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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS

DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM BANANEIRA ‘PRATA-

ANÃ’

SUZANE ARIÁDINA DE SOUZA

2011


DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM BANANEIRA ‘PRATA-ANÃ’

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Montes Claros, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal no Semiárido, área de concentração em Produção Vegetal, para obtenção do título de “Magister Scientiae”.

Orientadora Profª. D.Sc. Sílvia Nietsche

JANAÚBA MINAS GERAIS – BRASIL

2011

Catalogação: Biblioteca Setorial Campus de Janaúba

Souza, Suzane Ariádina de.

S729d Diversidade de bactérias endofíticas em bananeiras ‘Prata-Anã’ [manuscrito] / Suzane Ariádina de Souza – 2011.

101 p.

Dissertação (mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal no Semiárido, Universidade Estadual de Montes Claros-Janaúba, 2011.

Orientadora: Profª. D. Sc. Silvia Nietsche. 1. Bananeiras. 2. Bactérias endofíticas. 4. Musa spp. I. Nietsche, Silvia. II. Universidade Estadual de Montes Claros. III. Título. CDD. 634.772


DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM BANANEIRA ‘PRATA-ANÃ’

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Montes Claros, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal no Semiárido, área de concentração em Produção Vegetal, para obtenção do título de “Magister Scientiae”.

Aprovada em 02 de setembro de 2011.

Profª. D.Sc. Sílvia Nietsche Profª. D.Sc. Márcia Regina Costa (Orientadora) (Coorientadora)

Profª. D.Sc. Adelica Aparecida Xavier D.Sc. Luciana Nogueira Londe (DCA- UNIMONTES) (EPAMIG)

JANAÚBA MINAS GERAIS – BRASIL

2011

A Deus, minha fonte de sabedoria e amor; À minha amada mãe, Marluce; Ao meu querido irmão, Augusto; Aos meus queridos avôs Alfredo e Deza; Ao meu namorado, Fabrício. Dedico

AGRADECIMENTOS

Mais uma etapa se finda, e agora só tenho a agradecer a todos que me

ajudaram a subir mais este degrau na escada da vida.

A Deus, meu grande mestre, por ter me carregado no colo nos momentos

mais difíceis desta caminhada;

À minha mãe, pelo amor incondicional, por ser meu exemplo de vida.

Ao meu irmão, Augusto, pelo apoio e estímulo;

Aos meus avôs Alfredo e Maria Joaquina, por estarem do meu lado

sempre que precisei;

A Fabrício, pelo amor, companherismo e paciência;

À CAPES, pela bolsa concedida, e à FAPEMIG, pelo apoio financeiro,

para execução deste trabalho;

À minha orientadora, Sílvia Nietsche, minha eterna gratidão, por todos

os ensinamentos, pela paciência, pelo apoio, oportunidade e pelas palavras de

estímulo;

À professora Márcia, pela ajuda, paciência, pela amizade e pelo

agradável convívio;

À professora Adelica, pela disposição, pelos conselhos e pelas valiosas

sugestões;

Ao pesquisador Eder Jorge de Oliveira, pela ajuda nas análises

estatísticas;

À pesquisadora Luciana Londe, pela ajuda na análise dos dados e pela

disposição;

Aos meus familiares, principalmente Tia Marlene, Alcides, Murillo,

Fernando e Alcilene, pelo apoio, convivência e pela moradia durante esses anos;

Aos colegas do Laboratório de Fitopatologia: Leandro, Isaac, Josiane,

Bruna, Umberson, Lívia, Rafael, Jefferson e Maria Isabel, pela amizade e

brincadeiras, agradeço, em especial, a Acleide, pela ajuda na realização do

experimento.

Aos amigos do laboratório de Biotecnologia: Renata, Elizete, Josiane,

João, Irton, Mara, Felipe, Rayka, Gláucia e Tallyta, pela convivência e

companherismo, em especial a Nayara, Tiago e Emilly, pela ajuda na condução

deste trabalho.

Aos colegas do mestrado, pela alegria e agradável amizade. Agradeço

especialmente Poly, Irani, Joseilton, Fábio, Léo e Renata, por todo apoio, pelas

palavras de conforto e por me escutarem nas horas de angústia.

A todos os funcionários da UNIMONTES, principalmente a Dona Ana e

Dona Brasilina, pela disposição em ajudar.

Enfim, a todos que estiveram ao meu lado durante essa caminhada.

Muito Obrigada.

SUMÁRIO

RESUMO .................................................................................................. I ABSTRACT ........................................................................................... III 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1 2 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................ 4 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................ 17 3.1 Coleta das Raízes e Isolamento das Bactérias .................................... 17 3.2 Caracterização dos isolados bacterianos com relação à resposta de Gram ......................................................................................................... 21 3.3 Teste de patogenicidade por meio da reação de hipersensibilidade ... 22 3.4 Caracterização da Diversidade via Marcador Molecular ................... 23 3.4.1. Extração de DNA ........................................................................... 23 3.4.2 Amplificação por rep-PCR .............................................................. 24 3.4.3 Amplificação pela técnica ARDRA ................................................ 25 3.4.4 Amplificação por PCR dos genes nifH ............................................ 26 3.5 Análise dos Dados Moleculares ......................................................... 27 3.6 Sequenciamento do DNA ................................................................... 27 4 RESULTADOS .................................................................................... 30 4.1 Isolamento das Bactérias .................................................................... 30 4.2 Caracterização dos isolados bacterianos com relação à resposta de Gram ......................................................................................................... 31 4.3 Teste de patogenicidade por meio da reação de hipersensibilidade ... 32 4.4 Análise de variância molecular .......................................................... 33 4.5 Sequenciamento do DNA bacteriano ................................................. 34 4.6 Caracterização da Diversidade via rep-PCR ...................................... 41 4.7 Caracterização da Diversidade pela técnica ARDRA ........................ 47 4.8 Caracterização do Gene nifH .............................................................. 56 5 DISCUSSÃO ........................................................................................ 60 6 CONCLUSÕES ................................................................................... 77 REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 78 ANEXOS ............................................................................................... 100

TABELAS

01 Localização geográfica das áreas de coleta de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ para isolamento de bactérias endofíticas.................................

18

02 Sítio de restrição das enzimas Hinf I, MspI, NdeI e RsaI........................ 25

03 Análise de variância molecular (AMOVA), de 201 isolados bacterianos provenientes de dezesseis populações de ‘Prata-Ana’, utilizando os marcadores moleculares REP, ERIC e BOX.........................

33

04 Análise de variância molecular (AMOVA), de 201 isolados bacterianos provenientes de dezesseis populações de ‘Prata-Ana’...

33

05 Identificação das bactérias endofíticas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ com base na identidade da sequência parcial do gene16S rDNA......

35

06 Frequência de bactérias endofíticas obtidos de raízes bananeira ‘Prata-Anã’coletadas em 16 áreas de cultivo no Norte de Minas Gerais e Guanambi (BA)...........................................................................................

39

07 Número de bandas monomorficas e polimorficas formadas com a utilização dos primers REP, ERIC e BOX.................................................

42

08 Distância genética entre os isolados da mesma área onde foram coletadas raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ por meio da técnica rep PCR...........................................................................................................

45

09 Agrupamento dos gêneros e espécies isolados de raízes de bananaeira ‘Prata-Anã’ utilizando a técnica rep-PCR..................................................

47

10 Distância genética entre os isolados da mesma área onde foram coletadas raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ utilizando os dados da técnica ARDRA.....................................................................................................

53

11 Agrupamento dos gêneros e espécies isolados de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ utilizando a técnica ARDRA.................................

55

12 Número de isolados e identificação de gêneros e espécies de bactérias endofíticas que amplificaram o gene nifH por área de coleta............................................................................................................

58

FIGURAS

01 Mapa indicando os municipios pertencentes ao Estado de Minas Gerais onde foram realizadas as coleta das raízes de bananeira ‘Prata-Anã’........................................................................................................................

19

02 Mapa indicando o municipio pertencente ao Estado da Bahia onde foi realizada a coleta das raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.............................................................

19

03 Infiltração de suspensão de 108 células bacterianas para determinação da reação de hipersensibilidade (A) e sintomas característicos de reação hipersensibilidade positiva em folha de fumo (B)....................................................

23

04 Variação na coloração e na forma das bactérias isoladas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’...............................................................................................................

30

05 Número de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC/g de raiz) de bactérias endofíticas de raiz de bananeira ‘Prata-Anã’ de diferentes áreas..............

31

06 Padrão de coloração de Gram negativa (A) e Gram positiva (B) das bactérias endofíticas isoladas de bananeira ‘Prata-Anã’.........................................................

32

07 Reação de hipersensibilidade negativa em plantas de pimentão (A), feijão (B) e fumo (C)...................................................................................................................

32

08 Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de isolados de bactérias endofíticas pelo iniciador BOX I. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 6 a 146: codigos dos isolados.............................................................................

42

09 Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de isolados de bactérias endofíticas pelos iniciadores ERIC I e ERIC 2. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 18 a 199; 141 a 162: códigos dos isolados.....................................................................................................................

43

10 Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de isolados de bactérias endofíticas pelos iniciadores REP I e REP 2. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 38 a 56: código dos isolados...................................................

44

11 Dendograma de dissimilaridade obtido através da técnica rep-PCR, dos isolados de bactérias endofíticas provenientes de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.........................................................................................................................

46

12 Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima RsaI ...................................

49

13 Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima MspI ..................................

50

14 Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima HinfI.....................................

51

15 Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima NdeI.....................................

52

16 Dendograma de similaridade obtido através da técnica ARDRA dos isolados de bactérias endofíticas provenientes de bananeira ‘Prata-Anã’...............................

54

17 Amplificação do gene nifH de 18 bactérias endofíticas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 4 a 67: códigos dos isolados....................................................................................................................

57

i

RESUMO

SOUZA, Suzane Ariádina. Diversidade de bactérias endofíticas em raízes de bananeira ‘Prata-Anã’. 2011. 101 p. Dissertação (Mestrado Produção Vegetal no Semiárido)- Universidade Estadual de Montes Claros, Janaúba- MG1 A bananeira (Musa spp.) é uma das fruteiras mais cultivadas em todo território nacional. Esta cultura, assim como outras plantas, está associada a microrganismos, que podem trazer benefícios às mesmas. Dentre estes, estão às bactérias endofíticas, que habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem causar prejuízos ao seu hospedeiro e sem produzir estruturas externas emergindo dos tecidos vegetais. A diversidade de microrganismos endófitos tem sido avaliada em muitas plantas, mas em banana, pouco se sabe sobre esta relação. Os objetivos do presente trabalho foram acessar a diversidade genética e identificar em nível de espécie as bactérias endofíticas presentes em raízes de bananeira ‘Prata-Anã’, por meio do uso de marcadores moleculares. O trabalho foi conduzido nos laboratórios de Fitopatologia e Biotecnologia do Campus Janaúba da Universidade Estadual de Montes Claros. Foram utilizados fragmentos de raízes de banana ‘Prata-Anã’, provenientes de quatro municípios do Norte de Minas Gerais e um da Bahia. Foi realizada uma desinfestação das raízes para isolamento das bactérias endofíticas. Os isolados bacterianos obtidos foram caracterizados com relação à resposta de Gram, e a patogenicidade foi testada pela reação de hipersensibilidade em plantas não hospedeiras, sendo usadas mudas de pimentão, feijão e fumo. A diversidade genética foi verificada utilizando as técnicas rep-PCR e ARDRA. Foram selecionados isolados pela presença do gene nifH. A identificação em níveis de gênero e espécie foi realizada por meio do sequenciamento parcial da região rDNA 16S. Foram isoladas 201 bactérias endofíticas, destas 151 foram classificadas como Gram-positivas e 50 como Gram-negativas. Nenhuma apresentou reação de hipersensibilidade nas plantas testadas. A técnica rep-PCR gerou, para cada primer: REP, ERIC e BOX, separadamente, perfis moleculares diferentes. Foram obtidos no total 50 locus passíveis de leitura, sendo que todos os fragmentos mostraram-se polimórficos. A análise de diversidade dos isolados por meio da técnica ARDRA, obtida pelos produtos de clivagem com as quatro enzimas de restrição, produziu 45 bandas polimórficas e nenhuma monomórfica. A RsaI foi a enzima que apresentou maior poder discriminatório, gerando 13 bandas diferentes, seguido de MspI com 12, HinfI com 11 e NdeI com 9 bandas.

1 Comitê de Orientação: Profª Silvia Nietsche- DCA/UNIMONTES (Orientadora); Profª Márcia Regina Costa - DCA/UNIMONTES (Coorientadora); Profª Adelica Aparecida Xavier - DCA/UNIMONTES; Pesquisadora Luciana Nogueira Londe - EPAMIG.

ii

A amplificação por PCR do gene nifH foi verificada em 40 isolados. Após o sequenciamento da região rDNA 16S dos 201 isolados bacterianos, foram obtidas 143 sequências com boa qualidade. A análise das sequências revelou que os isolados estão distribuídos em 17 gêneros bacterianos: Bacillus, Agrobacterium, Klebsiella, Paenibacillus, Lysinibacillus, Streptomyces, Artrobacter, Micrococus, Rhizobium, Sporolactobacillus, Acetobacter, Aneurinibacillus, Pantoea, Brevibacillus, Stenotrophomonas, Pseudomonas e Enterobacter, os quais incluem 16 espécies diferentes. O gênero Bacillus foi o que apresentou maior número de espécies isoladas. As bactérias identificadas nesse trabalho têm potencial para promoção de crescimento, solubilização de fosfato, controle biológico e fixação de nitrogênio. Palavras-chave: Musa spp., Bactérias endofíticas, rep-PCR, ARDRA, Bacillus sp.

iii

ABSTRACT

SOUZA, Suzane Ariádina. Diversity of endophytic bactéria in roots of ‘Prata-Anã’ banana. 2011. 101 p. Dissertation (Master’s degree in Plant Production in the Semi arid)- Universidade Estadual de Montes Claros, Janaúba- MG2 Banana (Musa spp.) is one of the most cultivated fruit trees in the country. That culture, as well as other plants, is associated with microorganisms that can benefit them. Among these microorganisms, are the endophytic bacteria, which inhabit the interior of plant tissues and organs without causing damage to their host and without producing external structures emerging from plant tissues. The diversity of endophytes microorganisms has been evaluated in many plants, but in bananas little is known about this relationship. The objectives of this study were to access the genetic diversity and identify at the species level endophytic bacteria present in roots of 'Prata-Anã' banana, through the use of molecular markers. The study was carried out in the laboratory of Plant Pathology and Biotechnology Campus Janaúba Universidade Estadual de Montes Claros. Fragments of roots of ‘Prata-Anã’ banana from four municipalities in the north of Minas Gerais and Bahia were used. It was accomplished a root desifestation in order to isolate the endophytic bacteria. The bacterial isolates were characterized as for the response of Gram, and pathogenicity was tested by the hypersensitivity reaction in non-host plants, being used red pepper, common beans and tobacco plants. The genetic diversity was verified using the ARDRA and rep-PCR techniques. Isolates were selected by the presence of the nifH gene. The identification at the genus and species levels was performed by partial sequencing of 16S rDNA. They were isolated 201 endophytic bacteria, of these 151 were classified as Gram positive and 50 as Gram negative. None showed hypersensitivity reaction in the tested plants. The rep-PCR technique generated for each primer: REP, ERIC and BOX, separately, different molecular profiles. We obtained a total of 50 readable loci, and all fragments were shown to be polymorphic. The diversity analysis of isolates by ARDRA technique, obtained through cleavage products with four restriction enzymes, produced 45 polymorphic bands and no monomorphic. The RsaI was the enzyme which presented the highest discriminatory power, generating 13 different bands, followed by MspI with 12, HinfI with 11 bands and NdeI with 9 bands. Theamplification of the nifH gene by PCR was detected in 40 isolates. After the

1 Guidance Committee: Profª Silvia Nietsche- DCA/UNIMONTES (Adviser); Profª Márcia Regina Costa - DCA/UNIMONTES (Co-Adviser); Profª Adelica Aparecida Xavier - DCA/UNIMONTES; Pesquisadora Luciana Nogueira Londe - EPAMIG.

iv

sequencing of the 16S rDNA region from 201 bacterial isolates, were obtained 143 sequences with good quality. The sequence analysis revealed that the isolates are distributed among 17 bacterial genera: Bacillus, Agrobacterium, Klebsiella, Paenibacillus, Lysinibacillus, Streptomyces, Artrobacter, Micrococus, Rhizobium, Sporolactobacillus, Acetobacter, Aneurinibacillus, Pantoea, Brevibacillus, Stenotrophomonas, Pseudomonas and Enterobacter, which include 16 different species. The genus Bacillus showed the greatest number of isolate species. The bacteria identified in this study have potential for providing growth, phosphate solubilization, biological control and nitrogen fixation. Keywords: Musa spp., Endophytic bacteria, rep-PCR, ARDRA, Bacillus sp..

