UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MAICO DE MENEZES

“HOMOGENEIZAÇÃO INDUZIDA POR CAPILARIDADE DE MATRIZ EM PAPEL: UMA PODEROSA ABORDAGEM PARA A QUANTIFICAÇÃO DE INSUMOS

FARMACÊUTICOS ATIVOS USANDO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS POR IMAGEM”

“CAPILLARY INDUCED HOMOGENIZATION OF MATRIX IN PAPER: A POWERFUL APPROACH FOR THE QUANTIFICATION OF ACTIVE PHARMACEUTICAL

INGREDIENTS USING MASS SPECTROMETRY IMAGING”

CAMPINAS 2016

MAICO DE MENEZES

“HOMOGENEIZAÇÃO INDUZIDA POR CAPILARIDADE DE MATRIZ EM PAPEL: UMA PODEROSA ABORDAGEM PARA A QUANTIFICAÇÃO DE INSUMOS

FARMACÊUTICOS ATIVOS USANDO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS POR IMAGEM”

“CAPILLARY INDUCED HOMOGENIZATION OF MATRIX IN PAPER: A POWERFUL APPROACH FOR THE QUANTIFICATION OF ACTIVE PHARMACEUTICAL

INGREDIENTS USING MASS SPECTROMETRY IMAGING”

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Master's dissertation presented to the School of Medical Sciences of the Campinas State University as part of the requirements for obtaining the degree of Master in Sciences.

ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO MAICO DE MENEZES, E ORIENTADO PELO PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO.

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO MAICO DE MENEZES

ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO

MEMBROS:

1. PROF. DR. PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO

2. PROF(A). DR(A). DAISY MACHADO

3. PROF(A). DR(A). SELMA GUTIERREZ ANTONIO

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 30 de agosto de 2016

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha família, Tércio, Marlene, Márcio, Marcel e Karine por todo o apoio, amor e confiança que depositaram em mim.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente ao meus pais, Tércio e Marlene que sempre me

incentivaram ao estudo e pela busca incessante pelo conhecimento e claro, a toda a

educação recebida. A pessoa que sou, é graças a eles! Muito obrigado por toda a minha

vida, amo vocês!

Aos meus irmãos Márcio e Marcel, pelos exemplos de vida e conversas leais ao

longo desses nossos anos de convívio. Vocês fizeram parte de meu crescimento como

pessoa, fazendo com que a união e os laços de amizade puro e verdadeiro,

permaneçam para sempre entre nós.

À Karine, a minha eterna e grande companheira, por todo o amor, carinho,

incentivo, paciência, compreensão e confiança. Obrigado por me ajudar e me incentivar

nos momentos mais delicados de minha vida. Te amo!

Aos meus grandes e valiosos amigos do Laboratório Innovare: Lívia, Diogo, Tati,

Cibele, Fernando, Estela, Mônica, Gustavo, Fu, Luis e Matheus. Obrigado pelo

companheirismo, pelas ajudas e pela bela amizade e carinho que tenho com todos

vocês.

À Althaia S.A Industria Farmacêutica pelo grande incentivo e apoio técnico.

E por fim, ao orientador e amigo Prof. Dr. Rodrigo Ramos Catharino por todo

incentivo e confiança depositada desde o episódio conturbado no início do programa de

pós-graduação. Confesso que foi o maior estímulo que obtive para a conclusão deste e

de outros projetos juntos. Só Alegria!

RESUMO

Uma técnica sensível, seletiva e que permite elucidar as estruturas químicas presentes

na formulação de um medicamento é a espectrometria de massas. É uma técnica muito

utilizada para análises de insumos farmacêuticos ativos (IFA), impurezas e degradantes.

Neste contexto, este trabalho emprega uma nova abordagem para a quantificação de

insumos farmacêuticos ativos que utilizam a espectrometria de massas por imagem.

Esta estratégia utiliza um papel de filtro previamente "eluída" com uma solução de matriz

para MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization), como um suporte para a

aplicação do analito. As amostras são submetidas ao espectrômetro de massas por

imagem (MSI) e sua quantificação através das características das impressões digitais.

