DOUTORADO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM...
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DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA
TÂNIA ROCHA CABRAL RIBAS
DIVERSIDADE BACTERIANA NO BIOFILME SUBGENGIVAL DE
INDIVÍDUOS COM PERIODONTITE AGRESSIVA LOCALIZADA
Guarulhos
2012
TÂNIA ROCHA CABRAL RIBAS
DIVERSIDADE BACTERIANA NO BIOFILME SUBGENGIVAL DE
INDIVÍDUOS COM PERIODONTITE AGRESSIVA LOCALIZADA
Tese apresentada à Universidade Guarulhos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia.
Área de concentração: Periodontia Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Faveri
Co - orientadora: Profª. Dra Magda Feres
Guarulhos
2012
Dedico este trabalho a todos aqueles que me
apoiaram para a concretização de um sonho.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me conceder tantos momentos de grande alegria e em especial, este importante
passo na minha carreira profissional.
Ao meu orientador Profº Dr Marcelo de Faveri que me abriu um novo horizonte e acreditou
no meu desenvolvimento científico apontando uma trajetória complexa, mas possível de ser
atingida. Muito Obrigada!
Aos meus pais pelo amor, exemplo de vida, por ser meu porto seguro e pela minha formação
moral e intelectual que permitiram o meu desenvolvimento pessoal e profissional.
Ao meu amado marido “Ribas” pela paciência, atenção e companheirismo nas horas difíceis.
Aos meus dois “lindos” filhos Ana Lia e Rafael, razão de nossas vidas, pelo entendimento das
horas da minha ausência.
Aos meus irmãos Vânia, Vidal, Lânia, Vilar, Luís, Glênia, Sidney e Taninha pelas vibrações
de apoio em silêncio, carinho e amor.
Aos meus queridos sobrinhos: Nayra e Nayara, Dalise, Fernanda e Julia, Igor e Davi.
Aos professores do Curso de Pós-graduação pelo estímulo constante e por compartilhar seus
conhecimentos durante todo o processo do nosso desenvolvimento científico. Obrigada!
Aos meus amigos e orientadores profissionais Dr. Pascoal Laércio Armonia e Guilherme
Saraceni Junior que me mostraram o encantamento da docência.
A todos os professores do Curso de Graduação de Odontologia pelo companheirismo e apoio
nos vários períodos que me ausentei de minhas atividades no curso, em especial Profª Mônica,
Ana Paula, Paula, Andressa, Ricardo, Max, Leonardo, Calil.
Ao meu querido amigo Prof° Perito pelo exemplo de profissionalismo e principalmente pela
liderança harmônica e alegre que realiza, facilitando a integração da nossa equipe. Obrigada
pelo companheirismo e ensinamentos diários.
À Universidade Guarulhos pelo suporte financeiro concedido e em especial à Coordenadora
da Pós-Graduação Profª Magda Feres por ter viabilizado o meu sonho.
A FAPESP – Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro
concedido para o desenvolvimento desta pesquisa.
Aos meus colegas do doutorado e em especial o Profº Ênio e Profº Ivan pela amizade,
convivência e auxílio no laboratório de pesquisas.
As nossas queridas Izilvânia e Cristina por todo o auxílio e agradável convivência.
A bibliotecária Mariana Feitosa pelo excelente auxílio bibliográfico.
Agradecimento especial a todos os pacientes da clínica de Odontologia da Universidade
Guarulhos sem os quais não seria possível o desenvolvimento desta pesquisa.
A minha filha espiritual e anjo da guarda de todas as horas Lucileni de Almeida Suliano
minha eterna gratidão.
“Sua profissão não é aquilo que traz para casa o seu salário.
Sua profissão é aquilo que foi colocado na terra para você
fazer com tal paixão e tal intensidade que se torna chamamento
espiritual”
Vicente Van Gogh
Resumo O objetivo deste estudo foi determinar a diversidade bacteriana no biofilme
subgengival de indivíduos com periodontite agressiva localizada (PAgL) e com saúde periodontal (SP) usando métodos moleculares independentes de cultura baseados na clonagem do gene 16S rRNA pelo método de Sanger. Quinze indivíduos com PAgL e 15 indivíduos com saúde periodontal (SP) foram selecionados. Nos indivíduos com PAgL, foram coletadas amostras de placa subgengival de 2 sítios subgengivais, sendo um sítio com profundidade de sondagem (PS) > 5mm com sangramento a sondagem e um sítio com PS < 3mm sem sangramento à sondagem (SS). Nos indivíduos com SP foi coletado 1 sítio subgengival com PS < 3mm como controle. O DNA de todas as amostras foi extraído e posteriormente a presença de Aggregatibacter actinomycetemcomitans de máxima e mínima leucotoxicidade foi avaliada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Posteriomente, o gene 16S rRNA foi amplificado usando o par de iniciadores universais 4F - 1541R e 4F - 1492R. Os genes amplificados foram clonados, seqüenciados e identificados comparando com o banco de dados de seqüências 16S rRNA. Nove dos 15 indivíduos com PAgL eram colonizados pelo A. actinomycetemcomitans, sendo que 7 apresentavam a cepa de alta leucotoxicidade. Em relação à análise clonal do gene 16S, um total de 2.041 clones foram sequenciados, sendo 697 clones para as bolsas profundas (PS>5mm) do grupo com PAgL, 666 clones para as bolsas rasas (PS<3mm) do grupo PAgL e 678 clones para as amostras (PS<3mm) nos indivíduos com SP. Cento e sessenta e quatro diferentes espécies/filotipos foram identificadas nas 45 amostras analisadas sendo que 42% destas espécies ainda não foram cultivadas. Nos indivíduos com saúde periodontal, espécies do gênero Streptococcus representaram cerca de 32,7% dos clones analisados. Por outro lado, este gênero representou apenas 14,1% e 13,0% dos clones encontrados nos sítios rasos e profundos dos indivíduos com PAgL, respectivamente. Actinomyces sp. BL008/OT171 e Actinomyces sp. IP073/OT448 foram as espécies de bactérias ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones mais elevados nos indivíduos com saúde periodontal. Parvimonas micra, Selenomonas sputigena, Filifactor alocis, Pseudoramibacter alactolyticus, Dialister pneumonsites, Dialister invisus, Synergistes sp BH007/OT359, Prevotella sp. AH125/OT292, Desulfobulbus sp. R004/OT041, Selenomonas sp. DS051/OT137, foram as espécies de bactérias incomuns ou ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones mais elevados nos indivíduos com periodontite agressiva localizada. Em conclusão, a diversidade da microbiota subgengival de indivíduos com PAgL difere marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente saudáveis, sendo que existem diferenças entre a diversidade bacteriana presente nos sítios rasos dos indivíduos com PAgL e sítios rasos com saúde periodontal. Palavras-chave: Periodontite agressiva, microbiota subgengival, bactérias ainda não-cultiváveis, gene 16S rRNA, sondas genômicas
Abstract The aim of this study was to determine the bacterial diversity in subgingival
biofilm of individuals with localized aggressive periodontitis (LAgP) and periodontally healthy (PH) subjects. Fifteen individuals with LAgP and 15 periodontally healthy (PH) individuals were selected. In individuals with LAgP, subgingival biofilm samples were collected from 2 subgingival sites, one with probing depth (PD) > 5mm and the other with PD < 3mm. In PD healthy individuals samples were collected from 1 subgingival site with PD < 3mm. DNA of all samples was extracted and gene 16S rRNA was amplified using the pair of universal initiators. Amplified genes were cloned, sequenced and identified by comparing with the 16S rRNA sequence data bank A total of 2.041 clones were sequenced, with 697 and 666 clones for deep and shallow pockets of the LAgP group, respectively and 678 clones for samples from the PH group. In the SP group, species of the genus Streptococcus represented around 32.7% of the clones analyzed. Whereas, this genus represented only 14.1% and 13.0% of the clones found in the shallow and deep sites of individuals with LAgP, respectively. Actinomyces sp. BL008/OT171 and Actinomyces sp. IP073/OT448 were the species of bacteria not yet cultivated found with higher frequency in clones of PH individuals. Parvimonas micra, Selenomonas sputigena, Filifactor alocis, Pseudoramibacter alactolyticus, Dialister pneumonsites, Dialister invisus, Synergistes sp BH007/OT359, Prevotella sp. AH125/OT292, Desulfobulbus sp. R004/OT041, Selenomonas sp. IP073/OT448 were the uncommon, or not-yet-cultivated species of bacteria found with higher frequency in clones of individuals with LAgP. In conclusion, the diversity of the subgingival microbiota of individuals with LAgP differs remarkably from that observed in PH individuals, and there are differences between the bacterial diversity present in shallow sites of individuals with LAgP and shallow sites in those who are PH.
Key Words: Aggressive Periodontites, subgingival microbiota, non cultivable bacteria, gene
16S rRNA, genomic probes.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 12
1.1 Periodontite agressiva localizada 12
1.2. Estudo de Metagenômica 14
2. OBJETIVO 18
3. MATERIAL E MÉTODOS 19
1.2 Seleção da população 19
3.2. Avaliação clínica 19
3.3. Critérios de inclusão e exclusão 20
3.3.1.Critérios de inclusão 20
3.3.2.Critérios de exclusão 20
3.4 .Seleção dos sítios-teste 21
3.4.1 Coleta das amostras de placa subgengival 21
3.5 Análise microbiológica. 21
3.5.1.Extração de DNA 21
3.5.2. Amplificação da região 16S rRNA de A.actinomycetemcomitans
pela reação em cadeia da polimerase 22
3.5.3. Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) 22
3.5.4. Clonagem 23
3.5.5. Sequenciamento 24
3.5.6. Análise das sequencias do gene 16S rRNA 25
3.5.7.Análises estatísticas 25
4.RESULTADOS 26
4.1.Resultados Clínicos 26
4.2. Resultados Microbiológicos 27
5. DISCUSSÃO 37
6. CONCLUSÃO 42
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43
ANEXO A 50
12
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
1.1. Periodontite agressiva localizada
A periodontite agressiva (PAg) é uma infecção que acomete indivíduos
sistemicamente saudáveis, caracterizada por uma grande perda de inserção clínica associada a
uma rápida destruição óssea alveolar, atingindo normalmente indivíduos jovens
(ARMITAGE, 1999; LANG et al., 1999; TONETTI e MOMBELLI, 1999). Esta infecção
pode apresentar-se na forma localizada ou generalizada, dependendo de sua extensão
(ARMITAGE, 1999; LANG et al., 1999; ARMITAGE, 2004; ARMITAGE, 2010). A forma
localizada da PAgL caracteriza-se por perdas ósseas e de inserção localizadas na região
interproximal dos primeiros molares e incisivos permanentes, não envolvendo mais do que
dois elementos dentários, além dos molares e incisivos (ARMITAGE, 1999). A perda óssea
vertical, progressão rápida, moderada inflamação com pequena presença ou ausência de
cálculo e resposta imunológica aumentada para determinados agentes infecciosos, são
importantes características da periodontite agressiva localizada (PAgL).
A microbiota da PAgL é complexa consistindo geralmente de bactérias anaeróbias
Gram-negativas, tais como Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus e
Fusobacterium ssp. (LOESCHE et al., 1985; MULLALY et al., 2000; KAMMA et al., 2001;
KAMMA et al., 2004; FAVERI et al., 2009; SANZ e WINKELHOFF, 2011). O papel de
bactérias específicas, especialmente do A. actinomycetemcomitans na forma localizada da
periodontite agressiva tem sido extensivamente estudado em adolescentes e adultos jovens.
Slots et al. (1980) analisando por meio de cultura microbiana, amostras de biofilme
subgengival de bolsas periodontais profundas de pacientes portadores de PAgL, detectaram A.
actinomycetemcomitans em 9 dos 10 indivíduos analisados. Outros estudos detectaram A.
actinomycetemcomitans em cerca de 75 a 100% das amostras de biofilme de bolsas
periodontais de indivíduos com PAgL (SLOTS et al.,1980; MANDELL e SOCRANSKY,
1981; ZAMBON et al., 1983; CHISTERSSON et al., 1985; ZAMBON, 1985; RUSSO et
al.,1998; LEE et al.,2003; YANG et al., 2004; CORTELLI et al., 2005) demonstrando assim a
possível relação existente entre este patógeno e a forma agressiva das periodontites. Por outro
lado, a prevalência deste patógeno em indivíduos jovens sem perdas ósseas alveolares ou
portadores de periodontite crônica é mais baixa, variando entre 19 a 28% respectivamente
(TINOCO et al., 1997; MOMBELLI et al., 2002; CORTELLI et al., 2005).
13
O A. actinomycetemcomitans é um cocobacilo, fermentativo, Gram-negativo,
capnofílico, imóvel e anaeróbio facultativo e vêm demonstrando capacidade de invadir as
células epiteliais da gengiva humana in vitro, células endoteliais vasculares humana; e células
epiteliais bucais in vivo (SREENIVASAN et al., 1993; SCHENKEIN., et al., 2000; RUDNEY
et al., 2001; NOGUSHI et al., 2003). Embora esta espécie seja considerada o principal
patógeno na PAg, existem dados contraditórios na literatura (HAN et al., 1991; LOPEZ et al.,
1996; MULLALY et al., 2000; KAMMA et al., 2001; ISHIKAWA et al., 2002;
TREVILATTO et al., 2002; TAKEUCHI et al., 2003; GAJARDO et al., 2005). Mullally et
al. (2000) e Kamma et al. (2001) estudando populações na Irlanda do Norte e na Grécia,
respectivamente, observaram por meio da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)
uma baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans (28% e 18,8%) em bolsas periodontais
de indivíduos com PAgL. Em outro estudo, Han et al. (1991) não detectaram esta espécie em
nenhuma das 23 amostras subgengivais obtidas de indivíduos chineses portadores de PAg.
Trevilatto et al. (2002) estudaram uma família brasileira com PAg (n=14) e relataram uma
baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans, questionando assim o valor do isolamento
deste microrganismo como forma de diagnóstico. Gajardo et al. (2005) por meio de cultura
microbiana isolaram este periodontopatógeno em apenas 19,4% das bolsas periodontais de 30
indivíduos com PAg em uma população chilena. Esta baixa prevalência de A.
actinomycetemcomitans na população chilena já havia sido reportada previamente por Lopez
et al. (1996). Complementando, Mombelli et al. (2002), em uma revisão sistemática da
literatura, relataram que a presença ou ausência do A. actinomycetemcomitans não pode ser
um parâmetro para diferenciar indivíduos com periodontite agressiva e/ou crônica. Assim,
estes estudos sugerem que outros microrganismos podem estar associados à etiologia da PAg.
Outro ponto que deve ser ressaltado são a patogenicidade e mecanismos de virulência
descritos para as cepas de A. actinomycetemcomitans, sendo os principais: fator cito-letal (lct)
e leucotoxina (ltx). A toxina distensora cito-letal é capaz de causar parada de ciclo celular na
fase G2, levando a distensão das células epiteliais e fibroblastos, além de agir sobre linfócitos
T (SUGAI et al.,1998; MAYER et al., 1999). A ltx pertence à família das toxinas de
repetição (RTX), sendo codificada por 4 genes designados ltxC, ltxA, ltxB, e ltxD. A estrutura
da ltx é designada ao gene A, e os demais genes são responsáveis pela ativação e transporte da
toxina. (LALLY et al., 1999). A ltx é expressa de maneira distinta entre as diferentes cepas de
A. actinomycetemcomitas, sendo algumas cepas produtoras de elevados níveis da toxina,
consideradas cepas leucotóxicas que apresentam uma deleção de 530 pb na região promotora
do operon ltx e as cepas consideradas de baixa leucotoxicidade que apresentam a região
14
promotora sem alterações com um tamanho de 1022 pb (BROGAN et al., 1994; MAYER et
al., 1999; HAUBEK., 2009).
Como já descrito anteriormente, outros patógenos podem estar envolvidos com a
etiologia da PAgL. Faveri et al. (2009) estudaram o perfil microbiano do biofilme subgengival
de indivíduos com PAgL e comparando com indivíduos com saúde periodontal, periodontite
crônica (PC) e periodontite agressiva generalizada (PAgG). Os autores relataram que espécies
do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e Treponema denticola) e algumas espécies
do complexo laranja (Campylobacter gracilis, Eubacterium nodatum e Prevotella intermedia)
foram encontradas em elevados níveis, proporções e prevalência nos indivíduos com PAgL.
Além disso, os autores observaram níveis aumentados de A. actinomycetemcomitans em sítios
com profundidade de sondagem <3mm e entre 4-6mm de indivíduos com PAgL em
comparação aos grupos PAgG e PC. Esta diferença não foi observada em sítios mais
profundos. Os autores observaram ainda baixos níveis de espécies de Actinomyces nos
indivíduos com PAgL. Em conclusão, os autores sugerem que o A. actinomycetemcomitans
pode estar associado com o início da PAgL e outras espécies tais como T.forsythia,
P.gingivalis, T. denticola, C.gracilis, E.nodatum e P.intermedia podem ser patógenos
importantes na progressão da doença. Desta forma, uma vez que a diversidade bacteriana
presente no ambiente subgengival das PAgL ainda não foi completamente definido, outros
estudos devem ser realizados para estudar a fundo a diversidade bacteriana presente nestes
indivíduos e assim aumentar a compreensão da etiologia e formas de tratamento para esta
infecção.
1.2 Estudos de Metagenômica
Seguindo a taxonomia Lineana tradicional, baseada em dados morfológicos e
fisiológicos, todas as formas de vida na Terra podem ser classificadas em 5 reinos: Animalia,
Plantae, Fungi, Protista e Monera (WHITTAKER.,1969). Além disso, pode-se também
dividir a vida em dois tipos fundamentais: aqueles que possuem uma membrana nuclear
(eucariotos) e aqueles que não a possuem (procariotos), de modo que a maior diversidade da
vida na terra era devido aos Eucariotos, particularmente às suas formas multicelulares
(WHITTAKER.,1969). Os procariotos (Reino Monera) eram considerados simples, primitivos
e relativamente uniformes em suas características (HUGENHOLTZ e PACE, 1996) e esses
sistemas perduraram até 1990 quando Woese et al. (1990) utilizaram as comparações de
sequências de 16S e 18S rRNA para propor uma nova classificação universal para a grande
diversidade existente no meio ambiente. Pela primeira vez uma proposta completa de
15
classificação foi feita baseada em dados moleculares e não morfológicos (WOESE,
KANDLER e WHEELIS, 1990). Os autores propuseram a criação de um novo nível
taxonômico, denominado Domínio, sendo a vida no planeta dividida em três Domínios:
Bacteria, Archaea e Eukarya, já que o sistema de 5 Reinos era insuficiente e não refletia a
filogenia natural dos seres vivos. Desta forma, estudos avaliando a diversidade de
microrganismos presentes nestes domínios em diferentes ambientes e a evolução das
metodologias de biologia molecular vem contribuindo significativamente para um grande
avanço do conhecimento sobre diversidade microbiana (HUNTER-CEVERA,1998). O termo
diversidade para a biologia é geralmente utilizado para descrever o número de espécies
presentes em um habitat. Em termos moleculares, a diversidade é caracterizada pelo número
de diferentes tipos de sequências de DNA encontradas em um ambiente.
Inúmeros métodos têm sido utilizados para a identificação dos microrganismos
bucais. As técnicas de microscopia de contraste de fase e de campo escuro podem demonstrar
diferenças de tamanho, forma e motilidade dos microrganismos presentes no biofilme dental.
Porém, estes métodos microscópicos não diferenciam as espécies bacterianas (LOESCHE et
al., 1985; BELTRAMI et al., 1987; OMAR et al., 1999; DAHAN et al., 2004). O método de
cultura, considerado o “padrão-ouro”, é capaz de identificar diversos microrganismos
presentes no biofilme dental, além de ser extremamente importante para a busca de novas
espécies e para a determinação da susceptibilidade microbiana a diferentes antibióticos (ALI
et al., 1992; LIE et al., 1995). Entretanto, estima-se atualmente que a cavidade bucal apresente
aproximadamente 700 espécies de bactérias, sendo que mais de 40% destas espécies ainda
não foram cultivadas (DEWHIRST et al., 2010). Assim, outros microrganismos poderiam
estar associados às doenças periodontais, embora muitos não tenham sido ainda cultivados e
caracterizados (PASTER et al., 2001; HUGHES et al., 2001; KUMAR et al., 2005, SANZ e
WINKELHOFF, 2011). Para determinar a diversidade bacteriana sem a necessidade do
cultivo dos microrganismos, foram desenvolvidos métodos baseados na extração do DNA da
amostra, amplificação da região do gene 16S rRNA com a utilização de iniciadores universais,
clonagem do amplicon em plasmídeo inserido em Escherichia coli e posterior
sequenciamento genético. Esta metodologia vem sendo utilizada em inúmeros estudos de
Metagenômica em vários ambientes, incluindo a cavidade bucal (HUGENHOLTZ e PACE,
1996; HUGENHOLTZ et al., 1998; PASTER et al., 2001; KAZOR et al., 2003; KUMAR et
al., 2005; FAVERI et al. 2008; WADE, 2011; TELES., 2011).
Os RNA ribossomal (rRNA) está entre as macromoléculas mais conservadas
evolutivamente em todos os seres vivos. Seu papel funcional no sistema de processamento de
16
informações deve ter sido bem estabelecido nos primeiros ancestrais comuns de Bacteria,
Archaea e Eukaria. Os genes dos rRNA em todos os organismos contemporâneos partem de
um ancestral comum e eles não parecem submeter-se à transferência lateral de gene entre
espécies. Por causa das unidades funcionais, grandes porções nos genes rRNA são bem
conservadas e suas sequências podem ser usadas para medir distâncias filogenéticas, mesmo
entre os organismos mais distintamente relacionados. Variações nas sequências dos
nucleotídeos do gene de rRNA são indícios de mudanças evolucionárias. Resultados de
filogenia baseados nas análises do gene 16S, 18S e 23S rRNA revelaram separação dos
domínios Bacteria, Archaea e Eukaria. O gene 16S rRNA é uma das moléculas que compõe a
subunidade menor do ribossomo nos domínios Archaea e Bacteria. O gene 16S rRNA possui
também 9 regiões variáveis, alternadas com regiões conservadas, denominadas de V1 a V9.
Estas regiões são utilizadas para determinação de filogenia (WOESE et al.,1990). Áreas
variáveis podem ser usadas para estudar as relações evolutivas entre dois organismos muito
próximos. Já as áreas conservadas podem ser usadas para revelar relações antigas entre duas
moléculas. Desta forma, os estudos de diversidade utilizam os conhecimentos adquiridos com
o gene 16S rRNA para estudar diferentes habitats (WADE, 2011).
Recentemente, Faveri et al. (2008) analisaram a diversidade bacteriana no
ambiente subgengival de 10 indivíduos com PAgG. Os autores observaram uma alta
diversidade bacteriana na microbiota desses indivíduos e que espécies de Selenomonas
poderiam estar envolvidas na etiologia da forma generalizada da PAg. Assim sendo,
investigações realizadas utilizando este modelo em amostras de biofilme subgengival de
pacientes portadores de PC (SAKAMOTO et al., 2000; PASTER et al., 2001; KUMAR et al.,
2003; KUMAR et al., 2005) e de PAgG (FAVERI et al., 2008) demonstraram a presença de
novos filotipos (espécies) de bactérias que poderiam estar associadas às periodontites.
Deferribacteres sp. D084 e BH017, Megasphaera sp. BB166 e CS025, TM7 sp. AH040, TM7
sp. BS003, Eubacterium sp. BB167, Prevotella sp. DO027, Eubacterium saphenum,
Cryptobacterium curtum, Filifactor alocis, Dialister pneumosintes, Dialister sp. GBA27,
Selenomonas sputigena, Selenomonas sp. EW084 e FNA3, Selenomonas sp. CS002,
Prevotella denticola, Porphyromonas sp. BB136, Peptostretococcus sp. AJ062, Bacteroidetes
sp. AU126, Pseudoramibacter alactolyticus, Solobacterium moorei, Brevundimonas
diminuta, Veillonella atypica e Granulicatella adiacens são alguns exemplos de
espécies/filotipos que tem sido sugerido como possíveis patógenos periodontais em diferentes
estudos (PASTER et al., 2001; KUMAR et al., 2003; KUMAR et al., 2005; KUMAR et al.,
2006; PASTER et al., 2006; FAVERI et al., 2008; COLOMBO et al., 2009). Por outro lado,
17
espécies/filotipos tais como, Veillonella sp. X042, Deferribacteres sp. W090, Bacteroidetes
sp. BU063, Atopobium rimae, Atopobium parvulum, e espécies do gênero Streptococcus e
Granulicatella sp. são indicados com associação com a saúde periodontal (AAS et al., 2005;
KUMAR et al., 2005).
Em outro estudo, Kumar et al (2003) a partir da análise de amostras provenientes
de pacientes com Periodontite Crônica e indivíduos com saúde periodontal, por meio de
clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA, identificou diversos gêneros, ainda não
cultivados, que foram associados a periodontite e representados por bactérias Gram-positivas,
incluindo espécies do gênero Peptostreptococcus e Filifactor. Além disso, espécies dos
gêneros Megasphaera e Desulfobulbus também foram encontradas em elevados níveis em
indivíduos com PC, bem como níveis de várias espécies ou filotipos de Campylobacter,
Selenomonas, Deferribacteres, Dialister, Catonella, Tannerella, Streptococcus, Atopobium,
Eubacterium e Treponema. Já as espécies de Streptococcus e Veillonella spp. foram
encontradas em números elevados em todas as amostras e representaram uma fracção
significativamente maior em indivíduos saudáveis quando comparado a indivíduos com PC. O
perfil microbiológico da saúde periodontal também incluiu espécies do gênero
Campylobacter, Abiotrophia, Gemella, Capnocytophaga e Neisseria. P.gingivalis, P.
denticola e T. forsythia foram raramente detectadas neste estudo e somente T. forsythia
apresentou uma associação com a doença.
Até o presente momento, nenhum estudo analisou a diversidade bacteriana
presente no ambiente subgengival de indivíduos com PAgL. Desta forma, o uso da
metodologia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA em amostras de biofilme
subgengival de indivíduos com PAgL é importante para analisar a diversidade e observarmos
se existem espécies que ainda não foram cultivadas envolvidas com a etiologia desta doença.
18
2. OBJETIVO
Determinar a diversidade bacteriana presente no biofilme subgengival de
indivíduos com PAgL e com saúde periodontal pela técnica de Sanger de clonagem e
sequenciamento genético.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção da população
Foram selecionados 15 indivíduos com PAgL (grupo teste) e 15 indivíduos com
saúde periodontal (SP, grupo controle). Todos os participantes foram informados sobre o
objetivo do estudo, seus riscos e benefícios, incluindo os tipos de medições clínicas e forma
de coleta de amostras. Os pacientes que concordaram em participar do estudo assinaram um
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, responderam a um questionário de
saúde/anamnese e quando necessário receberam a terapia periodontal, estando de acordo com
as diretrizes e normas do Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96) (ANEXO).
3.2 Avaliação clínica
O exame clínico periodontal foi realizado por um único examinador previamente
treinado e calibrado no início do estudo com o objetivo de realizar o diagnóstico do indivíduo
e selecionar os sítios-teste. Todos os dentes, exceto os terceiros molares, foram avaliados em
6 sítios (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual, disto-lingual),
para os seguintes parâmetros:
- Índice de placa visível - IPV (AINAMO e BAY, 1975): presença (escore 1) ou
ausência (escore 0) de biofilme dental supra gengival visível, após lavagem e secagem dos
dentes.
- Índice de sangramento gengival – ISG (AINAMO e BAY, 1975): presença
(escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento na gengiva marginal após percorrer
levemente a sonda periodontal ao longo do sulco gengival.
- Profundidade de sondagem – PS: distância, em milímetros, entre a margem
gengival livre e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.
- Nível clínico de inserção - NCI: distância, em milímetros, entre a junção
esmalte-cemento e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.
- Sangramento à sondagem - SS: presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de
sangramento após 20 segundos da sondagem com sonda periodontal milimetrada.
- Supuração: presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de supuração após 20
segundos da sondagem com sonda periodontal milimetrada.
A metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araujo et al. (2003)
onde se avaliou o erro padrão da medida (e.p.m) e o erro médio percentual (e.m.p) para os
20
parâmetros clínicos periodontais contínuos (profundidade de sondagem e nível clínico de
inserção. O e.p.m e e.m.p intra-examinador demonstrou que o examinador obteve e.p.m. de
0,18 mm e 0,21 mm para a PS e NCI, respectivamente. Para as variáveis categóricas (IPV e
ISG), considerando somente a presença ou a ausência do parâmetro clínico, foi realizada a
média do nível de concordância e o examinador apresentou uma concordância intra-
examinador igual a 90% (Teste Kappa).
3.3 Critérios de inclusão e exclusão
3.3.1 Critérios de inclusão
Periodontite agressiva localizada (PAgL)
Os indivíduos foram selecionados baseado em critérios propostos pela Academia
Americana de Periodontia (AAP) (ARMITAGE 1999):
- possuir no mínimo 20 dentes excluindo-se os terceiros molares;
- possuir mínimo de 6 dentes com pelo menos 1 sítio interproximal apresentando
profundidade à sondagem e nível clínico de inserção maior do que 5 mm, não contíguos,
localizados na região de incisivos e primeiros molares;
- não apresentar mais do que 2 dentes com as mesmas características clínicas;
- possuir idade inferior ou igual a 30 anos.
Indivíduos com saúde periodontal (SP)
- Possuir no mínimo 20 dentes excluindo-se os terceiros molares;
- não apresentar sítios com PS e/ou NCI maior do que 3 mm;
- não apresentar sinais clínicos de gengivite generalizada;
- não apresentar mais de 10% dos sítios com sangramento sondagem;
- não apresentar mais do 10% dos sítios com sangramento marginal;
- idade inferior ou igual a 30 anos.
3.3.2 Critérios de exclusão
Os seguintes critérios de exclusão foram respeitados. Foram excluídos os
indivíduos :
- fumantes;
- grávidas ou lactantes;
- ter realizado tratamento periodontal previamente;
21
- uso de antibióticos sistêmicos nos últimos 12 meses;
- uso periódico de antissépticos bucais nos últimos seis meses;
- história de doença sistêmica que comprometa a resposta do
hospedeiro ou exija medicação profilática ao tratamento.
3.4 Seleção dos sítios testes
Nos indivíduos com PAgL foram selecionados aleatoriamente 2 sítios
subgengivais, sendo 1 sítio com PS > 5mm com SS e outro sítio com PS< 3mm sem SS que
não apresentasse sangramento à sondagem. Nos indivíduos com SP foi coletado 1 sítio com
PS < 3mm que não apresentasse sangramento à sondagem.
3.4.1 Coleta das amostras de placa subgengival
Após a remoção da placa supragengival a coleta de amostras de biofilme
subgengival foi feita com curetas Gracey do tipo mini-five (HuFriedy, USA), posicionadas na
porção mais apical dos sítios selecionados. As amostras foram depositadas em tubos de
polipropileno de 1,5 ml (tubo1) contendo 50 µL de solução TE (10 mM Tris-HCl, 0,1mM
EDTA, pH 7,6). Imediatamente após a coleta da amostra, esta foi homogeneizada por 1
minuto em agitador de tubos e armazenados à -80OC até serem analisadas.
3.5 Análise microbiológica
Análise da diversidade do domínio bactéria por sequenciamento do gene 16S rRNA
pelo método de Sanger.
3.5.1 Extração de DNA
O tubo contendo 50 µL da amostra foi utilizado para extração do DNA segundo o
método descrito por Dewhirst et al. (2000). Após o descongelamento da amostra, foram
adicionados 1µL de solução de proteinase K em uma concentração de 200mg/mL (Sigma) e 5
µL de solução de Tween 20 a 5%. A amostra foi aquecida a 55 0C durante 120 minutos e
posteriormente a 95 0C por 10 minutos para inativação da Proteinase K em um termociclador
(Gen Amp PCR System 2400, Applied Biosystems, California, EUA).
22
3.5.2 Amplificação da região 16S rRNA de A. actinomycetemcomitans pela reação em cadeia
da polimerase (PCR)
O DNA das amostras foram extraídas e posteriormente utilizado como molde na
reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão para amplificação da região 16S rRNA de A.
actinomycetemcomitans usando os iniciadores propostos por Macheleidt et al. (1999).
Os iniciadores apresentavam as seguintes sequências:
Forward primer: 5’ GTT TAG CCC TGG TGC CCG AAG -3’
Reverse primer: 5’ TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG - 3’
Para cada reação de amplificação do gene 16S rRNA foram utilizados: 5µL de
DNA molde, 0,5 µL de Platinum Taq polimerase (5 unidades/µL, Invitrogen, São Paulo, SP,
Brasil), 5 µL de tampão (10X), 4µL de dNTPs (10nM) , 1µL de uma solução de cada
iniciador (25 pmoles; Invitrogen), 1,5 µL de cloreto de magnésio (50 mM) e 36 µL água Milli
Q estéril q.s.p. para uma solução final de 50 µL.
As reações de amplificação foram realizadas segundo as seguintes condições:
desnaturação inicial a 94oC por 4 minutos, seguindo-se 30 ciclos de desnaturação a 94oC por
30 segundos, 55oC por 30 segundos e 72oC por 60 segundos, e uma extensão final de 5
minutos a 72oC em termociclador (Gen Amp PCR System 2400). Os produtos da reação de
PCR foram submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, em tampão Tris
Acetato EDTA (TAE, Tris acetato a 40mM, pH 8,5; EDTA a 2mM) e corados com brometo
de etídio. Os fragmentos específicos contendo 547 bp foram visualizados e documentados sob
luz ultravioleta. Os controles positivos (A. actinomycetemcomitans cepa 652) e negativos
foram incluídos.
3.5.3 Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
O DNA das amostras foi utilizado como molde em duas reações de PCR para
amplificação da região 16S rRNA utilizando os iniciadores universais propostos por Colombo
et al. (2009). Na primeira reação de PCR foram associados na proporção de 1/1 dois “forward
primer” (4F: 5′-CCAGAGTTTGATYMTGGC-3’ e 6F 5′- GACTAGAGTTTGATYMTGGC-
3’) e um “reverse primer (1541R 5′-GAAGGAGGTGWTCCADCC-3’) (Invitrogen). Para
esta reação foram utilizados: 1µL de DNA molde, 0,2µL de Platinum Taq polimerase (5
unidades/µL, Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, Invitrogen), 5 µL de tampão
(10X), 0,5µL de dNTPs (10nM), 1µL de uma solução de cada iniciador (5 pmoles/µL), 1,5 µL
de cloreto de magnésio (50 mM) e 13,8 µL água Milli Q estéril q.s.p. para uma solução final
23
de 25 µL. Para a segunda reação de PCR, foram utilizados os mesmos “forward primer”
descritos anteriormente e o seguinte “reverse primer”: 1492R (5’-
GYTACCTTGTTACGACTT-3’) (Invitrogen). Para esta reação foram utilizados: 1µL de
DNA molde, 0,2µL de Platinum Taq polimerase (5 unidades/µL, Platinum Taq DNA
Polymerase High Fidellity, Invitrogen), 5 µL de tampão (10X), 0,5µL de dNTPs (10nM), 1µL
de uma solução de cada iniciador (15 pmoles/µL para “forward” e 5 pmoles/µL para
“reverse), 1,5 µL de cloreto de magnésio (50 mM) e 13,8 µL água Milli Q estéril q.s.p. para
uma solução final de 25 µL.
As reações de amplificação foram realizadas segundo as condições propostas por
Colombo et al (2009): desnaturação inicial a 94oC por 120 segundos, seguindo-se 32 ciclos de
desnaturação a 94oC por 30 segundos, 55oC por 30 segundos e 68oC por 90 segundos, com 1
segundo adicional para cada ciclo e uma extensão final de 10 minutos a 68oC em
termociclador (Gen Amp PCR System 2400). Os produtos da reação de PCR foram
submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, em tampão Tris Acetato EDTA
(TAE, Tris acetato a 40mM, ph 8,5; EDTA a 2mM) e corados com brometo de etídio. Os
fragmentos específicos contendo 1500 pb foram visualizados e documentados sob luz
ultravioleta.
3.5.4 Clonagem
Após a determinação da presença do amplicom, descritos no item 3.5.3
(Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da polimerase) estes foram
clonados em Escherichia coli. Para a clonagem foi utilizado o kit comercial TOPO TA
Cloning - Version P (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante.
Os produtos obtidos foram ligados ao vetor TOPO. A seguir, as células
quimiocompetentes de E. coli TOPO foram transformadas por choque térmico e
posteriormente adicionados em meio S.O.C. (2% Triptone, 0,5% extrato de levedura, 10mM
NaCL, 2,5 mM KCL, 10mM MgCL2, 10mM MgSO4, 20 mM glucose). As células foram
semeadas em placas de Petri contendo ágar Luria-Bertani acrescido de 50µg/mL de
Canamicina e posteriormente incubadas a 37o C por 24hs. As colônias recombinantes foram
transferidas para tubos contendo 40 µL de tampão TE e mantidas em -80oC até o momento do
processamento.
Foram selecionadas 50 colônias por amostra clonada e em seguida foi realizada
uma reação de PCR contendo 1µL de cada amostra para determinar o tamanho correto dos
24
insertos. Para cada reação de amplificação da região 16S rRNA de microrganismos procariotos
foram utilizados os iniciadores M13 (TOPO, Invitrogen). As condições da reação foram as
mesmas já descritas no item 3.5.3 (Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia
da polimerase). Os produtos da reação de PCR foram submetidos à corrida eletroforética em
gel de agarose a 1%, em tampão Tris Acetato EDTA (TAE, Tris acetato 40mM, pH 8,5;
EDTA 2mM) e corados com brometo de etídio. Os fragmentos específicos foram visualizados
e documentados sob luz ultravioleta. Após a amplificação do fragmento, os produtos das
reações 16S rRNA foram purificados por meio do Microcon 100 (Amicon, Indianápolis, IN,
USA) e a seguir pelo QIAquick PCR purification (Qiagen, Cambridge, MA, USA).
3.5.5 Sequenciamento
Após a purificação dos produtos das reações de 16S rRNA, 50 produtos foram
selecionados ao acaso para cada uma das amostras. Preliminarmente, a concentração de DNA
foi quantificada em espectrofotômetro 260 e 280 nm (Nanodrop Technologies ND-100, DE,
EUA), de forma que o volume a ser utilizado na reação de sequencimento fosse estimado. As
reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando o kit de seqüenciamento Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Standart Version 3.1 (Applied Biosystems, CA, EUA). O
primer utilizado para o seqüenciamento foi o 533R (TKACCGCGGCTGCTG). A reação de
seqüenciamento foi constituída por: 2 µL das bases fluorescentes (Big Dye), 3,5 µL de
tampão (5X), 50 de primer, 100 a 200 ng produto de PCR purificado e água para completar 20
µL de volume final da reação. A reação foi submetida à termociclagem (MJ Research,
Minnesota, EUA) de acordo com as seguintes condições: desnaturação inicial a 96º C por 2
minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 96º C (45 segundos), anelamento a 60º C (30
segundos) e extensão a 60º C (4 minutos). Após a reação de seqüenciamento, os produtos
obtidos foram submetidos à precipitação. Foram adicionados 28 µL de etanol 100% gelado,
1,15 µL de 3M NaOAc (pH 5,2) e 1,15 µL de glicogênio (1mg/mL) aos 15 µL da reação.
Após a incorporação dos reagentes a reação foi agitada e mantida em gelo por 15 minutos, em
ambiente escuro, seguindo-se centrifugação a 4.000 rpm por 30 minutos em temperatura
ambiente. O sobrenadante foi removido pela inversão dos tubos e execução de dois pulsos de
1.000 rpm. O pellet remanescente foi lavado com 50 µL de etanol 70% gelado por reação. A
centrifugação foi repetida, seguida pelo procedimento de drenagem dos tubos e secagem por 1
minuto a 95º C em termociclador (MJ Research, Minnesota, EUA). As amostras seladas e
protegidas da luz foram encaminhadas ao Serviço de Seqüenciamento do Instituto de Química
25
(IQ – USP, São Paulo, Brasil). As sequências foram analisadas com o auxílio do ABI
PRISM® 3100GeneticAnalyzer (HITACHI).
3.5.6 Análise das sequências do gene 16S rRNA
Cerca de 50 clones de cada amostra com o tamanho certo do inserto em 30
amostras provenientes de 15 indivíduos com periodontite agressiva localizada e 15 amostras
de indivíduos saudáveis foram analisadas. Uma sequência de aproximadamente 500 pares de
base foi obtida por clone para determinar e identificar a posição filogenética do
microrganismo (PASTER et al., 2001, FAVERI et al. 2008). A sequência de DNA obtida foi
comparada com sequências 16S rRNA em banco de genes (GenBank) e no banco de dados do
Forsyth Institute (www.hmod.org). Os dados foram inseridos em um software (TREECON,
Microsoft Windows) e árvores filogenéticas (dendrograma) foram construídas segundo a
metodologia preconizada por Paster e Dewhirst. (1988). As matrizes de similaridade foram
corrigidas para a mudança de bases pelo método descrito por Jukes e Cantor (1969). Após a
identificação das espécies e/ou filotipos, a prevalência das mesmas foi comparada entre as
amostras.
3.5.7 Análise estatística
A média das medidas clínicas de profundidade de sondagem e nível clínico de
inserção, assim como a média da porcentagem de sítios apresentando placa visível,
sangramento gengival, sangramento à sondagem e supuração foram calculadas para cada
indivíduo e, posteriormente, para cada grupo. As diferenças entre os grupos foram avaliadas
utilizando o teste de Mann–Whitney. O teste Qui-quadrado foi utilizado para a variável
gênero. A significância estatística foi estabelecida em 5%. Os dados microbiológicos foram
tabulados e uma análise estatística descritiva foi realizada.
26
4 RESULTADOS
4.1 Resultados clínicos
A Tabela 1 apresenta os dados epidemiológicos e respectivos valores médios dos
parâmetros clínicos dos indivíduos em ambos os grupos experimentais. Os grupos foram
homogêneos em relação à distribuição do gênero (teste Qui-quadrado, p>0,05), na média de
idade e de Índice de Placa Visível. Foram observadas diferenças significativas entre os grupos
para as variáveis clínicas de média de profundidade de sondagem e nível clínico de inserção e
para o percentual de sítios com sangramento gengival, sangramento à sondagem e supuração.
O grupo PAgL apresentou maiores médias para estes parâmetros clínicos comparado com o
grupo SP.
Tabela 1. Média (±DP) dos parâmetros demográficos e clínicos para os indivíduos com saúde periodontal (SP) e com periodontite agressiva localizada (PAgL).
t Teste Qui- Quadrado ; p> 0,005
Variáveis
SP n=15
PAgL n=15
Idade t 22,1±3,5
18-26 21,3±2,2
15-24
Gênero (F/M) t 9/6 8/7
Profundidade de sondagem * 2,19 ± 0,3 3,43 ± 0,91
Nível clínico de inserção * 2,15 ± 0,2 3,59 ± 1,03
% sítios com:
Índice de placa visível 33,74 ± 17,8 49,20 ± 15,9
Sangramento gengival * 6,71 ± 2,5 13,29 ± 14,0
Sangramento à sondagem * 7,21 ± 1,5 61,56 ± 14,22
Supuração * 0,0 3,10 ± 3,14
* Teste U Mann-Whitney; p<0,05 M=masculino; F=feminino
27
4.2 Resultados microbiológicos
Com o objetivo de analisar a prevalência de cepas de A. actinomycetemcomitans,
as amostras selecionadas foram submetidas a reação de PCR. A figura 1 apresenta uma
fotografia do gel de agarose (1%) resultante da reação de amplificação para o A.
actinomycetemcomitans. Amostras clínicas de pacientes com PAgL e SP foram amplificadas
conforme o item 3.5.2 e posteriormente submetidos à eletroforese. Dois e nove indivíduos dos
grupos SP e PAgL, respectivamente eram colonizados por esta espécie.
Figura 1. Fotografia do gel de agarose (1%) em tampão TAE onde produtos da reação de amplificação do gene
16S rRNA do A. actinomycetemcomitans de amostras clínicas de pacientes com periodontite agressiva localizada
foram submetidos à eletroforese. Em (PM) 1000 bp Mass Ladder (Invitrogen, São Paulo, Brasil), em (CN)
controle negativo. Controle positivo (+) - cepas JP2 e FDCY4 (Y4).
Com a finalidade de estudar a diversidade bacteriana presente nas amostras de
biofilme subgengival dos indivíduos com PAgL e com SP, foi realizado o sequenciamento de
45 amplicons 16S rRNA, sendo 30 amplicons de indivíduos com PAgL e 15 de SP. Um total
de 2.041 clones foram sequenciados, sendo 697 clones para as bolsas profundas (PS≥5mm) do
grupo com PAgL, 666 clones para as bolsas rasas (PS≤3mm) do grupo com PAgL e 678
clones para as amostras (PS≤3mm) do grupo com SP. O número de clones 16S rRNA por
amostra variou entre 36 e 49 clones, com uma média de 45,3 ± 4,5. O valor de identidade de
98,5% foi colocado como limite para definição de homologia às espécies encontradas por
meio do programa BLAST presente no banco de dados HOMD (Human Oral Microbiome
Database – The Forsyth Institute – www.homd.org) e GenBank
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Entre todas as amostras analisadas, foram
+ + CN-
28
identificadas 164 espécies/filotipos bacterianos, representados em 8 diferentes Filos
(Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusubacteria, Proteobacteria, Spirochaetes,
Synergistetes e TM7), 16 diferentes classes (Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacili,
Bacteroides, Betaproteobacteria, Clostridia, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria,
Firmicutes, Flavobacteria, Fusobacteria, Gammaproteobacteria, Mollicutes, Spirochaetes,
Synergistetes e TM7), 32 e 46 diferentes famílias e gêneros bacterianos, respectivamente. A
Tabela 3 apresenta a distribuição de Filos, Classe, Família, Gênero e Espécies/Filotipos
bacterianos encontrados nos 2 grupos experimentais e analisadas para ambos os grupos
experimentais.
Espécies pertencentes aos Filos, Spirochaetes, Synergistes e TM7 não foram
encontradas nos indivíduos com SP. Vinte e oito espécies/filotipos foram comuns aos sítios
profundos e rasos dos indivíduos com PAgL e com SP. Trinta e três e 16 espécies/filotipos
foram encontrados somente nas amostras de sítios profundos e rasos dos indivíduos com
PAgL, respectivamente. Por outro lado, 33 espécies/filotipos foram encontrados
exclusivamente nos indivíduos com SP.
Tabela 3. Prevalência de diferentes Filos, Classe, Família, Gênero e de Espécies nas amostras para ambos os grupos experimentais.
A Figura 3 apresenta o número de clones encontrados entre os diferentes Filos
bacterianos em ambos os grupos experimentais. Podemos observar que a principal diferença
entre os sítios profundos dos indivíduos com PAgL e os sítios rasos deste mesmo grupo e
sítios do grupo com SP foi no número de clones dos Filos Actinobacteria e Spirochaetes. A
Tabela 4 apresenta o número de clones encontrados entre os diferentes gêneros bacterianos
29
em ambos os grupos experimentais. A tabela foi ordenada de forma crescente para o número
de clones encontrado no grupo com SP. Espécies do gênero Streptococcus representaram
cerca de 32,7% dos clones analisados no grupo SP. Por outro lado, este gênero representou
apenas 14,1% e 13,0% dos clones encontrados nos sítios rasos e profundos dos indivíduos
com PAgL, respectivamente. Nos sítios rasos do grupo PAgL, espécies de outros gêneros
apresentaram-se em grande quantidade em comparação aos indivíduos com SP, tais como
espécies do gênero Parvimonas, Pseudoramibacter, Synergistetes, Desulfobulbus, Filifactor,
Dialister, Neisseria e Selenomonas. Em bolsas profundas de indivíduos com PAgL,
observamos que espécies do gênero Selenomonas representaram cerca de 15% da microbiota
encontrada. Além disso, espécies do gênero Dialister, Parvimonas, Porphyromonas e
Eubacterium também foram encontrados em elevado número.
Figura 3. Número de clones encontrados dentre os diferentes filos bacterianos em ambos os grupos experimentais. PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.
PAgL – PS>5mm PAgL – PS<3mm SP – PS<3mm
30
Tabela 4. Prevalência de clones encontrados nos diferentes gêneros bacterianos em ambos os grupos experimentais.
Grupos experimentais Gênero SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Afipia 0 7 0 Aggregatibacter 0 2 3 Bacteroidetes[G-1] 0 0 7 Corynebacterium 0 2 2 Haemophilus 0 0 6 Mitsuokella 0 9 8 Mogibacterium 0 3 4 Olsenella 0 0 2 Parvimonas 0 24 29 Peptococcus 0 0 5 Pseudoramibacter 0 18 17 Synergistetes 0 14 6 TM7 0 4 6 Treponema 0 2 10 Cardiobacterium 1 0 0 Desulfobulbus 1 12 9 Peptoniphilus 1 0 0 Tannerella 1 12 8 Anaeroglobus 2 0 14 Filifactor 2 21 27 Oribacterium 2 0 0 Peptostreptococcus 2 7 16 Leptotrichia 3 8 1 Clostridiales[F-2][G-1] 4 5 9 Dialister 4 27 35 Capnocytophaga 5 0 6 Kingella 6 5 5 Firmicutes 7 8 0 Solobacterium 7 8 6 Porphyromonas 8 12 25 Abiotrophia 10 0 1 Megasphaera 10 0 1 Neisseria 11 22 2 Catonella 12 8 0 Granulicatella 12 0 0 Rothia 13 14 0 Fusobacterium 14 13 14 Eubacterium 20 19 43 Prevotella 24 34 11 Gemella 29 0 48
31
Tabela 4. Continuação Gênero Grupos experimentais SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Selenomonas 40 83 104 Campylobacter 41 39 44 Veillonella 66 64 63 Actinomyces 68 42 9 Streptococcus 222 94 91 PS: profundidade de sondagem, PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.
A Tabela 5 apresenta um comparativo do número de clones encontrados e o
número de indivíduos colonizados pelas espécies/filotipos encontrados em ambos os grupos
experimentais. A Tabela 5 foi ordenada de forma crescente para o número de clones
encontrado no grupo SP. Podemos observar que existem diferenças nos perfis de colonização
entre indivíduos com SP e com PAgL. Além disso, um fato interessante é que existem
também diferenças entre os perfis de colonização de sítios rasos dos indivíduos com
periodontite e os sítios rasos dos indivíduos com saúde periodontal. Algumas espécies foram
encontradas em altas taxas entre os indivíduos, independentemente do grupo experimental.
Veillonella parvula foi encotrado em 66,6% (37 clones) dos indivíduos do grupo com SP,
40% (19 clones) e 53,3% das amostras de sítios rasos e profundos do grupo com PAgL,
respectivamente. Streptococcus oralis foi encontrado em 46,6% (31 clones) dos indivíduos do
grupo com saúde periodontal e em 60% (28 clones) e 40% (12 clones) das amostras de sítios
rasos e profundos do grupo com periodontite agressiva localizada, respectivamente. Outras
espécies/filotipos que tiveram destaque tanto para o grupo com saúde periodontal como para
as amostras de sítios rasos e profundos de indivíduos com periodontite, respectivamente,
foram: Streptococcus mitis, 66,6% (59 clones), 33,3% (10 clones) e 26,65% (12 clones); C.
gracilis, 53,3% (28 clones), 66,6% (24 clones) e 33,3% (14 clones).
32
Tabela 5. Prevalência de espécies/filotipos (número de indivíduos colonizados) encontrados em ambos os grupos experimentais Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Afipia broomeae 0 (0) 7 (5) 0 (0) Agregatibacter aphrophilus 0 (0) 6 (4) 0 (0) Prevotella denticola 0 (0) 5 (3) 0 (0) Eikenella corrodens 0 (0) 5 (2) 0 (0) Parvimonas sp. AJ062 / OT110 0 (0) 5 (3) 0 (0) Peptostreptocossus sp. BS044 / AF385559 0 (0) 1 (1) 0 (0) Selenomonas sp. DD020 / OT134 0 (0) 10 (3) 0 (0) Selenomonas sp. EO003 / OT284 0 (0) 4 (3) 0 (0) Streptococccus sanguinis 0 (0) 5 (4) 0 (0) Streptococcus sp. DO002 / OT431 0 (0) 1 (1) 0 (0) Veillonella sp. X042 0 (0) 14 (6) 0 (0) Neisseria subflava 0 (0) 2 (2) 0 (0) Treponema socranskii 0 (0) 1 (1) 0 (0) Synergistes sp. BH007 / OT359 0 (0) 3 (3) 0 (0) Synergistes sp. W028 / OT363 0 (0) 11 (7) 0 (0) TM7 sp. EW055 / OT353 0 (0) 1 (1) 0 (0) Haemophilus parainfluenzae 0 (0) 0 (0) 6 (3) Actinomyces sp. EP005 / OT175 0 (0) 0 (0) 1 (1) Olsenella uli 0 (0) 0 (0) 2 (1) Bacteroidetes sp. X083 / OT 272 0 (0) 0 (0) 7 (3) Capnocytophaga granulosa 0 (0) 0 (0) 2 (2) Porphyromonas catoniae 0 (0) 0 (0) 3 (1) Abiotrophia para-adiances 0 (0) 0 (0) 1 (1) Eubacterium nodatum 0 (0) 0 (0) 14 (5) Eubacterium saphenum 0 (0) 0 (0) 13 (6) Gemella 933-88 0 (0) 0 (0) 22 (4) Gemella haemolysans 0 (0) 0 (0) 8 (4) Peptococcus sp. I070 / OT168 0 (0) 0 (0) 2 (1) Peptococcus sp. JM048 / OT500 0 (0) 0 (0) 3 (1) Peptostreptococcus stomatis 0 (0) 0 (0) 2 (1) Selenomonas artemedis 0 (0) 0 (0) 4 (3) Selenomonas dianae 0 (0) 0 (0) 5 (3) Selenomonas P2PA_80 0 (0) 0 (0) 6 (3) Selenomonas sp CS024 / OT133 0 (0) 0 (0) 1 (1) Selenomonas sp IQ048 0 (0) 0 (0) 1 (1) Selenomonas sp IQ049 0 (0) 0 (0) 1 (1) Staphylococcus aureus 0 (0) 0 (0) 1 (1) Streptococcos BP2-25 0 (0) 0 (0) 3 (1) Streptococcus sp C6_7A 0 (0) 0 (0) 5 (5) Streptococcus sp. AY020 / OT056 0 (0) 0 (0) 1 (1) Veillonela BP2-87 0 (0) 0 (0) 18 (5) Veillonella sp. AA050 0 (0) 0 (0) 7 (1) Veillonellaceae OT150 0 (0) 0 (0) 6 (2) Fusubacterium sp. I035 / OT 203 0 (0) 0 (0) 2 (1) Campylobacter concisus 0 (0) 0 (0) 5(2)
33
Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Aggegatibacter actinomycetemcomitans 0 (0) 3 (2) 3 (1) Corynebacterium matruchotti 0 (0) 2 (2) 2 (1) Neisseria elongata 0 (0) 0 (0) 2 (1) Treponema paladium 0 (0) 0 (0) 1 (1) Synergistes sp W090 / OT363 0 (0) 0 (0) 6 (3) TM7 sp I025 / OT 356 0 (0) 0 (0) 1 (1) Porphyromonas endodontalis 0 (0) 1 (1) 6 (3) Porphyromonas gingivalis 0 (0) 3 (2) 12 (6) Porphyromonas sp. DP023 / OT279 0 (0) 4 (3) 4 (3) Prevotella sp. AH125 / OT292 0 (0) 13 (7) 7 (3) Tannerella forsythia 0 (0) 2 (2) 6 (3) Eubacterium yuri 0 (0) 3 (2) 7 (4) Mitsuokella sp. CS002 / OT131 0 (0) 9 (5) 8 (4) Mogibacterium tidmidium 0 (0) 3 (2) 4 (1) Parvimonas micra 0 (0) 19 (10) 29 (10) Peptostreptococcus sp. DA014 / OT065 0 (0) 6 (4) 14 (4) Pseudoramibacter alactolyticus 0 (0) 18 (8) 17 (7) Selenomonas sp. EW084 / OT146 0 (0) 6 (4) 9 (3) Streptococcus constelattus 0 (0) 5 (5) 5 (3) Streptococcus salivarius 0 (0) 12 (6) 3 (1) Veillonellaceae sp. GAA14 / OT155 0 (0) 8 (6) 1 (1) Treponema denticola 0 (0) 1 (1) 9 (4) TM7 sp AH040 / OT346 0 (0) 3 (2) 5 (2) Rothia BQ2-13 1 (1) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sp. DZ073 1 (1) 0 (0) 0 (0) Peptoniphilus asaccharoliticus 1 (1) 0 (0) 0 (0) Peptostreptococcus sp. FX38-1 1 (1) 0 (0) 0 (0) Pretostreptococcus FX38-1 1 (1) 0 (0) 0 (0) Selenomonas sp. EY047 / OT124 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus BP2-25 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus mitis bv 2 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus mitis/pneumoniae 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus peneumoniae 1 (1) 0 (0) 0 (0) Veillonella OH1A 1 (1) 0 (0) 0 (0) Cardiobacterium valvarum 1 (1) 0 (0) 0 (0) Porphyromonas sp. EP003 / OT284 1 (1) 4 (3) 0 (0) Veillonella sp. BI029 / OT158 1 (1) 9 (6) 0 (0) Fusobacterium periodonticum 1 (1) 7 (3) 0 (0) Eubacterium saburreum 1 (1) 0 (0) 7 (3) Tannerella sp. BU063 / OT286 1 (1) 10 (5) 2 (1) Dialister pneumonsites 1 (1) 10 (8) 8 (3) Veillonella atypica 1 (1) 6 (5) 8 (2) Desulfobulbus sp. R004 / OT041 1 (1) 12 (6) 9 (4) Oribacterium sp. AO068 / OT078 2 (1) 0 (0) 0 (0) Selenomonas fluggei 2 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp.EK048 / OT064 2 (2) 0 (0) 0 (0) Gemella 1714-94 2 (2) 0 (0) 0 (0)
34
Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Campylobacter curvus 2 (1) 0 (0) 0 (0) Neisseria flava 2 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. CH016 / OT058 2 (2) 4 (4) 0 (0) Streptococcus sp. EK048 / OT064 2 (2) 3 (2) 0 (0) Neisseria mucosa 2 (2) 8 (6) 0 (0) Neisseria sp. AP132 / OT018 2 (2) 3 (2) 0 (0) Capnocytophaga gingivalis 2 (1) 0 (0) 2 (1) Anaeroglobus germinatus 2 (2) 0 (0) 14 (6) Filifactor alocis 2 (1) 21 (8) 27 (11) Actinomyces meyeri 3 (2) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sp. EI074 / OT100 3 (2) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. AA007 / OT055 3 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. DN025 / OT061 3 (2) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. FN051 / OT066 3 (2) 0 (0) 0 (0) Fusobacterium nucleatum ss. polymorphum 3 (2) 0 (0) 0 (0) Prevotella sp. FM005 3 (1) 1 (1) 0 (0) Capnocytophaga sputigena 3 (2) 0 (0) 2 (2) Selenomonas sp. CS024 / OT133 3 (2) 0 (0) 1 (1) Shuttleworthia satelles 3 (1) 0 (0) 6 (3) Leptotrichia buccalis 3 (1) 8 (5) 1 (1) Dialister invisus 3 (2) 17 (9) 27 (11) Streptococcus BP2-15 4 (1) 0 (0) 0 (0) Fusubacterium sp CY024 / OT203 4 (3) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sulci 4 (2) 7 (2) 0 (0) Selenomonas sp. DS051 / OT137 4 (2) 12 (6) 0 (0) Eubacterium infirmum 4 (2) 0 (0) 2 (2) Streptococcus intermedius 4 (2) 0 (0) 13 (5) Prevotella intermedia 4 (2) 6 (6) 1 (1) Clostridiales sp. F058 / OT075 4 (1) 5 (3) 9 (5) Selenomonas noxia 4 (4) 17 (9) 19 (10) Streptococcus anginosus 4 (1) 4 (2) 13 (5) Fusubacterium nucleatum sp. nucleatum 4 (3) 6 (4) 12 (5) Selenomonas sp. AA024 5 (2) 0 (0) 0 (0) Veillonellaceae sp. EZ011 / OT148 5 (1) 0 (0) 0 (0) Atopobium parvulum 5 (2) 9 (4) 0 (0) Neisseria ap. AP015 / OT014 5 (2) 9 (4) 0 (0) Actinomyces gerencseriae 5 (2) 7 (4) 5 (2) Streptococcus cristatus 5 (3) 2 (1) 3 (2) Streptococcus parasanguinis 5 (2) 7 (3) 1 (1) Campylobacter rectus 5 (1) 5 (5) 20 (6) Campylobacter showae 5 (2) 10 (6) 5 (2) Gemella sanguinis 6 (5) 0 (0) 0 (0) Catonella morbi 6 (3) 4 (3) 0 (0) Cantonella morbi 6 (3) 4 (3) 0 (0) Kingella oralis 6 (3) 5 (4) 5 (3) Porphyromonas sp. CW034 / OT279 7 (2) 0 (0) 0 (0)
35
Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Firmicutes sp. CH017 7 (3) 8 (3) 0 (0) Eubacterium brachy 7 (3) 4 (3) 0 (0) Solobacterium moorei 7 (3) 8 (3) 6 (5) Actinomyces odontolyticus 8 (3) 5 (5) 0 (0) Prevotella melaninogenica 8 (4) 3 (3) 0 (0) Prevotella oris 9 (6) 6 (6) 3 (1) Selenomonas infelix 9 (4) 9 (6) 9 (5) Selenomonas sputigena 9 (4) 25 (9) 42 (9) Abiotrophia adiacens 10 (4) 0 (0) 0 (0) Megasphaera micronuciformis 10 (2) 0 (0) 1 (1) Granulicatella adiacens 12 (5) 0 (0) 0 (0) Rothia dentocariosa 12 (4) 14 (7) 0 (0) Streptococcus gordonii 13 (5) 7 (6) 2 (1) Actinomyces sp. BL008 / OT171 14 (4) 11 (6) 0 (0) Actinomyces sp. IP073 / OT448 14 (5) 8 (6) 0 (0) Streptococcus infantis 19 (6) 0 (0) 0 (0) Veillonella dispar 21 (7) 8 (3) 0 (0) Streptococcus sp. FN042 / OT065 21 (3) 0 (0) 8 (3) Gemella morbillorum 23 (7) 0 (0) 18 (9) Actinomyces naeslundii 24 (7) 11 (5) 3 (1) Atopobium rimae 25 (8) 8 (8) 0 (0) Streptococcus sanguinis 28 (9) 0 (0) 9 (4) Campylobacter gracilis 29 (8) 24 (10) 14 (5) Streptococcus oralis 31 (7) 28 (9) 12 (6) Veillonella parvulla 37 (10) 19 (6) 23 (8) Streptococcus mitis 59 (10) 10 (5) 12 (4) PS: profundidade de sondagem, PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.
Quando comparamos os sítios rasos dos indivíduos com saúde periodontal com os
sítios rasos dos indivíduos com PAgL observamos algumas espécies/filotipos em destaque
para o grupo com periodontite, tais como: Selenomonas sp. DD020/OT134 (20%, 10 clones),
Veillonella sp. X042 (40%, 14 clones), Synergistes sp. W028/OT363 (46,6%, 11 clones),
Prevotella sp. AH125/OT292 (66,6%, 13 clones), Parvimonas micra (66,6%, 10 clones),
Pseudoramibacter alactolyticus (66,6%, 18 clones), Streptococcus salivarius (46,6%, 12
clones), Tannerella sp. BU063/OT286 (33,3%, 10 clones), Dialister pneumonsites (66,6%, 10
clones), Desulfobulbus sp. R004/OT041 (46,6%, 12 clones), F. alocis (66,6%, 21 clones),
Dialister invisus (73,3%, 27 clones), Selenomonas sp. DS051 / OT137 (46,6%, 12 clones),
Selenomonas noxia (66,6%, 17 clones) e S. sputigena (66,6%, 25 clones). Algumas
espécies/filotipos foram predominantes nas bolsas profundas dos indivíduos com PAgL, tais
como: E. nodatum (33,3%, 14 clones), Eubacterium saphenum (40%, 13 clones), Gemella
36
933-88 (26,6%, 22 clones), Veillonella BP2-87 (33,3%, 18 clones), Anaeroglobus germinatus
(40%, 14 clones), F. alocis (73,3%, 27 clones), D. invisus (73,3%, 27 clones), Campylobacter
rectus (40%, 20 clones), S. sputigena (60%, 42 clones), P. gingivalis (40%, 12 clones), P.
micra (66,6%, 29 clones), P. alactolyticus (46,6%, 17 clones).
É importante salientar que, das cento 164 espécies/filotiopos encontrados em
ambos os grupos experimentais, 69 (42%) eram filotipos ainda não cultivados. Não foram
observados diferenças no perfil microbiológico quando sítios positivos e negativos para A.
actinomycetemcomitans foram analisados.
37
5. DISCUSSÃO
O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana por
análise clonal do gene 16S rRNA pela técnica de Sanger, em amostras de biofilme subgengival
de indivíduos com SP e com PAgL. Primeiramente, é relevante a discussão do perfil clínico
dos indivíduos selecionados. O grupo saudável apresentou todos os parâmetros clínicos
compatíveis com SP, como valores significativamente inferiores dos parâmetros de
profundidade de sondagem, nível clínico de inserção, sangramento à sondagem, sangramento
gengival e supuração em relação ao grupo de indivíduos portadores de periodontite agressiva
localizada. O único parâmetro clínico que não diferiu significativamente entre os grupos foi o
índice de placa visível. Estes dados corroboram com estudos que avaliaram populações com
PAgL (TAKEUCHI et al., 2003; GAJARDO et al., 2005; FAVERI et al., 2009). Muitos
estudos microbiológicos envolvendo indivíduos com PAg têm avaliado poucas espécies
bacterianas (SLOTS et al., 1980; ZAMBON et al., 1985; SCHENKEIN et al., 1993; TINOCO
et al., 1997; CORTELLI et al., 2005). No entanto, o biofilme subgengival é composto por
diversas espécies de microrganismos altamente relacionadas entre si. As associações entre
determinadas espécies, como a co-agregação, mediada por diferentes adesinas presentes nas
superfícies celulares, e as relações de cooperação e antagonismo, e as diferentes fontes de
nutrição irão caracterizar as propriedades do biofilme que será formado (KOLEMBRANDER
et al., 2006). Assim sendo, é de suma importância que o biofilme subgengival dos indivíduos
com PAgL seja estudado de uma maneira mais complexa do que a análise de poucas espécies
bacterianas, que representariam uma pequena porcentagem do total de células microbianas na
amostra. Faveri et al. (2009) analisaram por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA
Hybridization amostras subgengivais de indivíduos com PAgL. Os autores observaram que o
perfil microbiológico para as 40 espécies bacterianas analisadas nestes indivíduos apresentou-
se tão complexa quanto à dos indivíduos com PAgG e PC. De uma maneira geral, o perfil de
colonização bacteriana frente às 40 espécies bacterianas analisadas, não foi diferente entre as
3 formas de periodontite. Estes dados corroboram com os dados do presente estudo, onde
observamos que a diversidade microbiológica presente nas amostras de biofilme subgengival
de indivíduos com PAgL é tão complexa quanto a apresentada em outros estudos que
avaliaram a diversidade da PAgG e com PC (KUMMAR et al., 2005; FAVERI et al., 2008)
A análise da literatura revelou que 69 destas 164 espécies (42%) detectadas no
presente estudo ainda não foram cultivadas (Tabela 5). Estes dados corroboram com estudos
anteriores onde a proporção de espécies ainda não cultivadas era em média de 40% (PASTER
38
et al., 2001; PASTER et al., 2002; KUMMAR et al., 2005; AAS et al., 2005, KAZOR et al.,
2003; SAKAMOTO et al., 2006, DEWHIRST et al. 2010).
No grupo SP, em relação a espécies já cultivadas, foram observadas uma alta
prevalência e número de clones de S. mitis, V. parvulla, S. oralis, S. sanguinis, A. naeslundii e
G. morbilorium. Esses achados corroboram com estudos anteriores onde essas espécies
estavam associadas à saúde periodontal (COLOMBO et al., 2009; HAFFAJEE et al., 2005;
XIMENEZ-FYVIE et al., 2006; FAVERI et al., 2009). Uma espécie incomum que foi
encontrada em alta prevalência no grupo SP e nas bolsas rasas do grupo PAgL foi o A. rimae.
Kummar et al. (2005) avaliaram 66 indivíduos com PC e 66 indivíduos com SP por meio da
técnica do PCR e observaram que 79% e 33 % dos indivíduos do grupo SP e PC,
respectivamente, eram colonizados por A. rimae (p<0,0001). Estes dados corroboram com o
presente estudo, onde dos 15 indivíduos com SP analisados 8 (53,3%) eram colonizados por
esta espécie. Observamos uma redução de espécies do filo Actinobacteria presentes nas
amostras de sítios profundos dos indivíduos com PAgL e um aumento de espécies deste Filo
nas bolsas rasas do grupo PAgL e SP (Figura 3). Estes dados corroboram com estudos de
clonagem e sequenciamento que observaram uma grande proporção de espécies deste filo em
indivíduos com SP (AAS et al. 2005, PASTER et al. 2006). Dentre as espécies ainda não
cultivadas, Actinomyces sp. BL008/OT171 e Actinomyces sp. IP073/OT448 apresentaram
relativa frequência e número de clones em comparação com as amostras de sítios profundos
do grupo PAgL (Tabela 5). O presente estudo corrobora com os achados prévios que
relacionavam estes dois filotipos com a SP (KUMAR et al., 2003; KUMAR et al., 2005; AAS
et al. 2005, COLOMBO et al., 2009).
Por meio da avaliação de análise clonal, a espécie A. actinomycetemcomitans foi
encontrada em baixos índices e prevalência em ambos os grupos (Tabela 5), tendo apenas
13,3% (2/15) de frequência para os indivíduos do grupo PAgL com apenas 3 clones
encontrados para esta espécie neste grupo. Além disso, nenhuma diferença foi observada
quando analisamos a diversidade bacteriana presente em sítios colonizados ou não por esta
espécie. A baixa frequência e número de clones encontrados para o A.
actinomycetemcomitans não foi surpreendente, pois já é bem observado na literatura que em
trabalhos de análise clonal do gene 16S rRNA, esta espécie é raramente observada. Em um
estudo de nosso grupo de pesquisa Faveri et al. (2008) identificou 7 de 10 indivíduos com
PAgG eram positivos para esta espécie e durante os procedimentos de análise clonal destas
amostras, nenhum clone de A. actinomycetemcomitans foi encontrado. É interessante observar
que Bragd et al. (1987) e Rams et al. (1997) sugeriram que a A. actinomycetemcomitans
39
apresenta uma alta patogenicidade e, portanto, mesmo níveis baixos dessa espécie poderiam
ser danosos ao periodonto. O fato de outras espéceis terem sido encontrados em frequência e
número de clones superiores ao do A. actinomycetemcomitans, corroboram com estudos que
relatam que outras espécies bacterianas, além do A. actinomycetemcomitans, apresentam
importância no desenvolvimento da forma localizada da PAg conforme estudos de Ximenez-
Fyvie et al. (2006); Gajardo et al. (2005); Faveri et al. (2009) e devem ser melhor estudadas.
Algumas espécies já cultivadas foram encontradas em alta frequência e número de
clones nos indivíduos com PAgL, tanto nos sítios rasos quanto nos sítios profundos. Entre
estas espécies podemos citar S. sputigena e F. alocis, que também foram encontradas em
níveis, proporção e prevalência superiores em todas as análises realizadas (Figuras 1 a 5). S.
sputigena é um bacilo, multiflagelado, dotado de motilidade, anaeróbio estrito e Gram-
negativo, tem sido associado com casos de periodontite ulcerativa necrosante (Gmur et al.
2004), periodontite de progressão rápida ( Kamma et al. 1994), lesões periodontais ativas
(Haffajee et al., 1984) e com a PAgG (FAVERI et al., 2008). F. alocis foi primeiramente
isolado em 1985 em amostras de fluido gengival como Fusobacterium alocis por meio de
estudos de Cato et al. (1985) e posteriormente reclassificado como Filifactor alocis (JALAVA
et al., 1999). Trata-se de uma espécie Gram-positiva, anaeróbia estrita que tem a capacidade
de processar N-benzoyl-DL-arginine-2-naphtylamide, assim como P.gingivalis e T. denticola.
Os dados do presente estudo corroboram com estudos prévios que vinculam esta espécie a
etiologia das periodontites (DAHLÉN & LEONHARDT, 2006; KUMAR et al., 2006;
COLOMBO et al., 2009; SCHLAFER et al., 2010). Schlafer et al. (2010) estudaram em
detalhes a relação desta espécie no biofilme subgengival de indivíduos com várias condições
periodontais. Por meio da técnica do “Dot blot hybridization” os autores analisaram a
presença desta espécie em 78 amostras de biofilme subgengival de bolsas profundas (média
de PS 7,1 ± 1,4) de 30 indivíduos com PC e 82 amostras de biofilme subgengival de 19
pacientes com SP (média de PS 3,6 ± 0,8). Apenas 15,8% das amostras do grupo SP
apresentavam-se colonizados por esta espécie, enquanto que 76,7% das amostras do grupo PC
eram positivos para F. alocis. Por meio da técnica “Fluorescent in situ hybridization” (FISH)
os mesmos autores observaram que F. alocis concentra-se próximo à parede da bolsa
periodontal e em maiores concentrações no fundo da bolsa. Desta forma, visto os resultados
do presente estudo e os dados disponíveis na literatura, sugere-se que o F. alocis e S.
sputigena podem apresentar um papel importante na etiologia da periodontite agressiva
localizada e deveriam ser melhor investigados. P. micra, P. alactolyticus, D. pneumonsites,
D. invisus e S. noxia também apresentaram em frequência e número de clones elevados em
40
ambos os sítios avaliados no grupo PAgL. É interessante observar que o número de clones
destas espécies encontrados nas amostras de SP foi em muitos casos inexistente.
Várias espécies bacterianas ainda não cultivadas também foram encontradas em
altas frequências no grupo PAgL em comparação aos indivíduos com SP. Entre elas
encontram-se Synergistes sp BH007 / OT359 (46,6%, 11 clones), Prevotella sp. AH125 /
OT292 (46,6%, 13 clones), Selenomonas sp. DS051 / OT137 (40%, 12 clones). Os dados do
presente estudo corroboram com os estudos que tem vinculado à possibilidade destas espécies
ainda não cultivadas serem possíveis periodontopatógenos (PASTER et al., 2002; KUMAR et
al., 2003; FAVERI et al., 2008; COLOMBO et al., 2009; TELES et al., 2011).
Outro achado interessante refere-se ao padrão de colonização observado nas
diferentes categoria de Profundidade à Sondagem no grupo PAgL (Figura 3, Tabela 4 e 5).
Indivíduos do grupo PAgL mostraram uma alteração evidente na microbiota nas
profundidades rasas às profundas, sendo que o mais interessante é que a microbiota de sítios
rasos de indivíduos com periodontite apresentam uma diversidade diferente da observada nos
sítios rasos de indivíduos com SP. Estes dados corroboram com a hipótese de que a
periodontite não é apenas uma infecção do sítio, mas trata-se de uma infecção da cavidade
bucal ( Kumar et al. 2005) e desta forma a visão de tratamento não deve ser sítio especifica.
41
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Até o presente momento, nenhum estudo havia descrito a diversidade bacteriana
presente no ambiente subgengival de indivíduos com PAgL. Por muito tempo, o A.
actinomycetemcomitans foi considerado como o principal patógeno na doença periodontal
agressiva localizada. Entretanto, estudos recentes, bem como o presente estudo,
demonstraram que esta infecção apresenta uma microbiota tão complexa quanto à vista na
PAgG e PC. Um fato interessante que observamos em nossos dados é que os sítios
considerados saudáveis nos indivíduos com PAgL apresentam uma diversidade bacteriana
diferente dos sítios saudáveis de indivíduos com SP. O estudo mais detalhado da microbiota
presente nestes sítios será de fundamental importância para detectar possíveis marcadores
microbiológicos que indicam o início da progressão da perda dos tecidos de sustentação do
elemento dentário. Além disso, dentre as espécies que apresentaram frequência e número
aumentado de clones, o estudo dos níveis, proporções e prevalência em um número maior de
indivíduos e amostras se faz necessário.
42
6. CONCLUSÃO
Dentro dos limites do presente estudo, podemos concluir que:
- A diversidade da microbiota subgengival de indivíduos com periodontite
agressiva localizada difere marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente
saudáveis;
- A diversidade da microbita subgengival de sítios rasos de indivíduos com saúde
periodontal apresenta diferenças em relação a diversidade encontrada em sítios rasos de
indivíduos com periodontite agressiva localizada;
- Actinomyces sp. BL008 / OT171 e Actinomyces sp. IP073 / OT448 foram as
espécies de bactérias ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones
mais elevados nos indivíduos com saúde periodontal;
- S. sputigena, F. alocis, Synergistes sp BH007 / OT359, Prevotella sp. AH125 /
OT292, Selenomonas sp. DS051 / OT137 foram as espécies/filotipos de bactérias incomuns
ou ainda não cultivadas encontradas em frequência e número de clones mais elevados nos
indivíduos com peridontite agressiva localizada.
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ANEXO