações de

indivíduos possuem uma grande dificuldade na identificação de grupos taxonômicos

discretos. Esta dificuldade deve-se ao fato de que a grande maioria dos caracteres vegetais é

influenciada por fatores ambientais, exibindo variação contínua e um alto grau de plasticidade

fenotípica. Para tentar solucionar estes problemas, técnicas moleculares têm sido utilizadas

para monitorar a variabilidade genética (Parker et al., 1998).

Os recentes avanços na biologia molecular abriram novas perspectivas para a pesquisa

em conservação de espécies e para os estudos de biologia populacional como um todo. Pela

primeira vez a variação encontrada em plantas e animais pode ser analisada no DNA.

Diferenças na sequência genética podem ser diretamente observadas e descritas com um grau

de precisão impraticável há pouco tempo atrás. Os marcadores moleculares são uma destas

técnicas (Marques, 2002).

Os marcadores moleculares estão facilitando a realização de estudos de genética,

taxonomia e evolução de plantas proporcionando um substancial avanço no conhecimento

científico. As principais implicações deste avanço no conhecimento se refletem no poder,

precisão e rapidez na manipulação da variabilidade genética. Assim a conservação de plantas

pode se beneficiar de várias maneiras através dos marcadores moleculares, como na

24

construção de mapas genéticos (Ganal et al., 1991), caracterização da variabilidade genética

(Goldstein & Schlotterer 2001), monitoramento (Sonstebo; Borgstrom; Heun, 2007),

"fingerprinting" (Weising et al., 2005) seleção assistida por marcadores (Lande e Thompson,

1990), clonagem de genes (Chaves, 2002), estudos de crescimento e desenvolvimento das

plantas (Nodari et al., 1992).

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Áreas de estudo

A área escolhida para coleta está localizada na Área de Proteção Ambiental de Pandeiros

(APA-Pandeiros), sob monitoramento do Instituto Estadual de Florestas – IEF/MG, situada na

região Norte do Estado de Minas Gerais, no município de Januária (15° 29’ 7” Latitude Sul e

46° 21’ 32” Longitude Oeste), região de abrangência da Bacia do Rio São Francisco (Figura

4). Nesta área foram escolhidas duas populações para este estudo: a) população 1, presente na

comunidade sede do IEF (Vila) e caracterizada como população explorada pela comunidade e

b) população 2, presente na localidade denominada Pindaibal (população não explorada).

Figura 4 - Localização do município de Januária. Fonte: Galizoni (2005).

25

5.2. Material biológico para estudos genéticos

Para a construção da biblioteca genômica e desenvolvimento dos marcadores

moleculares SSR, o material genético (DNA total) foi obtido a partir de folhas jovens

coletadas de 1 indivíduo adulto (reprodutivo) presente em uma população natural de M.

flexuosa que foram enviadas ao Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa Recursos

Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), Brasília, DF.

5.3. Extração e amplificação do DNA

O DNA foi extraído a partir de 500 mg de tecido vegetal macerado utilizando o protocolo

CTAB 2% descrito por Doyle & Doyle (1990) com as modificações a seguir: (1) Em

eppendorffs de 2 mL identificados para cada amostra foram adicionados 150 mg do tecido

macerado pelo triturador mini beadbeater; (2) foram adicionados 800 µL de tampão de

extração (pré-aquecido a 65ºC), os tubos foram fechados e agitados para ressuspender o tecido

no tampão; (3) foram levados ao banho-maria (65 ºC) por 60 minutos, agitando-os

manualmente a cada 10 minutos; (5) após serem retirados do banho-maria e com a mistura em

temperatura ambiente foram adicionados 600 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e os

tubos foram agitados por 5 minutos invertendo-os no mínimo 20 vezes até fazer uma emulsão

homogênea; (6) os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 12.000 rpm; (7) o

sobrenadante foi transferido para novos tubos também marcados; (8) foram adicionados 70%

(v/v) do volume (≈ 400 µl) de isopropanol gelado, misturado suavemente até formar um

precipitado; (9) os tubos foram centrifugados durante 15 minutos a 12.000 rpm; (10)

suavemente foi descartado o máximo de sobrenadante invertendo os tubos sem perder o

pellet; (11) foi adicionado 1 mL de etanol 70% (v/v) para lavar o precipitado, deixando-o

imerso por 5 a 10 minutos, invertendo-o suavemente; (12) os tubos foram centrifugados

durante 10 minutos a 12.000 rpm; (13) foi retirado o máximo do etanol sem perder o pellet;

(14) foi adicionado 1 mL de etanol 100% (v/v) para lavar o precipitado, invertendo-o

suavemente; (15) os tubos foram centrifugados durante 10 minutos a 12.000 rpm; (16) foi

retirado o máximo do etanol e o pellet secou em temperatura ambiente; (17) cada precipitado

foi dissolvido em 100 µL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0)

acrescido de 1 µL RNAse (10mg/mL) e deixado em overnight. As amostras foram então

armazenadas a -20ºC (Figura 5).

26

Figura 5 – Esquema representativo adaptado das etapas de extração de DNA pelo método

CTAB 2%. Fonte: Romano & Brasileiro, 2005.

5.4. Construção de biblioteca genômica enriquecida

As estratégias clássicas de isolamento de microssatélites envolvem a construção de

bibliotecas genômicas selecionadas para certo tamanho de inserto, e o screening de milhares

de clones com sondas apropriadas (Rassman, Schlötterer e Tautz, 1991).

A construção da biblioteca genômica enriquecida com locos microssatélites foi feita

utilizando o protocolo descrito por Rafalski et al. (1996) com modificações de Buso et al.,

2003, conforme a Figura 6.

A metodologia utilizada neste trabalho foi a da construção de biblioteca genômica

enriquecida para poli AG/TC. Este protocolo envolveu uma série de etapas, e o uso de

controles, principalmente nas etapas de: i) digestão do DNA; ii) seleção dos fragmentos

enriquecidos; iii) amplificação por PCR dos fragmentos enriquecidos; iv) seleção de clones

positivos; v) PCR dos insertos com poli AG/TC e purificação do DNA para o

sequenciamento. Sabe-se que não existem iniciadores específicos para o buriti e testes com

primers entre espécies relacionadas ainda não foram feitos e publicados.

27

Figura 6 – Esquema representativo das etapas da construção da biblioteca enriquecida

com microssatélites. Fonte: Nucci, 2007.

5.4.1. Seleção da enzima para digestão do DNA

Após a extração do DNA total, foi feita uma avaliação da digestão com três diferentes

enzimas de restrição, MseI (↓TAA), Sau3A (↓GATC), e Tsp509 (↓AATT) para verificar a

eficiência da ação enzimática na segmentação do DNA e a que obtivesse maior quantidade de

fragmentos na proporção de 200 a 800 pb. A Tabela 2 mostra os reagentes utilizados no

processo de seleção da enzima.

28

Tabela 2 – Reagentes utilizados no teste da digestão enzimática após a extração do DNA.

Após o preparo da reação de digestão, as amostras foram centrifugadas rapidamente

(spin), sendo que, o tubo 1 continha a MseI e o tubo 2 a Sau3A, ficando ambos os tubos em

estufa a 37 °C em overnight. O tubo 3 que continha a Tsp509 ficou no banho-maria a 65°C

também em overnight. Em seguida o material foi submetido ao processo de eletroforese em

gel de agarose a 2% (p/v), Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X e 4,5 µL de brometo de etídeo para

migração das reações de digestão e quantificação do DNA. Foram utilizados três pesos

moleculares para avaliar o tamanho dos fragmentos que são: 1Kb, Ø174 e Kb Plus. O DNA

foi visualizado com trans-iluminador com luz ultravioleta/366 nm. (Figura 7).

Figura 7 - Gel de eletroforese do ensaio de digestão enzimática com as enzimas MseI,

Sau3A e Tsp509.

Após eletroforese a quantificação das amostras foi estimada pela intensidade de

fluorescência emitida pelo brometo de etídeo sob UV (ultravioleta) em gel de agarose a 1%

(p/v), TBE 1X e 4,5 µL de brometo de etídeo. Essa intensidade foi comparada à de padrões

com pesos moleculares e concentrações específicas e conhecidos de DNA do fago λ (Gibco).

MseI Sau3A Tsp509

Água miliQ (μL) 5,5 μL 6,5 μL 6,5 μL

Tampão 10x 1 μL NEB 2 1 μL React 4 1 μL NEB 1

BSA (10ng/mL) 1 μL

Enzima (10u/μL) 0,5 μL 0,5 μL 0,5 μL

DNA (300 μg/μL) 2 μL 2 μL 2 μL

Total 10 μL 10 μL 10 μL

29

Foram utilizadas 10 amostras de DNA de buriti em diferentes diluições e 4 pesos

moleculares DNA λ (invtrogem) em diferentes concentrações conforme mostra a tabela 3.

Tabela 3 – Amostras utilizadas na quantificação do DNA de buriti.

As amostras foram aplicadas em gel de agarose a 2%, aplicando-se 2 µL de Ficol 15%.

Nas colunas 1, 2, 3 e 4 foi aplicado o peso molecular λ e 10 µL de tampão de carreamento

(TC). O gel correu a 75 volts durante 1 hora (Figura 8).

Figura 8 – Primeira quantificação das amostras de DNA do buriti.

