UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITRIOS

DIVERSIDADE GENTICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DE Vibrio

cholerae DA AMAZNIA BRASILEIRA

LENA LLLIAN CANTO DE S

Belm-Par

2009

1

LENA LLLIAN CANTO DE S

DIVERSIDADE GENTICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DE Vibrio

cholerae DA AMAZNIA BRASILEIRA

Tese apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Biolgica de Agentes

Infecciosos e Parasitrios do Instituto de

Cincias Biolgicas da Universidade Federal

do Par como requisito parcial para a obteno

do grau de Doutor em Biolgica de Agentes

Infecciosos e Parasitrios.

Orientadora: Prof. Dra. Ana Carolina Paulo

Vicente

Belm-Par

2009

2

S, Lena Lllian Canto

Diversidade Gentica de Isolados Ambientais de Vibrio cholerae

da Amaznia Brasileira, Belm-Par, 2009 / Lena Lllian Canto de S. ---

Belm, 2009.

147f.: Il.; 30 cm.

Orientadora: Ana Carolina Paulo Vicente

Tese (Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitrios) --- Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal

do Par, 2009.

1. Vibrio cholerae 2. Diversidade 3. Amaznia brasileira

I. Vicente, Ana Carolina. II. Universidade Federal do Par, Instituto de

Cincias Biolgicas. III. Ttulo.

3

LENA LLLIAN CANTO DE S

DIVERSIDADE GENTICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DE Vibrio

cholerae DA AMAZNIA BRASILEIRA

Tese aprovada como requisito parcial para a obteno do grau de Doutor em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitrios do Programa de Ps-Graduao em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitrios do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade

Federal do Par, pela comisso formada pelos professores:

Orientadora: Prof. Dra. Ana Carolina Paulo Vicente

Laboratrio de Gentica Molecular de

Microrganismos Instituto Oswaldo Cruz-RJ

Banca Examinadora: Prof. Dr. Artur Luiz da Costa da Silva

Departamento de Gentica, UFPA

Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro

Instituto Evandro Chagas, IEC/SVS/MS

Prof. Dra. Karla Tereza Silva Ribeiro

Departamento de Microbiologia, UFPA

Prof. Dra. Antonia Benedita Rodrigues Vieira

Departamento de Microbiologia, UFPA

Prof. Dr. Jos Maria dos Santos Vieira (suplente)

Departamento de Farmcia, UFPA

Belm, 30 de Setembro de 2009

4

5

Ele se move ao longo de grandes trilhas de convivncia humana, nunca mais

rpido que o caminhar do povo, e, via de regra, mais lentamente. Ao se propagar a

uma ilha ou continente ainda no atingidos, surge sempre primeiramente num

porto martimo. Jamais ataca as tripulaes de navios que vo de um pas livre de

clera para outro onde ela se est desenvolvendo, at que eles tenham entrado num

porto, ou que tenham tido contato com o litoral. O seu avano preciso de cidade

para cidade nem sempre pode ser seguido; contudo, o clera jamais apareceu,

exceto onde tenha havido abundantes oportunidades para que fosse transmitido

por convvio humano.

In: Sobre a Maneira de Transmisso do Clera

John Snow, Londres, 1854

6

A Deus pelo seu infinito amor que nos momentos difceis ajuda-me a ter esperana

e a superar obstculos e por todas as demonstraes de que sua presena real em

meu viver.

Aos meus pais Newton e Ruth S por todo o legado transmitido e pelo apoio em

mais esta etapa de minha formao.

Ao meu marido Massimo Roberto Morais pelo seu amor incondicional a mim e aos

nossos filhos; pela cumplicidade, compreenso, carinho e apoio, sem os quais, tudo

seria muito mais difcil.

Aos meus filhos Letcia de Cssia (no mais presente), Ariadine Cristine (4 anos) e

Matheus Mssimo (5 meses) que mesmo to pequeninos conseguem encher meu

corao de fora, alegria e coragem para lutar.

7

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Ana Carolina Paulo Vicente pela oportunidade, incentivo, confiana,

pacincia, ensinamentos, conselhos e, sobretudo, pela amizade. Tenho por voc grande

admirao e respeito pelo que voc e pelo que representa no meio acadmico. Serei

eternamente grata pela orientao criteriosa e crtica que muito contriburam para minha

formao.

A Dra. Elisabeth Conceio de Oliveira Santos, por quem cultivo profunda admirao e

respeito, pelo constante apoio, incentivo, amizade, e, sobretudo, por acreditar em nosso

potencial. Meus sinceros agradecimentos pela confiana.

Aos Professores Doutores Artur Silva, Edvaldo Loureiro, Jos Maria Vieira, Karla

Ribeiro e Antonia Vieira por terem aceitado compor a banca examinadora desta tese e

pelas criteriosas contribuies.

A Coordenao do Programa de Ps-Graduao em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitrios da UFPA, na pessoa do Prof. Dr. Sandro Percrio, por todo apoio.

Agradecimento extensivo aos coordenadores que o antecederam, Antonio Valinoto e

Luis Fernando Machado.

Ao corpo docente do Programa de Ps-Graduao em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitrios da UFPA pelos ensinamentos ministrados.

Ao Instituto Evandro Chagas/SVS/MS e seu corpo tcnico e administrativo pela

oportunidade e por ter possibilitado a aquisio de equipamentos, softwares e

consumveis necessrios para o desenvolvimento deste trabalho.

A FIOCRUZ/MS, por meio do Laboratrio de Gentica Molecular de Microrganismos-

LGMM, pela concesso de materiais, reagentes e apoio tcnico em diferentes etapas

deste trabalho.

8

As Doutoras Vernica Vieira, Erica Loureno, Fernanda Freitas e Rosa Koko do

Laboratrio de Gentica Molecular de Microrganismos da FIOCRUZ-RJ pelos

ensinamentos sobre PFGE e pelo apoio no sequenciamento de genes.

Aos Doutores Edvaldo Loureiro, Karla Ribeiro, Lzio Ramos e Za Lins pela

importante participao na etapa que precedeu este estudo (isolamento e identificao

de espcimes ambientais e clnicos de Vibrio cholerae da Amaznia brasileira no

perodo de 1977 a 1999).

Aos Professores Doutores, Maria Paula Schnneider, Marcio Nunes, Karla Lima e Luis

Fernando Machado pela importante contribuio no plano de qualificao.

A Dra. Iracina Maura de Jesus, chefe da Seo de Meio Ambiente-SAMAM/IEC, pela

compreeso, amizade e pelo apoio incondicional a este e a todos os outros projetos e

anseios do Laboratrio de Microbiologia Ambiental.

A Dra. Maria de Ftima Assis pela agradvel convivncia, conselhos e estmulo

constante e pela reviso ortogrfica do plano de qualificao e da tese.

A Juliana Perez Chaparro pela reviso do abstract e pela inestimvel ajuda na

finalizao e impresso do manuscrito e na preparao dos slides para defesa.

Aos amigos Pio Girard, Geralda Resende e Elivam Vale por nunca me deixarem sem

apoio nas horas difceis e pelas conquistas e vitrias do Laboratrio de Microbiologia

Ambiental-LMA da SAMAM/IEC.

A Neila Patricia e Raimundo Pio pelo inestimvel auxlio tcnico na genotipagem das

amostras por PFGE.

Aos recm chegados ao LMA/SAMAM/IEC, Vanessa Costa, Francisco Arimatia e

Samara Cristina pelo importante apoio tcnico e amizade no decorrer da minha licena

9

maternidade, em especial a Vanessa, que durante este perodo assumiu em meu lugar a

responsabilidade tcnica do LMA, com muita propriedade.

Aos profissionais da SAMAM/IEC/MS, Eleomar Santiago, Isabel Jesus, Marcelo Lima,

Bruno Carneiro, Kleber Faial, Rosivaldo Alcantara, Kelson Faial, Adaelson, Elane,

Tereza, Elone, Alana, pelo convvio, auxlio e amizade no decorrer desta etapa.

Ao Henri Berghs e Leonardo Dagnoll pelas dicas preciosas sobre o uso do software

BioNumerics.

10

SUMARIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................................ 12

RESUMO ................................................................................................................... 15

ABSTRACT ............................................................................................................... 16

1. INTRODUO .............................................................................................. 17

1.1. ASPECTOS HISTRICOS DA CLERA ...................................................... 18

1.2. TAXONOMIA ................................................................................................ 24

1.3. ETIOLOGIA DA CLERA ............................................................................. 24

1.5. ECOLOGIA E EPIDEMIOLOGIA DO VIBRIO CHOLERAE ......................... 31

1.6. PATOGENICIDADE E ADAPTABILIDADE AMBIENTAL ......................... 33

1.7. O GENOMA DE VIBRIO CHOLERAE ........................................................... 35

1.8. GENES RELACIONADOS A VIRULNCIA DO VIBRIO CHOLERAE ........ 36

1.8.1. O pilus tcp e msha ...................................................................................... 37

1.8.2. A toxina colrica (CTX) ............................................................................. 39

1.8.3. O plasmdeo TLC ....................................................................................... 41

1.8.4. Toxinas RTX .............................................................................................. 42

1.8.5. Hemolisina/citolisina (hlyA), fator quimiottico (hlyB), Fosfolipase (lec),

lipases (hlyC ou lipA e lipB) e metaloprotease (prtV) .............................................. 44

1.8.6. Outras toxinas ............................................................................................ 48

1.9. TRANSFERNCIA HORIZONTAL DE GENES............................................ 49

1.10. INTEGRONS EM VIBRIO CHOLERAE ...................................................... 50

1.11. GENOTIPAGEM DE VIBRIO CHOLERAE ................................................ 54

1.12. OBJETIVO ................................................................................................ 60

1.12.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 60

11

SUMARIO

1.12.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ....................................................................... 60

2. MATERIAL E MTODOS ............................................................................ 61

2.1. SELEO DAS AMOSTRAS DE V.CHOLERAE O1 E NAG PARA O

ESTUDO MOLECULAR ............................................................................................ 61

2.2. REATIVAO DAS BACTERIAS ISOLADAS NO PERODO DE 1977 A

2007 ........................................................................................................................ 64

2.3. MANUTENO E CULTIVO DOS VIBRIO CHOLERAE ............................. 64

2.4. LISE DO VIBRIO CHOLERAE POR CHOQUE TRMICO ............................ 65

2.5. GENOTIPAGEM POR PERFIL DE MACRORESTRIO DO DOS

CROMOSSOMOS DO VIBRIO CHOLERAE .............................................................. 65

2.6. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PARA OS GENES

ASSOCIADOS A VIRULNCIA DO VIBRIO CHOLERAE ....................................... 67

2.7. DETECO DE INTEGRONS DE CLASSE I (INTI1), II (INTI2) E III (INTI3)

E SEQUENCIAMENTO DOS SEGMENTOS AMPLIFICADOS ............................... 69

3. RESULTADOS ............................................................................................... 72

3.1. GENOTIPAGEM ............................................................................................ 72

3.2. PREVALNCIA DE GENES ASSOCIADOS VIRULNCIA ..................... 74

3.3. DETECO DE INTEGRONS ....................................................................... 83

4. DISCUSSO ................................................................................................... 85

5. CONCLUSES............................................................................................... 99

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................... 100

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representao esquemtica do profago VPI (~ 40kb). As

cadeias abertas de leitura so mostradas como setas que

correspondem a direo de transcrio (adaptado de Kirn et al.,

2000).

