Introdução

Os aminoácidos são unidades estruturais básicas das proteínas. Esses aminoácidos consistem de um átomo de carbono alfa ligado covalentemente a um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo carboxílico e um grupo R de cadeia lateral. As proteínas naturais contêm até 21 aminoácidos primários diferentes ligados entre si por meio de ligações amida. As estruturas das proteínas são divididas em: primária, secundária, terciária e quartenária.

A estrutura nativa da proteína é o resultado líquido de varias interações atrativas e repulsivas que emanam de forças intermoleculares variadas. Mudanças na estrutura secundária, terciária e quartenária sem clivagem das ligações peptídicas da cadeia principal, são consideradas desnaturação.

Do ponto de vista estrutural, enquanto a estrutura nativa de uma proteína é uma entidade bem definida, com coordenadas estruturais para cada um dos átomos da molécula, podendo ser obtida a partir de sua estrutura cristalográfica, o mesmo não ocorre com uma estrutura desnaturada.

A desnaturação é um fenômeno no qual o estado inicial é bem definido de uma proteína formada sob condições fisiológicas, usando-se um agente desnaturante. Isso não envolve nenhuma mudança química na proteína.

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas. Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reação, sem no entanto participar dela como reagente ou produto. [1]

A bromelina pertence ao grupo de enzimas proteases, que tem a característica de hidrolisar ligações peptídicas das proteínas. Encontra-se presente no abacaxi (Ananas comosus), cujas enzimas são referidas de forma genérica como “bromelinas”. A bromelina é encontrada no caule, folhas, raízes e no fruto do abacaxi (A. comosus) e em todas as espécies da família Bromeliaceae. [2]

A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteolítica. A sua importância econômica está relacionada com a produção de fármacos e a sua utilização na indústria alimentícia (na clarificação de cervejas, na fabricação de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de alimentos infantis e dietéticos, entre outros), no tratamento de distúrbios, digestivos e

inflamações, preparo de colágenos hidrolisados, nas indústrias têxteis, para amaciamento de fibras e também na produção de detergentes. [3]

A bromelina é uma enzima proteolítica da classe das hidrolases. As proteases são hidrolases capazes de romper a ligação peptídica das proteínas e peptídeos. [4].

A enzima bromelina vem sendo amplamente caracterizada. A bromelina do fruto tem uma atividade proteolítica maior que a bromelina do talo em diversos substratos proteicos, e sua atividade é máxima em pH 8,0 e temperatura de 70ºC. A bromelina do talo apresentou atividade máxima a 60ºC e pH 7,0 [5].

A papaína é obtida do fruto verde do mamoeiro (Carica papaya). Esta

enzima proteolítica causa hidrólise geral de todos os componentes estruturais

do músculo da carne bovina. Sua penetração é baixa (de 0,5 a 2,0 mm),

necessitando-se, assim, a perfuração da carne durante sua preparação, para

que esta enzima penetre mais facilmente na carne. A maior ação da papaína

ocorre durante a cocção da carne (à temperatura de 60-80oC).

. Potente digestivo de material morto proteico. Sua eficácia é aumentada na presença de ativadores que estimulam sua potência digestiva: como a uréia, que desnatura proteínas por ação solvente e desnatura material necrosado permitindo que fique mais susceptível a digestão enzimática.

A carne pode ser considerada como a matéria prima que maior atenção desperta, devido tanto ao seu alto valor econômico quanto ao nutritivo. As características organolépticas (cor, sabor, aroma e consistência) das carnes exercem bastante influência no momento da escolha e do consumo, devendo assim, ser bem monitorados ao longo de seu preparo. Para o amaciamento da carne são utilizados métodos: mecânicos, térmicos e químicos, sendo que neste último a carne é submetida à ação de enzimas. Dentre as mais utilizadas se destacam a papaína do mamão e a bromelina do abacaxi. Estas enzimas exercem sua ação principalmente no colágeno da carne. [6]

Material e Métodos

Avaliação qualitativa da textura de carne bovina tratadas com enzimas de frutas tropicais

Material:

Corte de carne bovina Coxão Duro em bife; Abacaxi pérola; Mamão formosa verde; Processador de alimentos; Grelha Elétrica; Sal Refinado; Peneira de Nylon; Facas; Proveta; Vasilhas.

Método:

Parte 1 – Extração dos sucos das frutas:

O abacaxi e o mamão foram lavados e sanitizados em solução de hipoclorito de sódio na concentração de 50ppm e deixados em repouso por 5 minutos. Em seguida, as frutas foram fatiadas e levadas ao processador de alimentos para serem trituradas. Em seguida foi feito a separação do bagaço do suco por uma peneira de nylon. Após a extração dos sucos foram preparadas soluções com 100g de suco e 5g de sal refinado. Para comparação foi preparada uma solução controle com 100 ml de água e 3g de sal (branco).