5.4.2. Eluição dos fragmentos de DNA em gel de agarose

Após a primeira quantificação foi realizada uma nova quantificação com um pente

preparado com 4 poços unidos, no qual foi feita a digestão do DNA para o desenvolvimento

da biblioteca usando a enzima Sau3A (Gibco) na concentração de 10U/µL, a qual se mostrou

Tubos Amostras Concentrações

1 DNA λ 2 μL 10 ng/ μL




5 2 μL DNA buriti (amostra 01) 250 ng/ μL

6 2 μL DNA buriti (amostra 01) Diluído 25:1



9 2 μL DN A buriti (amostra 03) Diluído 25:1






30

mais eficiente no teste de digestão enzimática. Nesta reação foram utilizados 55 µL de água

miliQ, 20 µL tampão 10X react 4, 130 µL de DNA (600 ng/µL) e 25 µL da enzima (10U/µL),

totalizando 200 µL, e incubado a 37°C em overnight (Figura 9A). Após foi feito a

quantificação da eluição dos fragmentos de 200 a 800 pb que foram recuperados do gel por

meio de purificação através do kit Qiaquick Gel Extraction (Qiagen) no qual foram utilizados

os marcadores de peso molecular conhecidos. O procedimento de recuperação do DNA segue

os seguintes passos: 1ª etapa o gel a 2% (p/v) da segunda quantificação foi cortado com uma

massa variando em torno de 400 a 430 mg e inseridos em eppendorfs de 2 mL, num total de 6

tubos, os quais foram adicionados 1260 µL da solução QG, em cada tubo. Na 2ª etapa os

tubos foram deixados em banho-maria por 10 minutos a 50 °C, sendo agitados de 2 em 2

minutos. Na 3ª etapa foram adicionados 400 µL de isopropanol, invertendo e agitando, após,

foi montando em uma coluna e centrifugado a 1 minuto. Na 4ª etapa foram adicionados 500

µL de QG e centrifugado por 1 minuto. Na 5ª etapa foram adicionados 750 µL de PE, deixado

reagir por 5 minutos e em seguida centrifugado por 1 minuto. Na 6ª etapa a coluna foi

colocada em tubos de 1,5 mL e o DNA recuperado em 20 µL de água miliQ. A 7ª etapa e

final, 2 µL de DNA digerido (fragmentos de 200 a 800 pb), foi quantificado em gel de agarose

a 2% (Figura 9B).

Figura 9 – (A) Segunda quantificação feita com o pente de 4 poços unidos, utilizando os marcadores Kb e ØX174 (B) Quantificação da eluição dos fragmentos de 200 a 800 pb utilizando o marcador Kb. 5.4.3. Ligação do DNA aos adaptadores e ligação de biotina aos oligonucleotídeos

Nesta parte do desenvolvimento dos microssatélites, a primeira etapa foi a preparação da

biotina para ligação ao Oligo (TC)14. A Tabela a seguir mostra os reagentes utilizados neste

preparo.

A B

31

Tabela 4 - Reagentes utilizados no preparo da biotina.

Após a mistura, a reação foi incubada a 37°C por 30 minutos, logo em seguida foram

aplicados 4 µL de EDTA (0,5 M) para inativação enzimática, a solução foi precipitada com

2,5 volumes com etanol absoluto a -20°C e deixado em overnight.

Na segunda etapa, foi feita a ligação dos adaptadores ao DNA digerido. Os adaptadores

Long SAU (5´ - GAT CGG TGA ATT CGG CTC TAG GTC G - 3´) e Short SAU (5´ - CAG

CTT AGA GCC GAA TTC ACC- 3´) foram ligados aos fragmentos digeridos de extremidade

abrupta com a enzima T4 DNA ligase (Introgen). Foram utilizados 3 µL do adaptador Long

SAU (200 µM) e 3 µL do adaptador Short SAU (200 µM), 20 µL do DNA genômico digerido

no passo anterior, 12 µL do tampão 10X (50 mM Tris-HCl, pH 7,8; 10 mM MgCl2; 10 mM

DTT; 25 µg/ml BSA), 6 µL de T4 DNA ligase (400 U/µL) e 76 µL de água milliQ

autoclavada para completar 120 µL, o volume total desta solução. Esta reação foi incubada a

20°C por overnight.

Em seguida a biotina deixada overnight foi centrifugada por 15 minutos a 13.000 rpm,

lavada 2x com etanol 70% (500 µL). O etanol foi retirado e o material deixado para secar.

Logo após, foi resuspendido em 30 µL de água miliQ.

5.4.4. Enriquecimento da biblioteca - preparo das contas magnéticas para hibridização

No enriquecimento da biblioteca, foram preparadas as contas magnéticas adicionando 1

mg de beads (Dynabeads – Streptavidin Boehring Mannhein) a 10 mg/mL em um tubo de 2

mL, lavados 2x com 900 µL PBS (Phosfate-Buffered Saline) pH 7,0 + 100 µL de BSA a 10

mg/mL injetando 400 µL de cada vez, logo após foi usado um imã para separar as beads da

solução aquosa (Figura 10), depois da separação magnética o sobrenadante foi descartado e as

beads lavadas uma vez com 400 µL de tampão 1X BEW após uma nova separação magnética

o material foi ressuspendido em 200 µL do estoque de 2X BEW e acrescentado 170 µL de

Reagentes Volume (μL)

Água MiliQ 24

Tampão 10x (NeBuffer 4) 4

CoCl2 (0,25 mM 10x) 4

Oligo (TC)14 (100 μM) 2

Biotina 16 ddUP ( 25 nmol) 2

Terminal Transferase (20 U/μL) 4

Total (μL) 40

32

água, deixando as beads mais alcalinas para a ligação com a biotina. Finalizado o processo foi

adicionado 30 µL da solução preparada de Bio-Oligo (biotina mais oligo) e agitado a

temperatura ambiente por 60 minutos no vórtex mixer. Novamente após a agitação a solução

foi lavada uma vez com 400 µL de 1X BEW, depois uma vez com 400 µL de 5X SSPE com

0,1% SDS ressuspendido em 150 µL de 10X SSPE com 0,2% de SDS (pré-aquecido a 65°C)

e deixado a 65°C por 15 minutos e armazenado a 4°C.

Figura 10 – Na seta azul o imã utilizado para separar as contas magnéticas (beads) das

soluções aquosas. Na seta verde o eppendorf com a solução. 5.4.5. Hibridização do DNA+adaptador ao complexo Bio-oligos-conta e PCR para controle do enriquecimento da biblioteca

Terminado o processo de preparação do complexo bio-oligo-conta foi realizada a

hibridização com o DNA ligado ao adaptador, assim foram transferidos 120 µL de

DNA+adaptador para um tubo de 1,5 mL e adicionado 30 µL de água deixando um volume

final de 150 µL. Foi feita uma diluição 1:1000 (1 µL de DNA+adaptador em 999 µL de água)

colocando em um tubo enumerado (tubo 1) servindo de controle e desnaturado a 95°C

durante 10 minutos no bloco térmico (Marca Fisher Scientific). Utilizando o kit Hibridization

Solution a solução foi recuperada e colocada em um novo tubo (tubo 2), lavada 2 vezes com

400 µL 2X SSPE + 0,1% SDS por 5 minutos cada e recuperada a solução - 1ª lavagem (tubo

3) o sobrenadante foi posto em outro tubo - 2ª lavagem (tubo 4), após a solução foi lavada

uma vez com 400 µL 2X SSPE + 0,1% de SDS por 15 minutos a 65 °C. A solução foi

recuperada - 3ª lavagem (tubo 5) e ressuspendida uma vez com 400 µL 2X SSPE (tubo 6). As

33

beads foram ressuspendidas em 200 µL de água (tubo 7). Assim, o controle de enriquecimento

da sonda (AG)14

via PCR com o objetivo de avaliar se houve perda de DNA nas lavagens foi feito

com 7 alíquotas diferentes: 1-DNA controle (1:1000); 2-Solução de hibridização; 3-Solução da 1ª

lavagem; 4-Solução de 2ª lavagem; 5-Solução da 3ª lavagem; 6-Solução de enxague e 7-Solução

com DNA ligado as contas magnéticas. Os reagentes utilizados na PCR estão descritos na tabela

5. A amplificação dos fragmentos por PCR foi realizada utilizando o seguinte programa: 94ºC por

3 minutos ou 94ºC por 2 minutos, 25 ciclos com etapas de desnaturação (45 segundos a 94ºC),

ligação (45 segundos a 56ºC) e extensão (2 minutos a 72ºC); e uma etapa final de extensão de 7

minutos a 72ºC. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 2% corado com

brometo de etídio (Figura 11).

Tabela 5 – Reagentes utilizados na reação de amplificação das sete soluções na hibridização.

Figura 11 – Resultado da PCR para controle do enriquecimento da biblioteca (sete soluções mais o peso molecular distribuído em oito poços). 1° poço (Marcador Ladder Kb), 2° poço (Tubo 1 - diluição 1:1000), 3° poço ( Tubo 2 - solução de hibridização), 4° poço (Tubo 3 - 1ª lavagem), 5° poço (Tubo 4 - 2ª lavagem), 6° poço (Tubo 5 - 3ª lavagem), 7° poço (Tubo 6 - solução de enxague e no 8° poço (Tubo 7 - DNA ligado às beads).

Reagentes Volume (μL) Mix de 8 Reações (μL)

DNA 2

Tampão 10x Buffer + MgCl2 2,5 20

10 μM de Primer SAU 2,5 20

2,5 mM de dNTP 2,5 20

Taq 5U 2 16

Água 4 122,4

Total 25 184

34

5.4.6 – Purificação das reações de PCR após a hibridização

Foram realizadas 36 reações de PCR das beads hibridizadas ao DNA ligado ao adaptador

(Figura 12A) e logo após uma purificação destas PCRs utilizando o kit de purificação QIAquick

PCR Purification (Qiagen®) dividindo o volume em dois eppendorfs de 2 mL com 400 µL cada

um. As beads foram retiradas por separação magnética, o volume distribuído em três tubos em

cinco volumes de PB (2000 µL) inseridos em cada tubo. Em um tubo de coleta com coluna

QIAquick spin foram passados 700 µL por 60 segundos. Depois foi deixado por 1 minuto na

centrífuga para homogeneizar. Após, foi lavado utilizando 750 µL de tampão PE e centrifugado

por 1 minuto, descartado o líquido do fundo, retornado o tubo a coluna e centrifugado mais uma

vez. No final, foram acrescentados 20 µL de água MiliQ no centro para recuperar o DNA, deixado

por 1 minuto e centrifugado por 1 minuto a 12.000 rpm. A quantificação do DNA purificado foi

feita em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo, com 2 µL do marcador molecular

Ladder, 2 µL da amostra de DNA purificado e 2 µL de tampão (Figura 12B).

