MARIA - Universidade NOVA de Lisboa · “Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado...

MARIA LUÍSA LOBO FERREIRA DA COSTA

(Bolseira de Doutoramento pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia,

Aluna de Doutoramento pelo Instituto de Higiene e Medicina Tropical, da Universidade Nova de Lisboa)

EPIDEMIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DE

ESPÉCIES IMPLICADAS NA MICROSPORIDIOSE

HUMANA EM PORTUGAL POR ANÁLISE

PARASITOLÓGICA E MOLECULAR

LISBOA

2010

“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo, e posso

evitar que ela vá à falência.

Ser feliz é reconhecer que vale

a pena viver apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos

de crise.

Ser feliz é deixar de ser vítima dos

problemas e se tornar um autor da própria história. É atravessar

desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da

sua alma.

É agradecer a Deus a cada manhã

pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos próprios

sentimentos.

É saber falar de si mesmo.

É ter coragem para ouvir um "não".

É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta.

Pedras no caminho?

Guardo todas, um dia vou construir um castelo…”

Fernando Pessoa

iii

Dissertação de candidatura ao grau de Doutor em

Ciências Biomédicas, especialidade de Parasitologia, pela

Universidade Nova de Lisboa, Instituto de Higiene e

Medicina Tropical.

v

A presente dissertação foi realizada sob a orientação da Professora

Doutora Olga Maria Guerreiro de Matos, na Unidade de Protozoários

Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina

Tropical, da Universidade Nova de Lisboa, e na “Division of Parasitic Diseases”

do “Centers for Disease Control and Prevention”, EUA. A doutoranda usufruiu

de uma Bolsa de Doutoramento da Fundação para a Ciência e a Tecnologia e

Fundo Social Europeu no âmbito do Quadro Comunitário de Apoio (referência

SFRH/BD/34674/2007).

vii

Aos meus pais,

cujos corações guardo para

sempre, junto ao meu.

Adriano e Adília

ix

Agradecimentos

À Professora Doutora Olga Matos, que amavelmente aceitou orientar o presente

trabalho, expresso não só a minha gratidão pela maneira como desde o início apoiou e

incentivou a minha formação e valorização profissional e a todas as oportunidades que

me proporcionou, mas também pela sua compreensão e amizade ao longo do período

complicado que atravesso nos últimos anos.

Ao Professor Doutor Francisco Antunes, agradeço a amabilidade de ter acedido

fazer parte da comissão tutorial deste trabalho de doutoramento, mas principalmente

agradeço todos os valiosos ensinamentos, profissionais ou de vida em geral, sempre

com a boa disposição que o caracteriza, assim como a confiança que tem em mim

depositado e todo o apoio e oportunidades que me concedeu.

Ao Doutor Lihua Xiao, agradeço a extraordinária oportunidade de me ter

recebido no seu laboratório, em Atlanta, os ensinamentos, a pronta disponibilidade e a

preciosa ajuda que me concedeu, durante o decorrer deste trabalho.

Ao Professor Doutor Jorge Gaspar, agradeço a amabilidade de ter acedido fazer

parte da comissão tutorial deste trabalho de doutoramento, e de toda a disponibilidade e

apoio que sempre demonstrou ao ser solicitado, acrescentando sempre uma visão

humorística às questões científicas.

À Professora Doutora Maria Amélia Grácio, que muito contribuiu para despertar

o interesse pela Parasitologia Médica, um obrigado especial pela amabilidade que

sempre me votou.

Ao Professor Doutor Virgilio de Rosário, agradeço a consideração e

disponibilidade que me concedeu.

Ao Doutor Bruno de Souza, da UEI de Epidemiologia Biostatística pelo tempo e

simpatia que amavelmente me disponibilizou para esclarecer as minhas dúvidas no

tratamento estatístico dos dados obtidos neste estudo.

A todos os colegas que passaram pela Unidade de Protozoários

Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, que partilharam comigo alegrias e tristezas,

que aturaram o meu mau humor pela manhã, em especial ao residente e amigo

Engenheiro Francisco Esteves, e às minhas amigas Margarida Alves e Marina Costa

agradeço todo o apoio, carinho e amizade. Ao Dr. António Amorim, e à Dr.ª Vera

x

Codices o meu reconhecimento pela ajuda, e pela amizade e votos de um óptimo

trabalho de doutoramento.

Aos meus familiares que tenho vindo a “negligenciar”, em especial à Ana, à Tia

Carmo e ao Luís, agradeço todo o carinho e apoio moral que me têm dado durante este

longo período.

A todos os que, de algum modo, contribuíram para a minha chegada ao fim desta

etapa e que, por falha não intencional, não foram aqui mencionados, o meu sincero

agradecimento.

xi

Publicações

A partir do conjunto de resultados, obtidos no decurso do presente projecto de

doutoramento, foram publicados os seguintes trabalhos, em revistas de circulação

internacional com arbitragem científica:

LOBO ML, TELES A, BARÃO DA CUNHA M, HENRIQUES J, LOURENÇO AM, ANTUNES F,

MATOS O. Microsporidia detection in stools from pets and animals from the Zoo.

Journal of Eukariotic Microbiology, 2003 , vol 50, suppl,:581-582

SULAIMAN IM, MATOS O, LOBO ML, XIAO L. Identification of a new microsporidian

parasite related to Vittaforma corneae in humans in Portugal. Journal of Eukariotic

Microbiology, 2003, vol 50, suppl.:586-590

MATOS O, LOBO ML, TELES A, ANTUNES F. Is Microsporidial infection in animals a

potencial source for human microsporidiosis?. Southeast Asian Journal of Tropical

Medicine and Public Health ,2004, 35 (Suppl 1): 48-53

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, MAGALHÃES N, ANTUNES F, MATOS O. Identification of

potentially human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi genotypes in various birds. Appl

Environ Microbiol. 2006 Nov; 72(11):7380-2.

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Genotypes of

Enterocytozoon bieneusi in Mammals in Portugal. J Eukaryot Microbiol. 2006 Nov; 53

Suppl 1:S61-4.

LOBO ML, SILVEIRA H, RAMOS S, XIAO L, MATOS O. Characterization of a Pathogen

Related to Vavraia culicis Detected in a Laboratory Colony of Anopheles stephensi. J

Eukaryot Microbiol. 2006 Nov; 53 Suppl 1:S65-7.

xii

Magalhães N, Lobo ML, Antunes, F, Matos, O. Aves e cães como potencial fonte de

infecção zoonótica por microsporídeos para o homem. Revista Portuguesa de Ciências

Veterinárias. 2006; 101 (557-558): 69-75.

A partir dos resultados desta dissertação, foram apresentados trabalhos em

reuniões científicas, cujos resumos foram publicados em livros de resumos ou em

revistas nacionais, ou internacionais, com comité de leitura:

LOBO ML, TELES A, MATOS O, BARÃO DA CUNHA M, HENRIQUES J, LOURENÇO AM,

ANTUNES F. Infecção por Microsporidia em animais em Portugal.[Abstract CO37] Acta

Parasitológica Portuguesa, 2003; 10(1): 68-69

MATOS O, LOBO ML, TELES A, ANTUNES F. Is Microsporidial infection in animals a

potencial source for human microsporidiosis?. [Abstract] 4th Seminar on Food and

Water-borne Parasitic Zoonoses. 2nd International Meeting on Gnathostomiasis. Joint

International Tropical Medicine Meeting 2003, 221

MATOS O, LOBO ML, XIAO L, MAGALHÃES N, TELES A, ANTUNES F. Human and

animal microsporidiosis, in Portugal. NATO Advanced Research Workshop “Emergent

Pathogens in the 21st Century: First United Workshop on Microsporidia from

Invertebrate and Vertebrate Hosts”. Folia Parasitologica, 2005, 52(1/2): S7A

LOBO ML, MAGALHÃES N, HENRIQUES J, ANTUNES F, MATOS O. Animais de

companhia como potenciais fontes de infecção zoonótica por microsporídeos para o

homem [resumo CO - 16]. Acta Parasitológica Portuguesa, 2005, 12 (1-2): 47-48.

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, ANTUNES F, MATOS, O. Frequency of microsporidian spores

among HIV-positive and HIV-negative patients. [resumo 62.044]. International Journal of

Infectious Diseases, 2006, 10 (Suppl 1): S298.

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, ANTUNES F, MATOS, O. Genotypes of Enterocytozoon

bieneusi in mammals in Portugal [PL64]. Nineth International Workshops on

xiii

Opportunistic Protists (IWOP-9) and International Conference on Anaerobic Protists

(ICAP), Lisboa, Portugal, 2006. Livro de resumos: 66-67.

LOBO ML, SILVEIRA H, RAMOS S, XIAO L, MATOS O. Occurrence of Vavraia culicis

related pathogen in a laboratory colony of Anopheles stephensi [PO20]. Nineth

International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-9) and International

Conference on Anaerobic Protists (ICAP), Lisboa, Portugal, 2006, Livro de resumos:

40.

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Mamíferos como

potenciais fontes de infecção zoonótica por Enterocytozoon bieneusi (Microsporidia)

[Abstract CO 14] Acta Parasitológica Portuguesa, 2006; 13 (1-2): 92-93

LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Genotypes of

Enterocytozoon bieneusi in Mammals in Portugal [Abstract 138A]. J Eukaryot

Microbiol. 2007 Mar-Apr; 54 (2): 47S.

LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. Species and Genetic Diversity of

Microsporidian Parasites among HIV-Positive and HIV-Negative Patients [Abstract P-

1885] 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

Chicago, Illinois, USA., 2007, Livro de resumos: 473.

MATOS O., LOBO ML., TELES A. & ANTUNES F. Is microsporidial infection in animals a

potential source for human microsporidiosis? In: Proceedings of the workshop on

waterborne human microsporidia. Frank W. Schaefer III e H. D. Alan Lindquist

(editores). U. S. Environmental Protection Agency, 2007, Cap 3: 57-66.

LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Enterocytozoon bieneusi and Vittaforma-

like: Detection and genotyping in HIV-positive and negative patients from Portugal.”

[resumo PO54]. X International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-10),

Boston, Massachusetts, USA, 2008. Livro de resumos: 84.

xiv

LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Occurrence of Cryptosporidium, Giardia,

and Microsporidia in water supplies in Portugal.” [resumo PO28]. X International

Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-10), Boston, Massachusetts, USA, 2008.

Livro de resumos: 49.

LOBO ML XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Enterocytozoon bieneusi e Vittaforma-like

(Microsporidia): Detecção e genotipagem em doentes seropositivos para VIH e em

imunocompetentes, em Portugal.” [resumo OA08] Congresso Nacional de Doenças

Infecciosas e Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso Nacional de

Doenças Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre Sida, XII

Congresso Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de resumos:

15.

LOBO ML F, XIAO L, WAAP H, GASPAR J, ANTUNES F, MATOS O. MATOS O.

“Ocorrência de Cryptosporidium, Giardia, Microsporidia, e Besnoitia spp. Em água de

consumo, em Portugal.” [resumo OA13] Congresso Nacional de Doenças Infecciosas e

Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso Nacional de Doenças

Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre Sida, XII Congresso

Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de resumos: 18.

MARTINHO, F, LOBO ML, MATOS O. “Aves silvestres como reservatórios de alguns

agentes com potencial zoonótico em Portugal” [resumo PA32] Congresso Nacional de

Doenças Infecciosas e Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso

Nacional de Doenças Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre

Sida, XII Congresso Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de

resumos: 52.

LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Microsporidia as Potential Pathogens in

HIV-positive and Immunocompetent Portuguese.” [resumo P-377]. 49th Interscience

Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC), San Francisco, CA,

USA., 2009. Abstract book.

xv

LOBO ML, XIAO L., ANTUNES F., MATOS O. Human pathogenic microsporidia: detection

and genotyping in HIV-positive and negative patients from Portugal [abstract PO6].

Eleventh International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-11), Hilo, Hawaii,

USA, 2010. Abstract book: 26.

xvii

Resumo

Os agentes responsáveis pela microsporidiose e, designados, genericamente, por

microsporidia são parasitas intracelulares obrigatórios, ubíquos na natureza. Os

microsporidia inicialmente reconhecidos como agentes patogénicos de insectos e peixes,

emergiram nas últimas décadas como um importante grupo de microrganismos

responsáveis por infecção no Homem, associada à pandemia da sida. Encontram-se

descritas na literatura mais de 1200 espécies de microsporidia, mas apenas um número

reduzido é considerado infectante para o Homem. Entre os microsporídios mais

prevalentes, responsáveis por infecção humana, encontram-se as espécies

Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem e

Encephalitozoon cuniculi. Recentemente foi identificada em Portugal, uma nova espécie

patogénica para o Homem - Vittaforma-like, em doentes seropositivos para VIH e em

imunocompetentes.

No Homem, os microsporídios causam desde patologia gastrintestinal a

infecções disseminadas variando os aspectos patogénicos da doença consoante a espécie

envolvida assim como com a resposta imunitária do hospedeiro. Já foram descritos

portadores assintomáticos de microsporídios, quer em imunodeficientes quer em

imunocompetentes

Actualmente, são ainda escassos os dados epidemiológicos sobre esta parasitose,

e poucos os estudos disponíveis sobre os animais identificados como potenciais

hospedeiros dos parasitas infectantes para o Homem. Mais recentemente, o contacto

com água infectada passou a ser considerado um factor de risco associado à

microsporidiose humana.

A recente aplicação de técnicas moleculares ao diagnóstico e caracterização dos

microsporidia, permitindo o reconhecimento de diferenças intraespecíficas, tem

contribuído para uma melhor compreensão da epidemiologia destes parasitas.

O presente trabalho tem como objectivos: (i) determinar a frequência de infecção

de microsporidia patogénicos para o Homem, numa população de seropositivos e

seronegativos para VIH, em animais em estreito contacto com humanos e em água de

abastecimento público, a fim de identificar, não só os parasitas infectantes para o

Homem, como, também, os seus possíveis reservatórios zoonóticos e ambientais; (ii)

xviii

caracterizar geneticamente as espécies e genótipos de microsporidia identificados na

população humana, animal e em amostras de água de consumo público; (iii) avaliar a

importância dos microsporidia na Saúde Pública Humana em Portugal.

No intuito de dar prossecução ao presente estudo, de modo a cumprir os objectivos

propostos, foram adoptadas metodologias de diagnóstico e caracterização genética dos

microsporidia, seleccionadas após extensa pesquisa bibliográfica. Todas as amostras

foram analisadas simultaneamente pela técnica parasitológica de coloração Gram-

Chromotrope e por PCR, com excepção das amostras fecais de animais silváticos de

vida livre e da água de consumo público, que atendendo às reduzidas quantidades de

amostra disponíveis, só foram estudadas pelas técnicas moleculares.

Para o presente trabalho foi efectuado um estudo retrospectivo e prospectivo,

englobando 1989 amostras fecais de 856 doentes (adultos e crianças) seropositivos e

seronegativos para VIH. A percentagem de doentes seropositivos para VIH estudados

foi de 65,5% (561/856) e seronegativos para VIH foi de 34,5% (295/856). Do total de

doentes (586 do sexo masculino e 270 do sexo feminino), 675 eram adultos e 181

crianças. Dos doentes analisados 57,6% apresentavam diarreia e 42,4% não

apresentavam quadro diarreico. Nove (3,1%) dos 295 seronegativos para VIH

apresentavam outras causas de imunossupressão. Uma frequência de infecção por

microsporidia de 12,0% (103/856) foi observada nas fezes da população humana

estudada, sendo que 13,9% e 8,5% das amostras fecais pertenciam a seropositivos e a

seronegativos para VIH, respectivamente. A percentagem de crianças e adultos

positivos para microsporidia foi de 18,8% e 10,2%, respectivamente. Os resultados

obtidos permitiram determinar uma associação significativa entre a presença de infecção

por microsporidia e os seropositivos para VIH, facto este que não constituiu um dado

surpreendente em virtude do carácter oportunista largamente atribuído a esta doença,

por outros autores. Foram identificados esporos de microsporídios nas fezes de doentes,

que, embora sendo seronegativos para VIH, apresentam outro tipo de deficit

imunológico. Através das técnicas de PCR, identificaram-se duas espécies de

microsporídios nas amostras fecais dos doentes estudados no presente trabalho. E.

bieneusi foi detectada em 6,3% (54/856) e Vittaforma-like em 6,8% (58/856) dos

doentes estudados. Na análise dos dados obtidos, não se verificou que a infecção por

microsporidia, em geral, nem, especificamente, por nenhuma das duas espécies

xix

identificadas nas fezes estivesse, significativamente, associada a doentes com quadro

diarreico. A caracterização genética da região ITS rRNA de 48 isolados de E. bieneusi

obtidos de humanos, de um total de 54 amplificados por PCR, permitiu identificar seis

genótipos diferentes, Tipo IV (37,5%), Peru 6 (29,2%), D (12,5%), A (8,3%), C (6,3%)

e PtEbII (6,3%). Até à data os genótipos A e C só foram identificados no Homem. Em

contrapartida os genótipos Tipo IV, Peru 6 e genótipo D já foram descritos numa vasta

gama de hospedeiros, incluído o Homem e outros animais (inclusive em cães, gatos e

ruminantes em Portugal). A caracterização genética dos 58 isolados de Vittaforma-like

revelou a presença de dois genótipos diferentes, previamente descritos em humanos:

Isolado 5830 (39 amostras) e Isolado 5843 (19 amostras), com frequências de 67,2% e

32,8%, respectivamente.

Para o estudo de microsporidia em amostras de urina, foram recolhidos 69

amostras, retrospectivamente e durante o decurso do trabalho, pertencentes a 69 doentes

(59 doentes seropositivos para VIH [85,5%] e 10 doentes seronegativos para VIH

[14,5%] sendo 44 adultos (63,8%) e 25 crianças (36,2%). Do total de amostras de urina

48 (69,6%) eram de doentes do sexo masculino e 21 (30,4%) de doentes do sexo

feminino. Foram identificados microsporídios em 1,5% (1/69) das amostras de urina,

correspondente a um seropositivo para VIH (1,7%). A espécie identificada na urina foi

E. intestinalis e a caracterização da sequência de um fragmento da região SSU rRNA

revelou total homologia com diversas sequências previamente descritas em humanos e

outros animais.

Para a identificação e caracterização de microsporídios em secreções

pulmonares, foram analisadas 200 amostras, recolhidas retrospectivamente e durante o

decorrer do estudo correspondentes a 124 expectorações induzidas (EI) e 76 lavados

broncoalveolares (LBA). As amostras pertenciam a 150 doentes seropositivos para VIH

(75%) e a 50 seronegativos para VIH (25%), sendo 129 (64,5%) do sexo masculino e 71

(35,5%) do sexo feminino. A percentagem de infecção por microsporidia foi de 1,0%

(2/200) em secreções pulmonares da população estudada. Dois seropositivos (1,3%)

apresentavam microsporídios, nomeadamente num LBA e numa EI. E. cuniculi e

Vittaforma-like foram identificadas nos referidos espécimes. A caracterização da SSU

rRNA para E. cuniculi revelou 99% de homologia genética nesta sequência com outras

sequências previamente descritas em humanos para E. cuniculi, e para a espécie

xx

Vittaforma-like registou-se homologia genética com o Isolado 5830, previamente

descrito em humanos em Portugal. Ambos os achados constituem os primeiros registos

desta espécie em secreções pulmonares no Homem em Portugal.

A detecção e caracterização dos microsporidia em animais, incluiu estudos

retrospectivos e prospectivos em amostras fecais de: 66 animais de companhia (oito

cães e 58 gatos) e 50 cães errantes albergados em canis; 100 bovinos, provenientes de

explorações leiteiras de várias regiões de Portugal; 103 animais cativos no Jardim

Zoológico de Lisboa (75 espécies de mamíferos, 9 espécies de répteis e 9 espécies de

aves); 134 pequenos mamíferos capturados nos concelhos de Moura e Aljustrel, Baixo

Alentejo (52 insectívoros de espécie Crocidura russula e 80 roedores Mus spretus e

dois Apodemus sylvaticus); 39 aves exóticas de gaiola de diversas espécies pertencentes

às Ordens Psittaciformes e Passeriformes (31 de um criador de aves e oito de agregados

familiares) e 52 pombos urbanos (Ordem Columbiformes), da região da grande Lisboa.

A maioria dos animais dos diversos grupos estudados não apresentava sintomatologia.

Nos diversos grupos de animais estudados foram identificados microsporidia em

amostras fecais de 8,6% de cães, 15,5% de gatos 40,7% de aves de gaiola e pombos

urbanos, 6,0% de bovinos e 1,9% de animais silváticos em cativeiro (Jardim

Zoológico).

E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de cães e gatos analisados, cuja

caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E. bieneusi, amplificados

por PCR, veio revelar a presença de seis genótipos distintos: TipoIV, PtEbIV, Peru6, D,

PtEbVIII e PtEbIX. Os genótipos PtEbIV, PtEbVIII e PtEbIX, foram descritos pela

primeira vez no decurso deste estudo. Nos cães foram identificados os genótipos D

(20%; 1/5), Peru6 (60,0%; 3/5) e PtEbIX (20%;1/5) e nos gatos os genótipos TipoIV

(77,8%), PtEbIV (11,1%) e PtEbVIII (11,9%). Verificou-se associação com

significância estatística da infecção pelo genótipo Tipo IV ao grupo dos gatos,

relativamente aos cães estudados. Também nos bovinos, a espécie E. bieneusi foi

identificada nas seis amostras positivas estudadas registando-se três genótipos diferentes

(dois dos quais já previamente reportados): TipoIV (50%; 3/6), PtEbXI (33,3%; 2/6) e J

(16,7%; 1/6) (AF135837). O genótipo PtEbXI foi caracterizado pela primeira vez no

decurso deste estudo. A espécie E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois

mamíferos do jardim Zoológico: o saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) e o

xxi

cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros) e a genotipagem através da

região ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi permitiu caracterizar, pela primeira vez,

durante o decurso deste trabalho, dois genótipos distintos: PtEbV (cavalo de Timor) e

PtEbXII (saguim de face branca). A análise da diversidade genética da região ITS rRNA

dos 10 genótipos diferentes de E. bieneusi identificados num total de 22 isolados de

cães, gatos, bovinos e animais do Jardim Zoológico (um primata não humano e um

bovídeo) estudados permitiu verificar a presença na maioria destes mamíferos (cães,

gatos e bovídeos) de genótipos patogénicos para o Homem e de outros genótipos

específicos de hospedeiro (cão, gato, bovinos e primata não humano), que,

possivelmente, não terão impacte na saúde pública humana. Nos 134 pequenos

mamíferos (Crocidura russula, Mus spretus e Apodemus sylvaticus não foi observado

nenhum animal com infecção por microsporidia.

As espécies E. bieneusi e E. hellem foram identificadas, em 35,2% (32/91) e

13,2% (12/91), respectivamente, das aves de gaiola e pombos de parques públicos de

Lisboa estudadas. Registou-se co-infecção por ambas as espécies. Ambos os

microsporidia foram identificados nas três Ordens de aves: Psittaciformes (E. bieneusi-

12,5%; E. hellem- 12,5%); Passeriformes (E. bieneusi- 14,3%; E. hellem- 42,9%) e

Columbiformes (E. bieneusi- 51,9%; E. hellem- 6,9%). Contudo, nos pombos

(Columbiformes) registou-se uma elevada frequência de infecção por E. bieneusi,

estatísticamente significativa, comparativamente à observada nas outras duas Ordens de

aves. Para a espécie E. hellem a percentagem mais elevada de infecção nos

Passeriformes (42,9%; 3/7), não apresentou significância estatística. A caracterização do

locus ITS rRNA, dos 32 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, revelou a presença

do genótipo Peru6 descrito pela primeira vez em humanos, no Peru, e foi caracterizado

pela primeira vez o genótipo PtEbII muito semelhante ao Peru6, com uma única

alteração nucleotídica (G para A) junto da extremidade 3’ do fragmento amplificado por

PCR. Em pombos registou-se a presença simultânea dos dois genótipos. Nos 12

isolados de E. hellem identificados nas amostras fecais e/ou conteúdo intestinal e numa

raspagem da traqueia da população de aves analisada, e caracterizados com recurso à

sequenciação nucleotídica do fragmento do gene da SSU rRNA, verificou-se 99% a

100% de homologia genética das sequências obtidas com sequências do gene da SSU

rRNA, previamente reportadas no homem e em aves (genótipos 1 e 2). No interior das

xxii

regiões alvo, registaram-se três locais polimórficos, que permitem agrupar em três tipos

diferentes as 12 sequências dos isolados de E. hellem obtidos neste estudo: PtEhI

(genótipo1, previamente descrito); PtEhII (99% homologia genética com genótipo 2) e

PtEh III (99%de homologia genética com PtEhII).

No presente trabalho, também com o intuito de determinar a presença de esporos

de microsporídios, foram analisadas 184 amostras de água, de locais de amostragem

envolvidos no processo conducente ao abastecimento de água da cidade de Lisboa (175

amostras processadas de acordo com o método 1623 da USEPA e purificadas por

separação imunomagnética [IMS] para os géneros Cryptosporidim spp. e Giardia e

nove sem IMS). Cento e seis eram amostras de água tratada (42 captações subterrâneas,

25 captações superficiais, 39 de água de abastecimento), provenientes de três Estações

de Tratamento e reservatórios de água de abastecimento da cidade de Lisboa, e 69 eram

amostras de águas não tratadas, obtidas em captações superficiais (30 amostras) e na

captação subterrânea (30 amostras com IMS e nove sem IMS). As espécies E. bieneusi e

Vittaforma-like foram identificadas em água de abastecimento da cidade de Lisboa,

tanto na água de origem superficial como subterrânea. A genotipagem de Vittaforma-

like revelou a presença de um genótipo Isolado 5830, descrito em humanos, em

Portugal. Também o genótipo Tipo IV de E. bieneusi, potencialmente infectante para o

homem e outros animais, foi identificado em água tratada com origem subterrânea.

Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar a presença de espécies

e/ou genótipos de microsporidia patogénicos para o Homem em seropositivos e

seronegativos para VIH, em animais e em águas de consumo público, em Portugal.

Também na nossa população humana, tal como descrito na literatura, a infecção por

estes parasitas, , parece afectar os grupos mais susceptíveis, como os doentes com

imunossupressão, crianças e idosos. Por outro lado, a identificação dos mesmos

genótipos de microsporidia, com destaque para os genótipos de E. bieneusi, em

humanos e animais, sugere a ocorrência de transmissão zoonótica através de animais em

estreito contacto com o Homem. Dos resultados obtidos verificou-se que, quer para os

humanos, quer para os animais não foi observada associação directa entre a infecção por

microsporidia e a presença de sintomatologia, nomeadamente de diarreia, sugerindo a

existência, em ambos os grupos populacionais estudados, de portadores crónicos

assintomáticos e salientando a sua importância no ciclo de transmissão destes parasitas.

xxiii

Em suma a análise dos dados deste estudo sugere um papel relevante a nível da

Saúde Pública, para os microsporidia circulantes, entre a população portuguesa,

evidenciando a necessidade de implementar a pesquisa de microsporídios no

diagnóstico de rotina, com recurso a métodos de referência bem definidos e adequados à

sua utilização nos laboratórios de rotina. A metodológica adoptada neste estudo,

nomeadamente as técnicas de PCR e sequenciação de DNA, traduziu-se numa

abordagem eficaz para atingir os objectivos propostos.

Esperamos que os resultados obtidos neste estudo, contribuam para clarificar a

epidemiologia da microsporidiose em Portugal, mais precisamente, os processos

envolvidos na circulação e transmissão destes microrganismos oportunistas à população

susceptível

xxv

Abstract

Microsporidia are small eukaryotic, obligate intracellular parasites with a

widespread occurrence in animals. There are over 1200 species of microsporidia, but

only a few have been identified as cause of human diseases. Before onset of the AIDS

pandemic, microsporidia infections had only been described in few cases, but by the

expansion of the pandemic, microsporidia came increasingly under attention.

The most frequent human infecting microsporidia species are Enterocytozoon

bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem and Encephalitozoon.

cuniculi. Recently it has been identified in Portugal, a new species pathogenic to

humans - Vittaforma-like, in HIV-positive patients and in immunocompetent persons.

These emerging opportunistic organisms have now become important pathogens that

can cause a broad spectrum of intestinal and disseminated pathologies depending on the

infectious species involved and also on the immune status of the host. Microsporidia

asymptomatic carriage was already described among both imunossupressed and

immunocompetent population.

The epidemiology of human microsporidia infections is still unclear in many

aspects. Routes of transmission and sources of human microsporidia infections have

been difficult to ascertain. However, the four most common human microsporidian

species have been reported in a wide range of domestic and wild animals. Thus, it has

been debated for some time now whether animals could be a source of infection of

microsporidiosis to humans. More recently, a risk factor consistently associated with

human microsporidiosis in epidemiological studies is the contact with water.

The use of molecular methods has provided new tools to detect and characterize

microsporidia, and the finding of previously unrecognized intraspecific genetic

differences has improved our understanding of the epidemiology and zoonotic

transmission of microsporidia.

This study intended to: (i) confirm the occurrence and determine the frequency

of infection of human patogenic microsporidia in HIV-positive and negative patients, in

several animals species with close contact with humans (pet dogs, cats and birds,

bovines, captive animals from the zoo and pigeons from public parks) and in

environmental samples (water), in order to identify, not only the microsporidian species

xxvi

enrolled in Portuguese human infection, but also to determine potential animal

reservoirs and environmental sources of infection; (ii) to characterize the parasites

found at the genotype level; (iii) to evaluate the public health significance of

microsporidia in Portugal.