Os resultados para o conteúdo de rosuvastatina a partir de uma formulação comercial

são comparáveis aos obtidos com um método validado de HPLC.

Palavras-chave: Rosuvastatina Cálcica. Espectrometria de Massas por Ionização e

Dessorção a Laser Assistida por Matriz. Análise Quantitativa. Controle de Qualidade.

ABSTRACT

A sensitive technique, selective and that allows elucidating the chemical structures

in the drug formulation is mass spectrometry. It is a technique widely used for

active pharmaceutical ingredients (API) analysis, impurities and degradation

products. In this context, this study employs a novel approach for the quantitation

of active pharmaceutical ingredients using mass spectrometry imaging. This

strategy uses a filter paper previously “eluted” with a MALDI matrix solution as a

support for analyte application. Samples are submitted to mass spectrometry

imaging (MSI) and quantification through characteristic fingerprints is finally

performed. Results for the content of rosuvastatin from a commercial formulation

are comparable to those obtained with a validated HPLC method.

Key words: Rosuvastatin Calcium. Spectrometry, Mass, Matrix-Assisted Laser

Desorption-Ionization. Quantitative Analysis. Quality Control

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Esquema simplificado mostrando a biossíntese do colesterol. Em destaque, a enzima HMG-CoA redutase, que é inibida pela ação das estatinas………………………………………………….………………..…14

Figura 2 As estruturas químicas das estatinas e a reação catalisada por HMG-CoA redutase.....................................………………..……………………15

Figura 3 Estrutura química da Rosuvastatina ......………………………..………..16

Figura 4 Componentes básicos de um cromatógrafo liquido …………….....……24

Figura 5 Ionização por MALDI …………….....…………………….……………..…25

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

BPF Boas Práticas de Fabricação

CHCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico

Cmáx

CQ

Concentração plasmática máxima

Controle de Qualidade

DAC Doença Arterial Coronariana

DAD Detector de arranjos de diodos (Detector diode array)

DESI Ionização de dessorção por elétron-spray (Desorption electrospray ionization)

ESI Ionização por elétron-spray (Electrospray ionization)

HDL Lipoproteína de alta densidade (High density lipoprotein)

HMG Hidroximetilglutarílico

HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A

HPLC

IFA

Cromatografia líquida de alta eficiência (High-performance liquid chromatography)

Insumo Farmacêutico Ativo (Active Pharmaceutical Ingredientes)

LC Cromatografia líquida (Liquid chromatography)

LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein)

MALDI Ionização por dessorção a laser assistida por matriz (Matrix-assisted laser

desorption/ionization)

MS Espectrometria de massas (Mass spectrometry)

MSI Espectrometria de massas por imagem (Mass spectrometry imaging)

MS/MS Espectrometria de massas em tandem

VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa (Very low density lipoprotein)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................13

2. OBJETIVOS.................................................................................................27

3. METODOLOGIA...........................................................................................28

4. RESULTADOS.............................................................................................31

5. DISCUSSÃO GERAL...................................................................................38

6. CONCLUSÃO...............................................................................................40

7. REFERÊNCIAS............................................................................................41

8. ANEXOS......................................................................................................46

13

1. INTRODUÇÃO

Estatinas

As estatinas são agentes hipolipemiantes que exercem os seus efeitos

através da inibição da HMG-CoA redutase, enzima fundamental na síntese do

colesterol. (1) São os fármacos mais usados para tratamento das hiperlipidemias

em prevenção primária e secundária, com o propósito de diminuir os níveis de

lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e reduzir os riscos de doença arterial

coronariana (DAC). Estes efeitos são resultantes da atividade inibidora das

estatinas sobre a enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA)

redutase, com a propriedade de bloquear a conversão do substrato HMG-CoA em

mevalonato, inibindo os primeiros passos da biossíntese de colesterol. Estas

substâncias, capazes de mimetizar o substrato natural, podem ser divididas em

naturais e sintéticas e diferem fundamentalmente em termos de potência, perfil

farmacocinético, interação farmacológica e efeito indesejado relacionado à

miotoxicidade. (2-5)

14

Figura 1: Esquema simplificado mostrando a biossíntese do colesterol. Em destaque, a enzima HMG-CoA redutase, que é inibida pela ação das estatinas.