40

Figura 2: Representao esquemtica do profago CTX (~ 7 kb). As fases

abertas de leitura so mostradas como setas que correspondem

direo de transcrio (adaptado de Boyd et al., 2000).

42

Figura 3: Representao esquemtica da organizao gentica do cluster

da toxina RTX em V. cholerae. As fases abertas de leitura so

mostradas como setas que correspondem direo de

transcrio. A barra representa a deleo encontrada no biotipo

clssico (adaptado de Chow et al., 2001).

45

Figura 4: Representao esquemtica da organizao gentica do locus

hly (~ 8,2 kb) em V. cholerae. As fases abertas de leitura so

mostradas como setas que correspondem a direo de

transcrio (adaptado de Ogierman et al., 1997).

46

Figura 5: Representao esquemtica de um integron de classe I com

cassete gnico inserido no seu segmento varivel. Adaptado de

Mazel et al., 1998.

54

Figura 6: Extratgia de utilizao dos iniciadores da PCR para deteco

e caracterizao dos integrons.

72

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 7: Dendograma da relao de identidade entre os isolados de

V.cholerae O1 e NAGs ambientais da Amaznia a partir de

perfis de macrorestrio (enzima de restrio NotI) definidos

por PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado

pelo coeficiente de Dice e mtodo UPGMA. A matriz

cinza/preta representa ausncia/presena dos genes de

virulncia (definidos na barra lateral). Quadrados coloridos em

verde so os O1 e em vermelho os NAGs. O registro,

sorogrupo, fonte, data e origem esto listados ao lado.

SG=sorogrupo, Key=registro da amostra, A=ambiental,

H=humana.

76

Figura 8: Exemplos dos perfis de macrorestrio do genoma de

V.cholerae O1 e NAG ambientais resolvidos por eletroforese

em gel de campo pulsado (PFGE) utilizando a enzima de

restrio Not I. 1=NAG, 2-10=O1, 11=El Tor (N16961), 12=El

Tor (121), 13=clssico (200), 14=O1, 15=Marcador de peso

molecular.

77

Figura 9: Exemplos de perfis de macrorestrio do genoma de

V.cholerae O1 resolvidos por eletroforese em gel de campo

pulsado (PFGE) utilizando a enzima de restrio Not I. 1-

09=O1, 10=El Tor (N16961), 11=El Tor (121), 12=clssico

(200), 13-14=O1, 15=Marcador de peso molecular.

78

14

LISTA DE FIGURAS

Figura 10: Exemplo dos resultados da amplificao por PCR do gene

tcpB-H em V.cholerae O1 ambientais da Amaznia brasileira.

79

Figura 11: Exemplo dos resultados da amplificao por PCR do gene do

gene ctxAB em V.cholerae O1 ambientais da Amaznia

brasileira.

80

Figura 12: Exemplo dos resultados da amplificao por PCR do plamdeo

TCL em V.cholerae O1 ambientais da Amaznia brasileira.

80

Figura 13: Distribuio de genes associados virulncia entre os 148

isolados de V.cholerae O1 e NAG de fontes ambientais. A

matriz cinza/preta representa ausncia/presena dos genes de

virulncia por PCR. Os quadrados coloridos representam:

verde=sorogrupo O1, vermelho=NAG. Reg=registro da

amostra, SG=sorogrupo, A=ambiental, H=humano.

82

Figura 14:

(A e B)

Composio e organizao dos integrons de classe 1 dos

isolados ambientais de V.cholerae NAG da Amaznia

brasileira.

85

Figura 15: Perfis de macrorestrio e de genes associados a virulncia

nos isolados ambientais de V.cholerae NAG da Amaznia

brasileira com integrons de classe 1. A matriz cinza/preta

representa ausncia/presena dos genes de virulncia por PCR.

Os quadrados coloridos em vermelho=NAG. Key=registro da

amostra.

85

15

RESUMO

Vibrio cholerae, agente etiolgico da clera, uma bactria nativa de

ambientes aquticos de regies temperadas e tropicais em todo o mundo. A clera

endemica e epidemica em pases da frica, sia e Americas Central e do Sul. Neste

trabalho o objetivo foi estudar a diversidade gentica de isolados desta espcie, de

ambientes aquticos da Amaznia brasileira. Um total de 148 isolados de V.cholerae

no-O1 e no-O139 (NAGs) e O1 ambientais da Amaznia, obtidos entre 1977 e 2007,

foram caracterizados e comparados a linhagens clnicas de V.cholerae O1 da sexta e

stima pandemias. Utilizou-se os perfis de macrorestrio definidos em eletroforese em

gel de agarose em campo pulsado (PFGE), para determinar a relao clonal entre

V.cholerae non-O1 e O1 ambientais e clnicos. A presena de genes de virulncia

(hlyA/hem, hlyB, hlyC, rtxA, rtxC, tcp, ctx, zot, ace, stn/sto) e integrons de classe 1, 2 e 3

(intI 1, 2 e 3), foi analisada utilizando-se a reao em cadeia da polimerase. A anlise

dos perfis de macrorestrio revelou que os NAGs apresentaram uma grande

diversidade gentica comparada aos V.cholerae O1. Isolados de NAGs e O1 segregaram

em distintos grupos e a maioria dos O1 ambientais apresentou relao clonal com

isolados clnicos da stima pandemia de clera. A distribuio dos genes de virulncia

entre os NAGs diferente a dos O1, os quais, em geral, foram positivos para todos os

genes de virulncia estudados exceto stn/sto e integrons de classe 1, 2 e 3. Alguns

V.cholerae O1 ambientais pertencentes a linhagem da stima pandemia, apresentaram

uma extensiva perda de genes. Diferentes NAGs foram stn/sto+ e intI 1

+. Dois alelos do

gene aadA foram encontrados: aadA2 e aadA7. De modo interessante os V.cholerae O1

ambientais pertencentes linhagem pandmica, s foram isolados durante o perodo da

ltima epidemia de clera na regio Amaznica brasileira (1991-1996).

16

ABSTRACT

Vibrio cholerae, the etiologic agent of cholera, is an autochtonus bacterium

of aquatic environment in temperate and tropical regions of the world. Cholera is

endemic and epidemic in many countries in Africa, Asia and Central and South

America. In this study our goal was to detemine the genetic diversity of V.cholerae

environmental isolates from aquatic ecosystems in the Amazon region of Brazil. A total

of 148 environmental strains of V.cholerae non-O1 and non-O139 (NAG) and O1

serogroups, isolated from the Amazon region since 1977 to 2007, were characterized

and compared with clinical strains of V.cholerae O1 from sixty and seventh cholera

pandemic. PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) was performed to determine the

clonal relationships between V.cholerae non-O1, O1 environmental and clinical strains.

The presence of virulence genes (hlyA/hem, hlyB, hlyC, rtxA, rtxC, tcp, ctx, zot, ace,

stn/sto) and class 1, 2 and 3 integrons (intI 1, 2 e 3) was analyzed by polymerase chain

reaction. Whole genome macrorestriction analysis revealed that the environmental

V.cholerae NAGs were more diverse than the environmental O1 strains, both groups

segregate in distinct clusters and most of environmental O1 strains show a clonal

relationship with seventh cholera pandemic strains. The distribution of virulence genes

in NAGs strains is largely different from that of O1 strains which, in general, were

positive for all virulence genes analyzed excepting for stn/sto and class 1, 2 and 3

integrons. Some O1 environmental strains, belonging to the seventh pandemic lineage,

went through an extensive gene loss. Distinct NAGs strains were stn/sto+ and intI 1

+.

Two alleles of aadA were found: aadA2 and aadA7. Interestingly, V.cholerae O1

environmental strains belonging to the pandemic lineage were only isolated during the

period of cholera epidemic in the Amazon region of Brazil (1991-1996).

17

1. INTRODUO

O gnero Vibrio abriga atualmente 12 espcies patognicas para humanos,

incluindo o Vibrio cholerae. Este gnero tem sido associado a doenas veiculadas por

gua e alimentos (Pruzzo et al., 2005a; 2008). O Vibrio cholerae sorogrupos O1 e

O139, so considerados os de maior importncia clnica devido sua associao com

pandemias (O1) ou epidemias (O1 e O139) de clera ou diarria grave muito

semelhante a clera (cholera-like), em muitas partes do mundo (Kaper et al., 1995;

Raychoudhuri et al., 2009). Outras espcies do gnero capazes de causar diarria em

humanos so: V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.alginolyticus, V.damsela, V.fluvialis,

V.furnissii, V.hollisae, V.metschnikovii e V.mimicus; todas ocorrem naturalmente em

ambiente aqutico, que tem um importante papel na persistncia, disseminao,

evoluo e transmisso destes agentes para humanos (Colwell, 1996; Alam et al., 2007).

A clera (CID A09) uma doena infecciosa intestinal aguda, exclusiva dos

seres humanos, de veiculao predominantemente hdrica, causada pela enterotoxina

(CTX) do V.cholerae. As manifestaes clnicas so variadas e vo desde infeces

inaparentes e quadros leves, predominantemente pelo biotipo El Tor, a graves, que se

caracterizam por incio repentino de diarria aquosa e abundante, sem dor, vmitos

ocasionais e cimbras. Esse quadro, quando no tratado prontamente, pode evoluir para

desidratao grave, acidose metablica, insuficincia renal e choque hipovolmico. A

taxa de mortalidade pode chegar a 50%, mas com tratamento adequado no chega a 1%

(Kaper et al., 1995; Nitrini et al., 2002; Sack et al., 2004; Matson et al., 2007).

18

1.1. ASPECTOS HISTRICOS DA CLERA

Segundo Barua (1992), as seis primeiras pandemias teriam ocorrido no

perodo entre 1817 a 1923. A primeira pandemia (1817 e 1823) estendeu-se do vale do

rio Ganges a regies da sia e norte da frica. Durante as quatro seguintes, a

propagao da clera deveu-se s rotas comerciais, migraes, e deslocamento de

exrcitos atingindo alm da sia e frica, a Europa e as Amricas (Barua, 1992).

A segunda pandemia (1829-1851) de clera comeou quando os russos,

aps a invaso da Prsia, levaram a clera para Europa, pela primeira vez atingida em

larga escala. A doena chegou ao continente Americano via Mxico, difundindo-se

ainda pelos pases da Amrica Central, Amrica do Sul e Estados Unidos, quando

surgiu nas cidades de Nova York e Philadelphia. Neste contexto, o ano de 1832 ficou

marcado devido a ecloso de uma grande epidemia no Canad, que comeou em

Quebec e Montreal e seguiu rapidamente pelo rio St. Lawrence e seus tributrios,

atingindo o interior deste pas (Barua, 1992; Nitrini et al., 2002).