Figura 12 – (A) Quantificação da PCR das beads. (B) Quantificação do DNA após purificação.

No poço enumerado 1 está o peso molecular ladder, no poço 2 a amostra aplicada não purificada e no poço 3 a amostra purificada.

A B

35

5.4.7. Ligação do DNA ao plasmídeo pGEM-T, transformação e repicagem de colônias

Após a hibridização e purificação, 3 µL dos produtos da PCR (DNA purificado) foram

ligados a 1 µL do vetor pGEM-T Easy Vector (kit Promega) de concentração a 50 ng/ µL (Figura

13), segundo o protocolo fornecido com o vetor plasmidial, utilizando 1 µL de T4 Ligase (3U/ µL)

e 5 µL de tampão T4 ligase 2X, totalizando 10 µL de volume para esta reação que foi incubada

em geladeira (4°C) overnight. Foram preparadas várias placas com meio NZY Agar (Botton-

agar).

Para crescimento das bactérias foram adicionados 50 µL de bactérias competentes

Escherichia coli cepa XL1-Blue armazenadas a -80°C, 1 µL de água e 3 µL de ligação. A

transformação foi realizada pelo procedimento de eletroporação (Chassy et al. 1988; Dower et al.,

1988) montado em uma cuba Gene Pulser® (Biorad) (Figura 14). Em 1 pulso de 1.8 volts no

tempo de 4 a 6 segundos, onde os 50 µL das bactérias mais ligação foram eletroporados e

imediatamente após acrescido 1 mL de meio. Em seguida foi deixado no shaker agitando a 37°C

por uma hora. Acrescentou-se às placas de petri 200 µL de meio NZY Agar (caseína hidrolizada

10g, extrato de levedura 5g, NaCl 5g, MgSO4.7H2O, pH 7,5) contendo 0,013 g de ampicilina, 16

µL de IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) a 0,5 M, 40 µL de X-gal (5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) a 40 mg/mL. Com a ajuda de esferas todo o material

foi espalhado de maneira homegenia na superfície da placa. As placas foram incubadas invertidas

a 37°C por 18 horas em estufa para o crescimento de colônias. No final foram feitas duas placas

MF1 com 100 µL e a MF2 com 50 µL de colônias eletroporadas.

Figura 13 – Representação do vetor de clonagem pGEM-T. Ori = origem de replicação; Lac Z = α-peptídeo -região codificadora da enzima ß-galoctosidade; T7 e SP6 = promotores da RNA polimerase que flanqueiamuma região múltipla de clonagem; T = local de inserção da molécula de DNA exógena; f1 ori = região f1fago; Ampr= gene que confere resistência a ampicilina.

36

Figura 14 – Cuba de eletroporação utilizada no processo de transformação bacteriana.

5.4.8. Seleção de Clones Positivos para SSR

A atividade do gene da enzima β-galactosidase foi um dos critérios utilizados para avaliar

a seleção dos clones. As colônias brancas (recombinantes) possuem esse gene inativo e não

produzem a enzima que cliva o X-gal expressando uma cor branca, consideradas assim como

oriundas da ausência de degradação do substrato cromogênico, portanto sendo dito positivo.

Os clones não recombinantes possuem esse gene ativo sendo capazes de transcrever e traduzir

a enzima, o que torna as colônias azuis sendo fáceis de identificarem na placa de petri,

considerados a partir deste conhecimento negativos.

Logo após a análise das duas placas feitas, o resultado não apresentava colônias azuis e

tinha um alto índice de colônias o que atrapalhava o processo de repicagem sendo necessário

fazer mais duas placas com 50 µL e 25 µL de transformação melhorando o processo de

repicagem e seleção das colônias bacterianas.

Para garantir que cada construção (vetor + fragmento) fosse mantida em condições

apropriadas para análise posterior, foram utilizadas placas DeepWell com fundo em U, com

80 µL por poço de meio LB contendo ampicilina (100µg/ml). As colônias brancas foram

repicadas com a ajuda de palitos estéreis acondicionados em tubos falcon. As placas foram

vedadas com um plástico apropriado, furado em cada poço para entrada de ar e oxigenação do

ambiente, incubadas a 37°C overnight em estufa para o crescimento de colônias (Figura 15).

Após esse período as placas foram armazenadas em freezer -20°C por 30 minutos.

37

Figura 15 - Placa DeepWell com fundo em U. (A) Vista superior da placa. (B) Vista basal da

placa.

5.4.9. PCR dos insertos

Com o objetivo de identificar os clones contendo microssatélites e verificar a eficiência

do procedimento de enriquecimento e clonagem, os clones positivos identificados na

hibridização foram diluídos em 80 µl de água ultrapura estéril e expostos a 95°C por 5

minutos. Logo em seguida foi realizada uma reação de amplificação dos insertos diretamente

das colônias obtidas na etapa anterior, utilizando o primer M13F e M13R. Esta suspensão de

células foi utilizada em uma reação com volume final de 10 µL por tubo contendo as

seguintes concentrações dos reagentes: 1,0 µL de tampão 10X (50 mM KCl; 10mM de Tris-

HCl, pH 8,9) na concentração de 1,5 mM, 0,06 µL de MgCl2 (2,5 mM), 0,6 µL de dNTP (2,5

mM), 0,12 µL de M13F e M13R (10 mM), 0,2 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL), 0,8 µL

de BSA, 1 µL de DNA utilizado da diluição das colônias, totalizando um volume final de 10

µL. Foi feito um mix para 96 reações. Esta reação foi submetida a um passo inicial de

desnaturação a 94 ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos (94 ºC/1 minuto, 56 ºC/1 minuto, 72

ºC/1 minuto) e um passo final de extensão a 72 ºC por 7 minutos. Para controle, 2 µL do

volume da reação de PCR e 2 µL de tampão de carregamento foram utilizados na eletroforese

em gel de agarose 2% (Figura 16).

A B

38

Figura 16 – Resultado da eletroforese (quantificação pré-reação de sequenciamento) da PCR das amostras de inserto. As setas em azul indicam o marcador Ladder 1Kb. Foram feitas 3 fileiras com 14 poços cada e uma fileira com 8 poços.

5.4.10. Reação de Exo/Sap

A reação de PCR faz uso de dois primers, dNTPs e DNA polimerase para produzir

múltiplas cópias de uma sequência de DNA específica. Quando a reação termina a maior parte

dos primers e dNTP permanece intacta, e, se não retirados, irão interferir no sequenciamento.

As enzimas Exonuclease I (Exo I) e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) removem estes

materiais indesejados (Figura 17). Depois deste procedimento o sequenciamento é feito

normalmente.

Nesta reação foram utilizados 5 µL do PCR de inserto, 2 µL do mix de Exo/Sap com as

enzimas Exo na concentração de 10U/µL e a SAP 1U/µL. Foram adicionados 26,1 µL de

tampão tris 50 mM pH 8,0 e permaneceram na programação de 37°C por 30 minutos e 80°C

por 20 minutos no termociclador. Logo em seguida a reação foi deixada a 4°C por 60

minutos.

39

Figura 17 – Esquema da reação de ExoSap utilizada no processo.

Fonte: http://www.icb.ugmf/ibem/protocolos/exosap.html

5.4.11. PCR e reação de sequenciamento

Segundo Applied Biosystems, (2001) o sequenciador automático de DNA ABI Prism®

3700 Genetic Analyzer, dispõe de um sistema de 16 capilares que injetam uma carga

eletrostática nas amostras que migram através dos capilares de um pólo negativo até o pólo

positivo localizado no final do capilar, encerrando a corrida eletroforética realizada em

polímero POP Version 6 (Applied Biosystems®). Os capilares dispõem de uma janela de

detecção acoplada a um sistema de laser e a uma câmera. O feixe de raios laser, ao passar pela

janela atravessando os capilares, incita as bases marcadas que produzem um comprimento de

onda característica de cada base específica (A, T, C ou G). O comprimento de onda é então

detectado pela câmera que transmite a informação ao computador acoplado ao seqüenciador.

Este computador dispõe de um software, Data Colection® (Applied Biosystems®), que

controla as operações do seqüenciador, bem como coleta e interpreta os dados produzidos. Os

resultados coletados são posteriormente analisados pelo software Sequence Analisys®

(Applied Biosystems®) responsável pela produção de um eletroferograma, que é

representativo da sequência de bases detectadas nas amostras. O eletroferograma é

visualizado pelo aplicativo Chromas, que também pode traduzir o eletroferograma em um

arquivo *.txt (*nome da amostra) em formato FASTA. O formato FASTA é um formato de

texto padrão utilizado para submissão de sequência a diversos programas de bioinformática,

40

como por exemplo, o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990). O

tamanho do capilar utilizado neste trabalho foi o de 50 cm, que sequencia até

aproximadamente 500 bases por corrida.