The frequency of microsporidia, genetic diversity, distribution of genotypes and

the relationship between observed genotypes and different parameters of infection

among humans, animals and environmental samples enrolled in the study were

investigated using SSU rRNA and ITS-based PCR, followed by DNA sequencing.

In order to achieve the objectives proposed in this study were adopted

methodologies for diagnosis and genetic characterization of microsporidia, selected

after an extensive literature search. All samples were analyzed by both the

parasitological Gram-Chromotrope staining and PCR-techniques, with the exception of

fecal samples from free-living animals and water for public consumption. Water

samples due to the small amount of samples available, have only been studied by

molecular techniques..

For the present work it was carried out a retrospective and prospective study,

comprising 1989 fecal samples from 856 patients (adults and children), HIV-positive

and negative. The percentage of HIV-positive and negative patients studied was 65.5%

(561/856) and 34.5% (295/856), respectively. Of all patients (586 males and 270

females), 675 were adults and 181 children. Of the patients studied 57.6% had diarrhea

and 42.4% had no diarrhea. Nine (3.1%) of the 295 HIV-negative had other causes of

immunosuppression. A frequency of infection with microsporidia of 12.0% (103/856)

was observed in the feces of human population studied; being 13.9% and 8.5% of the

fecal samples from HIV-positive and HIV-negative patients, respectively. Percentages

of 18.8% and 10.2% of positive children and adults, respectively were observed. The

results obtained indicated a significant association between the presence of

microsporidia infection and HIV-positive patients. This data was not a surprising fact

due to the opportunistic nature attributed to this disease. Microsporidia infection was

identified in the feces of patients, which, although HIV-negative, have another type of

immunedeficiency. Overall, the infection with microsporidia was significantly

associated with patients with diarrhea. E. bieneusi was identified in 6.3% (54/856) and

Vittaforma-like in 6.8% (58/856) of the fecal samples from the patients studied. Genetic

xxvii

characterization of the ITS rRNA region was performed on 48 isolates of E. bieneusi

obtained from humans, from a total of 54 amplified by PCR. Six different genotypes

were identified, Type IV (37.5%), Peru 6 (29.2%), D (12.5%), A (8.3 %), C (6.3%) and

PtEbII (6.3%). So far, the genotypes A and C were identified only in humans. In

contrast, Type IV, Peru 6 and D genotypes have been described in a wide range of

hosts, including humans and other animals (including dogs, cats and ruminants in

Portugal). A total of 58 isolates of Vittaforma-like were characterized genetically

revealing the presence of two different genotypes, previously described in humans:

Isolated 5830 (39 samples) and isolate 5843 (19 samples), with frequencies of 67.2%

and 32.8 %, respectively.

Urine samples both collected retrospectively and during the course of the study

were obtained from 69 patients corresponding to 59 (85.5%) HIV-positive patients and

10 (14.5%) HIV-negative patients. Of the total sample, 48 (69.6%) were males and 21

(30.4%) females and 44 (63,8%) were adults and 25 (36,2%) children. Microsporidia

were identified in 1.5% (1/69) of the urine samples, corresponding to one HIV-positive

patient (1.7%; 1/59). The species identified in the urine was E. intestinalis, and

characterization of the sequence of a fragment of the SSU rRNA showed total

homology with several sequences previously described in humans and other animals.

For the identification and characterization of microsporidia were analyzed 200

pulmonary secretions, collected retrospectively and during the course of the study,

corresponding to 124 induced sputa (IS) and 76 bronchoalveolar lavage (BAL) fluids.

The samples were collected from 150 (75%) HIV-positive patients and from 50 (25%)

HIV-negative patients. The proportion of men and women corresponding to the samples

studied was 64.5% and 35.5% respectively. The percentage of microsporidia infection

was 1.0% in pulmonary secretions of the population studied. Two HIV-positive patients

(1.3%) had microsporidia in a BAL and an EI. E. cuniculi and Vittaforma-like were

identified in these specimens. Characterization of SSU rRNA for E. cuniculi revealed

99% homology in this gene sequence with other sequences previously described in

humans for E. cuniculi, and for the species Vittaforma-like there was genetic homology

with the isolate 5830 that was previously described in humans in Portugal. Both

findings are the first records of this species in pulmonary secretions in humans in

Portugal.

xxviii

The detection and characterization of microsporidia in animals, included

retrospective and prospective studies in fecal samples: 66 companion animals (eight

dogs and 58 cats) and 50 stray dogs housed in kennels, 100 cattle from dairy farms in

various regions of Portugal, 103 captive animals in Lisbon Zoo (75 species of

mammals, nine species of reptiles and nine9 species of birds), 134 small mammals

captured in the municipalities of Aljustrel and Moura and Baixo Alentejo (52

insectivores Crocidura Russula and rodents 80 Mus spretus and two Apodemus

sylvaticus) and 39 exotic birds cage of several different species belonging to the orders

Psittaciformes and Passeriformes (31 from a poultry farmer and eight pets) and 52 urban

pigeons (order Columbiformes), from the Lisbon area. Most animals in each group did

not display symptoms. In the several groups of animals studied microsporidia were

identified in fecal samples from dogs (8.6%), cats (15.5%), caged birds and pigeons

(40.7%), bovine (6.0%) and silvatic animals (zoo)(1.9%). E. bieneusi was identified in

fecal samples from cats and dogs. The characterization of the ITS rRNA sequences of 14

isolates of E. bieneusi, has revealed the presence of six different genotypes: TypeIV,

PtEbIV, Peru6, D, and PtEbVIII PtEbIX. Genotypes PtEbIV, PtEbVIII and PtEbIX

were first described during this study. Genotypes D (20%, 1/5), Peru6 (60.0%, 3/5) and

PtEbIX (20%, 1/5) were identified in dogs, and TypeIV (77.8%), PtEbIV (11.1%) and

PtEbVIII (11.9%) were identified in cats. There was a statistically significant

association of infection with genotype Type IV to the group of cats. In cattle, E.

bieneusi was identified in the six positive samples. The genetic characterization

revealed three different genotypes (including two previously reported): TypeIV (50%,

3/6), PtEbXI (33.3%, 2/6) and J (16.7% 1/6). Genotype PtEbXI was characterized for

the first time during this study. The species E. bieneusi was identified in feces of two

mammals from the zoo: the white-fronted marmoset (Callithrix geoffroyi) and horse

Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros). ITS rRNA genotyping of the two E.

bieneusi isolates allowed characterizing for the first time during the course of this work,

two distinct genotypes: PtEbV (horse Timor) and PtEbXII (white-fronted marmoset).

Analysis of genetic diversity of the ITS rRNA of 10 different genotypes of E. bieneusi

identified in 22 isolates from dogs, cats, cattle and animals from the zoo (a non-human

primate and bovid) demonstrated the presence in most of these mammals (dogs, cats

and cattle), of genotypes pathogenic to humans and other host specific genotypes (dog,

xxix

cat, cattle, and nonhuman primate), which possibly have no impact on human health. In

the fecal samples of the 134 small mammals (Crocidura Russula, Mus spretus and

Apodemus sylvaticus) studied no microsporidian spores were detected.

The species E. bieneusi and E. hellem were identified in 35.2% (32/91) and

13.2% (12/91), respectively, of caged birds and pigeons from public parks in Lisbon

studied. Co-infection by both microsporidia species were observed in avian samples.

Both microsporidia were identified in three orders of birds studied: Psittaciformes (E.

bieneusi-12.5%; E. hellem-12.5%), Passeriformes (E. bieneusi-14.3%; E. hellem-42,

9%) and Columbiformes (E. bieneusi-51.9%; E. hellem-6.9%). However, in pigeons

(Columbiformes) there was a high frequency of infection by E. bieneusi, statistically

significant compared to that observed in the other two orders of birds. For E. hellem the

highest percentage of infection in the Passeriformes (42.9%; 3/7) was not statistically

significant. The characterization of the ITS rRNA locus of the 32 isolates belonging to

the species E. bieneusi, revealed the presence of genotype Peru6 first described in

humans in Peru, and it has been characterized for the first time PtEbII genotype, very

similar to Peru6, with a single nucleotide change (G to A) near the 3 'end of the

fragment amplified by PCR. The simultaneous presence of the two genotypes was

observed in two pigeons. The genetic sequences obtained from the 12 isolates of E.

hellem identified in fecal samples and/or intestinal contents and a scraping of the

trachea of the bird population, analyzed and characterized using the nucleotide

sequencing of the gene fragment of SSU rRNA, showed 99% to 100% homology with

sequences of the SSU rRNA gene, previously reported in humans and birds (genotypes

1 and 2). Within the target regions, there were three polymorphic sites, which allow to

group the 12 isolates of E. hellem from this study into three different sequences: PtEhI

(genotype1 previously described); PtEh II (99% genetic homology with genotype 2) and

PtEh III (99% of genetic homology with PtEhII).

In the present study 184 water samples were analyzed. These water samples

corresponded to sampling sites involved in the process leading to the water supply of

Lisbon (175 samples processed according to the USEPA 1623 method and purified by

immunomagnetic separation [IMS] and nine without IMS): 106 treated water samples

collected at water treatment plants (25 surface and 42 groundwater source and 39

finished water samples from six main entrance points to the city of Lisbon water

xxx

supply), as well as 69 raw water samples, obtained in the surface (30 samples) and

groundwater source (30 and nine samples with IMS and without IMS treatment,

respectively). The species E. bieneusi and Vittaforma-like were identified in water

supply of the city, both on the surface and groundwater sources. Genotyping of

Vittaforma-like revealed the presence of a genotype (Isolate 5830), described in humans

in Portugal. The Type IV E. bieneusi genotype, potentially pathogenic for man and

other animals, was detected in treated water from groundwater source.

In conclusion, this study confirmed the presence of species or genotypes of

microsporidia pathogenic to humans in HIV-positive and negative patients, in animals

and in water for public consumption in Portugal. Microsporidia infection, as described

in the literature in this study, also appears to affect the most susceptible population,

such as patients with immunosuppression, children and the elderly. The identification

of human infecting microsporidia genotypes, both in humans and animals, in what

concerns the species E. bieneusi suggests zoonotic transmission from animals in close

contact with humans. It was not observed a direct association between infection with

microsporidia and the presence of symptoms, including diarrhea (for both humans and

animals), suggesting the existence in both populations of asymptomatic chronic carriers,

and emphasizing their importance in the transmission cycle of these parasites.

In summary, the analysis of data from this study suggests an important role at

Public Health for the microsporidia circulating among the Portuguese population,

highlighting the need to implement the diagnosis of microsporidia in routine

laboratories, using standard methods well-defined and suitable for use in these

laboratories. The methodology adopted in this study, namely the PCR and DNA

sequencing techniques, resulted in an effective approach to achieve the proposed

objectives. We hope that the results of this study will contribute to clarify the

epidemiology of microsporidiosis in Portugal, more precisely, the processes involved in

the circulation and transmission of opportunistic microorganisms to susceptible

population.

xxxi

Lista de abreviaturas

% – Percentagem

% (m/v) – Percentagem massa/volume

ºC – Grau Celsius

5S rRNA – Sequência pequena do RNA ribossómico da subunidade grande

ribossomal

5.8S rRNA – Sequência pequena do RNA ribossómico da subunidade grande

ribossomal

18S rRNA – Subunidade pequena do RNA ribossómico

26S rRNA – Sequência grande do RNA ribossómico da subunidade grande

ribossomal

A, C, G, T – Bases orgânicas constituintes dos nucleótidos (adenina, citosina,

guanina e timina)

α TUB – Alfa tubulina

AcM – Anticorpo monoclonal

ADP – Adenosina difosfato

ASD – Estudo do espectro do vírus da imunodeficiência humana em adultos e

adolescentes, do inglês Adult and Adolescent Spectrum of HIV Disease

ATP – Adenosina trifosfato

β TUB – Beta tubulina

BSA – Albumina sérica bovina, do inglês bovine serum albumin

CDC – Centro de controlo e prevenção de doenças dos Estados Unidos da

América, do inglês Centers for Disease Control and Prevention.

CT – Ciclo limite de amplificação, do inglês threshold cycle

DNA – Ácido desoxirribonucleico, do inglês desoxiribonucleic acid

dNMP – Desoxirribonucleótido monofosfato

ddNTP – Didesoxirribonucleótido trifosfato

dNTP – Desoxirribonucleótido trifosfato

dsDNA – Ácido desoxirribonucleico em cadeia dupla, do inglês double strand

DNA

xxxii

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

EF3 – Factor de elongação 3, do inglês elongation factor 3

EI – Expectoração induzida

ELISA – Teste imunoenzimático especifico, do inglês enzyme-linked

immunosorbent assay

E.U.A. – Estados Unidos da América

EXO – Exonuclease I

g – Grama

g – Aceleração gravitacional (unidade de força centrífuga relativa)

H+ – Ião hidrogénio

HAART – Terapêutica anti-retrovírica potente, do inglês Highly Active

AntiRetroviral Therapy

HCl – Ácido clorídrico

IF – Imunofluorescência

IFI – Imunofluorescência indirecta

IgG – Imunoglobulina do tipo G

IgM – Imunoglobulina do tipo M

IL-1β – Interleucina 1 beta

IL-6 – Interleucina 6

IL-8 – Interleucina 8

IFN-γ – Interferão gama

ITS – Espaçadores internos transcritos, do inglês internal transcribed

spacers, do operão nuclear do RNA ribossómico

Kb – Quilobases

kDa – Quilodaltons

kV – Quilovolt

L – Litro

λ – Lambda

LBA – Lavado broncoalveolar

LO – Lavado oral

mg – Miligrama

Mg2+

– Ião magnésio

xxxiii

Mb – Milhões de pares de bases

MgCl2 – Cloreto de magnésio

ml – Mililitro

MLG – Genótipo multilocus, do inglês multilocus genotype

mm – Milímetro

mM – Milimolar

mm3 – Milímetro cúbico

mmHg – Milímetros de mercúrio

mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro, do inglês messenger ribonucleic acid

MSG – Glicoproteínas major de superfície, do inglês major surface

glycoproteins

LSU rRNA – Subunidade grande do RNA ribossómico, do inglês

mithocondrial large subunit ribossomal RNA

SSU rRNA – Subunidade pequena do RNA ribossómico, do inglês

mithocondrial small subunit ribossomal RNA

N – Número

NJ – Método de análise de semelhanças, do ingles Neighbour Joining

ng – Nanograma

nm – Nanómetro

nmol – Nanomol

nt – Nucleótido

O2 – Oxigénio molecular

OH – Grupo hidroxilo

OMS – Organização Mundial de Saúde

P – Probabilidade

PaO2 – Pressão parcial do oxigénio

pb – Pares de base

PBS – Tampão fosfato salino, do inglês phosphate buffered saline

PCA – Análise de componentes principais, do inglês principal componente

analysis

PCR – Reacção de polimerização em cadeia, do inglês polymerase chain

reaction

xxxiv

PFGE – Electroforese em campo pulsado, do inglês pulsed-field gel

electrophoresis

RFLP – Análise de fragmentos de restrição, do inglês restriction fragment

length polymorphism

RNA – Ácido ribonucleico, do inglês ribonucleic acid

rRNA – Ácido ribonucleico ribossómico, do inglês ribosomal ribonucleic acid

RT-PCR – Reacção de polimerização em cadeia em tempo real, do inglês real time

polymerase chain reaction

SCID – Imunodeficiência severa combinada, do inglês Severe combined

immunodeficiency

Sida – Síndroma de imunodeficiência adquirida

SNP – Polimorfismo de base única, do inglês single nucleotide polymorphim

SPSS – Programa informático de análise estatística, do inglês statistical

package for social sciences

SSCP – Análise de polimorfismos por conformação de DNA em cadeia

simples, do inglês single strand conformation polymorphysm

TA – Temperatura de hibridação, do inglês annealing temperature

TAE – Tampão tris-acetato-EDTA

TATA – Sequência característica da região promotora de genes, constituída por

timina e adenina

TBE – Tampão tris-Borato-EDTA

TCD4+ – Linfócitos T com receptores do agrupamento de diferenciação 4, do

inglês cluster of differentiation 4

TCD8+ – Linfócitos T com receptores do agrupamento de diferenciação 8, do

inglês cluster of differentiation 8

TE – Tampão tris-HCl-EDTA

TLR2 – Receptor do tipo toll 2, do inglês toll-like receptor 2

TNF-α – Factor de necrose tumoral alfa

Tris-HCL – Tris(hidroximetilo)aminometano-ácido clorídrico

tRNA – Ácido ribonucleico de transcrição, do inglês transcription ribonucleic

acid

U – Unidade

xxxv

UDG – Uracilo-DNA glicosidase

UCS – Região conservada, do inglês upstream conserved region

UTR – Região não transcrita, do inglês untranslated region

UV – Ultravioleta

V – Volt

VIH – Vírus da imunodeficiência humana

W – Watt

χ2 – Teste do Chi-quadrado

μl – Microlitro

m – Micrómetro

xxxvii

Índice geral

Página

Agradecimentos …….............................................................................................. ix

Publicações …………............................................................................................. xi

Resumo ……........................................................................................................... xvii

Abstract ……........................................................................................................... xxv

Lista de abreviaturas ……....................................................................................... xxxi

Índice geral ……...….............................................................................................. xxxvii

Índice de figuras ……............................................................................................. xlv

Índice de quadros …................................................................................................ xlvii

PRIMEIRA PARTE

(Introdução Geral aos Microsporidia) .………………...........................1

1. Perspectiva histórica …..………………………………………..…................. 3

2. Classificação taxonómica e biologia dos microsporídios................................ 7

2.1. Taxonomia ………………………………………………................... 7

2.1.1 A descoberta e visão inicial sobre a evolução dos

microsporídios …………………………………………..…..….12

2.1.2 Os Archezoa e primeiros dados moleculares dos

microsporídios …………………………………….….……...…13

2.1.3 Uma ligação aos fungos ………………………………….…..…15

2.2 Morfologia e Ciclo de vida …………………………………………....18

2.2.1 Morfologia dos microsporídios ………………………………....18

2.2.2 Ciclo de Vida …………………………………………….……..21

3. Espectro clínico e patogenia no Homem …………………………….……….28

3.1 Infecções por espécies de microsporidia mais frequentes .......................28

3.1.1 Infecção por Enterocytozoon bieneusiI ………………..……......30

3.1.2 Infecção por Encephalitozoon intestinalis ……………….…..….31

3.1.3. Infecção por Encephalitozoon hellemi ………………………….31

3.2. Infecções por espécies de microsporidia menos frequentes …………...33

3.2.1 Infecção por Anncaliia spp. ……………………………..……….33

xxxviii

3.2.2. Infecção por Microsporidium spp. ……………………………...34

3.2.3. Infecção por Nosema ocularum ……………………………..….34

3.2.4 Infecção por Pleistophora sp. …………………………………...34

3.2.5. Infecção por Trachipleistophora spp. ……………………….….35

3.2.6. Infecção por Vittaforma corneae ……………………………….35

4. Imunologia …………………………………………............................................37

4.1.Resposta Imunológica .................................……………….....................38

4.1.1 Relações parasita-hospedeiro …………………………………....39

4.1.2 Mecanismos de resistência do hospedeiro ……..……………..…40

4.1.2.1 Imunidade humoral ………………………………….......40

4.1.2.2 Imunidade celular ………………………………………..41

4.1.3 Especificidade de hospedeiro ……………………………………42

5. 5. Diagnóstico da microsporidiose ………………...............................................44

5.1. Diagnóstico presuntivo ……………………..………………...................44

5.2. Diagnóstico definitivo ………..................................................................44

5.2.1 Microscopia electrónica de transmissão ………………………...45

5.2.2 Microscopia óptica ……………………………………………….46

5.2.2.1 Exame histológico ao microscópio óptico …………….…46

5.2.2.2 Diagnóstico citológico e exame de fezes ………………...47

5.2.2.2.1 Coloração pelo tricrómio modificado ……….…48

5.2.2.2.2 Coloração pelo Gram – Chromotrope ……….....49

5.2.2.2.3 Coloração por fluorocromos …………………...49

5.2.3. Técnicas de imunofluorescência indirecta com anticorpos

mono e policlonais …………………………………………….50

5.2.4 Testes serológicos ………………………………………………51

5.2.5 Isolamento em culturas celulares …………………………….....53

5.2.6 Modelos animais …………………………………………….….54

5.2.7 Métodos moleculares ………………………………………..….55

6. Tratamento da microsporidiose humana …………...........................................67

6.1. Tratamento da infecção intestinal ……. …..……………........................68

6.2. Tratamento da infecção ocular ................................................................70

7. Controlo e prevenção da microsporidiose ………..............................................71

A B

xxxix

8. Epidemiologia da microsporidiose Diagnóstico ……......................................73

8.1.Distribuição geográfica e prevalência no Homem .……………............73

8.1.1 Distribuição geográfica e prevalência no Homem

da espécie Entrocytozoon bieneusi ……………………………...74


da espécie Encepalitozoon intestinalis…………………………….78


da espécie Encephalitozoon cuniculi …………………………….79


da espécie Encephalitozoon hellem ………………………………81

8.1.5 Grupos específicos da População humana, em

risco de microsporidiose ………………………………………….81

8.2. A microsporidiose noutros animais ……….............................................86

8.2.1. Mamíferos ………………………………………………………..86

8.2.2. Aves …………………………………………………………..….89

8.3. Fontes de Infecção e Modos de transmissão ….......................................91

8.3.1. Transmissão inter-humana (vertical e horizontal) .....................91

8.3.2. Transmissão Zoonótica .............................................................93

8.3.3. Transmissão hídrica ………………..……................................96

8.3.4. Transmissão através de alimentos contaminados ......................98

8.3.5. Transmissão aérea ……………………………………………..99

8.3.6. Transmissão por vectores (insectos) ………………………….100

9. Epidemiologia Molecular ……………………………........................................102

9.1. Identificação da diversidade genética de Enterocytozoon

bieneusi ………………………………………………………………….102

9.2. Identificação de diversidade genética de Encephalitozoon

cuniculi ………………………………………………………………….107


hellem ……………………………………………………………………108


intestinalis ………………………………………………………………..108

xl

SEGUNDA PARTE

(Caracterização Epidemiológica de Microsporidiose em Portugal ) .... 111

CapítuloI – Objectivos Gerais…………………………………………………...113

Capítulo II – Material e Métodos ….....................................................................117

1. População estudada ………………………………………………….........118

1.1. População humana …………………………………………………....118

1.1.1. Amostras Fecais ..........................................................................118

1.1.2. Amostras de Urina ……………………………………………..119

1.1.3. Secrecções pulmonares ………………………………………...120

1.2. População animal ……………………………...……...………............121

1.2.1. Cães e gatos ……………...........................................................121

1.2.2. Gado bovino de explorações leiteiras ........................................122

1.2.3 Animais silváticos em cativeiro …………………………..........122

1.2.4 Animais silváticos de vida livre ……..…………………...........124

1.2.5 Aves exóticas de gaiola e pombos urbanos .................................125

1.3. Amostras ambientais ............................................................................126

1.4. Definição do critério de positividade ....................................................128

2. Processamento e concentração de amostras fecais, urina e secrecções

pulmonares (expectoração induzida e lavados broncoalveolares) ….….128

2.1. Amostras fecais ....................................................................................128

2.2 Amostras de urina ……………………………….................................129

2.3 Secreções pulmonares ...........................................................................129

2.3.1 Expectoração induzida (EI) .......................................................130

2.3.2 Lavado broncoalveolar (LBA) ……….......................................130

2.4 Obtenção do conteúdo intestinal e exsudado traqueal post mortem

de um grupo de aves ………..……...…................................................131

3. Coloração diferencial ..............................................................................132

3.1 Coloração pelo Gram-Chromotrope (GC) …………………................132

3.1.1 Quantificação da carga parasitária ………………………….....133

4. Extracção de DNA .....................................................................................134

xli

5. Diagnóstico molecular das espécies Enterocytozoon bieneusi,

Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon cuniculi,

Encephalitozoon hellem e Vittaforma-like .............................................. 136

5.1 Amplificação de DNA genómico de microsporídios no geral ..........138

5.2 Amplificação de DNA genómico de Encephalitozoon intestinalis,

Encephalitozoon cuniculi, Encephalitozoon hellem ...........................139

5.3 Amplificação e caracterização genética de DNA genómico de

Enterocytozoon bieneusi ……….........................................................141

5.3.1 Amplificação de DNA genómico de Enterocytozoon

bieneusi ………………………………………………….……141

5.3.2 Desenvolvimento e optimização de uma nova técnica de PCR

nested …...................................................................................142

5.3.3 Caracterização génetica dos isolados de Enterocytozoon

bieneusi ……………………………………………………….144

5.4 Caracterização Genética de uma nova espécie de microsporídio -

Vittaforma-like ..................................................................................145

5.4.1 Detecção da espécie Vittaforma-like …………….………….145

5.4.2 Amplificação de DNA genómico de Vittaforma-like .............146

5.5 Visualização do DNA amplificado ……………..............................147

6. Purificação e Sequenciação dos fragmentos amplificados

por PCR ………………………………………………………………..148

6.1 Análise da diversidade genética da região ITS rRNA de

E. bieneusi de animais (mamíferos) ……..........................................152

7. Análise estatística ...................................................................................153

Capitulo III - Detecção e caracterização genética de microsporidia

em humanos (seropositivos e seronegativos para VIH) ..............155

1. Introdução ……….……………..…………………..….………….........157

2. Resultados ………………………...……………….………...………….158

2.1 Detecção e identificação de microsporídios em amostras fecais,

amostras de urina e secreções pulmonares de doentes infectados

por VIH ..............................................................................................158

2.1.1 Microsporidia em amostras fecais ...........................................158

xlii

2.1.1.1 Seropositivos para o VIH ...………………………….162

2.1.1.2 Seronegativos para VIH .………………………….…164

2.1.1.3 Caracterização genética dos isolados de

Enterocytozoon bieneusi e Vittaforma-like ……….…165

2.1.2 Microsporidia em amostras de urina …..…………………….171

2.1.2.1 Seropositivos para ..VIH …………………………...171

2.1.2.2 Seronegativos para VIH ………….………………...172

2.1.3 Microsporidia em secreções pulmonares ……………….….172

2.1.3.1 Seropositivos para VIH …..………………………...173

3. Discussão ………………………...……………….………..…………….175

Capitulo IV - Detecção e caracterização genética de microsporidia

em animais ……………………………………………………….....187

1. Introdução ……….…………….………………….….…………...….….189

2. Resultados ………………………...……………….…………………….190

2.1 Detecção e identificação de microsporídios em animais ....................190

2.1.1 Ocorrência e identificação de microsporídios

em animais domésticos - cães e gatos e cães errantes .............190

2.1.2 Ocorrência e identificação de microsporídios em bovinos .….191

2.1.3 Ocorrência e identificação de microsporídios em animais

silváticos em cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa) ……….192

2.1.4 Ocorrência e identificação de microsporídios em animais

silváticos de vida livre …………………….………………….193

2.1.5 Diversidade genética da região ITS rRNA de

Enterocytozoon bieneusi na população de animais estudada ...195

2.2 Microsporidia em aves exóticas de gaiola e pombos

urbanos de Lisboa .…………………………………………………...197

2.2.1 Ocorrência e identificação de microsporídios ………………..197

2.2.2 Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon

bieneusi e Encephalitozoon hellem ...………………………...199

3. Discussão ………………………...……………….…..………………….203

xliii

Capitulo V - Detecção e caracterização genética de microsporidia

em amostras ambientais ………………………………………...…..213

1. Introdução ……….…………….……………….….………….…..............215

2. Resultados ………………………...……………….…..………….…........216 2.1 Detecção e identificação de microsporídios em água

subterrânea e superficial, tratada e não tratada ....................................216

3. Discussão ………………………...………………...….…………….........217

Capitulo VI – Conclusão ……………….……………………………………….....221

Capitulo VII – Referências bibliográficas ………………………………………..229

xlv

Índice de figuras

Página

Figura 1. Fotografia de Karl Wilhelm von Nägeli (1817-1891) e capa

da publicação aludindo à sua palestra sobre N. bombysis,

em 1857 ................................................................................................. 3

Figura 2. Fotografia de microscopia electrónica de varrimento de esporos de

microsporidia em cultura in vitro .......................................................... 7

Figura 3. Diagrama e fotografia de microscopia electrónica de transmissão

da estrutura interna de um esporo de microsporídio ............................. 19

Figura 4. Fotografias de microscopia electrónica de varrimento do

esporo de microsporida com o filamento polar exteriorizado

injectando o esporoplasma na célula .................................................... 21

Figura 5. Representação esquemática do ciclo de vida de dois géneros de

Microsporidia patogénicos para o Homem (Enterocytozoon

bieneusi e Encephalitozoon spp.) .......................................................... 24

Figura 6. Secção de jejuno intestinal infectado por E. bieneusi. .......................... 30

Figura 7. Fotografia de esporos de Encephalitozoon cuniculi em esfregaço

de secreção pulmonar, corados pela técnica do calcoflúor; Fotografia

de esporos de Encephalitozoon. intestinalis, em esfregaço de cultura,

corados por Gram-Chromotrope ............................................................ 47

Figura 8. Fotografia de esporos de microsporidia, em esfregaço fecal,

corado por Gram-Chromotrope …………………………………......... 159

Figura 9. Fotografias dos produtos de PCR de isolados de E. bieneusi e

Vittaforma-like, após separação por electroforese em gel de agarose .... 160

Figura 10. Fotografia do produto de PCR do isolado de E. intestinalis após

separação por electroforese em gel de agarose ………………............171

Figura 11. Fotografias de esporos de E. cuniculi, em esfregaço de lavado

brocoalveolar, corado por Gram-Chromotrope ................................... 172

xlvi

Figura 12. Fotografia do produto de PCR do isolado de E. cuniculi ................... 174

Figura 13. Relação filogenética entre os genótipos de E. bieneusi

identificados nos mamíferos e outros genótipos de E. bieneusi,

inferida pela análise de sequências do gene ITS rRNA ........................ 196

Figura 14. Fotografia de esporos de Encepalitozoon hellem em esfregaço da

Mucosa traqueal de um papagaio cinzento (Psittacus erithacus).

Coloração pelo Gram-Chromotrope ……………………….................198

xlvii

Índice de quadros

Página

Quadro I. Espécies de microsporidia mais frequentes descritas como

infectantes para o Homem ………………………………………........ 8

Quadro II. Espécies de microsporidia menos frequentes descritas como

infectantes para o Homem …............................................................... 9

Quadro III. Microsporídios patogénicos para o Homem, e respectivos

locais de infecção …........................................................................... 29

Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de

Microsporidia …................................................................................. 61

Quadro V. Terapêutica das microsporidioses ……....………………………....... 68

Quadro VI. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos

para VIH, em África, América, Austrália e Ásia ……………........... 75

Quadro VII. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em

seropositivos para VIH, na Europa ................................................. 76

Quadro VIII. Casos exporádicos de infecção por E. cuniculi, confirmados

por técnicas de biologia molecular ……...……………………...... 80

Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes

transplantados .. ……………………………………………………...84

Quadro X. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia mais

frequentes infectantes para o Homem .................................................. 94

Quadro XI. Alguns reservatórios animais das espécies de

microsporidia menos frequentes infectantes para o Homem ……...... 95

Quadro XII. Genótipos de E. bieneusi caracterizados pela sequência da

região ITS rRNA, decritos no Homem ............................................. 104

Quadro XIII. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela

região ITS e descritos em animais de companhia (cães e gatos) ...104

xlviii

Quadro XIV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela

sequencia da região ITS rRNA, decritos no Homem e outros

animais …........................................................................................ 105

Quadro XV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela

sequência da região ITS rRNA e descritos em diversos grupos de

hospedeiros …………………………………………………….….. 106

Quadro XVI. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela

sequência da região ITS rRNA e descritos em gado bovino e

suínos .............................................................................................. 106

Quadro XVII. Hospedeiros e distribuição geográfica das estirpes de

E. cuniculi ……………………………………………………...... 107

Quadro XVIII. Mamíferos do Jardim Zoológico de Lisboa cujas

fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas e

moleculares para identificação de microsporídios …………....... 123

Quadro XIX. Aves do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram

submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares para

identificação de microsporídios ……………………………...….... 124

Quadro XX. Répteis do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram

submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares, para

identificação de microsporídios …………………………….…...... 124

Quadro XXI. Critério para a determinação da carga parasitária dos

isolados de microsporídios, englobados no presente

estudo ……………………………………………………….….... 133

Quadro XXII. Sequências nucleotídicas e características dos primers

utilizados na amplificação e sequenciação directa do gene

SSU rRNA de microsporídios ………………………………….... 138

xlix

Quadro XXIII. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de

microsporídios ………………..................................................... 139

Quadro XXIV. Sequências nucleotídicas e características dos primers


SSU rRNA de E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem ………...... 140

Quadro XXV. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de

E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem ………………...……….... 141

Quadro XXVI. Sequências nucleotídicas e características dos

primers (AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040)

utilizados na amplificação e sequenciação directa da região

SSU ITS LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested ………....... 141

Quadro XXVII. Condições das reacções de PCR nested

(primers AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040) para

amplificação da região região SSU ITS LSU rRNA,

de E. bieneusi ….......................................................................... 142

Quadro XXVIII. Sequências nucleotídicas e características dos

primers (MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2) utilizados

na amplificação e sequenciação directa da região

SSU ITS LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested ……..... 143

Quadro XXIX. Condições das reacções de PCR nested

(primers MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2 para

amplificação da região região SSU ITS LSU rRNA,

de E. bieneusi ……………………………….…………….…..... 144

Quadro XXX. Sequências nucleotídicas e características dos primers


SSU rRNA de Vittaforma-like ………………………………....… 146

Quadro XXXI. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de

Vittaforma-like. ............................................................................ 147

l

Quadro XXXII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação

à idade e género dos doentes englobados no estudo ….…........ 161

Quadro XXXIII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação

à serologia para VIH e presença ou ausência de diarreia,

dos doentes englobados no estudo …………………………... 162

Quadro XXXIV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação

à idade, género e quadro clínico, em seropositivos para

VIH …………………………………………………………... 163

Quadro XXXV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação

à idade, género e quadro clínico, em seronegativos

para VIH …................................................................................ 165

Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e

epidemiológicos dos seropositivos para VIH com

microsporidia nas amostras fecais, cujos isolados

foram caracterizados no presente trabalho .................................167

Quadro XXXVII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e

epidemiológicos dos seronegativos para VIH com

microsporidia nas amostras fecais, cujos isolados

foram caracterizados no presente trabalho ………………..... 170

Quadro XXXVIII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos

dos dois doentes, cujos isolados de E. cuniculi e Vittaforma-like

foram caracterizados no presente trabalho …....................... 173

Quadro XXXIX. Dados dos animais – cães, gatos, gado bovino e animais

silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia

e cujos isolados foram caracterizados no presente

trabalho …………………………………………….……….... 194

Quadro XL. Dados das diversas espécies de aves identificadas com

microsporidia e cujos isolados foram caracterizados no

presente trabalho ………………………………………………....... 202

li

Quadro XLI. Ocorrência de microsporidia em amostras de água tratada e

não tratada em locais de amostragem envolvidos no processo

conducente ao abastecimento de água da cidade de Lisboa ….......217

- Primeira parte –

INTRODUÇÃO GERAL AOS MICROSPORIDIA

1.PERSPECTIVA HISTÓRICA


- 3 -

1. PERSPECTIVA HISTÓRICA

Os microsporídios, são eucariotas, parasitas intracelulares obrigatórios, ubíquos

na natureza, considerados agentes patogénicos emergentes, no Homem e nos animais.

Após o advento da pandemia da síndrome da imunodeficiência adquirida (sida), as

infecções por microsporidia, passaram a ser objecto de vários estudos, que conduziram a

um conhecimento mais profundo, sobre os diversos aspectos clínicos, terapêuticos e de

diagnóstico laboratorial destes microrganismos. Apesar dos progressos alcançados nos

últimos anos, a epidemiologia das doenças causadas por microsporídios ainda não é

bem conhecida.

Durante a primeira metade do século XIX, uma grave epidemia, conhecida por

pebrina (que no dialecto do sul de França quer dizer doença da pimenta), afectou a

indústria europeia de sericicultura, particularmente em França e Itália. Naquela época,

foram vários os investigadores, entre os quais o famoso Louis Pasteur, que

direccionaram estudos com o objectivo de identificar o responsável pela enfermidade no

bicho-da-seda (Bombyx mori) [Wittner 1999; Franzen 2008]. O agente em causa, foi

designado Nosema bombycis, pelo microbiologista suisso Karl Wilhelm von Nägeli

(1857) [Nageli 1857] (Figura 1).

Figura 1. Fotografia de Karl Wilhelm von Nägeli (1817-1891) e capa da publicação

aludindo à sua palestra sobre N. bombysis, em 1857. Adaptado de [Franzen 2008]


- 4 -

Mais tarde, foram descritas novas doenças provocadas por estes microrganismos,

noutros hospedeiros, com particular relevância em abelhas e nalgumas espécies de

peixes [Canning & Lom 1986; Canning & Hollister 1987; Canning & Hollister 1992b;

Franzen 2008].

O primeiro registo de microsporídios em mamíferos, data de 1922, em que

Wright e Craighead descreveram a infecção em coelhos de laboratório, que

apresentavam sintomatologia nervosa [Wright & Craighead 1922; Franzen 2008]. No

ano seguinte, a espécie E. cuniculi, foi considerada por Levaditi e colaboradores

[Levaditi et al. 1923; Franzen 2008], como o microsporídio associado à encefalite dos

lagomorfos.

Embora, reconhecidos como agentes patogénicos, em diversas espécies de

animais, o primeiro caso de infecção no Homem por microsporídios só foi registado em

1959. Matsubayashi e colaboradores descreveram um caso de microsporídiose num

rapaz de nove anos de idade com manifestações neurológicas [Matsubayashi et al. 1959;

Franzen 2008]. O agente envolvido, inicialmente, foi considerado como sendo

pertencente ao género Encephalitozoon. Alguns autores, mais tarde, atribuíram a

infecção da criança, à espécie Encephalitozoon cuniculi [Wittner 1999]. No período que

se seguiu até 1984, foram ocasionais e pouco valorizados pela comunidade científica, os

registos de microsporidiose no Homem.

Em Junho de 1981, era reconhecida pela primeira vez a sida. Esta pandemia,

veio alterar profundamente o nível de interesse, dedicado aos microsporídios, até essa

data. Assim, uma nova visão sobre estes organismos, como agentes emergentes de

infecções oportunistas no Homem, ganha terreno após os primeiros registos. Em 1985,

Desportes e colaboradores, descreviam, pela primeira vez, uma nova espécie de

microsporídio, nos enterócitos de um doente com sida, associado a diarreia persistente e

infecção sistémica: Enterocytozoon bieneusi [Desportes et al. 1985]. Quase

simultaneamente, outros dois grupos de investigadores reportaram a identificação do

mesmo organismo [Dobbins, III & Weinstein 1985; Modigliani et al. 1985].

Em 1991, foi identificada a espécie Encephalitozoon hellem, a partir de lesões de

queratoconjuntivite, em três doentes com sida [Didier et al. 1991b]. A descoberta de

uma segunda espécie do género Encephalitozoon, com recurso a uma nova metodologia


- 5 -

de diagnóstico, questionou a etiologia dos casos clínicos anteriormente descritos, e

atribuídos a E. cuniculi.

Uma terceira espécie, Encephalitozoon intestinalis, inicialmente denominada

Septata intestinalis [Cali et al. 1993], foi isolada em doentes com sida, em 1993, como

agente de diarreia aguda, nefrite e ainda colecistite. Dois anos mais tarde, as dúvidas

dissiparam-se quanto à patogenicidade de E. cuniculi, ao identificar-se uma infecção

disseminada por este parasita, num doente com sida [De Groote et al. 1995].

A terapêutica anti-retrovírica potente (HAART, acrónimo anglo-saxónico para

highly active antiretroviral therapy), administrada aos doentes infectados por vírus da

imunodeficiência humana (VIH), parece ter reduzido a frequência da microsporidiose

intestinal, entre este grupo da população [Goguel et al. 1997; Conteas et al. 2000; Miao

et al. 2000; van Hal et al. 2007]. Contudo, em países em vias de desenvolvimento, tem

vindo, a observar-se o registo de um crescente número de casos de microsporidiose. A

elevada prevalência de VIH/sida entre a população, destas regiões, na maioria sem

acesso a terapêutica anti-retrovírica, associados à existência de precários sistemas de

saúde no terreno são apontadas como potenciais causas deste aumento [Endeshaw et al.

2006].

Actualmente, estão descritas na literatura, mais de 1200 espécies de

microsporídios, pertencentes a 150 géneros [Wittner 1999; Didier & Weiss 2006]. Nos

últimos anos, a espécie com maior número de casos reportados foi E. bieneusi, seguida

de E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi, sendo as duas primeiras consideradas como os

principais agentes de microsporidiose intestinal. Cerca de 14 espécies de

microsporídios, são reconhecidas como infecciosas para o Homem [Wittner 1999;

Franzen 2008]. Porém, à medida que aumenta o interesse por estes microrganismos, e

novas e mais eficazes metodologias de diagnóstico são desenvolvidas, verifica-se um

aumento crescente de registos de novas espécies potencialmente patogénicas.

A ocorrência de microsporidiose encontra-se intimamente ligada à infecção

VIH/sida, todavia têm sido descritos, um número crescente de casos de infecção

intestinal em seronegativos para VIH, mas que possuem um grau variável de

imunossupressão, como o que se verifica em transplantados de órgãos, doentes com

neoplasias, ou com patologias auto-imunes. Igualmente, os registos de casos de

microsporidiose em crianças, idosos, e viajantes são cada vez mais frequentes, assim


- 6 -

como, a descrição de microsporídios em portadores assintomáticos [Didier & Weiss

2006].

Embora nas últimas décadas, o reconhecimento gradual da importância dada a

estes microrganismos, tenha proporcionado avanços significativos, nas diversas

vertentes que abrangem o estudo dos microsporídios, reflectindo-se no aumento

exponencial de publicações presentes na “National Library of Medicine”

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi), são ainda, muitas as lacunas, que

envolvem este grupo de importantes organismos emergentes. É, então, de prever, que

exista um longo caminho a percorrer, tendo por objectivo, a clarificação da biologia e

epidemiologia da microsporidiose, fundamental para avaliação dos factores de risco,

identificação de alvos terapêuticos e estratégias de prevenção e controlo desta infecção

oportunista emergente.

2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS

- 7 -

2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS.

2.1. TAXONOMIA

Os microsporídios, são microrganismos eucariotas, unicelulares, de distribuição

ubiquitária, com relevância médica, bem como importância comercial, ao nível de

determinadas indústrias. Estes microrganismos pertencem ao filo Microsporidia

Balbiani 1882 [Balbiani 1882; Wittner 1999], constituído por mais de 1200 espécies,

que parasitam membros de todos os filos animais, e entre as quais 14 espécies são

consideradas infectantes para o Homem [Didier 2005; Didier & Weiss 2006]. O termo

microsporidia é, também, utilizado como designação não taxonómica para estes

parasitas intracelulares obrigatórios. Na Figura 2 podem ser observados esporos de

quatro espécies de microsporídios patogénicos para o Homem em fotografias de

microscopia de varrimento.

Figura 2. Fotografia de microscopia electrónica de varrimento de esporos de

microsporidia em cultura in vitro. (A) E. hellem; (B) Anncaliia algerae; (C) E. cuniculi;

(D) E. intestinalis. Adaptado de [Visvesvara et al. 1999b]


- 8 -

Nos Quadros I e II, é apresentado um resumo das 14 espécies de microsporidia

consideradas infectantes para o Homem, as suas classificações originais e/ou as

actualmente consideradas válidas, assim como o primeiro registo da infecção no

Homem.

Quadro I. Espécies de microsporidia mais frequentes descritas como infectantes para o

Homem. Adaptado de [Didier 2005].

ESPÉCIES REFERÊNCIAS

MAIS FREQUENTES

Enterocytozoon bieneusi

Designação taxonómica actual [Desportes et al. 1985] Primeiro registo no Homem [Desportes et al. 1985]

Encephalitozoon (sin. Septata)

intestinalis

Designação taxonómica original [Cali et al. 1993] Designação taxonómica actual [Hartskeerl et al. 1995] Primeiro registo no Homem [Cali et al. 1991c]

Encephalitozoon hellem

Designação taxonómica actual [Didier et al. 1991a] Primeiro registo no Homem [Friedberg et al. 1990]

Encephalitozoon cuniculi

Designação taxonómica actual [Levaditi et al. 1923]

Primeiro registo no Homem [Bergquist et al. 1984a; Bergquist et al. 1984b]


- 9 -

Quadro II. Espécies de microsporidia menos frequentes descritas como infectantes para

o Homem. Adaptado de [Didier 2005].

ESPÉCIES REFERÊNCIAS

MENOS FREQUENTES

Anncaliia (sin. Nosema e Brachiola)

algerae

Designação taxonómica original [Vavra & Undeen 1970; Lowman et al. 2000] Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Visvesvara et al. 1999a]

Anncaliia (sin. Nosema e Brachiola)

connori

Designação taxonómica original [Cali et al. 1998] Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Matsubayashi et al. 1959; Margileth et al. 1973; Weiser 1993]

Anncaliia (Sin. Nosema-like e

Brachiola) vesicularum

Designação taxonómica original [Cali et al. 1996; Cali et al. 1998]; Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Cali et al. 1996]

Microsporidium africanum (sin.

Nosema sp.)

Designação taxonómica original [Pinnolis et al. 1981] Designação taxonómica actual [Canning & Lom 1986]

Primeiro registo no Homem [Pinnolis et al. 1981]

Microsporidium ceylonensis (sin.

Nosema sp.)

Designação taxonómica original [Sprague 1977] Designação taxonómica actual [Canning & Lom 1986] Primeiro registo no Homem [Ashton & Wirasinha 1973]

Nosema ocularum Designação taxonómica actual [Cali et al. 1991a] Primeiro registo no Homem [Bryan et al. 1991]

Pleistophora ronneafiel (sin.

Pleistophora sp)

Designação taxonómica actual [Cali & Takvorian 2003]

Primeiro registo no Homem [Ledford et al. 1985]

Trachipleistophora antropophtera Designação taxonómica actual [Vavra et al. 1998] Primeiro registo no Homem [Yachnis et al. 1996]

Trachipleistophora hominis Designação taxonómica actual [Hollister et al. 1996b] Primeiro registo no Homem [Field et al. 1996]

Vittaforma corneae (sin. Nosema

corneum)

Designação taxonómica original [Shadduck et al. 1990] Designação taxonómica actual [Silveira & Canning 1995] Primeiro registo no Homem [Davis et al. 1990]


- 10 -

Dado que, até há alguns anos atrás, eram parcos os conhecimentos sobre estes

organismos, as classificações atribuídas aos microsporídios eram simples e artificiais.

Tradicionalmente, a classificação das espécies de microsporidia fundamenta-se

nas características ultra estruturais e ecológicas, incluindo as dimensões e morfologia

dos esporos e o número de voltas do filamento polar, no ciclo de vida, no tipo de inter-

face parasita-hospedeiro, e no ciclo de desenvolvimento no interior do hospedeiro

[Franzen 2008].

Ao nível estrutural, os microsporidia caracterizam-se por uma redução

significativa, ou mesmo por ausência de determinados constituintes típicos dos

organismos eucariotas, tais como, mitocôndrias, um clássico aparelho de Golgi e

flagelos. A sua organização celular simplificada, tem dificultado o estabelecimento das

relações evolutivas entre os microsporidia e os outros eucariotas, dado que estes

parasitas, não possuem algumas das características, habitualmente usadas, para esse tipo

de comparações. De início, estas características, conduziram à teoria, que considerava

que os microsporídios, divergiam de uma forma ancestral eucariota, antes das células

eucariotas terem adquirido as mitocôndrias (teoria endosimbiótica) [Li et al. 1996]. Os

primeiros estudos bioquímicos e moleculares deste grupo, vierem reforçar esta hipótese.

No entanto, durante a última década, surgiram evidências divergentes,

suportadas por novos dados moleculares. Como resultado destes estudos, foi insinuado a

existência de uma proximidade de parentesco, entre os microsporidia e os fungos.

Sugeriu-se que, características que haviam sido, no início, interpretadas como

primitivas, não são mais do que meras adaptações especializadas inerentes ao seu ciclo

de vida parasitário obrigatório.

Estes parasitas, ao constituirem-se simultaneamente, como organismos simples,

embora também demonstrando um elevado grau de complexidade, têm gerado extensas

e controversas revisões sobre a sua origem evolutiva. Se por um lado, os microsporídios

perderam determinadas características, habitualmente, utilizadas para a comparação

entre eucariotas, por outro lado encontram-se tão adaptados ao parasitismo intracelular,

que acabaram por desenvolver diversas características exclusivas deste grupo de

organismos.


- 11 -

Durante os últimos 150 anos, a classificação dos microsporídios em diferentes

sistemas taxonómicos, tem-se revelado bastante instável. Com particular relevância, nas

últimas três décadas, a aplicação da microscopia electrónica e de metodologia

molecular, vieram despoletar novas questões sobre a taxonomia dos microsporidia.

Simultaneamente, verificou-se um interesse gradual nestes organismos, como agentes

patogénicos, oportunistas, no Homem, em especial, nos doentes com imunussupressão

[Weiss 2001; Franzen 2008].

Em 1909, Stempell eleborou, pela primeira vez, uma classificação de

microsporídios em que estes eram distinguidos dos mixosporídios, grupo com o qual,

até então, eram frequentemente confundidos. Posteriormente, esta classificação foi

alterada por Léger e Hesse, em 1922 e Kudo [Kudo 1925], vigorando atémeados da

década de 70 [Sprague 1977]. No final deste período, já existiam inúmeras publicações

com dados obtidos de microscopia electrónica, consequentemente tornava-se preemente

ocorrer uma reestruturação da classificação até então utilizada. Os primeiros modelos

modernos foram propostos por Weiser [Weiser 1976] e Sprague [Sprague 1977]. Este

último autor propôs a designação de Filo Microspora, bem como reclassificou as

espécies-tipo em géneros, segundo aspectos inerentes ao desenvolvimento do ciclo de

vida do parasita. Nos anos seguintes, Sprague propôs um segundo modelo, que serviria,

posteriormente, de suporte às classificações de Larsson e de Canning , contudo não

existiam critérios em relação aos taxa superiores á família [Wittner 1999]. Em 1992,

numa revisão elaborada por Sprague e colaboradores foram introduzidos na taxonomia,

como critério principal, os aspectos referentes à divisão nuclear, sem que isso

implicasse profundas alterações em ralação à definição dos taxa família e género.

Assim, o modelo proposto tornou-se complexo e de difícil utilização, constantando-se

um uso preferencial do modelo proposto por Canning.

Com o acumular de evidências moleculares durante a última década do século

XX, constatou-se que os microsporídios são aparentados com os fungos. Cavalier-Smith

transferiu o filo Microsporidia Balbiani 1882, para o sub-Reino Eomycota Cavalier-

Smith, em 1998 e subdividiu o filo em duas classes: Minisporea e Microsporea. Esta

última classe é composta por duas sub-classes: Pleistophorea (microsporídios com

divisão em plasmotomia e diferenciação de um único tipo de esporo) e disporea (fissão


- 12 -

binária e diferenciação de dois tipos de esporos) [Cavalier-Smith 1998]. Por outro lado

as análises moleculares filogenéticas revelaram-se inconsistentes chegando mesmo a ser

proposta a sua subdivisão em três classes, Aquasporidia, Marinosporidia e Terrasporidia

reflectindo o habitat de cada grupo [Vossbrinck & brunner-Vossbrinck 2005].

Quando se comparam as árvores filogenéticas, baseadas na sequência

nucleotídica do DNA, com as classificações clássicas, sustentadas em critérios

fenotípicos, verifica-se que as relações de semelhança entre os géneros e espécies, se

alteram. A tendência actual da taxonomia moderna, é reavaliar os dados sobre a

morfologia, fisiologia e ecologia e integrá-los com a informação genómica, no que se

denomina por taxonomia polifásica [Rosselló-Mora & Amann 2001], podendo daqui

resultar novos critérios para a delimitação dos grupos taxonómicos. A concordância de

resultados, obtida pela utilização independente dos diferentes critérios, proporciona

maior grau de certeza nas afinidades estabelecidas e na evolução sequencial de

determinado grupo de organismos.

Apesar dos avanços, dos últimos anos, na direcção de estabelecer a origem

evolutiva dos microsporídios, um número elevado de questões permanecem por

esclarecer. A clarificação da taxonomia dos microsporídios, é essencial para se atingir

maior percepção da epidemiologia destes parasitas, possibilitando o controlo da sua

transmissão.

Em seguida será efectuada uma abordagem sumária, às diversas classificações

taxonómicas que têm sido atribuídas aos microsporídios e, alguns dos fundamentos que

as suportam.

2.1.1. A descoberta e visão inicial sobre a evolução dos microsporídios.

Em 1857, N. bombycis a primeira espécie de microsporidia, identificada por

Nägeli, foi descrito como sendo semelhante a uma levedura e, incluido no grupo dos

fungos, mais propriamente nos Schizomycetes [Franzen 2008]. Curiosamente, esta

classificação inicial não anda muito longe da que é, actualmente, proposta por alguns

autores. No entanto, a descrição de Nagëli, não resultaria de um conhecimento

detalhado do organismo mas, certamente, das noções limitadas sobre a biodiversidade e

nomenclatura primitiva dos microrganismos, à data. Esta classificação inicial, como


- 13 -

fungo, foi revista, rapidamente, acompanhando o crescimento de um sistema

taxonómico mais complexo, que levava em conta o grupo dos protistas. Balbiani, em

1882, incluiu o microsporídio Nosema, no grupo dos protozoários, Sporozoa. Este

grupo, constituido por um conjunto de parasitas com produção de esporos, incluia

diversos organismos, hoje em dia, reconhecidos como membros dos Apicomplexa

(alveolados), os Haplosporidia, e um subgrupo designado como Cnidosporidia. Estes

últimos, compreendem os Mixosporidia (animais), os Actinomicidia (protistas de

origem desconhecida), os Helicosporidia (algas verdes), e os Microsporidia [Kudo

1947; Corradi & Keeling 2009].

Apesar das incongruências, face aos conhecimentos actuais, estas classificações

foram importantes, na tentativa de compreender a origem evolutiva dos microsporídios,

na medida em que acabaram por ser reconhecidos como um grupo natural, constituído

por parasitas intracelulares, com um mecanismo exclusivo de infecção do hospedeiro. O

mais inportante foi, sem dúvida, a inclusão no Filo Cnidosporidia. À medida que

ocorreram avanços ao nível da microscopia que permitiram uma ligação entre os

subgrupos dos cnidosporídios, tornou-se claro que a posição dos microsporidia teria de

ser revista [Lom & Vavra 1961].

2.1.2. Os Archezoa e primeiros dados moleculares dos microsporídios.

A análise dos microsporídios através da microscopia electrónica, permitiu não

só, a descoberta de características únicas dos esporos, como também revelou a ausência

de outras, que são uma constante nos organismos eucariotas (mitocôndrias, aparelho de

Golgi clássico, peroxissomas e flagelos) [Vavra & Larsson 1999; Corradi & Keeling

2009].

Ao nível molecular, os microsporídios possuem genomas de dimensões

reduzidas, sendo o mais pequeno o de E. intestinalis, com 2.3 Mpb. Simultâneamente,

verificou-se nos microsporídios, a presença de subunidades ribossomais semelhantes às

dos procariotas [Vossbrinck et al. 1987; Katinka et al. 2001]. Com base nestes

argumentos, os microsporídios eram vistos como um grupo primitivo de organismos

eucariotas. Esta visão articulava-se com a integração dos microsporídios, nos Archezoa,

proposta por Thomas Cavalier-Smith (1983) [Cavalier-Smith 1983; Corradi & Keeling


- 14 -

2009] e, na qual, era postulado que a origem da célula eucariota deverá ter precedido a

origem simbiótica da mitocôndria. Assim, diversas linhas de organismos eucariotas

haviam divergido antes da ocorrência desta endosimbiose. No total, foram identificadas

quatro linhas eucariotas, e incluídas no novo sub-reino Archezoa: Archamoebae,

Metamonada, Parabasali, e Microsporidia [Cavalier-Smith 1983; Cavalier-Smith 1987;

Corradi & Keeling 2009]. Assumiu-se que constituíam um grupo parafilético, em que os

microsporidios eram colocados no ramo mais ancestral dos eucariotas, pelo facto de

serem os únicos que não possuíam estruturas microtubulares do tipo 9+2 (estruturas

cilíndricas organizadas em tripletos de nove microtúbulos ligados entre si, que ocorrem

geralmente em número de duas) [Patterson 1994; Corradi & Keeling 2009].

Pouco depois, da inclusão nos Archezoa, surgem os primeiros dados moleculares

para a espécie, Vairimorpha necatrix, correspondentes à sequenciação do gene

conservado que codifica a pequena, e a grande subunidade do ácido ribonucleico

ribossómico (SSU e LSU rRNA, siglas anglo-saxónicas para small subunit ribosomal

ribonucleic acid e large subunit ribosomal ribonucleic acid, respectivamente)

[Vossbrinck et al. 1987]. Curiosamente, estes dados vieram adicionar evidências à

hipótese de integração nos Archezoa. Em primeiro lugar, nas diversas análises

filogenéticas efectuadas com base na SSU rRNA, nas quais eram incluídos diversos

membros de outras linhas de eucariotas, a espécie V. necatrix surge, no ramo inicial dos

eucariotas [Vossbrinck et al. 1987]. Facto este, consistente com a previsão postulada

pela hipótese dos Archezoa que considerava os microsporídios como uma linha

ancestral (uma condição para ser um amitocondriado primitivo). Em segundo lugar,

verificou-se que, ao contrário do que acontece noutras linhas de eucariotas, nos

microsporídios, as subunidades 5.8S e LSU do rRNA encontram-se fundidas numa

molécula única, tal como ocorre nos procariotas [Vossbrinck et al. 1987]. Mais um

facto, interpretado como sendo outra característica primitiva dos microsporidia.

A determinação de sequências de diferentes genes e as análises filogenéticas

estabelecidas a partir destes novos dados, vierem conferir um maior peso à ideia que

atribui uma origem ancestral aos microsporidia. O estudo dos genes que codificam a

isoleucil aminoacil sintetase do ácido ribonucleico de transcrição (tRNA, sigla anglo-

saxónica para transcription ribonucleic acid) e os factores de elongação 1-alfa e 2


- 15 -

reforçam esta classificação [Brown & Doolittle 1995; Kamaishi et al. 1996a; Kamaishi

et al. 1996b; Brown & Doolittle 1999].

