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Bacteriologia - 1º/2018 04/04/2018
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Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico
Identificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem Bacteriana
Prof. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo Diniz
� Diagnóstico clínico
• Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivos)
• Origem
• Etiologia
• Natureza
� Diagnóstico laboratorial
• Identificação agentes envolvidos em patologias
• Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico
• Investigação epidemiológica
• Investigação científica
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Microbiota indígena
Microbiota exógena
ORIGEM
Monomicrobiana
Polimicrobiana
ETIOLOGIA
Infecciosa
Não-infecciosa
NATUREZA
A utilidade do resultado liberado pelo laboratório de
microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para
investigação.
A investigação baseia-se na construção de um estudo extremamentecuidadoso para a identificação correta de determinada espécie ou linhagembacteriana.
Linhagem microbiana:
- Grupo de indivíduos, que de acordo com um sistema de identificação sãoindistinguíveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivíduos de umamesma espécie em uma população.
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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO
Pesquisa da presença de agentes causais de processos infecciosos em espécimes clínicos.
Em termos gerais o diagnóstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes:
• Cultivo de microrganismos em meio de cultura específicos;
• Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia;
• Detecção de antígenos específicos do patógeno. Estes métodos requerem a utilização de técnicas imunológicas ou de biologia molecular;
• Detecção de seqüências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação gênica;
� A visualização e o cultivo são, em geral, as técnicas mais utilizadas para se realizar diagnóstico microbiológico.
• São técnicas mais simples;
• Requerem menor infraestrutura;
• Tem menor custo.
� O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microrganismos permite a recuperação do agente etiológico e sua utilização futura para estudos científicos
• Epidemiológicos;
• Susceptibilidade a drogas.
Alguns microrganismos não podem ser visualizados ao microscópio óptico e outros não crescem em meios de cultivo.
Neste caso, devemos nos ater aos métodos moleculares de diagnóstico ou às técnicas de diagnóstico indireto.
• As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior além de seus resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicos especializados.
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A detecção de antígenos e de ácidos nucléicos não permite recuperar células microbianas.
• Estas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentrações muito baixas nos espécimes clínicos.
Outra vantagem destas técnicas é sua rapidez.
• Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo porque não dependem do crescimento in vitro do patógeno.
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO
É possível diagnosticar uma infecção estudando-se o sistema imunológico do paciente pela pesquisa de anticorpos formados pela resposta imune específica.
• A pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos específicos de um dado microrganismo possibilita o diagnóstico de infecções crônicas ou agudas.
Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade do espécime.
O diagnóstico incorreto pode ter conseqüências diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes.
Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na recuperação de patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso.
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Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um
"falso" agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada
� Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;
� Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;
� Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos;
� Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado;
� Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos, causadores
de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a
fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal.
� Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise
microbiológica;
� O pedido do exame deve conter dados como idade, doença de base e indicação do uso de
antibióticos.
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Métodos broncoscópicos: => Escovado brônquico => Lavado broncoalveolar
Métodos não broncoscópicos: => Aspirado endotraqueal => Coleta às cegas
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CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DE SISTEMAS DE INVESTIGAÇÃO
� Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo, nulo ou
indistinguível entre diferentes amostras
� Reprodutibilidade: fatores técnicos e biológicos.
� Poder discriminatório: capacidade de discriminação entre as
linhagens.
� Facilidade de execução: infra-estrutura pessoal e material.
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As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.
� Biotipagem (isolamento e identificação);
� Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;
� Sorologia;
� Fagotipagem;
� Tipagem por bacteriocinas;
� Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;
� Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)
� Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia
As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.
� Biotipagem (isolamento e identificação);
� Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;
� Sorologia;
� Fagotipagem;
� Tipagem por bacteriocinas;
� Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;
� Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)
� Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia
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BIOTIPAGEM
Também utilizado para taxonomia bacteriana – manual e automatizada.