Mevastatina (ou compactina) foi o primeiro inibidor de HMGCoA redutase

descoberto em 1976, originalmente isolado como produto metabólico de culturas

de Penicillium citrinium (6), sendo sua afinidade pelo sítio enzimático cerca de

10.000 vezes superior ao substrato HMG-CoA. Por outro lado, lovastatina (ou

mevinolina) foi isolada posteriormente de culturas de Aspergillus terreus e

Monascus ruber com estrutura semelhante à mevastatina (grupo 6´-metílico

adicional), mas com potência superior. Em 1987 lovastatina foi aprovada pelo FDA

para uso terapêutico, enquanto mevastatina foi abandonada devido a problemas

na morfologia intestinal de cachorros e toxicidade hepatocelular verificada em

ratos. (7)

15

Figura 3: As estruturas químicas das estatinas e a reação catalisada por HMG-CoA redutase.

As estatinas são bem toleradas com boa margem de segurança durante a

utilização prolongada. Os efeitos colaterais não são frequentes, mas um dos mais

sérios está relacionado à ação hepatotóxica, com possível aumento das enzimas

aspartato e alanina transaminases. Miopatias, com evolução a rabdomiólises e

insuficiência renal, são raras, mas são efeitos graves associados ao uso de

estatinas. O uso concomitante de estatinas com eritromicina, ciclosporina, niacina

e fibratos aumenta o risco de miopatias em 10-30% dos pacientes. (2-5)

16

Em 2002, atorvastatina foi o fármaco mais vendido no mundo, rendendo

para o fabricante Pfizer cerca de US$ 8 bilhões. (8) A partir de 2004, a

rosuvastatina foi aprovada em 154 países e lançado em 56. Aprovação nos

Estados Unidos pela FDA veio em 12 de agosto de 2003. (9) A rosuvastatina é

hoje a estatina mais vendida no mundo. (10) A figura 3 mostra a estrutura química

da rosuvastatina.

A faixa terapêutica das estatinas é de 10-80 mg/dia. A faixa de dose usual é

de 10 mg a 40 mg, por via oral, uma vez ao dia. A dose máxima diária de

rosuvastatina é de 40 mg. Doses elevadas devem ser usadas com precaução em

idosos, em pacientes com insuficiência renal ou hepática, hipotireoidismo ou

diabetes. (11)

Figura 3: Estrutura química da rosuvastatina

17

Aplicações de tratamento

A rosuvastatina, um agente hipoglicemiante, é um inibidor seletivo e

competitivo da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase, a enzima

limitante responsável pela conversão da HMG-CoA a mevalonato, um precursor

dos esteróis, inclusive do colesterol.

Em pacientes com hipercolesterolemia familiar homozigótica e

heterozigótica, formas não-familiares de hipercolesterolemia e dislipidemia mista,

a rosuvastatina reduz o colesterol total, LDL-colesterol (lipoproteína de baixa

densidade) e apolipoproteína B. A rosuvastatina também reduz o VLDL-colesterol

(lipoproteínas de densidade muito baixa) e os triglicérides e produz aumentos

variáveis no HDL-colesterol (lipoproteínas de alta densidade).

De uma forma geral, ela aumenta o número de receptores de LDL hepáticos

na superfície da célula, aumentando a absorção e o catabolismo do LDL.