1

1 INTRODUÇÃO

A bananeira (Musa spp.) é uma das fruteiras mais cultivadas em todo

território nacional. O Brasil ocupa a quarta colocação no ranking mundial, tendo

uma produção de 7.116.808 toneladas e área colhida de 510.825 mil hectares. O

Estado de Minas Gerais destaca-se como quarto maior produtor do país, com

uma produção em 2010 de 654.861 toneladas (AGRIANUAL, 2011). A região

Norte de Minas é responsável por mais de um terço da produção estadual com,

aproximadamente, 241mil toneladas em uma área de 11.600 hectares. Os

maiores produtores da fruta são os municípios de Jaíba, Janaúba, Matias

Cardoso, Nova Porteirinha e Varzelândia (ABANORTE, 2008).

O Norte de Minas Gerais é reconhecido como o maior produtor mundial

da banana do grupo Prata, uma vez que, segundo os dados da Federação da

Agricultura de Minas Gerais - FAEMG, dos 11,6 mil hectares de área plantada

com banana, 80% são da cultivar Prata-Anã (ABANORTE, 2008).

Observa-se que as plantas, incluindo a bananeira, são consideradas um

microecossistema complexo, onde diferentes nichos são explorados por uma

extensa variedade de microrganismos, dentre eles os endofíticos (AZEVEDO et

al., 2000). São considerados endofíticos todos aqueles microrganismos que

podem ou não crescer em meios de cultura, ou seja, cultivados ou não, e que

habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem causar prejuízos ao seu

hospedeiro e sem produzir estruturas externas emergindo dos tecidos vegetais

(AZEVEDO e ARAÚJO, 2007). Em geral, são representados por fungos e

bactérias, que desempenham funções importantes no processo de adaptação da

planta com o meio ambiente (MENDES e AZEVEDO, 2007).

Com o aumento de informações sobre interação planta/microrganismos e

com a determinação das diferentes funções destes no interior dos vegetais, tem

2

sido dada atenção ao estudo dos mesmos, já que podem atuar no controle

biológico de inúmeras doenças, na promoção de crescimento vegetal

(HALLMANN et al., 1997; HALLMANN e BERG, 2006; RYAN et al., 2008) e

na biorremediação de áreas poluídas (NEWMAN e REYNOLDS, 2005;

GERMAINE et al., 2009). Além disso, o uso desses microrganismos pode ser

preferível ao uso de fertilizantes químicos e aos de pesticidas, não somente

devido ao menor custo, mas por contribuir com um sistema agrícola sustentável.

Dentre os microrganismos endofíticos, têm se destacado as bactérias, já

que elas estão entre os principais e mais abundantes grupos de microrganismos

que interagem com as plantas. O fato de elas serem capazes de colonizar os

tecidos internos das plantas, constitui-se em vantagens sobre outros

microrganismos que habitam partes externas, pois podem sobreviver em um

ambiente mais uniforme, além de serem menos afetadas pela temperatura,

potencial osmótico e radiação ultravioleta (LODEWYCKX et al., 2002).

Os microrganismos endofíticos têm sido isolados de raízes, nódulos,

caule, folhas e frutos em uma extensa variedade de plantas, incluindo muitas de

interesse agrícola, tais como, cana-de-açúcar (CAVALCANTE e

DOBEREINER, 1988), milho (ARAUJO et al., 2000), videira (BELL et al.,

1995), algodão (QUADT-HALLMANN et al., 1997), arroz (STOLZFUS et al.,

1997), tomate (PILLAY e NOWAK, 1997), citros (MARCON, 2002), batata

(REITER et al., 2003), trigo e sorgo (ZINNIEL et al., 2002), entre outras.

Tradicionalmente, o estudo de endofíticos foi baseado em técnicas de

isolamento em meios de cultura. Entretanto, nos últimos anos, com o avanço das

técnicas moleculares, tem sido possível investigar aqueles que não são

cultiváveis ou de natureza fastidiosa, possibilitando o estudo do material

genético a partir de amostras coletadas no ambiente (ASSUMPÇÃO et al.,

2009).

3

As técnicas moleculares têm sido utilizadas amplamente em estudos de

caracterização de bactérias endofiticas tais como, a Rep-PCR utilizando as

sequências conservadas ERIC, REP e BOX, a amplificação e restrição do rDNA

16S, bem como a clonagem e sequenciamento desse gene (LOUWS et al., 1994;

TORRES, 2005; RYAN et al., 2008). Além disso, os primers que permitem a

amplificação específica de genes codificando importantes características das

bactérias, como o gene nifH, necessários para a fixação de nitrogênio ou de

genes envolvidos na degradação de poluentes orgânicos, são utilizados para

estudar o potencial da população endofítica que participam de processos

importantes dentro da planta hospedeira (RYAN et al., 2008).

Vários trabalhos têm sido realizados com o objetivo de isolar, identificar

e estudar a diversidade de bactérias endofíticas nos tecidos de várias espécies de

plantas e suas interações (FERREIRA et al., 2008; VIDEIRA et al., 2009; LI et

al., 2010; MAGNANI et al., 2010). Há poucos relatos na literatura sobre a

caracterização de bactérias endofíticas na cultura da bananeira. As espécies:

Burkolderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981), Azospirillum brasilense

(Tarrand et al., 1979), Azospirillum amazonense (Magalhaes et al., 1984),

Burkholderia sp. (Yabuuchi et al. 1993 emend. Gillis et al. 1995), Citrobacter

sp.( Werkman and Gillen 1932), Klebsiella variicola (Rosenblueth et al. 2004)

foram citadas por Rosenblueth e Martínez-Romero (2006) como colonizadoras

de bananeira. Já Ganem et al. (2009), trabalhando com explantes de bananeiras

tetraploides cultivares Tropical e Galil, identificaram quinze gêneros de

bactérias, destes, o gênero Klebsiella sp.( Trevisan 1885 emend. Carter et al.

1999, emend. Drancourt et al. 2001) apresentou maior frequência.

Assim, os principais objetivos do presente trabalho foram acessar a

diversidade genética e identificar em nível de espécie as bactérias endofíticas

presentes em raízes de bananeira ‘Prata-Anã’, por meio do uso de marcadores

moleculares.

4

2 REFERENCIAL TEÓRICO

A banana (Musa spp.) é explorada na maioria dos países tropicais com

produção mundial de 90,7 milhões de toneladas (FAO, 2010). Segundo dados do

Agrianual (2011), o Brasil está entre os maiores produtores mundial de banana.

Dentre os estados produtores, destaca-se Bahia, São Paulo, Santa Catarina,

Minas Gerais e Pará. Minas Gerais é quarto maior produtor, tendo em 2010, um

total de 40.373 hectares de área colhida dessa cultura. Entre as regiões mineiras,

o Norte de Minas destaca-se como maior produtora, alcançando em 2009 uma

produção de 241 mil toneladas em uma área de 11.600 hectares (ABANORTE,

2008).

Segundo Souto et al. (1997), a cultura da banana foi introduzida na

região do Norte de Minas no início da década de 80, onde os primeiros plantios

ocorreram pelos produtores do Perímetro Irrigado do Gorutuba, situado em

Porteirinha-MG, com a variedade Nanicão, que sofreu intenso ataque de

nematoides, comprometendo a sua viabilidade na região. Essa variedade foi

sendo substituída gradativamente pela ‘Prata-Anã’, devido a sua aceitação,

melhor remuneração e qualidade dos frutos. Atualmente o Norte de Minas

Gerais é o maior produtor mundial da banana 'Prata-Anã' (SEAPA, 2008).

A localização da região Norte-Mineira é favorável com relação à

distância dos mercados consumidores, pois se encontra entre os da região

Sudeste e Sul e também próximo aos da região Nordeste do Brasil, tendo o

escoamento da produção facilitado. Associadas a isto a ampliação do nível

tecnológico no sistema produtivo e a organização dos produtores tem permitido

a expansão para novos mercados, inclusive o internacional (ALMEIDA et al.,

2000).

Embora exista um número expressivo de variedades de banana no Brasil,

quando se consideram aspectos como preferência dos consumidores,

5

produtividade, porte, tolerância a pragas e doenças, resistência à seca, e ao frio,

restam poucas cultivares com potencial agronômico para serem usadas

comercialmente. As cultivares mais difundidas no Brasil são : Prata, Prata-Anã,

Pacovan (responsáveis por aproximadamente 60% da área cultivada com banana

no Brasil), do grupo AAB, e Nanica, Nanicão e Grande Naine, do grupo AAA,

utilizadas principalmente na exportação (OLIVEIRA, 1999).

A banana ‘Prata-Anã’ (Musa acuminata x Musa balbisiana), proveniente

de uma mutação da cultivar 'Branca' ocorrida no início do século no estado de

Santa Catarina, é uma das mais cultivadas na região Norte-Mineira.Essa cultivar

possui fruto de seção pentagonal, com cinco quinas bem visíveis quando verde,

de tamanho médio, com 10 a 13 cm de comprimento e 3,5 a 4,0 cm de diâmetro,

com casca fina, de cor amarelo-ouro e endocarpo de cor creme-róseo pálido

(MASCARENHAS, 1999). A cultivar é tolerante ao frio, e dispensa o uso de

escoramento, devido ao grande vigor da planta (SILVA et al., 1999).

A prevalência do cultivo de bananeiras tipo Prata, com destaque para a

'Prata-Anã', evidencia a tradição de seu cultivo e a sua aceitação comercial. É

uma cultivar exigente em nutrientes, não só por produzir grande massa

vegetativa, mas também por apresentar elevadas quantidades de elementos

absorvidos pela planta e exportados pelos frutos (SILVA et al., 1999). Além

disso, é susceptível à sigatoka-amarela, à sigatoka-negra e ao mal-do-Panamá

(DONATO et al., 2009) e, moderadamente, à broca-da-bananeira (ALVES,

2001).

Assim, nas últimas décadas, tem se investido muito em pesquisas para

disponibilizar formas alternativas de nutrientes às plantas, e em metodologias

alternativas de controle de patógenos, com enfoque no uso de microrganismos

endofíticos (KUSS et al., 2007; BARROSO e NAHAS, 2008; RYAN et al.,

2008; LUCON et al., 2009).

6

O termo ‘Endófito’ (Endophyte) tem origem Grega, em que ‘endon’

significa ‘de dentro’ e ‘phyte’ significa ‘planta’ (CARROLL, 1988). Os

microrganismos endofíticos são todos aqueles que habitam o interior de tecidos

e órgãos vegetais sem causar prejuízos ao seu hospedeiro e sem produzir

estruturas externas, emergindo dos tecidos vegetais (AZEVEDO e ARAÚJO,

2007). São divididos em dois tipos: Tipo I, que não produzem estruturas

externas à planta e Tipo II, que produzem estruturas externas à planta

(MENDES e AZEVEDO, 2007). São diferentes dos microrganismos

patogênicos, que causam doenças nas plantas, e dos epifíticos que vivem na

superfície dos vegetais. No entanto, essa distinção entre microrganismos

endofíticos, patogênicos e epifíticos é complicada, já que um microrganismo

endofítico pode se tornar patogênico conforme o genótipo do hospedeiro e as

condições de ambiente, e um epifítico pode, eventualmente, entrar em uma

planta e lá permanecer por um determinado período, causando ou não danos à

mesma (AZEVEDO, 1998).

Um dos primeiros trabalhos com bactérias endofíticas foi realizado por

Colombo (1978), no qual relatou a ocorrência de bactérias endofíticas no talo de

algas, entre sifões e dentro dos filamentos cenocíticos. O autor sugeriu a

ocorrência de um equilíbrio fisiológico entre a bactéria e o seu hospedeiro.

Também supôs que o fato dos endofíticos se encontrarem próximo aos

cloroplastos e nas zonas mais jovens dos talos, indicaria uma ligação com a

atividade fotossintética da alga e sua provável dependência de oxigênio.

A partir dos anos 80, os trabalhos se tornaram mais frequentes. Jacobs et

al. (1985), empregando métodos e técnicas mais aperfeiçoadas de estudo e

análise, enumeraram, localizaram e caracterizaram bactérias endofíticas de

raízes de beterraba utilizando técnicas de imunológia e de microscopia

eletrônica de varredura. Os autores observaram um aumento na população de

7

bactérias nas regiões centrais e periféricas da raiz, e sugeriram que as regiões de

maior ocorrência constituem uma rota de colonização das bactérias.

As bactérias endofíticas têm sido alvo de vários estudos, com diferentes

culturas, uma vez que, segundo Misaghi e Donndelinger (1990), através de

processos coevolutivos elas conseguiram manter uma relação bastante íntima

com seu hospedeiro. Essas bactérias possuem também a habilidade de se manter

dentro dos tecidos vegetais isentos da competição microbiana, o que é uma

vantagem ecológica sobre as bactérias epifíticas. Essa característica pode

acrescentar uma vantagem no aproveitamento desses microrganismos em

aplicações biotecnológicas.

Apesar da ocorrência de microrganismos endofíticos, em diferentes

plantas, pouco se sabe sobre sua identidade, diversidade e níveis populacionais

nos diferentes tecidos. Acredita-se que de cerca de 300 000 espécies de plantas

que existem na Terra, cada planta individual é hospedeira de um ou mais

endófitos (STROBEL et al., 2004), principalmente por bactérias, uma vez que

elas constituem um dos grupos mais diversos no planeta e podem compreender

mais de um milhão de espécies (KENNEDY, 1999). Vários relatos indicam que

essas bactérias existem em uma variedade de tecidos em numerosas espécies de

plantas, sugerindo uma existência onipresente na maioria, se não em todos os

vegetais superiores (LODEWYCKX et al., 2002). Apesar dessa grande

diversidade, estima-se que tenhamos conhecimento de apenas uma pequena

fração das bactérias existentes (TORSVIK et al., 2002). Muitos fatores, tais

como rotação de culturas, tipos de solo e os fitopatógenos, são conhecidos por

influenciarem a estrutura da população de bactérias endofíticas (GRANER et al.,

2003).

Acredita-se que as bactérias endofíticas se dispersam nas plantas através

das sementes, propagação vegetativa, implementos agrícolas, ventos ou insetos

(BALDANI, 1997). Uma vez presentes no solo, elas penetram na planta, via

8

zona radicular, através de aberturas que ocorrem naturalmente como resultado

do crescimento das plantas ou através de pelos radiculares (SPRENT e de

FARIA, 1988). Além de proporcionar vias de entrada, essas aberturas favorecem

a exsudação radicular e estimulam o processo de quimiotaxia e permitem a

penetração direta das bactérias nas raízes. Além disso, tais substâncias

constituem fonte de nutrientes na região da rizosfera (LODEWYCKX et al.,

2002).

A maneira de penetração também pode ser pelas aberturas naturais,

estômatos, lenticelas, hidatódios, ou por injúrias causadas por insetos e

maquinário agrícola. Além disso, essas bactérias são capazes de degradar a

parede celular das plantas pela liberação de enzimas hidrolíticas como celulases

e pectinases, sendo essa uma possível forma de penetração. Embora observações

demonstrem a possibilidade de mecanismos de penetração ativa de algumas

bactérias endofíticas, muito pouco se sabe sobre a origem e regulação dessas

enzimas (LODEWYCKX et al., 2002). Uma maneira diferente de penetração é

descrito por Ashbolt e Inkerman (1990) em cana-de-açúcar através da associação

com cochonilha, e por Kluepfel (1993) via diferentes insetos.

Então, pode-se dizer que a colonização endofítica pode ser

intracelularmente e limitada ao interior de algumas células, intercelularmente

localizada, e intra e intercelular, ao mesmo tempo, de maneira sistêmica

(STONE et al., 2000). Os diferentes mecanismos de distribuição das bactérias

endofíticas podem estar relacionados com interações com outras bactérias ou

com os diferentes mecanismos de cada microrganismo, que lhes permitem

habitar vários nichos, representado pelos tecidos e, mais especificamente, pelos

espaços intercelulares no interior de cada tecido (DI FIORI e DEL GALLO,

1995).

Mesmo colonizando sistemicamente a planta, as bactérias endofíticas

apresentam preferência de colonização por certos tecidos. Kuklinsky-Sobral et

9

al. (2004) observaram, em soja, que a densidade e a diversidade dessas bactérias

variam de acordo com o tecido, fase de desenvolvimento da planta, mudanças

sazonais e genótipo do hospedeiro. Os autores constataram que a densidade

bacteriana foi maior na raiz e menor em folhas nessa cultura. Fisher et al. (1992)

isolaram bactérias e fungos endofíticos de três tipos de tecidos (epiderme, córtex

do caule e folha) de plantas de milho sadias, e verificaram que as partes das

plantas mais próximas do solo eram mais colonizadas por bactérias que a parte

superior das plantas.

Em termos quantitativos os estudos indicam que o tecido radicular é o

mais colonizado por bactérias endofíticas. O fato de a colonização ser abundante

no tecido radicular pode refletir uma consequência da raiz ser o sítio primário de

entrada dos endofíticos nas plantas. Além do mais, isso pode explicar a estreita

relação entre rizobactérias e bactérias endofíticas (LODEWYCKX et al., 2002).

De acordo com Germida et al. (1998), a comunidade de bactérias endofíticas é

um subconjunto da comunidade do rizoplano.