Por ocasio da terceira pandemia de clera (1852-1859), marcada por uma

intensa produo de casos, vrios pases da sia, frica, Amricas e Europa foram

acometidos. Nesta ltima, restringiu-se a Frana, Itlia e Espanha. Foi nesta poca, mais

precisamente entre 1854 e 1855, que a clera, uma doena infecciosa de etiologia ainda

desconhecida, aconteceu pela primeira vez no Brasil. Os primeiros casos foram

registrados na cidade do Rio de Janeiro em 1854. J em 1855, chegou a cidade de

Belm do Par por via martima, trazida pelo galera portugues Defensor, procedente

da cidade do Porto, Portugal (Viana, 1992). A partir da, irradiou com grande rapidez

para o interior do Par e posteriormente para o resto do pas, tendo sido registrados, at

19

1867, aproximadamente 200 mil bitos (Viana, 1992; Lainson et al., 1997; Beltro,

1999; Nitrini et al., 2002).

A clera voltou a fazer vtimas no Brasil durante a quarta pandemia (1863-

1879) por volta dos anos 1866-1869 quando atingiu todos os estados do litoral, alm de

alcanar as tropas brasileiras e argentinas que lutavam na guerra do Paraguai. Por

ocasio da quinta pandemia (1881-1896) tambm foram registrados surtos importantes

no Brasil (Barua, 1992), nessa poca, o agente etiolgico desta doena foi descoberto.

Credita-se a Robert Koch este feito, em 1883/1884, por ter sido o primeiro cientista a

isolar a bactria cultivada em placas de gelatina e denomin-la de "cholera vibrio". Na

mesma poca (1884), Filippo Paccini, que estudava um surto de clera em Florea,

Itlia, examinou a mucosa intestinal de vtimas fatais da clera usando unicamente

microscpio ptico e detectou a mesma bactria, isolada por Koch, em todas as

amostras. Nesta ocasio, Paccini sugeriu o caracter contagioso da doena enquanto os

mdicos e cientstas acreditavam na teoria miasmtica (Brock, 1999; Nitrini et al.,

2002).

No mesmo perodo, Jonh Snow estudou a epidemiologia da clera em vrias

cidades da Inglaterra, incluindo Birmingham, Manchester e Londres, tendo sido

desenvolvido nesta ltima, o clebre estudo epidemiolgico da doena, referencial

terico para esta cincia e aplicao de seu mtodo. Jonh Snow, em 1855, recomendava

j naquela poca, para conteno da doena, provimento de gua em quantidade e

qualidade adequadas, livre de contaminao por excretas de natureza humana (Nitrini et

al., 2002).

Aps essas descobertas, iniciava-se uma nova era na anlise das condies

de sade e doena dos grupos humanos, ou seja, definir medidas profilticas,

20

diagnsticas e de tratamento, desta vez baseados na etiologia correta das doenas. A

partir de ento, a clera passou a se manifestar mais intempestivamente nos pases onde

as condies de saneamento bsico eram precrias (Snow, 1999). No perodo de 1893-

1895 a clera retornou ao Brasil pela terceira vez, atingindo a capital do estado de So

Paulo e algumas cidades do Vale do Paraba, com extenso ao Rio de Janeiro (Lainson

et al., 1997; Nitrini et al., 2002).

At quase o final da sexta pandemia (1899-1923), admite-se que todos os

casos de clera haviam sido causados pelo V. cholerae O1 biotipo clssico, at que em

1905 foi caracterizado o V. cholerae O1 biotipo El Tor, entretanto, este s foi

relacionado s epidemias cerca de 60 anos mais tarde, por ocasio da ecloso da stima

pandemia (Barua, 1992; Lainson et al., 1997; Nitrini et al., 2002).

A stima e atual pandemia teve seu incio registrado em 1961 na Ilha de

Sulawesi (ex-Clebes, na Indonsia). Por uma dcada o V. cholerae O1, biotipo El Tor

acometeu principalmente a sia e Oriente Mdio, j nos anos 70, dispersou-se para

frica, sul da Europa e ilhas do Pacfico, com eventuais achados nos Estados Unidos e

Autralia (Barua, 1992; Blake, 1994). Ao atingir a frica em 1970, o trnsito de navios e

aeronaves entre os continentes europeu, africano e a costa brasileira, foi causa de grande

preocupao por parte das autoridades internacionais, em funo do alto risco da

reintroduo do vibrio no hemisfrio ocidental (Barua, 1992; Lainson et al., 1997;

Nitrini et al., 2002).

Prevendo uma nova entrada da clera no Brasil, em 1971 o Ministrio da

Sade, em parceria com a Organizao Pan-Americana de Sade (OPAS) e a

Organizao Mundial de Sade (OMS), instituiu no pas um Programa Nacional para

Vigilncia da Clera que foi integrado Rede Nacional de Laboratrios de Sade

21

Pblica, com treinamento de pessoas, capacitando-as a realizar o diagnstico

laboratorial da clera, seguindo tcnicas padronizadas pela OMS e Centro de Controle

de Doenas (CDC), Atlanta, EUA. A vigilncia laboratorial da clera passou a ser

realizada em todo o territrio brasileiro, ficando o Instituto Evandro Chagas-IEC, como

referncia para a regio Norte (Lainson et al., 1997).

Em 1973, o Ministrio da Sade criou a Comisso Nacional de Preveno a

Clera, que se desdobrou em 17 comisses estaduais e algumas municipais, sendo

responsvel pela vigilncia da clera, desde 1971, a Seo de Bacteriologia do Instituto

Evandro Chagas-IEC/MS-Pa. Naquele ano, o IEC deu incio a investigaes sobre a

possvel ocorrncia desta bactria na regio e, em 1974, passou a investigar a presena

do vibrio colrico e de outras bactrias enteropatognicas nos esgotos sanitrios de

Belm. A partir de 1975, o IEC em colaborao com a Capitania dos Portos, Aeroportos

e Fronteiras de Belm, passou a exercer o controle de imigrantes da Europa, frica,

inclusive portugueses de colnias africanas e sia. Num perodo de nove anos, foram

examinadas 750 amostras de esgoto, observando-se uma frequncia de isolamento de V.

cholerae no O1 e no O139 (NAG) de 5,6% (Loureiro, 1986; Lainson et al., 1997).

Com o declnio da pandemia no fim da dcada de 70, observou-se um

relaxamento mundial na vigilncia epidemiolgica da clera. No Brasil, mais

especficamente no estado de So Paulo, um programa de vigilncia da clera analisou

entre os anos de 1974 a 1983, 12.867 amostras. Neste perodo, nenhum caso de clera

foi detectado, entretanto, obteve-se o isolamento de V. cholerae O1 no toxignico e V.

cholerae NAG a partir de amostras de gua de esgoto (Martins, 1988; Hofer &

Fernandez, 1990; Martins et al., 1991).

22

Em 1989, a doena passou a apresentar um recrudescimento significativo na

sia e na frica e, em janeiro de 1991, a stima pandemia eclodiu na Amrica do Sul.

Os primeiros casos surgiram no litoral do Peru em janeiro de 1991 e, a partir da,

alastraram-se pelas Amricas Central e do Sul (PAHO, 1991; Tauxe et al., 1994) de

modo que ao final de 1993, com exceo do Uruguai, todos os pases da Amrica do Sul

j estavam afetados pelo vibrio colrico (Toledo, 1993; Lainson et al., 1997; Nitrini et

al., 2002).

Neste contexto, a clera ressurgiu no Brasil em 1991, atravs do estado do

Amazonas, mais especificamente nos municpios de Benjamin Constant e Tabatinga, na

trplice fronteira do Brasil com a Colmbia e Peru, em decorrncia da grande presso de

transmisso procedente de Letcia, na Colmbia, e Iquitos, no Peru. A partir da, o V.

cholerae O1 biotipo El Tor provocou surtos em vrias comunidades ribeirinhas ao

longo, principalmente, dos rios Solimes/Amazonas, espalhando-se progressivamente

pela regio Norte, seguindo o curso destes rios e seus afluentes, principal via de

deslocamento de pessoas na regio Norte (Brasil, 2005; Brasil, 2008; Nitrini et al.,

2002).

Ainda em 1991 o Maranho j havia registrado sete casos. No ano seguinte,

a regio Nordeste, principalmente, e Sudeste, foram atingidas atravs dos principais

eixos rodovirios. Em fevereiro de 1992, a clera foi detectada no serto da Paraba e,

logo em seguida no agreste de Pernambuco. At o final deste mesmo ano, todos os

estados do nordeste foram atingidos tendo sido registrado um caso autctone no Rio de

Janeiro e um no Esprito Santo. Em 1993 a doena avanou para as regies Sudeste e

Sul, tendo sido registrado casos em Minas Gerais (57), Esprito Santo (100), Rio de

Janeiro (267), So Paulo (11) e Paran (6). Em 1994, a clera passou a ter a maioria dos

23

casos concentrados na regio Nordeste, cujos estados (Cear, Paraba, Pernambuco,

Bahia, Rio Grande do Norte e Alagoas) apresentavam os maiores coeficientes de

incidncia (Brasil, 2008).

A epidemia de clera manteve-se na Amaznia, mais especificamente nos

estados do Amazonas, Par, Rondnia e Amap, de 1991 a 1998, com um total de

11.613 casos confirmados pelo Ministrio da Sade do Brasil. Tocantins e Roraima no

registraram casos at hoje. No Par, a epidemia manteve-se de 1991 a 1996. O nmero

de casos confirmados foi de 4.798, tendo a maioria deles ocorrido no ano de 1992

(Tabela 1).

Tabela 1: Nmero e percentagem de casos de clera no Brasil, 1991 2008.

REGIO NMERO %

Norte 11.613 6,89

Nordeste 155.357 92,15

Sudeste 860 0,51

Sul 473 0,28

Centro-Oeste 285 0,17

Brasil 168.588 100

FONTE:Adaptadode http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/casos_conf_colera_1991_20

08.pdf Acessado em 12/08/2009.

Aps uma importante diminuio dos casos de clera no Brasil, a partir de

1995, observou-se em 1999 um recrudescimento da epidemia, tendncia que no se

confirmou no ano de 2000, com o registro de 733 casos, todos procedentes da regio

Nordeste, em sua grande maioria dos estados de Pernambuco e Alagoas (Brasil, 2008).

Com exceo dos casos registrados por ocasio de surtos nos estados de

Minas Gerais e Paran, todos os outros computados nos anos de 1999, 2000 e 2001

ocorreram na regio Nordeste. Embora em 2002 e 2003 nenhum caso da doena tenha

24

sido confirmado no Pas, o V.cholerae O1 foi isolado de amostras ambientais coletadas

em municpios dos estados de Alagoas e Pernambuco, alm disso, houve a identificao

do V.cholerae O1, sorotipo Inaba em uma amostra clnica do estado de Alagoas, com

toxigenicidade negativa. Em 2004, foram confirmados 21 casos autctones. Em 2005

outros cinco casos autctones foram registrados, todos procedentes do estado de

Pernambuco (Brasil, 2008).

