Diagnóstico laboratorial – Brucelose

TESTE DO ANTÍGENO ACIDIFICADO

TAMPONADO (TAAT)

Universidade Federal de Pelotas

Medicina Veterinária

Zoonoses

Teste do AAT

• Triagem

• Muito sensível

• Fácil execução

• MV habilitado / laboratório credenciado / oficial

credenciado

• Soro do animal

Falso-positivo: 2 fatores

• Anticorpos não específicos:

• Infecções por bactérias: Yersinia enterocolitica 0:9,

Salmonella sp, Escherichia coli 0:157,

Pseudomonas sp.

• Resultado da vacinação com B19 após a idade

recomendada (acima 8 meses)

• Conhecimento da dinâmica das imunoglobulinas

nos diferentes estágios da resposta imune

Resposta imune – infecção e vacinação

• Imunoglobulinas em soro bovídeo:

• Classe G (IgG 1 e IgG 2) – seguidas de:

• Classe M (IgM)

• Classe A (IgA)

Infecção B. abortus ou

vacinação com B 19

Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados

com amostra patogênica de Brucella abortus ou vacinados com B19.

1º = IgM

2º = IgG 1

IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas

permanecem níveis baixos

Pós-infecção ou pós-vacinação (a partir da 1ª

semana) (IgM)

Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus.

Leve decréscimo IgM

IgG 1 permanece alto, inalterado

IgG 2 e IgA permanecem níveis baixos e estáveis

Infecção crônica B. abortus - IgG

Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus.

Vacinados até 8 meses (3 – 8 meses)

Títulos Acs decrescem rapidamente – depois 12 meses

Vacinação acima 8 meses

Títulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )

Vacinação

com B 19

TAAT

• Teste de aglutinação: soroaglutinação (Ag + Acs = grumos)

• Antígeno:

• Células inteiras da amostra de B. abortus 1119-3 a

concentração de 8%

• Tamponado em pH ácido (3,65) (inibe IgM)

• Corado com o Rosa de Bengala

• A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos

apresenta reação a essa prova

TAAT

• Pode ocorrer alguns poucos casos de reações falso + em

decorrência da utilização da vacina B19

• Toda reação positiva nesse teste → confirmada por testes

de maior especificidade para se evitar o sacrifício de

animais não infectados

• Prova qualitativa: não indica o título de anticorpos do soro

testado.

Vacina B19

• Amostra B. abortus lisa

• Brasil: obrigatória bezerras 3 – 8 meses

• Atenuada para fêmeas jovens

• Machos: orquite

• Fêmeas gestantes: aborto

• Lisa → induz anticorpos aglutinantes específicos contra

LPS liso → interferência diagnóstico sorológico (B. abortus,

B. suis, B. melitensis)

• Persistência dos Acs – relacionado à idade de vacinação

Vacina B19

• Fêmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e

interferem por mais de 24 meses

• Vacina até 8 meses: Acs desaparecem rapidamente:

animais > 24 meses são negativos ao teste

Vacina RB 51

• Amostra de B. abortus rugosa atenuada (diversas

passagens → rugosa)

• Proteção semelhante à B 19

• Rugosa: não induz formação Acs anti-LPS liso (B. canis

e B. ovis)

• Não interfere na sorologia

• Não indutora de Acs aglutinantes

• Viva: mesmos cuidados que B 19

Animais que devem ser testados

• Fêmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 – 8 m)

• Machos e fêmeas não vacinadas igual ou > 8 m (exclui

castrado)

• Fêmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas?

• Sim. Idade igual ou > 24 meses

Colheita de sangue

• Sangue → soro

• Tubos com vácuo (sem anticoagulante)

• Siliconados: facilita a retração do coágulo

• Agulhas individuais e descartáveis

• Sangue: 50% tubo 10 mL

• Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz – boa

coagulação

• Soro: frasco limpo e seco

• Enviar para laboratório rapidamente (resfriado ou

congelados)

• Identificação correta frascos

Protocolo

• Antígeno para AAT

• Soros a testar

• Soros controles positivo e negativo

• Pipetas de Bang

• Micropipetador de 30 µL (0,03 mL)

• Ponteiras

• Placa de vidro – quadrados delimitados 4 cm x 4 cm

• Misturador de plástico ou metal

• Caixa de luz indireta para leitura

• Agitador de placa (opcional)

Protocolo

• Antígeno para AAT

• Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido

no serviço de DSA Estadual

• Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)

• Usados sempre dentro do prazo de validade

• Não podem ser congelados

Cuidados na execução

• Antígeno não em uso: manter 2 a 8 ºC (perda da

sensibilidade por resfriar/aquecer

• Temperatura de execução: 22ºC ± 4ºC

• Limpar material após uso (placas, pipetas, misturadores)

• Soros muito hemolisados = desprezados → Falso +

• Controle positivo e negativo da reação

Técnica

• Equilibrar soro e antígeno – T.A. (30 min)

• Soro congelado: tempo maior

• Homogeneizar soros (cuidado!)

• Identificar área da placa

• 30 µL de soro por área da placa – encostar pipeta num

ângulo 45º

• Agitar suavemente antígeno – 30 µL ao lado do soro

(sem misturar)

Técnica

• Misturar soro e Ag com misturador (círculo 2 cm

diâmetro)

• Agitar a placa – movimentos oscilatórios (30

movimentos / minuto) por 4 minutos

• Colocar placa na caixa de leitura

• Anotar resultados

• Desconsideram reações de aglutinação que ocorrem

após os 4 minutos

Técnica

• Resultado

• Presença de grumos – Reagente

• Ausência de grumos – Não reagente

NegativaPositiva

Reação

positiva

DIAGNÓSTICO de BRUCELOSE

2-ME

2-ME (RETESTE)

Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT