DOUTORADO - TESE FINAL€¦ · Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,...

Elizângela Guedes

ESTUDO DE POPULAÇÕES DE Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum (Acari:Ixodidae) E PESQUISA DE Rickettsia spp. NESTAS ESPÉCIES EM CORONEL PACHECO,

MINAS GERAIS

Tese apresentada à Universidade Federal de MinasGerais, Escola de Veterinária, como requisito parcialpara obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal.

Área: Medicina Veterinária Preventiva

Orientador: Romário Cerqueira Leite

Belo HorizonteEscola de Veterinária – UFMG

2009

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G924e Guedes, Elizângela, 1979- Estudo de populações de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum(Acari: Ixodidae) e pesquisa de Rickettsia spp. nestas espécies em CoronelPacheco, Minas Gerais / Elizângela Guedes. -2009. 69 p. : il.

Orientador: Romário Cerqueira Leite Tese (doutorado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Escola deVeterinária Inclui bibliografia

1. Amblyomma cajennense – Teses. 2. Carrapato como transmissor dedoenças – Teses. 3. Rickettsioses – Teses. 4. Febre maculosa das montanhasrochosas – Teses. I. Leite, Romário Cerqueira. II. Universidade Federal deMinas Gerais. Escola de Veterinária. III. Título.

CDD – 636.089 696 8

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Expedito e Maria Aparecida, pelo apoio incondicional, pela dedicação, pelassábias palavras, ainda que simples, pelo colo que sempre me acalentou e ainda o faz.

Ao André pelo seu amor, companheirismo, compreensão pelos momentos de ausência e pelacumplicidade.

Ao meu “príncipe” Felipe a quem tanto amo e sem o qual nada disso teria razão de ser.

Dedico este trabalho.

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Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo.

E que posso evitar que ela vá à falência.Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver

apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de crise.Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e

se tornar um autor da própria história.É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar

um oásis no recôndito da sua alma.É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida.

Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.É saber falar de si mesmo.

É ter coragem para ouvir um 'não'.É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta.

Pedras no caminho?

Guardo todas, um dia vou construir um castelo...

Fernando Pessoa

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AGRADECIMENTOS

A Deus pela luz que sempre ilumina meus caminhos e pela realização deste trabalho.

Aos meus pais, irmãs e sobrinhos pela corrente de positividade que sempre me cercou.

Aos meus sogros, Heloísa e Zé Luís, pelo carinho com que cuidaram de meu filho Felipe naminha ausência.

Ao André e ao Yan pelo amor, carinho e paciência dispensados a mim ao longo destepercurso.

Ao “Príncipe” por compreender que a mamãe, às vezes, precisa ficar longe.

Ao Professor Romário Cerqueira Leite pela amizade, pela orientação e pelo desprendimentocom que doou seus nobres conhecimentos a mim.

Ao Professor Paulo Roberto de Oliveira pelas nobres dicas que engrandeceram este trabalho.

À família “Parasitologista” da Escola de Veterinária da UFMG: Eduardo, Ana, Ari, Luísa,Carolina e Ricardo por compartilharem comigo de minhas aflições e alegrias.

Ao John e à Marcinha pelas dicas, pelo exemplo profissional, pelo carinho com que sempre metrataram e pela amizade.

Ao Dedi e companhia limitada do Laboratório de Parasitologia da Embrapa: Caio, Aline, Helder,Ana Elisa, Daniele, pela ajuda a campo e pela alegre convivência.

Ao professor e amigo Marcelo Bahia Labruna pelo carinho com que me recebeu no VPS daUSP em São Paulo e por toda ajuda na realização deste trabalho.

Aos grandes amigos que fiz no Laboratório “Carrapatos” do VPS da USP pelo agradávelperíodo que passamos juntos: Richard, Maurício, Jonas, Maria, Fernanda, Thiago, Guilherme, eem especial, Iara.

Aos amigos de república de BH: Carla, Sílvia, Leandro, Theonys, Jankerle, Aliny e Hayala, pelacompanhia durante essa caminhada.

À chefia da Embrapa Gado de Leite por ceder, gentilmente, suas instalações para execuçãodeste projeto.

Aos funcionários do Campo Experimental de Coronel Pacheco, em especial, ao Klinger, portoda colaboração nas coletas de carrapatos.

Ao Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e a todos os professores pelaoportunidade desta convivência.

Ao colegiado de pós-graduação e a todos seus funcionários, em especial, à Nilda e Débora,pela contribuição ao longo da execução deste projeto.

À FAPEMIG pelo apoio financeiro para execução deste trabalho (Processo CAG 1115/05)

À CAPES pela concessão de bolsa de estudo durante o curso.

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SUMÁRIO

RESUMO .............................................................................................................. 19

ABSTRACT .......................................................................................................... 21

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 23

2 LITERATURA CONSULTADA............................................................................. 252.1 Epidemiologia de A. cajennense .......................................................................... 252.2 Epidemiologia de A. dubitatum............................................................................. 282.3 Epidemiologia de R. rickettsii................................................................................ 29

3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 313.1 Local e duração do experimento .......................................................................... 313.2 Animais do experimento ....................................................................................... 323.3 Coleta de estádios em vida livre........................................................................... 323.4 Coleta de estádios em vida parasitária ................................................................ 333.5 Identificação dos carrapatos................................................................................. 343.6 Teste de hemolinfa ............................................................................................... 343.7 Extração de DNA e análise pela PCR .................................................................. 363.8 Clonagem.............................................................................................................. 373.9 Sequenciamento de DNA ..................................................................................... 383.10 Dados meteorológicos .......................................................................................... 393.11 Análise estatística................................................................................................. 39

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 394.1 Dados meteorológicos .......................................................................................... 394.2 Flutuação da população de larvas, ninfas e adultos de vida livre de A.

cajennense e A. dubitatum ................................................................................... 404.3 Flutuação da população de larvas, ninfas e adultos de vida parasitária de A.

cajennense............................................................................................................ 454.4 Eficiência de armadilhas de CO2 na coleta de estádios de vida livre de A.

cajennense e A. dubitatum ................................................................................... 494.5 Teste de hemolinfa ............................................................................................... 504.6 Análise pela PCR.................................................................................................. 50

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 53

6 CONCLUSÕES..................................................................................................... 53

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 54

8 ANEXOS............................................................................................................... 60

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Pares de oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação dos genesde Rickettsia spp................................................................................................... 37

Tabela 2 Total de larvas, ninfas e adultos de A. cajennense e A. dubitatum coletadospor diferentes técnicas em Coronel Pacheco, MG, no período de maio de2006 a abril de 2008. ............................................................................................ 40

Tabela 3 Coleta de ninfas e adultos de vida livre de A. cajennense e A. dubitatum portécnicas de amostragem utilizando CO2, no município de Coronel Pacheco,MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008................................................ 50

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LISTA DE FIGURASFigura 1 Localização do município de Coronel Pacheco, Minas Gerais, área

endêmica para FMB e local de coleta de carrapatos........................................ 32

Figura 2 Armadilhas de CO2............................................................................................33

Figura 3 Fêmea e macho de A. cajennense.................................................................... 35

Figura 4 Fêmea e macho de A. dubitatum ...................................................................... 35

Figura 5 Temperaturas máximas, médias e mínimas observadas no município deCoronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008............... 39

Figura 6 Umidade relativa do ar e índices pluviométricos no município de CoronelPacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008............................. 40

Figura 7 Flutuação da população de larvas e ninfas de vida livre de Amblyomma sp.coletadas no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de2006 a abril de 2008.......................................................................................... 41

Figura 8 Flutuação da população de adultos de vida livre de A. cajennense e A.dubitatum coletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período demaio de 2006 a abril de 2008............................................................................ 42

Figura 9 Flutuação da população de machos e fêmeas de A. cajennense em vidalivre coletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maiode 2006 a abril de 2008..................................................................................... 43

Figura 10 Flutuação da população de machos e fêmeas de A. dubitatum em vida livrecoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de2006 a abril de 2008.......................................................................................... 43

Figura 11 Flutuação da população de larvas e ninfas de vida parasitária de A.cajennense coletadas no município de Coronel Pacheco, MG, no períodode maio de 2006 a abril de 2008....................................................................... 46

Figura 12 Flutuação da população de adultos de vida parasitária de A. cajennensecoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de2006 a abril de 2008.......................................................................................... 47

Figura 13 Flutuação da população de machos e fêmeas de A. cajennense em vidaparasitária coletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período demaio de 2006 a abril de 2008............................................................................ 47

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LISTA DE ABREVIATURAS

GFM grupo da febre maculosa

et al. e colaboradores

FMB febre maculosa brasileira

FMMR febre maculosa das montanhas rochosas

Embrapa Empresa de Pesquisa Agropecuária

CECP Campo Experimental de Coronel Pacheco

FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

S south

W west

CO2 dióxido de carbono

% por cento

°C graus Celsius

cm centímetro

m metro

m2 metro quadrado

g gramas

DNA ácido desoxirribonucléico

PCR reação em cadeia de polimerase

TE tampão Tris-HCl-EDTA

Tris tris (hidroximetil) amino metano

HCl cloreto de hidrogênio

EDTA ácido etileno diamino tetracético

pH potencial hidrogeniônico

GT isotiocianato de guanidina

µl microlitro

ml mililitro

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M molar

mM milimolar

pmoles picomoles

ng nanogramas

g gravidade terrestre

rpm rotações por minuto

primers oligonucleotídeos iniciadores

pb pares de base

gltA gene citrato sintase

OmpA outer membrane protein A

OmpB outer membrane protein B

dNTP dexoxinucleotídeo trifosfatado

Taq Termophilus aquaticus

NaCl cloreto de sódio

MgCl2 cloreto de magnésio

LB Luria Bertani

X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indol-ß-D-galactosídeo

IPTG isopropil-tio-ß-D-galactosídeo

BLAST basic local alignment search tool

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RESUMO

Devido à importância dos ixodídeos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum naepidemiologia da Febre Maculosa Brasileira (FMB), o presente estudo avaliou a flutuação depopulações de vida livre e de vida parasitária destas duas espécies de carrapatos, bem como afrequência de infecção de carrapatos por Rickettsia spp. em Coronel Pacheco, área de riscopara ocorrência de FMB no Estado de Minas Gerais. Larvas de Amblyomma sp. foramcapturadas da pastagem por arraste de flanela durante o período de maio a outubro de 2006,de fevereiro a novembro de 2007 e a partir de março de 2008. Apresentaram picospopulacionais bem definidos sendo os maiores em maio de 2006, abril-maio de 2007, abril de2008 e outubro-novembro de 2007. Larvas de A. cajennense foram capturadas em vidaparasitária no período de maio a setembro de 2006, de março a setembro de 2007 e a partir deabril de 2008. Apresentaram picos populacionais bem definidos sendo os maiores em maio de2006, abril-maio de 2007 e abril de 2008. Ninfas de Amblyomma sp. foram capturadas dapastagem por armadilhas de CO2 durante todos os meses do ano e apresentaram picospopulacionais entre os meses de junho a novembro e densidade populacional máxima em julhoe outubro-novembro de 2006 e de 2007. Ninfas de A. cajennense foram capturadas em vidaparasitária por raspagem dos equinos durante todos os meses do ano e apresentaram picospopulacionais entre os meses de junho a novembro e densidade populacional máxima em julhode 2006 e de 2007. Adultos também foram coletados da pastagem com armadilhas de CO2 eestes ocorreram durante todos os meses do ano com aumento populacional de outubro atémarço e de agosto até abril para A. cajennense e para A. dubitatum, respectivamente, nos doisanos de duração do experimento. Adultos de A. cajennense em vida parasitária ocorreramdurante todos os meses do ano com aumento populacional de setembro até abril. Doscarrapatos coletados, 1213 exemplares tiveram sua hemolinfa testada e todos se apresentaramnegativos para a presença de microrganismos semelhantes à riquétsia. Através da análise pelareação em cadeia de polimerase (PCR) usando um fragmento do gene riquetsial citrato sintase(gltA), somente dois carrapatos adultos de vida livre da espécie A. cajennense (um macho euma fêmea) e quatro pools de 5 ninfas de vida livre de Ambyomma sp. mostraram produtos detamanho esperado. O sequenciamento de DNA do fragmento amplificado dos genes gltA,OmpA e OmpB dos dois carrapatos adultos mostrou 100% de similaridade com as sequênciascorrespondentes de R. rickettsii no Gen Bank. O sequenciamento de DNA do fragmentoamplificado do gene gltA das ninfas mostrou 99,7% de similaridade com as sequênciascorrespondentes de Rickettsia tamurae no Gen Bank. Estes resultados apresentam, mais umavez, evidências moleculares da presença de R. rickettsii em populações de A. cajennense emCoronel Pacheco e sugerem a identificação de R. tamurae nas populações de A. cajennense eA.dubitatum.

Palavras-chave: Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Rickettsia spp., febremaculosa.

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ABSTRACT

Owing to the importance of Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum in theepidemiology of Brazilian Spotted Fever (BSF), this study evaluated the flutuation of populationsof the free-living and parasitic these two species of the ticks, as well the frequency of ticksinfection by Rickettsia spp. in Coronel Pacheco, risk area for occurrence of BSF in Minas GeraisState. Larvae of Amblyomma sp. were collected from pasture using the technique of dragsampling with flannelette during May to October 2006, from February to November 2007 andfrom March 2008. Well-defined peaks of populations occurred in May 2006, April-May 2007,April 2008 and October-November 2007. Larvae of A.cajennense were collected from animalsduring May to September 2006, from March to September 2007 and from April 2008. Well-defined peaks of populations occurred in May 2006, April-May 2007 and April 2008. Nymphs ofAmblyomma sp. were captured from pasture throughout the year by the use of traps with carbondioxide and peaks populations were observed between June and November, with an increase inpopulation density in July and October-November 2006 and 2007. Nymphs of A. cajennensewere captured throughout the year on equines and peaks populations were observed betweenJune and November, with an increase in population density in July 2006 and 2007. Adults werecaptured from pasture throughout the year by the use of traps with carbon dioxide with anincrease in population density from October to March and from August to April for A. cajennenseand A. dubitatum, respectively, during the two years of experiment. Adults of A. cajennenseoccurred on animals throughout the year with an increase in population density from Septemberto April. A total of 1213 ticks were individually processed by the hemolymph test with Gimenezstaining and being all sample negative. By polimerase chain reaction (PCR) targeting afragment of the rickettsial gene gltA only two adults A. cajennense ticks (one male and onefemale) and four pools of 5 nymphs showed the expected products. The DNA sequencing of twoadults A. cajennense ticks showed 100% identity to the corresponding sequences of the R.rickettsii genes fragments gltA, OmpA and OmpB available in Gen Bank. The DNA sequencingof four pools of nymphs showed 99, 7% identity to the corresponding sequences of theRickettsia tamurae genes fragments gltA available in Gen Bank. This results showed one moretime molecular evidence for the presence of R. rickettsii in populations of A. cajennense inCoronel Pacheco and suggest the identification of R. tamurae in populations of A. cajennenseand A. dubitatum.

Key-words: Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Rickettsia spp., spotted fever.

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1 INTRODUÇÃO

O gênero Rickettsia compreende bactériasintracelulares obrigatórias que causamvárias doenças zoonóticas em todos oscontinentes habitados por humanos nomundo e são classicamente transmitidasaos humanos por vetores artrópodes queincluem pulgas, piolhos, carrapatos eácaros. As espécies de Rickettsia sãodivididas em três grupos, baseando-se empadrões antigênicos, moleculares eecológicos: (1) o grupo ancestral (GA),composto por Rickettsia bellii e Rickettsiacanadensis associadas a carrapatos; (2) ogrupo do tifo (GT), composto por Rickettsiaprowazekii e Rickettsia typhi associadascom piolhos e pulgas, respectivamente; (3)e o grupo da febre maculosa (GFM) queinclui mais de 20 espécies, a maioriaassociada a carrapatos, com exceção deRickettsia felis e Rickettsia akari associadasa pulgas e ácaros, respectivamente(Labruna, 2006).

No GFM há pelo menos 12 espécies deRickettsia que, comprovadamente, causaminfecções no homem (Rickettsia rickettsii,Rickettsia conorii, Rickettsia africae,Rickettsia parkeri, Rickettsia australis,Rickettsia honei, Rickettsia sibirica,Rickettsia japonica, Rickettsia massiliae,Rickettsia aeschlimannii, R. akari e R. felis)(Raoult et al., 2002). Nas Américas, asespécies causadoras de febre maculosa sãoRickettsia rickettsii, Rickettsia africae,Rickettsia parkeri, Rickettsia felis eRickettsia akari. Recentemente, outrasespécies de Rickettsia do GFM têm sidodescritas em carrapatos nas Américas, compossível associação a casos de febremaculosa em humanos ou animais (Billeteret al., 2007; Apperson et al., 2008; Saito etal., 2008).

A febre maculosa causada pela espécie R.rickettsii, foi primeiramente descrita nosEstados Unidos (EUA), onde a doençarecebeu o nome de Rocky Mountain SpottedFever ou Febre Maculosa das MontanhasRochosas (FMMR) em 1909 por Howard T.Ricketts. Além dos EUA, R. rickettsii ocorreendemicamente no México, Costa Rica ePanamá (Fiebre Manchada) e Colômbia

(Fiebre de Tobia). No Brasil, a doença édenominada de Febre Maculosa Brasileira(FMB) e R. rickettsii tem sido incriminadacomo principal agente etiológico. Casosconfirmados de infecção por R. rickettsii temsido relatados nos Estados do EspíritoSanto (Sexton et al., 1993), Rio de Janeiro(Rozental et al., 2002), São Paulo (Lemos etal., 2001) e Minas Gerais (Galvão, 1988;Galvão, 1996; Galvão et al., 2003). Hátambém um caso confirmado na Bahia nadécada de 1970 (Plank et al., 1979) e, maisrecentemente, de 2002 a 2006, foramdiagnosticados os primeiros casos de febremaculosa nos Estados de Santa Catarina,na região de Blumenau (Madeira eWeisbrich, 2004), Paraná (São José dosPinhais) e Rio Grande do Sul (região deSerro Grande) 1.

Os carrapatos da espécie Amblyommacajennense são incriminados como oprincipal vetor da FMB. Tal fato é reforçadopelos isolamentos de R. rickettsii nestaespécie de carrapato em Minas Gerais(Moreira e Magalhães, 1935; Dias et al.,1937) e São Paulo (Valejo-Freire, 1946)além de várias associações de ocorrênciade FMB em locais com altas infestações deA. cajennense (Horta et al., 2004; Sangioniet al., 2005). Menos prevalente, mas nãomenos importante, tem-se ainda no Brasil aespécie Amblyomma dubitatum que tambémparece ter um papel importante no cicloenzoótico de R. rickettsii. Observações daecologia da febre maculosa em áreasendêmicas do Estado de São Paulosugerem o potencial papel das capivarascomo reservatórios naturais de R. rickettsiina natureza (Labruna et al., 2004a). Nestasáreas, a maioria dos casos de FMB estáquase sempre relacionada ao aumentopopulacional de capivaras que são um dosprincipais hospedeiros primários do estádioadulto do carrapato A. cajennense ehospedeiro quase que exclusivo de A.dubitatum. Além disso, embora não hajacomprovação do papel do carrapato A.dubitatum na transmissão de FMB, adetecção de riquétsias do GFM nessaespécie de carrapato tem levado a suspeitar 1 Comunicação pessoal fornecida por Martins, E.C. em 17 de março de 2004.

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de um possível papel na epidemiologia dafebre maculosa em áreas endêmicas.

A febre maculosa pode ser consideradauma zoonose reemergente no Brasil, comuma elevada taxa de letalidade parahumanos, principalmente quando nãodiagnosticada precocemente, e asinformações sobre o ciclo da doença nanatureza ainda possuem muitas lacunas.Dessa forma, torna-se importante oconhecimento da epidemiologia de regiõescom potencial biótico para odesenvolvimento da doença bem como adeterminação das condiçõessocioeconômicas da população, dadistribuição e densidade dos vetores jáincriminados como transmissores, dascondições ecológicas das localidades e dasespécies silvestres relacionadas comohospedeiros. A influência dos fatoresclimáticos e ambientais regula em grandeparte, a dinâmica populacional dessesvetores, possibilitando um momento definidode intervenção, visando à quebra do cicloparasitário quando já instalado. Deve-sesalientar que aspectos importantes ligadosao ambiente socioeconômico são maisevidentes quando se analisa a coevoluçãoda população brasileira e o crescimento dosplantéis de equinos e bovinos. Esse fatopermite inferir que o crescimento daspopulações potencialmente parasitáveis têmproporcionado a A. cajennense umacrescente fonte de recursos alimentares queresulta no aumento de sua população.

Em Minas Gerais, a febre maculosa passounovamente a ser descrita a partir da décadade 80 sob a forma epidêmica e em”clusters”, ou seja, ocorrendo vários casosem uma mesma residência, além de casosisolados. Do ponto de vista epidemiológicolevantaram-se várias hipóteses comodeterminantes do ressurgimento da doença,entre elas, a invasão de focos naturais e adisseminação da doença a partir da ação dohomem nesses focos (Silva e Galvão,2004). A década de 80 e início da décadade 90 caracterizaram-se pelo aparecimentode casos em áreas periurbanas do Vale doRio Doce, como foi o caso de Caratinga em1992, o que pareceu indicar uma expansão

da doença devido a um novoreordenamento ecológico, sendo aindadecorrência do modo de vida dessaspopulações marginalizadas no contextosocioeconômico (Galvão, 1996). Aindasegundo Silva e Galvão (2004), no períodode 1990 a 1994, o Estado de Minas Geraisapresentou uma incidência da ordem de0,35 casos por 100.000 habitantes, maior nosexo masculino, na faixa etária de 5 a 14anos e entre os meses de maio e outubro,com uma letalidade de 10%. De 1995 a2003, no entanto, 106 casos foramconfirmados com uma letalidade de 18%.Atualmente, as áreas do Estado com maiorincidência de casos são a da RegiãoMetropolitana de Belo Horizonte, Zona daMata, Central e Vales do Mucuri, do Aço edo Rio Doce.

A cidade de Juiz de Fora, considerada amaior da Zona da Mata Mineira, teve seuprimeiro caso notificado em 1995 e no anode 2006 já era a cidade com maior númerode casos notificados no Estado, com seisocorrências e dois óbitos. No ano de 2007foram quatro notificações com dois óbitos eem 2008 um caso com óbito (Secretaria deEstado da Saúde de Minas Gerais). Éimportante ressaltar que todos os casosocorreram em bairros da periferia da cidade,normalmente dentro da mesma família eassociados a trabalhadores rurais,apontando para o aspecto socioeconômicoda doença. Outra área relevante é CoronelPacheco, município localizado dentro damicrorregião de Juiz de Fora, que além deum caso humano de FMB confirmadolaboratorialmente em um residente no anode 2000 (Secretaria de Estado da Saúde deMinas Gerais), traz em seu históricocoabitação de animais domésticos, comoequinos, bovinos e caninos, e silvestres,como capivaras, e a identificação ecaracterização molecular de R. rickettsii emcarrapatos A. cajennense de origem local,pela primeira vez no Brasil e na AméricaLatina (Guedes et al., 2005). Na época, otrabalho acima citado foi realizado na regiãonum período limitado de tempo (outubro de2003 a abril de 2004) onde foram coletadosapenas exemplares adultos de vida livre decarrapatos das espécies A. cajennense e A.

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dubitatum já que se tratava do período deverão e, larvas e ninfas encontram-se emnúmero muito reduzido ou ausentes nessaestação. Neste contexto, visando ampliar oconhecimento epidemiológico no que dizrespeito à FMB, seus agentes e vetores naárea, o presente estudo teve como objetivogeral:

• Estudar a distribuição de riquétsiasno município de Coronel Pacheco,Minas Gerais, através doconhecimento da dinâmicapopulacional de carrapatos dasespécies A. cajennense e A.dubitatum nas fases de vida livre eparasitária e da utilização detécnicas moleculares paraidentificação e caracterização dosagentes riquetsiais presentes nestaárea, durante um período de doisanos.

Como objetivos específicos o trabalho visou:• Estudar a dinâmica populacional de

larvas, ninfas e adultos decarrapatos das espécies A.cajennense e A. dubitatum,coletados nas fases de vida livre ede vida parasitária.

• Testar a eficiência de duasarmadilhas utilizando fontesalternativas de dióxido de carbonopara a coleta de estádios de vidalivre de carrapatos das espécies A.cajennense e A. dubitatum.

• Estudar a frequência de riquétsiasem carrapatos das espécies A.cajennense e A. dubitatum.

• Caracterizar molecularmente asriquétsias encontradas a partir decarrapatos infectados.

2 LITERATURA CONSULTADA

2.1 Epidemiologia de A. cajennense

A espécie A. cajennense é uma das maisprevalentes e apresenta ampla distribuiçãopelo continente americano. Ocorre ao suldos EUA espalhando-se pelo México,

América Central e Caribe, disseminando-sepela América do Sul, especialmente aolongo da costa do Atlântico (Robinson,1926). No Brasil, embora um grande númerode exemplares seja encontrado na regiãoSudeste, apresenta ampla distribuiçãoocorrendo em todo o território nacional(Rozental et al., 2002).

O carrapato estrela, como é conhecidopopularmente, tem ciclo trioxênico e nãoapresenta comportamento sexualpartenogenético fazendo com que o machotenha um papel fundamental naperpetuação da espécie (Oliveira, 2004). Éencontrado com maior frequênciaparasitando equídeos, entretanto, emvirtude de sua baixa especificidadeparasitária, pode infestar outros mamíferoscomo bovídeos, cervídeos, canídeosdomésticos e silvestres, além de aves e opróprio homem (Oliveira, 1998). Essa maiorimportância dos equinos pode ser avaliadapela grande capacidade de albergar altasinfestações. Em condições naturais, umúnico equino pode se apresentar parasitadopor mais de 50 mil larvas, ou mais de 12 milninfas ou mais de dois mil adultos de A.cajennense (Labruna, 2000). Embora A.cajennense tenha uma baixa especificidadeparasitária, para que uma população estejaestabelecida numa área, há dois pontoscríticos a serem considerados: (1) apresença de hospedeiros primários e (2)condições ambientais favoráveis às fases devida livre do carrapato. Para A. cajennense,os hospedeiros primários são os equinos, asantas e as capivaras (Labruna et al., 2001).Numa área onde uma população de A.cajennense está estabelecida, pelo menosuma destas três espécies de hospedeirosvertebrados deverá estar presente. Uma vezque a população de carrapatos cresce, elapassa a parasitar outros hospedeiros. Naliteratura há diversos relatos do parasitismode A. cajennense em dezenas de espéciesde mamíferos e aves. Como regra geral,quanto maior a população de A. cajennensenuma determinada área, maior a chance deencontrá-lo parasitando outras espécies dehospedeiros, inclusive humanos (Labruna etal., 2001). Na região de Campinas, SãoPaulo, num estudo para levantamento dasespécies de carrapatos, A. dubitatum

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apareceu em frequência similar a A.cajennense. Nessas áreas não havia apresença de equinos sendo as capivaras oshospedeiros primários predominantes paraA. cajennense (Souza et al., 2006). Emalgumas áreas, mesmo na abundância dehospedeiros primários para A. cajennense,esse pode não se estabelecer em função decondições ambientais que não propiciem ummicroclima adequado para as fases de vidalivre do carrapato. Populações de A.cajennense podem sobreviver em áreasonde não existam equídeos, parasitandovárias espécies de animais silvestres,principalmente, em áreas de pastagens“sujas” ou de cobertura vegetal mais densa,as quais esses hospedeiros silvestresfrequentam com mais assiduidade. Poroutro lado, áreas de pastos limpos limitam oestabelecimento deste carrapato, mesmo naabundância de hospedeiros primários(Labruna et al., 2001).

Por sua total dependência do sangue e dostecidos de seus hospedeiros, tais carrapatosatuam como vetores de uma série deagentes infecciosos, entre eles protozoários,vírus e bactérias. A. cajennense estárelacionado à transmissão de Cowdriaruminantium no Novo Mundo (Uilemberg etal., 1984) e de Ehrlichia bovis no Brasil(Massard, 1984) a bovinos. Subsídios sobreos prejuízos induzidos por A. cajennenseforam relatados por Cunha (1979) sobre opoder toxicóforo deste carrapato paracoelhos. A picada é dolorosa podendocausar severa reação local acompanhadade febre e estresse, tanto no homem comonos animais. Estes últimos, devido aoparasitismo, podem apresentar significativaqueda na produção e produtividade, alémda depreciação da qualidade do couro(Oliveira, 2004; Cunha, 2006).

Além da sua importância do ponto de vistaeconômico-zootécnico nos sistemas deexploração animal, A. cajennense tambémse destaca na saúde pública, já que éincriminado como o principal vetor ereservatório de R. rickettsii, agenteetiológico da FMB, a qual é transmitidatransovarianamente à sua progênie, o que otorna simultaneamente vetor e reservatórioda doença (Lemos et al., 1997). A

transmissão do patógeno também podeocorrer a partir das larvas para ninfas edestas para os adultos caracterizando atransmissão transestadial (Pereira eLabruna, 1998). Carrapatos A. cajennenseinfectados com R. rickettsii já foramcomprovadamente identificados no México(Bustamante e Varela, 1947), no Panamá(Rodaniche, 1953), na Colômbia (Patino-Camargo, 1941) e no Brasil (Guedes et al.,2005).

Segundo Oliveira (1998), a distribuiçãosazonal do carrapato dos equinos édeterminada pelas condições do ambientenatural e social, resultando emcomportamento epidemiológico diferenciadopara os diversos ecossistemas.

Assim, Smith (1975) em um estudo sobre adistribuição sazonal de A. cajennense emTrinidad e Tobago, assinalou apredominância dos estádios imaturos naestação seca do ano (novembro a março) eenfatizou a redução dos ixodídeos noperíodo chuvoso.

Guglielmone e Hadani (1982), por sua vez,observando a distribuição sazonal de trêsespécies de carrapatos do gêneroAmblyomma coletados de bovinos nonoroeste da Argentina, encontraram asmaiores infestações por larvas e ninfas deA. cajennense durante as estações secas(outono e inverno) e por adultos durante overão.

Estudos realizados na Região Sudeste doBrasil têm demonstrado que esta espécietem um ciclo anual, isto é, odesenvolvimento de apenas uma geraçãopor ano, com picos populacionais bemdefinidos ao longo do ano para cada estádiode desenvolvimento.

Moreno (1984) observando a incidência deixodídeos em bovinos de leite e suaprevalência em animais domésticos daRegião Metalúrgica de Minas Gerais relatouque as espécies mais frequentes foramBoophilus microplus, A. cajennense eAnocentor nitens. A maior ocorrência delarvas de A. cajennense se deu nos mesesde abril a julho, de ninfas nos meses de

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junho a outubro e de adultos no período deoutubro a junho.

Cunha (1986) estudando sobre oparasitismo por A. cajennense em bovinosleiteiros no Estado do Rio de Janeiroobservou que ninfas e adultos desteixodídeo ocorreram durante todo o ano eque a intensidade do parasitismo tende aatingir seu ponto máximo em julho paraninfas e em novembro para as formasadultas.

Souza e Serra-Freire (1992) estudando avariação sazonal dos estádios adultos de A.cajennense e A. nitens, como parasitas decavalos, no município de Itaguaí no Estadodo Rio de Janeiro verificaram que asmaiores infestações por A. cajennenseocorreram de outubro a maio e as menoresde junho a setembro durante todo o períodode investigações.

Com relação à fase não parasitária de A.cajennense e A. nitens, ainda no municípiode Itaguaí, Souza e Serra-Freire (1994a)encontraram as maiores infestações daspastagens por larvas de A. cajennense nosmeses de maio a setembro, no primeiro anoe de junho a setembro no segundo ano doexperimento; ninfas foram observadas dejulho a novembro, nos dois anos doexperimento e adultos, de outubro a maio ede janeiro a abril, no primeiro e segundoano, respectivamente.

Em Paracambi, Estado do Rio de Janeiro,Souza e Serra-Freire (1994b) analisando afase não parasitária de A. cajennense e B.microplus observaram que as maioresinfestações das pastagens por larvas de A.cajennense ocorreram de junho a setembro,por ninfas de julho a setembro e por adultosde fevereiro a abril. Observaram ainda que ofato da ocorrência de larvas e ninfas naspastagens apresentar índices muitopróximos de zero nos períodos de outubro amaio e de novembro a junho,respectivamente, provavelmente indica queocorra apenas uma geração deste carrapatopor ano.

Lemos et al. (1997) no Estado de SãoPaulo, em um estudo da dinâmica

populacional, demonstraram que adultos deA. cajennense foram colhidos durante todoo ano, com picos nos meses de fevereiro emarço. Larvas foram encontradas entremarço e agosto e ninfas foram maisabundantes entre os meses de junho esetembro com pico populacional no mês deagosto.

Oliveira et al. (2000 e 2003) analisando, emum extenso estudo de dois anos deduração, a ecologia de A. cajennense, tantoem vida livre quanto em vida parasitária noEstado de Minas Gerais, concluíram que aslarvas deste carrapato apresentam suamaior população entre os meses de abril eagosto, com pico populacional em maio,sendo que no restante do ano, ocorrem emnúmero muito reduzido ou mesmocompletamente ausentes na vegetação.Ninfas foram coletadas de junho a outubro,com pico populacional em julho, tanto naspastagens quanto na sua forma parasitária,nos dois anos de duração do experimento.O estádio adulto foi encontrado durante todoo ano nas pastagens e parasitando osanimais, no entanto, no períodocompreendido entre setembro e março,foram observadas as maiores densidadespopulacionais da fase adulta de A.cajennense.

No Estado de São Paulo, Labruna et al.(2002) realizaram um estudo sobre adinâmica sazonal de A. cajennenseavaliando as infestações naturais deequinos mantidos a pasto. Os autoresobservaram que este carrapato apresentapicos distintos de atividade para cada um deseus estádios parasitários e um padrãodefinido de uma geração por ano. Larvas deA. cajennense predominaram de abril ajulho e ninfas de junho a outubro. A faseadulta ocorreu predominantemente deoutubro a março.

Este padrão cíclico anual do carrapato naRegião Sudeste do Brasil parece estarcontrolado primariamente pela realização dediapausa comportamental pelas larvas nãoalimentadas existentes nas pastagensdurante os meses de verão (Labruna et al.,2003; Cabreira, 2008), fato estecomprovado pela ausência ou ocorrência

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em número muito reduzido de larvas noambiente na primavera e verão. Os autoresobservaram em seu estudo que ofotoperíodo e as varáveis climáticas como atemperatura e a umidade relativa do ar,apresentam uma correlaçãoestatisticamente significativa com asinfestações do carrapato.

Segundo Belezerov (1982), as atividadesdos ixodídeos são marcadas por ritmossazonais que alternam períodos de picos deatividades como a busca pelo hospedeiro,ingurgitamento, postura de ovos, etc., comperíodos de dormência em sincronia com asestações do ano para regulação do seuciclo de vida. O autor relata que as espéciesde carrapatos que apresentam uma únicageração por ano, tendem a apresentardiapausa nas suas fases ainda nãoalimentadas.

Um outro dado importante com relação àepidemiologia de A. cajennense é amarcante presença de machos nãoalimentados que pode ser observada maiscedo parasitando os animais, antes mesmodo aparecimento das fêmeas (Oliveira,2004). Observa-se uma elevação nascontagens de machos sobre o número defêmeas no início do período deaparecimento de adultos, já no final daestação de inverno e começo da primavera.Nos meses subsequentes o que se observaé uma redução gradativa do número demachos em relação ao número de fêmeas,com tendência ao equilíbrio na relação entreos sexos desta espécie de carrapato. Oautor afirma ainda que a presença demachos precedendo o aparecimento defêmeas está, possivelmente, relacionada ànecessidade dos machos de encontraremseus hospedeiros mais cedo para realizar orepasto sanguíneo e, assim, produzirferomônios que vão possibilitar a atraçãodas fêmeas para os animais.

2.2 Epidemiologia de A. dubitatum

Se o número de estudos existentes sobre abioecologia de A. cajennense em nossopaís que visem expor com maior realidade

os aspectos intrínsecos ao comportamentodeste parasita é reduzido, para A. dubitatumtorna-se mais escasso ainda. SegundoAlmeida et al. (2001), os carrapatos deanimais silvestres na América do Sul, comoé o caso de A. dubitatum, por exemplo,ainda não são bem estudados,principalmente no que diz respeito ao seuciclo biológico em laboratório ou sobcondições naturais. Os poucos estudosdisponíveis são relativos à presença denovos hospedeiros.

Esta espécie de carrapato está presente donorte ao sul da América do Sul e no Brasil érelatado nos estados das Regiões Sudeste,Sul e Centro-Oeste (Camargo-Neves, 2004).Não há qualquer comprovação do papel docarrapato A. dubitatum na transmissão dequalquer espécie de riquétsia para humanose a sua possível participação naepidemiologia da FMB. Entretanto, Lemos etal. (1996) relataram o primeiro isolamentode uma riquétisa do GFM, a partir de umexemplar dessa espécie de carrapatocoletado de capivara, no município dePedreira, São Paulo, contudo não houvedescrição da espécie de riquétsiaencontrada.

Embora as capivaras, abundantes emmuitas áreas endêmicas para FMB, sejamconsideradas hospedeiros primários paratodos os estádios parasitários (larva, ninfa eadulto) do carrapato A. dubitatum, osestádios de larva e ninfa apresentam menorespecificidade parasitária, podendo sealimentar em diversas espécies dehospedeiros em laboratório e em condiçõesnaturais (Labruna et al., 2004b), inclusivecom relatos de parasitismo em sereshumanos (Famadas et al., 1997; Labruna etal., 2007). Desta forma, é lógico indagar seesta espécie de carrapato pode se infectarpor alguma riquétsia patogênica ao homem,ou se seria possível sua participação natransmissão desse agente aos sereshumanos. No entanto, não se sabe afrequência com que esse parasitismo possaocorrer, uma vez que não existe literaturaadequada para uma precisa identificaçãotaxonômica de larvas e ninfas das espéciesdo gênero Amblyomma no Brasil, o quedificulta o relato de parasitismo humano por

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essas fases de vida do carrapato (Labrunaet al., 2004c).

Labruna et al. (2004a), com objetivo deverificar o papel de A. dubitatum no cicloenzoótico de R. rickettsii, avaliaram ainfecção por Rickettsia spp. em 40carrapatos coletados no município dePedreira, São Paulo, tendo encontrado DNAde R. bellii em 16 carrapatos (40%), e outrostrês carrapatos (7,5%) positivos para umariquétsia do GFM, denominada amostraCOOPERI (=R. parkeri). Apesar de essesautores obterem o isolamento da amostraCOOPERI em células Vero, o isolado foiperdido após a terceira passagem. Apesardisso, o fato das análises molecularesiniciais mostrarem que a amostra COOPERIé filogeneticamente próxima de R. africae,R. parkeri e R. sibirica e, como todas essastrês espécies causam doenças do tipo febremaculosa em humanos em diferentespaíses, é possível suspeitar que a amostraCOOPERI possa também estar causandoeste tipo de doença no Brasil.

Estrada et al. (2006), objetivando adetecção de riquétsias em carrapatos dogênero Amblyomma coletados no municípiode Campinas, considerado uma regiãoendêmica para FMB no Estado de SãoPaulo, processaram 1.078 exemplares decarrapatos, dos quais 131 eram A.dubitatum, tendo observado através da PCRe sequenciamento somente infecção por R.bellii na população de carrapatosestudados.

Pacheco (2007) com o objetivo de obterisolados de Rickettsia spp. para confirmaras evidências sobre o papel do A. dubitatumna transmissão de riquétsias do GFM noBrasil, realizou a avaliação da presença deriquétsia em carrapatos da espécie A.dubitatum no município de Pedreira, SãoPaulo. Foi coletado um total de 841 (367machos e 474 fêmeas) carrapatos adultosda espécie A. dubitatum os quais foramsubmetidos ao teste de hemolinfa, àextração de DNA e à técnica da PCR para ogene gltA, presente em todas as espéciesde riquétsias. Dos 841 A. dubitatum, umtotal de 378 (44,94%) amostras forampositivas para o gene gltA e, posteriormente,

foram testadas para o gene ompA, presentesomente em riquétsias do GFM, sendo quenenhuma das amostras foi positiva. Dos 378A. dubitatum positivos na PCR, o produtoamplificado de 93 foi sequenciado, sendotodos identificados como R. bellii de acordocom sequências disponíveis no Gen Bank.

Com relação à distribuição sazonal de A.dubitatum, Souza et al. (2006) avaliando ocomportamento de carrapatos de vida livrena mata ciliar de uma área endêmica parafebre maculosa na região de Campinas, SãoPaulo, observaram uma alta infestação delarvas do gênero Amblyomma na maioriados meses de estudo, atribuindo ao A.dubitatum os picos ocorridos de novembro amarço. Ninfas do gênero Amblyommaocorreram durante todos os meses do ano,sendo mais abundantes de julho adezembro, atribuindo os picos ocorridos noprimeiro semestre do ano à espécie A.dubitatum. Já os adultos apresentaram osmaiores picos a partir de agosto comdeclínio a partir de março.

2.3 Epidemiologia de R. rickettsii

R. rickettsii é o agente etiológico da maisgrave riquetsiose das Américas, chamadano Brasil de FMB ou febre do carrapato. Oagente da febre maculosa está intimamenteassociado a diversas espécies decarrapatos e com seus hospedeirosvertebrados. A incidência da doença emhumanos, que não servem comoreservatórios, depende, em grandeproporção, dos vetores, sua distribuição eecologia (Lemos, 1991). Assim, adistribuição geográfica da febre maculosacorresponde a dos seus vetores, além dedepender de uma complexa interação dedensidade populacional e ciclos anuais doscarrapatos e hospedeiros vertebradosenvolvidos. Nos vertebrados, incluindohumanos, R. rickettsii se multiplica emcélulas endoteliais; nos carrapatos, vetoresda doença, a bactéria causa infecçãodisseminada, multiplicando-se em célulasdos intestinos, ovários, glândulas salivares,túbulos de Malpighi e hemolinfa (Yu eWalker, 2003).

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Lemos (1991) ainda afirma que na febremaculosa, a curta duração da circulação deR. rickettsii no sangue dos pequenosmamíferos hospedeiros suscetíveis enfatizao papel dos carrapatos como reservatórios.Dessa forma, a relação dos carrapatos comas riquétsias é extremamente importantepara a manutenção dos microrganismos nanatureza.

Os carrapatos vetores de R. rickettsii parahumanos conhecidos até o momento são:Dermacentor andersoni, Dermacentorvariabilis e Rhipicephalus sanguineus nosEUA (Demma et al. 2005); R. sanguineus eA. cajennense no México (Bustamante eVarela, 1947); A. cajennense no Panamá(Rodaniche, 1953); A. cajennense naColômbia (Patino-Camargo, 1941); A.cajennense e Amblyomma aureolatum noBrasil (Guedes et al., 2005; Pinter eLabruna, 2006).

Segundo Philip e Burgdorfer (1961), apósum carrapato infectar-se com uma riquétsiadurante sua alimentação sanguínea, nodécimo dia aproximadamente, pode ocorreruma infecção completa com disseminaçãodo microrganismo para todos os tecidos,principalmente para as glândulas salivares eovários. A partir de um indivíduo, outrospodem tornar-se infectados através datransmissão vertical ou transovariana, datransmissão transestadial, além dapossibilidade de alimentação simultânea decarrapatos infectados com os não infectadosem animais com suficiente riquetsemia.

Considerando-se que um grande número decarrapatos suscetíveis a R. rickettsii venhaeventualmente parasitar mamíferoshospedeiros com suficiente riquetsemia eque outros carrapatos possam se tornarinfectados através da transmissãotransovariana, é de se esperar um índiceelevado desses artrópodes infectados nanatureza. Porém, diversos estudosdemonstram que os índices de infecção sãogeralmente baixos, mesmo considerando apresença de outras riquétsias do GFM (Elliotet al., 1990).