Até então, a classificação da origem evolutiva dos microsporidia, aparentava

estar mais ou menos esclarecida, residindo as duas questões fundamentais, apenas, na

determinação da sua posição entre o grupo dos Archezoa, e na localização temporal da

sua ancestralidade.

2.1.3 Uma ligação aos fungos.

Apesar da acumulação de evidências, a origem primitiva dos microsporidia

continuou a suscitar dúvidas entre a comunidade científica. A capacidade de adaptação

destes parasitas assim como a elevada divergência das sequências dos seus genes

constituem características problemáticas, com possibilidade de serem mal interpretadas.

Um ciclo de vida intracelular obrigatório, pode potencialmente conduzir á

redução e/ou perda de diversos organelos e estruturas celulares, tais como as

mitocôndrias, os peroxissomas, centríolos, ou os ribossomas. Acrescente-se que, os

rRNA possuem muitas delecções de modo que, é possível que a fusão das subunidades

5.8S com a LSU resultasse de uma regressão, pela perda de uma sequência [Cavalier-

Smith 1993; Corradi & Keeling 2009]. Sabe-se também, que taxas elevadas de

divergência de sequências dos genes, podem originar um artefacto filogenético,

conhecido por “atracção de ramificações-longas” (da expressão anglo-saxónica para

long-branch attraction), arrastando errôneamente, os microsporidia para a base da

árvore filogenética.

Inicialmente, a proposta que sugeria os microsporidia com ligação de parentesco

aos fungos, surgiu da ocorrência de semelhanças no ciclo de vida [Flegel &

Pasharawipas 1995], da presença de quitina na parede do esporo (embora também possa

ser encontrada noutros filos para além dos fungos), e do dissacárido trealose

(dissacárido não reduzível, composto usado para armazenamento de energia), em ambos

os grupos de organismos. Mais recentemente, a perspectiva evolutiva proporcionada por

diversos estudos moleculares evidencia, esta proximidade ao Reino Fungi: a

sequenciação dos genes conservados que codificam para as proteínas - e - tubulina

[Edlind et al. 1994; Keeling & Doolittle 1996; Edlind et al. 1996; Muller 1997]; a


- 16 -

identificação de quitinases semelhantes às dos fungos [Hinkle et al. 1997]; e a análise

filogenética das proteínas de ligação à TATA-box [Fast et al. 1999]; assim como, a

sequenciação de genes codificantes da grande subunidade da RNA polimerase II [Hirt et

al. 1999], da proteína de choque térmico de 70-kDa (HSP70, sigla anglo-saxónica para

heat shock protein 70-kDa) [Hirt et al. 1997; Germot et al. 1997; Peyretaillade et al.

1998b], da glutamil sintetase [Brown & Doolittle 1999], ou das subunidades - e - da

piruvato desidrogenase E1 [Fast & Keeling 2001]. Mais recentemente, a primeira

caracterização do genoma total de um microsporídio E. cuniculi, veio reforçar a ligação

entre os dois grupos [Katinka et al. 2001].

Acresce, a identificação, nos microsporidia, de mais de uma dúzia de genes que

codificam para proteínas mitocondriais e a localização da proteína HSP70, no

remeniscente mitocondrial, o mitossoma [Williams et al. 2002; Tsaousis et al. 2008;

Goldberg et al. 2008; Lee et al. 2008; Williams et al. 2008a; Williams et al. 2008b],

consistentes com a presença de mitocôndrias, confere rubustez à ideia, de que estes

parasitas seriam de início organismos mais especializados que, embora tivessem

perdido, posteriormente estes organelos, possuem, ainda, algumas evidências genéticas

do seu passado.

Diversos autores, abandonaram então, a teoria de que, os microsporidia

constituíam uma linha primitiva dos eucariotas, para os passarem a considerar como

organismos especializados, que terão evoluído a partir de ancestrais com mitocôndrias,

e que apresentam na sua constituição determinadas características celulares e

moleculares que os ligam ao grupo dos fungos.

No final dos anos 90, do século passado a possibilidade de proximidade de

parentesco entre os microsporidia e os membros do reino Fungi começou a ter

aceitação, entre a comunidade científica [Weiss et al. 1999]. Actualmente, os debates

centralizam-se em decidir se, na realidade, estes organismos partilharam o mesmo

ancestral com os fungos ou, se então, derivaram dos fungos. Todavia, não foi possivel

ainda, obter uma resposta concreta para estas dúvidas, uma vez que as análises

filogenéticas são estabelecidas a partir de genes únicos, e que incluem habitualmente,

apenas uma pequena fracção da diversidade quer dos microsporidia, quer dos fungos.

Na verdade, o sucesso dos métodos moleculares nos estudos filogenéticos e de

sistemática dependem em grande parte das moléculas escolhidas para a análise.


- 17 -

Idealmente, a resolução do problema, passaria pela utilização, de um conjunto de

dados multigénicos, com uma ampla representação taxonómica. Porém, até à data só foi

possível o estudo do genoma de um grupo restrito de microsporidia, e dentre estes, a

caracterização só foi obtida para um reduzido número de genes (<2000). Se a estas

limitações, adicionarmos a elevada divergência das sequências determinadas [Katinka et

al. 2001; Slamovits et al. 2004], torna-se difícil, não só efectuar reconstruções

filogenéticas moleculares, como as torna extremamente incertas [Hirt et al. 1999;

Thomarat et al. 2004]. Mais recentemente, recorreu-se a uma abordagem diferente, com

base na conservação da ordem dos genes [Lee et al. 2008]. Verificou-se, que apesar das

sequências dos genes dos microsporidia evoluírem muito rapidamente, a ordem dos

genes dentro do próprio genoma, é altamente conservada [Slamovits et al. 2004;

Corradi et al. 2007]. Estes resultados sugerem uma ligação aos zigomicetes, visto que

ambos os grupos partilham uma elevada taxa de conservação no ordenamento dos

genes. Ao contrário do que se observa, quando se compara esta taxa de ordenamento

genético, com outros grupos de fungos, como por exemplo, dos basidiomicetes [Dyer

2008; Lee et al. 2008].

A hipótese dos microsporidia terem pelo menos uma proximidade de parentesco

com o reino Fungi, parece estar a ser adoptada por um número crescente de autores

[Hibbett et al. 2007]. Têm sido desenvolvidos esforços com o intuito de obter dados

relativos ao genoma de outros microsporídios, e de continuar a análise comparativa

entre os genomas das diversas espécies e outros organismos, de modo a clarificar as

forças com impacte, na redução e compactação genómica, em relação à filogenia e

evolução destes parasitas. A recente aplicação da comparação de análises filogenéticas

moleculares gerou novas considerações, sobre a classificação taxonómica de diversas

espécies, dentro dos microsporidia, estabelecida, previamente, com base em

características ultraestruturais, biológicas, bioquímicas ou de habitat [Vossbrinck &

brunner-Vossbrinck 2005; Larsson 2005].

A validade da classificação taxonómica dos microsporidia tem sido, diversas

vezes questionada. À medida que vão sendo descritos e analisados aspectos moleculares

de um crescente número destes parasitas, torna-se mais elevada a probabilidade de

ocorrerem, no futuro, novas alterações no esquema de classificação do grupo [Baker et

al. 1995].


- 18 -

Verificada a ausência de consenso, entre os diversos membros da comunidade

científica [Dong et al. 2010], como tal, não parecem estar, ainda, reunidas todas as

condições para elaborar uma classificação definitiva para os microsporidia.

2.2. MORFOLOGIA E CICLO DE VIDA

2.2.1. Morfologia dos microsporídios

Os microsporídios são organimos eucariotas unicelulares, parasitas intracelulares

obrigatórios, de diversos grupos de animais (em particular invertebrados e peixes),

incluindo o Homem. Caracterizam-se pela ausência de algumas características típicas

dos eucariotas, nomeadamente os ribossomas (70S), as sub-unidades ribossomais (30S e

50S) e os rRNA que são do tamanho dos encontrados nos procariotas e, por outro lado,

não possuem um rRNA com a subunidade 5.8S separada da LSU. Além disso, não têm

mitocôndrias, peroxissomas e um aparelho de Golgi clássico [Vossbrinck et al. 1987;

Canning & Hollister 1992b; Didier 1998; Weiss & Vossbrinck 1999]. Todavia, estes

organismos são verdadeiros eucariotas com núcleo onde ocorre separação

cromossómica por fusos mitóticos [Vossbrinck et al. 1987], bem como poliadenilação

do ácido ribossómico mensageiro (mRNA, sigla anglo-saxónica para menssenger

ribosomal ribonucleic acid), tal como se observa em todos os organismos eucariotas

estudados.

Os esporos são o único estádio, do ciclo de vida, que sobrevive no exterior do

seu hospedeiro, e a sua forma é mais ou menos constante entre as espécies do mesmo

género. Os esporos maduros, de microsporídios infectantes dos mamíferos, apresentam

em geral uma forma oval e piriforme e reduzidas dimensões, medindo entre 1,0 – 3,0

m de comprimento e 1,5 – 4,0 m de largura [Didier 1998; Cali & Takvorian 1999]. O

esporo maduro de E. bieneusi, é o mais pequeno de todos os esporos de microsporídios,

medindo apenas 1,1-1,6 x 0,7-1,0 m. O endosporo e o exosporo são relativamente

delgados quando comparados com outros microsporídios. A Figura 3, representa o

diagrama e fotografia de microscopia electrónica de transmissão onde se podem

observar as principais estruturas internas do esporo de um microsporídio.


- 19 -

Figura 3. (A) Diagrama e (B) fotografia de microscopia electrónica de transmissão da

estrutura interna de um esporo de microsporídio. Adaptado de [Franzen 2008].

A necessidade absoluta de células hospedeiras para a sobrevivência e

multiplicação dos microsporídios, implica a existência de um mecanismo eficaz de

penetração na célula hospedeira, desempenhado pelo aparelho de extrusão. Destaque-se

entre os constituintes deste aparelho, o filamento polar: a característica que define um

organismo, como sendo um microsporidia. Este organelo consiste numa estrutura

tubular enrolada em hélice, dentro do esporo maduro. O polaroplasto e o vacúolo

completam o aparelho de extrusão.

O filamento polar parte do disco de adesão ou saco polar, junto do pólo anterior

do esporo, formando uma espiral com várias voltas até à região posterior do esporo

[Cali & Takvorian 1999]. O número de voltas do filamento polar varia entre as espécies.

A título de exemplo, na espécie E. bieneusi, o filamento polar descreve seis

voltas, que quando visualizadas ao microscópio electrónico de transmissão, surgem em

duas filas de três espiras; nas espécies do género Encephalitozoon, o filamento polar

descreve entre três a oito voltas, organizadas numa fila única de espiras. Sob

determinadas condições (alterações na pressão osmótica), o filamento emerge para o

exterior, passando a designar-se por tubo polar e injecta o conteúdo do esporo


- 20 -

(esporoplasma) no interior de uma célula hospedeira, sem contudo destruir a membrana

desta.

O tubo polar estendido, tem entre 50-100 m de comprimento e parece originar-

se a partir do retículo endoplasmático e das vesículas golgi-like [Cali & Takvorian

1999].

O disco de adesão encontra-se na região mais anterior do esporo, e constitui a

estrutura mais rica em hidratos de carbono dos microsporídios, sendo responsável pela

coloração ácido-resistente. Em posição posterior ao disco de adesão encontra-se um

conjunto de membranas lamelares, denominadas de polaroplasto. Este é rico, também

em hidratos de carbono, e é contíguo com a membrana externa do filamento polar. O

polaroplasto irá mais tarde constituir a membrana exterior do esporoplasma [Cali &

Takvorian 1999].

Na extremidade posterior do filamento polar encontra-se o núcleo que pode ser

único como no caso dos géneros Encephalitozoon, Enterocytozoon, Pleistophora e

Trachipleistophora, ou, por outro lado, binucleado como nos casos dos géneros

Anncalliia, Thelohania e Vittaforma).

Apesar de eucariotas, os microsporidia possuem ribossomas semelhantes aos dos

procariotas, como já foi referido anteriormente. Os esporontes e esporoblastos (formas

proliferativas) são ricos em retículo endoplasmático liso e rugoso [Cali & Takvorian

1999].

O vacúolo posterior fornece, por vezes, uma característica de diagnóstico na

identificação de microsporídios, em produtos biológicos, através da microscopia óptica.

Este vacúolo tem origem, na coalescência tardia da maturação do esporo, das vesículas

de Golgi, após a formação do filamento polar. A sua função é desconhecida, embora tal

como acontece com o polaroplasto, aumenta de volume antes da germinação [Cali &

Takvorian 1999].

A envolver o esporoplasma (conjunto do núcleo [s], citoplasma com ribossomas

e retículo endoplasmático) e o sistema de extrusão, encontra-se, uma membrana

plasmática ou plasmalema revestida por uma parede resistente. Esta parede possui uma

camada externa fina, densa aos electrões, o exosporo, constituída, essencialmente, por

glicoproteínas e, ainda, uma camada interna espessa, transparente aos electrões, o

endosporo, de natureza quitinosa [Kotler & Orenstein 1998; Cali & Takvorian 1999].


- 21 -

A região anterior do endosporo, junto ao disco de adesão, é menos espessa do

que a restante porção desta camada. A parede do esporo permite aos microsporídios,

possuir um elevado grau de resistência em condições ambientais adversas [Cali &

Takvorian 1999; Koudela et al. 1999].

2.2.2 Ciclo de Vida

O ciclo de vida dos microsporidia, embora apresente variabilidade nalgumas

fases do desenvolvimento, conforme as espécies do parasita, genericamente, caracteriza-

se por três fases: infectante, proliferativa e esporogónica.

Fase infectante. A fase infectante, corresponde à etapa extracelular, metabolicamente

inactiva, do ciclo de vida do microsporídio. Compreende a libertação da forma

infectante, o esporo, a sua passagem pelo meio exterior, assim como os factores

ambientais necessários para o accionar do mecanismo de extrusão, que conduzem à

subsequente penetração numa célula hospedeira adequada (Figura 4).

Figura 4. Fotografias de microscopia electrónica de varrimento do esporo de

microsporida com o filamento polar exteriorizado injectando o esporoplasma na célula

Adaptado de [Franzen 2008].


- 22 -

O esporo pode conservar a sua infecciosidade por longos períodos, durante a sua

permanência no meio exterior. Diversos factores, tais como, temperatura, humidade,

radiação, ou mesmo o material em que são depositados, podem influênciar a viabilidade

dos esporos, no exterior do hospedeiro. Também o tipo de produto biológico (fezes,

urina ou secreções pulmonares) em que são eliminados os esporos pode influenciar a

sua sobrevivência. Por exemplo, os esporos em amostras fecais ou em cadáveres secos

sobrevivem menos de seis meses se mantidos à temperatura ambiente, mas em meio

aquoso frio podem manter-se infecciosos por mais de um ano [Kramer 1970; Cali &

Takvorian 1999]. Um estudo demonstrou que, um em cada seis esporos de

Encephalitozoon, mantém a sua infecciosidade após 24 meses de conservação a 4ºC

[Kucerova-Pospisilova et al. 1999].

Em regra, a infecção estabelece-se, após a inalação ou ingestão dos esporos de

microsporídia, sendo as células epiteliais, que limitam o tracto gastrintestinal e

respiratório os locais mais comuns para a infecção primária [Orenstein 1991; Didier

1998]. Segue-se o processo de germinação do esporo sob factores ambientais

favoráveis. A interacção de diversos factores activa um conjunto sequencial de eventos

que culminam com o aumento da pressão hidrostática no interior do esporo. Esta

pressão parece ser suficiente para accionar o mecanismo de extrusão dos

microsporídios. Na presença de iões de cloro e em meio alcalino ocorre entrada de iões

de sódio e/ou potássio no esporo. Por sua vez, estes iões irão accionar quer a entrada de

cálcio, através de canais iónicos na membrana, quer a activação da enzima trealase. O

dissacárido trealose é então, clivado em moléculas mais pequenas, aumentando o

potencial da pressão osmótica, e permitindo a entrada de água no esporo que interage

com estas moléculas. É desta interacção que parece resultar a força que possibilita a

extrusão do filamento polar. Como foi referido, o influxo de cálcio, através de canais

iónicos na parede do esporo, parece desempenhar um papel importante, na

exteriorização do filamento polar, durante a germinação. Dado que já foi demonstrado

que o tratamento com bloqueadores dos canais de cálcio (i.e. nifedipina) inibem a

exteriorização e a infecção de células hospedeiras, in vitro, este mecanismo pode vir a

fornecer um potencial alvo para o tratamento da microsporidiose [Fedorko & Hijazi

1996; Didier 1998].


- 23 -

Após a germinação do esporo (exteriorização do filamento polar) e a injecção do

seu conteúdo (esporoplasma) no interior da célula hospedeira, o organismo entra numa

fase proliferativa, designada por merogonia, seguida por um processo de diferenciação

em esporos, denominado esporogonia. Os esporos libertados podem continuar a

replicar-se no hospedeiro (autoinfecção), quer infectando as células adjacentes às

parasitadas, quer disseminando-se para outros tecidos.

Os esporos são, também eliminados com a urina, fezes ou secreções

respiratórias, podendo, então ser transmitidos a novos hospedeiros [Franzen & Muller

1999b; Weber et al. 1999b].

As variações no desenvolvimento e na interface parasita-hospedeiro, durante o

ciclo de vida dos microsporídeos são numerosas e determinam o grupo taxonómico a

que pertence um determinado microsporídia [Cali 1991].

O ciclo de vida dos microsporidia infectantes do Homem Enterocytozoon

bieneusi e Encephalitozoon spp., encontra-se esquematizado na Figura 5.


- 24 -

Figura 5. Representação esquemática do ciclo de vida de dois géneros de microsporidia

patogénicos para o Homem, um que se desenvolve em contacto directo com o citoplasma da

célula hospedeira (E. bieneusi) e o outro que ocorre dentro de um vacúolo parasitóforo

(Encephalitozoon spp.). (A) Esporo vazio após injectar através do tubo polar o esporoplasma no

citoplasma da célula hospedeira. (B1 a D1) Desenvolvimento intracelular de E. bieneusi em

contacto directo com citoplasma da célula hospedeira. (E1) Esporos maduros; (B2 a D2)

Desenvolvimento do ciclo de Encephalitozoon spp dentro de um vacúolo parasitóforo no

citoplasma da célula hospedeira. (E2) Libertação dos esporos maduros no citoplasma da célula

hospedeira após ruptura da membrana do vacúolo; (a1 a e1 e b2 a e2) Fotografias de

microscopia electrónica de transmissão de diferentes estádios do ciclo de vida de E. bieneusi e

Encephalitozoon spp., respectivamente. Adaptado de [Franzen 2008].


- 25 -

Fase proliferativa ou merogonia. O processo de merogonia inicia-se após a penetração

do esporoplasma numa célula hospedeira susceptível. Os primeiros estádios deste

processo designam-se de merontes, sendo por norma células esféricas, maiores que os

esporos maduros, ou, ainda, elongadas quando já se encontram em divisão. Em geral,

apresentam pouca diferenciação do citoplasma e possuem uma membrana plasmática

[Cali & Takvorian 1999]. A divisão dos merontes ocorre por fissão binária

(Encephalitozoon, Anncaliia, Thelohania, Vittaforma) ou por cariocinese, antes da

citocinése, resultando em células multinucleadas, designadas por plasmodia merogonial

(Enterocytozoon, Pleistophora, Trachipleistophora). A merogonia pode verificar-se em

contacto directo com o citoplasma da célula hospedeira (Anncaliia, Enterocytozoon), no

interior de um vacúolo parasitóforo derivado da célula hospedeira (Encephalitozoon),

dentro de um revestimento de material amorfo depositado pelo parasita (Pleistophora,

Trachipleistophora, Thelohania), ou, então, apenas com o organismo individual

intimamente envolvido por retículo endoplasmático (Vittaforma) [Cali & Takvorian

1999].

Fase esporogónica. O processo de esporogonia inicia-se com o desenvolvimento dos

merontes em esporontes que se caracterizam por possuir uma camada superficial

bastante densa aos electrões [Franzen & Muller, 1999; Didier et al., 1998]. Este

revestimento irá, mais tarde, originar a camada exterior, o exosporo, da parede do

esporo [Franzen & Muller, 1999]. Os esporontes multiplicam-se por fissão binária ou

múltipla e dividem-se em esporoblastos (estruturas ovóides, nas quais já se podem

reconhecer organelos) que irão desenvolver-se até ao estádio de esporo maduro. Os

esporontes podem ser uni-nucleados ou diplocarióticos. O número de divisões nucleares

e celulares que ocorrem nos esporontes varia consoante o género do microsporídio. São

observados três tipos de divisão: cariocinese ligada a citocinése, também descrita como

fissão binária, conduzindo à formação de dois esporoblastos, que por metamorfose

produzem dois esporos (ex. Anncaliia, Encephalitozoon); a citocinése não se encontra

ligada à cariocinese ocorrendo a repetição da divisão nuclear no interior da célula sendo

produzidos quatro núcleos (Tetramicra). Pode ainda verificar-se a ocorrência de

múltiplas divisões nucleares dentro da célula, constituindo estádios plasmodiais

multinucleados, que ao dividirem-se por plasmotomia podem produzir entre oito


- 26 -

(Vairimorpha) a mais de 100 esporos (Pleistophora). Alguns dividem-se, directamente,

em esporoblastos, por fissão binária, enquanto outros constituem estádios plasmodiais

multinucleados [Cali & Takvorian 1999; Franzen & Muller 1999b].

Enquanto os merontes, esporontes e esporoblastos apresentam intensa actividade

metabólica, nos esporos maduros, aquela é muito limitada [Cali & Takvorian 1999].

Ciclos secundários de infecção verificam-se após a ruptura das células infectadas

do hospedeiro, em que são libertados, quer os esporos maduros, quer outras formas

imaturas. Embora o esporo maduro seja considerado o estádio infectante, outras formas

ainda que imaturas, podem ser, também, infectantes ou, por outro lado, podem ter

atingido um determinado grau de desenvolvimento, suficiente para completar a sua

diferenciação no exterior da célula hospedeira e tornarem-se infectantes mais tarde [Cali

& Takvorian 1999].

Os microsporídios, de início, podem ser eliminados com as fezes ou com as

secreções respiratórias, ou auto-infectar o hospedeiro (in loco ou disseminando). O

parasita infecta novas células, injectando directamente, o conteúdo do esporo.

Recentemente, foi sugerido um processo alternativo, em que a entrada na célula

hospedeira ocorre por fagocitose do esporo do parasita, em que o tubo polar é utilizado

para escapar aos fagossomas e, infectar o citoplasma, da célula hospedeira [Franzen

2004; Franzen et al. 2005b] .

As infecções por E. bieneusi localizam-se, primeiro no intestino delgado,

apesar de também ocorrer envolvimento do tracto biliar [Yachnis et al. 1996; Cali &

Takvorian 1999]. Por outro lado, refira-se, também, que foram identificados esporos

deste parasita em secreções pulmonares de doentes imunodeficientes [del et al. 1997a].

Salvo algumas excepções, os géneros Pleistophora e Anncaliia, parasitam, em primeiro

lugar, o músculo esquelético e o estroma da córnea, respectivamente [Cali & Takvorian

1999]. O género Encephalitozoon, para além de infectar os enterócitos do intestino

delgado, parasita os macrófagos, disseminando-se no hospedeiro. Localizações

secundárias da infecção incluem (mas não são limitadas) o rim, fígado, baço, cérebro,

peritoneu e epitélio nasal. Os esporos de Encephalitozoon, são eliminados, também pela

urina (quando ocorre envolvimento renal), e pelas secreções respiratórias [Cali &

Takvorian 1999; Kotler & Orenstein 1999].


- 27 -

Aparentemente, todos os tecidos do hospedeiro parecem ser vulneráveis à

infecção de, pelo menos, um género de microsporidia [Cali & Takvorian 1999].

3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM

- 28 -

3. ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM

3.1. INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE MICROSPORIDIA MAIS FREQUENTES

Antes da pandemia da sida, eram raros os casos descritos de infecções por

microsporídios, em humanos: desde o primeiro registo de um caso em 1959 e, até 1985,

apenas foram reportados seis casos de infecção [Bryan et al. 1991]. Dois dos casos

verificaram-se em doentes imunocomprometidos, enquanto os restantes observaram-se

em pessoas presumivelmente imunocompetentes ou de estado imunológico

desconhecido.

Quando os microsporídios foram identificados pela primeira vez, no contexto da

infecção por VIH-1 e diarreia, especulou-se se estes organismos seriam verdadeiros

agentes patogénicos, visto que também eram detectados em pessoas sem quadro

diarreico, ou quaisquer outros sintomas típicos associados à microsporidiose. Estas

observações, parecem reflectir, o papel preponderante do sistema imunológico do

hospedeiro, na expressão de sinais clínicos durante a infecção. Os doentes com sida e

contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 100 cel/mm3 têm uma maior probabilidade de

desenvolver diarreia persistente, perda de peso e dor abdominal associada à infecção por

E. bieneusi e E. intestinalis. Enquanto os seropositivos para VIH, submetidos a

terapêutica anti-retrovírica, ou os seronegativos para VIH, mas com sistemas

imunológicos imaturos e/ou sem exposição prévia aos parasitas, como por exemplo os

de crianças, ou os viajantes para zonas endémicas, desenvolvem apenas quadros de

diarreia autolimitada [Tumwine et al. 2005; Wichro et al. 2005]. Estes achados,

sugerem a ocorrência de infecções persistentes ou de portadores assintomáticos, em

imunocompetentes.

A replicação dos microsporídios, nas vilosidades do epitélio do intestino

delgado, associada a uma redução da altura das vilosidades e, da sua área de superfície,

parece contribuir para a má-absorção que conduz à diarreia [Kotler & Orenstein 1999;

Weber et al. 2000; Morpeth & Thielman 2006; Wiwanitkit 2006]. Dois factores,

inerentes às lesões intestinais, são importantes para que ocorra má-absorção: a

diminuição da área de superfície da mucosa e a maturidade das vilosidades intestinais,

visto que ambos os parâmetros são importantes nos processos de absorção. A taxa de


- 29 -

absorção para qualquer nutriente, que atravesse a membrana, está associada com a área

de superfície da mucosa, a distância de difusão à membrana de absorção e o gradiente

de concentração que se verifica ao longo da membrana. A área de superfície da mucosa

é uma função do número de vilosidades intestinais, que por sua vez está dependente das

taxas de produção e perdas celulares. Estas taxas encontram-se em circunstâncias

normais, estritamente reguladas, de modo a manter a homeoestase [Johnson 1988;

Kotler & Orenstein 1999].

As 14 espécies de microsporidia patogénicas para o Homem, e os respectivos

locais de infecção, encontram-se sumariados no Quadro IV.

Quadro III. Microsporídios patogénicos para o Homem, e respectivos locais de

infecção. Adaptado de [Didier & Weiss 2006].

ESPÉCIES LOCALIZAÇÃO DAS PATOLOGIAS

Mais frequentes


Intestino delgado, vias biliares, aparelho respiratório

Encephalitozoon intestinalis Intestino delgado, vias biliares, aparelho respiratório, ossos, pele, disseminada


Globo ocular, aparelho respiratório, aparelho urinário, disseminada

Encephalitozoon cuniculi

Disseminada, olho, aparelho respiratório, aparelho urinário, fígado, peritoneu, cérebro

Menos frequentes

Anncaliia algerae Córnea e músculo esquelético

Anncaliia connori Disseminada

Anncaliia vesicularum Estroma da córnea, músculo esquelético

Microsporidium africanum Estroma da córnea

Microsporidium ceylonensis Estroma da córnea

Nosema ocularum Estroma da córnea

Pleistophora ronneafiel Músculo esquelético

Trachipleistophora antropophtera Córnea, disseminada

Trachipleistophora hominis Músculo esquelético, córnea (células epiteliais e do estroma)

Vittaforma corneae Estroma da córnea, íris e aperelho urinário


- 30 -

3.1.1. Infecção por Enterocytozoon bieneusi

A infecção por E. bieneusi, exprime-se clinicamente como uma síndrome de má-

absorção. Os sintomas consistem em diarreia aquosa crónica, intermitente, em geral,

sem muco nem sangue. Os doentes apresentam perda de peso lenta e progressiva. A

febre não está associada à infecção por E. bieneusi [Eeftinck Schattenkerk et al. 1991;

van & Dankert 1996; Kotler & Orenstein 1998] . Observam-se lesões sobretudo ao nível

do duodeno e do jejuno as quais se caracterizam microscopicamente, pela atrofia das

vilosidades intestinais, hiperplasia das criptas de Lieberkühn e infiltração linfocitária

[Shadduck & Orenstein 1993]. E. bieneusi propaga-se, essencialmente, nas células

epiteliais do topo das vilosidades intestinais e nas vias biliares À medida que a infecção

progride, os enterócitos sofrem diversas alterações, tornando-se o epitélio

progressivamente cúbico e, numa fase mais avançada, pleomórfico. O núcleo do

enterócito perde a polaridade basal e verifica-se um aumento da cromaticidade. O

citoplasma torna-se gradualmente mais vesiculado [Orenstein 1991; Kotler & Orenstein

1999] (Figura 6)

Figura 6. Secção de jejuno intestinal infectado por E. bieneusi. Na imagem, obtida por

microscopia electrónica de transmissão no interior do enterócito vesiculado podem

observar-se diversos esporos maduros (×9813). Adaptado de [Kotler & Orenstein 1999].


- 31 -

Apesar de E. bieneusi se propagar preferencialmente no intestino, encontram-se

descritas algumas infecções extra-intestinais: infecções ao nível das vias biliares e

vesícula de doentes com colangiopatia, no fígado, canal pancreático assim como no

aparelho respiratório [Weber et al. 1992b; del et al. 1997a; Lores et al. 1999; Weber et

al. 2000; Botterel et al. 2002; Sodqi et al. 2004].

3.1.2. Infecção por Encephalitozoon intestinalis

E. intestinalis representa a segunda espécie de microsporidia patogénico, mais

frequente no Homem. Clinicamente, E. intestinalis, tal como se verifica para E.

bieneusi, também se encontra associada a síndrome de má-absorção [Kotler & Orenstein

1999]. Esta espécie tem capacidade de invadir as células epiteliais do intestino delgado

e do intestino grosso. Simultaneamente com a multiplicação enteroepitelial, a mucosa

do intestino, também pode ser atingida ao nível da lâmina própria, incluindo as células

endoteliais de pequenos vasos e macrófagos [Cali et al. 1993; Chu & West 1996].

Tipicamente as infecções provocadas por E. intestinalis tendem a disseminar,

havendo registos de infecções em quase todos os sistemas de órgãos, incluindo aparelho

urinário, vesícula biliar, conjuntiva e aparelho respiratório [Cali et al. 1993; Molina et

al. 1995; Kotler & Orenstein 1999]. Orenstein e colaboradores descreveram um caso de

infecção pulmonar fatal, o qual ocorreu num doente transplantado de medula óssea

[Orenstein 2003; Orenstein et al. 2005].

E. intestinalis é sensível à terapêutica com albendazol, ao contrário de E.

bieneusi, constituindo a distinção das espécies uma importante informação para o

clínico [Chu & West 1996; Didier & Weiss 2006].

3.1.3. Infecção por Encephalitozoon hellem

E. hellem é descrita como a terceira espécie de microsporidia, causadora de

patologia no Homem [del et al. 2001b]. A maior parte dos casos clínicos de infecção

por esta espécie, correspondem a patologia ocular em doentes com sida, envolvendo a

córnea e a conjuntiva [Cali et al. 1991b; Didier et al. 1991b; Schwartz et al. 1993a;

Friedberg & Ritterband 1999]. As lesões da córnea causadas por E. hellem, são


- 32 -

superficiais, ao contrário das queratites associadas a outras espécies de microsporidia,

que atingem as camadas do estroma da córnea [Cali et al. 1991a; Schwartz et al. 1992;

Friedberg & Ritterband 1999]. A diminuição da acuidade visual, a sensação de corpo

estranho, lacrimejo, olho seco, fotofobia e olho vermelho são os sinais e sintomas desta

infecção [Cali et al. 1991a; Didier et al. 1991b; Didier et al. 1996a; Conners et al. 2004]

[Schwartz et al. 1993a].

Em doentes infectados por VIH, esporos de E. hellem foram isolados nas vias

respiratórias superiores e em secrecções respiratórias, embora sem qualquer quadro

clínico associado [Hollister et al. 1993; Weber et al. 1993; Scaglia et al. 1998b].

Contudo, também estão descritas infecções sintomáticas do aparelho respiratório, em

doentes com sida, atribuídas a esta espécie [Schwartz et al. 1993b; Deplazes et al.

1998].

Os esporos de E. hellem foram, também, detectados na urina [Weber et al. 1993;

Didier et al. 1996a]. Durante a autópsia a um doente com sida, que havia apresentado

disúria e hematúria no seu historial clínico, foram observadas, extensas lesões nos rins,

ureteres e bexiga, atribuídas a E. hellem [Schwartz et al. 1992]. Müller e colaboradores

identificaram E. hellem, em amostras fecais de viajantes, com quadro diarreico,

regressados de Singapura [Muller et al. 2001].

3.1.4. Infecção por Encephalitozoon cuniculi

Actualmente, encontram-se descritos 15 casos de infecção disseminada por E.

cuniculi, em doentes com sida [Gamboa-Dominguez et al. 2003]. As manifestações

clínicas dependem da localização das infecções. E. cuniculi já foi isolado nos aparelhos

respiratório, urinário e gastrintestinal, no sistema nervoso central e no globo ocular

(córnea e conjuntiva) [De Groote et al. 1995; Franzen et al. 1995b; Weber et al. 1997;

Rossi et al. 1998].

E. cuniculi infecta células epiteliais e endoteliais, assim como, macrófagos e

fibroblastos de vários tecidos e órgãos [Weber et al. 1992b]. A queratoconjuntivite e a

rinosinusite, parecem constituir as patologias mais frequentes [De Groote et al. 1995;

Rossi et al. 1998].


- 33 -

3.2. INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE MICROSPORIDIA MENOS FREQUENTES

Outros casos de interesse, correspondem à infecção no Homem, por espécies de

microsporidia menos frequentes: infecção da córnea num doente com sida por T.

anthropopthera [Juarez et al. 2005]; um caso fatal de miosite, numa mulher, com artrite

reumatóide, e diabetes, causada por A. algerae, um miscrosporídio que habitualmente

infecta mosquitos [Coyle et al. 2004; Visvesvara et al. 2005; Franzen et al. 2006]. Este

último caso, suscita a possibilidade de transmissão dos microsporidia, por vectores.

O número de casos de microsporidiose ocular também tem vindo a aumentar,

nomeadamente entre os utilizadores de lentes de contacto [Theng et al. 2001; Sridhar &

Sharma 2003; Chan et al. 2003; Kodjikian et al. 2005; Joseph et al. 2005; Fogla et al.

2005; Kakrania et al. 2006; Joseph et al. 2006; Sagoo et al. 2007].

3.2.1. Infecção por Anncaliia spp.

A espécie Anncaliia algerae [Lowman et al. 2000] é sobejamente conhecida

como um agente patogénico de insectos, nomeadamente de mosquitos [Vavra &

Undeen 1970], sendo apontada como um potencial agente de controlo biológico destes

insectos [Mathis et al. 2005]. Há três registos de infecção por A. algerae. O primeiro

caso, refere-se a uma queratite num imunocompetente com 67 anos de idade, que

apresentava diminuição da acuidade visual, olho vermelho e prurido [Visvesvara et al.

1999a]. No segundo caso, o microsporídio foi isolado a partir de biópsia do tecido

muscular da coxa, associado a mialgia, miastenia e ao aumento dos níveis séricos da

creatina quinase, de um doente com diabetes e artrite reumatóide submetido a

terapêutica imunossupressora [Coyle et al. 2004]. A espécie A. algerae foi também

isolada de lesões na pele, de uma criança com leucemia linfocítica aguda [Kucerova et

al. 2004]

Estão descritos mais dois casos de infecção humana, por outras espécies

pertencentes ao género Anncaliia: Anncallia connori [Bergquist et al. 1984a]

(originalmente designada por Nosema connori e depois como Brachiola connori) [Cali

et al. 1998], numa criança imunodeprimida, que desenvolveu infecção disseminada por


- 34 -

este agente [Margileth et al. 1973], e a espécie Anncallia vesicularum, envolvendo um

doente com sida, com lesões no tecido muscular esquelético [Cali et al. 1998].

3.2.2. Infecção por Microsporidium spp.

O género Microsporidium foi criado para albergar os microsporídios, ainda com

classificação por definir. Encontram-se neste género as espécies Microsporidium

africanum (sin. Nosema sp.) e Microsporidium ceylonensis (sin. Nosema sp.), que foram

isoladas no estroma da córnea de dois seronegativos para VIH [Ashton & Wirasinha

1973; Pinnolis et al. 1981]. Em ambos os doentes, a infecção causou úlceras na córnea,

que levaram à perda de visão [Canning et al. 1998; Kotler & Orenstein 1999].

3.2.3. Infecção por Nosema ocularum

A infecção por Nosema ocularum, foi descrita no estroma da córnea, num

seronegativo para o VIH, que apresentava inflamação e diminuição da acuidade visual,

do olho esquerdo [Cali et al. 1991a].

3.2.4. Infecção por Pleistophora sp.

Estão descritas três infecções por Pleistophora sp., em doentes com sida [Kotler

& Orenstein 1999]. O primeiro caso foi registado em 1985, tendo sido identificado à

data, o microsporídio, apenas até ao género. Mais tarde, este isolado veio a constituir a

primeira descrição da espécie Pleistophora ronneafiei [Ledford et al. 1985; Cali &

Takvorian 2003]. Os restantes isolados, apenas, foram identificados até ao género. Estes

microsporídios, foram isolados no tecido muscular esquelético, em doentes que

apresentavam mialgia e miastenia [chupp et al 1993].


- 35 -

3.2.5. Infecção por Trachipleistophora spp.

O género Trachipleistophora alberga as espécies T. anthropophthera [Vavra et

al. 1998] e T. hominis [Hollister et al. 1996b]. A espécie T. hominis, foi identificada em

dois doentes com sida e num imunocompetente africano, imigrante no Reino Unido

[Field et al. 1996; Hollister et al. 1996b; Rauz et al. 2004; Curry et al. 2005]. Nos

doentes com sida, esta espécie provocou infecção no tecido muscular esquelético, para

além de, num deles, ter causado infecção do epitélio da córnea. No imunocompetente

observou-se uma infecção localizada no estroma da córnea.

T. anthropophthera, foi identificada em três doentes com sida, dois dos quais

manifestavam sintomas neurológicos [Yachnis et al. 1996; Vavra et al. 1998; Juarez et

al. 2005; Pariyakanok & Jongwutiwes 2005]. As autópsias destes dois doentes,

permitiram isolar a espécie no cérebro e em vários outros órgãos. Pelo contrário,

observou-se no terceiro doente, uma infecção localizada, ao nível do epitélio da córnea.

Uma nova avaliação de dois casos de miosite atribuídos inicialmente a

Pleistophora spp. [Chupp et al. 1993; Grau et al. 1996], apontou para que, em ambos os

casos, se tratasse de uma infecção por Trachipleistophora [Curry et al. 2005].

3.2.6. Infecção por Vittaforma corneae

Encontram-se descritas quatro infecções por V. corneae (originalmente

designada por Nosema corneum) [Shadduck et al. 1990; Davis et al. 1990; Silveira &

Canning 1995; Mittleider et al. 2002; Rauz et al. 2004], em que apenas uma delas se

reporta a um doente africano com sida [Deplazes et al. 1998]. Nos três casos de

imunocompetentes oriundos dos EUA, a infecção circunscreveu-se ao estroma da

córnea. A sintomatologia englobava fotofobia e diminuição da acuidade visual. No

doente com sida, identificaram-se esporos de V. corneae na urina, sugerindo que este

microsporídio tenha a capacidade de se propagar noutros órgãos.

Em Portugal, foi identificada uma nova espécie - Vittaforma-like, geneticamente

relacionada com V. corneae, nas fezes de 22 doentes infectados por VIH e de três


- 36 -

crianças, seronegativas para VIH. Todos os infectados manifestavam um quadro

diarreico [Sulaiman et al. 2003c].

4.IMUNOLOGIA

- 37 -

4. IMUNOLOGIA

As infecções parasitárias continuam a ser causa a de morbilidade e mortalidade

significativas a nível mundial, independente do estado imunológico dos doentes.

Estima-se que existam aproximadamente cerca de 340 espécies de parasitas

potencialmente infectantes para o Homem, sendo a maioria das pessoas infectadas

residentes em regiões do globo em vias de desenvolvimento [Stark et al. 2009]. Os

parasitas intestinais são considerados a causa mais comum de doenças parasitárias,

associadas a uma significativa morbilidade e mortalidade.

Os factores de risco associados à probabilidade de contrair uma infecção

parasitária são idênticos quer se trate da população imunocompetente, quer da

população imunodeficiente. Qual será, então o papel do sistema imunológico, nas

infecções parasitárias? Na verdade, o sistema imunológico, através de determinadas

respostas localizadas ou sistémicas, tem um papel preponderante na forma do

estabelecimento da infecção, no controlo da infecção após o estabelecimento, limitando

a gravidade e a disseminação da doença, e ajudando na eliminação ou controlo do

parasita [Stark et al. 2009]. Sendo assim, os hospedeiros imunossuprimidos, encontram-

se mais susceptíveis a contrair a infecção após serem expostos ao parasita, desenvolvem

doença com maior gravidade, têm maior probabilidade de desenvolver infecção

disseminada e não têm capacidade de erradicar os parasitas, passando ao estado de

portadores crónicos. Todos estes parâmetros conduzem à elevada morbilidade e

mortalidade entre este grupo específico de doentes. No entanto, a maioria dos

imunossuprimidos não diferem dos imunocompetentes na sua apresentação, sendo o

grau de deficiência imunitária o determinante principal da gravidade da infecção e da

sua evolução. Acrescenta-se, ainda, que a reconstituição imunitária através da

introdução de terapêutica eficaz ou da remoção e/ou redução da dose de fármacos

imunossupressores, pode dar a estes doentes uma maior capacidade de combater o

agente infeccioso como acontece com os imunocompetentes.

O número de doentes com inmunossupressão, aumenta mundialmente, a cada

ano que passa, associado à dispersão do VIH, estimando-se que surgam diariamente, em

diversas regiões do globo, cerca de 14000 novas infecções [Barsoum 2006]. O que

complica este problema é que a maioria destas novas infecções ocorre em regiões, nas

4.IMUNOLOGIA

- 38 -

quais o acesso a terapia anti-retrovirica é limitado, levando a que os doentes evoluam

rapidamente para estados de profunda imunossupressão (ex, sida). Pelo contrário, nas

regiões mais desenvolvidas o número de pessoas com imunossupressão continua a

aumentar, mas como resultado da crescente administração de potentes fármacos

imunossupressores, no tratamento de doenças auto-imunes ou em doentes submetidos a

transplantes de medula e/ou órgãos [Bachur et al. 2008]

4.1. RESPOSTA IMUNOLÓGICA

A maioria dos organismos patogénicos desenvolveu mecanismos de evasão ao

sistema imunológico do hospedeiro. Sendo assim, a ocorrência de infecção e/ou a sua

persistência no organismo, estabelece-se da interacção entre o hospedeiro (sistema

imune) e o parasita.

O desenvolvimento de uma infecção por microsporídios encontra-se dependente

da contagem absoluta do número de células TCD4+, com níveis baixos deste número

associados a doença mais grave, com manifestações atípicas e com elevado risco de

infecções disseminadas [Weber et al. 1999a; Attili et al. 2006; Stark et al. 2009]. Por

outro lado a administração de terapêutica eficaz e o restabelecimento do sistema

imunitário, por exemplo ao aumentar os níveis de TCD4+ acima das 200 céls/mm3, o

risco de contrair e/ou desenvolver microsporidiose [Stark et al. 2009]. A imunidade

mediada por células parece ser importante na protecção contra a infecção pelos

microsporidia. Na verdade, uma resposta de citoquinas Th1 eficaz, que se caracteriza

pela produção de citoquinas como a interleucina-2 (IL-2), a citoquina interferão gamma

(-IFN, da sigla anglo-saxónica para gamma interferon) e a citoquina factor de necrose

tumural alpha (TNF-, da sigla anglo-saxónica para alpha tumor necrosis factor),

activação de macrófagos e de mecanismos citotóxicos é importante na resposta imune à

infecção. No entanto o papel das respostas imunes humorais à infecção humana pelos

microsporídios, ainda não se encontra clarificado [Didier et al. 1994].

Em regra, E. bieneusi, parasita em primeiro lugar, os enterócitos do intestino

delgado (jejuno e duodeno) e/ou as células epiteliais do tracto biliar, do hospedeiro. À

sua replicação estão associadas a atrofia ou perda das vilosidades dos enterócitos,

4.IMUNOLOGIA

- 39 -

malabsorção da D- xilose, hiperplasia das criptas, diminuição da actividade de enzimas

(dissacaridase), ou infiltração mononuclear, entre outras [Schmidt et al. 1997; Kotler &

Orenstein 1998].

As espécies do género Encephalitozoon ao infectarem, de inicio os enterócitos

do intestino delgado causam inflamação e subsequente dano às células intestinais. No

entanto, estes organismos através da infecção de macrófagos, podem ter a capacidade de

disseminar e de parasitar qualquer tecido do hospedeiro. Lesões granulomatosas

ocorrem nas áreas afectadas, consistindo em infiltrados de macrófagos, neutrófilos,

linfócitos ou células plasmáticas, sendo detectados níveis elevados da citoquina TNF-α

nas fezes de indivíduos com co-infecção sida/microsporidiose, os quais parecem

contribuir para a emaciação associada a esta parasitose, nestes doentes [Didier &

Bessinger 1999].

As respostas imunitárias e as lesões associadas à microsporidiose, dependem do

tipo de relação parasita-hospedeiro que se estabelece [Didier & Bessinger 1999].

4.1.1. Relações parasita-hospedeiro. Três tipos de relação parasita-hospedeiro, são

observadas entre os mamíferos infectados por microsporídios [Didier & Bessinger

1999]:

(I) hospedeiros jovens que desenvolvem patologia aguda, muitas vezes letal;

(II) adultos imunocompetentes que desenvolvem infecções crónicas e assintomáticas,

em que o hospedeiro sobrevive e o parasita persiste;

(III) hospedeiros imunocomprometidos que desenvolvem infecções patentes graves, que

podem ser letais.

A transmissão transplacentária da infecção por E. cuniculi em cães, raposas azuis

norueguesas e macacos são, muitas vezes letais. Estes animais revelam distúrbios

neurológicos, tais como ataxia, paralesia, convulsões, podendo morrer de síndroma de

emaciação ou de hemorragia cerebral, em poucos meses. De início, o parasita, parece

replicar-se devido à imaturidade do sistema imunitário do hospedeiro [Didier &

Bessinger 1999].

Os carnívoros adultos (raposas azuis e cães domésticos), infectados pelos

microsporídios, desenvolvem respostas de hipersensibilidade (tipo III) e

4.IMUNOLOGIA

- 40 -

hipergamaglobulinemia, as quais contribuem para a patologia renal (via formação de

complexos imunes) [Didier & Bessinger 1999].

A maioria dos casos de microsporidiose ocorre como resultado de transmissão

horizontal e se os hospedeiros forem imunocompetentes, desenvolvem-se, apenas,

infecções transitórias que evoluem, espontaneamente para a cura mas que persistem

como infecções crónicas latentes.

Em hospedeiros imunodeprimidos, tais com ratinhos atímicos ou em seropositivos

para VIH, com níveis de linfócitos T CD4+ menores ou iguais a 100 céls/mm3, a

susceptibilidade à microsporidiose é evidente, evoluindo a doença muitas vezes para a

morte [Didier et al., 1998]. Desconhece-se se estas infecções nos indivíduos

seropositivos para VIH são o resultado de uma reactivação de uma infecção latente ou

de uma primo-infecção.

4.1.2. Mecanismos de resistência do hospedeiro. O sistema imunitário do hospedeiro

parece desempenhar um importante papel no controlo da microsporidiose animal e

humana dado que quer nos animais quer nos humanos, imunocompetentes, apesar de se

registar sintomatologia, ocorre, em geral, evolução para a cura expontânea, enquanto

nos imunocomprometidos, a microsporidiose pode ser fatal para o hospedeiro.

Um sistema imunitário competente, nos hospedeiros dos microsporídios, parece ser

crítico, na relação equilibrada parasita-hospedeiro.

4.1.2.1. Imunidade humoral

Em animais de laboratório (macacos rhesus e ratinhos), imunologicamente

competentes, expostos aos antigénios de microsporídios, os níveis da imunoglobulina

IgM desenvolvem-se em três semanas, enquanto os níveis da IgG atingem um pico entre

as cinco e seis semanas, persistindo em geral durante toda a vida do hospedeiro

[Schmidt & Shadduck 1983; Didier et al. 1998; Didier & Bessinger 1999]. Em humanos

imunocompetentes, registou-se a expressão de anticorpos contra E. cuniculi, embora

não tenha sido possível determinar se a presença de anticorpos estava correlacionada

com uma verdadeira infecção dado que os microsporídios não foram, nunca

identificados [Didier & Bessinger 1999].

4.IMUNOLOGIA

- 41 -

O desenvolvimento de anticorpos contra os microsporídios, por animais (macacos

rhesus seropositivos para VIS, ratos SCID) e por humanos imunodeprimidos, é variável

e com pouco valor de diagnóstico. Esta variabilidade observa-se, também, nos níveis de

produção de anticorpos contra os microsporídios em seronegativos para VIH, sem

história de microsporidiose. Esta variabilidade parece ter ligação com o estado do

sistema imunitário do hospedeiro, quando ocorre a primo-infecção [Didier et al. 1991a;

Didier et al. 1991b].

Com base em estudos em modelos animais, foram associadas duas funções

protectoras à produção de anticorpos específicos contra os microsporídios, isto é,

actuando como opsoninas para facilitar a fagocitose mediada pelo macrófago, ou como

anticorpos específicos, contra E. cuniculi, produzidos por ratos murino, fixando o

complemento e induzindo a morte do parasita in vitro [Didier & Bessinger 1999].

Acresce que, embora a actividade dos anticorpos, por si só, não confira protecção à

microsporidiose [Weber & Bryan 1994] devendo co-existir, então, com outros

mecanismos protectores, encontra-se descrito que podem prolongar a sobrevivência de

ratinhos SCID (sigla anglo-saxónica para severe combined immune deficiency),

infectados por E. cuniculi por via oral [Sak et al. 2006].

Algumas das respostas por anticorpos, contribuem, provavelmente, para a

patologia, como se observa, nos casos das raposas azuis e cães infectados por E.

cuniculi que desenvolvem doença associada à presença de complexos imunes.

4.1.2.2. Imunidade celular

A morte de ratinhos com deplecção de linfócitos TCD4+, e TCD8+, infectados

experimentalmente com microsporídios, vem consolidar a hipótese de que a resistência

à doença letal se encontra dependente dos linfócitos T funcionais, no hospedeiro

[Moretto et al. 2004].

Na verdade, a transferência de linfócitos T sensibilizados, confere protecção a

ratinhos, e os doentes com níveis baixos de contagem de linfócitos TCD4+ (tal como

acontece nos doentes com sida) são particularmente susceptíveis à microsporidiose

[Asmuth et al. 1994; Didier & Bessinger 1999].

4.IMUNOLOGIA

- 42 -

Em estudos com ratos murino verificou-se que a citoquina IFN-γ promove a

activação de macrófagos, para eliminação dos microsporídios, parecendo possuir um

papel importante na resistência à microsporidiose in vivo [Didier & Bessinger 1999],

1998].

Sharpstone e colaboradores, verificaram que os níveis de -TNF, detectados nas

fezes, eram significativamente mais elevados, em indivíduos infectados por VIH com

microsporidiose intestinal do que em seropositivos para VIH sem microsporidiose,

atribuindo-lhe um possível papel na patogénese da infecção intestinal por microsporidia.

O tratamento, com um inibidor da citoquina -TNF, a talidomida, resultou no alívio da

sintomatologia do doente (redução do número de dejecções) e no aparecimento de

formas anormais de microsporídios [Sharpstone et al. 1997].

Estudos mais recentes, recorrendo ao uso do modelo murino, ou a estudos ex-

vivo no homem, realçaram a importância de citoquinas pró-inflamatórias (Th1), tais

como IFN-γ, TNF-α, assim como o papel do óxido nítrico observado na resistência a

Encephalitozoon spp. [Salat et al. 2004; Franzen et al. 2005a]. Após administração oral

de E. cuniculi a ratinhos, observa-se um rápido aumento dos linfócitos TCD8+

intraepiteliais. Estas células parecem participar nas respostas pró-inflamatórias via

produção e actividade citotóxica do IFN-γ, assim como contribuir para a regulação

imune, através da secrecção interleucina-10 (IL-10) [Moretto et al. 2004].

Pouco se conhece ainda, sobre o papel que os linfócitos T, desempenham nos

humanos com microsporidiose. Contudo, parece existir uma correlação com os níveis de

células TCD4+ e o risco de infecção por microsporidia [Orenstein 1991].

4.1.3. Especificidade de hospedeiro. A especificidade do hospedeiro parece ter, em

parte, um papel na resistência ou susceptibilidade à infecção, com algumas espécies de

microsporidia que infectam os mamíferos. Entre as cerca de mil espécies de

microsporidia, muito poucas são infectantes para os mamíferos. Algumas destas

espécies, foram descritas, apenas, em humanos (i.e. E. intestinalis). À medida que as

pesquisas avançam e se disponibilizam métodos mais aperfeiçoados de diagnóstico,

muitos destes microsporídios poderão vir a ser registados também em hospedeiros não

humanos.

4.IMUNOLOGIA

- 43 -

No entanto, deve ocorrer um certo grau de especificidade do hospedeiro, dado o

número de tentativas frustradas, de transmissão, experimental, de E. bieneusi, em

inúmeras estirpes de ratinhos imunodeficientes (atímicos, SCID; beije). A genética do

hospedeiro puderá desempenhar, também, algum papel, na susceptibilidade/resistência à

microsporidiose [Didier & Bessinger 1999]. Outro factor que pode influenciar a

especificidade do hospedeiro, diz respeito à própria temperatura corporal do hospedeiro.

Na verdade para, pelo menos, duas espécies de microsporidia, a temperatura constitui

um importante factor limitante, restritivo da gama de hospedeiros, bem como do local

de infecção [Didier & Bessinger 1999]. Um microsporídio parasita de insectos, A.

algerae, em cultura celular de rim de suíno, embora seja infectante, não sobrevive mais

do que três dias a 37 º C. Todavia, este parasita cresce indefinidamente quer em cultura

celular de rim de porco quer em células MDCK, mantidas a temperaturas entre os 25-

27º C. Também E. hellem, agente de doença humana, reconhecido em diversas espécies

de aves, cuja temperatura corporal ronda os 41º C, parece replicar-se in vitro, muito

mais rapidamente a 41º C do que a 37º C [Didier et al. 1991c]. Também E. hellem,

agente de doença humana, reconhecido em diversas espécies de aves, cuja temperatura

corporal ronda os 41º C, parece replicar-se in vitro, muito mais rapidamente a 41º C do

que a 37º C [Didier & Bessinger 1999]. Estas observações têm de certo modo um

interesse epidemiológico, na medida em que vários dos doentes com sida e infectados

por E. hellem tinham periquitos domésticos, contribuindo este facto para apoiar a

hipótese de as infecções por esta espécie constituírem zoonoses [Didier & Bessinger

1999].

Devido à ausência de culturas in vitro e de em modelo animal para E. bieneusi,

ainda não foi possível estudar a resposta imunitária que confere protecção, à infecção

por este microsporídio. A ocorrência de infecções naturais por E. bieneusi encontra-se

descrita em macacos rhesus e macacos cauda-de-porco, representando os únicos

modelos animais que mimetizam as infecções que se podem observar quer em doentes

imunodeficientes quer em imunocompetentes [Green et al. 2004; Drosten et al. 2005].

5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE

- 44 -


5.1. DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO

Os sinais e sintomas que acompanham as infecções por microsporídios, não são

suficientemente claros, para que o seu diagnóstico possa ser baseado no quadro clínico.

Contudo, o diagnóstico presuntivo da microsporidiose humana justifica-se em doentes

infectados por VIH, assim como com outras causas de imunossupressão, que

apresentam um quadro clínico de diarreia persistente, malabsorção, emaciação e

contagem de linfócitos T CD4+ inferior a 100 céls/mm3 [Weber et al. 1999b].

5.2. DIAGNÓSTICO DEFINITIVO

O diagnóstico da microsporidiose, no Homem, depende da identificação dos

esporos, em produtos biológicos, nomeadamente em amostras de fezes, urina, sucos

duodenal e biliar, exsudado da conjuntiva e nasal, expectoração, lavado broncoalveolar

ou biópsia dos tecidos. A identificação dos esporos nestas amostras é, contudo, uma

tarefa árdua, para o investigador, devido ao facto destes organismos terem dimensões

reduzidas, possuírem um fraco e variável poder da coloração e, ainda, causarem escassa

resposta inflamatória nos tecidos infectados, facilitando a dissimulação da infecção. O

desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial sensíveis, específicos e

rápidos, tem sido objecto de recentes estudos.

De início, para o diagnóstico definitivo da microsporidiose, recorria-se ao

auxílio da microscopia electrónica. Nos últimos anos assistiu-se ao desenvolvimento de

novos métodos de coloração, apropriados para a microscopia óptica. Contudo, apesar

dos avanços nesta área, a diferenciação das espécies de microsporídia é, em regra,

impossível através destes métodos. Visando a diferenciação das espécies,

desenvolveram-se técnicas de imunofluorescência com anticorpos monoclonais anti-

microsporidia, embora os anticorpos utilizados nestes métodos, só recentemente,

tenham começado a ser comercializados. Até, há bem pouco tempo, estes anticorpos

monoclonais só se encontravam disponíveis nos laboratórios de investigação.

Analogamente, embora os sistemas de cultura celular, permitam a cultura de algumas


- 45 -

espécies de microsporidia in vitro, a cultura celular não é uma técnica de rotina

adequada, dado ser demasiado demorada e laboriosa.

Para a detecção de anticorpos anti-microsporidia têm sido desenvolvidos vários

testes serológicos, sendo ainda, desconhecida a sensibilidade e especificidade destes

testes. Por outro lado, refira-se que estes métodos não são apropriados para o

diagnóstico da infecção em doentes imunocomprometidos.

Recentemente, a aplicação de novas técnicas moleculares, no estudo da

microsporidiose humana, tem vindo a revelar-se como uma promissora metodologia, no

diagnóstico dos vários quadros clínicos provocados pelos microsporídios.

5.2.1. Microscopia electrónica de transmissão

O diagnóstico definitivo da microsporidiose fundamenta-se na observação dos

microsporídios em biópsias de tecidos, nos fluídos corporais (urina, exsudado nasal,

expectoração, lavado broncoalveolar, suco duodenal e biliar, líquido cefalorraquidiano)

ou, ainda, em amostras de fezes, observadas por microscopia electrónica de transmissão

(MET). A visualização da ultra-estrutura dos esporos, com o seu característico

filamento polar é diagnóstica [Weber et al. 1999b]. Esta técnica permite a identificação

dos microsporídios ao nível do género ou, mesmo, da própria espécie, com base nas

características morfológicas dos esporos ou das suas formas proliferativas, no método

de divisão e, ainda, na natureza da interface entre o parasita e a célula hospedeira.

Todavia, nem todas as espécies de microsporidia, podem ser caracterizadas

exclusivamente com recurso à morfologia. A diferenciação entre as três espécies do

género Encephalitozoon só é possível através de uma análise molecular e aos seus

antigénios. Contudo a MET continua a ser considerada a técnica padrão, para

confirmação do diagnóstico e identificação de microsporidia [Weber et al. 1999b].

Todos os estádios do ciclo de vida do parasita podem ser encontrados nos

tecidos infectados, enquanto que nos fluídos corporais e nas fezes, em geral, apenas se

podem observar os esporos [Fedorko & Hijazi 1996].

A detecção de microsporídios por MET é bastante específica, sendo, contudo, uma

técnica de fraca sensibilidade, inerente à reduzida quantidade de amostra que pode ser

examinada. Outras das desvantagens, associadas a este método, incluem a necessidade


- 46 -

de recorrer a procedimentos invasivos (biópsia) para observar as formas intracelulares, e

por se tratar de uma metodologia demasiado laboriosa e onerosa [Fedorko & Hijazi

1996; Didier 1998; Franzen & Muller 1999b]. Por outro lado, não é fácil encontrar

microscópios electrónicos em laboratórios de rotina.

5.2.2. Microscopia óptica

O exame histológico de biópsias, ou por citologia de fluídos corporais e de fezes,

por microscopia óptica, permite o diagnóstico dos vários quadros clínicos da

microsporidiose mas, na grande maioria dos casos, é muito difícil a identificação da

espécie ou do género dos microsporídios.

5.2.2.1. Exame histológico ao microscópio óptico

As reduzidas dimensões dos organismos, bem como a escassez de resposta

inflamatória dos tecidos infectados, tornam difícil a detecção dos microsporídios por

microscopia óptica. A sua visualização depende de um contraste entre os esporos e os

restantes constituintes celulares.

Os parasitas, em tecidos corados pela hematoxilina-eosina, passam

despercebidos, mesmo a patologistas experientes [Didier 1998; Weber et al. 1999b;

Franzen & Muller 1999b].

Em contrapartida, nas colorações Gram e Warthin-Starry modificado, os esporos

exibem a propriedade de birrefracção, que os diferencia de outras inclusões

intracelulares. As colorações Brown-Brenn ou Brown-Hopps, aparentam alguma

utilidade na identificação de microsporídios em secções de tecido embebidas em

parafina [Lamps et al. 1998; Franzen & Muller 1999b], corando os esporos maduros de

Gram-positvo. Os esporos de vermelho tendem a ser os imaturos [Garcia 2002].

Técnicas de coloração fluorescente com branqueadores ópticos são rápidas e

fáceis de efectuar em tecidos, apresentando elevada sensibilidade e podendo ser

combinadas com outros métodos de coloração [Franzen et al. 1995a; Franzen & Muller

1999b].


- 47 -

A coloração de tecidos com o tricrómio modificado-Cromotrope 2R, ou a

Warthin-Starry são utilizadas, também, embora ambas as técnicas sejam demoradas e de

difícil interpretação [Weber et al. 1992c; Fedorko & Hijazi 1996].

Secções semifinas de material de biópsia, embebidas em resina, coradas com

uma vasta gama de corantes (hematoxilina-eosina, Giemsa, azul de toluidina, fucsina

básica), são métodos úteis para a visualização dos microsporídios, não sendo contudo

usados por rotina, na maioria dos laboratórios [Franzen & Muller 1999b]. Na Figura 7

podem ser observados esporos de microsporídios corados pela técnica do calcoflúor e

do Gram-Chromotrope.

5.2.2.2. Diagnóstico citológico e exame de fezes.

A identificação dos microsporídios pela microscopia óptica, em amostras obtidas

por processos não invasivos, tem constituído um forte desafio aos investigadores. Os

esporos de microsporidia podem ser detectados em diversos fluídos corporais e em

amostras de fezes [van et al. 1994a; Weber et al. 1999b].

A parede dos esporos é constituída por uma camada externa (exosporo)

proteinácea e por uma camada interna (endosporo) quitinosa. Várias colorações, tais

como, Gram, Giemsa, tricrómio ou fluorescentes têm sido experimentadas na coloração

dos microsporídios. No diagnóstico citológico, as colorações por Giemsa (ou por Gram

B

Figura 7. (A) Fotografia de esporos de E. cuniculi em esfregaço de secreção pulmonar,

corados pela técnica do calcoflúor; (B) Fotografia de esporos de E. intestinalis, em

esfregaço de cultura, corados por Gram-Chromotrope. (×1000). Originais de autora.


- 48 -

não são apropriadas, visto que não permitem a distinção entre os microsporídios e

outros microrganismos presentes nas amostras de produtos biológicos (i.e.

enterobactérias, com tamanho, forma e características de coloração semelhantes aos

microsporídios) [Fedorko & Hijazi 1996; Weber et al. 1999b]. Só após o

desenvolvimento de colorações especiais fluorescentes ou baseadas no reagente

chromotrope 2R tornou-se rotineiro o exame microscópico de fluídos corporais para o

diagnóstico dos microsporídios.

5.2.2.2.1. Coloração pelo tricrómio modificado.

A técnica de tricrómio modificada, desenvolvida por Weber e colaboradores

[Weber et al. 1992a], é o método mais comum, utilizado nos laboratórios de diagnóstico

para a detecção de microsporídios em fezes, urina e muco [Didier 1998; Sparfel et al.

1998; Amato et al. 1999; Weber et al. 1999b]. A modificação à técnica de tricrómio

consiste em decuplicar a concentração de chromotrope 2R, um dos componentes da

solução do tricrómio. Os esporos de microsporídios, observados com uma ampliação

1000, apresentam a sua parede celular corada de rosa, e nalguns pode ver-se uma cinta

rosada que divide os esporos, diagonalmente ou equatorialmente [Weber et al. 1992a].

As leveduras podem corar de um modo semelhante, mas distinguem-se dos

microsporídios, por serem de maiores dimensões e corarem mais intensamente. As

bactérias que coram com a mesma cor, podem-se distinguir dos microsporídios, pela

forma não oval (coco ou bastonete), e pela coloração homogénea que apresentam

[Weber et al. 1992a].

Esta técnica tem como desvantagens ser lenta e apresentar dificuldades na

detecção dos esporos se estes se encontrarem em pequeno número na amostra. Todavia,

algumas modificações implementadas por vários autores, como alterações na

temperatura e no tempo de coloração [Kokoskin et al. 1994; Didier et al. 1995a],

decréscimo no nível de ácido fosfotúngstico e substituição do contracorante [Ryan et al.

1993] têm como propósito acelerar o processo e proporcionar um melhor contraste entre

os esporos e o fundo.


- 49 -

5.2.2.2.2. Coloração pelo Gram - Chromotrope

Moura e colaboradores [Moura et al. 1997], desenvolveram a técnica Gram-

Chromotrope a quente, com vantagens acrescidas na coloração dos microsporídios para

microscopia óptica. Neste método, as amostras são coradas em soluções de violeta de

cristal e iodo, usadas na coloração Gram e, ainda, pela solução do tricrómio modificado,

aquecida entre os 50 ºC a 55º C. O tempo de duração da técnica fica reduzido apenas a

cinco minutos.

Os esporos de microsporídios, ficam, então, corados de violeta escuro sobre um

fundo verde claro. A solução Chromotrope, realça a cinta que rodeia habitualmente o

esporo, e ajuda a minimizar a coloração gram-variável, que algumas espécies de

microsporídios apresentam, quando coradas com a coloração Gram (Figura 7).

5.2.2.2.3. Coloração por fluorocromos

Para a detecção de microsporídios na urina, fezes ou muco, podem ser usados

agentes quimiofluorescentes, sendo o Uvitex 2B, calcoflúor e o fungifluor (formulação

de Calcoflúor em 10% de KOH), os corantes de primeira linha [Conteas et al. 1996;

Didier 1998; Goodgame et al. 1999; Franzen & Muller 1999b; Weber et al. 1999b]. Os

fluorocromos possuem elevada afinidade para a camada quitinosa (endosporo) do

esporo, sendo estes identificados pelo seu tamanho, forma e características de

fluorescência (halos ovais azul turquesa brilhantes sob luz ultravioleta) [Weber et al.

1999b] (Figura 7). Por vezes, verifica-se uma intensidade variável da coloração dos

esporos, presentes numa amostra, brilhando uns mais do que os outros [Luna et al.

1995]. A metodologia desta técnica é fácil e rápida, mas o exame requer um

microscópio de fluorescência com um filtro de excitação com comprimentos de onda

entre os 350-380 nm e, ainda, de lentes potentes com objectiva de 1000. Estes métodos

com fluorocromos, são descritos nalguns estudos como sendo mais sensíveis do que os

que utilizam o tricrómio, no entanto podem corar leveduras, dando origem a falsos

positivos [Weber & Bryan 1994; Luna et al. 1995; DeGirolami et al. 1995; Chioralia et


- 50 -

al. 1998; Weber et al. 1999b; Matos et al. 2002]. Todavia, existem outros estudos, que

não corroboram estes resultados [Didier et al. 1995a; Ignatius et al. 1997]. Num

aspecto, vários autores estão de acordo, as duas técnicas devem ser utilizadas

simultaneamente, de forma a potenciar o diagnóstico correcto, especialmente nos

produtos biológicos com baixa carga parasitária [DeGirolami et al. 1995; Didier et al.

1995a; Ignatius et al. 1997].

A concentração dos fluídos corporais torna-se necessária, dado, por vezes, o

pequeno número de microsporídios nas amostras biológicas. As técnicas de

concentração, para detecção dos esporos de microsporídios, geram alguma polémica.

Alguns autores observaram que técnicas de concentração, tais como a concentração com

acetato de formalina-éter ou diferentes métodos de flutuação, conduzem a uma perda

substancial dos esporos, logo a resultados falso negativos. Outros, porém, verificaram

que as técnicas de sedimentação água-éter ou a centrifugação de amostras de fezes

tratadas com KOH, aumentavam a possibilidade de identificação dos esporos de

microsporídios. Uma destas técnicas de concentração deverá ser, então, aplicada às

amostras de fezes [Weber et al. 1999b].

5.2.3. Técnicas de imunofluorescência indirecta com anticorpos mono e policlonais

A técnica de imunofluorescência indirecta (IFI), associada a anticorpos específicos

anti-microsporídios, marcados com fluoresceína, tem sido utilizada no diagnóstico e

diferenciação de espécies destes parasitas. Os anticorpos poli e monoclonais foram

usados, também, para análise de várias espécies de microsporidia por Western-blot

[Weber et al. 1999b].

Ensaios com anticorpos imunofluorescentes, envolvendo antisoro policlonal contra

E. hellem, E. cuniculi e E. intestinalis, produzido quer em ratinhos, quer em coelhos,

revelaram que várias das espécies de microsporídios apresentavam reacções cruzadas

imunológicas. As reacções cruzadas, observadas, quer entre diferentes espécies de

microsporídios, quer com bactérias e fungos, constituem um factor limitante desta

técnica [Zierdt et al. 1993; Aldras et al. 1994].

Até à data, já foi conseguida a produção de anticorpos que reconhecem E. hellem

[Aldras et al. 1994], E. cuniculi, E. intestinalis [Beckers et al. 1996] e E. bieneusi


- 51 -

[Accoceberry et al. 1999]. A maior parte destes anticorpos monoclonais são específicos

de antigénios existentes nos esporos [Aldras et al. 1994]. Porém, outros autores,

utilizam simultaneamente, anticorpos monoclonais que reagem com as proteínas do

filamento polar e anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios da superfície dos

esporos [Beckers et al. 1996]. Alguns destes anticorpos monoclonais são específicos de

espécie, enquanto outros reagem com a parede do esporo ou com o filamento polar de

várias espécies de microsporidia.

Embora estas técnicas sejam úteis na diferenciação dos microsporídios, nas

diferentes amostras biológicas, existem estudos, que lhe atribuem um baixo grau de

sensibilidade, quando comparadas com outras técnicas. Assim, Didier e colaboradores

[Didier et al. 1995a], ao compararem três técnicas, nomeadamente tricrómio

modificado, coloração pelo calcoflúor e um teste fluorescente com anticorpo policlonal,

verificaram que este último era o método menos sensível para detectar os esporos de

microsporídios em amostras de fezes, de urina e de fluído duodenal. Estes autores

propõem que se faça um rastreio das amostras a testar com o calcoflúor, confirmando,

posteriormente as amostras positivas com a técnica do tricrómio modificado. No

entanto, como estes métodos não permitem a identificação da espécie de microsporidia,

os anticorpos específicos de espécie, deverão ser utilizados para fornecer identificações

definitivas.

5.2.4. Testes serológicos

Entre os diversos testes serológicos, com vista à detecção de anticorpos das classes

IgG e IgM contra os microsporídios nos humanos, incluem-se a IFI e o teste

imunoenzimático específico (ELISA, sigla do anglo-saxónico enzyme linked

immunosorbent assay) [Singh et al. 1982; Kucerova-Pospisilova & Ditrich 1998;

Kucerova-Pospisilova et al. 2001; Kucerova-Pospisilova et al. 2003; Omura et al.

2007], contraimunoelectroforese ou o Western-blotting. A sensibilidade e especificidade

destes métodos, na detecção de anticorpos anti-microsporidia, é, contudo, ainda,

desconhecida dado não existirem estudos comparativos disponíveis [Fedorko & Hijazi

1996; Didier & Weiss 2006]. Alguns destes testes, são utilizados na detecção de

anticorpos em diversas espécies animais [Singh et al. 1982; Weber et al. 1999b].


- 52 -

Em seropositivos e seronegativos para VIH [van et al. 1997], têm sido registados

anticorpos contra E. cuniculi [van et al. 2004] e E. intestinalis. Contudo, não existem

certezas se a presença de anticorpos são o resultado de uma verdadeira infecção, de

exposição antigénica sem estabelecimento do parasita, de reacções cruzadas com outras

espécies de microsporídios ou, ainda, de uma reacção não específica.

Nalguns estudos, demonstrou-se um aumento das taxas de seropositividade para E.

cuniculi, em habitantes de regiões tropicais e que apresentam doenças endémicas dessas

mesmas regiões. Em doentes com malária e com shistosomose, as taxas de

seropositividade para E. cuniculi foram de 4,7 % e 9,1 %, respectivamente [Hollister &

Canning 1987].

Com base num estudo em homossexuais suecos verificou-se que 10 em 30

indivíduos (33%) possuiam anticorpos contra E. cuniculi, e que todos os doentes

seropositivos para E. cuniculi tinham visitado uma região tropical [Hollister et al. 1991;

Fedorko & Hijazi 1996; Franzen & Muller 1999b] . Por outro lado, refira-se que foram

observadas taxas elevadas de seroprevalência de anticorpos contra E. intestinalis entre

um grupo de dadores de sangue alemães, de mulheres grávidas francesas e de doentes

com várias patologias infecciosas e não infecciosas, 8%, 5% e 4%, respectivamente

[van et al. 1997]. Em 2010, no Japão, foi publicado um estudo seroepidemiologico, em

380 pessoas saudáveis, em que a prevalência de anticorpos IgM anti-E. cuniculi da

proteína do tubo polar, detectada foi de 36,3% [Omura et al. 2007]. Recentemente, a

presença de anticorpos contra E. cuniculi foi detectada em 0.9% de humanos, 52% de

suínos, 2% de gado bovino, 9% em ovelhas e 15 % em cães. No mesmo estudo, foram

detectados anticorpos contra E. intestinalis em 6% de humanos, 51% de suínos, 11% de

gado bovino e 6% de cães [Malcekova, dados não publicados].

Os métodos serológicos não constituem ferramentas apropriadas de diagnóstico

para a microsporidiose, dado que, pelo menos, metade das amostras de soro de

indivíduos sem história de infecção por microsporídios, possuem títulos positivos

[Didier et al. 1991b; Fedorko & Hijazi 1996; Weber et al. 1999b]. Associadas às

técnicas serológicas, identificam-se outros problemas, nomeadamente a fraca resposta

imunológica em imunocomprometidos ou, ainda, a probabilidade de diferentes

microsporídios (patogénicos e não patogénicos) possuírem antigénios comuns que


- 53 -

gerem reacções cruzadas, ou memo de reacções cruzadas com outros organismos

(fungos) [Fedorko & Hijazi 1996; Thomarat et al. 2004; Furuya et al. 2009].

No entanto, dado que tem vindo a aumentar o número de casos de infecção por

microsporídios em, imunocompetentes, como crianças, viajantes e idosos, têm vindo a

ser dados passos no sentido do desenvolvimento de métodos serológicos, que utilizam a

totalidade do parasita, ou proteínas do tubo polar ou da parede do esporo, como

antigénios, nomeadamente para os microsporídios que não crescem em cultura [van et

al. 2004; Xu & Weiss 2005; Polonais et al. 2005; Peek et al. 2005; Taupin et al. 2006].

Já foi demonstrado que, a resposta serológica, que se observa nos humanos é, em parte,

resultado da exposição aos glicoepitopos constituintes do tubo polar [Xu & Weiss 2005;

Notermans et al. 2005; Peek et al. 2005]. Este tipo de metodologia na abordagem ao

diagnóstico da microsporidiose, pode vir a permitir a detecção de infecções subclínicas

em portadores, que podem transmitir a infecção a grupos populacionais de risco (ex:

doentes transplantados), ou que podem eles próprios, vir a sofrer reactivação do

organismo, em virtude de desenvolverem algum grau de imunocomprometimento (ex:

envelhecimento).

5.2.5. Isolamento em culturas celulares

Os microsporídios são parasitas intracelulares obrigatórios e, como tal, não

podem ser isolados nos meios de cultura tradicionais, utilizados para as bactérias e

fungos.

Undeen, em 1975, estabeleceu pela primeira vez, um microsporídio, A. algerae

numa linha celular de mamífero, nomeadamente em células de rim de suíno, a 26 ºC

[Undeen 1975; Franzen 2008]. Diversas espécies de microsporidia têm sido cultivadas

com sucesso, em linhas celulares de mamíferos, nomeadamente em células de rim de

macaco e de coelho (Vero e RK13), em fibroblastos de pulmão de fetos humanos

(MRC-5), células MDCK e, ainda, em várias outras linhas celulares [Weber et al.

1999b].

Entre as espécies que crescem em cultura in vitro, obtidas a partir de uma

variedade de amostras biológicas humanas, incluem-se as três espécies do género

Encephalitozoon (E. cuniculi, E. intestinalis e E. hellem), para além de V. corneae, A.


- 54 -

algerae, T. hominis, e T. anthropophthera [Shadduck 1969; Vavra et al. 1972; Didier et

al. 1991a; Visvesvara 2002; Garcia 2002; Juarez et al. 2003; Juarez et al. 2005]. Até à

data, E. bieneusi foi possível, apenas, manter em cultura, durante um curto período de

tempo (seis meses) [Visvesvara et al. 1995; Weber et al. 1999b].

A detecção de microsporídios em células de cultura infectadas pode levar entre três

a 10 semanas [van et al. 1994b; Visvesvara et al. 1995].

As culturas in vitro permitem estudar, por exemplo, os aspectos biológicos dos

microsporídios, potenciar o desenvolvimento de reagentes imunológicos para o

diagnóstico e diferenciar espécies, para além de proporcionarem um meio adequado

para ensaios farmacológicos [van et al. 1994b; Weber et al. 1999b; Snowden et al.

2000; Leitch & Ceballos 2008; Choudhry et al. 2009].

Análises moleculares, ultraestruturais, bioquímicas e antigénicas, combinadas com

culturas in vitro, têm servido para confirmar determinadas infecções provocadas por

espécies de microsporidia, já identificadas, bem como para definir novas espécies

[Franzen & Muller 1999b].

Contudo, o isolamento de microsporídios in vitro, não tem relevância como

método de diagnóstico de rotina, embora seja um instrumento importante no contexto da

investigação. Apenas os laboratórios especializados mantêm culturas celulares de

microsporídios [Weber et al. 1999b].

5.2.6. Modelos animais

Vários modelos animais foram desenvolvidos para o estudo das infecções por

microsporídios [Silveira et al. 1993; Snowden et al. 1998; Franzen & Muller 1999b;

Snowden et al. 2000]. A maioria destes modelos utiliza E. cuniculi, como agente

patogénico, visto este organismo ser reconhecido como causa importante de infecções

latentes em roedores de laboratório. BALB/c e C57B1/6, estirpes de ratinhos atímicos

infectados intraperitonealmente com E. cuniculi, E. hellem ou V. corneae, foram

utilizados como modelos animais [Schmidt & Shadduck 1983].

Num estudo, para testar a eficácia do albendazol em E. cuniculi, in vivo, utilizou-se

um modelo animal, com ratinhos SCID infectados por via oral com esporos daquele

parasita. Verificou-se que ratinhos imunocompetentes infectados por E. cuniculi


- 55 -

desenvolviam apenas infecção crónica assintomática. Macacos rhesus, infectados com o

vírus da imunodeficiência dos símios (VIS), foram infectados por via oral, com E.

cuniculi, E. hellem e V. corneae e mais recentemente com E. bieneusi (via oral)

[Franzen & Muller 1999b].

Até à data, foi possível infectar animais em laboratório, a partir de isolados de E.

bieneusi de origem humana, nomeadamente macacos rhesus [Tzipori et al. 1997; Green

et al. 2004], porquinhos gnotobióticos [Kondova et al. 1998], ambos com

imunodeficiência, ratos Sprague-Dawley [Accoceberry et al. 1997a] e coelhos da Nova

Zelândia [Accoceberry et al. 1997b]. Em qualquer destes grupos de animais estudados,

mais uma vez, apenas de observou infecção crónica assintomática, à semelhança do que

outros autores haviam registado em suínos imunocompetentes, infectados naturalmente

[Breitenmoser et al. 1999]. Diversas tentativas de infectar ratinhos imunodeficientes,

assim como imunocompetentes, revelaram-se infrutíferas durante algum tempo [Didier

et al. 1998]. No entanto, Feng e colaboradores desenvolveram potenciais modelos

animais (roedores) para estudos da espécie E. bieneusi [Feng et al. 2006]. Estes estudos,

permitiram a transmissão do parasita isolado de humanos com sucesso, e o

estabelecimento de infecção crónica durante 18 semanas, em diversos modelos de

roedores imunodeficientes.

Porém, não foi ainda desenvolvido, um modelo animal experimental adequado,

que tenha a capacidade de mimetizar a patologia intestinal, que ocorre nos doentes

infectados por VIH.

Não obstante, os modelos animais constituem uma importante base para o

desenvolvimento e a avaliação de métodos de diagnóstico, produção em massa do

parasita, para o estudo de respostas imunológicas [Omalu et al. 2007], de candidatos a

vacinas, de estratégias de tratamento [Snowden et al., 2000] ou da investigação sobre

vias de transmissão [Cox et al. 1979], sendo, também, essenciais à produção de

anticorpos poli e monoclonais contra os microsporídios.

5.2.7. Métodos moleculares

Os métodos moleculares aplicados em todas as áreas do estudo dos seres vivos

têm contribuído para um conhecimento mais aprofundado em todos os domínios da


- 56 -

biologia. Em filogenia e sistemática contribuíram para uma nova organização dos seres

vivos ao nível da megasistemática.

Ao longo da última década, verificou-se uma aplicação gradual, das técnicas

moleculares, ao diagnóstico e caracterização dos microsporídios. Esta metodologia, tem

como objectivo, a detecção de uma determinada sequência do ácido nucleico, ou de um

antigénio específico. Enquanto, nos laboratórios de rotina, o diagnóstico de primeira

linha é feito com recurso aos métodos de microscopia, nos últimos 15 anos, as técnicas

moleculares têm sido, essencialmente, desenvolvidas e aplicadas nos centros de

investigação.

Vários autores têm descrito técnicas de amplificação de ácido

desoxirribonucleico (DNA, da sigla anglo-saxónica para deoxyribonucleic acid), por

reacção em cadeia da polimerase (PCR, da sigla anglo-saxónica para polymerase chain

reaction), a fim de detectar a presença de microsporídios em amostras biológicas e

ambientais, ultrapassando as limitações de sensibilidade e especificidade apresentadas

pelas técnicas acima descritas [Ombrouck et al. 1997; Weber et al. 1999b]. O limiar de

detecção de microsporídios numa amostra de fezes, através de microscopia óptica, varia

entre a presença de 10 e 106 esporos/g de fezes, enquanto a PCR permite detectar

concentrações da ordem dos 102 esporos/g de fezes [Rinder et al. 1998a]. Como tal,

estudos epidemiológicos, que envolvam, apenas, a utilização da microscopia óptica,

podem conduzir a dados que não reflitam uma correcta avaliação da prevalência de

microsporídios. Porém, são necessários, ainda, mais estudos para avaliar estes

parâmetros e os valores preditivos destes métodos.

A sensibilidade da reacção de PCR para a detecção de microsporídios depende

de diversos factores, tais como o número de cópias da região do genoma a amplificar ou

a presença de constituintes fecais inibidores da reacção [Weber et al. 1999b; Carey et al.

2004]. Assim, os sais biliares, a bilirrubina, os metabolitos de fármacos, o DNA de

outros microrganismos ou polissacáridos complexos de origem vegetal que sequestrem

o ião magnésio, de cuja concentração depende a actividade da enzima Taq DNA

polimerase, ou que mimetizem o comportamento do DNA, reduzem a eficiência e a

sensibilidade da reacção de PCR [Monteiro et al. 1997; Weber et al. 1999b]. Para

ultrapassar este problema são necessários métodos de extracção de DNA genómico

eficazes na remoção daqueles inibidores fecais. Os ácidos nucléicos podem ser extraídos


- 57 -

de amostras biológicas, tais como biópsias de tecidos, raspagens da córnea, aspirados

duodenais, urina, material embebido em parafina, assim como de culturas in vitro, ou de

amostras em lâmina coradas [Chan & Koh 2008], através de uma variedade de kits

comerciais. Podem ser também aplicadas técnicas de uso rotineiro em laboratórios,

como seja a digestão pela proteinase K, seguida de um protocolo de extracção com

fenol-clorofórmio e precipitação por etanol [Ghosh & Weiss 2009].

Por outro lado, é da máxima importância que a extracção de DNA seja precedida

da eficiente destruição da parede dos esporos, uma vez que esta é muito resistente e que

a sua lise incompleta compromete todo o processo de extracção e, consequentemente, o

rendimento da reacção de PCR. O isolamento e amplificação de DNA, a partir de

amostras de fezes, constitui em geral, um maior desafio, tendo por vezes de recorrer-se

à disrupção mecânica e/ou condições de extracção mais agressivas [Ghosh & Weiss

2009]. Alguns dos métodos descritos na literatura, incluem a submissão da amostra ao

hipoclorito de sódio 0,5%, à quitinase [Fedorko & Hijazi 1996], liticase [Raynaud et al.

1998], tiocianato de guanidina [Kock et al. 1997; Talal et al. 1998], ditiotreitol

[Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996], ou à fervura [Ombrouck et al. 1996]. Em geral,

como já foi referido, as amostras fecais têm um número elevado de inibidores das

enzimas polimerases, que são difíceis de remover pelos métodos acima referidos. De

modo a potenciar a eficácia de remoção de inibidores, pode recorrer-se à diluição das

amostras a estudar [Ombrouck et al. 1997], ou ao tratamento com tiocianato de

guanidina [Ghosh & Weiss 2009].

A aplicação da técnica da PCR, ao diagnóstico de um parasita, está condicionada

pela informação disponível sobre o seu genoma. Os microsporídios que infectam o

Homem, constituem um grupo de agentes patogénicos emergentes, e embora seja

reduzida a informação genética disponível até à data, novos dados não páram de surgir.

Os primeiros dados sobre os microsporídios obtidos através dos métodos

moleculares, vieram complementar o conhecimento das características eucariotas

únicas, destes parasitas, salientando a sua semelhança aos organismos procariotas.

Verificou-se, a presença de ribossomas do tipo 70S, rRNA 16S e 23S e, na ausência de

uma região espaçadora transcrita 2 (ITS2, da sigla anglo-saxónica para internal

transcribed spacer) observa-se a fusão da região 5.8S com a subunidade grande (23S)

do rRNA [Weiss & Vossbrinck 1999].


- 58 -

Também através das técnicas moleculares tem sido possível estudar e avaliar o

tamanho do genoma dos microsporídios, tendo-se verificado que comparativamente a

outros eucariotas, os microsporídios possuem genomas pequenos, numa gama de

tamanhos que podem oscilar entre os 2,3 Mb e os 19,5 Mb. Os genomas de E. cuniculi e

E. intestinalis apresentam apenas 2,9 Mb, e 2.3 Mb, respectivamente, constituindo,

assim, esta última espécie, entre os microsporídios o parasita com o genoma mais

pequeno [Biderre et al. 1995; Peyretaillade et al. 1998a].