Parte 2 – Preparo dos bifes com os sucos:

Foram colocados 03 bifes de coxão duro em vasilhas separadas e acrescentadas as soluções preparadas com suco de abacaxi, suco de mamão verde e controle. Os bifes foram deixados em contato com as soluções durante 30 minutos. Após esse tempo os bifes foram grelhados e avaliados sensorialmente.

Desnaturação Protéica: Bromelina

Material:

Abacaxi pérola; Gelatina incolor; Tabua para corte; Faca; Processador de Alimentos; Peneira doméstica;

Banho Maria (60° C); Banho Maria (100°C); Estufa a 37°C; Pipetas Sorológicas de 5 ml; 8 Tubos de Ensaio de 20 ml; Béqueres; Proveta.

Método:

Parte 1 – Solubilização da gelatina e obtenção do suco de abacaxi:

A gelatina incolor foi preparada conforme indicada no rótulo pelo fabricante e após a solubilização foi mantida em estufa a 60°C até ser utilizada. O abacaxi foi lavado, descascado, e triturado aos poucos no processador, obtendo-se suco de abacaxi puro (sem adição de água).

Parte 2 – Avaliação da desnaturação enzimática:

Com o auxilio de uma pipeta foram colocados 2 ml do suco de abacaxi em três tubos de ensaio de 20 ml e 2 ml de água em um quarto tubo de ensaio de 20 ml.

Um tubo com o suco de abacaxi e o tubo com água foram mantidos à temperatura ambiente. O segundo tubo com suco de abacaxi foi aquecido à 60°C ao mesmo tempo em que o terceiro tubo com suco de abacaxi foi aquecido à 100°C durante 5 minutos.

A gelatina foi retirada da estufa. 2 ml de gelatina foi adicionada nos quatro tubos e estes foram colocados à 37°C por 10 minutos e, em seguida foram resfriados. As amostras foram observadas e os resultados anotados.

Resultados e Discussões

Avaliação qualitativa da textura de carne bovina tratadas com enzimas de frutas tropicais

Após a extração dos sucos do mamão e do abacaxi, foram adicionados em diferentes béqueres junto à carne da seguinte forma:

1. Água e Sal2. Papaina3. Bromelina

Figura1: Repouso da carne com os sucos do mamão e do abacaxi.

Figura 2: Carne após repouso e fritura.

O repouso de 30 minutos foi necessário para que as enzimas atuassem sobre a proteína da carne. O processo de fritura foi realizado para analise sensorial das modificações ocorrida na carne após o repouso.

No experimento 1 notamos ação do sal, ocorrendo simultaneamente, dois fenômenos de transferência de massa em contra-fluxo.Ocorre difusão da umidade do interior da carne para o exterior, e difusão de sal entrando na carne, com conseqüente diminuição da umidade, aumento no teor de sal e redução da atividade de água. Dentre os fatores de estabilidade dos produtos, a atividade de água é um dos parâmetros que pode ser medido facilmente e comprecisão [9].

Griswold (1972, p.108) [15] destaca ainda que um processo utilizado para amaciar as carnes é a adição de sal que, sob certas condições, pode aumentar a hidratação das proteínas, mesmo durante o aquecimento. Quantidades pequenas de cloreto de sódio aumentam a capacidade das proteínas reterem água.

A cura da carne, a utilização de sais, condimentos e a defumação, produzem alteração da cor da mioglobina, que passa a metamioglobina e ferrohemocromo (esta devido à ação do calor), ambas de cor castanha [8]. Já os efeitos do sal na variação da cor da carne fresca estão relacionados basicamente a dois mecanismos prooxidantes; o sal aumenta o potencial de oxidação da mioglobina diminuindo a capacidade de “buffering” da carne, e reduz a tensão superficial do oxigênio da carne, levando à oxidação do pigmento. Pela reação de oxidação, com uso do sal, este deslocaria a reação no sentido de formação de metamioglobina [10]. Assim a carne apresentou cor acinzentada e opacas.

No experimento 2 a papaína causou um amaciamento mais significativo sobre a carne. Esta enzima proteolítica causa hidrólise geral de todos os componentes estruturais do músculo da carne bovina. Sua penetração é baixa (de 0,5 a 2,0 mm), necessitando-se, assim, a perfuração da carne durante sua preparação, para que esta enzima penetre mais facilmente na carne. A maior ação da papaína ocorre durante a cocção da carne (à temperatura de 60-80oC). [12]

No experimento 3 a bromelina causou um amaciamento mediano comparado com os outros três, isso devido a capacidade proteolítica da bromelina permite que a enzima atue de forma catalisadora da quebra das ligações peptídicas nas proteínas, o que possibilita a quebra das ligações fibrosas musculares das carnes, amaciando-as [14].