Seu mecanismo de ação é semelhante ao de outras estatinas. A sua meia

vida de eliminação é de aproximadamente 19h e o seu tempo para a concentração

plasmática máxima (Cmáx) é alcançada em 5/3h após a administração oral. (12)

Pesquisas sugerem que a rosuvastatina pode diminuir o risco relativo de

ataque cardíaco e acidente vascular cerebral em pacientes sem hiperlipidemia,

mas com níveis elevados de proteína C-reativa altamente sensível. Isso pode

impactar fortemente a prática médica, colocando muitos pacientes em profilaxia

com a estatina. Como resultado deste ensaio clínico, o FDA aprovou a

rosuvastatina para a prevenção primária de eventos cardiovasculares.(13,14)

18

Controle de Qualidade na Industria Farmacêutica

A Indústria Farmacêutica é um segmento vital do sistema de cuidados da

saúde, já que conduz a pesquisa, fabrica e comercializa os medicamentos. A

realização do Controle de Qualidade (CQ) nas indústrias farmacêuticas é de

extrema importância para que a qualidade, segurança, eficácia e credibilidade dos

seus produtos sejam asseguradas junto à população que irá consumir estes

medicamentos. (15) Para garantir o cumprimento das legislações vigentes e de

suas políticas e procedimentos internos, com o objetivo de produzir produtos

farmacêuticos de qualidade, a empresa deve desenvolver organizações de

qualidade bastante sofisticadas, com responsabilidades bem definidas. Desta

forma, estão sendo apresentados novos desafios para o controle de qualidade e

para os sistemas que operam para assegurar esta característica essencial ao

produto. (15)

O CQ é parte das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos (BPF), cujas

atividades envolvidas são amostragem, especificações, ensaios, procedimentos

de organização, documentação e liberação que asseguram que os ensaios

necessários e relevantes sejam executados e que os materiais não sejam

liberados para uso, nem os produtos liberados para venda ou fornecimento, até

que a qualidade dos mesmos seja julgada satisfatória. (16)

A ANVISA regulamenta as Boas Práticas de Controle de Qualidade na

Indústria Farmacêutica através da Resolução RDC no 17, de 16 de abril de 2010.

Esta resolução estabelece requisitos mínimos a serem seguidos na fabricação de

19

medicamentos, para padronizar a verificação do cumprimento das BPF durante as

inspeções sanitárias. As matérias-primas para uso na indústria farmacêutica, tanto

os IFAs quanto excipientes, estão sujeitos a requisitos de qualidade farmacêutica

descritos nas BPF. Para garantir a máxima segurança do produto, as diretrizes de

BPF, contidas na Resolução RDC nº 17, requerem testes especiais, visto que

além dos testes rotineiros de liberação da substância, a identificação deve ser

realizada para todo recipiente de matéria-prima, de todos os lotes. (17)

Um sistema apropriado da Garantia da Qualidade aplicado à fabricação de

medicamentos deve assegurar:

• Que os medicamentos sejam desenvolvidos considerando a necessidade

do cumprimento das Boas Práticas de Fabricação.

• As operações de produção e controle estejam especificadas por escrito e as

exigências de BPF cumpridas.

• As responsabilidades gerenciais estejam claramente especificadas na

descrição de cargos e funções.

• Sejam tomadas providências à fabricação, suprimento e utilização correta

das matérias primas.

• Sejam realizados todos os controles nas matérias primas, produtos

intermediários, produtos granel, bem como outros controles em processo,

calibrações e validações.

• O produto terminado seja corretamente processado e conferido segundo

procedimentos definidos.

20

• Sejam fornecidas instruções e tomadas as providências necessárias para

garantir que os medicamentos sejam armazenados, transportados,

distribuídos e manuseados, de forma que a qualidade seja mantida por todo

prazo de validade.

• Haja procedimento de auto-inspeção e/ou auditoria interna de qualidade

que avalie regularmente a efetividade e a aplicação do Sistema de Garantia

da Qualidade.

• Que haja um sistema de treinamento e capacitação contínua dos

funcionários de toda a indústria.

• Que os fornecedores de materiais e matérias-primas sejam classificados,

segundo os critérios de qualidade.

Técnicas Analíticas

A caracterização de medicamentos e de seus contaminantes ou de

produtos de degradação exige técnicas analíticas sensíveis e seletivas para

determinar compostos existentes em sua formulação, bem como para elucidação

de mecanismos de reações bioquímicas.