Várias são as razões que despertam o interesse pelo potencial

biotecnológico das bactérias endofíticas, tais como: íntima associação com a

planta hospedeira, fixação de nitrogênio, indução de resistência à condição de

estresse, mudanças nas condições fisiológicas da planta, produção de enzimas,

drogas de interesse farmacológico e produção de reguladores de crescimento

vegetal (LODEWYCKX et al., 2002). De fato, inúmeros relatórios mostraram

que as bactérias endofíticas são capazes de controlar patógenos em plantas

(STURZ e MATHESON, 1996; DUIJFF et al., 1997; KRISHNAMURTHY e

GNANAMANICKAM, 1997), insetos (AZEVEDO et al., 2000) e nematoides

(HALLMAN et al., 1997, 1998). Em alguns casos, podem também acelerar a

emergência das plântulas, promover o estabelecimento de plantas em condições

adversas (CHANWAY, 1997) e auxiliar no crescimento do vegetal (BENT e

CHANWAY, 1998).

10

São muitos os trabalhos de isolamento de bactérias em culturas com

interesse econômico. Li et al. (2008) isolaram bactérias endofíticas de nódulos

de soja dos gêneros Pantoea spp. (Gavini et al. 1989 emend. Mergaert et al.

1993 emend. Brady et al., 2010), Serratia spp. (Bizio, 1823), Acinetobacter spp.

(Brisou and Prevot 1954), Bacillus spp.(Cohn, 1872), Agrobacterium spp.(

Conn, 1942) e Burkholderia spp.. Germida et al. (1998) e Misko e Germida

(2002) encontraram uma alta proporção de endofíticos Bacillus sp.,

Flavobacterium sp.( Bergey et al., 1923 emend. Bernardet et al. 1996),

Micrococcus sp.( Cohn 1872 emend. Stackebrandt et al., 1995 emend. WIESER

et al., 2002), Pseudomonas sp. (Migula, 1894) e Rathayibacter sp.( Zgurskaya et

al., 1993) em raízes de canola e trigo. Magnani et al. (2010) isolaram 32

bactérias endofíticas de cana-de-açúcar, dessas 18 foram extraídas do caule e 14

das folhas.

Entretanto, há poucos relatos na literatura sobre o isolamento das

bactérias endofíticas na cultura da bananeira. Weber e Freire (2003) detectaram

a presença de bactérias diazotróficas em todas as amostras de raízes e de

pseudocaules de bananeiras coletados nas diferentes localidades de

microrregiões serranas do Estado do Ceará. Populações semelhantes foram

observadas por Weber (1998) em amostras de raízes e pseudocaules de

bananeiras provenientes do Rio de Janeiro e da Bahia.

Thomas et al. (2008), avaliando a comunidade endofítica em banana

cultivar Grand Naine, identificaram isolados dos gêneros Enterobacter

(Hormaeche and Edwards, 1960), Klebsiella, Ochrobactrum (Holmes et al.,

1988), Bacillus, Pantoea (Gavini et al., 1989 emend. Mergaert et al., 1993

emend. Brady et al., 2010) ou Staphylococcus (Rosenbach, 1884). Já Ganem et

al. (2009), trabalhando com explantes de bananeiras tetraploides, registraram

quinze bactérias, oito provenientes da cultivar ‘Tropical’ e sete da cultivar

‘Galil’, pertencentes a seis gêneros diferentes. Identificaram-se um isolado como

11

Erwinia chrysanthemi (Burkholder et al., 1953), seis como Klebsiella

pneumoniae pneumoniae (Schroeter 1886; Trevisan 1887), um como

Pseudomonas huttiensis (Leifson, 1962), um como Enterobacter gergoviae

(Brenner et al., 1980), um como Enterobacter cloacae (Jordan 1890)

Hormaeche and Edwards 1960, um como Paenibacillus polymyxa (Prazmowski

1880) (Ash et al., 1994) e um como Salmonella spp.( Lignieres, 1900).

O emprego de técnicas moleculares tornou-se possível a partir dos

estudos pioneiros de Pace et al. (1986), em análises de estrutura de comunidades

microbianas utilizando as informações da sequência de nucleotídeos do gene da

subunidade 16S do RNA ribossômico (16S rDNA). Este gene tem sido muito

utilizado por estar presente em todas as bactérias, derivar de um ancestral

comum, além de ser geneticamente estável e apresentar um tamanho suficiente

para análises filogenéticas (CHENEBY et al., 2000). O gene 16S rRNA tem sido

largamente utilizado para estudos taxonômicos, pois permite a análise de

sequências tanto estreitamente relacionadas quanto entre microrganismos mais

distantes (STACKEBRANDT e GOEBEL, 1994). Nos dias atuais, vários

estudos têm sido realizados utilizando técnicas moleculares, com o intuito de

identificar e avaliar a diversidade e a filogenia de microrganismos presentes nos

diferentes ambientes.

Dentre as técnicas moleculares, destacam-se a análise de rep-PCR, que

permite a amplificação de sequências definidas da molécula de DNA, e o

método de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição, ARDRA

(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) (CHUEIRE et al., 2000).

Várias técnicas utilizam a PCR como base para estudos de diversidade

de microrganismos. A rep-PCR (PCR- repetitivo) emprega a PCR para

relacionar o genótipo dos organismos, sendo usada em fingerprints genômicos

com a utilização de primers correspondentes a regiões repetitivas (rep) ao longo

do genoma (KOEUTH et al., 1995). Esses elementos repetitivos no DNA são

12

observados em bactérias, e servem como sítios para primers na amplificação do

DNA genômico (De BRUJIN, 1992). As bandas amplificadas no rep-PCR são

separadas de acordo com seu tamanho em gel de agarose, e geram um perfil que

serve como uma impressão digital específica de cada estirpe bacteriana

(LUPSKI, 1993).

Famílias de sequências repetitivas intergênicas têm sido encontradas em

procariotos e foram primeiramente identificadas em bactérias entéricas como

Escherichia coli. Três famílias de regiões repetitivas já foram descritas. São os

elementos REP (repetitive extragenic palindromic) de 35-40 pb, ERIC

(enterobacterial repetitive intergenic consensus) de 124-127 pb e o elemento

BOX de 145 pb (VERSALOVIC et al., 1991). O uso de rep-PCR tem a

vantagem de que os primers possuem sequências conhecidas e já foram

utilizados em estudos com várias bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

O primer BOX gera padrões de banda complexos e robustos, enquanto o

REP gera um menor nível de complexidade, porém produz padrões de bandas

reproduzíveis e diferenciadoras. O primer ERIC é mais sensível a condições

subótimas de PCR, como contaminantes na preparação do DNA; entretanto, gera

padrões altamente discriminatórios (RADEMAKER e DE BRUJIN, 1997;

RADEMAKER et al., 1998).

A técnica molecular que emprega os elementos BOX-PCR reúne várias

vantagens, uma vez que é uma técnica rápida, de execução fácil e altamente

discriminatória para espécies, produz resultados que representam bem as

análises baseadas na homologia DNA-DNA (De BRUJIN, 1992).

Esta técnica vem sendo muito utilizada para avaliar diversidade genética

de populações microbianas. Ela foi usada por Rademaker et al. (2000) para

estudar diversidade genética em população de Xanthomonas spp.(Dowson 1939

emend. Vauterin et al., 1995). Goris et al. (2003) empregaram BOX-PCR para

avaliar diversidade genética entre linhagens bacterianas que receberam o gene

13

gfp. Fernandes et al. (2003), em estudo de caracterização de rizóbios nativos em

culturas dos feijões guandu e caupi, verificaram um elevado grau de diversidade

genética entre as estirpes pela técnica BOX-PCR, mostrando eficiência para

diferenciar espécie, mas não para a diferenciação de estirpe de rizóbios.

A técnica aplicada ao estudo da diversidade microbiana, denominada

ARDRA, consiste na amplificação e posterior digestão do rDNA com enzimas

de restrição. Este método é baseado no princípio de que os sítios de restrição no

rDNA são conservados de acordo com padrões filogenéticos. Dessa forma, pode

ser utilizado o gene 16S rDNA para o estudo de grupos heterogêneos, ou a

região espaçadora entre o gene 16S e o 23S rDNA para o estudo de grupos

muito similares (RANJARD et al., 2000).

Os ácidos ribonucleicos ribossomais (rRNA) são considerados os

biopolímeros mais adequados para estudos de diversidade. Seus genes são

universalmente distribuídos, cuja molécula possui a maior conservação. Sua

variabilidade pode apresentar-se em maior ou menor extensão em diferentes

regiões da molécula (LANE et al., 1985). O valor desse método está na sua

rapidez e habilidade para avaliar diferenças entre grupos filogenéticos, efetuando

análises em vários níveis de classificação, inclusive em estudos de evolução,

gerando novos marcadores para estudos de genética de populações (ABD-

ELSALAM et al., 2003).

Recomenda-se cuidado na escolha do fragmento de rDNA a ser

amplificado e analisado. No caso da análise de diversidade de grupos de

indivíduos com elevada afinidade genética, o fragmento amplificado deve incluir

o espaço intergênico 16S-23S rDNA. Essa região intergênica apresenta maior

variabilidade não só na sua composição de bases como também no seu tamanho

ao serem comparadas as regiões gênicas 16S ou 23S (REIS JUNIOR et al.,

2004). O uso de primers específicos é vantajoso sobre aqueles não específicos

porque, em uma única reação, obtém-se um número elevado de bandas,

14

permitindo a detecção de polimorfismo suficientemente elevado para a análise

genética das bactérias (CHUEIRE et al., 2000).

Essa técnica tem sido aplicada para o estudo da diversidade microbiana

associada a vegetais ou a diferentes solos (KUKLINSKY- SOBRAL et al.,

2004), análise da diversidade genética de bactérias degradadoras de pesticidas

(DESAINT et al., 2000), caracterização de bactérias diazotróficas (CRUZ et al.,

2001), em estudos taxonômicos e filogenéticos (RODAS et al., 2003), entre

outros. Além disso, o ARDRA é mais rápido do que o sequenciamento da região

16S rDNA e menos oneroso. A maioria das caracterizações é realizada através

de um pequeno número de enzimas, amplamente utilizadas, e uma interpretação

visual do padrão de restrição (HEYNDRYCKX et al., 1996). Mocali et al.

(2003) pesquisaram a diversidade endofítica em Ulmus spp., utilizando as

técnicas de sequenciamento rDNA 16S e ARDRA, e encontraram representantes

dos gêneros Bacillus spp., Curtobacterium spp.( Yamada and Komagata 1972),

Pseudomonas spp., Stenotrophomonas spp.( Palleroni and Bradbury 1993),

Sphingomonas spp.( Yabuuchi et al., 1990 emend. Takeuchi et al., 1993 emend.

Yabuuchi et al., 1999 emend. Takeuchi et al., 2001 emend. Yabuuchi et al.,

2002 emend. Busse et al., 2003) , Enterobacter spp. e Stahlylococcus spp..

A presença do gene nifH, que codifica a unidade Fe-nitrogenase do

complexo nitrogenase, tem se tornado um marcador muito utilizado no estudo da

diversidade de endofíticos com potencial para fixar N2, em estudos

independentes do cultivo (IZQUIERDO e NUSSLEIN, 2006). Esse gene

apresenta sequências extremamente conservadas, sendo considerado um dos

genes funcionais mais antigos. As relações filogenéticas entre bactérias,

baseadas em divergência na sequência do nifH, apresentam-se de maneira

semelhante ao que ocorre com o 16S rDNA. A vantagem da utilização desse

gene para estudo de populações microbianas no ambiente é que, neste caso, se

15

trata de um gene funcional, o que permite uma correlação entre a estrutura e a

função da comunidade microbiana (ROSADO et al., 1999).

Teixeira et al. (2007), utilizando primers específicos do gene nifH para

os grupos Proteobacteria, Actinobacteria e Bacillus, verificaram que o produto

de amplificação do gene nifH foi observado somente em oito espécies

bacterianas endofíticas, de um total de 47 isolados de mandioca. Destas, algumas

Enterobacter cancerogenus (Urosevic, 1966) Dickey and Zumoff 1988,

Stenotrophomonas maltophilia (Hugh, 1981) Palleroni and Bradbury 1993 e

Pseudomonas fluorescens (Migula, 1895) apresentaram capacidade para

produção de hormônio de crescimento e para fixação de nitrogênio atmosférico,

constatado pela presença do gene nifH.

Cruz et al. (2001) identificaram oito novas bactérias fixadoras de

nitrogênio, além de Herbaspirillum seropedicae (Baldani et al., 1986 emend.

Baldani et al., 1996), H. rubrisubalbicans (Christopher and Edgerton 1930)

Baldani et al., 1996), Burkholderia brasilensis (Baldani et al., 1997) e

Burkholderia tropicalis (Reis et al., 2004), em algumas bactérias isoladas de

banana e abacaxi através da técnica ARDRA, revelando a grande diversidade de

bactérias fixadoras de nitrogênio associadas a essas culturas. Por outro lado,

Assumpção et al. (2009) isolaram bactérias endofíticas de diferentes grupos

morfológicos a partir de sementes de soja e identificaram 62 isolados por meio

do sequenciamento parcial do gene 16S rDNA. Os critérios utilizados para

selecionar os isolados para serem identificados foram morfológicos e baseados

na análise de ARDRA.

O sequenciamento do gene 16S rDNA tem auxiliado nos estudos de

diversidade genética bacteriana, pois permite a identificação das espécies

isoladas. Até 1975, a ideia de sequenciamento de cromossomos inteiros, parecia

improvável. Porém, atualmente inúmeras sequências completas de muitas

espécies já são conhecidas e registradas em bancos genéticos. A descoberta de

16

técnicas que utilizam enzimas de restrição, de clonagem gênica, de PCR e o

aprimoramento dos processos de eletroforese, com máquinas automatizadas de

sequenciamento, têm permitido as análises de DNA em larga escala (SNUSTAD

e SIMMONS, 2008).

Em bactérias, como a região 16S é altamente conservada, o

sequenciamento total ou parcial deste gene tem sido usado em estudos de

filogenia e taxonomia. Chueire et al. (2003) empregaram a técnica de

sequenciamento dessa região, com o intuito de estabelecer relações filogenéticas

de estirpes comerciais recomendadas para as culturas de soja e do feijoeiro no

Brasil. Videira et al. (2009) avaliaram a diversidade de bactérias associadas ao

arroz e registraram espécies fixadoras de nitrogênio através do sequenciamento

do gene 16S rRNA. Resultados de estudos baseados na amplificação e

sequenciamento de fragmentos dos genes de rDNA 16S mostraram que a

diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta (HUNTER-

CEVERA, 1998).

Até o momento, poucas sequências do genoma de bactérias endofíticas

foram publicadas (RYAN et al., 2008). Porém, várias sequências já estão

depositadas em banco de dados, e servem como ferramenta nos estudos de

diversidade genética. Portanto, as sequências genômicas oferecem informações

valiosas sobre a biologia das bactérias endofíticas, e quanto mais sequências

tornam-se disponíveis, maior número de informações é gerado sobre a

identidade e os mecanismos envolvidos no sucesso de colonização e interação

desses microrganismos com as plantas.

17

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta das Raízes e Isolamento das Bactérias

Foram coletadas raízes, em plantas jovens que não haviam emitido

cachos, pertencentes à cultivar Prata-Anã. As coletas foram realizadas em cinco

localidades (TABELA 1, FIGURA 1 e 2), raízes com 10 a 15 cm de

comprimento foram retiradas a 15 cm de profundidade, individualizadas em

saquinhos, identificadas e posteriormente transportadas para o laboratório de

Fitopatologia da UNIMONTES, onde foi realizado o isolamento das bactérias

endofíticas. No momento da coleta aplicou-se um questionário aos produtores

para um prévio conhecimento das condições de manejo do bananal (em anexo).

18

TABELA 1. Localização geográfica das áreas de coleta de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ para o isolamento de bactérias endofíticas.

Área Município Estado Coordenadas geográficas de cada área

1 Janaúba Minas Gerais S15º49’51.4’’; W 43º16’12.8’’; 548 m

2 Janaúba Minas Gerais S 15º50’2.1’’; W43º19’32’’; 503 m

3 Guanambi Bahia S 14º13’30’’; W42º46’53’’; 525 m

4 Porteirinha Minas Gerais S 15º35’31.8’’; W 43º16’24.2’’; 549 m

5 Nova Porteirinha Minas Gerais S 15º41’42.8’’; W43º16’31.4’’; 530 m

6 Nova Porteirinha Minas Gerais S 15º42’25.4’’; W 43º16’18.6’’; 527 m



9 Nova Porteirinha Minas Gerais S15º46’57.7’’; W 43º16’43’’; 575 m


11 Matias Cardoso Minas Gerais S 15º04’53.8’’;W 43º47’50.1’’; 487 m

12 Jaíba Minas Gerais S 15º15’2.9’’; W 43º55’20.5’’; 480 m

13 Jaíba Minas Gerais S 15º05’11’’; W 44º00’57.7’’; 458 m




19

FIGURA 1. Mapa indicando os municípios pertencentes ao Estado de Minas Gerais onde foram realizadas as coletas das raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.

FIGURA 2. Mapa indicando o município pertencente ao Estado da Bahia onde

foi realizada a coleta das raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.