Em 2006 e 2007, no foram confirmados casos autctones de clera no

Brasil, entretanto, um V.cholerae O1 Ogawa no toxignico foi isolado de uma amostra

de gua superficial coletada do Igarap Tucunduba no municpio de Belm-Pa (S,

L.L.C. comunicao pessoal).

1.2. TAXONOMIA

O gnero Vibrio compreende, atualmente, 72 espcies reconhecidas e est

includo na famlia Vibrionaceae juntamente com os gneros Photobacterium (N=16),

Aliivibrio (N= 4), Enterovibrio (N=4), Salinivibrio (N=3) e Grimontia (N=1). Ao todo o

grupo dos vibrios, incluindo todas as espcies da famlia Vibrionaceae, compreende 100

espcies (Euzby, 2009).

1.3. ETIOLOGIA DA CLERA

O agente etiolgico da clera o V.cholerae O1, biotipo clssico e El Tor.

Mais recentemente, o sorogrupo O139 desta espcie tem tambm sido includo na

etiologia desta doena (Nitrini et al., 2002). Segundo o Bergeys Manual of Systematic

Bacteriology (1984), a famlia Vibrionaceae composta por bacilos Gram-negativos,

25

retos ou curvos, com flagelao polar nica, so quimiorganotrficos e possuem

metabolismo fermentativo e oxidativo. A maioria produz oxidase e requer de 2% a 3%

de cloreto de sdio para crescimento timo, entretanto, o V.cholerae apresenta

crescimento tanto em caldo nutritivo sem adio de NaCl quanto com adio deste sal a

1%. oxidase positivo, reduz nitrato a nitrito, apresenta reao negativa nas provas de

fermentao do mio-inositol e arginina diidrolase e positiva nas provas da lisina e

ornitina descarboxilase (Nitrini et al., 2002; Winn Jr et al., 2008).

Os V. cholerae NAG tem sido reconhecidos como agentes etiolgicos de

casos isolados e surtos de diarria muito semelhante a clera (Bhattacharya et al., 1992;

Russel et al., 1992; Ramamurthy et al., 1993; Dakin et al., 1974; Sharma et al., 1998).

Muitos apresentam caractersticas epidemiolgicas de crescente importncia, pois nem

sempre se detecta qualquer fator de virulncia conhecido entre eles (Bag et al., 2008)

ou, como j observado em outros casos, possvel a deteco da toxina colrica (CTX)

e/ou do pilus TCP, toxina termoestvel (ST), alm do gene regulatrio ToxR em

isolados de casos clnicos ou de origem ambiental (Ramamurthy et al., 1993; Bagchi et

al., 1993; Dalsgaard et al., 1995b; Mukhopadhyay et al., 1995; Nandy et al., 1995;

Ghosh et al., 1997; Rivera et al., 2001).

O V. cholerae classificado em sorogrupos ou sorovares com base nos seus

antgenos somticos (antgenos O), de modo que at o momento, 206 j foram

identificados, sendo os sorogrupos O1 e O139 toxignicos diretamente associados

clera epidmica (O1 e O139) ou pandmica (O1) (Raychoudhuri et al., 2009). O

restante dos sorogrupos de V. cholerae, possuem as mesmas caractersticas

morfolgicas e bioqumicas dos sorogrupos O1 e O139, porm, no aglutinam com

estes antisoros especficos e sim com seus prprios antisoros e, por este motivo, ficaram

26

conhecidos como no O1 e no O139 (NAG-non aglutination group). Vale a pena

ressaltar que a transformao de um sorogrupo em outro pode ocorrer, inclusive, em

reservatrios aquticos (Colwell et al., 1995) e so provenientes de recombinaes

homlogas, entre as regies codificadoras dos determinantes antignicos, genes rfb

(Blokesch & Schoolnik, 2007), ou por mutao e/ou rearranjo, como ocorrido com a

linhagem Bengal O139 (Salles et al., 1994; Li et al., 2002). Deste modo, a caracterizao

sorolgica isoladamente, representa uma ferramenta insuficiente do ponto de vista

epidemiolgico.

O V. cholerae O1 pode ser caracterizado por dois principais sorotipos, Inaba

e Ogawa, alm do sorotipo Hikojima que raramente identificado. Esta classificao

tambm baseada na deteco das fraes A, B e C do antgeno somtico O. O sorotipo

Inaba apresenta as fraes A e C, o Ogawa (A e B) e o Hikojima (A, B e C) (Sakazaki,

1970; Kaper et al., 1995; Sack et al., 2004; Winn Jr et al., 2008).

Linhagens de V. cholerae O1 podem pertencer aos biotipos, clssico e El

Tor. Esta classificao taxonmica subespecfica no diretamente relacionada aos

processos de manejo clnico da clera, entretanto, de grande importncia

epidemiolgica em sade pblica visto que permite a identificao da fonte e dispersso

da infeco, sobretudo, quando V.cholerae isolado pela primeira vez em uma dada

regio geogrfica ou pais (Raychoudhuri et al., 2008; Winn Jr et al., 2008).

A classificao em biotipo clssico e El Tor est primariamente baseada em

propriedades bioqumicas e susceptibilidade a bacterifagos como resumido no Quadro

1 (Sakazaki, 1970; Kaper et al., 1995; Sack et al., 2004; Winn Jr et al., 2008).

Entretanto, mtodos de biotipagem molecular tem demonstrado variaes entre estes

dois biotipos. Uma delas diz respeito a subunidade principal da protena TCP, gene

tcpA, que apresenta diferentes alelos entre os biotipos (Kesler & Hall, 1993). O

27

bacterifago CTX ladeado pelo elemento RS1 contendo o gene rstC somente nos

isolados toxignicos de V.cholerae O1 El Tor e O139 (Waldor et al., 1997). O gene

rtxC tem sido observado apenas no biotipo El Tor (Lin et al., 1999). A hemolisina hlyA

do biotipo clssico apresenta uma deleo de 11 nucleotdeos (Rader & Murphy, 1988)

e esta diferena tem sido utilizada como marcador para diferenciar o clssico do El Tor

(Alm & Manning, 1990). Baseados na estrutura da subunidade B da toxina CTX,

Finkelstein et al. (1987), designaram de CT1 o prottipo elaborado pelo biotipo clssico

e isolados da Costa do Golfo e CT2 aquele produzido pelo biotipo El Tor e isolados do

sorogrupo O139. Outra classificao identificou gentipos do gene ctxB, baseada em

trs mudanas de bases que resultam na modificao da sequncia de aminocidos. O

gentipo 1 encontrado em isolados do biotipo clssico e da costa do Golfo, o gentipo

2 no biotipo El Tor e isolados da Austrlia e o gentipo 3 encontrado no biotipo El

Tor da stima pandemia e em cepas epidmicas da Amrica Latina (Olsvik et al., 1993).

Outra anlise mostra que o V.cholerae El Tor, que causa a forma mais branda da

doena, possui uma nica cpia do operon da toxina CTX, enquanto que o biotipo

clssico possui duas cpias, alm disto, apresentam diferenas suts na maneira como

regulam a expresso de fatores de virulncia (Dziejman et al., 2002; Matson et al.,

2007). Por outro lado, o biotipo El Tor parece possuir melhor adaptabilidade ao

ambiente aqutico, j tendo sido identificado em diversos ecossistemas aquticos do

mundo (Alam et al., 2006; Alam et al., 2007).

Com o surgimento de isolados de V.cholerae O1 com caractersticas de

hbridos entre os biotipos clssico e El Tor (Ansaruzzaman et al., 2004; Nair et al.,

2006; Faruque et al., 2007), alm de variantes do biotipo El Tor (Nair et al., 2006)

muitos dos testes fenotpicos e genotpicos tem se mostrado insuficientes para a correta

28

classificao de isolados de V.cholerae O1, por este motivo, Raychoudhuri et al. (2008),

propuseram aumentar o nmero de provas conforme descrito no Quadro 2.

Quadro 1: Diferenciao entre biotipos de Vibrio cholerae

TESTE CLSSICO EL TOR

Teste do cordo + +

Hemoltico em gar sangue de carneiro - +

Teste CAMP - +

Teste de Voges-Proskauer - +

Aglutinao de hemcias de galinha - +

Sensibilidade a 50U de polimixina B S R

Sensibilidade ao fago IV S R

+, teste positivo; -, teste negativo; S, sensvel; R, resistente

Fonte: Winn Jr et al., 2008

O V. cholerae O1 biotipo clssico foi descrito por Koch no Egito e na ndia,

em 1883/1884, quando o chamou de Kommabazilus (bacilo em forma de vrgula). O

biotipo El Tor foi isolado por Gotschlich, em 1905/1906, de peregrinos provenientes de

Meca, examinados na estao de quarentena de El Tor, situada na pennsula do Sinai, no

Egito, e o responsvel pela stima e atual pandemia de clera (Tauxe et al., 1994;

Nitrini et al., 2002; Feng et al., 2008; Winn Jr et al., 2008).

At meados de 1992, a relao entre as epidemias de clera no mundo e o V.

cholerae O1 era absolutamente direta, sendo o biotipo clssico responsvel pelas seis

primeiras pandemias (1817 a 1923), e o biotipo El Tor pela stima, que teve seu incio

em 1961 permanecendo at hoje. Em 1992, surgiu um novo sorogrupo de V. cholerae,

isolado por ocasio de uma expressiva epidemia de clera no sul da sia (ndia e

Bangladesh) (Albert et al., 1993; Cholera Working Group, 1993; Nair et al., 1994;

29

Faruque et al., 1998b) onde se mantm at o presente. Esta variante no aglutinou com

o anti-soro O1 ou com qualquer dos 138 anticorpos no O1 existentes na poca, por isso

foi denominado O139. Por ter sido o agente da epidemia iniciada no Golfo de Bengal,

ficou conhecido como V. cholerae Bengal (Albert et al., 1993). Este novo sorotipo

surgiu por modificaes na regio codificadora dos antgenos O de um V. cholerae O1

El Tor (Bik et al., 1995; Mooi & Bik, 1997).

Quadro 2: Novo esquema para biotipagem de Vibrio cholerae O1

TESTE EL TOR CLSSICO HIBRIDO VARIANTE

EL TOR

Teste de Voges-

Proskauer + - +/- +

Susceptibilidade a

50U de polimixina B - + +/- -

Aglutinao de

hemcias de galinha + - +/- +

Lise pelo fago IV-

clssico - + +/- -

Lise pelo fago V-El

Tor + - +/- +

Epitopo da CT CT2 CT1 CT1/CT2 CT1

Gentipo do gene

ctxB El Tor clssico El Tor/clssico clssico

rtxC + - +/- +

tcl + + +/- +

Alelo do tcpA El Tor clssico varivel El Tor

Elemento RS RS1, RS2 RS2 RS1, RS2/RS2 RS1, RS2/RS2

Fonte: Raychoudhuri et al., 2008

Em 1995, foi descrito uma nova linhagem do V. cholerae O1 oriunda de

casos de diarria tpica ocorridos em 1991 e 1992, com diagnstico clnico-

epidemiolgico e laboratorial de clera, em residentes de algumas vilas da regio do

alto Solimes, no estado do Amazonas. Esta variante, alm de no possuir nenhum dos

fatores associados virulncia (CTX-cholera-toxin e TCP-toxin-coregulated pilus), no

30

geneticamente relacionada aos biotipos at ento associados com a clera (clssico e

El Tor). Esse foi denominado V. cholerae Amaznia (Coelho et al., 1995a; b).

Ainda na Regio Norte, e dentro da atual pandemia, mais uma vez

contrariando o tradicional diagnstico do vibrio colrico, que reconhecido

fenotipicamente por fermentar a sacarose, Ramos et al. (1997) isolaram em 1994, um V.

cholerae fermentador tardio de sacarose, durante um surto de clera no municpio de

Oiapoque, estado do Amap. A caracterizao molecular destes isolados mostrou que

estas variantes pertencem ao mesmo MLEE (perfil isoenzimtico) e AP-PCR (arbitrary

primer-PCR) da principal cepa epidmica (V. cholerae O1, biotipo El Tor) e possui os

genes que codificam para CTX e TCP, associados virulncia. Seria, pois, um El Tor

fermentador tardio de sacarose (Vicente, A.C.P., comunicao pessoal).

Entre os anos de 1991 e 1994, foram identificadas variantes de V.cholerae

O1 toxignico que representam hbridos entre os biotipos clssico e El Tor, utilizando

caractersticas fenotpicas e genmicas (genes tcpA e rstR, e ribotipagem). Estes foram

isolados de pacientes hospitalizados com diarria aguda em Matlab, rea rural de

Bangladesh e diferenciadas nos tipos Matlab I, II e III. Embora todas tenham

demonstrado pertencer a ribotipos previamente encontrados entre os vibrios El Tor, o

tipo I apresenta a maioria das caractersticas do biotipo clssico, enquanto que nos tipos

II e III prevalecem as caractersticas do El Tor (Nair et al., 2002) dados confirmados

posteriormente por PFGE (Safa et al., 2005).

Considerando a epidemia de clera da Amrica do Sul, mais uma linhagem

do V. cholerae O1 foi descrita a partir de pacientes com clera, residentes na provncia

de Tucum, Argentina, entre os anos de 1994 e 1998. A variante Tucum, como foi

denominada, tambm no possui a toxina colrica (CTX) e nem os outros genes que

31

compe o cassete de virulncia do fago CTX , por exemplo, tcpA, zot e ace, alm

disso, seu gentipo difere claramente tanto da linhagem Amaznia quanto dos outros

isolados clnicos ctxA+ da Argentina (Pichel et al., 2003).

Como consequncia da identificao de novas linhagens patognicas de V.

cholerae, temos atualmente uma nomenclatura que abriga: o V. cholerae O1 biotipos

clssico e El Tor; V. cholerae O139 ou Bengal; V. cholerae O1 Amaznia; V. cholerae

O1 biotipo El Tor sacarose negativo; V. cholerae O1 Matlab I, II e III, V. cholerae O1

Tucum, V. cholerae NAG e ainda a possibilidade da descrio de novas linhagens

patognicas entre os NAG, a princpio no epidmicos, mas com importncia crescente

para a epidemiologia, gentica e evoluo dos vibries.

1.5. ECOLOGIA E EPIDEMIOLOGIA DO Vibrio cholerae

A ocorrncia espacial e temporal das espcies patognicas do gnero Vibrio,

bem como sua associao doena em humanos, est fortemente relacionada a fatores

ambientais do habitat aqutico de origem (Colwell, 1996; Lipp et al. 2002; Pruzzo et al.

2008).

Trabalhos relevantes sobre a ecologia dos vibries de um modo geral tem

sido realizados em ambientes marinhos costeiros. Os vibrios so equipados com uma

bateria de mecanismos de resposta adaptativa que lhes permite persistir em ambientes

hosts, com exigncias especficas, tais como: limitaes de nutrientes, incidncia de

radiao ultravioleta, variaes de temperatura e protozorios predadores (Colwell,

1996).

A persistncia dos vibries no ambiente aqutico tem sido associada a

matrizes ambientais preferenciais que funcionam como reservatrios, dentre elas, os

32

substratos biticos e abiticos. Entre os substratos biticos destacam-se os organismos

quitinosos, vrios crustceos planctnicos, como os coppodes e amphipodas (Rawlings

et al., 2007), e outros organismos de vida livre, como por exemplo, mosquitos da

famlia Chironomidae (Broza et al., 2005). J o substrato abitico mais relacionado

presena dos vibrios no ambiente so os sedimentos em suspenso na gua. Em ambos

os casos, esta bactria capaz de formar biofilme por meio de processos que podem

envolver coliso randmica ou quimiotaxia, aglomerao reversvel ou irreversvel,

formao de microcolnias ou ainda, por meio da formao de outras estruturas

tridimensionais que favorecem a agregao e manuteno microbiana no ambiente

(Lipp et al., 2002; Pruzzo et al., 2008).

Tanto os quironomdeos voadores (Broza et al., 2005) quanto os crustceos

planctnicos, que se encontram dispersos na gua (Rawlings et al., 2007), participam do

processo de disseminao de vibrios patognicos na natureza (Vezzulli et al., 2008).

A transmisso dos vibrios aos humanos pode ser mediada por contato direto

com o microrganismo ou pela ingesto de clulas a partir do ambiente aqutico (Pruzzo

et al., 2005b), com destaque para o consumo de moluscos crus ou parcialmente cozidos,

especialmente ostra e mexilho, que por serem filtradores de partculas em suspenso na

gua, terminam por concentrar espcies microbianas patognicas (Pruzzo et al., 2005b).

A persistncia dos vibries no ambiente aqutico est relacionada

temperatura, salinidade, concentrao de matria orgnica e a presena de plncton

(Lipp et al., 2002). Nos pases onde a clera endmica, por exemplo, concentraes de

plnctons conteriam a dose infectante (106 clulas de V. cholerae) necessria para

desencadeamento da clera por meio do consumo de gua no tratada (Colwell, 1996).

A populao de vibrios no ambiente esta relacionada tambm a predao entre as

33

cadeias trficas, tais como, aquela realizada por protozorios sobre o V. cholerae

(Worden et al., 2006) e a lise desta espcie por bacterifagos (Jensen et al., 2006).

1.6. PATOGENICIDADE E ADAPTABILIDADE AMBIENTAL

A transferncia horizontal de genes ocorre com frequncia entre

microrganismos no meio ambiente (Ochman et al., 2000; Wilson & Saliers, 2003). No

que diz respeito ao V. cholerae no ambiente aqutico, destacam-se os recentes achados

de Blokesch & Schoolnik (2007), que demonstraram o surgimento do sorogrupo

epidmico O139, via recombinao homloga de uma cepa O1 El Tor por transferncia

horizontal de genes.

Outros exemplos importantes de como a transferncia horizontal de genes

no ambiente aqutico podem favorecer a patogenicidade e adaptabilidade ecolgica do

V. cholerae so: a aquisio do fago filamentoso designado VPI , onde residem os

genes envolvidos na biosntese do pilus TCP, um fator essencial para colonizao

intestinal (Davis & Waldor, 2003) e a induo do estado de competncia para adquirir

material gentico exgeno, via transformao bacteriana, durante a fase de crescimento

do V. cholerae no substrato quitinoso de organismos marinhos (Meibom et al., 2005).

Genes responsveis pela patognese do V. cholerae podem ser trocados via

transferncia horizontal de genes entre membros da mesma espcie, entre gneros

distintos, ou at mesmo entre famlia ou nveis taxonmicos mais altos. Assim, bactrias

que no carreiam genes de virulncia, podem receb-los de bactrias doadoras e, no

mnimo, passarem a funcionar como reservatrios ambientais destes genes. Um

exemplo deste processo a sugesto de que Vibrio mimicus funciona como reservatrio

dos fagos CTX e TCP configurando uma possibilidade de surgimento de novos

34

isolados toxignicos de V. cholerae no ambiente (Boyd et al., 2000). Outros genes

associados virulncia do V. cholerae ou regulao dessa virulncia tem sido

detectada em outros vibrios ambientais, entre eles V.cholerae NAG e Vibrio

alginolyticus (Xie et al., 2005; Baffone et al., 2006).

Em relao aos estudos das caractersticas ambientais dos reservatrios

bacterianos na seleo de peculiaridades da patogenicidade dos vibries, vale a pena

ressaltar os mecanismos moleculares que esto por trs da interao do V.cholerae com

partculas de quitina ou com a superfcie quitinosa dos coppodes (Zampini et al., 2005;

Kirn et al., 2005). Nestes estudos, a mesma protena envolvida na ligao do V.cholerae

com a quitina, tambm media aderncia cultura de clulas epiteliais intestinais, pela

mesma especificidade de ligao. Tem sido sugerido tambm que, fatores associados

colonizao intestinal (TCP-toxin-coregulated pilus e MSHA-mannose-fucose

hemagglutinin) esto implicados na ligao com a quitina e na formao de biofilmes

em superfcies quitinosas, no ambiente aqutico (Chiavelli et al., 2001; Reguera &

Kolter, 2005). Pelo fato dessas moleculas terem sido relacionadas com a colonizao,

tanto de superfcies presentes no ambiente quanto de seres humanos, elas tem recebido a

denominao de fatores de colonizao com duplo papel (DRCF-dual role colonization

factors) (Vezzulli et al., 2008). Estes fatores representam a ligao entre os dois

estgios de vida do V. cholerae (ambiente e hospedeiros humanos) e evidenciam que

alguns fatores de virulncia usados pelo patgeno, durante o processo de infeco,

atuam na sua interao com o ambiente natural (Pruzzo et al., 2008). Deste modo, as

bactrias portadoras de DRCF, em reservatrio ambiental, apresentam melhores

condies de adaptabilidade (environmental fitness) no que diz respeito a persistncia,

disseminao e evoluo. Alm disso, esta peculiaridade pode representar uma

35

discriminao entre os isolados ambientais e aqueles com potencial patognico

(Zampini et al., 2005).

1.7. O GENOMA DE Vibrio cholerae

Em 2000, foi publicado o sequenciamento completo dos 2 cromossomas de

V. cholerae do isolado El Tor N16961, mostrando que a composio do cromossoma 1

de 2.961.146 pb ( 3,0 Mb) e de 1.072.313 pb ( 1,1Mb) para o cromossoma 2

(Heidelberg et al., 2000). A maioria dos genes necessrios para o crescimento e

viabilidade celular est localizado no cromossoma 1, embora alguns genes essenciais

estejam localizados no cromossoma 2. A presena de 2 cromossomas tem sido

demonstrada em todas as espcies do gnero at agora analisadas (Yamaichi et al.,

1999).