Ainda são poucos os genes localizados nos cromossomas dos microsporidia e

este mapeamento foi feito, apenas, para um número limitado de espécies [Franzen &

Muller, 1999]. Actualmente, entre os microsporidios mais estudados, o número de

cromossomas varia entre os oito e os 18 [Weiss 2000; Metenier & Vivares 2001].

As reduzidas dimenções do genoma dos microsporídios, sugerem que estes

microrganismos desenvolveram estratégias de compactação da informação genética (por

exemplo, semelhante à organização do genoma de vírus), e/ou perderam informação

genética das vias metabólicas, dependendo exclusivamente de fontes celulares do

hospedeiro, para estes compostos. Até á data, a espécie E. cuniculi é a única cujo

genoma se encontra totalmente sequenciado [Biderre et al. 1995], e no qual se pode

comprovar esta redução genómica. Na verdade, sugere-se que, o ciclo de vida

obrigatório intracelular, deste parasita tenha induzido a perda de diversos genes, cujas

funções podem vir a ser desempenhadas pela célula hospedeira. Esta espécie de

microsporidia, possui um número reduzido de genes, cerca de 2000, desconhecendo-se,

todavia a função de mais de metade. [Vivares & Metenier 2000; Katinka et al. 2001].

Para além da redução quantitativa de genes, os que permaneceram, ficaram circunscritos

a um espaço limitado, quer pela redução do tamanho total dos genes (por exemplo

devido à escassez de intrões), quer pela redução significativa das regiões espaçadoras

intergénicas [Katinka et al. 2001; Slamovits et al. 2004].

O DNA que codifica o RNA dos ribossomas é constituído por genes que

codificam respectivamente a SSU e a LSU. O produto do gene 16S, que é RNA e não

uma proteína, combina-se com proteínas para formar a pequena subunidade dos

ribossomas (SSU) A grande subunidade dos ribossomas é formada por proteínas e pelo

produto do gene 5,8S, 23S e 5S [Weiss 2000].


- 59 -

O gene 16S rRNA é uma região muito conservada e muito estável em todos os

organismos sendo utilizada em estudos filogenéticos ao nível da megasistemática

[Weiss & Vossbrinck 1999].

Ao contrário do que se observa nos outros eucariotas, nos microsporídios, só

existe uma unica região intergénica (ITS) localizada entre o gene 16S e o 5.8S ligado ao

gene que codifica para a LSU. Esta região do DNA, por ser uma zona não codificante

acumula mutações mais rapidamente, sendo muito utilizada para identificar e

caracterizar espécies ao nível de um determinado género [Weiss & Vossbrinck 1999].

O RNA e as proteínas ribossomais desempenham um papel essencial na

manutenção da estrutura e integridade dos ribossomas sendo o RNA fundamental no

processo de síntese proteica em todas as células o que lhe confere uma extraordinária

importância e conservação em todos os organismos vivos [Weiss & Vossbrinck 1999].

As sequências do gene do rRNA, depositadas no GenBank são para a maioria

dos microsporídios a única informação genética disponível. O número de sequências,

nesta base de dados, aumentou de cerca de 200, em 1999, para aproximadamente 6000,

na actualidade [Weiss & Vossbrinck 1999]. Assim, a maioria dos métodos moleculares

de detecção e identificação de microsporídios, baseados na amplificação pela PCR e

descritos na literatura, foram desenvolvidos com base na região do genoma que codifica

para os ribossomas (rDNA), mais concretamente na região SSU, ITS e LSU rRNA. A

disponibilidade de acesso público destas sequências, caracterizadas pela presença de

regiões conservadas e outras variáveis, veio assim constituir-se como uma ferramenta

importante, por vezes a única, para a caracterização genética destes parasitas. A

clonagem da SSU do rDNA de Vairimorpha nacatrix, um microsporídio associado a

doenças com impacte económico na agricultura [Vossbrinck et al. 1987], constitui o

primeiro registo da utilização desta região genómica, com sucesso, pelo desenho de

oligonucleótidos iniciadores (primers), específicos, no interior desta mesma sequência

de nucleótidos.

Primers tendo como sequências alvo as regiões conservadas do gene do rRNA,

resultaram na amplificação do DNA e obtenção de informação genética de diversos

microsporídios patogénicos para o homem: E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis, E.

bieneusi e V. corneae [Franzen & Muller 1999b; Menotti et al. 2003b]. No genoma de

E. cuniculi, estes genes de rRNA estão presentes em mais de 20 cópias [Katinka et al.


- 60 -

2001], fornecendo um acréscimo na sensibilidade (relativamente a genes de cópia

única), quando se pretende a amplificação de DNA do parasita em amostras biológicas

ou ambientais. A região ITS do rRNA, apresenta uma elevada variabilidade, sendo

adequada para a caracterização genotípica de algumas espécies de microsporídios, com

destaque, para E. bieneusi.

Assim, para o diagnóstico e identificação de espécies de microsporídios

infectantes para os humanos [Fedorko & Hijazi 1996; da Silva et al. 1996; Didier et al.

1996a; Gatti et al. 1997], bem como para os animais [Malone & McIvor 1995; Malone

& McIvor 1996], têm sido desenvolvidas diversas técnicas de PCR para amplificação de

diferentes regiões do gene que codifica a SSU rRNA e a LSU rRNA, bem como da região

do espaço intergénico (ITS), cujos estudos foram revistos por Weiss e Vossbrink [Weiss

& Vossbrinck 1999], e por Franzen e Müller [Franzen & Muller 1999b].

No Quadro IV, encontram-se compiladas as diversas sequências de primers

utilizados na amplificação dos microsporídios (adaptado de [Weiss & Vossbrinck

1999]). Enquanto que alguns primers foram desenhados para amplificar uma gama

alargada de microsporídios, incluindo as principais espécies infectantes para o homem

e, designados habitualmente na literatura por pan-específicos, outros permitem a

identificação da espécie envolvida.

Para além da detecção e identificação directa de diversos microsporídios, a

técnica de PCR, associada a outros métodos de biologia molecular, como o

polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP, sigla anglo-saxónica

para restriction fragment length polymorphism), ou a determinação da sequência

nucleotídica de fragmentos de DNA amplificado, possibilita, também, a identificação da

espécie e/ou genótipo dos parasitas [Weiss & Vossbrinck 1999].


- 61 -

Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia. Adaptado de [Ghosh & Weiss 2009].

ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.

Primers usados em PCR

Anncaliia algerae ACTCCGGTAACGTGTGATGTG NALGf2 55 180 [Visvesvara et al. 1999a] TACAAAGCATGATCCCAGTCT NALGR1 Anncaliia algerae GCCGTTTCCGAAGTTGG NAGf 50 192 [Cali et al. 1998] ATATCGACGGGACTCTCACC NAG178r Encephalitozoonidae e Ent. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC PMP1 (V1)

60

Eb 250 [Fedorko & Hijazi 1996]

CCTCTCCGGAACCAAACCTG PMP2 Ec 268

Ei 270

Eh 279

Encephalitozoonidae e E. bieneusi TGAATG(G/T)GTCCCTGT MSP1

58

Eb 508 [Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996]

TCACTCGCCGCTACT MSP2A Ec 289

GTTCATCGCACTACT MSP2B Ei 305 Ei 305 GGAATTCACACCGCCCGTC(A/G)(C/T)TAT MSP3 CCAAGCTTATGCTTAAGT(C/T)(A/C)AA(A/G)GGGT MSP4A CCAAGCTTATGCTTAAGTCCAGGGAG MSP4B

Encephalitozoonidae e E. bieneusi CCAGGUTGATUCTGCCUGACG Mic3U

65/62

Eb 132 [Kock et al. 1997]

TUACCGCGGCUGCUGGCAC Mic421U Ec 113 AAGGAGCCTGAGAGATGGCT Mic266 Eh 134 CAATTGCTTCACCCTAAGGTC Eb379 Ei 128 GACCCCTTTGCACTCGCACAC Ec378 TGCCCTCCAGTAAATCACAAC Eh410 CCTCCAATCAATCTCGACTC Ei395 Encephalitozoonidae e E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCC C1 (V1)

56

Eb 1170 [Raynaud et al. 1998] GTGACGGGCGGTGTCTAC C2 Ec 1190 Eh 1205 Ei 1186

Encephalitozoonidae TGCAGTTAAAATGTCCGTAGT int530f 40 1000

[Didier et al. 1996a]

TTTCACTCGCCGCTACTCAG int580r


- 62 -

Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado

de [Ghosh & Weiss 2009].


E. intestinalis CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1 58

375 [Weiss et al. 1994]

CTCGCTCCTTTACACTCGAA Si500

E. intestinalis GGGGGTAGGAGTGTTTTTG 3 65

930

[Schuitema et al. 1993]

CAGCAGGCTCCCTCGCCATC 3 E. intestinalis TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA SINTF1

55 520 [De Groote et al. 1995; da Silva et al. 1997]

CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG SINTR E. cuniculi ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG ECUNF

55 549 [Visvesvara et al. 1994; De Groote et al. 1995]

TGCCATGCACTCACAGGCATC ECUNR E. hellem TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA EHELF

55 547 [Visvesvara et al. 1994]

GTAAAAAGACTCTCACACTCA EHELR E. bieneusi GAAACTTGTCCACTCCTTACG EBIEF1

55 607 [da Silva et al. 1997]

CCATGCACCACTCCTGCCATT EBIER1 E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1

48 353 [Zhu et al. 1993; Coyle et al. 1996]

ACTCAGGTGTTATACTCACGTC EB450 E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1

54 446 [Mansfield et al. 1997; Carville et al. 1997]

CAGCATCCACCATAGACAC Mic3 E. bieneusi TCAGTTTTGGGTGTGGTATCGG Eb.gc

49 210 [Velasquez et al. 1996]

GCTACCCATACACACATCATTC Eb.gt E. bieneusi GCCTGACGTAGATGCTAGTC 2

55 1265 [David et al. 1996]

ATGGTTCTCCAACTGAAACC 2

Vittaforma corneae TGAGACGTGAAGATGAGTATC NCORF1 55

375 Pieniazek, Visvesvara, PC

TCCCTGCCCACTGTCTCCAAT NCORR1 Primers e sondas usadas em hibridação

Encephalitozoon spp. CAGGTTGATTCTGCCTGACG FP 63

[Notermans et al. 2005] ATCTCTCAGGCTCCCTCTCC RP E. hellem ACT CTCACA CTC ACT TCA G HEL878F 54 [Hester et al. 2000]


- 63 -




E. bieneusi CGGTGGTGTGTGTAGGCGTGAGAGTGTATC sonda 55 [Velasquez et al. 1999]

Primers e sondas usadas em RT-PCR ou PCR fluorogénico

EncephP1 CCC TGT CCT TTG TAC ACA CCG CCC EncephP1 68 [Hester et al. 2002] EcunF1 TCC TAG TAA TAG CGG CTG ACG AA EcunF1 59 EcunR2 ACT CAG GAC TCA GAC CTT CCG A EcunR2 59 EhelF1 GAA TGA TTG AAC AAG TTA TTT TGA ATG TG EhelF1 59 EhelR2 AAC ACG AAA GAC TCA GAC CTC TCA EhelR2 58 EintF1 AAT TCC TAG TAA TAA CGA TTG AAC AAG TTG EintF1 59 EintR2 ACG AAG GAC TCA GAC CTT CCA A EintR2 59

E. bieneusi CGCTGTAGTTCCTGCAGTAAACTATGCC FEB1 65 102 [Menotti et al. 2003a; Menotti et al. 2003b][33,34] CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG REB1 ACGTGGGCGGGAGAAATCTTTAGTGTTCGGG sonda E. intestinalis GCAAGGGAGGAATGGAACAGAACAG FEI1

65 127 [Menotti et al. 2003a]

TTCAGAAGCCCATTACACAGC REI1 CGGGCGGCACGCGCACTACGATA sonda E. bieneusi TGTGTAGGCGTGAGAGTGTATCTG EbITS-89F

60 103 [Verweij et al. 2007]

CATCCAACCATCACGTACCAATC EbITS-191R CACTGCACCCACATCCCTCACCCTT EbITS-114revT Encephalitozoon spp. CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC MSP1F

60

CTAGTTAGGCCATTACCCTAACTACCA Eint227R CTATCACTGAGCCGTCC Eint82Trev Encephalitozoon GTCCGT TAT GCC CTG AGA T

60

268 ACA GCAGCC ATGTTA CGACT GCC CGT CGC TATCTA AGA TGA CGC A sonda 1 TGG ACG AAG ATT GGA AGGTCT GAG TC sonda 2


- 64 -




Primers e sondas usadas em microarrays

Microsporidia GATTCTGCCTGACGTGGATGCTATT Msp1 58 [Wang et al. 2005]

ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGAT Msp2 61 ATTGACGGAAGGACACTACCAGGA Msp3 57 GTGCGGCTTAATTTGACTCAACGCG Msp4 58 E. bieneusi ACGGCTCAGTAATGTTGCGGTAATT Eb1 56 CCTATCAGCTTGTTGGTAGTGTAAA Eb2 54 TCATGAGACGTGAGTATAAGACCTG Eb3 56 ATCGAATACGTGAGAATGGCAGGAGT Eb4 58 CTAAAAGCGGAGAATAAGGCGCAAC Eb5 58 CGTTGTTCAATAGCGATGAGTTTGC Eb6 56 GGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGG Eb7 56 AGCCTGTGTGTGAGAATACGTGG Eb8 56 Encephalitozoon ACGGCTCAGTGATAGTACGATGATT Ence1 56 TATCAGCTGGTAGTTAGGGTAATGG Ence2 56 GAGTGAAACTTGAAGAGATTGACGG Ence3 56 E. cuniculi TGTGGGGTTGGCAAGTAAGTTGTGG Ec1 59 ATGAGAAGTGATGTGTGTGCGAGTG Ec2 58 GCCTGTGAGTGCATGGCATGAG Ec3 59 GGGAAACTGCAGATAGTGGTCTGC Ec4 59 GGATGTAGTGATGTGTGTGGCAGAG Ec5 59 CTGGACGGGACAGTGTGTGTTGT Ec6 59 E. hellem TAAGTTCTGGGGGTGGTAGTTTGTA Eh1 56 GCGGTTATGAGAAGTAAGATGTTTAGCA Eh2 57 CTGAAGTGAGTGTGAGAGTGTTTTTAC Eh3 57 ATTGGGAGCCTGGATGTAACTGTGG Eh4 59 GGATGTAGTTTTATTGTAGCAGAGG Eh5 54 TGGACGGGACTGTTTTAGTGTTGTC Eh6 58 E. intestinalis TTGACACGAGCCAAGTAAGTTGTAG Ei1 56 TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGAGATTGA Ei2 57 GGCAGGAGAACGAGGACGGGAT Ei3 60 CAGGTAGGGGGCTAGGAGTGTTTTT Ei4 59 TGGACGGGACTATATAGTGTTGTG Ei5 56 TATGTCCTGATGTGGATGTAAGAGG Ei6 56 microsporidia-em geral TTTMMAACGGCCATGCACCAC MspR3 52 var


- 65 -

Acresce, que a PCR é também um instrumento útil na determinação de

microsporidios de humanos e animais, que são desconhecidos à partida. Aplicando

primers, que amplificam regiões conservadas da SSU e LSU rRNA, é possível clonar e

sequenciar determinadas porções deste gene em microsporídios a caracterizar. Os

primers designados na literatura por V1 (18f::1492r e o 530f::580r) são considerados

universais, sendo habitualmente aplicados com sucesso na caracterização específica de

microsporídios [Weiss & Vossbrinck 1999; Vossbrinck & brunner-Vossbrinck 2005;

Ghosh & Weiss 2009].

Diversas publicações, referem-se à aplicação da técnica de PCR em tempo-real

(RT-PCR, sigla anglo-saxónica para real-time polymerase chain reaction), ao

diagnóstico dos microsporíos [Hester et al. 2002; Wolk et al. 2002; Menotti et al.

2003a; Menotti et al. 2003b; Verweij et al. 2007]. Esta técnica permite a detecção de

amplicões em tempo real, com recurso a fluorocromos ou sondas marcadas com

emissão de fluorescência, e tem como vantagens, permitir a quantificação da amostra,

encontrar-se padronizada para testar uma grande quantidade de amostras em simultâneo,

e dispensar o processo da sua visulização em gel. Estas características, potenciam a

eficiência do diagnóstico em laboratório e reduzem o risco de contaminações, inerente à

PCR [Monis & Giglio 2006]. Num estudo, registou-se, um limiar de detecção para esta

técnica, entre os 102 e os 103 esporos/ml [Wolk et al. 2002].

Também referida na literatura, embora em número reduzido, a hibridação in situ

(FISH, sigla do anglo-saxónico para fluorescent in situ hybridization), é uma técnica

que possibilita a detecção de microsporídios [Carville et al. 1997; Velasquez et al.

1999; Hester et al. 2000; Graczyk et al. 2007a]. A FISH utiliza uma sonda marcada com

fluorescência que ira ligar-se ao ácido nucleico (DNA ou RNA) do parasita [Procop

2007]. Ao contrário da PCR, esta técnica permite informação morfológica e espacial do

organismo em estudo. Apesar desta técnica parecer uma ferramenta atraente, visto que

proporciona uma vasta informação, duas limitações podem condicionar a sua aplicação

ao diagnóstico clínico: é extremamente laboriosa e menos sensível do que a PCR.

Recentemente, foi descrito um sistema de microarrays, para a detecção

simultânea das quatro principais espécies infectantes para o Homem, em amostras

clínicas, que pelo menos terá como vantagem num único teste identificar mais do que

uma espécie, cuja elevada capacidade de processamento das amostras conduz ao ao


- 66 -

aumento da eficiência de diagnóstico, nos laboratórios de investigação [Wang et al.

2005].

Diversos autores, defendem que, os métodos moleculares, devem ser utilizados,

em simultâneo com os outros métodos colorimétricos, procedendo-se, após a

identificação dos microsporídios, pela microscopia óptica, à confirmação e à

identificação das espécies, pelas técnicas moleculares, visando contribuir para o rápido

aumento dos conhecimentos acerca destes organismos.

As técnicas de biologia molecular, em especial a reacção de PCR, possuem um

elevado potencial como técnicas de diagnóstico da microsporidiose. Todavia, apesar de

considerados métodos fiáveis, fáceis de implementar e com elevada sensibilidade, não

são ainda técnicas de rotina laboratorial, sendo necessário uma avaliação rigorosa de

parâmetros, tais como a especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, quer entre

diferentes laboratórios, quer nas diferentes situações de aplicação, de modo a ser

possivel adoptar métodos de referência bem definidos e adequados à sua utilização de

rotina no diagnóstico da microsporidiose.

6.TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA

- 67 -

6. TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA

Actualmente, não existe tratamento eficaz contra as infecções por

microsporídios. A dificuldade de penetração dos fármacos, na espessa parede do esporo

do parasita, constitui um dos principais obstáculos, dado que, mesmo que outros

estádios vegetativos sejam destruidos e a morfogénese dos esporos seja perturbada,

existe sempre, a possibilidade do restabelecimento da infecção através dos esporos

maduros, quando a terapêutica é interrompida [Canning & Hollister 1992a; Kotler &

Orenstein 1999].

Os poucos estudos publicados sobre a terapêutica das microsporidioses, inserem-

se sempre no contexto de abordagem terapêutica às infecções oportunistas em doentes

infectados por VIH. A terapêutica anti-retrovírica utilizada presentemente, no

tratamento de doentes com sida, resultou num aumento dos níveis dos linfócitos T

CD4+ que, com a concomitante redução da carga viral de VIH, conduziu a um

decréscimo na prevalência da maioria das infecções oportunistas, incluindo da

microsporidiose [Goguel et al. 1997; Conteas et al. 1998b; Maggi et al. 2000; Didier et

al. 2005; Wiwanitkit 2006; Morpeth & Thielman 2006]. Num estudo recente sugere-se

que os inibidores da aspartil protease do VIH, inibem directamente o crescimento de E.

intestinalis em culturas de tecidos [Menotti et al. 2005]. No entanto, a eficácia da

terapêutica anti-retrovírica é variável, devido a alguma toxicidade e a resistência viral,

que se podem registar. É, então, possível que, no futuro, se venha a verificar um novo

acréscimo na prevalência das infecções oportunistas, em particular em regiões em vias

de desenvolvimento [Stark et al. 2009].

No Quadro V, apresentam-se os princípios activos e respectivas doses,

encontrados na literatura.


- 68 -

Quadro V- Terapêutica das microsporidioses. Adaptado de [Kotler & Orenstein 1999].

Microsporídios Princípio activo Dose


Não existe terapêutica eficaz; melhoria clínica em alguns doentes com albendazol

Infecções sistémicas por Encephalitozoon spp.

Albendazol 400 mg BID

Infecções oculares por Encephalitozoon spp.

Fumagilina (Fumidil b, 3 mg/ml; terapêutica com albendazol, também deve ser considerada

2 gotas em cada 2 horas, nos primeiros 4 dias, a partir do 5º dia, 2 gotas 4 vezes ao dia.

Trachipleistophora hominis

Albendazol 400 mg BID

Anncaliia vesicularum Albendazol e itraconazol 400 mg BID e QD, respectivamente

BID= duas vezes por dia; QD= uma vez por dia.

6.1. TRATAMENTO DA INFECÇÃO INTESTINAL

Na identificação de fármacos potenciais para o tratamento da microsporidiose,

têm sido utilizadas culturas celulares e modelos animais [Snowden et al., 1999]. Em

hospedeiros invertebrados, existem fármacos eficientes no combate à microsporidiose,

nomeadamente a fumagilina (um antibiótico produzido pelo fungo Aspergillus

fumegatus) [Katznelson & Jamiesin 1952; Franzen 2008] ou o itraconazol no controlo

de Nosema apis em abelhas e noutros microsporidia em gorgulhos [Canning & Hollister

1991].

Ensaios clínicos, confirmaram a erradicação selectiva das espécies do género

Encephalitozoon, pelo albendazol [Molina et al. 1995]. Ensaios, in vitro, demonstraram

alterações no desenvolvimento de E. cuniculi [Beauvais et al. 1994]. O albendazol

produz um desarranjo microtubular, inibindo a formação dos fusos mitóticos e

bloqueando a divisão nuclear do parasita [Kotler & Orenstein 1999].

Na actualidade, o albendazol (benzimidazol) é o fármaco mais eficiente no

tratamento das infecções causadas pela maioria das espécies de microsporidia no

homem, embora a sua eficácia seja reduzida ou mesmo nula em E. bieneusi [Molina et

al. 1997; Conteas et al. 1998b].

O albendazol tem sido aplicado, com sucesso, na microsporidiose por

Encephalitozoon spp., em seropositivos para VIH, com melhoria da sintomatologia e,


- 69 -

ainda, erradicação dos parasitas nas fezes [Weber & Bryan 1994; Sobottka et al. 1995;

Didier et al. 1996a; Gatti et al. 1997; Fournier et al. 2000b]. No entanto, dado que se

observam recaídas nalguns doentes, a manutenção da terapia, pode ser necessária nestes

doentes. Por vezes, após tratamento e melhoria da sintomatologia, podem ser

detectados, ainda, esporos na urina. A persistência do parasita, em determinados focos

infecciosos, pode justificar as recaídas, nestes doentes imunocomprometidos, apesar da

manutenção do fármaco administrado [Molina et al. 1995].

A terapêutica com talidomida, um inibidor relativamente específico da citoquina

TNF-, em doentes com sida, infectados por E. bieneusi, levou à diminuição dos

sintomas, embora não se tenham verificado alterações significativas nos níveis elevados

de TNF- nas fezes [Sharpstone et al. 1995; Sharpstone et al. 1997].

O TNP-470, um composto sintético, análogo da fumagilina, usado em ensaios

clínicos do cancro da mama, é muito menos tóxico que esta última e, de igual modo,

eficaz contra várias espécies de microsporidia (E. intestinalis, E. hellem, E. cuniculi e V.

corneae), em estudos quer in vitro quer in vivo. No futuro, este composto poderá

constituir-se como promissor agente antimicrosporidiano [Coyle et al. 1998; Curry &

Smith 1998; Didier et al. 2006].

As infecções devidas a Enterocytozoon são muito difíceis de tratar, não existindo

actualmente um tratamento consensual. O facto de não se conseguir cultivar E. bieneusi

em culturas de células, dificulta ainda mais os ensaios farmacológicos in vitro nesta

espécie. Alguns estudos iniciais, referiam o albendazol como tendo sido eficaz em

seropositivos para VIH infectados por E. bieneusi, observando-se uma diminuição dos

movimentos peristálticos e aumento de peso destes doentes. Ainda, verificou-se, um

decréscimo da carga parasitária ao nível do intestino, e danos consideráveis nos diversos

estádios de desenvolvimento do parasita que conduziam a inibição parcial da sua

reprodução [Kotler & Orenstein 1999]. Todavia, em nenhum dos estudos ocorreu

erradicação do parasita no intestino.

Outros fármacos têm sido utilizados no tratamento da microsporidiose, com

resultados variáveis [Brasil et al. 1996; Bacchi et al. 2004; Didier et al. 2005; Zhang et

al. 2005; Didier & Weiss 2006], necessitando de ser confirmados os seus efeitos em

ensaios controlados, entre os quais se encontram o metronidazol, a furazolidona, a

sinefungina, atovaquona, azitromicina e as sulfamidas.


- 70 -

Por outro lado, refira-se, que uma dieta rica em triglicéridos de cadeia média, em

detrimento de uma que contenha triglicéridos de cadeia longa, parece contribuir para

uma melhoria da clínica dos doentes infectados por VIH, com diarreia e malabsorção

associada à microsporidiose [Didier 1998].

Visto que ainda não se encontra disponível, um tratamento eficaz para as infecções

por E. bieneusi, enquanto que as provocadas por Encephalitozoon spp., respondem, na

maioria dos casos, ao albendazol, torna-se necessária uma diferenciação exacta dos

géneros de microsporidia envolvidos na infecção dos doentes com microsporidiose.

6.2. TRATAMENTO DA INFECÇÃO OCULAR

Os primeiros casos de queratoconjuntivite por microsporídios em doentes com

sida, não encontraram qualquer resposta terapêutica. A tentativa para tratar a queratite

com uma lubrificação intensa, ou antibioterapia tópica revelou-se ineficaz (Friedberg,

1990)

A aplicação tópica da fumagilina permitiu a redução dos sinais clínicos, em

doentes com sida com queratoconjuntivite microsporidial, devida a espécies do género

Encephalitozoon [Diesenhouse et al. 1993; Rosberger et al. 1993; Didier et al. 1996a;

Friedberg & Ritterband 1999]. Este fármaco, quando administrado por via sistémica (20

mg, três tomas diárias) é bastante eficaz contra E. bieneusi. No entanto, para além de

apresentar toxicidade, causa neutropenia e trombocitopenia nos doentes, após duas a

três semanas de tratamento [Molina et al. 1997]. O isetionato de propamidina e o

itraconazol foram também descritos como eficazes no alívio sintomático da

queratoconjuntivite por microsporídios do género Encephalitozoon [Yee et al. 1991;

Metcalfe et al. 1992], embora após cessação da terapia ocorresse recorrência da

infecção.

7.CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE

- 71 -

7. CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE

Medidas que permitam prevenir a microsporidiose humana, são difíceis de

estabelecer, visto que, não estão definidas as potenciais fontes de infecção. Também,

não existem vacinas disponíveis, nem se conhecem quaisquer ensaios clínicos a

decorrer, neste âmbito.

Perante tais dificuldades, a adopção de medidas gerais de prevenção constitui o

primeiro passo no sentido de evitar o contacto do Homem com estes parasitas. Como as

consequências da infecção podem ser particularmente graves em imunodeficientes, esta

população deverá ter cuidados especiais para prevenir uma eventual infecção.

Entre algumas das medidas recomendadas [Bryan & Schwartz 1999], com o

objectivo de prevenir a microsporidiose no homem, destacam-se as seguintes:

i) Adoptar boas práticas de higiene – lavar as mãos depois de ir à casa de banho,

depois de mudar fraldas a crianças, antes de preparar alimentos e antes de comer. As

pessoas com diarreia devem, ainda, proteger os outros de uma possível infecção,

inibindo-se de utilizar piscinas e locais públicos com água de recreio.

ii) Evitar o contacto com água que possa estar contaminada – não engolir água

de recreio, não beber água de poços, de rios, de lagos e de fontes não tratadas e não

beber água ou gelo em países onde a qualidade da água de abastecimento seja duvidosa.

Em caso de dúvida quanto à sua qualidade, a água deverá ser fervida antes de

consumida.

iii) Evitar ingerir alimentos contaminados – lavar bem ou tirar a casca à fruta e

aos legumes e evitar comer alimentos crus, em países onde o tratamento da água é

deficiente.

iv) Evitar o contacto com potenciais animais infectados.

v) Evitar práticas sexuais que envolvam o contacto fecal-oral.

Nas instituições de saúde, infantários e centros de dia, para além da adopção de

rigorosos hábitos de higiene, o modo mais eficaz de prevenir a transmissão da infecção

consiste na criação de áreas restritas para os doentes infectados, evitando o seu contacto

com outras pessoas susceptíveis. A diminuição da contaminação ambiental constitui,

7.CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE

- 72 -

igualmente, uma importante medida de prevenção, podendo ser conseguida através da

redução da transmissão da infecção entre animais.

Nas explorações pecuárias é essencial um bom maneio higio-sanitário das

instalações, reduzir a densidade de animais num mesmo espaço, isolar os animais

doentes, impedir o acesso dos animais a zonas próximas de cursos de água e tratar o

estrume dos animais.