Matias Cardoso Jaíba

Porteirinha

Nova Porteirinha Janaúba

Guanambi

20

Fragmentos de raízes de bananeira livres de sintomas foram lavadas em

água corrente durante três minutos e, posteriormente, para eliminação dos

microrganismos epifíticos, 1,5 g de fragmentos de raízes foram imersos em

álcool a 70% por 1 minuto, hipoclorito de sódio (NaCLO) a 4,0% por 3 minutos

e, em seguida, foram lavados por três vezes em água destilada e esterilizada.

Posteriormente, os fragmentos foram expostos em câmara de fluxo à luz

ultravioleta durante 10 minutos, transferidos para tubos de ensaio contendo 15

mL de solução salina estéril a 0,85% e submetidos a banho de ultrassom/10 min,

na potência de, aproximadamente, 40 Kz. O procedimento de desinfecção e

banho de ultrassom das raízes foi novamente repetido nas mesmas condições

descritas anteriormente, e os fragmentos foram transferidos para tubos contendo

solução salina estéril a 0,85% e mantidos em banho de ultrassom/10 min, na

potência de aproximadamente 40 Kz. Após o banho, esses fragmentos foram

macerados em 15 mL de solução salina a 0,85% e, novamente submetidos a

banho de ultrassom /10 min.

As suspensões obtidas foram diluídas até 10-1 e, a partir dessa suspensão

diluída, uma alíquota de 0,1 mL foi plaqueada em meio Agar-Nutritivo-

Dextrose-Levedura (10 g de dextrose, 5 g de extrato de levedura, 3 g de extrato

de carne, 5 g de peptona e 18 g de ágar), Batata Dextrose Agar (200 g de batata,

20 g de dextrose e 20 g de Ágar) e “Trypic Soy Agar” (30 g de TSA), com três

repetições cada, efetuando espalhamento com auxílio de alça de Drigalski. Após

48 h de incubação, sob temperatura a 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 12 h, realizou-

se a contagem do número de Unidade Formadora de Colônia por grama de raiz

(UFCs/g). As colônias bem individualizadas, que apresentaram diferenças

principalmente quanto à cor e ao formato, dentro de uma mesma amostra, foram

transferidas para tubos contendo meio de melhor crescimento no isolamento

(MARIANO et al., 2000).

21

Após o segundo banho de ultrassom e antes do maceramento das raízes,

foi realizado um plaqueamento para confirmar a natureza endofítica dos

isolados. Não havendo crescimento bacteriano nessas placas dentro de 48 horas,

os isolados obtidos pela trituração das raízes foram considerados endofíticos

(NAVES et al., 2004).

Os isolados foram armazenados em tubos contendo meio de melhor

crescimento (NYDA, BDA ou TSA), e mantidos em geladeira à temperatura de

4 ºC. Também foram armazenados em eppendorf contendo água mineral

esterelizada e mantidos em temperatura ambiente. Para realização dos ensaios,

os isolados mantidos em geladeira foram multiplicados em meio de melhor

desenvolvimento.

3.2 Caracterização dos isolados bacterianos com relação à resposta de

Gram

Os isolados bacterianos foram caracterizados com relação à resposta de

Gram. Para realizar a reação, adicionou-se uma gota de suspensão de bactéria

diluída, em lâminas flambadas em álcool 92,8% e, com o auxílio de um bastão

de vidro, preparou-se o esfregaço da suspensão bacteriana. Posteriormente, o

esfregaço foi coberto com solução cristal violeta durante um minuto e lavado

rapidamente com água corrente, em seguida coberto com lugol por um minuto e

novamente lavado em água corrente. Após esse período, as lâminas foram

lavadas com álcool etílico por 30 segundos e contrastadas com safranina por um

minuto, e novamente lavadas em água corrente (MARIANO et al., 2000). As

lâminas foram secas ao ar e observadas com objetiva de imersão. As células que

apresentaram coloração violeta foram consideradas Gram-positivas e coloração

avermelhada Gram-negativas.

Para fim de comparação, os isolados foram comparados com as espécies

Enterococcus faecalis e Escherichia coli (isolados gentilmente cedidos pelo

22

laboratório de Microbiologia da Unimontes) caracterizadas como Gram-positiva

e Gram-negativa, respectivamente.

3.3 Teste de patogenicidade por meio da reação de hipersensibilidade

Para a verificação da patogenicidade dos isolados bacterianos, foi

realizado o teste de reação de hipersensibilidade em plantas não hospedeiras da

bactéria, sendo utilizadas mudas de pimentão (Capsicum annuum Mill), fumo

(Nicotiana tabacum L.) e de feijão (Phaseolus vulgaris L.) produzidas em casa

de vegetação. Os isolados bacterianos foram multiplicados em meio TSA por 24

horas. Após esse período, adicionaram-se 20 mL de solução salina a 0,85% de

NaCl estéril às placas e, com o auxílio de uma lâmina de microscopia, as

colônias foram colocadas em suspensão e transferidas para um bécher contendo

água destilada. As suspensões bacterianas obtidas foram filtradas em gaze dupla,

transferidas para tubos de ensaio e ajustadas para 0,1 de absorbância em

espectofotômetro que corresponde, aproximadamente, a 108 células/mL. As

suspensões bacterianas foram infiltradas nas folhas com auxílio de seringas

descartáveis utilizadas para aplicação de insulina, sempre tangenciando as

nervuras até que o local mudasse de cor (FIGURA 3 A). Foram inoculadas três

folhas por planta para cada isolado. Após 24 horas da inoculação, avaliou-se o

aparecimento de possíveis reações de hipersensibilidade nas folhas das plantas

não hospedeiras (ROMEIRO, 2001).

A reação de hipersensibilidade positiva é caracterizada por uma

mudança no aspecto das folhas, com o colapso do tecido vegetal ao redor do

sítio de infecção. Nos pontos de infiltração ocorre necrose das células, tendo a

aparência de folha de jornal (FIGURA 3 B).

23

FIGURA 3. Infiltração de suspensão de 108 células bacterianas para determinação da reação de hipersensibilidade (A) e sintomas característicos de reação hipersensibilidade positiva em folha de fumo (B).

3.4 Caracterização da Diversidade via Marcador Molecular

3.4.1. Extração de DNA

Para a extração de DNA, cada isolado foi cultivado em meio TSB

líquido por 24 h a 37 ºC sob agitação constante de 180 rpm. A extração de DNA

genômico das bactérias foi realizada com o auxílio de um Kit de extração de

DNA, DNeasy Blood e Tissue Handbook, fabricado pela empresa Qiagen.

Posteriormente foi realizada a quantificação do DNA, em que cada amostra

extraída foi diluída (1:100) em H2O milli-Q estéril, sendo depois colocada em

curvette de quartzo e submetida à leitura da densidade óptica a 260 nm (DO260),

para estimar a quantidade de DNA, e a 280 nm (DO280) para estimar a

contaminação com proteínas, utilizando o espectofotômetro. Após a estimação

da quantidade de DNA, todas as amostras foram ajustadas para uma

concentração de 10ng/μL. Em seguida, o DNA foi submetido a uma eletroforese

em gel de agarose a 1,2 % (60 V por aproximadamente 1 h) em tampão TBE (89

mmol/L Tris base, 89 mmol/L Tris borato, EDTA 2mmol/L pH 8,0). Para

A B

24

visualização do DNA, o gel foi corado com brometo de etídio em uma

concentração final de 0,5 μmol/ml e submetido à luz ultravioleta.

3.4.2 Amplificação por rep-PCR

Os isolados foram comparados aos perfis genômicos obtidos por rep-

PCR (PCR-repetitivo). Os primers utilizados foram: REP1R-I (5´-

IIIICGICGICATCIGGC-3´) e REP2-I (5´-ICGITTATCIGGCCTAC-3`), ERIC

1R (5´- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA-3´) e ERIC2 (5´-

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3´); e BOXA1R (5´-

CTCCGGCAAGGCGACGCTGAC -3´) (LOUWS et al., 1994). Cada reação foi

composta de 2,5 µl de Tampão 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl); 0,7 µl de

MgCl2 (50 mM); 2 µl de dNTPs (2,5 mM de cada), 1 µl de cada primer (50

pmoles/µM), 0,3 µl de Taq Polimerase (5 U-1µl), 3 µl de DNA (10 ng/µl)

completando-se com água miliQ estéril para um volume de 25 µl.

As amostras foram amplificadas com os primers REP, BOX e ERIC e

submetidas ao programa de amplificação: uma etapa de desnaturação (95 ºC por

7 min), seguido de 30 ciclos (94 ºC por 1 min, 53 ºC por 1 min para anelamento

do primer BOX 1AR, 39 °C para o primer REP e 52 ºC para o ERIC, 65 ºC por

8 min, e uma etapa final de extensão (65 °C por 15 min).

Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1,2%.

Após corrida em tampão TBE 1X, por aproximadamente 3 h a 100 V/cm, o gel

foi corado com uma solução de brometo de etídio (20 mg/ml) e fotografado sob

luz UV. Marcador de peso molecular 100bp-DNA Ladder foi utilizado para

servir como parâmetro para estimar o tamanho dos fragmentos amplificados.

A análise dos fragmentos amplificados com os primers BOX, ERIC e

REP foi baseada na presença ou ausência de bandas, atribuindo-se os valores 1 e

0, respectivamente, a cada situação.

25

3.4.3 Amplificação pela técnica ARDRA

O DNA dos isolados bacterianos endofíticos foram amplificados com os

primers FGPS 1490 5´- TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3´ e FGPS132 5`-

CCGGGTTTCCCCATTCGG-3´. As condições de amplificação foram 0,8 µL

de dNTPs (2,0 mM de cada), 2,5 µL de tampão 10X, 0,75 µL de MgCl2

(50mM), 0,25 µL de cada primer (5 mM), 0,2 µL de Taq DNA polimerase (5 U

µL-1), 7 µL de DNA (50ng), com volume final de 25 µL . Em seguida, o

material foi colocado em termociclador e submetido ao programa de

amplificação: uma etapa de desnaturação (95 °C por 3 min), seguidos de 35

ciclos intermediários (94 °C por 1min, 60 °C por 1 min, 72 °C por 2 min), e uma

etapa final de extensão (72 °C por 3 min).

Os produtos de amplificações foram digeridos com as enzimas de

restrição que reconhecem quatro ou cinco pares de bases (TABELA 2), HinfI,

MspI, NdeI e RsaI, recomendado por Fernandes et al. (2003).

TABELA 2: Sítio de restrição das enzimas Hinf I, MspI, NdeI e RsaI.

Enzimas Sítio de restrição

Hinf I 5’...G↓ANTC...3 e 3’...CTNA ↑ G... 5’

Msp I 5´...C↓CGG...3´ e 3´...GGC↑C...5´

Nde I 5’...CA ↓ TATG...3 e 3’...GTAT ↑ AC... 5’

Rsa I 5´...GT↓AC...3´ e 3´...CA↑TG...5´

Para cada enzima foi preparada uma mistura contendo: 10µL do produto

de PCR; 2 µL do tampão específico para cada enzima (10X); 2 µL da enzima (5

U reação -1) e 18 µL de água mili-Q estéril. As misturas foram incubadas durante

16 h em banho-maria a 37 ºC. Os fragmentos foram analisados por eletroforese

em gel de agarose a 1,2%, em TBE 1X, a 100 V por 3 horas. Marcador de peso

26

molecular 100bp-DNA Ladder foi utilizado para servir como parâmetro para

estimar o tamanho dos fragmentos amplificados. Os fragmentos amplificados

foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados em sistema digital.

A análise dos fragmentos amplificados e digeridos foi baseada na

presença ou ausência de bandas, atribuindo-se os valores 1 e 0, respectivamente,

a cada situação.

3.4.4 Amplificação por PCR dos genes nifH

O DNA dos isolados obtidos a partir das raízes foram amplificados para

verificação da presença da região gênica nifH, segundo Teixeira et al. (2007),

utilizando o primer universal 19f F 5´-GGAATTCTGTGACCTAAAGCTGA-

3´ e 19f R 5´-AGCATACATTGCCATCATTTCACC-3´. As condições de

amplificação foram 2,0 µL de dNTPs (2,0 mM de cada), 2,5 µL de tampão 10X,

1µL de MgCl2 (50mM), 0,5 µL de cada primer (5 mM), 0,6 µL de Taq DNA

polimerase (5 U µL-1), 5 µL de DNA (50ng), com volume final de 25 µL . Em

seguida, o material foi colocado num termociclador e submetido ao seguinte

programa de amplificação: uma etapa de desnaturação (94 °C por 2 min),

seguidos de 30 ciclos intermediários (94 °C por 30 segundos, 52 °C por 30

segundos, 72 °C por 30 segundos), e uma etapa de final de extensão (72 °C por 7

min).

Os produtos de amplificação foram observados em gel de agarose 1,2% e

fragmentos de aproximadamente 270 pb foram esperados para o gene nifH.

Marcador de peso molecular 100bp-DNA Ladder foi utilizado para servir como

parâmetro para estimar o tamanho dos fragmentos amplificados.

A análise foi feita analisando a presença ou ausência da banda que

caracterizava o gene.

27

3.5 Análise dos Dados Moleculares

Os resultados obtidos com os primers tanto da técnica rep-PCR quanto

da ARDRA foram analisados com os dados em conjunto de acordo com cada

técnica, com o programa R 2.13, usando o coeficiente de similaridade de

coincidência simples (simple matching) que é dado pela fórmula S(SM) = a +

d/a + b +c + d. O valor de a corresponde ao número de bandas presentes na

unidade J e na unidade K; b é o número de bandas presentes na unidade K

mas ausentes na unidade J; c é o número de bandas presentes na unidade J mas

ausentes em K; d é o número de bandas ausentes em K e J. Portanto, a e d

representam o número de concordâncias positivas e negativas, respectivamente,

enquanto b e c representam as discordâncias (SNEATH e SOKAL, 1973).

A análise de agrupamento foi determinada pelo método UPGMA

(Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean) utilizando o programa

MEGA 5 (TAMURA et al., 2011).

3.6 Sequenciamento do DNA

Os isolados foram identificados através do sequenciamento parcial da

região 16S. Inicialmente foi amplificada a região 16S utilizando os iniciadores

27 (5'-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3') e 1492R (5'

ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3') através da técnica de PCR. A reação

com volume final de 25 L consistiu da mistura de 2,0 L de dNTPs (2,0 mM

de cada), 2,5 µL de tampão 10X, 0,75 µL de MgCl2 (50mM), 2,5 µL de cada

primer (5 mM), 0,3 µL de Taq DNA polimerase (5 U µL-1), 5 µL de DNA

(50ng), completando o volume final com água ultra pura. Em seguida o material

foi colocado em um termociclador e submetido à amplificação: uma etapa de

desnaturação ( 94 °C por 3 min.), seguido de 30 ciclos intermediários (94 °C

28

por 30 segundos, 50 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 min.) e uma etapa final

de extensão (72 °C por 7 min.).

Após a amplificação, os fragmentos foram analisados por eletroforese

em gel de agarose a 1,2%, em TBE 1X, a 100 V por 3 horas, posteriormente os

mesmos foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados em sistema

digital. Após essa etapa, os fragmentos que apresentaram 1500bp foram cortados

do gel e, com a ajuda de um kit de extração de gel (QIAquick Gel Extration kit-

Qiagen), o DNA bacteriano foi purificado, para posterior sequenciamento.

O sequenciamento das amostras foi realizado pela empresa ACTGene

Análises Moleculares LTDA (Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre,

RS) utilizando o sequenciador automático ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer

armado com capilares de 50 cm e polímero POP6 (Applied Biosystems). Os

DNAs-molde (30 a 45 ng) foram marcados utilizando-se 3,2 pmol do primer

1492R (5'-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3') e 2 L do reagente BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems) em um volume

final de 10 L. As reações de marcação foram realizadas em termociclador

GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) com uma etapa de

desnaturação inicial a 96 ºC por 3 min seguida de 25 ciclos de 96 ºC por 10 seg,

55 ºC por 5 seg e 60 ºC por 4 minutos. Após marcadas, as amostras foram

purificadas pela precipitação com isopropanol 75% e lavadas com etanol 60%.

Os produtos precipitados foram diluídos em 10 l de formamida, desnaturados a

95 ºC por 5 min, resfriados em gelo por 5 min e eletroinjetados no sequenciador

automático. Os dados de sequenciamento foram coletados utilizando-se o

programa Data Collection v1.0.1 (Applied Biosystems) com os parâmetros Dye

Set “Z”; Mobility File “DT3100POP6{BDv3}v1.mob”; BioLIMS Project

“3100_Project1”; Run Module 1 “StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100”; e Analysis

Module 1 “BC-3100SR_Seq_FASTA.saz”.

29

Logo após o sequenciamento das amostras, as sequências foram

comparadas com as presentes no banco de dados do NCBI (Nacional Center for

Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov), pelo programa BLAST

(Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL, et al., 1997) para

nucleotídeos. Pela comparação das sequências, os isolados foram identificados

em nível de espécie quando os valores de similaridade encontrados variaram

entre 98% e 100% e menores que 98% em nível gênero.

Após a identificação dos isolados, foi avaliada a frequência de gêneros e

espécies presentes em cada área onde foram realizadas as coletas.