Aproximadamente 10% do contedo do cromossoma 2 formado por um

mega-integron/super-integron/integron cromossomal. Os integrons so elementos de

captura e expresso de informao gentica (Mazel et al., 1998). As seqncias

presentes em elementos denominados cassetes genticos mveis se integram em um

stio de ligao especfico presente no integron (stio att) atravs de uma recombinao

stio-especfico. A recombinao feita mediante a ao de uma integrase que

codificada por um gene presente no prprio integron, geralmente na extremidade

5`conservada. A integrase presente no integron de V. cholerae foi classificada como

uma integrase de classe IV (intl4) (Mazel et al., 1998) e ela reconhece como o stio de

ligao especfica (stio att) uma famlia de seqncias repetidas que foram

denominadas de VCRs (Vibrio cholerae repeats). Os VCRs so uma famlia de

seqncias de 123-126 pb que se repetem em mais de 100 vezes e esto concentradas

36

em uma nica regio no cromossoma 2 (Barker & Manning, 1997; Heidelberg et al.,

2000). O super-integron presente no isolado N16961 apresenta 216 ORFs, porm a

maioria delas no possui identidade com nenhuma outra seqncia conhecida. Entre os

genes identificados encontram-se genes de resistncia a drogas, como cloranfenicol

acetiltransferase, uma protena que confere resistncia a fosfomicina e glutationa

transferase, enzimas envolvidas no metabolismo do DNA e alguns potenciais genes de

virulncia (hemaglutininas e lipoprotenas) (Barker et al., 1994; Heidelberg et al.,

2000).

At recentemente, todos os integrons conhecidos estavam, principalmente,

associados a genes que conferiam resistncia aos antimicrobianos, os chamados

integrons de resistncia classe 1, 2 e 3 (Recchia & Hall, 1995a; 1995b; 1997). A

identificao de um integron com caractersticas to peculiares como este

primeiramente identificado V. cholerae, mas presente em vrias espcies do gnero e da

famlia, assim como em espcies de outras famlias de bactrias, sugere que os integrons

tenham papel na aquisio de genes de patogenicidade assim como genes envolvidos em

diferentes funes biolgicas (Mazel et al., 1998; Rowe-Magnus & Mazel, 1999).

1.8. GENES RELACIONADOS A VIRULNCIA DO Vibrio cholerae

A doena diarrica clera, consequncia da infeco por V. cholerae

patognico, envolve um mecanismo complexo com a participao dos genes do regulon

ToxR. Alm do papel essencial da toxina colrica, o TCP (toxin-coregulated pilus)

fundamental para a colonizao do epitlio intestinal. Outros fatores de colonizao

incluem o pilus MSHA (mannose-fucose hemagglutinin), as protenas regulatrias (por

ex. ToxR/ToxS a ToxT), as purinas de membrana externa, os genes biossintticos da

37

biotina e purina, as protenas de membrana externa reguladas pelo ferro (por ex. IrgA), e

os fatores acessrios de colonizao. Motilidade e quimiotaxia tambm tem papel na

virulncia (Thompson et al., 2004).

1.8.1. O pilus tcp e msha

Na evoluo das gastroenterites bacterianas uma etapa essencial a

colonizao do epitlio intestinal. Os fatores envolvidos permitem a adeso, persistncia

e multiplicao do microrganismo sobre o tecido do hospedeiro. Para os vibries, os

mais importantes so os pilus TCP e MSHA (Johnson et al.,1992; Franzon et al., 1993;

Kovach et al., 1996; Mukhopadhyay et al., 1996b; Karaolis et al., 1998; Karaolis et al.,

1999).

O pilus TCP possui natureza hidrofbica, mede cerca de 5 a 7 m de

dimetro por 10 a 15 m de comprimento. Consiste de um homopolmero de

subunidades idnticas e repetidas de pilina denominada TcpA. As pilinas so protenas

de 20 kDa codificadas pelo gene tcpA (Kaufman & Taylor 1994) que pertencem ao tipo

4 da classe das pilinas, protena expressa por vrias bactrias Gram-negativas, incluindo

Escherichia coli (enterotoxignica e enteropatognica), Neisseria gonorrhoeae e

Pseudomonas aeruginosa. A estrutura primria da TcpA apresenta 82% de identidade

na sequncia de aminocidos entre os biotipos clssico e El Tor de V. cholerae (Iredell

& Manning, 1994).

Todos os genes relacionados biognese do pilus TCP residem em uma ilha

de patogenicidade (pathogenicity island-PAI ou Vibrio pathogenicity island-VPI),

correspondendo ao genoma de um fago filamentoso, designado VPI , que pode ser

adquirido pelo V. cholerae via transferncia horizontal de genes, no ambiente aqutico

38

(Davis & Waldor, 2003). O TCP tambm funciona como receptor para CTX ,

bacterifago filamentoso que codifica a toxina colrica.

O gene tcpA apresenta vrios alelos, os biotipos clssico e El Tor de

V.cholerae O1 possuem alelos prpios, enquanto que a linhagem Bengal (O139)

compartilha o mesmo alelo com El Tor. Alm destes, vrios outros alelos j foram

identificados em linhagens de V. cholerae NAG (Novais et al., 1999; Nandi et al.,

2000).

O conjunto dos genes acf que codifica quatro genes (acfABCD) (Parsot et

al., 1991) est localizado imediatamente adjacente e a jusante dos genes tcp (Figura 1).

Adjacente aos genes acf, h a presena de um gene que codifica para uma integrase (int)

da famlia de recombinases stio-especfica e um stio de ligao tipo att de 20pb

(Kovach et al., 1996). montante aos genes tcp, esto os genes aldA e tagA, um gene

que codifica para uma transposase, algumas ORF de funo ainda desconhecida e uma

segunda cpia da sequncia tipo att (Karaolis et al., 1998; Kirn et al., 2000). Toda essa

regio de aproximadamente 40 Kb, flanqueada por sequncias tipo att, incluindo os

clusters de genes TCP-ACF, uma integrase e uma transposase parece constituir uma ilha

de patogenicidade, denominada de VPI (Karaolis et al., 1998) e sugere um potencial de

mobilizao desse elemento como um bacterifago (Kovach et al., 1996; Karaolis et al.,

1998; Karaolis et al., 1999). No entanto, foi visto que a ilha de patogenicidade VPI no

gera partculas de fagos, contradizendo estes ltimos estudos (Faruque et al., 2003).

O TCP necessrio para a ligao da bactria mucosa do intestino

humano, que um componente crucial para a estratgia de infeco do V. cholerae

(Kaufman & Taylor, 1994). Tambm foi atribuda ao TCP a funo de promover a

39

agregao de bactrias, dando origem microcolnias que ento colonizam, mais

eficientemente, o epitlio intestinal (Kirn et al., 2000).

Figura 1: Representao esquemtica do profago VPI (~ 40kb). As cadeias abertas de

leitura so mostradas como setas que correspondem a direo de transcrio (adaptado

de Kirn et al., 2000).

1.8.2. A toxina colrica (CTX)

A CTX uma protena termolbil com 82-84 kDa composta por duas

subunidades denominadas A e B, que so codificadas por duas ORFs (ctxAB) distintas

que se sobrepem e que esto organizadas em um operon, podendo se apresentar em

uma ou mais cpias no genoma do V. cholerae toxignico (Mekalanos et al., 1983;

Pearson et al., 1993).

Foi caracterizada em 1959 e sua estrutura completa e cristalizao foram

elucidadas posteriormente (Finkelstein, 1992). Apresenta semelhana estrutural e

antignica enterotoxina LT de E.coli. Sua composio caracteriza-se por uma nica

subunidade A e cinco subunidades B que ligam a toxina ao receptor GM1, gangliosdeo

localizado na superfcie do epitlio intestinal, induzindo a formao de um poro de 15

P H A B Q C R D S T E F

aldA tagA orf 2 3 4 tagD tcp toxT tcpJ acfBCAD orfvw int

40

no centro deste pentmero que permite a internalizao da subunidade A. Uma vez

dentro da clula, um fragmento da subunidade A derivado proteoliticamente (A1), ativa

a enzima adenilato ciclase resultando no aumento da produo de AMP cclico. Este

processo resulta na secreo abundante de ons cloreto e gua no lmem intestinal

caracterizando a diarria aguda observada nos pacientes com clera (Keen & Bujalski,

1992; Shears, 1994; Kaper et al., 1995; Matson et al., 2007). Pacientes com clera

chegam a perder at 20 litros de fluido em um perodo de 24h, resultando em rpida

desidratao e morte em mais de 50% dos casos no tratados; j entre aqueles que

recebem rehidratao oral ou intravenosa, a taxa de mortalidade cai para

aproximadamente 1% (Matson et al., 2007).

O gene que codifica para a CTX est associado aos genes da Zot (zot) e Ace

(ace) que juntamente com o gene cep que codifica uma potencial pilina e uma ORF de

funo desconhecida (orfU), esto localizados numa regio de 4,5Kb denominada de

regio central (core) que flanqueada por uma ou mais cpias de sequncias repetitivas

quase idnticas chamadas de RS1 (2,7Kb) e RS2 (2,4Kb) constituindo uma organizao

similar a um transposon, que foi denominado de CTX (Figura 2) (Pearson et al., 1993;

Boyd et al., 2000). Em 1996 foi mostrado que este conjunto de genes parte do genoma

de um fago filamentoso e lisognico, CTX . O genoma do fago abrange a regio

central e as sequncias RS flanqueadoras. Essas sequncias RS renem os genes

responsveis pelas funes de regulao, replicao e integrao do fago (Waldor &

Mekalanos, 1996; Waldor et al., 1997).

Alm da toxina colrica, a regiao central do genoma do CTX codifica a

toxina que atua na znula ocludens (Zot) e a enterotoxina acessria (Ace). A toxina Zot

reconhecida como capaz de alterar a permeabilidade da mucosa do intestino delgado

41

afetando a estrutura da juno intercelular ou znula ocludens (Fasano et al., 1991). A

enterotoxina colrica acessria (Ace) capaz de provocar, de modo similar toxina

colrica (CTX), o acmulo de fluido em modelo experimental de infeo em ala ileal

ligada de coelho (Trucksis et al., 1993). Sugere-se que a agregao de multmeros de

Ace na membrana de clulas eucariticas levariam formao de canal inico

desestabilizador do equilbrio eletroltico celular (Trucksis et al., 1993).

Figura 2: Representao esquemtica do profago CTX (~ 7 kb). As fases abertas de

leitura so mostradas como setas que correspondem direo de transcrio (adaptado

de Boyd et al., 2000).

1.8.3. O plasmdeo TLC

Em 1998, Rubin e colaboradores identificaram um plasmdio crptico de 4,7

Kb em todos os isolados de V. cholerae toxignicos testados, que estava ausente nos

isolados ambientais no toxignicos. O plasmdio, na forma integrada ao cromossomo,

encontra-se adjacente ao profago CTX (figura 2), devido esta proximidade foi

designado de TLC- toxin-linked cryptic. O pTLC, como foi denominado, quando est na

forma extracromossmica circular, pode emergir do cromossoma a partir de uma

recombinao homloga entre as repeties diretas das cpias do elemento TLC. O

tcl rstR rstA rstB cep orfU ace zot ctxA ctxB rtxA

Cassete de VirulnciaRegio Central (CORE)

RS2

tcl rstR rstA rstB cep orfU ace zot ctxA ctxB rtxA

Cassete de VirulnciaRegio Central (CORE)

RS2

42

elemento TLC parece ter algum papel na biologia do CTX , possivelmente facilitando

tanto sua aquisio quanto sua replicao, j que o TLC parece ser similar aos

elementos RS1, que frequentemente flanqueiam o CTX no cromossoma de V. cholerae

(Rubin et al., 1998).