As reações de sequenciamento foram feitas utilizando o Kit de sequenciamento BigDye®

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) para o modelo ABI 3700 da

Applied Biosystems (Figura 18). O produto foi amplificado seguindo os seguintes volumes para

a amplificação dos fragmentos via PCR: 0,5 µL de primers M13F (3,2 ng/µL), 1 µL do

template da exosap ; e 1 µL do BigDye o qual possui uma marcação fluorescente que

evidenciou o processo, 1,5 µL de tampão do kit de sequenciamento 5x, 6 µL de água,

totalizado 10 µL de reação final por amostra. Foram realizadas 18 reações para este

sequenciamento. As amplificações foram feitas utilizando um termociclador nas seguintes

condições: 94°C por 2 minutos, 30 ciclos com etapa de desnaturação (94°C por 10 segundos);

hibridização (50°C por 10 segundos) e de extensão (60ºC por 4 minutos) conforme

recomendação do fabricante.

Figura 18 – (A) Sequenciador de DNA capilar ABI 3700 da Applied Biosystems (B) Área

interna do sequenciador denotando os capilares (seta azul).

Os produtos das amplificações foram purificados seguindo o protocolo do Kit de

sequenciamento, foram inseridos 2,5 µL de EDTA (125 mM), 25 µL de etanol absoluto e

selado com tampa plástica aderente. O material foi misturado e invertido quatro vezes e

incubado a 15 minutos a temperatura ambiente. Em seguida foi centrifugado a 30 minutos

(3.000 rpm) a 4°C e toda a fase líquida foi retirada imediatamente por inversão. Após, dado

um spin foi com a placa invertida e protegida com papel toalha até 180 rpm; foram

A B

41

adicionados 50 µL de etanol 70% (tampada com o mesmo adesivo); centrifugada a 4°C por 15

minutos (1650 rpm) e todo o etanol foi retirado invertendo a placa; dado um spin com a placa

ainda invertida por 1 minuto a 180 rpm. A placa foi posta aberta pra secagem a 15°C no

termociclador protegida da luz e posteriormente deixada à temperatura ambiente.

Ao ser levada ao sequenciador, foram inseridos 9 µL de formamida, e o material

desnaturado a 95°C por 5 minutos e colocado no gelo para um choque térmico e a completa

desnaturação do DNA.

5.4.12. Desenho dos iniciadores

Os eletroferogramas produzidos pelo sequenciador foram analisados e editados através do

programa BioEdit Sequence Alignment Editor (versão 5.0.9) criado pelo Prof. Tom Hall do

departamento de microbiologia da Universidade do Estado da Carolina do Norte (USA) onde

cada sequencia foi conferida visualmente concatenando-se as sequencias dos primers forward

e reverse de cada amostra e seu respectivo alinhamento e selcionando sequências repetidas in

tandem com um, dois ou três nucleotídeos (Hall, 1999).

O próximo programa utilizado foi o STADEN (Staden, 1996), para obtenção da fita

consenso para posterior desenho de primers, cuja função foi desenhar os pares de primers

complementares às sequências de DNA que flanquearam os microssatélites presentes na

amostra. Foram especificados alguns parâmetros para o desenho dos pares de primers no

programa STADEN (Tabela 6).

Tabela 6 - Parâmetros específicos selecionados para os desenhos dos primers SSR no Programa STADEN.

Classe Parâmetro

Temperatura de hibridização mínimo: 56°C ótimo: 60°C máximo: 63°C

Quantidade de GC no primer mínimo: 30% máximo: 70%

Tamanho do produto mínimo: 100pb máximo: 300pb

42

A tabela 7 a seguir contém a relação dos 30 primers fabricados e utilizados no processo

de validação, descrevendo o tamanho do fragmento, a sequencia forward e reverse e as

unidades de base que compõe os primers.

Tabela 7 – Relação dos 30 primers desenhados para o teste de validação

.

5.4.13. Otimização e validação dos locos SSR

Neste trabalho, 160 regiões microssatélites foram desenvolvidas para a espécie, sendo

que apenas 30 pares de primers (forward e revese) foram desenhados, sintetizados e testados.

Os iniciadores sintetizados foram testados em uma série de reações de PCR utilizando DNA

de 2 populações selecionadas na APA-Pandeiros, totalizando 26 indivíduos de Mauritia

flexuosa, a fim de se obter a temperatura de hibridização ideal para cada par de iniciadores.

Assim, foram testadas temperaturas que variaram entre 48 e 62°C. A reação de PCR consistiu

da seguinte combinação de reagentes: 3 ηg de DNA, tampão de PCR 1x (10 mM Tris-HCl,

pH 8,3; 50 mM KCl), 1,5 mM de MgCl, 2,5 a 7,5 pmol de iniciadores, 200 µM de dNTP, 1 U

Nome Microssatélite Tamanho Fragmento Primer Foword Primer Reverse

MF 1 (GA)15 219 AATTCGATTCAGCCTAGAGCC CTTCCTCTTCCTCTTCCCAATC

MF 2 (GA)19 110 TCACCGATCTAACTTGACCAAA TCCTTTCTCTCTCTTGACCCAC

MF 3 (GA)19 110 TCACCGATCTAACTTGACCAAA TCCTTTCTCTCTCTTGACCCAC

MF 4 (AG)11 (AG)7 (AG)6 (AG)6 205 GAAGATAATGAGGGCTTCTGGA TCTTTCCATCTCTCTCTCCCTC

MF 5 (AG)23 169 AATTCGATTCAGCCTAGAGCC CTCCCTATCTTTCTCTCTGCCC

MF 6 (GA)11 (GA)13 234 AATTCGATTCAGCCTAGAGCC TTTCTCCCTACCTCAGTCAACC

MF 7 (GA)17 361 TACGACTCACTATAGGGCGAA CCCGATCTCTCTTCTTCTCTT

MF 8 (AG)23 163 ACCGATCATGGTGGTAGAACTC AATTCACCGATCAAACCCC

MF 9 (AG)19 143 ATACATCGCGCATATCTCACTG ATTCCCACACTCCCTCACTAGA

MF 10 (AG)8 178 AATTCGATTCAGCCTAGAGCC CCCTTCCTCTCTCTCGCTTACT

MF 11 (AG)17 135 AGAGATTGGGGAGGGGAAG TCTCCCTCTCTCTTTCGTTGTC

MF 12 (GA)7 (GA)8 158 AAACCGAGAGAGAGGGAGAAAG CTCGTCTGATTTCCTCTTCCTG

MF 13 (GA)14 333 CTAGAGAGGGAGGAGAAGGGAG TACTCAAGCTATGCATCCAACG

MF 14 (AGA)11 232 CGGGATAGGAGGTTCAGTGTAG CTCCACCTCTTTGTCTGATTCC

MF 15 (AG)11 261 TCGACGAAGATGAAGAATAGGG CGAATTCACCGATCTACTCCTC

MF 16 (AG)7 (GA)10 182 CTGACAAGGTGGCTTACGTTTT ACCTCCTCCTTCCCTATTTCCT

MF 17 (AG)7 (AG)8 191 AGGGCTTCTGGAAGTGTCATAG TCCTCTTCTTCTCTCCCTCTTG

MF 18 (CT)16 178 ATCATCGAAGTTTCATCCATCA CAGAGGGAAATGAACACAGAGA

MF 19 (AG)18 248 AATTCGATTCAGCCTAGAGCC ATCACCGAGCATTCCCCT

MF 20 (GA)8 108 GTGGGGAGGAATACGAGGA ATCTATCTCCCTCTCTCTGCCC

MF 21 (AGA)10 182 GGTCGTTGAGGTGGTAGGTG CCTCCTCCTTTCTTCGTCTTCT

MF 22 (AG)14 (GA)6 190 AGGGGAGGACATAGAGGAAGAG TGTATGTGAGGACGAAGGAGAA

MF 23 (GA)16 173 GATTGTGGGTCATAGTACAAG TATCTCTCTCTACCCCTCG

MF 24 (GA)10 253 AATGGAGGTTAGTTGGAGTTC GATCTCTCTTATCTCTCTCTATCTCTC

MF 25 (GA)18 273 AATTCACCGATCAGGGAGG CGATCTCTCTTCTTCTCTTTCTCC

MF 26 (GA)13 146 TAGTGAACCGAGAGAGAGAGGG CTCCTTCCTGAGATTTCCTCC

MF 27 (AG)6 (GA)12 129 TGGCACACAATAAAATCGAGAG TCTGAGCTTCTCTTTCCCTCCT

MF 28 (CT)9 174 ACCGATCGTTAATGACCTCTGT ACCATGATTACGCCAAGCTATT

MF 29 (GA)8 (GA)9 176 GATCGGGTGAGGAATTTTGAG CTCTCTCTCTTCCCTCTCGGAT

MF 30 (GA)9 159 GATCGGGAGGAGACAGTGG TTGTCTTGTTCTCTCTCTCGCC

43

de Taq DNA polimerase e água ultrapura. As amplificações foram padronizadas, variando a

temperatura de hibridização e as concentrações de MgCl2, DNA molde, dNTP e enzima.

Para a reação foi utilizado o seguinte programa no termociclador Applied Biosystems

9700: 94°C por 5 minutos, 35 ciclos a 94°C 1 minuto, temperatura de hibridização em teste

por 1 minuto, (48°C a 62°C) por 1 minuto e extensão de 72°C por 1 minuto. A temperatura

de hibridização era variada de modo a aumentar a especificidade e eficiência de hibridização

de cada par de primer e 72°C por 10 minutos. Os produtos amplificados foram visualizados

em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. A partir dos resultados das

amplificações, as detecções de polimorfismo foram realizadas em géis desnaturantes de

poliacrilamida 5% de alta resolução corados com nitrato de prata (Creste et al., 2001).

Primeiramente todos os 30 iniciadores foram testados na forma de gradiente com uma

única temperatura de anelamento e posteriormente testados variando as temperaturas de 2°C

em 2°C até que fossem acertadas.