30

4 RESULTADOS

4.1 Isolamento das Bactérias

Foram obtidos 201 isolados de bactérias endofíticas a partir das raízes de

bananeira ‘Prata-Anã’ cultivadas em diferentes pomares localizados nos quatros

municípios pertencentes à região Norte do Estado de Minas Gerais e em um

município do Estado da Bahia, Guanambi. Não foram observadas colônias nas

placas usadas como controle de assepsia, após o segundo banho de ultrassom,

confirmando assim a natureza endofítica dos isolados obtidos.

Por isolamento das bactérias endofíticas em meio de cultura, foi possível

observar vários tipos morfológicos, apresentando diferenças principalmente

quanto a cor e formato das colônias (FIGURA 4).

FIGURA 4. Variação na coloração e na forma das bactérias isoladas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.

Observou-se que dentre os meios utilizados no plaqueamento bacteriano,

o meio “Trypic Soy Agar” (TSA) favoreceu maior desenvolvimento bacteriano,

uma vez que promoveu crescimento de 53,8% dos isolados; já o Agar-Nutritivo-

Dextrose-Levedura (NYDA) com 29,8% e o Batata Dextrose Agar (BDA) com

apenas 16,4%.

31

A densidade de bactérias endofíticas isoladas nos meios de cultura

utilizados variou entre as áreas de coletas. Na área 12 observaram 13x104 UFC/g

de raiz, predominantemente dentro do gênero Bacillus spp. e na área 8,

quantificou-se a menor densidade de UFC/g de raiz, aproximadamente 1x104,

porém com maior diversidade comparativamente à área 12 (FIGURA

5).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Áreas de coleta

UF

Cx1

0-1/g

de

raiz

(x10

-4)

FIGURA 5. Número de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC/g de raiz) de bactérias endofíticas de raiz de bananeira ‘Prata-Anã’ de diferentes áreas.

4.2 Caracterização dos isolados bacterianos com relação à resposta de

Gram

Foi determinado o padrão de coloração de Gram de todas as bactérias

isoladas, sendo 150 classificadas como Gram-positivas e 51 como Gram-

negativas (FIGURA 6). A área 1, localizada em Janaúba, foi a que apresentou

32

maior número de bactérias Gram-negativas. Por outro lado, na área 2 e 5 foram

amostradas somente bactérias Gram-positivas.

FIGURA 6. Padrão de coloração de Gram-negativa (A) e Gram-positiva (B) das bactérias endofíticas isoladas de bananeira ‘Prata-Anã’. 4.3 Teste de patogenicidade por meio da reação de hipersensibilidade

Até os cinco dias após a inoculação, nenhum dos 201 isolados

bacterianos coletados apresentou reação de hipersensibilidade nas plantas de

fumo (Nicotiana tabacum L.), pimentão (Capsicum annuum Mill) e feijão

(Phaseolus vulgaris L.) (FIGURA 7) descartando a hipótese dos isolados

bacterianos serem fitopatogênicos.

FIGURA 7. Reação de hipersensibilidade negativa em plantas de pimentão (A), feijão (B) e fumo (C).

A B

A B C

33

4.4 Análise de variância molecular

Por meio da técnica rep-PCR foi demonstrado que a maior parte da

diversidade genética dos isolados, 91%, foi obtida dentro das áreas de coletas,

enquanto que entre as áreas a diferença foi de apenas 9% (TABELA 3).

Resultado similar foi obtido por meio da técnica ARDRA, sendo a diversidade

genética dentro dos locais de coletas de 93% e entre de 7% (TABELA 4).

TABELA 3. Análise de variância molecular (AMOVA), de 201 isolados bacterianos provenientes de dezesseis áreas, utilizando os marcadores moleculares REP, ERIC e BOX.

Fonte de variação

GL SQ QM Componentes de variância

Porcentagem da variância

P

Entre as áreas

15 67,721

4,515

0,196

9,0 <0,01

Dentro das áreas

185 381,245

2,061

2,061

91,0 <0,01

Total 200 448,965

2,245 2,257

100

TABELA 4. Análise de variância molecular (AMOVA), de 201 isolados bacterianos provenientes de dezesseis áreas, utilizando a técnica ARDRA.

Fonte de variação

GL SQ QM Componentes de variância

Porcentagem da variância

P

Entre as áreas

15 117,862

7,858

0,314

7,0 <0,01

Dentro das áreas

185 725,909

3,924

3,924

93,0 <0,01

Total 200 843,771

4,218 4,238

100

34

4.5 Sequenciamento do DNA bacteriano

As sequências consenso foram comparadas com sequências do banco de

dados público GenBank através do programa BLASTn (NCBI

www.ncbi.nih.gov). A análise dos dados apresentou valores de similaridade

variando entre 90% e 100% (TABELA 5). Dois isolados apresentaram 100% de

similaridade com as espécies de B. pumilus (Meyer e Gottheil, 1901) e B.

safensis (Satomi et al., 2006), e 90% foram encontrados entre um isolado e o

gênero Pseudomonas sp.

Após o sequenciamento parcial da região rDNA 16S dos 201 isolados

bacterianos, foram obtidas 143 sequências com boa qualidade. A análise das

sequências revelou que os isolados estão distribuídos por 17 gêneros

bacterianos: Bacillus, Agrobacterium (Conn, 1942), Klebsiella, Paenibacillus,

Lysinibacillus, Streptomyces, Artrobacter, Micrococus (Cohn 1872 emend.

Stackebrandt et al., 1995 emend. Wieser et al., 2002), Rhizobium,

Sporolactobacillus, Acetobacter (Beijerinck, 1898), Aneurinibacillus (Shida et

al., 1996 emend. Heyndrickx et al., 1997), Pantoea, Brevibacillus (Shida et al.,

1996), Stenotrophomonas, Pseudomonas e Enterobacter, os quais incluem 16

espécies diferentes (TABELA 6). Os diferentes gêneros e espécies de bactérias

endofíticas encontradas neste trabalho foram isolados de forma aleatória nas

áreas de coletas, e em função do bulk das amostras não foi possível detectar se

nos casos de isolamento de mais de uma espécie na mesma área, se estas eram

oriundas da mesma planta, e, portanto se tais espécies e/ou gêneros ocorriam

concomitantemente no mesmo nicho ecológico.

35

TABELA 5. Identificação das bactérias endofíticas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ com base na identidade da sequência parcial do gene16S rDNA.

Isolado E value 3* Identidade ** Organismo mais

relacionado *** Teste de Gram

Acesso no Genbank ****

1 0.0 98% Bacillus pumilus + HM006706.1 3 7.e -78 98% Bacillus.pumilus + JF738118.1 4 0.0 98% Bacillus subtilis + AY741264.1 5 7. e -119 99% Bacillus pumilus + HQ218993.1 6 2. e -47 98% Bacillus subtilis + JF926531.1 7 0.0 98% Agrobacterium tumefaciens - GU784794.1 9 1.e -116 98% Bacillus subtilis + AY741264.1

10 1.e -136 98% Bacillus pumilus + GQ917222.1 11 5.e-172 97% Bacillus sp. + HQ218993.1 12 4.e-116 98% Bacillus pumilus + GQ917222.1 14 0.0 99% Bacillus pumilus + HQ218993.1 15 4.e-127 98% Bacillus pumilus + GQ917222.1 16 4.e-111 97% Bacillus sp. + AJ550463.1 17 2.e -109 97% Bacillus sp. + JF802184.1 18 6.e-68 96% Bacillus sp. + EU977790.1 23 3.e -179 98% Klebsiella pneumoniae - JN201948.1 24 0.0 98% Bacillus thuringiensis + JF947357.1 25 0.0 98% Bacillus cereus + GU451184.1 26 0.0 98% Bacillus methylotrophicus + HM209756.1 27 0.0 97% Bacillus sp. + HQ256520.1 28 1.e-163 96% Paenibacillus sp. + EF178460.1 30 0.0 98% Bacillus axarquiensis + JF414764.1 32 4.e -76 94% Bacillus sp. + HQ003450.1 33 4.e -60 94% Bacillus sp. + GQ34O503.1 34 1.e-131 98% Bacillus pumilus + JN215511.1 35 2.e-88 94% Bacillus sp. + GQ340516.1 36 4.e-49 96% Lysinibacillus sp. + JF700466.1 37 2.e -146 96% Bacillus sp. + JN215502.1 38 3.e -97 96% Stenotrophomonas sp. - EU931559.1 39 3.e-72 94% Streptomyces sp. + FJ951435.1 40 7.e-99 97% Bacillus sp. + GQ340516.1 41 3.e-71 98% Bacillus subtilis + EF101707.1 42 2.e-89 96% Bacillus sp. + JN082266.1 43 3.e-61 91% Bacillus sp. + GU188935.1 44 4.e -173 98% Bacillus amyloliquefaciens + GU122948.1 45 0.0 98% Lysinibacillus sphaericus + JN215512.1 46 0.0 99% Bacillus pumilus + FJ236809.1 47 1.e -147 97% Bacillus sp. + FJ611939.1 48 0.0 98% Bacillus subtilis + AY741264.1 49 0.0 98% Bacillus licheniformis + EU366371.1

...continua...

3 * Valor E: probabilidade de se encontrar aleatoriamente o mesmo alinhamento entre duas sequências. **Identidade: porcentagem de identidade entre a sequência do isolado de banana e o organismo relacionado. ***Organismo mais relacionado: organismo que possui a sequência com a qual a sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado de banana apresentou maior homologia. ****Acesso no GenBank: número de acesso da sequência do organismo relacionado.

36

TABELA 5. Cont. Isolado E value * Identidade ** Organismo mais



50 3.e-108 96% Bacillus sp. + HM769816.1

51 0.0 98% Bacillus pumilus + HQ218993.1 52 3.e-133 96% Bacillus sp. + JF313264.1 54 7.e-85 92% Lysinibacillus sp. + JN215512.1 55 3.e -108 98% Bacillus subtilis + HQ334981.1 56 2.e-89 92% Bacillus sp. + GU269573.1 58 9.e -139 98% Bacillus pumilus + JN082265.1 59 1.e-71 95% Bacillus sp. + HQ334985.1 60 1.e -112 96% Lysinibacillus sp. + JF906500.1 61 1.e-55 95% Bacillus sp + AF332386.1 62 5.e-105 97% Bacillus sp. + HQ334981.1 63 3.e-108 98% Bacillus pumilus + GQ917222.1 64 0.0 98% Bacillus pumilus + JF271873.1 65 7.e-171 97% Bacillus sp. + EU366378.1 68 2.e-136 98% Bacillus safensis + JN092818.1 69 6.e-95 97% Bacillus sp. + GQ34O516.1 70 5.e-167 96% Bacillus sp. + GQ340516.1 71 2.e-166 97% Bacillus sp. + HM461161.1 73 4.e-117 99% Bacillus pumilus + GQ917222.1 75 1.e-50 93% Bacillus sp. + HM480346.1 76 7.e-130 97% Bacillus sp. + FJ937920.1 78 1.e-76 95% Bacillus sp. + EU977790.1 80 3.e-71 97% Bacillus sp. + EU972777.1 81 1.e-80 95% Bacillus sp. + HQ003450.1 83 1.e-60 95% Bacillus sp. + AF332386.1 84 0.0 98% Bacillus subtilis + HQ334981.1 86 8.e-17 92% Artrobacter sp. + FJ477042.1 87 8.e-155 98% Bacillus tequilensis + HM770882.1 88 3.e-175 98% Bacillus flexus + DQ870687.1 89 2.e-177 98% Bacillus subtilis + HQ234331.1 91 6.e-100 97% Bacillus sp. + JN092818.1 95 1.e-50 90% Bacillus sp. + GU939623.1 97 6.e-74 98% Bacillus amyloliquefaciens + AB301022.1 98 6.e -125 98% Micrococcus luteus + FJ380958.1 99 2.e-136 96% Bacillus sp. + AB301022.1 101 2.e-95 98% Bacillus pumilus + JN082266.1 102 7.e-89 98% Bacillus pumilus + EU977790.1 105 1.e-80 95% Bacillus sp + EU754844.1 106 5.e-85 95% Rhizobium sp. - AY693664.1 107 0.0 99% Bacillus thuringiensis + AM292316.1 108 2.e -84 95% Rhizobium sp. - AY693664.1 110 2.e -79 95% Bacillus sp + AF332386.1 111 8.e-114 99% Bacillus megaterium + AM237398.1 113 9.e -120 92% Bacillus sp. + JN208198.1 114 4.e-60 93% Bacillus sp. + AF332386.1 115 1.e-61 90% Bacillus sp. + GQ903406.1 116 4.e-91 98% Bacillus megaterium + HM104233.1 117 4.e-91 97% Bacillus sp. + JN082257.1

...continua...

37


relacionado ***Teste de Gram


120 6.e-131 97% Bacillus sp. + AM921636.1 123 1.e-60 95% Bacillus sp. + FN298317.1 124 1.e-55 93 % Bacillus sp. + EU977719.1 125 4.e-137 98% Bacillus pumilus + HQ858063.1 126 0.0 98% Bacillus subtilis + HM769817.1 127 2.e-89 97% Sporolactobacillus sp. + D16282.1 128 0.0 99% Bacillus pumilus + EU379285.1 129 1.e-137 95% Bacillus sp. + HM461228.1 132 3.e-149 98% Bacillus subtilis + AY741264.1 133 1.e-171 98% Bacillus amyloliquefaciens + AB301022.1 135 2.e-104 98% Bacillus pumilus + EU977790.1 136 2.e-135 98% Bacillus subtilis + AB301012.1 139 0.0 97% Acetobacter sp. - GU385849.1 140 1.e -92 94% Bacillus sp. + GQ340516.1 141 1.e-122 96% Lysinibacillus sp. + GU172164.1 142 2.e-63 95% Bacillus sp. + GQ340516.1 143 8.e-94 96% Bacillus sp. + JN092818.1 144 0.0 92% Paenibacillus sp. + EF178460.1 145 0.0 94% Bacillus sp. + JF896450.1 146 0.0 96% Bacillus sp. + HM461161.1 147 0.0 99% Bacillus subtilis + EU977724.1 148 0.0 97% Aneurinibacillus sp. + AB112723.1 149 2.e-145 97% Bacillus sp. + EU977790.1 150 6.e-121 92% Bacillus sp. + DQ915582.1 151 2.e-157 95% Bacillus sp. + AM237389.1 152 1.e-118 95% Bacillus sp. + JN082257.1 153 1.e-127 95% Bacillus sp. + HM461228.1 154 8.e-104 98% Bacillus pumilus + HQ334985.1 155 1.e-114 93% Bacillus sp. + JN215507.1 156 1.e-71 92% Bacillus sp. + AF332386.1 157 1.e-122 95% Bacillus sp. + JN092818.1 158 2.e-99 97% Bacillus sp. + AJ842964.1 161 1.e-96 96% Bacillus sp. + HM461161.1 162 3.e-107 100% Bacillus pumilus + GQ917222.1 164 1.e-142 96% Bacillus sp. + AY484507.1 169 5.e-106 98% Bacillus pumilus + FJ189791.1 170 2.e-48 92% Pantoea sp. - JN175332.1 171 2.e-78 94% Bacillus sp. + AY172514.1 172 2.e-48 91% Bacillus sp. + EU977719.1 173 1.e-60 93% Bacillus sp. + EU515205.1 175 1.e-75 94% Bacillus sp. + EF040535.1 181 8.e-63 92% Paenibacillus sp. + HE577054.1 182 0.0 95% Brevibacillus sp. + HG003422.1 184 0.0 96% Bacillus sp. + HQ218993.1 187 2.e-94 95% Bacillus sp. + FM865689.1 189 2.e-74 93% Aneurinibacillus sp. + AB271755.1

...continua...

38




190 5.e-39 90% Pseudomonas sp. - AB616678.1

194 2.e-110 93% Rhizobium sp. - FJ405377.1

195 1.e-46 96% Bacillus sp. + GU451175.1 196 5.e-91 95% Enterobacter sp. - GQ260081.1 199 1.e-92 95% Bacillus sp. + EF522800.1 200 3.e-97 99% Bacillus pumilus + EU977790.1 201 2.e-73 93% Bacillus sp. AM990996.1

O gênero Bacillus foi o que apresentou maior diversidade de espécies,

dos isolados obtidos 82,5% foram identificados dentro deste gênero e em 12

espécies diferentes, mostrando razoável variabilidade intraespecífica associada à

bananeira nesta região. Dentre as espécies identificadas Bacillus pumilus e

Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872 predominaram sobre as demais.

Além disso, 67 isolados pertencentes ao gênero Bacillus não foram identificados

em nível de espécie, já que não alcançaram o valor de similaridade considerado

neste trabalho.

A partir da identificação dos isolados, foi verificada a frequência de

gêneros e espécies presentes nas áreas de coleta das raízes (TABELA 6).

39

TABELA 6. Frequência de bactérias endofíticas obtidas de raízes bananeira ‘Prata-Anã’coletadas em 16 áreas de cultivo no Norte de Minas Gerais e Guanambi (BA).

Espécies/ Gêneros identificados Frequência / (área)

Acetobacter sp. 01/(16)

Agrobacterium tumefaciens 01/(1)

Aneurinibacillus sp. 01/(2); 01/(11);

Artrobacter sp. 01/(9)

Bacillus amyloliquefaciens 01/(3); 01/(9); 02/(16)

Bacillus axarquiensis 01/(3)

Bacillus cereus 01/(5)

Bacillus flexus 01/(8)

Bacillus licheniformis 01/(6)

Bacillus megaterium 02/(10)

Bacillus methylotrophicus 01/(6)

Bacillus pumilus 04/(1); 01/(2); 02/(3); 01/(4); 03/(5); 03/(7); 02/(8);

01/(9); 02/(11); 01/(12); 01/(13); 01/(14); 01/(15);

Bacillus safensis 02/(3)

Bacillus sp. 06/(1); 04/(2); 08/(3); 03/(4); 03/(5); 06/(6); 01/(7);

03/(8); 03/(9); 03/(10); 06/(11); 02/(12); 07/(13);

05/(14); 02/(15); 05/(16)

Bacillus subtilis 03/(1); 03/(4); 01/(6); 01/(8); 02/(11); 02/(16)

Bacillus tequilensis 01/(15)

Bacillus thuringiensis 01/(5); 01/(10)

Brevibacillus sp. 01/(14);

Enterobacter sp. 01/(10)

Klebsiella pneumoniae 01/(1)

Lysinibacillus sp. 01/(4); 01/(6); 01/(7); 01/(11);

Lysinibacillus sphaericus 01/(4)

Micrococcus luteus 01/(8)

Paenibacillus sp. 01/(1); 01/(15); 01/(16)

Pantoea sp. 01/(15)

Pseudomonas sp 01/(12)

Rhizobium sp 01/ (4); 01/(6); 01/(10);

40

Sporolactobacillus sp. 01/(11)

Stenotrophomonas sp. 01/(4)

Streptomyces sp. 01/(4)

De forma geral, o gênero Bacillus foi isolado em todas as áreas

amostradas, e em algumas áreas a diversidade intraespecífica foram maiores

como ocorreu na área 3, onde foi possível detectar quatro diferentes espécies de

bactérias associadas à bananeira, das quais citam-se: B. pumilus, B. safensis, B.

amyloliquefaciens (Priest et al. 1987 emend. Wang et al., 2008) e B.

axarquiensis (Ruiz-García et al., 2005). Nas áreas 5 e 13 e na área localizada em

Guanambi, foram encontradas apenas bactérias pertencentes ao gênero Bacillus,

demonstrando baixa diversidade de gêneros.

O maior número de espécies foi observado nas áreas 1 e 4. Na área 1

identificaram-se os gêneros Paenobacillus sp., Klebsiella sp., Bacillus spp. e a

espécie Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend 1907) Conn 1942, e

na área 4 os gêneros Stenotrophomonas sp., Streptomyces sp., Lysinibacillus

sphaericus (Meyer and Neide 1904) Ahmed et al., 2007), Rhizobium sp. e

Bacillus spp..

Observou-se que as espécies encontradas podem estar associadas com o

manejo das áreas. Em 81% das áreas de coleta há incorporação de matéria

orgânica realizada por meio da adição de esterco como medida adicional do

manejo da cultura. Entretanto, nas áreas 8 e 11 onde se pratica o manejo

orgânico, verificou-se alta diversidade interespecífica. Na área 8 foram

identificadas as espécies B. Subtilis, B pumillus, B flexus (Priest et al., 1989) e

Micrococus luteus, enquanto na área 11 quatro gêneros diferentes: Bacillus spp.,

Aneurobacillus sp., Lysinibacillus e Sporolactobacillus sp..

41

4.6 Caracterização da Diversidade via rep-PCR

A diversidade genética de 201 isolados de bactérias endofíticas foi

avaliada por meio da análise comparativa entre os padrões eletroforéticos,

gerados pela amplificação de sequências conservadas e repetitivas do DNA

genômico, que possibilitou a construção de dendrograma com base na

dissimilaridade dos padrões eletroforéticos determinados pela análise conjunta

dos marcadores moleculares.

A técnica rep-PCR gerou, para cada primer: REP, ERIC e BOX,

separadamente, perfis moleculares diferentes. Foram obtidos no total 50 locos

passíveis de leitura, sendo que todos os fragmentos mostraram-se polimórficos

(TABELA 7).

TABELA 7. Número de bandas monomórficas e polimórficas formadas com a utilização dos primers REP, ERIC e BOX pela técnica rep-PCR.

Primer No bandas monomórficas No bandas polimórficas

REP 0 11

ERIC 0 18

BOX 0 21

Os dados obtidos indicam que o primer BOX (FIGURA 8) apresentou

maior polimorfismo do que os outros dois primers ERIC e REP (FIGURAS 9 e,

10).

42

FIGURA 8. Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de 15

isolados de bactérias endofíticas pelo iniciador BOX I. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 6 a 146: código dos isolados.

43

FIGURA 9. Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de isolados de bactérias endofíticas pelos iniciadores ERIC I e ERIC 2. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 18 a 199: código dos isolados

44

FIGURA 10. Gel de agarose contendo produto da amplificação do DNA de

isolados de bactérias endofíticas pelos iniciadores REP I e REP 2. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 38 a 56: código dos isolados

Utilizando os dados em conjuntos dos três primers (REP, ERIC e BOX),

constatou-se que a distância genética entre as áreas de coleta variou de 3,0 % a

12,9%. Os indivíduos da área 16, coletados no município de Jaíba, apresentaram

a menor distância genética, enquanto que os isolados coletados no município de

Guanambi apresentaram a maior distância genética (TABELA 8, FIGURA 11).

Não foi observado padrão de amplificação específico para os isolados

45

pertencentes à mesma área de coleta, já que apresentaram uma distribuição

desuniforme.

TABELA 8. Distância genética entre os isolados da mesma área onde foram

coletadas raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ por meio da técnica rep-PCR.

Área Município da Coleta Distância genética (%)

1 Janaúba 11,0

2 Janaúba 7,8

3 Guanambi 12,9

4 Porteirinha 10,1

5 Nova Porteirinha 6,9






11 Matias Cardoso 5,5

12 Jaíba 12,4

13 Jaíba 4,0

14 Jaíba 4,5

15 Jaíba 9,5

16 Jaíba 3,0

46

Legenda:

Janaúba (1) Nova Porteirinha (9) Janaúba (2) Nova Porteirinha (10)

Guananbi (3) Matias Cardoso (11) Porteirinha (4) Jaíba (12) Nova Porteirinha (5) Jaíba (13) Nova Porteirinha (6) Jaíba (14) Nova Porteirinha (7) Jaíba (15) Nova Porteirinha (8) Jaíba (16)

FIGURA 11. Dendrograma de dissimilaridade obtido através da técnica rep-PCR dos isolados de bactérias endofíticas provenientes de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’.

47

Analisando o dendrograma, verificou-se a formação de seis grupos

(TABELA 9). Entretanto, não foi possível correlacionar os indivíduos com as

respectivas áreas de coleta, visto que estão distribuídos de forma aleatória pelo

dendrograma.

TABELA 9. Agrupamento dos gêneros e espécies isolados de raízes de bananaeira ‘Prata-Anã’ utilizando a técnica rep-PCR.

Grupos Gêneros/ Espécies identificados em cada grupo

I Acetobacter sp, Aneurinibacillus sp , B amyloliquefaciens, B sp., B megaterium, B pumilus, B subtilis, Brevibacillus sp., Paenibacillus sp., Sporolactobacillus sp..

II B. amyloliquefaciens, B megaterium, B methylotrophicus,., B. pumilus, B. safensis, B sp., B. subtilis, B. truringiensis, Rhizobium sp..

III Artrobacter sp., Aneurinbcacillus sp., B. axarquiensis, B. flexus, B.pumilus, B. safensis, B. sp., B. subtilis, B. tequilensis, B. truringiensis, Klebsiella pneumoniae, Lysinibacillus sp., Lysinibacillus sphaericus, Paenibacillus sp., Stenotrophomonas sp., Streptomyces sp..

IV B amyloliquefaciens, B pumilus, B sp., B. subtilis, Lysinibacillus sp., Pantoea sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp..

V B amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis, B pumilus, B sp, B. subtilis, Enterobacter sp., Lysinibacillus sp., Micrococus luteus.

VI Agrobacterium tumefaciens

4.7 Caracterização da Diversidade pela técnica ARDRA

A análise de diversidade dos isolados por meio da técnica ARDRA,

obtida pelos produtos de clivagem com as quatro enzimas de restrição, produziu

45 bandas polimórficas e nenhuma monomórfica. A RsaI foi a enzima que

apresentou maior poder discriminatório, gerando 13 bandas diferentes, seguida

48

de MspI com 12 , HinfI com 11 bandas e NdeI com 9 bandas (FIGURAS 12, 13,

14 e 15).

49

FIGURA 12. Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima RsaI (B).

50

FIGURA 13. Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima MspI (B).

51

FIGURA 14. Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima HinfI.

52

FIGURA 15. Perfil de restrição da região 16S DNAr dos isolados bacterianos isolados de bananeira ‘Prata-Anã’ após a digestão com a enzima NdeI.

A distância genética observada entre as áreas de coleta variou de 12,9%

a 20,3%. Os indivíduos coletados na área 7, município de Nova Porteirinha,

apresentaram a menor distância genética. Por outro lado, os isolados coletados

na área 13 são os mais distantes geneticamente (TABELA 10, FIGURA 16).

53

TABELA 10. Distância genética entre os isolados da mesma área onde foram coletadas raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ utilizando os dados da técnica ARDRA.

Área Município de coleta Distância genética (%)

1 Janaúba 19,2

2 Janaúba 19,2

3 Guananbi 19,4

4 Porteirinha 19,7







11 Matias Cardoso 17,4

12 Jaíba 18,4

13 Jaíba 20,3

14 Jaíba 17,5

15 Jaíba 18,9

16 Jaíba 15,3

54

Legenda:

Janaúba (1) Nova Porteirinha (9) Janaúba (2) Nova Porteirinha (10)

Guananbi (3) Matias Cardoso (11) Porteirinha (4) Jaíba (12) Nova Porteirinha (5) Jaíba (13) Nova Porteirinha (6) Jaíba (14) Nova Porteirinha (7) Jaíba (15) Nova Porteirinha (8) Jaíba (16)

FIGURA 16. Dendrograma de dissimilaridade obtido através da técnica ARDRA dos isolados de bactérias endofíticas provenientes de bananeira ‘Prata-Anã’.

55

Foram formados dezesseis grupos baseados nas distâncias genéticas

entre os isolados (TABELA 11), em que cada grupo foi formado por espécies e

gêneros diferentes.

TABELA 11. Agrupamento dos gêneros e espécies isolados de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ utilizando a técnica ARDRA.

Grupos Gêneros/ Espécies identificados em cada grupo

I Artrobacter sp., B amyloliquefaciens, B. methylotrophicus, B. pumilus, B. safensis , B sp., B. subtilis, B. tequilensis, B. thuringiensis, Paenibacillus sp., Sporolactobacillus sp., Streptomyces sp., Rhizobium sp..

II B.sp.. III B. licheniformis, B.sp., Lysinibacillus sp.. IV Aneurinibacillus sp., B amyloliquefaciens, B. pumilus, B.sp., B.

subtilis, B. thuringiensis, Klebsiella pneumoniae, Lysinibacillus sphaericus, Micrococus luteus, Pantoea sp., Rhizobium sp..

V Isolado não identificado VI B. pumilus, B.sp, B. subtilis, Lysinibacillus sp., Paenibacillus sp.. VII B. pumilus, B.sp., B. subtilis. VIII Acetobacter sp., B amyloliquefaciens, B. axarquiensis, B cereus, B.

megaterium,B. pumilus, B.sp., B. subtilis, Brevibacillus sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp.,

IX B.sp., Lysinibacillus sp.. X B. flexus, B.sp., XI Lysinibacillus sp., Paenibacillus sp.. XII B.sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp.. XIII Agrobacterium tumefaciens XIV Aneurinibacillus sp.. XV B.sp.. XVI B.sp., B. subtilis.

56

4.8 Caracterização do Gene nifH

A amplificação por PCR do gene nifH foi verificada em 40 dos 201

isolados bacterianos provenientes de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ (TABELA

12), pois uma banda com tamanho de 270 bp foi amplificada (FIGURA 17).

57

FIGURA 17. Amplificação do gene nifH de 18 bactérias endofíticas de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’. (M) marcador de peso molecular 100 pb; 4 a 67: códigos dos isolados.

58

TABELA 12. Número de isolados e identificação de gêneros e espécies de bactérias endofíticas que amplificaram o gene nifH, por área de coleta.

Área Origem N °de isoladoscom gene nifH

Gêneros/ Espécies

1 Janaúba 5 B. sp., B. subtilis, Klebsiella pneumoniae, Paenibacillus sp..

2 Janaúba 1 Isolado não identificado

3 Guananbi 3 B. sp..

4 Porteirinha 3

Lysinibacillus sphaericus, Stenotrophomonas sp., Streptomyces sp.

5 Nova Porteirinha 2 B. cereus, B. truringiensis.

6 Nova Porteirinha 6

B. licheniformis, B. pumilus, B. sp.,

Rhizobium sp..

7 Nova Porteirinha 2 B. pumilus

8 Nova Porteirinha 3 B. flexus, B. pumilus

9 Nova Porteirinha 2 Artrobacter sp..

10 Nova Porteirinha 2 B. sp..

11 Matias Cardoso 2 B. subtilis, Sporolactobacillus sp..

12 Jaíba 2 Isolados não identificados

13 Jaíba 0 -

14 Jaíba 0 -

15 Jaíba 2 B. tequilensis.

16 Jaíba 5

B. amyloliquefaciens, B. sp., B.

subtilis, Paenibacillus sp..

16 TOTAL 40

59

Verificou-se que apenas duas áreas de coleta não apresentaram isolados

com reações de PCR positivas para o gene nifH. A distribuição de isolados com

a presença desse gene ocorreu com frequência diferente entre os municípios

amostrados. A área 6 localizada em Nova Porteirinha apresentou maior número

de isolados com a presença desse gene. Além disso, observou-se que todas as

áreas localizadas na cidade de Nova Porteirinha apresentaram isolados com a

presença do gene para fixação de nitrogênio

Foi constatado que 40% dos isolados que apresentaram o gene nifH

pertencem ao gênero Bacillus spp. Os demais isolados pertencem aos gêneros:

Stenotrophomonas sp., Streptomyces sp. (Waksman and Henrici 1943),

Lysinibacillus sp.(Ahmed et al., 2007), Artrobacter sp.( Conn and Dimmick

1947 emend. Koch et al., 1995), Sporolactobacillus sp. (Kitahara and Suzuki

1963), Paenibacilllus sp, Rhizobium sp.(Frank 1889 emend. Young et al., 2001)

e a espécie Klebisiella pneumoniae.

60

5 DISCUSSÃO

Estudos entre plantas e bactérias endofíticas têm demonstrado a grande

importância dessa interação nos processos de adaptação das plantas aos diversos

ecossistemas bem como no incremento da sanidade e qualidade do solo. Pouco

se sabe sobre a relação dessas bactérias com a cultura da banana, sobre as

espécies colonizadoras e ainda sobre os benefícios instituídos por essa

associação nessa cultura.

No presente trabalho, foram isoladas e caracterizadas 201 bactérias

endofiticas provenientes de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’, por meio da

associação de técnicas morfológicas e moleculares.

A densidade de bactérias endofíticas nos tecidos das raízes variou de

1x104 a 13x104 Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Conforme Bandara et

al. (2006), bactérias endofíticas habitam as plantas, numa densidade entre 103 a

106 unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de tecido fresco. Em

Araucaria angustifólia, o isolamento de bactérias apresentou valores de

aproximadamente 104 UFC por grama de raiz fresca (RIBEIRO e CARDOSO,

2011). Kuklinski-Sobral (2003) observou que a densidade bacteriana isolada de

plantas de soja sofre influência de fatores como cultivar, variações sazonais,

tratos culturais, estádio de desenvolvimento do hospedeiro e tecido amostrado.

Embora no presente trabalho as coletas tenham sido realizadas a partir do

mesmo tecido, raízes, e de uma mesma cultivar, Prata-Anã, as variações de

densidade obtidas se devem provavelmente às diferenças edafoclimáticas e ao

manejo cultural aplicado nas diferentes áreas de coleta.

Dos 201 isolados bacterianos coletados no presente estudo, 75% foram

classificados como Gram-positivas. Germida et al. (1998) isolaram bactérias

endofíticas de raízes de canola e observaram que a comunidade era dominada

por gêneros Gram-positivos. Todavia, Ikeda (2010) isolou 414 bactérias

61

endofíticas de raízes de milho, das quais analisou 217 quanto à morfologia,

classificando 77% como bacilos Gram-negativos e 23% como cocos Gram-

positivos. De acordo com Kobayashi e Palumbo (2000), tanto as bactérias

endofíticas Gram-positivas quanto as Gram-negativas foram isoladas de vários

tipos de tecidos de numerosas espécies de plantas.