1.8.4. Toxinas RTX

As toxinas RTX so membros do sistema de secreo de exoprotena do tipo

I que est presente em uma grande variedade de bactrias Gram-negativas. Uma das

caractersticas desta famlia de toxinas a variao que elas apresentam em relao

atividade citotxica nos diferentes hospedeiros e tipos celulares. Podem ser classificadas

em 3 grupos funcionais: as hemolisinas, leucotoxinas e citotoxinas. As hemolisinas so

ativas em diferentes tipos celulares (eritrcitos, leuccitos, etc) de uma grande

variedade de espcies. As leucotoxinas possuem o menor espectro tendo alvo apenas o

grupo dos leuccitos. As citotoxinas possuem um espectro intermedirio, atuando em

grupos com especificidade mista (Welch, 2001).

Altas concentraes da toxina RTX induziriam uma rpida morte celular,

com caractersticas de necrose, entretanto, baixas concentraes desta toxina

desencadeiam alteraes morfolgicas, bioqumicas e moleculares associadas

apoptose (Lally et al., 1999).

A toxina RTX necessita de uma modificao ps-traducional para se tornar

biologicamente ativa. Essa ativao feita pelo produto do gene rtxC e de uma protena

carreadora de acil. A toxina produzida na ausncia da RtxC biologicamente inativa

(Issartel et al., 1991; Stanley et al., 1994). A RTX transportada do citoplasma para a

superfcie da clula por protenas de transporte que so codificadas pelos genes rtxB e

43

rtxD. Estes genes, que so necessrios para a funcionalidade da toxina RTX, esto

agrupados em um operon em que a ordem dos genes se apresenta da seguinte maneira:

rtxC, rtxA (gene que codifica a toxina propriamente dita), rtxB e rtxD. Em E.coli, um

gene adicional, tolC, necessrio para a secreo da toxina (Lin et al., 1999).

O operon da RTX em V. cholerae parece ser nico, pois h uma inverso

nos genes rtxC e rtxA, resultando em uma transcrio divergente dos genes rtxB e rtxD

e alterando tambem a ordem do operon (rtxACBD), como demonstrado na Figura 3. O

gene tolC tambm pode ser identificado, porem sem nenhuma ligao com o cluster da

RTX. No biotipo clssico, houve uma deleo que removeu o terminal 5 do gene rtxA,

todo o gene rtxC e uma parte do terminal 5 do gene rtxB. A deleo de 7.869 pb (Lin

et al., 1999; Chow et al., 2001). O cluster RTX intacto nas linhagens de V. cholerae

O139 e em isolados ambientais, sugerindo ento que a presena do cluster RTX precede

a aquisio do elemento vizinho CTX (Lin et al., 1999). Uma anlise da composio

trinucleotdica sugere que a regio da RTX foi adquirida horizontalmente junto com

mais dois genes que se encontram a jusante ao cluster da RTX que codificam para um

sensor histidina quinase e um regulador, podendo estes estarem envolvidos na expresso

da unidade transcricional da RTX (Heidelberg et al., 2000).

A RTX de V. cholerae diferente em sua estrutura, das demais toxinas RTX

conhecidas, no estando ainda completamente definida a sua forma de ao (Lin et al.,

1999). O efeito citolgico que a RtxA de V. cholerae induz em culturas de clulas o

arredondamento celular, fentipo que mantido mesmo nos mutantes em CTX (Fullner

& Mekalanos, 2000). A formao de poros e necrose estaria excluda da atividade da

toxina RTX dessa espcie bacteriana.

44

Figura 3: Representao esquemtica da organizao gentica do cluster da toxina RTX

em V. cholerae. As fases abertas de leitura so mostradas como setas que correspondem

direo de transcrio. A barra representa a deleo encontrada no biotipo clssico

(adaptado de Chow et al., 2001).

1.8.5. Hemolisina/citolisina (hlyA), fator quimiottico (hlyB), Fosfolipase (lec),

lipases (hlyC ou lipA e lipB) e metaloprotease (prtV)

Acoplado ao locus hly de V. cholerae esto vrios determinantes associados

a virulncia, incluindo uma fosfolipase (lec), uma hemolisina (hlyA), e um transdutor

quimiotxico (hlyB). Anlise da sequncia da regio a jusante revelou trs ORFs que

correspondem aos genes lipA, lipB e prtV cujas localizaes encontram-se apresentadas

na Figura 4 (Ogierman et al., 1997). Essa mesma organizao foi demonstrada em

outras espcies do gnero Vibrio, como por exemplo, em Vibrio mimicus (Kang et al.,

1998). A presena do locus lecitinase-hemolisina-lipase, entre as linhagens toxignicas

de V. cholerae dos diversos sorogrupos e biotipos, sugere que a lecitinase possa ser um

componente de um grupo de enzimas cuja funo causar dano membrana celular dos

entercitos (Fiore et al., 1997).

Em V. cholerae foi identificado o gene lec que codifica para uma fosfolipase

denominada de lecitinase. A anlise de sua sequncia mostrou uma fase aberta de leitura

de 1254 pb codificando uma protena de 418 aminocidos (Fiore et al., 1997). Essa

rtxA rtxC rtxB rtxD

45

fosfolipase parece causar citotoxidade, porm no provoca acmulo de fluido nas alas

intestinais de coelhos (Fiore et al., 1997).

A regio hly foi clonada em 1984 (Goldberg & Murphy, 1984; Manning et

al., 1984) e apresentada a seguinte composio de genes, hly A, hly B, e hly C, que na

ocasio supos-se estarem envolvidos na produo de uma hemolisina/citolisina

(Manning et al., 1984).

Figura 4: Representao esquemtica da organizao gentica do locus hly (~ 8,2 kb)

em V. cholerae. As fases abertas de leitura so mostradas como setas que correspondem

a direo de transcrio (adaptado de Ogierman et al., 1997).

Cepas de V. cholerae El Tor produzem e secretam uma toxina citoltica (El

Tor citolysin/hemolysin) em meio de cultura. O gene hlyA, que representa o gene

estrutural da citolisina, ao ser deletado (Kaper et al., 1989) do DNA cromossomal de

uma cepa de V. cholerae El Tor, resultou na perda da sua atividade hemoltica. Por este

motivo, passou-se a utilizar, entre outros, este marcador para diferenciar o V. cholerae

biotipo clssico do El Tor.

A citolisina/hemolisina produzida pelas cepas de V. cholerae NAG

imunologicamente e estruturalmente indistinguvel da citolisina/hemolisina do El Tor

lec

Fosfolipase (lecitinase) Hemolisina Lipase

hlyA hlyB

lipA ouHlyC

Transdutor

quimiotxico

lipB

prtV

Lipase

acessria Metaloprotease

46

(Yamamoto et al., 1984; Yamamoto et al., 1986) e tem atividade enterotxica (Ichinose

et al., 1987), sugerindo que esta pode contribuir para patognese da gastroenterite

causada por algumas cepas de V. cholerae que no possuem o gene que codifica para a

toxina colrica (Ichinose et al., 1987).

Esta citolisina/hemolisina (HlyA) a toxina mais amplamente distribuda

entre os vbrios patognicos (Shinoda, 1999) e parece estar ausente ou com uma baixa

expresso nas supostas linhagens ambientais avirulentas (Kaper et al., 1995;

Guhathakurta et al., 1999). Apresenta efeito hemoltico em uma grande variedade de

eritrcitos e efeitos citotxicos em culturas de clulas de mamferos (Honda &

Finkelstein, 1979; McCardell et al., 1985). A citolisina/hemolisina provoca acmulo de

fluido em alas ileais de coelho e em modelos de camundongo recm-nascido, porm, o

efeito produzido em resposta hemolisina distinto daquele causado pela CTX, j que

o fluido produzido vem acompanhado de sangue e muco (Ichinose et al., 1987; Zitzer et

al. 1993).

Estudos realizados por Coelho et al. (2000) e por Figueroa-Arredondo et al.

(2001) mostraram tambm que a induo da formao de vacolos em culturas de

clulas HeLa e Vero por filtrados de V. cholerae est associada a esta

citolisina/hemolisina. Esse efeito vacuoltico parecido com o induzido pela citotoxina

VacA de Helicobacter pylori (Montecucco & Rappuoli, 2001).

O papel da hemolisina como fator diarreiognico ainda debatido (Singh et

al., 1996). Um estudo com a vacina feita com mutantes de V. cholerae indicou que a

hemolisina no teria papel na patognese desta bactria (Levine et al., 1988), porm a

deleo do gene hlyU, um regulador da expresso do gene da HlyA, levou a uma

drstica diminuio da virulncia em modelo animal (Williams et al., 1993). Alm

47

disso, existem vrias evidncias para a atividade tanto citotxica (Honda & Finkelstein,

1979; McCardell et al., 1985; Zitzer et al., 1997) quanto enterotxica (McCardell et

al.,1985; Ichinose et al., 1987) desta molcula.

HlyB, um transdutor quimiottico tambm codificado neste locus, pode

monitorar o estatus de nutrientes do ambiente em que o microrganismo se encontra e

sinalizar para que a bactria movimente-se de acordo (Ogierman et al., 1997).

O operon da lipase de V. cholerae consiste dos genes lipA e lipB (Ogierman

et al., 1997). O gene lipA foi anteriormente descrito como hlyC que codificava para

uma protena de 18.3kDa (Alm & Manning. 1990; Manning 1994; Casanova &

Peterson, 1995), entretanto, estudos posteriores mostraram tratar-se de uma protena

com 33kDa na sua forma no processada e 30kDa na sua forma processada (Ogierman

et al., 1997).

O papel da lipase (lipA ou hlyC) na virulncia e/ou patogenicidade do V.

cholerae ainda permanece obscuro. A lipase poderia atuar na destruio de clulas do

sistema imune do hospedeiro hidrolisando a membrana lipdica e ento liberando cidos

graxos, que seriam metabolizados pelo V. cholerae. Foi proposto tambm que a lipase

ajudaria na quebra da camada de muco que protege o epitlio intestinal, aumentando

ento, a capacidade de colonizao (Fiore et al., 1997). Em relao a lipase acessria,

codificada pelo gene lipB, tem sido demonstrada sua essencial participao na

efetivao da atividade da protena LipA (Ogierman et al,. 1997).

O gene prtV parece codificar uma metaloprotease baseado na homologia

com uma metaloprotease de B.thuringiensis (Ogierman et al., 1997). De um modo geral,

toda esta regio (Figura 4) pode ser parte de uma ilha de patogenicidade que capaz de

48

causar dano as clulas do hospedeiro e/ou alterar as condies intestinais para favorecer

o crescimento bacteriano (Ogierman et al., 1997).