Após uma baterias de testes de validações dos primers sintetizados, apenas 6 foram

considerados polimórficos para análises genéticas com buriti (Tabela 8). Os outros primers

mostraram-se monomórficos ou com hibridizações inespecíficas.

Utilizando os primers validados, duas populações com uma distância média de 40 km

entre uma população e outra, foram utilizadas na tentativa de verificar a veracidade do

anelamento e geração do polimorfismo. As populações eram do município de região de

Januária – MG das regiões de Pindaibal e Vila.

Tabela 8 – Relação dos primers validados que apresentaram polimorfismo para M. flexuosa.

Nome Microssatélite Amplitude Alélica (pb) Tm Número de Alelos

MF03 (GA)19 101 a 209 56°C 29

MF08 (AG)23 107 a 155 56°C 18

MF11 (AG)17 101 a 241 48°C 17

MF12 (GA)7 (GA)8 103 a 223 48°C 29

MF17 (AG)7 (AG)8 103 a 213 56°C 26

MF18 (CT)16 113 a 213 56°C 20

44

5.5. Metodologia de análise estatística dos dados 5.5.1 - Estimativa das frequências alélicas

As frequências alélicas descrevem a variação para cada loco e suas estimativas foram

obtidas pelo software Population Genetic Analysis (PopGene) Versão 1.31 (Yeh & Boyle,

1999) por meio da contagem direta do número de alelos por loco, dividido pelo número de

alelos no loco (Nei & Kumar, 2000).

Em que:

pij - frequência do alelo i na população j;

nij - número de ocorrência do alelo i na população j;

n.j - número total de alelos amostrados na população j.

5.5.2. Estimativa do tamanho dos fragmentos

A determinação do tamanho dos fragmentos alélicos foi feita diretamente no gel

utilizando o programa Biorad Quantity One Versão 4.6.3, o qual foi capaz de medir

corretamente o tamanho dos fragmentos comparativamente com o valor do peso molecular

estabelecido (Figura 19).

Figura 19– Screen do tamanho dos fragmentos (MF18) do gel de poliacrilamida a 5% feito pelo programa Biorad Quantity.

45

Os fragmentos dos alelos de interesse foram marcados pelo programa na cor amarela com

um traço na horizontal, o traço em amarelo na vertical indica a coluna de aplicação. Com

relação ao peso molecular, seus níveis foram marcados com um traço azul na horizontal sendo

a coluna marcada com um traço na vertical também na cor azul. Na avaliação dos fragmentos

é possível ver que os alelos de interesse foram marcados pelo programa entre as regiões de

100 pb (número 11 do ladder em azul) e 300 pb (número 9 do ladder em azul). Alguns alelos

foram marcados a partir de 300 pb mas foram considerados inespecíficos.

5.5.3 - Estimativa dos índices de diversidade genética

A partir das frequências alélicas foram obtidos os seguintes índices de diversidade

genética: porcentagem de locos polimórficos (P), número médio de alelos por loco (A),

heterozigosidade média observada (Ho), heterozigosidade média esperada ou diversidade

gênica (He) de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg, número observado de alelos

(na), número efetivo de alelos (ne) e índice de fixação (f) (Berg & Hamrick, 1997).

Esses índices foram obtidos utilizando-se o programa Population Genetic Analysis

(PopGene) Versão 1.31.

a) Porcentagem de locos polimórficos (P): Um loco é considerado polimórfico quando

a frequência de seu alelo mais comum não exceder 0,95 ou 0,99. Usa-se o critério 0,95

quando o tamanho amostral é menor que 50 indivíduos, e para amostras que excedem 50,

usa-se o critério 0,99 (Lewontin, 1972). Esta medida é obtida pela média aritmética do

número de locos polimórficos pelo número total de locos.

b) Número médio de alelos por loco em cada população (A): O número médio de

alelos por loco (A) em cada população foi obtido pela divisão do número total de alelos

pelo número total de locos. Esta estimativa fornece uma idéia da distribuição dos alelos

nas diferentes populações estudadas.

c) Heterozigosidade média observada (Ho): Para se obter a heterozigose média

observada, as proporções obtidas para cada loco foram somadas e divididas pelo número

total de locos analisados.

46

Em que:

Ho - estimativa da heterozigose observada; Pii - frequência dos genótipos homozigotos.

d) Heterozigosidade média esperada (He): A heterozigosidade esperada para cada

loco, em uma dada população, foi obtida a partir das frequências alélicas, segundo as

frequências genotípicas esperadas, conforme equilíbrio de Hardy-Weinberg, de acordo

com Nei (1987).

Em que:

He - estimativa da heterozigose esperada; n - número de indivíduos amostrados na população em questão; pi2- frequência alélica estimada do i-ésimo alelo.

e) Índice de Fixação Wright, 1978 (Fis) – O coeficiente, que mede a correlação entre os

alelos nos gametas que formaram um zigoto (Wright, 1931), foi obtido por loco e pela

média dos locos, a partir das seguintes relações:

Em que:

f - estimativa do índice de fixação de Wright; He- estimativa da heterozigose esperada; Ho - estimativa da heterozigose observada.

Este coeficiente permite acessar os níveis de fixações alélicas, informando o grau de

endogamia dentro das populações. Para esta estimativa, foram estabelecidos intervalos de

confiança a 95% de probabilidade, utilizando-se o procedimento de bootstrap com 10.000

repetições (Weir, 1996).

47

f) Outros dados também foram analisados como número observado de alelos (na) e o

número efetivo de alelos (ne).

5.6. Transferibilidade para a espécie Orbignya oleifera (Burret)

Espécies filogeneticamente próximas podem apresentar homologia em sequências

flanqueadoras aos locos SSR permitindo a transferibilidade (Grattapaglia et al., 1998).

A espécie O. oleifera, de alto potencial de extração e utilização econômica pertencente a

mesma família do buriti (Arecaceae). Segundo Grattapaglia et al., 1998, a transferibilidade de

primers entre espécies correlacionadas vem se desenvolvendo e demonstra certa eficiência no

processo o que pode contribuir para o estudo da estrutura genética bem como outras pesquisas

relacionadas.

Estudos de transferibilidade já foram realizados de espécies como Eucalyptus (Brondani

et al., 1998), para indivíduos da família Meliaceae (White & Powell, 1997) e de Eucalyptus

spp. para Eugenia dysenterica (Zucchi, 2002) e confirmam a eficiência da transferibilidade.

A reação de PCR para este teste de transferibilidade consistiu da seguinte combinação de

reagentes: 3 ηg de DNA, tampão de PCR 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl), 1,5 mM

de MgCl, 2,5 a 7,5 pmol de iniciadores (forward e reverse otimizados), 200 µM de dNTP, 1U

de Taq DNA polimerase e água ultrapura.

Cada um dos seis primers validados foi testado numa mesma população, sendo que após

a verificação de polimorfismo nos, outras populações foram testadas. A finalidade desta

transferibilidade neste trabalho foi comprovar a eficácia dos iniciadores em espécies

correlacionadas.

48

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. Desenvolvimento de bibliotecas enriquecidas com locos microssatélites

No teste de digestão enzimática das três enzimas testadas (MseI, Sau3A, e Tsp509)

Sau3A foi a que mostrou melhor eficiência na digestão do DNA genômico produzindo o

perfil adequado de fragmentos (200 a 800 pb) para a construção da biblioteca (Figura 7) o que

pode ser confirmado na eluição dos fragmentos de acordo com a Figura 9B.

A ligação dos adaptadores foi importante para garantir que cada fragmento tivesse uma

terminação comum e conhecida. A utilização da biotina e dos oligos (TC)14, juntamente com

as contas se mostraram eficientes na separação magnética dos fragmentos contendo as regiões

microssatélites.

Com relação ao resultado da PCR para o controle do enriquecimento da biblioteca, o

mesmo foi satisfatório neste objetivo, não demonstrando perda de DNA nas lavagens, o que

ficou evidente na análise dos tubos 3, 4, 5 e 6 na Figura 11.

A reação de exosap utilizada no desenvolvimento dos marcadores apresentou um bom

rendimento na exclusão do excesso de primers e fragmentos de DNA que poderiam danificar

o processo de sequenciamento e causar queda na sua qualidade, o que pode ser comprovado

com o excelente sequenciamento realizado.

No processo de seleção dos clones positivos, algumas placas foram incubadas com um

tempo um pouco maior a fim de garantir que as colônias azuis (que não receberam o inserto)

evidenciassem, sendo assim não sequenciados falsos positivos.

Na primeira reação de transformação de células competentes E. coli XL1-Blue (Figura

20) com a ligação do fragmento de DNA ao plasmídeo obteve-se uma eficiência média de

95%.

De duas placas que foram semeadas contendo 25 µL de NZY + ampicilina, IPTG e Xgal,

a placa 1 continha um total de 2.428 colônias sendo 91 colônias azuis, (3,74%). A placa 2

continha um total de 3.280 colônias sendo 148 azuis (4,51%).

49

Figura 20 – Representação de uma placa de petri contendo as bactérias Escherichia coli XL1-BLUE transformadas. As colônias brancas estão representando os indivíduos positivos (que receberam o inserto corretamente) e as azuis os indivíduos negativos (que não receberam os insertos).

6.2. Enriquecimento e reenriquecimento da biblioteca genômica de microssatélites

Após o primeiro sequenciamento no ABI 3700, os resultados demonstraram ter

encontrado 30% de regiões microssatélites dos 96 insertos seqüenciados, necessitando de um

reenriquecimento do processo na tentativa de melhorar a resposta na procura das regiões SSR,

as quais com este valor foram considerados insuficientes. Diante disso, mais placas foram

cultivadas e o processo foi otimizado de forma eficiente. Após todo o processo de

reenriquecimento, as novas placas foram sequenciadas.