Os resultados observados na literatura têm indicado que as bactérias

isoladas a partir de explantes contaminados de bananeira apresentam uma maior

proporção de bactérias do tipo Gram-negativas. Isso provavelmente ocorre

devido àquelas bactérias serem mais facilmente isoladas dos tecidos vegetais, de

fácil manipulação e passíveis de abordagens genéticas. Outro fator que pode ter

influenciado o maior isolamento de bactérias Gram-negativas é o meio utilizado

no isolamento. Existem diferenças dos meios de cultura quanto aos

microrganismos selecionados; o meio Mac Conkey, por exemplo, contém sais

biliares e cristal violeta que são inibidores do crescimento de bactérias Gram-

positivas, já o meio MAS é mais utilizado para crescimento destas bactérias

(ANVISA 2010).

Devido à importância das bactérias Gram-positivas, em diversas

interações benéficas têm sido estudados protocolos de detecção e diferentes

formas de isolamento destas bactérias, visto que as mesmas possuem

características interessantes que as distinguem dos seus homólogos Gram-

negativos (FRANCIS et al., 2010).

Estudos conduzidos com diferentes cultivares de bananeira indicaram

presença significativa de bactérias do tipo Gram-negativa. Nietsche et al. (2006),

ao caracterizarem os isolados de bactérias endofíticas provenientes de explantes

de bananeiras ‘Prata-Anã’, ‘FHIA 18’ e ‘SH 3640’, classificaram-nas como

bactérias do tipo Gram-negativas, com valores de 62,5%, 30% e 14% dos

isolados, respectivamente. Ganem (2009) isolou quinze bactérias de explantes

das bananeiras “Tropical” e “Galil 18” e 100% foram classificadas como

62

bactérias Gram-negativas; entretanto, neste estudo o meio utilizado no

isolamento foi BDA. Outro estudo publicado por Thomas et al. (2008)

demonstraram que as bactérias isoladas a partir de explantes contaminados da

cultivar Grand Naine eram predominantemente Gram-negativas.

Nos trabalhos citados anteriormente foram utilizados meios para

crescimentos de explantes, que possuem grande quantidade de vitaminas e

nutrientes. No trabalho de Thomas et al. (2008) foi utilizado o meio TSA,

provavelmente ambos favorecem maior desenvolvimento de bactérias Gram-

negativas.

Os resultados negativos para o teste de hipersensibilidade dos 201

isolados bacterianos sugerem a ausência de bacterias fitopatogênicas; entretanto,

este não deve ser utilizado como único parâmetro para descartar a

patogenicidade dos isolados. De acordo com Kobayashi e Palumbo (2000),

alguns gêneros de fitobactérias podem ser identificados como típicas bactérias

endofíticas, sem nenhum sintoma de doença na planta associada. Estudos

mostram que o estágio de desenvolvimento do hospedeiro e do patógeno,

mudanças ambientais e as respostas de defesa do hospedeiro (SCHULZ e

BOYLE, 2005), bem como fatores genéticos, estruturais e fisiológicos dos

mesmos, determinam se um microrganismo se comporta como endofítico ou

fitopatogênico (HEUER et al., 2002; ANDREOTE et al., 2008; KOGEL et al.,

2006). No presente estudo foi identificada bactéria da espécie Agrobacterium

tumefaciens que, apesar de ser descrita como fitopatogênica em outras plantas

hospedeiras, não apresentou sintomas de HR em plantas não hopedeiras,

comportando-se como bactéria endofítica em bananeira.

Sabe-se que a capacidade de as bactérias fitopatogênicas induzirem a

reação de hipersensibilidade reside na presença dos genes hrp. Esses genes são

responsáveis pelo crescimento de bactérias em plantas hospedeiras e em plantas

não hospedeiras pela reação de hipersensibilidade. Os genes hrp estão muito

63

próximos uns dos outros, formando um agregado, em que todos são necessários

para o crescimento da bactéria no hospedeiro e indução de hipersensibilidade em

plantas não hospedeiras (BERGAN FILHO et al., 1995). Assim, as plantas não

hospedeiras podem ser indicadoras de patogenicidade. Neste estudo não houve

reação de HR para as bactérias endofíticas as quais foram consideradas não

fitopatogênicas. Todavia, no caso de espécies fitopatogênicas, para confirmação

dos resultados é necessário realizar inoculação na cultura hospedeira e

identificar a espécie envolvida na interação (ROMEIRO, 1973).

A análise de variância molecular revelou baixa proporção da

diversidade, tanto por meio da técnica de rep-PCR quanto da ARDRA, entre os

locais de coleta. Entretanto, valores significativos foram obtidos dentro dos

locais de coleta. Esse resultado indica a existência de diferenças entre os

ambientes analisados os quais devem estar influenciando a evolução da

população das bactérias colonizadoras.

Resultados similares foram obtidos por Nakatani et al. (2009)

trabalhando com Xanthomonas axonopodis (Starr and Garces 1950 emend.

Vauterin et al., 1995) pv. Passiflora. Os autores verificaram que a maior parte

da variabilidade genética dos isolados está dentro das populações, 89,4%,

embora existam diferenças significativas entre as populações, 10,6%. Santos

(2009), analisando isolados de Bacillus cereus (Frankland and Frankland 1887)

provenientes de alimentos e do solo, observou através da análise de variância

molecular maior proporção de variação genética dentro dos grupos de isolados

(92,22%), enquanto que o valor entre os grupos foi de 7,78%.

As análises das sequências utilizando o programa BLASTn mostraram

alta diversidade de bactérias em raízes de bananeira ‘Prata-Anã’, pois foram

identificados gêneros distintos de bactérias. Vários estudos têm verificado

interação de diferentes bactérias com seus hospedeiros, com intuito de conhecer

as funções desempenhadas pelas mesmas.

64

A utilização prática de microrganismos endofíticos no controle biológico

de patógenos depende de inúmeros fatores relacionados à interação de bactérias

endofíticas-patógenos-planta, pois a competição existente entre eles pode reduzir

a eficiência do controle inviabilizando a sua utilização (AZEVEDO et al.,

2000). Assim, a identificação e o estudo de novas substâncias, a partir de

endófitos, que apresentam potencial para controle de fitopatógenos, bem como

para o crescimento das plantas, podem levar à descoberta de novos hormônios,

antibióticos e fungicidas mais eficientes para controle das doenças e para o

desenvolvimento das plantas.

As espécies Bacillus pumilus e Bacillus subtilis foram isoladas em

81,25% e 37,5% das áreas de coletas respectivamente, sendo os principais

representantes do gênero Bacillus. Esses dois microrganismos também foram

encontrados colonizando o mesmo nicho ecológico em quatro áreas. Estes

resultados indicam que provavelmente existe uma relação de simbiose entre eles.

De acordo com Raupach e Kloepper (1998), a mistura dessas duas espécies e

Curtobacterium flaccumfaciens (Hedges 1922) Collins and Jones 1984 aplicadas

nas sementes estimulou o crescimento de plântulas de pepino e reduziu os

sintomas causados por patógenos. Em geral, há um certo grau de especificidade

entre gêneros encontrados e seus hospedeiros, entretanto, estas interações são

pouco conhecidas. Dessa forma, é possível que várias espécies se

interrelacionem e possuam relações mutualísticas, no entanto, mais estudos

precisam ser realizados no intuito de entender como ocorre esse processo nas

diferentes culturas.

Verificou-se que muitos gêneros, como Bacillus e algumas espécies

descritas neste estudo, foram também encontrados em outros trabalhos de

isolamento de bactérias endofíticas. Ferreira (2008), após identificação da

comunidade endofítica das raízes de eucalipto, por meio do sequenciamento

parcial do 16S rDNA, identificaram-se Psychrobacter sp. (Juni and Heym

65

1986), Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Lysinibacillus sphaericus, Rhizobium

tropici (Martínez-Romero et al., 1991), Rahnella aquatilis (Izard et al., 1981),

Erwinia persicina (Hao et al., 1990), Stenotrophomonas maltophilia (Hugh

1981) Palleroni and Bradbury 1993, como espécies colonizadoras. Os gêneros

Bacillus, Enterobacter e Pantoea foram identificados como endofíticos em

diversas plantas, tais como citros, cana-de-açúcar e soja (GURTLER et al.,

2005; MEDRANO e BELL, 2007). Espécies pertencentes aos gêneros:

Alcaligenes (Castellani and Chalmers 1919), Azospirillum (Tarrand et al., 1979

emend. Falk et al., 1985), Bacillus, Enterobacter, Herbaspirillum (Baldani et al.,

1986 emend. Baldani et al., 1996), Klebsiela, Pseudomonas, Burkholderia,

Paenibacillus, Acetobacter e a família Rhizobiaceae têm sido observadas em

associação com plantas de arroz, milho, sorgo, trigo, soja, feijão, tomate,

algodão e cana-de-açúcar (DI CELLO et al., 1997; BURDMAN et al., 1997;

BALDANI et al., 1997; REINHOLD-HUREK; HUREK, 1998; HALLMANN et

al., 1997; BALDANI et al.,2000).

O gênero Bacillus foi encontrado com maior frequência em todas as

áreas amostradas. De acordo com Hallmann et al. (1997), este gênero foi

relatado em vários trabalhos, como a principal bactéria endofítica de

determinadas plantas. As espécies: Bacillus cereus, Bacillus subtilis Bacillus

megaterium (Bary, 1884), e Bacillus pumilus já foram descritas como

endofíticas (BAI et al., 2002; ELVIRA-RECUENCO e VAN VUURDE, 2000;

ARAÚJO et al., 2002). Bactérias deste gênero já foram isoladas em explantes

contaminados de banana (BRAGA et al., 2001; ODUTAYO et al., 2007).

A diversidade de gêneros amostrados neste estudo ratifica que existe

uma alta variabilidade genética de bactérias endofíticas interagindo com a

cultura da bananeira. Essas interações são indispensáveis para os processos de

estabelecimento e crescimento das plantas. Bactérias pertencentes ao gênero

Bacillus, por exemplo, são classificadas como promotoras de crescimento, com

66

destaque à produção de auxinas e giberelinas por Bacillus pumilus, fixadoras de

nitrogênio, solubilizadoras de fosfato (FORCHETTI et al., 2007; STURZ;

NOWAK, 2000). Além disso, são capazes de induzir resistência sistêmica nos

vegetais (JUNG et al., 2006; ONGENA; JACQUES, 2008), e atuam no

biocontrole de doenças de plantas, demonstrando grande potencial para

utilização na agricultura, com a redução do uso de produtos químicos no

controle de pragas (LAÇAVA et al., 2004). A espécie Bacillus subtilis já foi

descrita como sendo capaz de incrementar a nodulação de raízes e promover o

crescimento de plantas de feijoeiro (LAZZARETTI e MELO, 2005).

Foram identificados dois isolados como pertencentes à espécie Bacillus

thuringiensis (Berliner, 1915). Resultado semelhante foi descrito por Teixeira et

al. (2007), que encontraram essa bactéria colonizando endofiticamente partes de

plantas de mandioca. Segundo o mesmo autor, a principal função relacionada a

esta espécie é o controle biológico, além de a mesma apresentar atividade

inseticida (ROSAS-GARCÍA, 2009). A espécie Bacillus megaterium e bactérias

do gênero Arthrobacter foram descritas com capacidade de reduzir metais

pesados e aumentar a disponibilidade de ferro para os vegetais (VALENCIA-

CANTERO et al., 2007). Espécies de Bacillus cereus têm a capacidade de suprir

doença através da produção de antibióticos (EMMERT e HANDELSMAN ,

1999).

De todos os isolados recuperados nas áreas de coleta, o gênero Bacillus

esteve presente em todas elas. Isso pode estar relacionado à especificidade deste

gênero pelo meio de isolamento utilizado neste estudo. Teixeira et al (2007),

analisando isolamento de bactérias endofíticas em mandioca, identificaram o

gênero Bacillus em todas as áreas amostradas, utilizando o meio TSA na

recuperação das bactérias. Conforme Vieira e Nahas (2000), fatores como

temperaturas, diluição e meios de cultura, isoladamente ou associados,

influenciam o crescimento de Bacillus spp.

67

Apesar da predominância de isolados do gênero Bacillus, outros gêneros

com potencial de utilização foram também isolados. Espécies do gênero

Paenibacillus sp. têm sido caracterizadas em função de sua capacidade de

produzir hormônios indutores de crescimento da planta, como auxinas e

citocininas, enzimas como quitinases, amilases, proteases, e antibióticos, e

também são solubilizadoras de fosfatos orgânicos (COELHO et al., 2009). Da

mesma forma, foi relatado que a espécie Paenibacillus polymyxa aumenta o

crescimento de plantas através da produção de citocinina e auxina (LAL e

TABACCHIONI, 2009).

Outro gênero encontrado como bactéria colonizadora de raízes de

bananeira ‘Prata-Anã’ foi o Stenotrophomonas. Representantes deste gênero são

potenciais produtores de ácido indol acético (AIA) (PARK et al., 2005) e atuam

na biodegradação de contaminantes, como 4-nitroanilina (QURESHI et al.,

2007).

Vários estudos descrevem as principais funções desempenhadas por

bactérias endofíticas. Espécies do gênero Enterobacter (Hormaeche and

Edwards, 1960) e Pseudomonas (Migula, 1894) são capazes de fixar nitrogênio

e solubilizar fosfato (ASIS e ADACHI, 2003; VERMA et al., 2001; DALTON

et al., 2004; RODRIGUEZ e FRAGA, 1999), o que aumenta o crescimento e a

produtividade das plantas. Já o gênero Streptomyces exerce uma atividade de

biocontrole sobre fungos fitopatogênicos (PARK et al., 2002). Diversos gêneros

bacterianos têm sido descritos como produtores de AIA e solubilizadores de

fosfato, entre eles, Acetobacter, Agrobacterium e Pantoea tem sido relatadas

como estimuladoras do crescimento vegetal (PATTEN; GLICK, 1996;

RODRIGUEZ; FRAGA, 1999). Além disso, um grupo diversificado de bactérias

Gram-positivas como Arthrobacter, Micrococcus, Bacillus, Rhodococcus (Zopf,

1891), Mycobacterium (Lehmann and Neumann 1896), Streptomyces e

Corynebacterium (Lehmann and Neumann 1896 emend. Bernard et al., 2010) é

68

capaz de produção de auxina, que pode estimular a absorção de nutrientes e

proliferação de raízes (TSAVKELOVA et al, 2006;. SPAEPEN et al., 2007).

Isolados do gênero Rhizobium foram identificados neste estudo, os

mesmos são utilizados como biofertilizante, uma vez que algumas espécies

podem suplementar a ausência de fertilizante nitrogenado através da promoção

do crescimento e da fixação de nitrogênio (CHOUDHURY e KENNEDY,

2004). Isso mostra que a interação plantas/Rhizobium é indispensável para

ambos os organismos, pois é classificada como uma relação simbiótica em que

ambos os organismos são beneficiados.

A espécie Klebsiella pneumoniae identificada neste estudo já foi descrita

em 50% dos isolamentos associados à cultivar Tropical (GANEM et al., 2009).

Espécies do gênero Klebsiella são fixadoras de nitrogênio e são consideradas

como microrganismo endofítico associado a raízes de plantas (SHIOMI et al.,

2006 ). A espécie Micrococus luteus foi isolada neste estudo, e pesquisas com

microrganismos pertencentes à família Micrococcineae revelam que os mesmos

apresentam potencialidades para propósitos biotecnológicos, bem como para

usos farmacêuticos e de biocontrole (AZEVEDO et al., 2000). Já a bactéria

Agrobacterium tumefaciens, apesar de já ter sido descrita como fitopatogênica,

apresenta potencial para o controle biológico de doenças fúngicas e bacterianas

(ARAUJO, 2000).

Foram constatadas diferenças na diversidade de gêneros encontrados nas

diferentes áreas de coletas. A área 4 é a mais diversa tendo sido isolados cinco

gêneros diferentes. Estes resultados podem estar relacionados à presença de

condição favorável para o estabelecimento de algumas bactérias endofíticas

nessa área. Fatores como o sistema agrícola utilizado, o uso ou não de

agroquímicos, genótipo da planta, estádio fenológico e tipo de solo

(DALMASTRI et al., 1999; FROMIN et al., 2001), provavelmente, influenciam

de alguma forma a diversidade e riqueza das populações de bactérias, sendo

69

responsáveis pela diferenças entre as espécies encontradas nas diferentes áreas

de coletas. Resultados que corroboram estas informações foram observados por

Kuklinsky-Sobral et al. ( 2004) que verificaram que a presença de diferentes

espécies de bactérias endofíticas na cultura da soja depende

do genótipo, da idade da planta, do tecido da amostra e também da época de

isolamento. O tipo de solo determinou diferenças na população endofítica

isoladas de trigo (CONN e FRANCO, 2004).

Contrastando os dados coletados com a aplicação dos questionários nas

áreas de coleta, notou-se que, na maioria das áreas, o bananal tem a mesma

idade e os tratos culturais são praticamente os mesmos. Um fato interessante da

área onde houve mais diversidade é que há incorporação de matéria orgânica,

porém isto não explica a diversidade, pois em outras áreas também é praticado

tal técnica.

Verifica-se que são raros os estudos que relacionam a comunidade

endofítica dos vegetais com manejo agrícola e tipos de solos. Seghers et al.

(2004), comparando sistemas de cultivo orgânico e tradicional, observaram

diferenças na comunidade de microrganismos endofíticos nas raízes de milho.