1.8.6. Outras toxinas

Embora a maioria das linhagens de V. cholerae NAG no tenha potencial

epidmico, algumas so identificadas como agentes causadores de casos clnicos

espordicos e surtos localizados, relacionados a uma gastroenterite similar clera em

vrios pases, incluindo ndia e Bangladesh, Guiana, Brasil, Peru, Argentina, Japo e

Estados Unidos (Levine et al., 1982; Morris & Black, 1985; Honda et al., 1988;

Rodrigue et al, 1994; Dalsgaard et al., 1995b; Coelho et al., 1995b; Saha et al., 1996;

Sharma et al., 1998; Pal et al., 1999; Pichel et al., 2003). Alm das infeces

gastrointestinais, essas linhagens esto associadas a vrias infeces no homem como

infeces em feridas (Hughes et al., 1978), celulite (Gelbart & Prabhudesai, 1986), e

septicemia (Safrin et al., 1988). Alguns isolados de V. cholerae NAG produzem toxinas

CTX-like; apesar da maioria no produzi-las (Zinnaka & Carpenter, 1972; Spira &

Fedorka-Cray, 1983; Yamamoto et al., 1983), foi possvel a deteco de atividades

hemoltica e citotxica in vitro na maioria das linhagens enteropatognicas CTX

negativas estudadas at agora (Moyenuddin et al., 1992; Dalsgaard et al., 1995b; Saha

et al., 1996; Sharma et al., 1998; Coelho et al., 2000; Pichel et al., 2003). A diarria

secretria, similar clera, determinada por mecanismo distinto daquele relacionado

patognese da clera propriamente dita e pode envolver a participao de um ou mais

fatores citotxicos (Yamamoto et al., 1986; Gyobu et al., 1991a; 1991b; Dalsgaard et

al., 1995b; Mitra et al., 1998; Sharma et al., 1998; Lally et al., 1999; Coelho et al.,

2000; Pichel et al., 2003). Alguns fatores de virulncia foram propostos para tentar

49

explicar as manifestaes clnicas produzidas por essas linhagens enterotxicas no

toxignicas. A enterotoxina termo-estvel ST considerada um potencial fator de

virulncia detectado quase que exclusivamente no grupo no-O1 (Ogawa et al., 1990;

Morris et al., 1990; Hoge et al., 1990; Pal et al., 1992; Vicente et al., 1997). Vrios

outros fatores de virulncia tambm j foram descritos em isolados de V. cholerae no

toxignicos, como hemolisinas (Yamamoto et al., 1986), TDH (hemolisina direta

termoestvel) similar a do Vibrio parahaemolyticus (Honda et al., 1985), toxina Shiga-

like (SLT) (OBrien et al., 1984), enterotoxina termo-lbil (Yamamoto et al., 1983) e

hemaglutininas (Hanne & Finkelstein, 1982; Datta-Roy et al, 1986). A evidncia da

presena de outro fator citotxico ainda desconhecido, capaz de iniciar uma resposta

secretria, tambm pode ser percebido em estudos com voluntrios que foram vacinados

com vacinas orais recombinantes onde foi observada uma diarria residual (Mitra et al.,

1998).

1.9. TRANSFERNCIA HORIZONTAL DE GENES

A transferncia horizontal de genes entre procariotos um fenmeno

permanente que tem um importante significado na evoluo bacteriana (de la Cruz &

Davies, 2000; Ochman et al., 2000; Jain et al., 2002).

Estudos demonstraram que a transferncia horizontal de genes contribui

para algumas importantes caractersticas de vibrios, como patogenicidade e explorao

de nichos ecolgicos (Boyd et al., 2000; Rowe-Magnus et al., 2001; Rowe-Magnus et

al., 2002). O V. cholerae compreende uma variedade de linhagens e biotipos que

recebem e transferem genes de toxinas, fatores de colonizao, resistncia a

antibiticos, polissacardios capsular e novos antgenos de superfcie (lipopolissacardio

50

0139 e o antgeno capsular O) (Waldor et al., 1994; Bik et al., 1995; Brown & Taylor,

1995, Waldor & Mekalanos, 1996; Karaolis et al., 1999; Hochhut & Waldor, 1999;

Yildiz & Schoolnik, 1999). Esses eventos mediaram a transformao de cepas

avirulentas para aquelas cepas que foram capazes de causar surtos de diarria (Boyd et

al., 2000).

1.10. INTEGRONS EM Vibrio cholerae

O sequenciamento do genoma completo de um isolado de V.cholerae do

biotipo El Tor (Heidelberg et al., 2000) mostrou a presena de um cluster gnico (Hall

et al., 1993) contendo estruturas caractersticas de recombinao e aquisio de genes,

da mesma forma que, a presena de um superintegron (Recchia et al., 1997; Clark et al.,

2000)

est tambm demonstrada nesta bactria. Estudos recentes tem sugerido o

mapeamento de integrons por PCR e o sequenciamento do DNA de seu contedo

gentico como uma importante ferramenta epidemiolgica para estudar a evoluo e a

disseminao de resistncia aos antimicrobianos em V.cholerae (Dalsgaard et al.,

2000b).

Os integrons so elementos genticos versteis caracterizados por sua

capacidade de inserir, arranjar e expressar genes atravs de um sistema de recombinao

stio-especfico. Esses elementos foram identificados pela primeira vez por Stokes &

Hall (1989). Estas estruturas no so elementos mveis, mas, quando associados a

transposons e/ou plasmdeos conjugativos, podem atuar como veculos da transmisso

intra- e inter-especfica de material gentico. Desta forma, podem ser observados em

vrios contextos genticos e estar distribudos em uma grande variedade de espcies

Gram-negativas e Gram-positivas (Rowe-Magnus & Mazel, 2001).

51

Um integron basicamente constitudo por trs elementos, o gene que

codifica uma integrase (intI), um stio de recombinao (attI) e uma regio promotora.

Podem ser divididos em dois grandes grupos: os integrons de resistncia (RI, resistance

integrons) e os superintegrons (SI). Os RI, que podem estar localizados no cromossomo,

nos plasmdios ou nos transposons, carreiam principalmente os cassetes gnicos que

codificam para resistncia a antibiticos e desinfetantes (Fluit & Schmitz, 2004). O

acmulo de loci exgeno pelo RI cria o integron de multi-rresistncia (MRI) (Rowe-

Magnus & Mazel, 1999). O SI um extenso integron que est localizado no

cromossoma bacteriano e que contem cassetes gnicos que apresentam uma variedade

de funes (Fluit & Schmitz, 2004).

Cassetes gnicos so elementos mveis que consistem de uma sequncia

codificadora (um gene funcional ou ORF) e uma sequncia de recombinao (stio

attC). So unidades que podem ser inseridas nos integrons independentemente, por ao

das integrases presentes nos mesmos. O arranjo de cassetes gnicos na regio varivel

dos integrons pode ser alterado pela exciso ou re-insero de cassetes individuais ou

ainda pela introduo precisa de novos cassetes gnicos (Collis et al., 1993).

Existem vrias classes de integrons, baseados no tipo de gene da integrase

(intI), que estas estruturas abrigam (Recchia et al., 1994; Collis et al., 2002a; Hansson

et al., 2002). Mais de 20 tipos de intI j foram identificadas (Collis et al., 2002a).

Dentre as inmeras classes de integron j identificadas, os de classes 1, 2 e 3 so os

mais frequentemente detectados e representam os chamados integrons de resistncia

(RI) ou de multiresistncia (MRI) por carrearem genes de resistncia a antibiticos

(Rowe-Magnus & Mazel, 2001). Mais de 70 diferentes cassetes gnicos de resistncia a

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antibiticos j foram caracterizados nestas trs classes de integrons (Mazel & Davies,

1999).

Os integrons de classe 1 (IntI1) so os mais prevalentes e estudados dentre

as diferentes classes j descritas (Collis et al., 2001; Collis et al., 2002a). Esta classe de

integron frequentemente encontrada em plasmdios conjugativos ou associada com a

famlia de transposon Tn21, o que favorece a disperso dos cassetes gnicos de

resistncia a antibiticos (Hall, 1997; Girlich et al., 2001; Fluit & Schmitz, 2004) sendo

os mais relatados e onipresentes em bactrias com resistncia a antibiticos, sobretudo,

isolados clnicos.

A estrutura bsica de um integron classe 1 (Figura 5) compreende uma

regio 5conservada (CS) que inclui o gene da integrase de classe 1 (intI1), cujo produto

catalisa as reaes de recombinao stio-especfico, um stio de recombinao (attI1,

attC e stios secundrios), que consiste na regio varivel do integron, onde cassetes so

inseridos, uma regio promotora (Pant ou Pc), responsvel pela expresso dos cassetes

gnicos inseridos no integron e uma regio 3conservada, que usualmente abriga os

genes qacE1 e sulI que conferem resistncia aos compostos quaternrios e

sulfonamidas, respectivamente (Stokes & Hall, 1989; Recchia & Hall, 1995b; Hall &

Collis, 1995; Mazel et al., 1998; Rowe-Magnus et al., 2002; Fluit & Schmitz, 2004).

Os cassetes gnicos, quando presentes, se encontram entre os segmentos 5-

CS e 3-CS. Essa regio de insero de cassetes denominada segmento varivel do

integron, devido ao fato de apresentar uma enorme variao quanto ao nmero e tipo de

cassetes gnicos nela encontrados, predominantemente genes associados resistncia

aos antimicrobianos. A maioria dos cassetes possui a regio de incio de traduo, que

compreende o codon de iniciao, a sequncia de Shine-Dalgarno e um espaador

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adequado (Fluit & Schmitz, 2004). Os cassetes gnicos tambm so caracterizados pela

ausncia de uma regio promotora, embora essa estrutura j tenha sido identificada

fazendo parte de um cassete gnico (Hall & Stokes, 1993). Dessa forma, essas unidades

mveis, quando inseridas em um integron, so expressas pela ao do promotor Pant ou

PC, localizado no segmento 5-CS desse elemento (Stokes & Hall, 1989).

Figura 5: Representao esquemtica de um integron de classe I com cassete gnico

inserido no seu segmento varivel. Adaptado de Mazel et al., 1998.

Integrons de classe 1 tem sido caracterizados em isolados clnicos e

ambientais de uma grande variedade de espcies bacterianas. J foi identificado em V.

cholerae clnico de diferentes reas geogrficas do mundo e sua distribuio e

importncia tem sido amplamente discutida (Dalsgaard et al., 1999; Falbo et al., 1999;

Dalsgaard et al., 2000a; 2000b; Dalsgaard et al., 2001; Thungapathra et al., 2002; Ehara

et al., 2004; Iwanaga et al., 2004; Fonseca et al., 2008).

Os integrons de classe 2 ocorrem em associao com transposons da famlia

do Tn7 e usualmente carreiam trs cassettes gnicos de resistncia: Trimetropina

(dfrA1), estreptotricina (sat1) e estreptomicina/espectinomicina (aadA1) (Hansson et al.,

SulIintI qacE1

5CS (segmento conservado) 3CS (segmento conservado)

segmento varivel

Stio de recombinao

Cassete gnico

SulIintI qacE1

5CS (segmento conservado) 3CS (segmento conservado)

segmento varivel

Stio de recombinao

Cassete gnico

http://jmm.sgmjournals.org/cgi/content/full/55/5/643#R5#R5

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2002; Op