O enriquecimento de bibliotecas genômicas é uma metodologia simples para o

isolamento de microssatélites, sendo amplamente aplicado para uma grande variedade de

espécies, porém com uma eficiência variável de recuperação de sequências contendo

microssatélites (Butcher et al., 2000; He et al., 2003). Alguns relatos demonstram uma baixa

eficiência, de 1,7% em batata (Ashkenazi et al., 2001) e 2,1% em mamão (Santos et al.,

2003); outros relatos apontam para alta eficiência de enriquecimento, de 46% em Lolium

perenne L. (Jones et al., 2001) e de 28% em melão (Ristschel et al., 2004). Já bibliotecas

genômicas convencionais (sem enriquecimento) possuem uma baixa eficiência de recuperação

de sequências contendo microssatélites. Em batata, por exemplo, Ashkenazi et al. (2001)

relatam uma eficiência de 0,37% na recuperação de microssatélites utilizando esta abordagem.

6.3. Sequenciamento, análise das sequências e validação dos primers

Neste estudo, os resultados obtidos após o sequenciamento foram satisfatórios. No total,

após o reenriquecimento foram analisados 576 clones positivos dos quais foram encontrados

160 regiões microssatélites (27,7%). Destas regiões, 30 foram selecionadas (18,75%) de

acordo com os critérios (Tabela 8) para desenvolvimento dos iniciadores forward e reverse.

50

Dentre as 30 sequências analisadas algumas apresentaram motivos que foram

classificados como perfeitos, compostos ou com sequências de dinucleotídeos e

trinucleotídeos (Figura 21).

Figura 21 – Porcentagem dos motivos microssatélites perfeitos e compostos e as frequências de motivos dinucleotídeos e trinucleotídeos.

Esses resultados são interessantes, visto que microssatélites perfeitos são considerados,

em média, como mais polimórficos do que aqueles com interrupções dentro dos motivos

(Weber, 1990), fazendo com que se tenha preferência no isolamento e desenho de primers

para este tipo de microssatélite (Ellegren, Primmer e Sheldon, 1995).

Com o auxílio do Bioedit os eletroferogramas foram analisados (Figura 22) e as

sequências microssatélites classificadas. Por meio de ferramentas disponíveis neste programa

foram retiradas das sequências as regiões correspondentes ao vetor e ao adaptador, restando

apenas à sequência do inserto.

Figura 22 – Eletroferograma (MF9) contendo região microssatélite rica em AG do DNA de

buriti (M. flexuosa).

51

A redundância pode ser atribuída à presença de clones duplicados pelo próprio

procedimento da PCR durante as etapas de enriquecimento, além da presença de locos

duplicados no genoma. Sequências com mais de 90% de similaridade foram consideradas

redundantes, sendo que muitas delas apresentaram variações na composição de nucleotídeos.

Paniego et al. (2002), adotaram critérios menos restritivos para analisar uma biblioteca

enriquecida com microssatélites de girassol, utilizando similaridade ≥ 85% para considerar as

sequências como redundantes.

Dos 30 primers, analisando ambos (forward e reverse), 6,6% apresentaram redundância e

93,4% não apresentaram similaridade nas sequências (Figura 23), enquanto que analisando

apenas os primers forward, 16,6% apresentaram redundância e 83,4% não mostraram haver

similaridade (Figura 24). A análise apenas dos primers reverse não demonstrou haver

redundância nas sequências. Nos primers validados não houve redundância entre as

sequências.

Figura 23 – Porcentagem de redundância nos primers forward e reverse.

Figura 24 – Porcentagem de redundância nos primers forward.

52

Na análise das Figuras 23 e 24 é possível verificar que a redundância somente dos

iniciadores SSR forward se apresentaram com maior porcentagem do que a redundância em

ambos os iniciadores (forward e reverse).

Os motivos microssatélites mais frequentes encontrados nos trinta primers desenhados

foram os dinucleotídeos AG e GA, outros motivos apareceram em porcentagem pequena,

inferior a 10%, como AGA e CT (Figura 25).

He et al. (2003) construíram uma biblioteca genômica de amendoim e encontraram uma

redundância de 67% das sequências de microssatélites. Já em Lolium perenne L., Jones et al.

(2001) encontraram uma redundância de 16,4%, valor este próximo ao encontrado neste

trabalho para os primers forward.

Figura 25 - Motivos microssatélites mais frequentes identificados em Mauritia flexuosa.

A frequência das classes de microssatélites é bastante variável em plantas (Wang et al.,

1994). Numa revisão feita por Powell, Machray e Provan (1996), estes autores relataram que

os motivos AG são mais abundantes no genoma de plantas do que os motivos AC,

diferentemente do que ocorre no genoma de mamíferos (Weissenbach et al., 1992).

Entretanto, ainda existe uma discordância sobre o assunto, uma vez que em algumas espécies

os motivos AG são mais abundantes do que os AC (Brondani et al., 1998; Varshney et al.,

2000) e, em outras, os motivos AC são mais frequentes (Echt e May-Marquardt, 1997; Bryan

et al., 1997; Butcher et al., 2000).

Os fatores responsáveis pela diferença em abundância dos motivos dos microssatélites

entre os vários gêneros em plantas ainda não são muito bem esclarecidos (Echt e May-

Marquardt, 1997). Contudo, a escolha das enzimas de restrição pode influenciar no número e

no tipo de repetição encontrados na construção das bibliotecas genômicas (Hamilton e

53

Fleischer, 1999). A construção de bibliotecas genômicas enriquecidas com microssatélites,

também, tornou-se uma prática rotineira nos últimos anos em plantas (Zane, Bargelloni e

Patarnello, 2002), sendo que a maioria delas utiliza sondas de dinucleotídeos, principalmente

AG e AC, embora, alguns autores afirmem que os dinucleotídeos AT sejam os mais

abundantes nos genomas vegetais (Primmer et al., 1997). No entanto, os dinucleotídeos AT/TA

são também instáveis em condições de PCR por formarem estrutura hairpin.

Considerando os 30 pares de primers desenhados e sintetizados, todos amplificaram

corretamente. Destes, apenas 6 se mostraram polimórficos (MF3, MF8, MF11, MF12, MF17

e MF18), 24 amplificaram apresentando muitas bandas inespecíficas (MF16, MF14, entre

outros) e monomórficas (MF7, MF16, MF15, entre outros).

Outros estudos envolvendo palmeiras, conforme Nucci et al. (2007), foram feitos visando

o desenvolvimento de marcadores microssatélites para macaúba (Acrocomia aculeata). Neste

estudo, de um total de 196 clones positivos, 174 (88,78%) tiveram pelo menos uma região

microssatélite. Primers foram desenhados usando 77 (44,25%) sequencias e 36 (46,75%)

foram sintetizadas e testadas. Oito pares de primers (22,22%) mostraram alto polimorfismo,

os quais foram usados para avaliar geneticamente populações de macaúba. Neste estudo em

macaúba foi utilizado na clivagem do DNA genômico a enzima RsaI, e no presente estudo, a

Sau3A, por esta ter mostrado melhor eficiência na digestão do DNA genômico produzindo o

perfil adequado de fragmentos (200 a 800 pb) para a construção da biblioteca.

Comparativamente, neste estudo envolvendo o buriti, do total de 576 clones positivos foram

encontradas 160 regiões microssatélites (27,7%), a partir das quais foram desenhados e

testados 30 primers (18,75%). A partir destes iniciadores desenhados e testados, seis

apresentaram polimorfismo (20%), valor este próximo do encontrado por Nucci et al. (2007)

em macaúba.

6.4. Análise da Variabilidade Genética

6.4.1. Estimativa do tamanho e das frequências alélicas

O tamanho dos fragmentos encontrados variou de 101 pb (locos MF11 e MF03) até 241

pb (loco MF11). Em uma proporção média ocorrem 11,6 alelos por loco na população 1 e

11,5 alelos por loco na população 2.

Para a determinação da estimativa da variabilidade genética de M. flexuosa, foram obtidas

as frequências de 24 alelos distribuídos nos seis locos polimórficos para as duas populações

estudadas (Tabelas 9 e 10).

54

Tabela 9 – Estimativa da frequência alélica na população 1 (Vila)

Na população 1, localizada na APA Pandeiros região da Vila, a partir da avaliação das

frequências obtidas, alguns alelos foram apresentados como raros considerando que

apresentam frequência menor que 0,05. Dentre os locos o MF11 apresentou o menor número

de alelos enquanto o MF12 apresentou o maior número.

O loco MF3 apresentou 12 alelos, sendo que os de menor frequência (0,0417) foram os

alelos G, L, M, Q, R e T e o alelo V o de maior frequência encontrado (0,2500). No loco MF8

foi encontrado um total de 13 alelos, sendo que os de menor frequência (0,0417) foram os

alelos J, L e M e o alelo de maior frequência encontrado foi o alelo H (0,3333). No loco

MF11 com um total de 10 alelos, a menor frequência foi de 0,0417 para os alelos A, C e M e

uma frequência maior de 0,2083 para o alelo K. No loco MF12 com 14 alelos, foi encontrado

alelos com frequência menor do que os outros locos como os alelos D e F (0,0208) e alelo

com grande valor de frequência como o alelo M (0,1667). Já no loco MF17 a frequência

menor encontrada entre os alelos foi de 0,0417 nos alelos E, L, O e V e a maior frequência foi

vista no alelo X (0,2500). Por fim, o loco MF18 apresentou alelos com frequência mínima de

0,0417 como os alelos C, E, P, Q e com alta frequência como o alelo J (0,2292).