Em trabalho de [12] FLÁVIO et al. (1989), comparando a utilização da papaína in natura e a industrializada, observou-se que a papaína industrializada apresentou efeitos semelhantes aos da papaína da folha do mamoeiro. A papaína do fruto verde do mamoeiro causou maior maciez quando comparada com a papaína industrializada e a da folha do mamoeiro.A bromelina é uma enzima proteolítica da classe das hidrolases. As proteases são hidrolases capazes de romper a ligação peptídica das proteínas e peptídeos. A

especificidade das proteases é ampla e classificada de acordo com a constituição de seu sítio ativo em três grupos principais: serina protease, ácido aspártico protease e cisteína protease, sendo que a bromelina se enquadra neste último grupo [7]. A carne do experimento 2 apresentou uma textura pastosa, uma coloração marrom avermelhado.

A bromelina pertence ao grupo de proteases que tem a característica de hidrolisar ligações peptídicas das proteínas, é encontrada no abacaxi (Ananas comosus), cujas enzimas são referidas de forma genérica como “bromelinas” [13]. Como estão intimamente relacionadas é possível tratá-las como uma entidade única; substratos suscetíveis à bromelina incluem muitas proteínas comuns, como caseína, gelatina, colágeno, globulinas e fibra muscular.

Segundo [11] STABILE et al. (1990), o suco de abacaxi Ananas comocus L., aumentou a solubilidade das proteínas (evidenciado pelo incremento da concentração de sólidos solúveis), em carne bovina de 33-40% para a variedade Hawai e de 40-46% para a variedade Pérola. Além disso, esses autores observaram que a bromelina existente no suco in natura apresentou atividade proteolítica alta, superiores aos alcançados pela enzima isolada e purificada. A carne após a fritura apresentou coloração bem escura devida reação de Mailard que ocorre quando as proteínas desnaturadas da superfície da carne recombinam-se com ao açúcares presentes.

Desnaturação Proteica: Bromelina

No tubo 1 contendo suco de abacaxi e a a gelatina (colágeno) mantidos em temperatura ambiente a proteína não desnaturou, pois quando adicionamos o suco de abacaxi ao colágeno ocorrem modificações no pH que resultam em alterações no estado iônico de cadeias laterais das proteínas, modificando as pontes de hidrogênio e as pontes salinas (associação de grupos iônicos de proteínas de carga oposta). Como afeta a ionização da proteína, conferem a molécula uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com exposição do núcleo hidrofóbico.

No tubo 2 contendo suco de abacaxi e a gelatina (colágeno) mantidos em temperatura de 60°C, a proteína desnaturou e o colágeno não foi prejudicado pois quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no suco de abacaxi são também desnaturadas, e a capacidade de quebra do colágeno é corrompida. Como a estrutura tridimensional específica das proteínas é fundamental para o exercício de suas funções, alterações estruturais provocadas pela desnaturação ocasionam a perda parcial ou completa das suas funções. Com o aumento da temperatura, a velocidade de vibração molecular aumenta. Eventualmente, interações fracas como as pontes de hidrogênio são rompidas promovendo alterações na conformação das enzimas presentes no abacaxi.

ARROYO-REYNA et. al. (1995) [16] estudaram a desnaturação térmica da bromelina, que é uma proteína globular. Estudos cinéticos da desnaturação da bromelina a uma temperatura constante foram realizadas a pH 3,40. A análise da fração de proteína nativa (fN) mostra que esta varia com o tempo, sendo que à temperaturas elevadas, esta diminui mais rapidamente. Por exemplo, a 30,5oC, fN diminui de 1 a aproximadamente 0,2 em 300 min; a 36,1oC, fN diminui a aproximadamente 0,1 em 300 min; a 42,3 oC, fN diminui de 1 a 0 em 150 min e a 46,1 oC, fN diminui de 1 a 0 em 50 min. Foram realizadas análises entre 30 e 50 oC. Este estudo indica que a desnaturação térmica da Bromelina segue um modelo de dois estados irreversível com cinética de 1a ordem. Neste estudo a desnaturação é determinada por mudanças na conformação da enzima.