Nem sempre a relação entre R. rickettsii eseus hospedeiros artrópodes é inócua. A

infecção no carrapato, por exemplo, podeser incompleta abortando, assim, atransmissão de riquétsia. Pode ocorrerainda, mesmo com a infecção completa deriquétsia no carrapato, redução daviabilidade, da fecundidade e até mesmo,morte do artrópode após algumas gerações,contrariando o conceito de que o vetor serveindefinidamente como reservatório (McDadee Newhouse, 1986). Segundo Burgdorfer(1988), embora a bactéria também sejatransmitida hereditariamente entre geraçõessucessivas de uma população decarrapatos, apenas este mecanismo nãoseria suficiente para mantê-la ativa ao longodo tempo, uma vez que há evidênciaslaboratoriais de que R. rickettsii épatogênica para o carrapato vetor.

Niebylski et al. (1999) utilizando algumascepas virulentas de R. rickettsii emcarrapatos D. andersoni, observaram quecerca de 98% das ninfas infectadas na fasede larva morreram durante a ecdise. Dosadultos infectados na fase de ninfa, 34,9%morreram na ecdise e daqueles quesobreviveram, 88,3% das fêmeas nãoconseguiram se alimentar e os autoresconcluíram que o efeito letal de R. rickettsiiexplica, pelo menos em parte, a baixa taxade infecção dos carrapatos adultos acampo.

A ecologia de R. rickettsii torna-se maiscomplexa ainda com a existência de outrasriquétsias do GFM, de patogenicidadedesconhecida que foram isoladas decarrapatos e que podem atuar como fatorlimitante da infecção de R. rickettsii nestesvetores. Acreditava-se que um carrapatopreviamente infectado por uma espécie deriquétsia tornava-se incapaz de manter etransmitir uma segunda espécie de riquétsia(Macaluso et al., 2002). No entanto,Carmichael e Fuerst (2006) mostraram asuperinfecção de um carrapato D. variabiliscoletado no ambiente em Ohio, EUA, por R.bellii, R. montanensis e R. rickettsii.

Dessa forma, o efeito amplificador quealguns animais silvestres desempenhamdeve existir para garantir a manutenção dabactéria na natureza. Nesse caso, ohospedeiro amplificador mantém a bactéria

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em níveis altos em sua corrente sanguíneapor alguns dias ou semanas, garantindo quenovos carrapatos se infectem amplificando ainfecção por R. rickettsii na população decarrapatos (Burgdorfer, 1988).

Segundo Labruna (2006), para que umaespécie de vertebrado seja considerada umbom hospedeiro amplificador de R. rickettsiina natureza ela: (1) deve ser abundante naárea endêmica para a febre maculosa; (2)deve ser um bom hospedeiro do carrapatovetor em condições naturais; (3) deve sersuscetível à infecção por R. rickettsii; (4)deve manter R. rickettsii circulante em níveisplasmáticos suficientes para infectarcarrapatos que se alimentem nela e (5) deveter uma alta taxa de renovaçãopopulacional.

Em relação à transmissão da febremaculosa nos EUA, considera-se que R.rickettsii mantém seu ciclo vital na natureza,entre o carrapato vetor (D. andersoni e D.variabilis) e algumas espécies de pequenosroedores (Microtus pensilvanicus, Pitymuspinetorum, Peromyscus leucopus eSigmodon hispidus) que são consideradosos principais hospedeiros amplificadoresnaquele país (McDade e Newhouse, 1986;Burgdorfer, 1988).

Embora diferentes trabalhos realizadosdesde a década de 1930 tenham levado asuspeitas das capivaras, gambás e coelhossilvestres como possíveis hospedeirosamplificadores de R. rickettsii para A.cajennense no Brasil, apenas,recentemente, foi comprovada a importânciadestes dois primeiros no ciclo silvestre daFMB (Souza et al., 2009; Horta et al., 2009).Ainda sim, a incidência da FMB causada porR. rickettsii parece ser esporádica apesar dasua aparente ampla distribuição emreservatórios animais e carrapatos.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local e duração do experimento

O presente trabalho foi realizado em umaárea de pastagem da fazenda da Embrapa

Gado de Leite no Campo Experimental deCoronel Pacheco (CECP) (21°35’ S, 43°15’W), Minas Gerais, Brasil, a 435m de altitude(Figura 1), de maio de 2006 a abril de 2008.

A região apresenta uma estação seca demaio a outubro e uma estação chuvosa denovembro a abril, com temperaturasvariando de 16°C no inverno a ≥ 23°C noverão (Antunes, 1986). É uma área devárzea recortada em toda sua extensão porum pequeno rio, no qual quase sempre épossível se observar trilhas e grupos decapivaras atraídas pela disponibilidade dealimento oriunda das plantações de milho ecana-de-açúcar do campo experimental.Nos campos gramados há a presença debovinos de leite e em alguns pontos,bovinos mestiços, bem como cavalos quesão utilizados no trabalho diário da fazenda,seja puxando carroças ou para montaria dospeões. Também não é raro de se ver algunscães errantes perambulando pela área.Dessa forma, o referido local foi escolhidoem virtude de haver a presença de bovinos,equinos, caninos e capivaras convivendo namesma região, pela confirmação laboratorialde um caso de febre maculosa ocorrido emum humano residente (Secretaria de Estadoda Saúde de Minas Gerais) e pelaidentificação e caracterização molecular deR. rickettsii em carrapatos adultos de vidalivre da espécie A. cajennense coletadosnesta área de pastagem em estudo anterior(Guedes et al., 2005).

A segunda parte do experimento, quecompreende os exames laboratoriais, foirealizada no Laboratório de Parasitologia dasede da Embrapa Gado de Leite em Juiz deFora, Minas Gerais, e no Laboratório deDoenças Parasitárias da Faculdade deMedicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) daUniversidade de São Paulo (USP). NaEmbrapa foram realizados os testes dehemolinfa nos carrapatos,concomitantemente, com as coletas destes,ou seja, no período de maio de 2006 a abrilde 2008. Já na USP foram realizados ostestes biomoleculares no período de agostode 2007 a janeiro de 2009.

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Coronel_Pacheco

Figura 1 - Localização do município de Coronel Pacheco, Minas Gerais, área endêmica paraFMB e local de coleta de carrapatos.

3.2 Animais do experimento

Foram utilizados para a observação daflutuação populacional da fase de vidaparasitária de A. cajennense, 22 cavalospertencentes à tropa de trabalho do CECP,sem raça definida, de idades e pelagensvariadas. Estes animais foram mantidos emregime de pasto sob exposição natural a A.cajennense e recebendo banhos à base depiretróide (cipermetrina 15%) 2 sempre quenecessário.

Para avaliação da flutuação populacional dafase de vida parasitária de A. dubitatum,seriam capturadas capivaras de vida livrepresentes no CECP, mas mesmo com aautorização do Instituto do Meio Ambiente

2 Colosso ® (Laboratório Ouro Fino)

(IBAMA) em mãos, não foi possível arealização dessa parte do experimento emvirtude de problemas burocráticos queindependiam da nossa vontade.

3.3 Coleta de estádios em vida livre

Os estádios de vida livre dos carrapatos A.cajennense e A. dubitatum foram coletadosda pastagem a cada 14 dias de intervalosempre pela manhã, utilizando-se a técnicade arraste de flanela para captura de larvas(Oliveira et al., 2000) e armadilhas de CO2,duas de gelo seco (Oliveira et al., 2000) eduas químicas (Cançado et al., 2008), paracaptura de ninfas e de adultos.

A captura por arraste de flanela consistiu nautilização de uma flanela branca com

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dimensões de 1,50 m de comprimento por0,90 m de largura, com duas barras de ferrode 1,0 m de comprimento, transpassadasem presilhas feitas em cada extremidade damesma com o objetivo de manter a flanelaaberta e o mais próximo possível dapastagem.

Na captura com armadilhas de CO2 utilizou-se 500 g de gelo seco em pequenospedaços como fonte de CO2, colocados nointerior de uma caixa de isopor de dois litrose com orifícios laterais de 0,5 cm dediâmetro. Esta caixa foi exposta duranteuma hora sobre uma flanela brancamedindo 100 cm de largura por 100 cm decomprimento (1,0 m2 de área) estendida napastagem nos dias de coleta. A cada 10minutos, aproximadamente, o gelo seco erasoprado no intuito de aumentar a área deexpansão do CO2 e, consequentemente,atrair mais carrapatos para o local. Nasbordas da flanela foi colocada fita dupla facepara que os carrapatos ali atraídos nãopudessem escapar (Figura 2).

Com relação às armadilhas químicas(Cançado et al., 2008), a partir de umareação química simples foi possívelestabelecer uma fonte segura e contínua deCO2 utilizando ácido lático a 20% (C3H6O3) ecarbonato de cálcio (CaCO3). Em cadaarmadilha foi necessária uma proporção de400 ml de ácido para cada 250 g decarbonato. A fabricação das armadilhasconsistiu no uso de dois vasilhamesplásticos de 500 ml de volume de usodoméstico, colocados um sobre o outro.Fez-se uma perfuração que atravessou ofundo do vasilhame superior e a tampa dovasilhame inferior, permitindo o gotejamentodo ácido lático do vasilhame superior para oinferior. No vasilhame inferior foram feitasperfurações laterais de 0,5 cm de diâmetrode modo a permitir a liberação do CO2produzido na reação química. Estesvasilhames foram expostos durante,aproximadamente, uma hora sobre umaflanela branca medindo 100 cm de largurapor 100 cm de comprimento (1,0 m2 deárea) estendida na pastagem nos dias decoleta (Figura 2).

Figura 2 - Armadilhas de CO2. Gelo seco (A)e química (B).

Uma flanela branca sem qualquer atrativoquímico foi colocada na pastagem nos diasde coleta e serviu como instrumento decontrole da eficácia das armadilhasanteriormente descritas.

3.4 Coleta de estádios em vida parasitária

Para avaliação da flutuação dos estádios devida parasitária de A. cajennense foramempregadas as técnicas de raspagem dosanimais para captura de larvas e ninfas e decontagem de estádios parasitários adultos(Oliveira et al., 2003) a cada 14 dias deintervalo.

A execução da técnica de raspagemconsistiu na escovação de toda superfíciedo lado esquerdo dos animais utilizando-seraspadeira de dentes finos e flexíveis,própria para uso em equinos, com o objetivode remoção de larvas e ninfas ingurgitadasem fase de desprendimento do hospedeiro.Empregou-se um saco plástico, para dentro

A

B

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do qual eram escovados os carrapatos quese desprendiam do equino.

A avaliação de estádios adultos, machos efêmeas, foi realizada por meio de contagenssucessivas de toda superfície do ladoesquerdo do corpo dos equinos, com aremoção de apenas uma parte doscarrapatos. Essa pequena parte, cerca deaproximadamente 10% dos carrapatoscontados, foi removida para posterioranálise biomolecular pela PCR, na buscapor espécimes infectados com riquétsias.Os animais foram contidos em tronco parafacilitar o processo de contagem. Todosadultos de A. cajennense encontradosforam contados e separados por sexo paradeterminar a curva de flutuaçãopopulacional e a relação macho: fêmeadurante os dois anos de observação doexperimento.

Como citado no item 3.2, as capivaras nãopuderam ser capturadas, logo não foipossível a coleta de carrapatos da espécieA. dubitatum em vida parasitária.

3.5 Identificação dos carrapatos

Os carrapatos foram recolhidos eacondicionados em sacos plásticos paraposterior identificação dos exemplares noLaboratório de Parasitologia da EmbrapaGado de Leite. A identificação foi feita como auxílio de um microscópio estereoscópioutilizando-se as chaves de identificação deClifford e Anastos (1960) para larvas e deAragão e Fonseca (1961) para ninfas eadultos (Figuras 3 e 4), após lavagem dosexemplares em água corrente e secagemem papel toalha. Larvas e ninfas foramidentificadas somente ao nível de gênero,devido à inexistência de chavestaxonômicas para identificação de espécies.

3.6 Teste de hemolinfa

Os testes de hemolinfa também foramrealizados no Laboratório de Parasitologiada sede da Embrapa Gado de Leite. Antesda realização do teste de hemolinfa, noentanto, os carrapatos adultos, de vida livree parasitária, foram colocados em umaestufa a 35°C e umidade relativa ≥80% portrês a quatro dias, para incrementar amultiplicação de riquétsias (Labruna et al.,2004a). A partir daí, os carrapatos foramprocessados individualmente, segundo atécnica descrita por Burgdorfer (1970).Cortou-se a porção distal do primeiro par depatas de cada carrapato e coletou-se umagota da hemolinfa em lâminas de vidro. Aslâminas passaram pelo processo desecagem sem o uso de qualquer fixadorpara que não atrapalhasse a visualizaçãode riquétsias e, só então foram coradas pelométodo de Giménez (Giménez, 1964). Aslâminas foram deixadas na solução detrabalho de fucsina básica fenolada porcerca de 1 a 2 minutos e, posteriormente,lavadas em água corrente. Depois foramimersas na solução de oxalato de verde demalaquita cerca de 9 segundos, foramlavadas e mais uma vez imersas no verdede malaquita por 9 segundos. A seguir,foram lavadas novamente e secas em papelabsorvente. As lâminas foram entãoexaminadas em microscópio ópticoutilizando-se objetiva de imersão (100x).

Após realização do teste de hemolinfa,todos os carrapatos foram congelados a -80°C até processamento para análise pelaPCR.

Fotos: Ogrzewalska, M.

Figura 3 - Fêmea (A) e macho (B) de A. cajennense.

Fotos: Ogrzewalska, M.

Figura 4 - Fêmea (A) e macho (B) de A. dubitatum.

A B

A

B

36

3.7 Extração de DNA e análise pela PCR

Os carrapatos foram processados deacordo com a técnica descrita por Labrunaet al. (2004a) para análise pela PCR noLaboratório de Doenças Parasitárias daFMVZ da USP em São Paulo. Para oprocedimento de extração de DNA, osexemplares foram assim divididos: (1)amostras individuais de estádios adultos devida livre; (2) 100 pools de 10 larvas devida livre; (3) 200 pools de 5 ninfas de vidalivre; (4) amostras individuais de estádiosadultos de vida parasitária; (5) 100 pools de10 larvas de vida parasitária e (6) 200 poolsde 5 ninfas de vida parasitária.

Utilizou-se o protocolo de isotiocianato deguanidina (GT) na extração: aos tubosdevidamente identificados contendo osexemplares de carrapatos seccionados e,posteriormente macerados, com auxílio demicropistilos, foram adicionados 150 µL deTE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0),submetidos ao vórtex por 10 segundos.Foram adicionados 450 µl de GT e os tubosforam levados para incubação por 10minutos à temperatura ambiente, comagitação a cada dois minutos e meio. Após,foram adicionados 100 µl de clorofórmio acada tubo e estes foram centrifugados por5 minutos a 14000 rpm (12000 x g). Cercade 400 µl do sobrenadante foramrecuperados de cada tubo aos quais foramacrescentados 600 µl de propanol. Ostubos foram levados ao freezer “over night”e só então foram centrifugados por 15minutos a 4°C a 14000 rpm (12000 x g). Osobrenadante foi desprezado e foramadicionados a cada tubo 800 µl de etanol a70%, sendo novamente levados àcentrifugação por 5 minutos a 4°C a 14000rpm (12000 x g). O sobrenadante foidesprezado e, após secagem do pellet emcada tubo à temperatura ambiente, omesmo foi ressuspendido com 40 µl de TE.

As amostras de DNA extraídas foramprocessadas pela PCR utilizando-se umpar de oligonucleotídeos iniciadores(“primers”) denominados de CS2-78 senso(“forward”) e CS2-323 anti-senso

(“reverse”) que amplifica um fragmento de401 pb do gene citrato sintase (gltA)(Tabela 1) detectado em todas as espéciesde Rickettsia. Amostras positivas comesses primeiros primers foram testadas emnovas baterias de PCRs utilizando osoutros primers mostrados na Tabela 1 queamplificam fragmentos dos genes gltA(Labruna et al., 2004a), OmpA (Regnery etal., 1991) e OmpB (Roux e Raoult, 2000).

Todas as reações da PCR (50 µl de volumefinal) foram realizadas adicionando 5 µl daamostra de DNA a 25,2 µl de água ultrapura e 19,8 µl de mix (dNTPs, tampão eTaq DNA polimerase + MgCl2). Asamostras foram levadas ao termocicladornas seguintes condições: para primersCS2-78 e CS2-323 foi 1 ciclo a 95oC por 3min, 40 ciclos de 15 s a 95oC, 30 s a 50oC,30 s a 72oC, seguidos por 1 ciclo a 72°Cpor 7 min. Para cada reação, três controlesnegativos (5 µl da mesma água usada nomix) e um controle positivo [300 ng de DNAde A. cajennense infectado com R. parkeri(Sangioni et al., 2005)] foram incluídos. Dezmicrolitros dos produtos da PCR foramseparados por eletroforese em gel deagarose a 1,5%, corados com brometo deetídeo e examinados em luz ultravioleta.

Como as ninfas de Amblyomma sp. foramidentificadas somente ao nível de gênero,devido à inexistência de chavestaxonômicas para identificação de espéciespor caracteres morfológicos, foi feita umanova PCR dos pools de ninfas positivaspara o gene gltA utilizando-se ametodologia de amplificação esequenciamento do fragmento do generibossômico mitocondrial 16S (16S rDNA)como descrito por Mangold et al. (1998)para identificação das espécies.

37

Tabela 1- Pares de oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação dos genes deRickettsia sp.

3.8 Clonagem

O produto amplificado do gene OmpB deuma amostra proveniente de um pool deninfas do gênero Amblyomma foi clonadono vetor pCR® 2.1-TOPO do kit TOPO TAcloning® da Invitrogen segundo a técnicadescrita por Cardoso (2004) em virtude dogrande número de reações inespecíficasobservadas após a eletroforese. O vetorpCR® 2.1-TOPO fornecido nesse kit é umplasmídeo de fita dupla linearizado, quecontém genes que conferem resistência àampicilina e à kanamicina e o sistemaoperon Lac Z de Escherichia coli, dentro doqual se encontra o sítio de clonagem. Osítio de clonagem é caracterizado pelapresença de uma timina despareada naextremidade 3’ e uma topoisomerasecovalentemente ligada, sendo o princípiode clonagem baseado na presença de umresíduo de desoxiadenosina na

extremidade 3’ do fragmento da PCR que éadicionado pela atividade terminaltransferase independente de molde daenzima Taq DNA polimerase. As reaçõesforam realizadas de acordo com oprotocolo sugerido pelo fabricante.

A ligação foi feita à temperatura ambientedurante 5 minutos. Foram utilizados 3 µl doproduto da PCR, 1 µl do plasmídeo vetor, 1µl de solução salina (1,2 M NaCl; 0,06 MMgCl2) e 1 µl de água do kit, resultando emum volume final de 6 µl.

Para cada transformação foramadicionados 2 µl do produto de ligação(cerca de 10 ng do plasmídeorecombinante) a 50 µl de célulacompetente. A mistura foi mantida em gelopor 20 minutos e então submetida a umchoque térmico a 42oC por 30 segundos,após o qual, foi novamente transferida parao gelo. Em seguida, foram adicionados 250

Gene Par deoligonucleotídeos

iniciadores

Sequência dosoligonucleotídeos

(5’ - 3’)

Referência Tamanho doproduto

amplificado(pb)

gltA CS2-78

CS2-323

GCAAGTATCGGTGAGGATGTAAT

GCTTCCTTAAAATTCAATAAATCAGGAT

Labruna et al. (2004a)

Labruna et al., (2004a)

401

CS4-239

CS4-1069

GCTCTTCTCATCCTATGGCTATTAT

CAGGGTCTTCGTGCATTTCTT



834

ompA Rr-190.70p

Rr-190.602n

ATGGCGAATATTTCTCCAAAA

AGTGCAGCATTCGCTCCCCCT

Regnery et al. (1991)

Regnery et al. (1991)

512

ompB 120-M59

120-807

CCGCAGGGTTGGTAACTGC

CCTTTTAGATTACCGCCTAA

Roux e Raoult (2000)

Roux e Raoult (2000)

862

16S +1

-1

CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG

CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT

Mangold et al. (1998)

Mangold et al. (1998)

460

38

µl de meio SOC e as células foramincubadas, sob agitação, a 37oC durante 60minutos. Após esse período, as célulasforam plaqueadas em meio LB-ágarcontendo 35 µl de X-gal e 40 µl de IPTG elevadas para incubação a 37oC por,aproximadamente, 18 horas paracrescimento das colônias.

A seleção das colônias recombinantes foifeita visualmente. Cada uma das colôniasde coloração branca (recombinantes) quesurgiram após a transformação foramtransferidas das placas, com auxílio de umpalito estéril, para crescimento em tuboscontendo meio LB líquido e ampicilina (1 µl/ ml). Estes tubos foram incubados a 37oCpor, aproximadamente, 18 horas.

A seleção de crescimento bacterianotambém foi feita visualmente através daturbidez do meio nos tubos. O conteúdodos tubos com crescimento bacteriano foitransferido para tubos de 2 ml, os quaisforam centrifugados por 10 minutos a14000 rpm (12000 x g). O sobrenadante foidescartado e o pellet reservado.

Para confirmação do tamanho do insertodas colônias recombinantes foi feita umaPCR utilizando-se um par de primersdenominados de 120.M59 senso (“forward”)e 120.807 anti-senso (“reverse”) queamplificam um fragmento de 862 pb dosgenes que codificam proteínas externas demembranas de Rickettsia (OmpB) (Tabela1). Com uma ponteira estéril, uma pequenaparte do pellet foi adicionada ao mix daPCR. Dez microlitros dos produtos da PCRforam separados por eletroforese em gel deagarose a 1,5%, corados com brometo deetídeo e examinados em luz ultravioleta.

Para extração do DNA plasmidial foiutilizado o kit Wizard® Plus SV MiniprepsDNA Purification System da Promega. Opellet correspondente a cada tubo foiressuspendido em 250 µl de soluçãocontendo 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HClpH 7,5 e 100 µg/ml RNAse H. Após aressuspensão das células foramadicionados 250 µl de solução de lisecelular e, em seguida, as amostras foramhomogeneizadas por inversão dos tubos e

incubadas à temperatura ambiente por,aproximadamente, 5 minutos, atéclareamento da suspensão celular. Emseguida, foram adicionados 10 µl desolução de proteinase alcalina misturando-se as amostras por inversão, as quaisforam incubadas durante 5 minutos àtemperatura ambiente. Após incubação,foram adicionados 350 µl de solução deneutralização com o objetivo de precipitaros restos celulares, sendo as amostras,imediatamente, homogeneizadas porinversão. O lisado celular resultante foientão centrifugado por 10 minutos a 14000rpm (12000 x g). O sobrenadante foitransferido para uma coluna contendoresina de decantação. Essa coluna foicentrifugada por 1 minuto a 14000 rpm(12000 x g), lavada com 750 µl de soluçãode lavagem e novamente centrifugada nasmesmas condições anteriores. O processode lavagem da coluna foi repetidoutilizando-se 250 µl de solução de lavageme centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm(12000 x g). O DNA plasmidial foi entãoeluído com 100 µl de TE, incubado por 1minuto à temperatura ambiente,centrifugado por 2 minutos a 14000 rpm(12000 x g) e congelado.

3.9 Sequenciamento de DNA

Após a confirmação da positividade daamostra pela PCR pelo gel de agarosecorado com brometo de etídeo, o materialamplificado foi purificado utilizando-se oproduto ExoSAP-IT® (USB® Corporation)conforme instruções do fabricante (7,5 µlda amostra amplificada e 3 µl de ExoSAP).Após a purificação, as amostra foramsubmetidas ao sequenciamento utilizando o“Kit Big Dye 3.1”, de acordo com asinstruções do fabricante (4 µl de DNApurificado – concentração máxima de 100ng, 1 µl de água de mili Q, 0,75 µl de “BigDye”, 1 µl de oligonucleotídeos iniciadoresespecíficos senso e anti-senso (5pmoles/µl) e 3,25 de “Save Money”. Foiutilizado o sequenciador de DNA modeloABI “Prism 3100 Genetic Analyser” (AppliedBiosystems/Perkin Elemer®), segundo omanual de instruções (“Automated DNA

39

sequencing”, 1998). As sequências obtidasforam submetidas ao programa “BLASTanalysis” (Altschul et al., 1990) paradeterminar similaridades com outrasespécies de riquétsia.

3.10 Dados meteorológicos

Dados climáticos referentes à temperaturado ar (mínimas, médias e máximas),índices pluviométricos e umidade relativado ar foram fornecidos pela EstaçãoAgroclimatológica de Coronel Pacheco,Minas Gerais, n° 83037, do 5° Distrito deMeteorologia (DISME), durante o períodode maio de 2006 a abril de 2008.

3.11 Análise estatística

A comparação da eficiência das duasarmadilhas de CO2 testadas foi analisadaempregando-se o teste de t Student.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Dados meteorológicos

Os dados climáticos mensais relativos àstemperaturas médias (mínimas, médias emáximas), umidade relativa e precipitaçãopluviométrica para o município de CoronelPacheco, Minas Gerais, durante o períododo experimento, são apresentados nasFiguras 5 e 6, respectivamente. A regiãoapresenta características de verão chuvosoe inverno seco. As temperaturas médiasnos meses mais frios são inferiores a 18ºCe nos meses mais quentes superiores a22ºC, típicas de clima do tipo Cwa segundoa classificação de Köppen (Antunes, 1986).

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5

10

15

20

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30

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M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A

Meses

Tem

pera

tura

(°C)

T máx T méd T mín

Figura 5 - Temperaturas máximas, médias e mínimas observadas no município de CoronelPacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

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M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M AMeses

Prec

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)

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Umid

ade

Rela

tiva

(%)

Precip Umidade

Figura 6 - Umidade relativa do ar e índices pluviométricos no município de Coronel Pacheco,MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

4.2 Flutuação da população de larvas,ninfas e adultos de vida livre de A.cajennense e A. dubitatum

Durante os dois anos do experimento foramcoletadas 4751 larvas e 2840 ninfas do

gênero Amblyomma através das técnicasde arraste de flanela e armadilha de CO2,respectivamente (Tabela 2).

Tabela 2 - Total de larvas, ninfas e adultos de A. cajennense e A. dubitatum coletados pordiferentes técnicas em Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

Vida Livre Vida Parasitária

Arraste CO2 Flanela Controle Raspagem Contagem

Larvas 4688 63 8800

Ninfas 707 2103 30 1452

A. cajennense 321 7 7022

A. dubitatum 284 8

As larvas de Amblyomma sp. foramcapturadas durante o período de maio aoutubro de 2006, de fevereiro a novembrode 2007 e a partir de março de 2008.Apresentaram picos populacionais bemdefinidos sendo os maiores em maio de2006 representando 58% das larvascapturadas neste ano, abril-maio de 2007com 37%, abril de 2008 com 92% e outubro-novembro de 2007 com 35% (Figura 7).

Ninfas de Amblyomma sp. foram capturadasdurante todos os meses do ano eapresentaram picos populacionais entre osmeses de junho a novembro e densidadepopulacional máxima em julho e outubro-novembro de 2006 com 56% e 31% dasninfas capturadas neste ano,respectivamente, e julho e outubro-novembro de 2007 com 16% e 63%,respectivamente (Figura 7). Os picospopulacionais dos estádios imaturosocorreram, principalmente, durante o outonoe o inverno quando as temperaturas eumidades relativas do ar estavam maisbaixas (Figuras 5 e 6).

-200

0

200

400

600

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1000

1200


Meses

Núm

ero

de la

rvas

e n

infa

s

LarvasNinfas

Figura 7 - Flutuação da população de larvas e ninfas de vida livre de Amblyomma sp. coletadasno município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

Foram coletados 620 carrapatos adultoscom auxílio de armadilhas de CO2, sendo328 identificados como A. cajennense e292 como A. dubitatum (Tabela 2).Observou-se que este estádio ocorreudurante todos os meses do ano comaumento populacional de outubro atémarço e de agosto até abril para A.cajennense e para A. dubitatum,respectivamente, nos dois anos de duraçãodo experimento. Foram identificados picosna população de carrapatos sendo outubro-novembro de 2006 (91%) e 2007 (60%),janeiro-fevereiro de 2007 (33%) e 2008

(90%) os meses de maior captura deexemplares de A. cajennense e outubro-novembro de 2006 (91%) e 2007 (58%),fevereiro-abril de 2007 (30%) e 2008 (90%)os meses de maior captura de espécimesde A. dubitatum (Figura 8). Ao contrário doque ocorreu com os estádios imaturos, ospicos populacionais dos estádios adultosocorreram durante a primavera e o verãoquando as temperaturas e umidadesrelativas do ar estavam mais altas (Figuras5 e 6).

-20

0

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Meses

Núm

ero

de a

dulto

s

A. caj.A. dub.

Figura 8 - Flutuação da população de adultos de vida livre de A. cajennense e A. dubitatumcoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

43

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Meses

Adul

tos

de A

mbl

yom

ma

caje

nnen

se

MachosFêmeas

Figura 9 - Flutuação da população de machos e fêmeas de A. cajennense em vida livrecoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

-10

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Meses

Adu

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de A

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tatu

m

MachosFêmeas

Figura 10 - Flutuação da população de machos e fêmeas de A. dubitatum em vida livrecoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

Considerando a presença de larvas e ninfasnas pastagens, a análise dos resultados dopresente estudo em conjunto com registrosda literatura permite inferir que a maioriadas larvas e ninfas encontradas em maio ejulho, respectivamente, são, principalmente,da espécie A. cajennense, em semelhançacom os resultados relatados por Smith(1975) em Trinidad e Tobago, Guglielmonee Hadani (1982) na Argentina, e no Brasil,Souza e Serra-Freire (1994 a, b) no Rio deJaneiro, Oliveira et al. (2000) em MinasGerais, que também encontraram picospopulacionais de estádios imaturos de A.cajennense nas pastagens durante asestações secas e frias do ano. Emcontrapartida, a maioria das larvas e ninfasativas encontradas no bimestre outubro-novembro, sugere pertencer à espécie A.dubitatum corroborando os resultadosencontrados por Souza et al. (2006) em SãoPaulo que também coletaram duas espéciesdo gênero Amblyomma (A. cajennnese e A.dubitatum) e atribuíram picos de larvas eninfas encontrados no período de novembroa março à espécie A. dubitatum. Isto porqueneste período, larvas e ninfas de A.cajennense já encontram-se em diapausacomportamental (Labruna et al., 2003;Cabreira, 2008), o que determina um padrãosazonal diferenciado em relação àpopulação de A. cajennense na áreaestudada.

Os dois picos de larvas ocorridos em abril-maio de 2007 e abril de 2008 nada mais sãodo que o reflexo da explosão da populaçãode fêmeas de A. cajennense que ocorreramanteriormente em outubro-novembro de2006 e 2007 e janeiro-fevereiro de 2007 e2008 (Figura 9). Esse período correspondeao tempo necessário à fêmea na busca pelohospedeiro, fixação na pele, ingurgitamento,desprendimento da teleógina, período depré-postura, postura, incubação dos ovos eeclosão das larvas. As fêmeas dos maiorespicos ocorridos em outubro-novembro ejaneiro-fevereiro se relacionam com aprodução dos maiores picos de larvas emabril e maio. Nesta época do ano ocorremaior atividade dos adultos na pastagem nabusca pelo hospedeiro e maior eficiênciareprodutiva das teleóginas, correspondendoà época de maiores temperaturas médias e

umidade relativa na região. O pico de larvasocorrido em outubro-novembro de 2007, porsua vez, parece ser decorrente da explosãoda população de fêmeas de A. dubitatumque ocorreu não só em outubro-novembrode 2006 e 2007, mas significativamentetambém, em janeiro-abril de 2007 e 2008(Figura 10). Fêmeas deste carrapato foramcapturadas até o mês de maio nos doisanos de duração do experimento, ao passoque fêmeas de A. cajennense praticamentejá não eram encontradas no mês defevereiro. Este fato nos leva a crer que apopulação de adultos de A. dubitatum, pelomenos na região em questão parece resistirmelhor à pressão ambiental suportandomaiores temperaturas médias e umidaderelativa do ar quando comparada àpopulação de adultos de A. cajennense. Ascondições climáticas apresentadas emCoronel Pacheco devem ter sido um fatorimportante favorecendo a sobrevivência, pormais tempo, também de larvas destecarrapato nas pastagens, daí a observaçãodo referido pico. A percepção destasdiferenças é de fundamental importânciapara a realização de estudosepidemiológicos regionalizados deixodídeos, em função de condições locaisdiversas como clima, vegetação, relevo,altitude e a disponibilidade de hospedeirosapresentadas entre as diferentes regiõeszoogeográficas de distribuição destescarrapatos.

Os picos da população de ninfas em julho eoutubro-novembro de 2006 e 2007ocorreram logo em seguida aos maiorespicos de larvas observados nos mesmosperíodos, correspondendo ao intervalonecessário para a captura dos hospedeirospela larva, fixação à pele, ingurgitamento,desprendimento da larva ingurgitada eecdise para o estádio de ninfa no ambiente.

O aumento da curva populacional deestádios adultos de A. cajennense deoutubro até março está de acordo com opadrão sazonal conhecido para estaespécie de carrapato na Região Sudeste doBrasil. Souza e Serra-Freire (1994a)relataram outubro-maio como o período demaior população de adultos no Rio deJaneiro. Oliveira et al. (2000) descreveram a

45

maior infestação das pastagens porestádios adultos de agosto a maio em MinasGerais. Souza et al. (2006) encontraramaumento na população de adultos de A.cajennense numa área de mata ciliar emSão Paulo de outubro a abril. O aumentopopulacional de estádios adultos de A.dubitatum de agosto até abril encontrado nopresente estudo também está de acordocom o padrão sazonal observado por Souzaet al. (2006) em São Paulo cujo aumento sedeu a partir de julho até abril.

Pela análise das curvas de flutuação dapopulação de machos e fêmeas de A.cajennense (Figura 9) e A. dubitatum(Figura 10) observou-se que durante operíodo de maior atividade de adultos(outubro-abril) a proporção de machos foimaior na primeira metade (outubro-dezembro) que na segunda (janeiro-abril),nos dois anos de experimento. Estaproporção foi de, aproximadamente, trêsmachos para cada fêmea (3:1) em outubro-dezembro de 2006 e 2007 caindo para 1,5:1 em janeiro-abril de 2007 e 2008 para A.cajennense e de três machos para cadafêmea (3:1) caindo para 1:1 para A.dubitatum no mesmo período. Estesresultados são coerentes aos encontradospor Oliveira (1998) que observou umaumento populacional nas pastagens,primeiro de machos, a partir de setembro,mantendo elevada a relação de machospara cada fêmea até o mês de novembro e,posteriormente, de fêmeas, a partir deoutubro, nos dois anos de observação.Entre agosto e outubro a razão observadafoi de 4,17 machos para cada fêmea e de1,67 machos para cada fêmea, nos outrosmeses do ano.

Larvas não foram encontradas naspastagens de outubro de 2006 a janeiro de2007 e de dezembro de 2007 a fevereiro de2008, ninfas apresentaram contagens muitobaixas de dezembro a abril e adultosocorreram durante todo o ano, porém, compresença reduzida de maio a julho. Essaredução ou ausência total de umdeterminado estádio na pastagem aliadaaos dados já existentes na literatura,sugerem que, embora haja um padrãosazonal diferenciado com prolongamento da

disponibilidade de estádios de A. dubitatumem relação à população de A. cajennensehá ocorrência de diapausa comportamentalnas larvas não alimentadas durante aprimavera e verão para estas duas espéciesde carrapatos na área de estudo emquestão.

4.3 Flutuação da população de larvas,ninfas e adultos de vida parasitária de A.cajennense

Foram capturadas 8800 larvas e 1452ninfas ingurgitadas pela técnica daraspagem de um dos lados dos equinos nosdois anos do experimento (Tabela 2). Aslarvas de A. cajennense foram capturadasdurante o período de maio a setembro de2006, de março a setembro de 2007 e apartir de abril de 2008. Apresentaram picospopulacionais bem definidos sendo osmaiores em maio de 2006 representando73% das larvas capturadas neste ano, abril-maio de 2007 com 74% e abril de 2008 com99% (Figura 11). Estes picos refletem opotencial reprodutivo das fêmeas de A.cajennense observadas sobre os animaisentre os meses de novembro e fevereiro, àsemelhança do que ocorreu em vida livre(Figura 13).

Ninfas de A. cajennense foram capturadasdurante todos os meses do ano eapresentaram picos populacionais entre osmeses de junho a novembro e densidadepopulacional máxima em julho de 2006 com41% das ninfas capturadas neste ano ejulho de 2007 com 47% (Figura 11). Ospicos populacionais dos estádios imaturosocorreram durante o outono e o invernoquando as temperaturas e umidadesrelativas do ar estavam mais baixas (Figuras5 e 6). A ausência de picos de larvas eninfas de A. cajennense no bimestreoutubro-novembro de 2006 e 2007 em vidaparasitária reforça a hipótese de que ospicos ocorridos no mesmo período em vidalivre (Figura 7) sejam realmente de larvas eninfas pertencentes à espécie A. dubitatum.

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LarvasNinfas

Figura 11 - Flutuação da população de larvas e ninfas de vida parasitária de A. cajennensecoletadas no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

Dos 7022 carrapatos adultos contados nosequinos durante os dois anos deexperimento (Tabela 2), observou-se queeste estádio ocorreu durante todos osmeses do ano com aumento populacionalde setembro até abril. Foram identificadospicos na população de carrapatos sendonovembro-dezembro de 2006 (72%) e 2007(28%), janeiro-fevereiro de 2007 (53%) e2008 (87%) os meses de maior captura deexemplares de A. cajennense (Figura 12).Ao contrário do que ocorreu com osestádios imaturos, os picos populacionaisdos estádios adultos ocorreram durante aprimavera e o verão quando astemperaturas e umidades relativas do arestavam mais altas (Figuras 5 e 6).

Moreno (1984) em estudo da flutuaçãopopulacional de A. cajennense em bovinosleiteiros em propriedades rurais da regiãoMetalúrgica de Minas Gerais observoumaior presença de larvas sobre os animaisentre os meses de abril a junho. Esteresultado coincide parcialmente com osdados do presente trabalho, quando foram

coletadas larvas deste carrapato até o mêsde setembro, nos dois anos de observação.Estas diferenças na flutuação populacionalpodem ser atribuídas às diferenças nastécnicas empregadas na amostragem,intervalo entre as coletas, infestações doshospedeiros e aos diferentes micro climasnos locais onde foram realizados osexperimentos. No entanto, corroboram osresultados encontrados por Oliveira et al.(2003) no município de Pedro Leopoldo,Minas Gerais, que encontraram larvas destecarrapato entre os meses de abril e agosto,com pico populacional em maio, ocorrendoem número muito reduzido ou mesmocompletamente ausentes na vegetação, norestante do ano.

O pico da população de ninfas ingurgitadasteve início um mês após o maior pico delarvas que ocorreu nos meses de abril-maiodurante os dois anos do experimento. Esteintervalo corresponde ao tempo necessáriopara o ingurgitamento das larvas,desprendimento do hospedeiro, pré-ecdise,ecdise para ninfas, encontro de novo

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A. cajennense

Figura 12 - Flutuação da população de adultos de vida parasitária de A. cajennense coletadosno município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

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MachosFêmeas

Figura 13 - Flutuação da população de machos e fêmeas de A. cajennense em vida parasitáriacoletados no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de 2006 a abril de 2008.

hospedeiro e ingurgitamento ninfal, uma vezque as ninfas coletadas pela técnica deraspagem já estavam totalmenteingurgitadas e foram facilmente removidasda pele do animal. Confrontando os dadosdeste trabalho com os resultadosencontrados por Moreno (1984) e Oliveira etal. (2003) em Minas Gerais, Cunha (1986)no Rio de Janeiro, Lemos et al. (1997) eLabruna et al. (2002) em São Paulo,observa-se uma grande concordância entreos resultados destes autores, quando operíodo de ocorrência de ninfas sobre osanimais se dá no final do inverno e início daprimavera.

Com relação aos carrapatos adultos, osdados levantados por Moreno (1984),Lemos et al. (1997), Labruna et al. (2002) eOliveira et al. (2003) concordam com operíodo de ocorrência do estádio adulto deA. cajennense durante todos os meses doano, com aumento populacional naprimavera e verão. No entanto, Cunha(1986) e Souza e Serra-Freire (1992)observaram períodos mais curtos naocorrência do carrapato adulto,provavelmente, influenciado pelas diferentescondições climáticas nos locais doexperimento, bem como as espécies dehospedeiros utilizados como modeloexperimental.

Pela análise das curvas de flutuação dapopulação de machos e fêmeas de A.cajennense (Figura 13) observou-se quedurante o período de maior atividade deadultos (setembro-abril) a proporção demachos foi maior na primeira metade(setembro-dezembro) que na segunda(janeiro-abril), nos dois anos deexperimento. Esta proporção foi de,aproximadamente, 2,8 machos para cadafêmea (2,8: 1) em setembro-dezembro de2006 caindo para 1,4: 1 em janeiro-abril de2007 e de 3 machos para cada fêmea (3:1)em setembro-dezembro de 2007 caindopara 1:1 em janeiro-abril de 2008. Estesresultados são coerentes com osencontrados por Labruna et al. (2002) queencontraram uma proporção de quatromachos para cada fêmea em outubro-dezembro de 1997 (4:1) caindo para 2:1 emjaneiro-março de 1998. Similarmente, no

segundo ano do experimento a proporçãofoi de 2,5 machos para cada fêmea emoutubro-dezembro de 1998 caindo para 1,4:1 em janeiro-março de 1999. Esse maiornúmero de machos em relação ao númerode fêmeas pode ser explicado pelo maiortempo de permanência sobre os animais.Assim, o mesmo macho pode ser contadoem mais de uma observação. Além disso, oparasitismo prolongado de machos de A.cajennense parece ter implicaçõesimportantes fazendo com que o hospedeirose torne mais atrativo para as fêmeas eoutros estádios não alimentados docarrapato. Segundo Oliveira (2004), apresença de machos precedendo oaparecimento de fêmeas está,possivelmente, relacionada à necessidadedos machos de encontrarem seushospedeiros mais cedo para realizar orepasto sanguíneo e, assim, produzirferomônios que vão possibilitar a atraçãodas fêmeas para os animais. Dessa forma,com o aumento da produção de feromôniospelos machos alimentados, a procura dohospedeiro pela fêmea deste carrapatoaumenta, diminuindo a proporção dosmachos em relação às fêmeas sobre oscavalos na segunda metade da estação.

Confrontando os dados das curvas deflutuação populacional destes carrapatosem vida livre e parasitária nota-se umasemelhança muito grande entre o queacontece a campo e sobre o animal.Observa-se uma estreita relação, tanto noperíodo de ocorrência dos diferentesestádios durante o ano, quanto no perfil dospicos de carrapatos. Este fato já havia sidomostrado em estudos anteriores como o deOliveira (1998) e revela-se um subsídioimportante para a realização de futurostrabalhos de pesquisa em epidemiologia edinâmica populacional agregandovantagens operacionais e de tempo aosestudos. Outro aspecto importante, dizrespeito aos tratamentos com produtoscarrapaticidas que poderão ser aplicadossobre o hospedeiro em determinado estádiodo ciclo evolutivo de vida parasitáriapredominantes em épocas específicas doano atingindo também a populaçãocorrespondente em vida livre,proporcionando a desinfestação das

49

pastagens dentro de esquemas estratégicosde controle deste carrapato. As formasimaturas deste parasito (larvas e ninfas) sãomais sensíveis quando submetidas aosefeitos dos tratamentos com as basesquímicas existentes no mercado. Aocorrência de períodos do ano em que há opredomínio destas formas do carrapato nanatureza proporciona grandespossibilidades no seu combate, uma vezque uma redução drástica nestaspopulações levará também à ocorrência deuma população muito menor de adultos naspastagens e parasitando os animais nasestações seguintes de primavera e verão.Vislumbra-se também, uma redução donúmero de casos de febre maculosa, umavez que se acredita que a doença sejatransmitida por esses estádios do carrapatodada sua ocorrência, principalmente, noperíodo compreendido entre os meses demaio e outubro.

4.4 Eficiência de armadilhas de CO2 nacoleta de estádios de vida livre de A.cajennense e A. dubitatum

Armadilhas utilizando CO2 como atrativoquímico são sabidamente efetivas para acaptura de ninfas e adultos em vida livre dealgumas espécies de carrapatos tais comoA. cajennense e Amblyomma parvum(Cançado et al., 2008). Ainda que a principalfonte de CO2 seja proveniente do gelo seco,a armadilha química utilizando ácido lático a20% (C3H6O3) e carbonato de cálcio(CaCO3) vem sendo testada como fontealternativa de CO2 em circunstâncias onde édifícil a obtenção do gelo seco (Cançado etal., 2008).

O número total de carrapatos em cada fasedo ciclo (ninfas e adultos) coletados pelasduas técnicas de amostragem, armadilhasde CO2 com gelo seco e com ácido lático a20% e carbonato de cálcio, durante os doisanos de observação foi comparado,estatisticamente, pelo teste de t Student(Tabela 3).

Larvas não foram coletadas por estastécnicas, pois segundo Oliveira (1998) a

baixa eficiência das armadilhas de CO2 paraa captura de larvas está associada,principalmente, à sua pequena capacidadede deslocamento horizontal ou lateral e pelainibição da atividade larval devido às baixastemperaturas e elevada concentração deCO2 que ocorrem nas proximidades dafonte, sendo indicado, portanto, para suaamostragem o arraste de flanela.

De acordo com os resultados apresentados,ambas as armadilhas proporcionaramcapturas de números semelhantes decarrapatos (p>0,05), confirmando aeficiência desta armadilha química eviabilizando seu uso em lugares de difícilacesso ou distantes de um fornecedor degelo seco como é o caso da área de estudoem questão. Outro ponto positivo foi acoleta de adultos de A. dubitatum pelaprimeira vez com este tipo de armadilhamostrando a eficiência da reação do ácidolático com o carbonato de cálcio tambémpara a captura dessa espécie de carrapatoa campo. Cançado et al. (2008) já haviamcomprovado a eficiência desta armadilha noPantanal matogrossense para a coleta decarrapatos do gênero Amblyomma (A.cajennense e A. parvum), mas não para A.dubitatum. É uma armadilha de baixo custo,principalmente quando comparada ao geloseco e fácil de ser confeccionada.

Um ponto negativo, no entanto, é o curtoperíodo que o carrapato permanece naarmadilha; nas armadilhas utilizando o geloseco, os carrapatos parecem permaneceratraídos por mais tempo pela fonte de CO2,ao passo que nas armadilhas químicas essetempo é menor. Dessa forma, quando setêm áreas muito extensas, em que precisamse colocar um número maior de armadilhas,ainda são indicadas as armadilhas de geloseco como atrativo para os carrapatos.

Tabela 3 - Coleta de ninfas e adultos de vida livre de A. cajennense e A. dubitatum por técnicasde amostragem utilizando CO2, no município de Coronel Pacheco, MG, no período de maio de

2006 a abril de 2008.

Médias seguidas de letras iguais na mesma linha são estatisticamente semelhantes (Teste t de Student 5%).

4.5 Teste de hemolinfa

Dos 620 carrapatos adultos de vida livre(328 A. cajennense e 292 A. dubitatum) edos 717 adultos de vida parasitária (717 A.cajennense) coletados, 1213 exemplares(90% dos carrapatos coletados) foramtestados. Dos testes realizados 100% foramnegativos para a presença demicrorganismos semelhantes à riquétsia. Os10% restantes formado somente porexemplares de adultos de vida parasitária(124 carrapatos) não foram processados emvirtude de problemas técnicos quecausaram a morte destes espécimes devidoa uma falha de controle da temperatura daestufa em que eram mantidos os carrapatosantes da realização do teste.

Labruna et al. (2004a) encontraram em 12carrapatos da espécie A. dubitatummicrorganismos semelhantes à riquétsiadentro de hemócitos. No entanto, outros 20carrapatos foram negativos e oitoapresentaram resultados inconclusivosporque as células da hemolinfa foramcompletamente perdidas durante osprocedimentos de lavagem da técnica.

Pinter e Labruna (2006) submeteram 669exemplares de A. aureolatum ao teste dehemolinfa para pesquisa de riquétsias etiveram perdas (264 carrapatos) superioresa deste experimento, em virtude de falhastécnicas no momento da execução do teste.Pacheco (2007) coletou um total de 841(367 machos e 474 fêmeas) carrapatosadultos da espécie A. dubitatum, os quaisforam submetidos ao teste de hemolinfa.Dos 841 A. dubitatum coletados, em 153(18,18%) amostras de hemolinfa foramobservados organismos morfologicamentecompatíveis com riquétsias, 452 foramnegativas (53,74%) e 236 (28,06%)amostras de carrapatos foram inconclusivas.

4.6 Análise pela PCR

Pela PCR, foram testados, individualmente,400 carrapatos adultos de vida livre (200 A.cajennense e 200 A. dubitatum) e 200carrapatos adultos de vida parasitária. Oscarrapatos testados na PCR incluíramaqueles que não tiveram sua hemolinfatestada, em virtude da morte duranteincubação na estufa. Foram testadas ainda

Gelo seco Ácido lático a 20% +carbonato de cálcio

Flanela controleCarrapatos de vidalivre

média ± desvio padrãon° total de carrapatos (%)



Ninfas 45,29a ± 71,761087 (51%)

42,33a ± 73,371016 (47,6%)

1,25b ± 3,1130 (1,4%)

A. cajennense 7,83a ± 15,43188 (57,3%)

5,54a ± 11,88133 (40,5%)

0,29b ± 0,697 (2,1%)

A. dubitatum 6,29a ± 11,35151 (51,8%)

5,54a ± 10,81133 (45,5%)

0,33b ± 0,638 (2,7%)

51

1000 larvas de vida livre (100 pools de 10larvas cada), 1000 ninfas de vida livre (200pools de 5 ninfas cada), 1000 larvas de vidaparasitária (100 pools de 10 larvas cada) e1000 ninfas de vida parasitária (200 poolsde 5 ninfas cada).

Dois carrapatos adultos de vida livre daespécie A. cajennense (um macho e umafêmea) ambos coletados em março de 2007e quatro pools de ninfas de vida livrecoletadas em novembro de 2006 e maio,outubro e novembro de 2007 apresentaramprodutos de tamanhos esperados para osprimers CS2-78 e CS2-323. Quando estescarrapatos positivos foram testados paraoutros primers descritos na Tabela 1, osdois carrapatos adultos produziram produtosde tamanhos esperados para todas asreações (OmpA e OmpB) ao passo que, osquatro pools de ninfas produziram produtosde tamanhos esperados somente na reaçãocom os primers OmpB. Ainda com relaçãoàs ninfas, as reações produziram bandasfracas, quando visualizadas à luzultravioleta, em virtude, da baixa quantidadede DNA concentrada durante o processo deextração. Dessa forma, as amostras deninfas tiveram seu DNA clonado, conforme atécnica descrita anteriormente, na tentativade se obter fragmentos ideais para osequenciamento.

O sequenciamento de DNA do fragmentoamplificado das duas amostras decarrapatos adultos de A. cajennensemostrou 100% de similaridade com asequência correspondente de R. rickettsii noGen Bank tanto para o gene gltA como parao OmpA e OmpB (Anexos 1, 2, 3, 4, 5 e 6).O sequenciamento do gene gltA mostrou ser100% similar à sequência correspondente(CP000766) de R. rickettsii amostra SheilaSmith e 100% similar à sequência (U59729)da cepa Bitterroot de R. rickettsii isolada decarrapatos D. andersoni nos EUA. Osfragmentos do gene OmpA foram 100%similares à sequência correspondente(CP000766) de R. rickettsii amostra SheilaSmith e 100% similares à sequência(DQ16483) de um isolado de R. rickettsii doPanamá. Os fragmentos do gene OmpBforam 100% similares à sequência

correspondente (CP000766) de R. rickettsiiamostra Sheila Smith.

Quando o fragmento amplificado das quatroamostras de ninfas foi sequenciado (Anexo7), este mostrou 99,7% de similaridade coma seqüência correspondente (AF394896) deRickettsia tamurae amostra AT-1 no GenBank para o gene gltA. Similaridades de99,1% também foram observadas com assequências correspondentes (DQ100163)de Rickettsia monacensis amostraIrR/Munich e com as sequênciascorrespondentes (AB297812) de Rickettsiaasiatica. O sequenciamento de DNA dofragmento amplificado das amostrasclonadas (OmpB) ainda não foi realizadocom sucesso.

O fragmento amplificado de uma amostra deninfa coletada em maio de 2006 para ogene 16S rDNA e seu posteriorsequenciamento, mostrou ser 99,7% similarà sequência correspondente (FJ424404) deA. cajennense disponível no Gen Bank aopasso que o sequenciamento de outraamostra coletada em novembro de 2007 foi100% similar à sequência correspondente(DQ858955) de A. dubitatum (Anexos 8 e 9).

O presente estudo, mais uma vez, forneceuevidências moleculares da presença de R.rickettsii em pelo menos dois carrapatos A.cajennense coletados nas pastagens deuma área endêmica para FMB em CoronelPacheco. Embora R. rickettsii tenha sidorelatada infectando carrapatos da espécieA. cajennense no Brasil e em outros paísesda América Latina (Moreira e Magalhães,1935; Dias et al., 1937; Patino-Camargo,1941; Bustamante e Varela, 1947; Valejo-Freire, 1946; Rodaniche, 1953) a primeiraidentificação com caracterização molecularde R. rickettsii em carrapatos desta espéciesó foi confirmada neste mesmo local emestudo anterior (Guedes et al., 2005). Assequências de DNA dos genes gltA, OmpAe OmpB geradas no presente estudo sãosimilares às sequências obtidas decarrapatos A. cajennense infectadosencontrados nessa mesma área nos anosde 2003 e 2004 bem como às seqüênciascorrespondentes de R. rickettsii amostraSheila Smith dos EUA. A cepa Sheila Smith

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é considerada altamente virulenta(Eremeeva et al., 2003) e o genótipo de R.rickettsii detectado em carrapatos A.cajennense no presente estudo,possivelmente, corresponde ao do caso deFMB confirmado em um homem na áreaendêmica de Coronel Pacheco no ano de2000.

Foram testados, no total, 600 carrapatosadultos (400 A. cajennense e 200 A.dubitatum); somente dois carrapatos A.cajennense continham DNA riquetsial,determinando, dessa forma, uma taxamínima de infecção de R. rickettsii em A.cajennense de 0,5%. Este valor se encontraabaixo do valor encontrado no estudoanterior, no qual a taxa foi de 1,28% decarrapatos infectados (Guedes et al., 2005),mas se compara a outros registros daliteratura no Brasil e nos EUA. No Estado deSão Paulo, Sangioni et al. (2005) testarampela PCR 810 espécimes de A. cajennensede três áreas endêmicas para FMB, masnenhum carrapato infectado foi encontrado.Numa outra área endêmica, ainda em SãoPaulo, Pinter e Labruna (2006) detectaramR. rickettsii em seis (0,89%) de 669carrapatos A. aureolatum testados. NosEUA, a taxa de infecção de R. rickettsiirelatada nas populações do carrapato D.variabilis de áreas endêmicas para a FMMRvaria de 0,05 a 1,3% (Burgdorfer, 1988).Essa baixa taxa de infecção ressalta o efeitoletal dessa bactéria para seu carrapato vetor(Niebylski et al. 1999).

Em estudo anterior, realizado por Guedes etal. (2005) foram testados apenas 78carrapatos adultos da espécie A.cajennense (26 pools de três carrapatoscada) coletados em um período curto detempo (outubro de 2003 a maio de 2004),ou seja, uma pequena amostra que nãorepresentava suficientemente o cenário reala campo. No trabalho atual, por sua vez,foram testados, individualmente, 400adultos de A. cajennense coletados aolongo de dois anos de estudos sobre adinâmica populacional deste carrapato bemcomo de A. dubitatum. Estes dados ajudama ampliar a visão sobre o panorama dadistribuição da doença em relação à

distribuição da população do vetor nessaárea endêmica.

Já R. tamurae, encontrada em quatro poolsde ninfas de vida livre de Amblyomma sp., éuma riquétsia de patogenicidadedesconhecida para humanos até o que sesabe no momento e que tem sido relatadaem carrapatos da espécie Amblyommatestudinarium no Japão e Tailândia(Fournier et al., 2006). Neste trabalho osautores ressaltam a marcada diferença dogenótipo dessa riquétsia em relação aosoutros membros do GFM, principalmente, noque se refere ao gene OmpB (Anexo 10).Este, provavelmente, é o motivo pelo qual,os produtos amplificados pela PCR comoutros genes tenham resultado em umgrande número de reações inespecíficas epela dificuldade encontrada nosequenciamento do gene OmpB, mesmonas amostras clonadas.

No presente estudo, R. tamurae foidetectada em ninfas de A. cajennense e deA. dubitatum, identificadas pelosequenciamento do gene 16S rDNA. Emestudo anterior, realizado na mesma áreade Coronel Pacheco, Guedes et al. (2005)não encontraram DNA riquetsial em nenhumcarrapato A. dubitatum. Apesar de nãoterem sido coletados carrapatos A.dubitatum diretamente das capivaras quesão consideradas hospedeirosamplificadores de R. rickettsii na natureza(Souza et al., 2009), os dados destetrabalho anterior aliados aos atuais, noslevam a acreditar que, pelo menos nessaárea, a população de A. cajennense sejamais suscetível que a população de A.dubitatum às infecções por R. rickettsii.

Trabalhos realizados, principalmente, emáreas endêmicas do Estado de São Paulo,normalmente, relatam carrapatos da espécieA. dubitatum infectados por Rickettsia bellii(Labruna et al., 2004a; Estrada et al., 2006;Pacheco, 2007) e menos comumente, poruma cepa de Rickettsia, filogeneticamentepróxima à Rickettsia parkeri (Labruna et al.,2004a).

Como ainda não foi possível osequenciamento do fragmento amplificado

53

do gene OmpB pouco se tem a discutir arespeito, mas esse novo achado geraespeculações a respeito da ecologia de R.rickettsii que pode ter sua transmissãominimizada dentro das populações destasduas espécies de carrapatos na áreaendêmica em virtude da presença dessariquétsia de patogenicidade desconhecida.Saindo do campo das hipóteses, énecessário dar continuidade a essesestudos na tentativa de fornecerinformações importantes que ajudem nacompreensão do padrão irregular deocorrência da FMB em áreas endêmicas.

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Como não foi possível avaliar a dinâmicapopulacional de A. dubitatum em vidaparasitária por motivos já citadosanteriormente, futuros estudos deverão serdirecionados no sentido de conhecer o perfilde larvas, ninfas e adultos sobre o corpodos animais e comparar com o perfil jáconhecido e aqui explicitado, destecarrapato em vida livre. A. cajennenseapresenta estreita relação entre o perfil dascurvas populacionais de larvas, ninfas eadultos, em vida livre e em vida parasitária.Será que o mesmo é observado para aspopulações de A. dubitatum nessa e emoutras regiões do país?

Outro ponto a ser esclarecido é a validadede R. tamurae, identificada em ninfas de A.cajennense e A. dubitatum. Até o momento,conseguiu-se realizar somente osequenciamento do gene gltA dessariquétsia. Uma caracterização mais ampla,com o sequenciamento do gene OmpB, queteve várias tentativas frustradas mesmoapós clonagem das amostras, bem como dogene OmpA, seria ideal para nos fornecermaiores informações.

Por fim, considerando que R. rickettsiicontinua circulando na população de A.cajennense que é um carrapato que ocorredurante todo o ano na região e queapresenta baixa especificidade parasitária,com possibilidade de parasitar humanos,inclusive, a região de Coronel Pacheco

mostra-se um local de risco para ocorrênciade FMB na população, especialmente, paraos funcionários diretamente ligados aoCECP, local onde foi realizada a parteexperimental do trabalho. Dessa forma,torna-se necessária uma vigilânciaepidemiológica constante no intuito deconscientizar, alertar e prevenir a populaçãoquanto aos riscos da doença. Métodos decontrole estratégico dos carrapatos vetorese a educação sanitária para conhecimentoda doença e das medidas de biossegurançade caráter preventivo serão ótimos aliadosno decorrer desse processo.

6 CONCLUSÕES

Pelos dados obtidos por meio deste estudo,conduzido no município de CoronelPacheco, Minas Gerais, no período de maiode 2006 a abril de 2008, concluiu-se que:

• Larvas de Amblyomma sp. não sãoencontradas durante todo o ano napastagem e apresentam picospopulacionais bem definidosocorrendo, principalmente, no mêsde maio para A. cajennense e nosmeses de maio e outubro-novembropara A. dubitatum.

• Ninfas de Amblyomma sp. sãoencontradas durante todo o ano napastagem, mesmo que emquantidades reduzidas em algunsmeses das estações quentes echuvosas e apresentam picospopulacionais bem definidosocorrendo, principalmente, no mêsde julho para A. cajennense e nosmeses de julho e outubro-novembropara A. dubitatum.

• Carrapatos adultos são encontradosdurante todos os meses do ano napastagem com aumentopopulacional de outubro até março ede agosto até abril para A.cajennense e para A. dubitatum,respectivamente.

• Larvas de A. cajennense não sãoencontradas durante todo o ano

54

sobre os equinos e apresentampicos populacionais bem definidosocorrendo, principalmente, nobimestre abril-maio.

• Ninfas de A. cajennense sãoencontradas durante todos osmeses do ano sobre os equinos,mesmo que em quantidadesreduzidas em alguns meses dasestações quentes e chuvosas eapresentam picos populacionaisbem definidos ocorrendo,principalmente, no mês de julho.

• Adultos de A. cajennense sãoencontrados nos equinos durantetodos os meses do ano comaumento populacional de setembroaté abril.

• Há uma estreita relação entre operfil das curvas populacionais delarvas, ninfas e adultos de A.cajennense, em vida livre e em vidaparasitária.

• Embora haja um padrão sazonaldiferenciado com prolongamento dadisponibilidade de estádios de A.dubitatum em relação à populaçãode A. cajennense sugere-se aocorrência de diapausacomportamental nas larvas nãoalimentadas durante a primavera everão para estas duas espécies decarrapatos na área de estudo emquestão.

• Há um aumento populacional naspastagens, primeiro de machosmantendo elevada a relação demachos para cada fêmea noperíodo de outubro a dezembro e,posteriormente, de fêmeas comtendência ao equilíbrio no períodode janeiro a abril, nos dois anos deexperimento, tanto para A.cajennense como para A.dubitatum.

• Armadilhas químicas utilizandoácido lático a 20% e carbonato de

cálcio como fonte de CO2 sãoeficientes na coleta de estádios devida livre, tanto de A. cajennensecomo de A.dubitatum.

• Há comprovação biomolecular dacirculação de R. rickettsii naspopulações de carrapatos A.cajennense da área em questão,não se confirmando o mesmo paraA. dubitatum.

• Os resultados apontam para aidentificação de R. tamurae emninfas tanto de A. cajennense comode A. dubitatum.

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60

8 ANEXOS

ANEXO 1

Sequências obtidas do carrapato A. cajennense (amostra 190)

Gene citrato sintase (gltA)

Seqüência (321 nucleotídeos):5’-ATTGCTTTACTTACGACCCGGGTTTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAGTCTACTATCACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGCATCGAGGATATGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTAGCATATTTACTGATTTATGGGGAACTACCAAGTGGCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAGACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCTATTATGCTTGCGGCTGTCGGTTCTCTTGCGGCATTTT - 3’

Máxima % de similaridades com as sequências disponíveis do Gen Bank:

1 - Ricketsia rickettsii amostra Iowa (CP000766): 100% (321/321)2 - Rickettsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (321/321)3 - Rickettsia rickettsii amostra Bitterroot (U59729): 100% (321/321)

61

ANEXO 2


Gene outer membrane protein A (OmpA)

Seqüência (471 nucleotídeos):5`-CGCTTTATTCACCACCTCAACCGCAGCGATAATGCTGAGTAGTAGCGGGGCACTCGGTGTTGCTACAGGTGTTATTGCTACTAATAATAATGCAGCATTTAGTAATAATGTTGGCAATAATAATTGGAATGAGATAACGGCTGCAGGGGTAGCTAATGGTACTCCTGCTGGCGGTCCTCAAAACAATTGGGCATTTACTTACGGTGGTGATTATACTGTCACTGCAGATGCAGCCGATCGTATTATTAAGGCTATAAATGTTGCGGGTACTACTCCCGTAGGTCTAAATATTACTCAAAATACTGTCGTTGGTTCGATTATAACGAAAGGTAACTTGTTGCCTGTTACTCTTAATGCCGGCAAAAGCTTAACTTTAAATGGTAATAATGCTGTTGCTGCAAATCATGGTTTTGATGCGCCTGCCGATAATTATACAGGTTTAGGAAATATAGCTTTAGGGGGAGCGAAGCT - 3’


1 - Rickettsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (471/471)2 - Rickettsia rickettsii isolado Panamá 2004 (DQ164838): 100% (471/471)3 - Rickettsia rickettsii amostra 1995HO2 (DQ150693): 100% (471/471)

62

ANEXO 3


Gene outer membrane protein B (OmpB)

Seqüência (760 nucleotídeos):5`-AGCTATGGGTGCTGCTATACAGCAGAATAGAACAACAAACGGCGCTGCTACAACTGTTGATGGTGCGGGATTTGACCAAACTGCCGCTCCTGCAAATGTTGGAGTTGCTCTAAATGCAGTTATTACTGCTAATGCTAATAATGGTATTAATTTCAATACTCCAGCCGGTAGTTTTAACGGTTTGTTGTTAAATACTGCAAACAATTTAGCAGTGACAGTGAGTGAAGATACTACCTTAGGGTTCATCACTAATGTTGTTCATAACGCTCACTCCTTTAACCTTACGCTTAAtGCCGGTAAAACTCTTACTATAACAGGTCAAGGTGTTACTAATGCACAAGCTGCTGCTACAAAAAATGCTCAAAATGTTGTTGTACAATTTAATAATGGTGCTGCTATTGACAATAATGATCTTAAAGGTGTAGGAAGAATAGACTTCGGTGCTCCGGCTTCTACATTAGTATTTAATTTAGCAAATCCTACAACTCAAAAAGCTCCTCTTATACTTGGAGATAATGCTGTAATAGCTAATGGTGTTAACGGTACATTAAATGTTACTAATGGATTTATTCAAGTTTCAAATAAAAGTTTTGCTACTGTTAAGGCAATTAATATCGCTGACGGTCAAGGTATCATATTCAATACTGATGCTAATAATGCTAATACTTTAAATTTACAAGCAGGTGGTACTACTATTAATTTTACTGGAACAGACGGTACGGGTAGATTAGTATTATTAAGTAAGCATGCTGCTGCTACC - 3’


1 - Ricketsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (760/760)2 - Rickettsia rickettsii (X16353): 100% (760/760)3 - Rickettsia rickettsii amostra Iowa (CP000766): 99, 7% (759/760)

63

ANEXO 4



Seqüência (321 nucleotídeos):5’-ATTGCTTTACTTACGACCCGGGTTTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAGTCTACTATCACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGCATCGAGGATATGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTAGCATATTTACTGATTTATGGGGAACTACCAAGTGGCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAGACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCTATTATGCTTGCGGCTGTCGGTTCTCTTGCGGCATTTT - 3’


1 - Ricketsia rickettsii amostra Iowa (CP000766): 100% (321/321)2 - Rickettsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (321/321)3 - Rickettsia rickettsii amostra Bitterroot (U59729): 100% (321/321)

64

ANEXO 5


Gene outer membrane protein A (OmpA)

Seqüência (490 nucleotídeos):5`-GGTCTTAAAGCCGCTTTATTCACCACCTCAACCGCAGCGATAATGCTGAGTAGTAGCGGGGCACTCGGTGTTGCTACAGGTGTTATTGCTACTAATAATAATGCAGCATTTAGTAATAATGTTGGCAATAATAATTGGAATGAGATAACGGCTGCAGGGGTAGCTAATGGTACTCCTGCTGGCGGTCCTCAAAACAATTGGGCATTTACTTACGGTGGTGATTATACTGTCACTGCAGATGCAGCCGATCGTATTATTAAGGCTATAAATGTTGCGGGTACTACTCCCGTAGGTCTAAATATTACTCAAAATACTGTCGTTGGTTCGATTATAACGAAAGGTAACTTGTTGCCTGTTACTCTTAATGCCGGCAAAAGCTTAACTTTAAATGGTAATAATGCTGTTGCTGCAAATCATGGTTTTGATGCGCCTGCCGATAAtTATACAGGTTTAGGAAATATAGCTTTAGGGGGAGCGAATGCTGCACTAA -3’


1 - Rickettsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (490/490)2 - Rickettsia rickettsii isolado Panamá 2004 (DQ164838): 100% (490/490)3 - Rickettsia rickettsii amostra 1995HO2 (DQ150693): 100% (490/490)

65

ANEXO 6


Gene outer membrane protein B (OmpB)

Seqüência (760 nucleotídeos):5`-AGCTATGGGTGCTGCTATACAGCAGAATAGAACAACAAACGGCGCTGCTACAACTGTTGATGGTGCGGGATTTGACCAAACTGCCGCTCCTGCAAATGTTGGAGTTGCTCTAAATGCAGTTATTACTGCTAATGCTAATAATGGTATTAATTTCAATACTCCAGCCGGTAGTTTTAACGGTTTGTTGTTAAATACTGCAAACAATTTAGCAGTGACAGTGAGTGAAGATACTACCTTAGGGTTCATCACTAATGTTGTTCATAACGCTCACTCCTTTAACCTTACGCTTAAtGCCGGTAAAACTCTTACTATAACAGGTCAAGGTGTTACTAATGCACAAGCTGCTGCTACAAAAAATGCTCAAAATGTTGTTGTACAATTTAATAATGGTGCTGCTATTGACAATAATGATCTTAAAGGTGTAGGAAGAATAGACTTCGGTGCTCCGGCTTCTACATTAGTATTTAATTTAGCAAATCCTACAACTCAAAAAGCTCCTCTTATACTTGGAGATAATGCTGTAATAGCTAATGGTGTTAACGGTACATTAAATGTTACTAATGGATTTATTCAAGTTTCAAATAAAAGTTTTGCTACTGTTAAGGCAATTAATATCGCTGACGGTCAAGGTATCATATTCAATACTGATGCTAATAATGCTAATACTTTAAATTTACAAGCAGGTGGTACTACTATTAATTTTACTGGAACAGACGGTACGGGTAGATTAGTATTATTAAGTAAGCATGCTGCTGCTACC - 3’


1 - Ricketsia rickettsii amostra Sheila Smith (CP000848): 100% (760/760)2 - Rickettsia rickettsii (X16353): 100% (760/760)3 - Rickettsia rickettsii amostra Iowa (CP000766): 99, 7% (759/760)

66

ANEXO 7

Sequências obtidas de ninfas de Amblyomma sp. (amostras 10-78-70-91)


Seqüência (350 nucleotídeos):5’-CGATATAAGTAGGGTATCTGCAGAAGCCGATTGCTTTACTTACGACCCGGGCTTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAGTCTACTATCACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGCATCGAGGATATGATATTAAAGATTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTAGCATATTTACTGATTTATGGGGAACTACCAAGTAGCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACATTATTTATTTCAAACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCTATTATGCTTGCGGCTGTTGGTTCTCTTTCGGCATTTT - 3’


1 - Rickettsia tamurae amostra AT-1 (AF394896): 99,7% (349/350)2 - Rickettsia monacensis amostra IrR/Munich (DQ100163): 99,1% (347/350)3 - Rickettsia asiatica (AB297812): 99,1% (347/350)

67

ANEXO 8

Sequências obtidas de ninfas de Amblyomma sp. (amostra 10)

Gene 16 S

Seqüência (391 nucleotídeos):5`-TAACTTCTTCGCCAAAAAAACATCCTAATCCAACATCGAGGTCGCAAACTATTTTGTCAATATGAACTATCTAAAATTATTACGCTGTTATCCCTAGAGTATTTTTACAATTTACCGCTATTAAACGGTTCATATTTTTGCAAAAAAGTTCAAAATATTAATTAATCGCCCCAATTAAAGAAATATATATTTCTTTAAATGAAATATATTTCAGAAAAATTCATAGGGTCTTCTTGTCCTTAATTTTAATTATTGTTTCTTCACAAATAAAAATAACTTTAATTATTAAATTTAAAAAAGCTTTTTTCTGTAATTCCATTCTCTTAGCACTCAATTAAAGTCTTATTTCAATACCTTTGTGTAGCCAAAATACCACAGCAATTTAAAAAAC - 3’


Amblyomma cajennense (FJ424404): 99,7% (358/359)

68

ANEXO 9

Sequências obtidas de ninfas de Amblyomma sp. (amostra 78)

Gene 16S

Seqüência (399 nucleotídeos):5`-TTGCTGTGGTATTTTGACTATACAAAGGTATTGAAATAAGACTTTAATTGAGTGCTAAGAGAATGGAAATACAGAAAAATTCTTTCTTAAATTCAAAAATTAAAGTTATTTTTACTTGTGAAGAAACAGTAATATTAATTAAGGACAAGAAGACCCTAAGAATTTTCTGAAAAATCAATTTTTTGATTGAAAATTTTCTTTAATTGGGGCGATTAATAAAAATTTAAAACTTTATTTAAATAACAAAAAATGAACCAATATTATTGGTCATATGAAAAAAATACTCTAGGGATAACAGCGTAATAATTTTTGATAGTTCTTATAGACAAAATAGTTTGCGACCTCGATGTTGGATTAGGATACTTTTTTAATGAAGAAGTTAAAAAAAGAAGTTTGTTC - 3’


Amblyomma dubitatum (DQ858955): 100% (399/399)

69

ANEXO 10

Dendograma mostrando a posição filogenética de Rickettsia tamurae (cepa AT – 1) entre asespécies de Rickettsia válidas publicadas comparando as sequências do gene OmpB.

DOUTORADO - TESE FINAL€¦ · Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,...

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