Alelo\Locos MF3 MF8 MF11 MF12 MF17 MF18

Alelo A 0,0208 0,0417 0,0417 0,0208

Alelo B 0,0208 0,1250

Alelo C 0,0208 0,0417 0,0417 0,0417

Alelo D 0,0833 0,1250 0,0208

Alelo E 0,1875 0,0625 0,0417 0,0417 0,0417

Alelo F 0,0833 0,0833 0,0208 0,2083

Alelo G 0,0417 0,0833 0,0833

Alelo H 0,3333 0,1042

Alelo I 0,0625 0,1250 0,0833

Alelo J 0,0417 0,1250 0,0417 0,2292

Alelo K 0,0625 0,2083 0,0625 0,1875

Alelo L 0,0417 0,0417 0,0417 0,0417

Alelo M 0,0417 0,0417 0,0417 0,1667

Alelo N 0,1667 0,0208

Alelo O 0,0833 0,0417 0,0208

Alelo P 0,1250 0,0417

Alelo Q 0,0417 0,0833 0,0833 0,0417

Alelo R 0,0417 0,0833 0,0833

Alelo S 0,0625 0,1250 Alelo T 0,0417 0,0833 0,1042

Alelo U 0,0833 0,0833

Alelo V 0,2500 0,0417 Alelo X 0,2500 Alelo Z 0,1667

55

Tabela 10 – Estimativa da frequência alélica na população 2 (Pindaibal).

Na população 2 (Pindaibal) foram analisados os alelos distribuídos num total de seis

locos alguns alelos foram apresentados como raros considerando que apresentam frequência

menor que 0,05. Dentre os locos, o MF8 apresentou o menor número de alelos enquanto o

MF3 apresentou o maior número.

O loco MF3 apresentou 17 alelos, sendo que os de menor frequência (0,0250) foram os

alelos A, F, I, K, L e M e o alelo C o de maior frequência encontrado (0,2000). No loco MF8

foi encontrado um total de 5 alelos, o menor número encontrado na população e entre as duas

populações, sendo o de menor frequência (0,0250) o alelo F e o de maior frequência o alelo K

(0,3000). No loco MF11 com um total de 7 alelos, a menor frequência foi de 0,1000 para os

alelos C, F, G e I e uma frequência maior de 0,3000 no alelo D. No loco MF12 o segundo a

apresentar o maior número de alelos (15 no total) foi encontrado alelos com menor frequência

(0,0250) como os alelos A, C, E, G e L e um alelo com grande valor de frequência como o

alelo D (0,2000). No loco MF17 a frequência menor encontrada entre os alelos foi de 0,0250

(alelos F, G, H, N, P e X e I) e a maior frequência foi vista no alelo X (0,2000). Por fim, o

loco MF18 apresentou um alelo com frequência mínima de 0,0250 (alelo A) e com alta

frequência como os alelos L e M (0,2250).

Os locos mais polimórficos considerados foram o MF3 e MF12. Dentre os seis locos

polimórficos encontrados, alguns amplificaram com temperatura média de 48°C (MF11 e

MF12), enquanto que os outros quatro locos polimórficos avaliados amplificaram na

temperatura de 56°C.


Alelo A 0,0250 0,0500 0,0250 0,0250

Alelo B 0,0500 0,1500 0,0500 0,0500

Alelo C 0,2000 0,1000 0,0250 0,0500

Alelo D 0,0750 0,3000 0,2000 0,1250 0,0500

Alelo E 0,1250 0,1500 0,0250

Alelo F 0,0250 0,0250 0,1000 0,0250 0,0500

Alelo G 0,0500 0,1000 0,0250 0,0250

Alelo H 0,0750 0,2000 0,0250 0,0500

Alelo I 0,0250 0,1000 0,1000 0,2000 0,1500

Alelo J 0,1000 0,1000

Alelo K 0,0250 0,3000 0,1000 0,0500

Alelo L 0,0250 0,0250 0,2250

Alelo M 0,0250 0,2000 0,0500 0,0500 0,2250

Alelo N 0,0500 0,0750 0,0250 0,0500

Alelo O 0,0500 0,0500 0,0750

Alelo P 0,0500 0,0750 0,0250 0,1000

Alelo Q 0,0500

Alelo R 0,1250

Alelo S 0,0250 0,0500 0,1750 Alelo T

Alelo U

Alelo V Alelo X 0,0250 Alelo Z

56

As frequências alélicas de cada loco estão representadas graficamente nas Figuras 26 e

27. Foram encontrados 139 alelos distribuídos entre os seis locos analisados nas duas

populações, sendo encontrados 70 alelos na população 1 e na população 2, 69 alelos.

Figura 26 - Histograma das frequênciass alélicas dos seis locos microssatélites, estimados para 24 indivíduos da população 1 de Mauritia flexuosa. O eixo Y indica a frequência alélica e o eixo X indica o número do alelo, em pares de base. As respectivas frequênciass se encontram acima de cada coluna.

57

Figura 27 - Histograma das frequênciass alélicas dos seis locos microssatélites, estimados para 20 indivíduos da população 2 de Mauritia flexuosa. O eixo Y indica a frequência alélica e o eixo X indica o número do alelo, em pares de base. As respectivas frequências se encontram acima de cada coluna.

Considerando que os locos estudados não estão em equidade gênica (baixa amplitude de

variação), pois apresentam frequências alélicas entre 0,020 e 0,300, esse resultado difere dos

observados por Silva (2006) que observou de 60 a 80% de equidade para as duas populações

estudadas de Geonoma schottiana Mart. Segundo Frankel et al. (1995), a maior equidade nas

frequências alélicas de uma população é um indicador de maior diversidade genética e de

menor susceptibilidade aos efeitos da deriva genética se comparada às que têm alelos muito

58

menos frequentes do que outros. Dessa forma, espécies que apresentam maior variação das

frequências alélicas ou menor equidade gênica possuem risco de gerar fixação e perda de

alelos quando submetidas a perturbações e gargalos genéticos. Na avaliação feita em M.

flexuosa pode-se comprovar que as frequências não possuem equidade, portanto a espécie está

mais susceptível a efeitos de endogamia e perturbações o que poderia acarretar problemas

futuros com a conservação da mesma.

6.4.3. Estimativa dos índices de diversidade genética

Entre estes parâmetros, A e He são muito influenciados pela deriva genética, em razão de

os alelos raros (com frequência inferior a 0,05) não serem retidos em pequenas amostras.

Porém, para inferir se a diversidade genética em uma população será mantida em longo prazo,

apenas a quantificação número médio de alelos (A) é insuficiente. Para esse tipo de inferência,

é necessária a análise comparativa de A e He, especialmente porque o valor de He é

influenciado tanto pelo número de alelos como pela distribuição de suas frequências relativas

(Raposo et al., 2007).

Os valores de heterozigosidade observada (Ho) variaram na população 1 de 0,00 (MF11)

a 0,458 (MF8), tendo uma média de 0,277 para os seis locos estudados. Já na análise da

heterozigosidade esperada, (He) variou de 0,858 (MF8) a 0,922 (MF11) tendo como média

0,833 (Tabela 11).

Os valores encontrado na população 2 em relação a heterozigosidade observada (Ho)

variaram de 0,000 (MF11) a 0,700 (MF18) com uma média de 0,408. A heterozigosidade

esperada (He) variou de 0,784 (MF8) a 0,923 (MF12) gerando uma média de 0,877 (Tabela

12). Gaiotto et al. (2003) encontraram valores similares de diversidade gênica (Ĥe = 0,749) e

heterozigosidade observada (Ĥo= 0,700) em Euterpe edulis. Em razão da heterozigosidade

média observada ter sido inferior a heterozigosidade esperada para as duas populações, ficou

caracterizado o predomínio de homozigotos. O aumento de homozigotos indica a possível

existência de um processo endogâmico, decorrente de desvios de panmixia e/ou deriva

genética.

59

Tabela 11 – Estimativa de diversidade gênica dos seis locos SSR de M. flexuosa pela análise de 24 indivíduos (população 1).

Dados: Heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), número de alelos observados (na) e número de alelos efetivos (ne).

Tabela 12 – Estimativas de diversidade gênica dos seis locos SSR de M. flexuosa pela análise de 20 indivíduos (população 2)

Dados: Heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), número de alelos observados (na) e número de alelos efetivos (ne).

Todos os locos validados detectados em M. flexuosa apresentaram polimorfismo (P) de

100%. O número médio de alelos por loco (A) foi de 11,5 para as populações, valor este

próximo aos encontrados para outras espécies de palmeiras (Â= 14,4 em Euterpe edulis,

Conte, 2004; Â= 13,1 em Bactris gasipaes, Pereira, et al., 2009).

Na população 1 estes valores diferem significativamente, relatando indício de

homozigose nos indivíduos a ela pertencente e teoricamente causada pelo extrativismo intenso

praticado pela população local.

Observou-se elevada variação entre locos nos parâmetros de diversidade genética. As

maiores estimativas de índices de fixação (f) foram observadas na população 1 nos locos

MF11 (1.0000) e MF17 (0,8550), e a menor no loco MF8 (0,4551), já na população 2 os

maiores índices de fixação foram observados nos locos MF8 (0,8693), MF11 (1,0000) e

MF17 (0,6056) e os menores valores nos locos MF12 (0,2222) e MF18 (0,1176). Estes

valores podem ser considerados como indícios de que as populações encontram-se em um

Locos Tamanho da Amostra Ho He na ne

MF3 48 0,375 0,885 12,000 7,529

MF8 48 0,458 0,859 13,000 6,295

MF11 48 0,000 0,890 10,000 7,783

MF12 48 0,291 0,922 14,000 10,285

MF17 48 0,125 0,880 11,000 7,245

MF18 48 0,416 0,865 11,000 6,545

Média 48 0,277 0,883 11,833 7,614

Desvio Padrão 0,180 0,022 1,472 1,427

Locos Tamanho da Amostra Ho He na ne

MF3 40 0,550 0,929 17,000 10,666

MF8 40 0,100 0,784 5,000 4,255

MF11 40 0,000 0,846 7,000 5,714

MF12 40 0,700 0,923 15,000 10,000

MF17 40 0,350 0,910 15,000 8,888

MF18 40 0,750 0,871 10,000 6,666

Média 40 0,408 0,877 11,500 7,698

Desvio Padrão 0,312 0,055 4,888 2,544

60

processo de endogamia e com possível comprometimento de sua estrutura populacional. No

entanto, torna-se necessário estudos com um maior número de indivíduos e populações para

se confirmar estas estimativas. Embora haja a necessidade deste tipo de estudo, fica claro que,

a população da Vila apresenta valores de estimativas de índice de fixação maiores que a

população do Pindaibal. Este resultado vem ao encontro do esperado, pois, a população da

Vila é explorada pela população, além de apresentar uma população com um menor número

de indivíduos. Este indício de processo de endogamia fica mais evidente ainda para a

população da Vila, pois, mesmo tendo sido avaliado um maior número de indivíduos em sua

população (25), ela apresentou maiores estimativas de índice de fixação (Tabelas 13 e 14).