A complexidade das substâncias existentes em medicamentos podem gerar

problemas à cromatografia e à espectrometria de massas, devido à separação de

matriz e ativo e supressão de íons, além de outros efeitos, sendo um grande

desafio científico. (18)

21

A espectrometria de massas por imagem apresenta vantagens particulares

sobre estas abordagens clássicas, quando aplicado ao estudo de moléculas

pequenas (com compostos de baixo peso molecular peso, 100-1000 Da) tal como

candidatos a fármacos: em contraste com LC-MS/MS, MALDI imaging permite a

detecção e o mapeamento de vários compostos de interesse simultaneamente

sem qualquer rotulagem, incluindo drogas, metabólitos lípidos, péptidos ou

proteínas, na mesma amostra de tecido. Há várias limitações em espectrometria

de massas com imagens em experimentos quantitativos, por exemplo, deposição

da matriz e suas propriedades, a única ionização de cada molécula, bem como a

dependência do sinal na natureza do tecido, todos representam fatores críticos

que devem ser tidas em conta de pré-análise. Para começar, o sinal detectado é

altamente dependente da deposição de matriz. A escolha da matriz, da

composição do solvente e a deposição influenciam no resultado do estudo. (19)

Além disso, uma elevada homogeneidade do analito da matriz de co--cristalização

de tecido é necessário para obter medições reprodutíveis e para minimizar sinal

de variação. (20) Além do pulverizador manual e de (21), novos dispositivos de

deposição de matriz usando nebulização (22) têm sido desenvolvidos para

estabelecer procedimentos automatizados e padronizados.

Considera-se também uma técnica não-destrutiva, assim, a amostra pode

ser utilizada para análises posteriores. (19)

A ampliação do campo de pesquisa para análise de substâncias em

produtos farmacêuticos, o processo de fabricação e a composição dos

medicamentos pela indústria farmacêutica são desafios, que auxiliarão na

melhoria na produção e qualidade dos medicamentos brasileiros.

22

Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está

fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que

ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e

a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e

estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

(23)

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua

utilização é atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na

separação dos componentes de extratos de folhas (24), porém há relatos que com

mais de um século e meio antes do russo, já se usavam a cromatografia embora

com uma conotação diferente. (25) Nesse estudo do botânico russo, a passagem

de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com

carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à

separação dos componentes em faixas coloridas. (24) Este é provavelmente o

motivo pelo qual a técnica é conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie

= escrita), podendo levar à errônea idéia de que o processo seja dependente da

cor.

Entre os métodos de análise em controle de qualidade, a cromatografia

ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação e

auxiliar a identificação e quantificação das espécies químicas, principalmente em

conjunto com outras técnicas de análise. Embora não identifique os compostos

23

separados, pode auxiliar neste processo. Sua maior vantagem consiste na

conservação estrutural dos compostos separados. (26)

Entre os contaminantes e produtos de degradação das estatinas existem

compostos com diferentes toxicidades, portanto, é necessária para uma

determinação mais exata a separação e quantificação individual de cada

composto considerando-se a atividade de cada um deles. (26) As técnicas

cromatográficas se aplicam muito bem a essa finalidade. Concomitantemente, um

grande número de medicamentos apresenta estatinas, contudo o controle desses

compostos tem sido dificultado pela falta de laboratórios preparados para a

realização das análises, mas, principalmente, pela falta de metodologias analíticas

adequadas. A cromatografia em camada delgada (CCD) é um método barato,

rápido e muito eficiente para separação de compostos e atende muito bem as

necessidades analíticas de uma avaliação inicial (screening). (27,28)

A determinação de estatinas, através de técnicas como a cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) tem sido desenvolvida em função de sua rapidez,

resolução, alta sensibilidade, precisão, exatidão e pela possibilidade de

determinação das diferentes contaminantes de estatinas em uma única corrida

para cada classe desses compostos é sem dúvida uma boa alternativa para

análise quantitativa. (29)

Por outro lado, essa técnica apresenta algumas desvantagens como: (I) o

alto consumo de solventes orgânicos tanto no preparo de amostra como na fase

móvel; (II) as longas corridas cromatográficas, chegando a até 60 minutos em uma

análise de impurezas; (III) a necessidade de extração da amostra para não haver

contaminantes na corrida cromatográfica; (IV) o baixo tempo de vida útil das

24

colunas cromatográficas; (V) o preço das colunas cromatográficas, que se torna

um fator limitante dessa técnica pois para cada tipo de substâncias é necessário

utilizar uma coluna específica e (VI) impossibilidade de determinar compostos

desconhecidos presentes da corrida cromatográfica.