Conclusão:

Durante o experimento, verificamos que as proteases (enzimas catalíticas biológicas) atuam nas ligações peptídicas, neste caso, foram às ligações do colágeno e as quebram. A prova disso é que quando a protease envolvida (bromelina) foi desnaturada sob alta temperatura, portanto perdendo sua função, o colágeno reagiu naturalmente, ou seja, enrijeceu a solução, como mostrado nos experimentos. Observamos também que uma das vias para o des-naturamento é o aumento da temperatura, pois a 60 °C a bromelina perdeu seu poder de reação com o colágeno.

A observação das enzimas proteolíticas presentes em frutos é importante, pois indica a eficácia de sua utilização em algumas situações do cotidiano, uma vez que sucos de frutas contendo enzimas purificadas de frutos, como no caso da papaína e a bromelina, são vastamente usadas para amaciar carnes. .A utilização dessas enzimas proteolíticas é importante para auxiliar no processo biológico para digestão de proteínas e, portanto, na melhor absorção destas pelo organismo.

Referencias bibliográficas

1. DAMODARAN, S.; PARKIN, L. K.; FENNEMA R. O. Química de alimentos de Fennema – 4. Ed. – Porto Alegre: Armed, 2010 181p., 202p.

2. GONÇALVES, N. B. (Org.). Abacaxi. Pós-colheita. Embrapa agroindústria de Alimentos (Rio de Janeiro, RJ). Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia, (2000). 45p. (Frutas do Brasil;).

3. DRAETTA, I.S.; GIACOMELLI, E.J. Ocorrência da bromelina e cultivares de abacaxizeiro. Colet. ITAL, v.23, n.1, p.44-55, Campinas, (1993).

4. SANTOS, S.A. Efeito do tempo na composição físico-química. Química e na atividade da bromelina do caule do abacaxizeiro Ananas comosus (L.) merr. cv. Pérola armazenado em condições com e sem refrigeração. Lavras: ESAL, (1995) 47p. (Dissertação de mestrado em Ciência dos Alimentos).

5. ROWAN, A. D.; BUTTLE D. J.; BARRET, A. J. The cysteine proteinases of the pineapple plant. Biochemical Journal, 266: 869-75 (1990)

6. FLÁVIO, E.F.; MATOS, D.H.; SILVEIRA, I.L. 1989. Utilização da papaína in natura e industrializada, no amaciamento de carne bovina. Oikos, 6(1):28-30.

7. SANTOS, S.A. Efeito do tempo na composição físico-química. Química e na atividade da bromelina do caule do abacaxizeiro Ananas comosus (L.) merr. cv. Pérola armazenado em condições com e sem refrigeração. Lavras: ESAL, (1995) 47p. (Dissertação de mestrado em Ciência dos Alimentos).

8. BOBBIO, P.A.; BOBBIO, F.O. Química do Processamento de Alimentos cap. 5, p.121-159,1984.

9. RÖDEL, W.; SCHEUER, R.; WAGNER, H. Nuevo Metodopara la Determinacion de la Actividad Agua en Produtos Cárnios Fleischwirtschaft,v.2,p.36-41, 1990.

10. SEIDEMAN, S.C.; CROSS, H.R.; SMITH, G.C.; DURLAND, P.R. Factors associated with fresh meat color: A review Journal of Food Quality, v. 6, n.3, p. 211-237, 1984

11. STABILE, M.N.O.; BARUFFALDI, R.; STEDEFELD, E.; BASÍLIO, M.C.; SILVA, M.E.M.P.; NIETO, R.A.; ALVARES, E.D. 1990. Carne pré-digerida a partir de suco de abacaxi. Alimentos & Tecnologia, 6(32):99-104.

12. FLÁVIO, E.F.; MATOS, D.H.; SILVEIRA, I.L. 1989. Utilização da papaína in natura e industrializada, no amaciamento de carne bovina. Oikos, 6(1):28-30

13. ROWAN, A. D. Fruit bromelain. Handbook of Proteolytic Enzymes, 2nd ed. New York: Elsevier, 2004. v. 2, p. 1137-1138

14. A. França-Santos ; R. S. Alves ; N. S. Leite ; R. P. M. Fernandes. Estudosbioquímicos da enzima bromelina do Ananas comosus(abacaxi). SCIENTIA PLENA,VOL. 5, NUM. 11, 2009. Disponível

em:<http://www.scientiaplena.org.br/sp_v5_111101.pdf>. Acesso em: 19 de novembro2011.

15. GRISWOLD, R. M. Estudo experimental dos alimentos. São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo, 1972.

16. ARROYO-REYNA, A.; HERNÁNDEZ-ARANA, A.; The thermal denaturation of stem bromelain is consistent with an irreversible two-state model. Biochimica and Biophysica Act, v. 1248, p. 123-128, 1995.