� Princípio: o perfil de atividades metabólicas expressado por uma dada amostra
bacteriana que inclui características como:
� Desvantagens: mutações ou mesmo condição fisiológica sob diferentes condições de
estresse podem trazer resultados errôneos de tipagem e identificação.
� Morfologia colonial e celular;
� Reações bioquímicas
� Tolerância ambiental (meios seletivos, atmosfera, pH, temperatura, salinidade)
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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS
- Muito utilizado nos centros de saúde para monitoramento dos níveis de resistência.
- Alteração nos padrões susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da
ocorrência de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vários pacientes pode
ser considerado como primeiro indicativo de um surto.
� Princípio:
Avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes.
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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS
� Desvantagens:
� A ausência da pressão seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos
marcadores de resistência;
� Os mecanismos de recombinação genética bacteriana permitem a troca de
marcadores de resistência em diferentes circunstâncias, o que dificulta a determinação
de marcadores epidemiológicos.
� Resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificação
equivocada dos marcadores epidemiológicos.
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SOROLOGIA
- Este método tem sido largamente utilizado na identificação microbiana, sendo uma das
ferramentas clássicas para os estudos epidemiológicos.
� Princípio: baseados na observação de que microrganismos de mesma espécie podem
expressar diferentes determinantes antigênicos na superfície. Variadas estruturas da
superfície apresentam propriedades antigênicas, como:
� Lipopolissacarídeo (LPS);
� Polissacarídeo capsular;
� Proteínas de membrana;
� Organelas extracelulares (flagelos e fímbrias)
Como outros métodos, a sorologia está sujeita a erros
• Em alguns casos a presença de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um agente infeccioso e não, necessariamente, apresenta uma doença.
• Janela imunológica - causa freqüente de falsos negativos: período compreendido entre o contato com o agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunológico e a produção de anticorpos específicos.
• Reações cruzadas podem ser a causa de falsos positivos.
- Estruturas antigênicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecífico de antígenos.
• Imunossupressão pode induzir uma queda ou inibição da resposta imune específica impedindo a detecção de anticorpos mesmo durante uma doença infecciosa.
� A determinação isolada de anticorpos específicos oferece pouca informação porque qualquer contato com antígenos vai desencadear sua produção.
� Para se estabelecer um diagnóstico sorológico confiável é necessário comparar-se a quantidade de anticorpos em períodos distintos do processo infeccioso
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SOROLOGIA
-Várias são as técnicas disponíveis para os ensaios sorológicos, como:
� Reações antígeno-anticorpo;
� Soroaglutinação;
� Aglutinação de partículas;
� Neutralização
� Marcação enzimática;
� Fluorescência;
� Aplicação de anticorpos monoclonais, etc.
� Desvantagens:
- Técnicas sorológicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua
pureza e as soluções preparadas.
- Considerando-se células bacterianas, estas técnicas podem apresentar um baixo poder
discriminatório devido à diversidade de determinantes antigênicos em uma mesma
população bacteriana.
Aplicabilidade de técnicas
moleculares no diagnóstico
microbiológico
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Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser usadasno lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente rápidas,sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo benefício.
• A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em consideração
principalmente o impacto da nova técnica na prática clínica e a economia de
gastos associados à intervenção e para o paciente.
• A detecção rápida de bactérias multirresistente pode resultar em um
isolamento mais rápido do paciente, terapia mais apropriada e diminuição da
infecciosidade do paciente.
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Contenção do
espalhamento da
infecção
diminuição do
tempo de
morbidade do
paciente
custo-benefício da
utilização de técnicas
moleculares para
diagnóstico
+ =
• Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico molecular não pode
substituir os métodos culturais e sorológicos convencionais em todos os
momentos.
• Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos culturais e sorológicos
têm significado diferente.
A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos
determinam se existe DNA ou RNA de um organismo
particular em uma amostra biológica
• Não revela dados sobre a viabilidade do organismo
• Não diz se um microrganismo está envolvido em um processo
infeccioso
• Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e
permite avaliação de surtos e geração de conhecimento
epidemiológico