Figura 4: Componentes básicos de um cromatógrafo liquido.

Espectrometria de Massas e Dessorção a Lazer Assistida por Matriz (MALDI-

MSI)

A importância da espectrometria de massas na elucidação estrutural e

testes para avaliação preliminar (screening) para produtos farmacêuticos e

correlatos é inquestionável. (29) Indubitavelmente, os avanços significativos das

técnicas de ionização (“Electrospray”) ESI e recentemente o (“Desorption

Electrospray Ionization ”) DESI e o aumento da sensibilidade dos equipamentos

contribuíram muito para a aplicação da EM. (30) As análises de biomoléculas e

biomarcadores de processos encontradas em perfumes (31), ativos de limpeza

(32), energéticos (33), e matrizes complexas (34) foram facilitadas, sendo a chave

25

da difusão da técnica nos últimos anos. Na ionização por electrospray, as

substâncias da solução analítica são protonadas ou desprotonadas, formando

cátions ou ânions. Esta solução é então nebulizada através de um tubo capilar

onde se aplica uma alta voltagem. Devido a ação deste potencial aplicado no

capilar e dos gases de solvatação e nebulização, o solvente presente nas

gotículas é evaporado restando assim a molécula protonada ou desprotonada na

fase gasosa. Entre as características da ionização por eletrospray, pode-se citar a

baixa energia dos íons formados e a possibilidade da formação de íons

multicarregados (30).

Figura 5. Ionização por MALDI.

Com o avanço de lasers modernos, Ionização e Dessorção a Lazer

Assistida por Matriz (MALDI-MSI) tornou-se um dos métodos de ionização mais

amplamente utilizados devido à sua alta sensibilidade, à velocidade, à faixa de

26

massa molecular ampla (> 300 Da até 200 000 Da) e à resolução espacial.

Ensaios quantitativos por MALDI desenvolvidos para a análise de alta velocidade

de moléculas pequenas tornaram-se bem estabelecidas e podem proporcionar

precisão de qualidade igual ou maior (<5% de desvio padrão relativo, DPR) do que

a sua ionização por electrospray (ESI). Além disso, MALDI tem um intervalo

dinâmico linear de 2 a 3 ordens de magnitude, e estes atributos positivos devem,

ainda, estender a MALDI-MSI. (35)

A espectrometria de massas por Imagem tem sido geralmente considerada

como um método qualitativo com algumas manifestações recentes de análises

quantitativas para pequenas moléculas. (36,37) Fundamentalmente, o sinal

proporcionado pela MSI é uma medição direta do analito em relativa abundância

e, por conseguinte, com a utilização de matrizes adequadas e os padrões internos,

é possível a obtenção de dados quantitativos (38).

O desafio associado à quantificação MALDI-IMS tem sido na determinação

de padrões apropriados, assim como na escolha e deposição homogénea de um

padrão interno na superfície do tecido que pode consistentemente refletir as

alterações na extração de íons e da eficiência de ionização em resoluções em

escala micrométrica (35).

27

2. OBJETIVOS

Objetivo Geral

- Quantificação do insumo farmacêutico ativo de rosuvastatina através da técnica

de espectrometria de massas por imagem (MALDI-MSI).

Objetivos Específicos

- Desenvolver um novo modelo de quantificação de insumos farmacêuticos ativos

através da impregnação de matriz em papel utilizando comprimidos comerciais de

rosuvastatina.

- Realizar a comparação dos resultados com a cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC), a técnica analítica tradicional e validada, com os resultados

encontrados na impregnação de matriz em papel por espectrometria de massas

por imagem.

28

3. METODOLOGIA

Preparação do padrão

Uma solução estoque de padrão de rosuvastatina concentrado foi

empregue para se obter todas as diluições subsequentes utilizados na curva de

calibração. Foi utilizado 98,5 mg de rosuvastatina (96,1% de pureza) em 20 mL de

metanol: acetonitrila (50:50), para alcançar a uma concentração final de 4,733

mg.mL-1.