Os níveis de endogamia detectados pelo índice de fixação (f) foram ligeiramente

superiores na população explorada (Vila) em relação a população não explorada (Pindaibal).

Uma consequência é a redução do número de indivíduos reprodutivos em populações naturais

exploradas e o aumento dos cruzamentos biparentais, levando ao aparecimento de endogamia

nas gerações futuras (Bawa & Krugman, 1990; Murawski, 1995 e Aldrich et al., 1998).

O número de alelos observados (na) e alelos efetivos (ne) não diferiu drasticamente entre

as populações. Na população 1 os valores foram, respectivamente, 11,833 e 7,614, enquanto

que na população 2 foram estimados os valores de 11,500 e 7,698.

Na análise de alelos por loco, muitos alelos da população 1 não foram encontrados na

população 2, totalizando 39 alelos restritos (55,7% dos alelos). Da mesma forma, uma

quantidade muito próxima de alelos pertencentes a população 2 não foram encontrados na

população 1, num total de 38 alelos restritos (55,1% dos alelos), levando a uma diferença de

8,6%. Este resultado mostra que há um número expressivo de alelos que caracterizam

especificamente as duas populações (Vila e Pindaibal).

61

Tabela 13 – Estimativa do índice de fixação alélica na população 1 (Vila) Tabela 14 – Estimativa do índice de fixação alélica na população 2 (Pindaibal).


Alelo A -0,0213 1,0000 -0,0435 -0,0213

Alelo B -0,0213 1,0000

Alelo C -0,0213 1,0000 -0,0435 1,0000

Alelo D 1,0000 1,0000 -0,0213

Alelo E 0,3162 0,6444 1,0000 1,0000 -0,0435

Alelo F 0,4545 1,0000 -0,0213 0,4947

Alelo G -0,0435 -0,0909 1,0000

Alelo H 0,4375 0,7767

Alelo I 0,6444 1,0000 1,0000

Alelo J -0,0435 1,0000 1,0000 0,4103

Alelo K 0,6444 1,0000 -0,0667 0,3162

Alelo L 1,0000 -0,0435 -0,0435 -0,0435

Alelo M 1,0000 -0,0435 1,0000 0,7000

Alelo N 1,0000 -0,0213

Alelo O 1,0000 1,0000 -0,0213

Alelo P 1,0000 -0,0435

Alelo Q -0,0435 1,0000 1,0000 1,0000

Alelo R 1,0000 1,0000 1,0000

Alelo S -0,0667 1,0000

Alelo T 1,0000 1,0000 0,7767

Alelo U 1,0000 0,4545

Alelo V 0,5556 1,0000

Alelo X 1,0000

Alelo Z 1,0000

TOTAL 0,5676 0,4551 1,0000 0,6769 0,8550 0,5082


Alelo A -0,0256 -0,0526 -0,0256 -0,0256

Alelo B 1,0000 1,0000 -0,0526 1,0000

Alelo C 0,6875 1,0000 -0,0256 1,0000

Alelo D 0,3143 1,0000 0,6875 0,7714 -0,0526

Alelo E 0,6396 1,0000 -0,0256

Alelo F -0,0256 1,0000 1,0000 -0,0256 1,0000

Alelo G 1,0000 1,0000 -0,0256 -0,0256

Alelo H 0,6875 1,0000 -0,0256 1,0000

Alelo I 0,3143 1,0000 -0,1111 0,4444 -0,1765

Alelo J 0,6396 1,0000

Alelo K -0,0256 1,0000 -0,1111 1,0000

Alelo L -0,0526 -0,0256 -0,0036

Alelo M -0,0811 0,6875 -0,0526 -0,0526 0,2832

Alelo N -0,0256 -0,0811 -0,0256 -0,0526

Alelo O 1,0000 -0,0526 -0,0811

Alelo P -0,0256 0,6396 -0,0256 -0,1111

Alelo Q -0,0526

Alelo R 0,7714

Alelo S -0,0256 -0,0526 0,8268

Alelo T

Alelo U

Alelo V

Alelo X -0,0256

Alelo Z

TOTAL 0,3931 0,8693 1,0000 0,2222 0,6056 0,1176

62

6.5. Transferibilidade dos marcadores SSRs de M. flexuosa

A transferibilidade de microssatélites entre espécies relacionadas é uma consequência da

homologia da sequência de DNA presente nas regiões que flanqueiam os microssatélites

(Grattapaglia et al., 1998). No caso específico da transferibilidade realizada neste trabalho, as

duas espécies, M. flexuosa e O. oleifera, embora sejam de gêneros e espécies diferentes, elas

são da mesma família (Arecaceae), indicando a presença de sequências comuns no DNA dos

indivíduos desta família.

Após a otimização e validação dos iniciadores SSRs, os seis primers polimórficos em

buriti foram utilizados para teste de transferibilidade para o coco babaçu (Orbignya oleifera).

Foram avaliados 15 indivíduos. Após a realização dos testes, os resultados mostraram que os

iniciadores validados para o buriti foram eficientes na transferibilidade para esta espécie

gerando boa amplificação e polimorfismos evidentes. Portanto 100% dos iniciadores

apresentaram homologia com as sequências do O. oleifera, mostrando que essas duas espécies

têm características genéticas próximas, podendo ser estudadas mais profundamente utilizando

os primers SSRs desenvolvidos para M. flexuosa.

Os resultados encontrados neste estudo mostram que, a transferibilidade de marcadores

SSRs pode acontecer entre espécies de gêneros diferentes, necessitando apenas da ocorrência

de homologia na sequência de DNA presente nas regiões flanqueadoras dos microssatélites,

podendo ocorrer até o nível de família.

Billotte et al. (2004) na construção de uma biblioteca enriquecida para Bactris gasipaes,

desenvolveram marcadores microssatélites, e ao avaliar a conservação de polimorfismo em

experiências de transferibilidade verificaram em 10 acessos de Bactris setulosa e em 25

acessos de Astrocaryum macrocalyx e A. urostachys a transferibilidade potencial e utilidade

de marcadores microssatélites de Bactris gasipaes para outros gêneros da tribo Cocoeae.

Estudos envolvendo árvores tropicais têm evidenciado uma alta razão de

transferibilidade de locos de microssatélites entre espécies arbóreas taxonomicamente

relacionadas, como ocorre dentro das Leguminosae (Dayanadan et al., 1997), Meliaceae

(Write & Powell, 1997) e entre espécies de Eucalyptus (Brondani et al., 1998). A absoluta

transferibilidade (100% de 10 locos) foi verificada em microssatélites desenvolvidos com

Caryocar brasiliense para cinco outras espécies do mesmo gênero (C. coriaceum, C.edule, C.

glabrum, C. pallidum e C villosum) indicando um alto nível de homologia do genoma e

permitindo, dessa forma, estudos comparativos da estrutura genética em todas estas espécies

(Collevatti et al., 1999).

63

7. CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos e considerando as hipóteses levantadas e os objetivos

propostos, as principais conclusões deste trabalho foram:

• A biblioteca foi eficiente na identificação de locos microssatélites;

• O procedimento foi eficaz no desenvolvimento de iniciadores específicos para a espécie,

com uma porcentagem de 20% de iniciadores amplificando locos polimórficos e baixo

índice de redundância;

• Os resultados provam que esses primers podem ser úteis para futuras análises genéticas;

• As populações de M. flexuosa, nas duas áreas estudadas, apresentaram uma pequena

variabilidade genética molecular, detectada pelos marcadores microssatélites

desenvolvidos;

• A população 1 (Vila) tem menor diversidade, portanto se encontra em declínio e em

processo de endogamia em relação a 2 (Pindaibal), o que pode ser efeito do processo de

extrativismo local de produtos não madeireiros;

• O teste de transferibilidade permite concluir que espécies da mesma família podem ter

homologia nas sequências, disponibilizando ferramentas úteis para o estudo de

populações sem recursos moleculares.

Contudo, os resultados obtidos neste estudo indicaram questões adicionais a serem

estudadas:

• Em função do nível de variabilidade dos locos microssatélites observado em M. flexuosa,

recomenda-se aumentar o tamanho das amostras (>100) visando otimizar a informação

genética proporcionada por esses marcadores;

• Novos estudos são necessários sobre os efeitos do extrativismo, uma vez que os

resultados obtidos neste estudo podem ter sido influenciados por esta prática de

exploração ocorrida no passado e pelas populações existentes;

• Finalmente, em virtude dos resultados obtidos, recomenda-se o monitoramento das

gerações futuras, principalmente em áreas críticas de exploração da espécie (população

1), tendo em vista as tendências observadas no presente estudo.

64

8. BIBLIOGRAFIA

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