Os autores relataram, porém, que não fica claro pelos resultados obtidos se as

diferentes práticas agrícolas afetaram diretamente a comunidade endofítica das

raízes, ou indiretamente, por meio de mudanças na comunidade total de

microrganismos do solo.

Quando se compara a diversidade genética gerada através da técnica

Rep-PCR, observa-se que o primer Box permitiu a formação de um maior

número de bandas polimórficas, apresentando maior poder discriminatório entre

os isolados bacterianos. Segundo Van Berkum (1999), as regiões BOX, por

estarem associadas a graus elevados de polimorfismos, tem participação em

processos de evolução adaptativa, mediando a interação dos microrganismos

com ambientes inóspitos ou adversos.

70

Apesar dos diferentes níveis de diversidade observados entre as

populações de isolados, nenhum primer utilizado com a técnica rep-PCR

apresentou bandas que relacionasse os isolados com suas áreas de coleta. Costa

et al. (2007), ao estudarem a diversidade molecular de Ralstonia solanacearum

(Smith 1896) Yabuuchi et al., 1996, perceberam, por meio dos perfis

eletroforéticos gerados por BOX-PCR, um alto grau de polimorfismo; no

entanto não foi observado padrão de amplificação específico para os isolados

pertencentes aos dois ecossistemas utilizados no trabalho (várzea e terra-firme)

ou às diferentes biovares. Entretanto, Silva et al. (2007) verificaram através da

caracterização molecular por rep-PCR que a diversidade genética entre os

isolados de Xanthomonas albilineans (Ashby 1929) Dowson 1943 apresentaram

certa relação com a região de origem.

Em geral, a utilização dos oligonucleotideos rep-PCR tem permitido a

caracterização de bacterias Gram-positivas e Gram-negativas, devido a

complexidade dos produtos gerados pela amplificação por PCR. Como a técnica

é baseada na amplificação de regiões repetitivas do genoma, ela tem sido

amplamente utilizada, por ser considerada de fácil execução, principalmente

para análise de grandes populações bacterianas (MEHTA et al., 2002). De

acordo com Versalovic et al. (1998), as sequências repetitivas estão por todo o

genoma, por isso a técnica de rep-PCR tem revelado ser potencialmente capaz

de caracterizar o genoma completo, demonstrando poder de diferenciação

semelhante ou melhor que outros métodos para análise de microrganismos.

Quando se comparam os valores de distância genética gerada pelos

dados de rep-PCR, entre áreas localizadas dentro do mesmo município, Nova

Porteirinha demonstrou o menor nível de variação. Uma das razões se deve,

provavelmente, à pequena distância geográfica média de 8,3Km entre as áreas

nas quais as amostras foram obtidas. No entanto, no município de Jaíba, a

diferença entre as distâncias genéticas foi superior, com uma variação de 9,4

71

pontos percentuais entre a menor e a maior área. Seguindo o mesmo raciocíonio,

pode-se considerar que a maior variação deve estar associada à maior distância

entre as áreas de coleta, que foi de 16,5 Km. Além disso, fatores como manejo e

tipo de solo podem influenciar a comunidade bacteriana, favorecendo assim o

desenvolvimento de diferentes microrganismos.

A análise do dendograma formado através da matriz de distância com os

dados dos primers da técnica de rep-PCR demonstra que não houve nenhum

critério de agrupamento. O grupo III apresentou maior diversidade de isolados,

uma vez que possui representantes de oito gêneros e de nove espécies diferentes.

Segundo Assumpção (2009), a diversidade e a estrutura de comunidades

microbianas variam com o tamanho da amostra, pois, quanto maior o tamanho

da amostra, maior a probabilidade de serem amostradas espécies raras.

Analisando a estrutura dos grupos formados, observa-se que apesar de

ter sido feito o isolamento em apenas uma área nos municípios de Porteirinha e

Matias Cardoso, seus representantes estão distribuídos por quatro e cinco

grupos, respectivamente, demonstrando que nesses locais a diversidade é alta.

O grupo V, apesar de ser formado por indivíduos de diferentes áreas de

coleta, apresentou menor variabilidade genética entre os isolados dos quais

muitos pertencem ao mesmo gênero. Como a técnica utilizada é baseada na

amplificação de regiões repetitivas do genoma, pode ter acontecido que mesmo

sendo diferentes, a região amplificada foi a mesma para todos os isolados, não

permitindo a diferenciação entre eles. Todavia, Antunes (2010) descreve que o

padrão de amplificação dos diferentes primers não é idêntico, uma vez que

podem ser formados diferentes números de bandas por oligonucleotídeo, e

também a condição de anelamento e a prevalência ou distribuição dos elementos

repetitivos podem variar em cada isolado.

Os resultados obtidos pela análise conjunta dos primers demonstraram

diferenças entre os isolados. Conforme Rademaker et al. (2000), a combinação

72

dos dados de REP, ERIC e BOX-PCR evidentemente é mais significante e

consistente, pois o número total de amplicons é consideravelmente aumentado.

Além do mais, o genoma é mais amplamente coberto, visto que algumas regiões

podem ter mais cópias de um determinado elemento do que outras.

Nota-se que fatores genéticos e ecológicos também influenciam a

diversidade genética dos microrganismos. Segundo Arber (2000), as principais

estratégias genéticas responsáveis pelo surgimento e amplificação da diversidade

genética são mutação, recombinação e aquisição de sequências de DNA de

outros organismos, as chamadas transferências horizontais gênicas. Já os fatores

ecológicos estão ligados à oportunidade de colonizar um hospedeiro e à

competição entre os isolados (SPIERS et al., 2000).

A técnica ARDRA foi eficiente e identificou variação entre os isolados

bacterianos avaliados, tanto pelo polimorfismo apresentado quanto pelas

estimativas de distância genética. Resultados similares foram obtidos por

diversos autores em diferentes culturas. Cruz et al. (2001), trabalhando com

bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio isoladas a partir de plantas de

bananeira e abacaxizeiro, observaram que as enzimas apresentaram variação nos

tamanhos dos fragmentos gerados, cuja enzima HaeIII foi capaz de gerar dez

tipos de perfis, seguida por AluI com sete tipos, e HinfI e RsaI com cinco tipos

cada.

Em relação às distâncias genéticas geradas entre as áreas, constatou-se

que aquelas localizadas no mesmo município apresentaram-se próximas

geneticamente, possivelmente por estarem a uma distância geográfica também

próxima. Dessa forma, as áreas mais próximas geograficamente revelaram

valores similares de distância genética, logo, quanto menor a distância

geográfica, maior a chance de isolar indivíduos semelhantes geneticamente.

O grande número de grupos formados no presente estudo confirma o

potencial da técnica nos estudos visando à avaliação da variabilidade bacteriana.

73

Michaud et al. (2004) analisaram a diversidade de linhagens isoladas de

Brevibacterium spp (Breed, 1953), agrupando os mesmos em 52 grupos, usando

apenas a enzima de restrição AluI.

Nao houve nenhum critério para a formação dos agrupamentos; todavia,

o isolado 161 identificado como B. sp., o isolado 112 que não foi identificado, o

7 identificado como Agrobacterium tumefaciens, o 189 como Aneurinibacillus

sp, 140 como B. sp apresentam características peculiares que os distinguem dos

demais, sendo os únicos representantes dos grupos II, V, XIII, XIV e XV

respectivamente. Dentre os dezesseis grupos formados, o grupo IV é

considerado o mais biodiverso, já que possui isolados de sete gêneros e de sete

espécies diferentes. As variações registradas entre os dezesseis grupos se devem

ao fato de a técnica gerar perfis de bandas diferentes, e estas alterações revelam

a diversidade entre os e dentro dos grupos bacterianos, agrupando os indivíduos

de genótipos semelhantes (MOCALI et al., 2003; KUKLINSKYSOBRAL et al.,

2004).

Ao analisar os dendrogramas depois da identificação das espécies, foi

possível observar que o gênero Bacillus está distribuído por todos os grupos,

pois possuem maior número de representantes. O isolado 7 identificado como

Agrobacterium tumefaciens em ambos os dendrogramas formou um grupo

isolado, já que é uma espécie que apresenta características bem diferentes das

outras. Os gêneros Pseudomonas e Enterobacter pertencem ao mesmo grupo,

isso porque apresentam semelhanças, ambos são Gram-negativos e estão

agrupados na mesma divisão gammaproteobactéria. A maioria dos gêneros da

divisão Firmicutes está agrupada próximo ou no mesmo grupo, confirmando que

as técnicas moleculares foram eficientes na formação dos agrupamentos

filogenéticos, baseando-se nas diferentes características dos isolados.

74

As enzimas utilizadas demonstraram alto grau de polimorfismo dos

genes ribossomais, gerando perfis de amplificação variáveis. De acordo com

Andreote (2007), os genes de rDNA utilizados são considerados cronômetros

evolutivos, pois são genes que apresentam uma taxa de mutação mínima, cujo

produto da expressão é funcional e essencial para a vida do organismo. Além

disso, estes genes apresentam sítios diferenciais de evolução rápida ou lenta, o

que permite a avaliação das relações filogenéticas entre organismos em

diferentes distâncias filogenéticas.

O estudo da presença do gene nifH demonstrou que 20% das bactérias

endofíticas avaliadas no presente estudo podem agir como fixadoras de

nitrogênio. Perin (2007) observou que dos 80 isolados obtidos de cana-de-

açúcar, 80% apresentaram o gene nifH. Videira et al. (2009), avaliando a

diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio associadas a plantas de arroz,

isolaram 46 bactérias e todas amplificaram o gene nifH.

Uma das explicações da presença do gene nifH pode estar associada ao

tecido dos quais os isolados foram obtidos, raízes, habitats de preferência destes

indivíduos. Chelius e Tripplet (2000) e Miche et al. (2006) demonstraram a

expressão do gene nifH de Klebsiella pneumoniae no interior de raízes de milho,

e de Azoarcus sp. em raízes de arroz, respectivamente.

Apesar de 40 isolados bacterianos apresentarem o gene nifH neste

estudo, não se pode afirmar que eles sejam potenciais fixadores de nitrogênio,

pois a simples existência deste gene não representa, necessariamente, atividade

da enzima nitrogenase (DEAN e JACOBSON, 1992). Por outro lado, sua

presença no genoma é uma forte evidência de que a bactéria pode ser fixadora de

nitrogênio. Logo, a presença do gene nifH, que codifica a unidade Fe-

nitrogenase do complexo nitrogenase, tem se tornado um marcador muito

utilizado no estudo da diversidade de endofíticos com potencial para fixar N2,

em estudos independentes de cultivo (ISQUIERDO e NUSSLEIN, 2006).

75

Observou-se que isolados bacterianos expressando o gene nifH

estiveram presentes em 14 áreas de coleta. Porém, sua presença foi marcante em

todas as áreas do município de Nova Porteirinha. Provavelmente, fatores como

tipo de solo, mudanças climáticas ou até mesmo os tratos culturais das áreas

influenciaram a permanência dessas bactérias. Roesch et al. (2007) avaliaram a

diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas associadas a plantas de milho,

e detectaram diferenças na distribuição das sequências do gene nifH entre

regiões, em que a região sul do Rio Grande do Sul apresentou menor

diversidade em comparação com ao norte do Estado. Segundo os autores, essas

diferenças podem estar relacionadas ao teor de argila dos solos e à distribuição

de chuvas das regiões amostradas. Além do mais, nesses ambientes pode haver

maior ocorrência de bactérias diazotróficas, visto que o estudo da sequência do

gene nifH é normalmente empregado para caracterizar a diversidade genética

dessas bactérias, o que explicaria este resultado.

A análise da presença do gene nifH foi realizada em 40 isolados. Destes

a maioria foi identificada como pertencentes ao gênero Bacillus, que já foi

relatado em vários estudos como potencial fixador de nitrogênio (RÓZCKI et

al., 1999; RAYMOND et al., 2004). O gênero Rhizobium também apresentou a

presença desse gene, o que já era esperado, uma vez que é classificado como

fixador de nitrogênio que são capazes de formar nódulos em associação com

leguminosas (YOUNG, 1996). A espécie Klebsiella pneunomiae apresentou a

banda característica do gene nifH. Segundo Arnold et al. (1988), os primeiros

genes envolvidos na fixação do nitrogênio foram identificados e estudados

utilizando se a bactéria Klebsiella pneumoniae. Dois gêneros da divisão

Actinobacteria e o Stenotrophomonas também possuem o gene nifH. Resultados

semelhantes foram encontrados por Assumpção (2008) que identificou quatro

isolados dessa mesma divisão, com potencial para fixação de nitrogênio. Já

Teixeira et al. (2007) isolaram o gênero Stenotrophomonas de mandioca, e o

76

mesmo apresentou o gene nifH, porém, segundo os mesmos autores, não há

relatos desse organismo como diazotrófico em outras culturas.

Portanto, as bactérias identificadas neste estudo têm potencial para

promoção de crescimento, solubilização de fosfato, controle biológico e fixação

de nitrogênio em bananeira. De acordo com Nowak (1998), a aplicação de

bactérias endofíticas em plantas provenientes de cultura de tecidos pode

favorecer o desenvolvimento de espécies micropropagadas, como a banana, pois,

ocorreria um enriquecimento biológico das mudas, além de evitar a competição

dessas bactérias com outras que colonizam a planta no ambiente. Assim, após o

estudo e confirmação dessas funções nesta cultura, as bactérias poderão ser

utilizadas dentro de um pacote tecnológico de produção de mudas

micropropagadas.

77

6 CONCLUSÕES

As caracterizações morfológica e molecular dos isolados endofíticos

colonizadores de raízes de bananeira ‘Prata-Anã’ revelam alta

diversidade genética.

Os marcadores REP, ERIC e BOX-PCR em conjunto demonstram

diversidade genética entre os isolados estudados, sendo que o BOX-PCR

apresenta maior polimorfismo.

Na análise de ARDRA, a endonuclease RsaI apresenta maior grau de

polimorfismo. Esta técnica possui alto poder discriminatório, e forma 16

grupos bem distintos de isolados bacterianos.

As análises das sequências parciais de nucleotídeos da região 16S rDNA

permitem separar os 143 isolados em 17 gêneros diferentes .O gênero

Bacillus é o que apresenta maior frequência nas áreas de coletas.

Quarenta isolados apresentam reações de PCR positivas para o gene

nifH.

78

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ANEXOS

Questionário para produtores de banana ‘Prata-Anã’

Nome do Responsável Técnico: _______________________________ Fazenda:__________________________________ Telefone_________________ 01- Tempo de atividade agrícola: ________anos (média) 02- Cultura anteriormente plantada na área___________________________ 03- Número de hectares que explora:________hectares (média) 04- Idade do bananal________ anos (média) 05- Tem alguma formação profissional na área agrícola? ( ) Sim ( ) Não 06- Costuma mandar fazer análise de solo? ( ) Sim ( ) Não

6.1 - Se respondeu sim, com que regularidade? ____________ 6.2 - Se respondeu não, porquê? (assinale as que acha verdadeiras ( )Não sabe para que servem ( ) Sabe para que servem mas não acha importante

Outra, qual?____________ 07- Faz incorporação de matéria orgânica? ( )Sim ( ) não Qual frequência e dose aplicada/cova?____________________ Qual a fonte?______ 08- Costuma mandar fazer análise foliar? ( ) Sim ( ) não Se respondeu sim, com que regularidade? ____________________ 09- Qual adubo utiliza?____________________ 10- Quantidade de adubo que utiliza? kg por hectare do adubo _________ 11 - Como escolhe os adubos que usa? ( ) Conselho do vendedor ( ) Conselho de vizinhos ou amigos ( ) Conselho de técnicos ( ) Por meio da consulta de publicações sobre a matéria ( ) Iniciativa própria ( ) Outra forma .Qual? ______________ 12- Como irriga a banana?( ) Pivot ( ) Gotejador ( ) Microaspersão ( )Outro sistema Qual_______________ 13- Faz uso de fertilizante? ( ) sim ( ) não Se respondeu sim, qual tipo?_________________ Com que regularidade?___________ 14- Faz uso de fertilizante foliares? ( ) sim ( ) não Se respondeu sim, qual tipo?_________________ Com que regularidade?_____ 15- Qual (s) principais problemas fitossanitários: Mal do Panamá ( ) Sim ( ) Não Se sim, qual a porcentagem de área afetada?

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Quando surgiu o primeiro foco?______ Antes do cultivo havia a doença? ________ ( ) Sigatoka amarela Qual índice é usado para começar com o controle?________ ( ) Nematoides ( ) Moleque de Bananeira 16-Qual(s) produto é usado para manejo fitossanitário? ( )Fungicida Sistêmicos ( ) Fungicida Protetores ( ) Herbicida pré-emergentes ( ) Herbicida pós emergentes ( ) Nematicidas organofosforados ( ) Nematicidas carbonatos ( ) Inseticidas ( ) Outro. Qual__________ 17- Qual é a produção por hectare?__________ População de plantas/ha__________ 18- Qual a qualidade da banana? ( ) 1° ( ) 2° 19- Faz corte de banana, quantas vezes por mês? ( )1 ( )2 ( )3 ( )4 ( )5

Mais de 5( ) .Quanto?___ 20- A produção é direcionada para qual mercado? ( ) Internacional ( ) Regional

( ) Local ( )Outro .Qual____________

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