Preparação de amostra

Um pedaço de papel de filtro quantitativo 80 g / m2 (teor de cinzas nominal:

90 ug) com tamanho de poro de 6 mm foi cortado em tiras de 2,5 x 7,5 cm. Uma

solução matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) foi preparada em

metanol / acetonitrila (50:50) a uma concentração final de 25 mg / mL. As tiras de

papel de filtro foram introduzidas numa câmara de vidro contendo a solução de

matriz na parte inferior e foram deixados para eluir completamente. Amostras de

vinte (20) comprimidos genéricos de um único fabricante de rosuvastatina 10 mg,

foram trituradas e diluídas em metanol / acetonitrila (50:50) e utilizados para

quantificar o teor de rosuvastatina. O padrão de rosuvastatina foi diluído no

mesmo sistema de solventes, em diferentes concentrações (0,12, 0,24, 0,36, 0,48

e 0,6 mg.mL-1, ou seja, 25. 50, 75. 100 e 125%, respectivamente para construir

uma curva de calibração. 2 µL das soluções amostras finais foram aplicadas sobre

as tiras de papel de filtro, em triplicada, e submetidas para análise em

espectrometria de massas após a secagem do solvente.

29

Espectrometria de massas

Os experimentos foram realizados em um instrumento LTQ-XL MALDI

equipado com recursos de imagens. As condições de operação típicas foram: 10

mJ de potência do laser, de 60 µm de tamanho de passo de varredura, tamanho

de amostra de 600 x 600 mm, três disparos de laser por passo e colisão induzida

por energia de dissociação fixado em 40 unidades, utilizando hélio como o gás

tampão para medições em MS / MS. Análises de varredura foram realizadas na

faixa de m / z de 380-600, no modo de íon positivo.

Tratamento dos dados

Resultados espectrais e MS / MS foram analisados utilizando o software

Mass Frontier (v. 6.0, Thermo Scientific, San Jose, CA). Dados de MSI foram

tratados utilizando o software ImageQuest (Thermo Scientific, San Jose, CA); A

quantificação foi realizada usando espectrometria de massas por imagem, onde as

áreas (pixels) das imagens obtidas em escala de cinza foram analisadas utilizando

o software ImageJ (National Institutes of Health - Open Source). Este software

fornece valores arbitrários em relação a de intensidade de pixels: uma cor mais

clara na escala, significa menor quantidade da substância, enquanto uma cor mais

escura significa uma quantidade mais elevada. Os valores arbitrários obtidos pelo

ImageJ foram então utilizados para traçar a curva analítica.

HPLC

30

As análises cromatográficas utilizadas para comparação em um método

validado foram realizadas em um HPLC LaChrom Elite, instrumento Merck Hitachi

equipado com uma coluna de Purospher® Star RP18e 150 x 4.6mm 5µm. Fase

móvel é constituída por uma solução de ácido fórmico 0,05 M e acetonitrila

(65:35). Outros parâmetros foram: Taxa de fluxo fixado em 2,0 mL.min-1; volume

de injeção de 10 µl; temperatura de forno de 35 °C e o detector DAD fixado em λ =

250 nm. As amostras foram diluídas de acordo com o método acima descrito, com

uma filtração através de um filtro de PVDF de 0,45µm. Todos os cálculos da

validação foram realizados utilizando o software Validation Manager (versão

3.40O, VWR International, Alemanha).

31

4. RESULTADOS

32

5.

33

34

35

36

37

38

5. DISCUSSÃO GERAL

Dois principais parâmetros de validação foram testados para verificar a

viabilidade desta aplicação: seletividade e linearidade. O primeiro foi verificado

através da caracterização por espectrometria de massas em “tandem” (MS / MS;

de alta resolução com atribuições de estrutura).

A verificação da linearidade foi realizada através do estabelecimento de

uma curva de calibração usando MSI e cinco pontos com concentrações que

variavam de 0,12-0,6 mg.mL-1. Após a preparação do papel de filtro, extraiu-se 10

mg de rosuvastatina em comprimidos obtidos a partir de um fabricante local e foi

medido utilizando a curva de calibração.

A recuperação observada em MALDI-MSI para a extração de rosuvastatina

em 100% (0,47 mg.mL-1) é 0,465 mg.mL-1 (98,23%). Assim, os resultados obtidos

para linearidade foram considerados validado de acordo com as especificações,

como estavam dentro da faixa de controle de qualidade do produto acabado (teor

deve estar dentro da faixa de 90-110%; HPLC: 99,8% de recuperação.

O uso de papel filtro impregnado de matriz como um suporte para ionização

em MALDI-MSI apresentou provas suficientes para ser considerado um método

eficaz para realizar uma avaliação quantitativa simples e eficaz de APIs. A

estratégia de eluição no papel com uma solução de matriz antes da incorporação

de amostra, elimina os potenciais problemas em relação à homogeneidade, o que

é uma desvantagem considerável na análise de MALDI. É possível observar a

dispersão homogênea da matriz entre as fibras de papel, o que aumenta o

potencial de ionização das moléculas depositadas sobre a tira de papel. Várias

39

vantagens podem ser, portanto, evidenciadas nesta abordagem; a utilização de

papel de filtro, um item barato de laboratório, tem uma gramatura e tamanho de

poro padronizados, bem como uma pequena e controlada quantidade de

impurezas (denominados como "teor de cinzas"), que são características

desejáveis para um suporte analítico. Além disso, utilizando a eluição para saturar

o papel com matriz, é uma estratégia de baixo custo, utilizando pequenas

quantidades de solvente e permitindo uma base homogênea para ionização, o que

é evidenciado pela linearidade observada nos ensaios, para além de uma

abordagem ecológica, com a geração de pequenos resíduos de solvente no

processo. Embora o HPLC é exato e preciso o suficiente, MALDI-MSI oferece uma

ampla faixa de recursos para auxiliar na caracterização e controle de moléculas

orgânicas que são adequados para o controle de APIs; MS / MS (em tandem MS)

surge como uma alternativa melhor e mais confiável para garantir a especificidade,

aumentando a seletividade método. A principal limitação da metodologia, em

comparação com HPLC, é, em termos de precisão e exatidão. Isto pode ser

explicado pelas características da ionização, intrínseca do método; MALDI usa um

laser pulsado para ionizar as moléculas, e a breve interrupção na formação dos

íons e, consequentemente, a detecção, podem influenciar diretamente nos

resultados quantitativos, provocando flutuações indesejadas e, às vezes, os

valores de desvio padrão relativo mais elevados quando comparados com a

abordagem convencional. No entanto, os experimentos evidenciaram que este

fenômeno tem pouca influência sobre os resultados, fornecendo valores que estão

dentro dos limites aceitáveis em todas as concentrações analisadas, de uma

forma muito simples e em curto tempo.

40

6. CONCLUSÃO

A proposta de quantificação de insumos farmacêuticos ativos (IFA) através

da técnica de impregnação de matriz em papel com Espectrometria de Massas por

Imagem se mostrou satisfatória.

Utilizando a nova técnica desenvolvida, foi possível quantificar de forma

simples e eficaz o IFA de rosuvastatina em apresentações comerciais, e

comparado com a técnica tradicional analítica validada de Cromatografia Liquida

de Alta Eficiência (HPLC).

A metodologia desenvolvida apresentou um grande avanço em relação aos

problemas de quantificação por imagem. Houve a eliminação dos potenciais

desvios com a homogeneidade da amostra e matriz.

A utilização dessa técnica na quantificação de insumos farmacêuticos

permite que seja utilizada no controle de qualidade de indústrias farmacêuticas,

nas áreas de controle na determinação da porcentagem do princípio ativo, na

quantificação das impurezas, na determinação da composição ou formulação de

um produto, proporcionando uma análise simples, rápida, especifica, seletiva e

com impactos ambientais reduzidos devido à baixa geração de resíduos de

solventes.

41

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46

8. ANEXOS