Vários estudos têm sido efectuados no sentido de encontrar estratégias de

redução da viabilidade e potencial infecciosidade nos microsporídios presentes no

ambiente. Entre os compostos que suscitaram resultados mais promissores, encontram-

se desinfectantes, tais como, amónio, etanol 70%, formaldeído (0,3% ou 1%), derivados

fenólicos, peróxido de hidrgénio (1%), cloramina, hidróxido de sódio, surfactantes

anfotéricos, cuja aplicação durante 30 minutos a 22 ºC, destruíram esporos de E.

cuniculi [Shadduck & Polley 1978; Waller 1979; Santillana-Hayat et al. 2002].

Determinados processos de coagulação, sedimentação, e filtração [Gerba et al. 2003]

parecem reduzir a sobrevivência e infecciosidade dos microsporídios. Também o

tratamento com ozono, exposição a radiação ultra-violeta ou radiação-γ e clorinação a

pH 7, revelaram-se processos eficazes na redução da viabilidade e infecciosidade de

espécies pertencentes ao género Encephalitozoon [Khalifa et al. 2001; Li et al. 2002;

John et al. 2003; Johnson et al. 2003; Marshall et al. 2003].

8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE

- 73 -

8. EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE

8.1. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E PREVALÊNCIA NO HOMEM

Apesar da infecção por microsporídios, já ter sido reportada em todos os

continentes, não existem estimativas fiáveis de prevalência, no sentido estrito do termo,

em parte pela escassez de dados assentes numa amostragem exacta e precisa,

obedecendo a rigorosos critérios de selecção aleatória das amostras. Outro dos factores

condicionantes da determinação da prevalência da microsporidiose humana, baseia-se

no facto da pesquisa de microsporidios no diagnóstico de rotina, ainda não se encontrar

implementado. Na generalidade, a maior parte dos registos de prevalência dos

microsporídios, referem-se a grupos específicos da população, tais como os doentes

com sida que apresentam diarreia crónica. Muitas vezes, são o resultado de estudos não

controlados, sem um desenho aleatório, onde se incluem determinados coortes

prospectivos, amostragens retrospectivas ou revisão de casos, e estudos limitados

utilizando uma amostragem de conveniência.

Outro dos problemas, na caracterização epidemiológica da microsporidiose,

reside na falta de coerência, em termos de abordagem de diagnóstico. Um estudo

realizado no Zimbabwe, ilustra esta situação, quando apresenta taxas de prevalência de

infecção por E. bieneusi de 18%, utilizando o método do tricrómio modificado, e de

51%, utilizando a técnica de PCR [Gumbo et al. 1999b]. Estes factores, conjuntamente

com as diversas espécies de microsporidia, e as múltiplas manifestações clínicas das

infecções em humanos, tornam difícil a compreensão das verdadeiras dimensões das

microsporidioses.

Apesar das limitações, os diversos estudos, reportados em todos os continentes,

revelam resultados consistentes em alguns grupos populacionais. A maior parte do que

se conhece, sobre a infecção em humanos incide na experiência obtida, em doentes

infectados por VIH. Em geral, a microsporidiose em humanos, é descrita mundialmente,

com prevalências que variam desde os zero aos 50%, dependendo quer da região

geográfica, da metodologia do diagnóstico, ou das características demográficas da

população [Bryan & Schwartz 1999]. Antes da utilização da terapia anti-retrovírica, as

taxas de prevalência, mais elevadas registavam-se entre os infectados por VIH com


- 74 -

diarreia e contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 100 células/mm3 de sangue

[Lewthwaite et al. 2005; Morpeth & Thielman 2006].

Apesar dos casos de infecção humana serem maioritariamente descritos em

países desenvolvidos, como a América do Norte, Europa Ocidental e Austrália, o

reconhecimento da microsporidiose aumenta em todo o mundo. Com excepção da

Antárctica, foram identificados casos de infecção humana em todos os continentes.

Encontram-se documentados estudos em diversas regiões africanas [Aoun et al. 1997a];

[Bretagne et al. 1993; Kelly et al. 1994; Drobniewski et al. 1995; van et al. 1995;

Hautvast et al. 1997; Maiga et al. 1997; Aoun et al. 1997b], Sudeste asiático [Morakote

et al. 1995] e América do Sul [Brasil et al. 1996; Brasil et al. 1998; Brasil et al. 2000].

Em determinadas regiões do globo, tais como a América do Sul, a África e a

Ásia, nas quais a implementação da HAART, é ainda limitada, a microsporidiose

continua a ser diagnosticada em doentes com sida, e associada a factores de risco,

incluindo baixas condições higio-sanitárias e/ou exposição a animais [Mak 2004;

Wiwanitkit 2006; Morpeth & Thielman 2006; Sarfati et al. 2006; Chacin-Bonilla et al.

2006; Didier & Weiss 2006].

Os registos de casos de microsporidiose continuam a aumentar em seronegativos

para VIH, tais como viajantes, crianças, idosos e transplantados de órgãos [Barsoum

2004; Tumwine et al. 2005; Wichro et al. 2005; Mungthin et al. 2005; Leelayoova et al.

2005; Barsoum 2006].

8.1.1 Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Enterocytozoon

bieneusi.

Diversos casos de doentes infectados por VIH, com diarreia associada a E.

bieneusi têm sido descritos, em todos os continentes. A prevalência da infecção desta

espécie, chega a atingir os 50%, entre este grupo da população, como se pode observar

nos Quadros VI e VII. Na maior parte dos estudos, verificam-se prevalências superiores

nos doentes que manifestam diarreia crónica [Eeftinck Schattenkerk et al. 1991; Field et

al. 1993; Wuhib et al. 1994; Sobottka et al. 1998; Weber et al. 2000].


- 75 -

Quadro VI. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos para VIH,

em África, América, Austrália e Ásia. Adaptado de [Mathis et al. 2005].

ÁREA GEOGRÁFICA ESPÉCIMES; MÉTODO

DE DIAGNÓSTICO

NO. PACIENTES; DADOS DA

POPULAÇÃO PREVALÊNCIA (%) REFERÊNCIA (S)

África

Camarões (Yaundé) Fezes; M.O. 66; diarreia crónica 9 [Same-Ekobo et al. 1997]

Níger (Niame) Fezes; M.O. 60; 41 com diarreia 7 [Bretagne et al. 1993] Zimbabwe (Harare) Fezes; M.O. 129; hospitalizados com diarreia 13 [van et al. 1995] Zimbabwe Fezes em formol; PCR 74; 45 com diarreia 46 [Carville et al. 1997]

Zâmbia (Lusaka) Fezes; MO. 69; diarreia crónica 23 [Drobniewski et al. 1995]

Mali (Bamako) Fezes; M.O., parcialmente confirmados por MET

88; 80% com diarreia crónica 32 [Maiga et al. 1997]

Tanzânia Fezes; M.O., MET 86; diarreia crónica 3 [Cegielsky et al. 1999] Zimbabwe (Harare) Fezes; M.O., PCR 88; Diarreia > 1 semana 18 (MO), 51 (PCR) [Gumbo et al. 1999]

Mali (Bamako) Fezes; M.O.,.IFA,.PCR 61; diarreia 13,1 [Alfa et al. 2002]

América

EUA (Washington, D.C.) Biópsias do intestino;EM, MET 67; diarreia crónica 30 [Orenstein et al. 1990]

EUA (Texas) Biópias do duodeno; MET

55 ; diarreia crónica 51; sem diarreia crónica

33 25 [Rabeneck et al. 1993]

EUA (Atlanta, Ga.) Fezes; M.O. 65 ; diarreia 65 ; sem diarreia

11 2 [Grohmann et al. 1993]

EUA (Nova Iorque) Biópsias do intestino; PCR, confirmação por MET

34; doentes com sida 194; diarreia

44 39

[Kotler & Orenstein 1994; Kotler et al. 1994]

EUA (Nova Iorque) Biópsias do duodeno; MET

68; diarreia 43; sem diarreia

37 2,3 [Coyle et al. 1996]

EUA (California) Fezes; M.O. 8 439; diarreia (1993-1996) 8,8; 9,7; 6.6; 2,9 [Conteas et al. 1998a]

Brasil (Fortaleza) Fezes; M.O. 79; diarreia 82; sem diarreia

6 1 [Raynaud et al. 1998]

Brasil (Rio de Janeiro) Fezes; M.O. 13; diarreia crónica 46 [Brasil et al. 1996]

Brasil (Rio de Janeiro) Fezes, biópsia do duodeno e íleo 40; diarreia crónica [Brasil et al. 2000]

Peru (Lima) Fezes; M.O. 2672; diarreia 27,5 [Sulaiman et al. 2003a] Austrália/Ásia

Austrália (Nova Gales do Sul)

Biopsias do duodeno; MO confirmada por EM

109; diarreia crónica 71; sem diarreia

29 1,4 [Field et al. 1993]

Austrália (Victoria) Fezes; M.O, MET 139; diarreia 3,5 [Ryan et al. 1993]

Tailândia Fezes; M.O.,MET 66; diarreia crónica 33,3 [Wanachiwanawin et

al. 1998] Tailândia (Bancoque) Fezes; M.O.,MET 288; diarreia 11 [Waywa et al. 2001]

Tailândia Fezes; M.O.,MET 95; crianças com diarreia 25,3 [Wanachiwanawin et

al. 2002] Índia Fezes; M.O. 120; diarreia 2,5 [Mohandas et al. 2002]

MO: microscopia óptica; MET: microscopia electrónica de transmissão; IFA: imunofluorescência indirecta.


- 76 -

Quadro VII. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos para

VIH, na Europa. Adaptado de [Mathis et al. 2005]

ÁREA GEOGRÁFICA ESPÉCIMES; MÉTODO

DE DIAGNÓSTICO

NO. PACIENTES; DADOS DA

POPULAÇÃO PREVALÊNCIA (%) ANO; REFERÊNCIA (S)

Europa

Holanda Biópsias do duodeno; MO, parcialmente confirmada por MET

55; diarreia 38; sem diarreia

27 3

[Eeftinck Schattenkerk

et al. 1991]

Holanda Fezes; M.O. 143; diarreia 7,7 [van et al. 1993]

França Biópsias do duodeno; MO 66; diarreia crónica 2 [Cotte et al. 1993]

França (Paris) Fezes, biopsias do intestino; M.O. 18; diarreia crónica 50 [Molina et al. 1993]

França (Nice) Fezes; M.O. 46; diarreia crónica 24 [Bernard et al. 1995]

Itália (Apulia) Fezes; M.O. 56; diarreia 2 [Marangi et al. 1995]

Itália Biópsias do intestino;EM, MET 72; diarreia crónica 4,2 [Voglino et al. 1996]

Alemanha (Colónia) Biópsias do intestino; PCR, hibridação… 46; diarreia 22 [Franzen et al. 1996b]

Alemanha (Hamburgo) Fezes; M.O. 50; doentes hospitalizados com diarreia 47; sem diarreia

32 4

[Sobottka et al. 1998]

Inglaterra (Londres) Biópsias do intestino; M.O. 59; diarreia 14 [Peacock et al. 1991]

Inglaterra (Noroeste) Fezes, biópsias do intestino; M.O, confirmada por MET

63; diarreia 14 [Kyaw et al. 1997]

Espanha (Madrid) Fezes; M.O, confirmada por PCR 48; crianças com diarreia crónica 2 [del et al. 1997b]

Suécia (Estocolmo) Biópsias do duodeno; M.O. 72; queixas gastrintestinais 3 [Svedhem et al. 1998]

Suíça

Fezes; M.O, parcialmente confirmada por MET e PCR

164; diarreia crónica (1992-94) 156; diarreia crónica (1994-96) 949; sem diarreia

10,7 5,3 0,4

[Weber et al. 1999a]

Portugal Fezes; M.O, PCR 215; diarreia 42,8 [Ferreira et al. 2001]

MO: microscopia óptica; MET: microscopia elctrónica de transmissão; IFA: imunofluorescência indirecta.

As prevalências que estão registadas nos Quadros VI e VII, não permitem,

todavia, uma análise comparativa entre elas, uma vez que se verificam diferenças

consideráveis, no que diz respeito à selecção do grupo de doentes, características da

população (idade, sexo, dados sócio-demográficos, grau de imunodeficiência,

parâmetros clínicos), assim como do tipo de espécimes (tecidos de biópsia, amostras

fecais) analisados. Acrescente-se, ainda, que deverá ser tido em consideração, para esta

análise, o avanço e o aperfeiçoamento, a que têm sido sujeitas as metodologias de

diagnóstico, nos últimos 15 anos, e que certamente deram origem a estudos mais

sensíveis e específicos.


- 77 -

Alguns estudos apontam um decréscimo da prevalência de E. bieneusi, em

países desenvolvidos [Conteas et al. 1998a; Weber et al. 1999a]. Parece estar a

verificar-se, uma remissão da microsporidiose intestinal, associada à infecção por VIH,

como resultado da utilização da terapêutica anti-retrovírica combinada [Goguel et al.

1997; Carr et al. 1998; Conteas et al. 1998b; Miao et al. 2000; Nannini & Okhuysen

2002]. Na Suíça, o registo da diminuição em 50% dos casos de infecção por E. bieneusi,

foi sugerido estar ligado ao uso da HAART [Weber et al. 1999a].

Apesar da maioria das infecções por E. bieneusi ocorrerem em adultos

infectados por VIH, encontram-se descritos diversos casos, em pessoas que embora

seronegativas para VIH, apresentam diferentes graus de imunossupressão: existência de

outras doenças subjacentes, doentes submetidos a terapêutica imunossupressora (por

exemplo, nos doentes transplantados) [Weber & Bryan 1994; Guerard et al. 1999;

Goetz et al. 2001; Rabodonirina et al. 2003; Lanternier et al. 2009].

Também os registos de infecção em imunocompetentes associados a um quadro

de diarreia auto-limitada, no contexto da diarreia do viajante na Europa [Sandfort et al.

1994; Sobottka et al. 1995; Wanke et al. 1996a; Albrecht & Sobottka 1997;

Svenungsson et al. 1998; Gainzarain et al. 1998; Lopez-Velez et al. 1999; Muller et al.

2001] e em casos isolados em África [Cegielski et al. 1999; Gumbo et al. 2000], são

cada vez mais comuns. Na Alemanha, a espécie E. bieneusi, foi detectada em sete

amostras fecais de um total de 148 viajantes analisados [Muller et al. 2001]. Uma

percentagem de infecção de 17% (8/47) foi determinada em idosos com diarreia, em

Espanha [Lores et al. 2002b]. Os resultados deste estudo, sugerem que a diminuição da

capacidade do sistema imunitário associada ao envelhecimento, pode predispor os

idosos para contrair microsporidiose.

Ao longo da última década, têm vindo a acumular-se evidências, que indicam

que a espécie E. bieneusi pode persistir como infecção assintomática em pessoas

imunocompetentes. Em África, um estudo envolvendo crianças seronegativas para VIH,

permitiu detectar E. bieneusi em amostras fecais, sugerindo o estádio de portador

assintomático, entre imunocompetentes, em regiões tropicais [Bretagne et al. 1993].

Abreu-Acosta e colaboradores identificaram E. bieneusi em 11,5%, 2,5% e 16,2% de

amostras fecais, urina e secreções pulmonares (expectoração), respectivamente nun

estudo conduzido em imunocompetentes em Tenerife (Espanha) [Abreu-Acosta et al.


- 78 -

2005].Outros casos de infecções assintomáticas em crianças, foram descritos,

novamente em África [Cegielski et al. 1999] e, também, num orfanato na Ásia

[Mungthin et al. 2001]. Neste ultimo, para além das crianças saudáveis, E. bieneusi foi

identificada entre 1,9% dos adultos a trabalhar na referida instituição. Em todos estes

estudos, as técnicas de diagnóstico utilizadas foram a microscopia óptica, combinada

com MET, para confirmação dos casos positivos. Todavia, é do conhecimento que esta

metodologia, pode não ser suficientemente sensível, em todas as circunstâncias, para a

detecção de infecções subclínicas. Por isso, deve-se, sempre que possível, aplicar

métodos de diagnóstico mais sensíveis (ex. PCR) que permitam aferir se E. bieneusi é

um parasita comum da flora intestinal humana, apenas desencadeando doença grave, em

hospedeiros imunodeficientes, ou esclarecer a importância da transmissão zoonótica

destes microrganismos.

8.1.2. Distribuição geográfica e prevalência no homem da espécie Encephalitozoon

intestinalis

A espécie E. intestinalis é considerada como a segunda causa de microsporidiose

intestinal no homem. Estão descritos casos de infecção, em doentes seropositivos para

VIH, por diversos continentes: América [Coyle et al. 1996; Moura et al. 1999b; Sheikh

et al. 2000], Europa [Weber et al. 1994; van et al. 1994b; Molina et al. 1995; Franzen et

al. 1996a; Liguory et al. 1997; Sobottka et al. 1998; Ferreira et al. 2001; Svedhem et al.

2002; Lippert et al. 2003], Austrália [Dore et al. 1995; Leder et al. 1998] e África

[Kelly et al. 1994; Alfa et al. 2002]. Porém, a maioria dos estudos correspondem a

registos de um único caso, e poucos são os que envolvem a análise de grupos maiores.

As prevalências variam: 7,3% em doentes com sida e diarreia nos EUA [Coyle et al.

1996], 2% em infectados por VIH na Alemanha [Sobottka et al. 1998], 3% de doentes

com diarreia crónica na Zâmbia [Kelly et al. 1994], 0,9% de doentes com diarreia

crónica na Suiça [Weber et al. 1999a]. Em Portugal, um estudo identificou por PCR, E.

intestinalis em 49 doentes (e E. bieneusi em 20 doentes) com queixas gastrintestinais,

dos 69 positivos detectados por microscopia óptica [Ferreira et al. 2001].

E. intestinalis, foi detectada em dois viajantes seronegativos para VIH, com

diarreia [Raynaud et al. 1998]. Na Malásia, Lono e colaboradores [Lono et al. 2008],


- 79 -

identificaram E. intestinalis, em dois doentes com cancro, sujeitos a quimioterapia. Esta

espécie foi também descrita num doente submetido a transplante renal [Latib et al.

2001].

8.1.3. Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Encephalitozoon

cuniculi.

A aplicação de métodos imunológicos e/ou moleculares permitiu a identificação,

de E. cuniculi em doentes com imunossupressão (infectados por VIH, transplantados de

órgãos, e com linfocitopenias de origem idiopática), demonstrando a sua infecciosidade

neste grupo populacional. No Quadro VIII, encontram-se registados os casos de

infecção por esta espécie, confirmados por técnicas moleculares.

Diversos estudos seroepidemiológicos, recorrendo a técnicas de ELISA e IFI,

registaram prevalências com valores até 42%, em pessoas com história de doença

tropical, ou com uma visita a região tropical e em pessoas com doença renal, psiquátrica

ou neurológica [Singh et al. 1982; Bergquist et al. 1984a; Hollister & Canning 1987;

Hollister et al. 1991]. Contudo, não se sabe ao certo, se a detecção de anticorpos anti-E.

cuniculi corresponde a uma verdadeira infecção, ou apenas, reflete a exposição ao

antigénio, sem estabelecimento do parasita, ou resulta de reacções cruzadas, ou ainda,

de reacções devidas à estimulação policlonal de células B, que particularmente, podem

ocorrer em pessoas com doença tropical. Apesar de estes estudos, assim como outros

posteriores se encontrarem condicionados pelas supracitadas limitações, sugerem uma

exposição frequente, do Homem, aos microsporídios, sem significado clínico [Gomez

Morales et al. 1995; Pospisilova et al. 1997; van et al. 1997; Kucerova-Pospisilova &

Ditrich 1998; Cislakova & Halanova 2003; Halanova et al. 2003].


- 80 -

Quadro VIII. Casos exporádicos de infecção por E. cuniculi, confirmados por técnicas de biologia molecular. Adaptado de [Mathis et al. 2005].

ESTADO IMUNOLÓGICO MANIFESTAÇÃO CLÍNICA LOCAL DE INFECÇÃO E/OU ESPÉCIME ESTIRPE ANO REF.

Doentes VIH+

Reino Unido Dor abdominal, anorexia, vómitos, febre, tosse, falência renal Rim, urina III 1994 [Aarons et al. 1994; Hollister et al. 1995; Hollister et al. 1996a]

EUA Febre, tosse, insónia, congestão nasal, olho seco, visão enevoada Urina, expectoração III 1995 [De Groote et al. 1995; Didier et

al. 1996c; Croppo et al. 1997] Alemanha Queratoconjuntivite, sinusite, rinite Urina, expectoração, exsudado nasal, biópsia duodenal ND 1995 [Franzen et al. 1995b] Suiça Cefaleia, convulsões,náusea, vómitos LCR, fezes, expectoração urina I 1997 [Weber et al. 1997]

EUA Febre, náuseas, dor abdominal, diarreia Glândula adrenal, rins, cérebro, coração, traquie, bexiga, baço, gânglios linfáticos III 1997 [Mertens et al. 1997]

Suiça Nenhuma Urina I 1997 [Mathis et al. 1997]

México Pneumonia, otite média Urina, secreções brônquicas, fezes III 1997 [Deplazes et al. 1996a; Mathis et al. 1997]

Suiça Nenhuma Urina I 1997 [Deplazes et al. 1996a; Mathis

et al. 1997] Suiça Conjuntivite, sinusite, tremores Urina I 1997 [Mathis et al. 1997] Suiça Insuficiência renal, leucocitúria, eritrocitúria Urina I 1997 [Mathis et al. 1997] Suiça Nenhuma Urina, secreções brônquicas I 1997 [Mathis et al. 1997] Itália Sinusite crónica, queratoconjuntivite bilateral, Epitélio nasal I 1998 [Rossi et al. 1998] França Diminuição da visão LCR, urina, expectoração, fezes, biopsia duodenal ND 2000 [Fournier et al. 2000b] Chile Tosse, febre LBA, biópsia transbronquial ND (III*) 2001 [Weitzel et al. 2001] Espanha Febre, astenia, dor abdominal, diarreia Fezes, urina, expectoração III 2002 [del et al. 2001a]

Itália Febre, mialgia, astenia Rim, fígado, gânglios linfáticos, baço, medula renal, cérebro, ovário III 2002 [Tosoni et al. 2002]

Doentes VIH-,

imunocomprometidos

(transplantados)

Canada Febre, queratoconjuntivite Urina, fezes, expectoração, raspagem conjunctiva III 2003 [Mohindra et al. 2002]

México Tosse, febre, diarreia, dor toráxica, astenia Fígado, rim III 2003 [Gamboa-Dominguez et al. 2003]

EUA Distress respiratório Biópsia pulmão III 2004 [Teachey et al. 2004] Doentes VIH-,

imunocomprometidos*

Suiça Tumor da íris Biópsia do tumor I 2005 [Kodjikian et al. 2005]158

VIH+ : seropositivo para VIH; VIH- : seronegativo para VIH; *doentes com linfocitopenia de origem idiopática; LCR: líquido cefalo-raquidiano ; LBA: lavado brocoalveolar ; ND: não determinado


- 81 -

8.1.4. Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Encephalitozoon

hellem

A espécie E. hellem foi descrita em cerca de 50 doentes infectados por VIH,

num número reduzido de regiões. A maioria dos casos foi registada nos EUA [[Didier et

al. 1991a; Schwartz et al. 1992; Schwartz et al. 1993a; Schwartz et al. 1993b;

Visvesvara et al. 1994; Didier et al. 1996a; Conners et al. 2004], contudo esta espécie

foi também identificada em Itália [Scaglia et al. 1997], Suiça [Weber et al. 1993;

Deplazes et al. 1996a; Franzen et al. 1996a], Alemanha [Franzen et al. 1998], Reino

Unido [Hollister et al. 1993] e na Tanzânia [Deplazes et al. 1998]. Não é claro se a

distribuição restrita deste microsporídio, se deve a factores epidemiológicos ou a

limitações técnicas na sua detecção.

E. hellem provoca infecções oculares e dissiminadas em doentes seropositivos

para VIH, mas também foram descritas infecções assintomáticas do aparelho

respiratório [Scaglia et al. 1998a]. Scaglia e colaboradores, isolaram E. hellem, num

lavado broncoalveolar, de um imunocompetente com infecção por Mycobacterium

tuberculosis [Scaglia et al. 1998b]. Este microsporídio foi, também, identificado em

amostras fecais, de dois viajantes com diarreia regressados de Singapura [Muller et al.

2001], assim como de um doente com cancro na Índia [Lono et al. 2008].

8.1.5. Grupos específicos da População humana, em risco de microsporidiose

Apesar das patologias severas associadas à microsporidiose ter a sua maior

expressão na população com imunodeficiência causada por VIH [Weber & Bryan 1994;

Bryan 1995], este grupo de patologias pode surgir, de igual modo, em doentes com

outras imunodeficiências. Na literatura estão descritos casos de infecção por

microsporídios em pessoas com neoplasias sob quimioterapia [Lono et al. 2008] e em

doentes submetidos a terapêutica imunossupressora, após transplante de órgãos

[Lanternier et al. 2009]. Os portadores de imunodeficiências primárias constituem uma

subpopulação, igualmente, em risco de contrair infecção por microsporidia [Kotler &

Orenstein 1999].


- 82 -

No Quadro IX encontram-se sumarizados os casos de microsporidiose registados

até à data, em doentes submetidos a transplantes. Por exemplo infecções por E. bieneusi

foram descritas num transplantado de fígado seronegativo para VIH, assim como num

transplantado de coração e pulmões [Sax et al. 1995; Rabodonirina et al. 1996]. Cotte e

colaboradores, registaram infecções por E. bieneusi, em transplantados de medula,

coração-pulmões, fígado e rim, durante um potencial surto de microsporidiose, ocorrido

em França em 1995 [Cotte et al. 1999]. Também foi identificado E. cuniculi num

doente submetido a transplante de rim e pâncreas [goodman et al, unpublished data].

Um caso de infecção pulmonar, provavelmente por Encephalitozoon sp., foi confirmado

durante a autópsia a um doente com leucemia mielóide crónica que havia sido sujeito a

um transplante de medula [Kelkar et al. 1997]. Contudo, permanece por esclarecer, se

os doentes submetidos a transplante, contraíem a infecção através do órgão doado, ou já

durante a fase em que lhes é administrada a terapia imunossupressora [Barsoum 2004].

No entanto, como referido anteriormente, os doentes submetidos a transplante de

órgãos, não constituem a única fatia da população de imunossuprimidos seronegativos

para VIH, em risco de contrair microsporidiose. Silverstein e colaboradores (1997),

descreveram um doente que desenvolveu queratoconjuntivite bilateral por

microsporídios, após medicação sistémica com prednisolona (20mg/dia) para a asma

[Silverstein et al. 1997]. Embora o esporo responsável não tivesse sido identificado,

parasitologicamente era compatível com microsporidio do género Encephalitozoon e o

doente respondeu positivamente ao tratamento com albendazol. Outro caso num

seronegativo para VIH, foi descrito por Wanke e colaboradores, em que o doente

apresentava um quadro diarreico associado a E. bieneusi, com uma diminuição

acentuada, sem explicação, da contagem do número de linfócitos TCD4+, com historial

de meningite criptocócica [Wanke et al. 1996b]. Curiosamente, este doente respondeu

ao tratamento com albendazol. Assim, é de esperar, que casos de microsporidiose

associados a outros tipos de imunossupressões (seronegativos para VIH) continuem a

aumentar.

Apesar da grande maioria dos casos de microsporidiose serem descritos em

doentes com um maior ou menor grau de imunossupressão, também o número de

infecções em imunocompetentes, tem vindo a aumentar. As crianças são

particularmente vulneráveis às infecções, em geral, e certamente também, à infecção por


- 83 -

microsporídios, devido não só à imaturidade do seu sistema imunológico, como aos

comportamentos que lhes são característicos, de que são exemplo, a incontinência fecal,

o uso de fraldas, os hábitos de higiene deficientes e o levar as mãos à boca, que

favorecem a transmissão fecal-oral de parasitas.

A população idosa também se encontra mais susceptível à infecção, devido à

senescência imunológica e às doenças crónicas, entre outros factores, que acompanham

o envelhecimento e diminuem as suas defesas imunológicas [Naumova et al., 2003].

Na literatura, encontram-se documentados casos de infecções por E. bieneusi

em turistas após o regresso de férias no estrangeiro, assim como em adultos e crianças

residentes em países tropicais ou subtropicais [Sandfort et al. 1994; Sobottka et al.

1995; Wanke et al. 1996a; Albrecht & Sobottka 1997; Hautvast et al. 1997; Maiga et al.

1997; Svenungsson et al. 1998; Lopez-Velez et al. 1999; Cegielski et al. 1999; Muller

et al. 2001; Wichro et al. 2005; Abreu-Acosta et al. 2005]. Também Raynaud e

colaboradores (1998), identificaram E. intestinalis em viajantes imunocompetentes com

diarreia crónica [Raynaud et al. 1998]. Será então interessante expecular se a

microsporidiose não será, também, uma possível causa de diarreia do viajante, à qual

não está a ser dada a devida importância.


- 84 -

Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes transplantados. Adaptado de [Lanternier et al. 1999].

Orgão Sexo Idade (anos)

Intervalo após tratamento

Último tratamento IS Sintomas Localização Espécies CD4

(/mm3) Tratamento Alterações no tratamento IS

Evolução Clínica

Ref.

Rim M 46 7A MMF;

ciclosporina; prednisona

Diarréia, perda de

peso Intestinal E. bieneusi 549 Albendazol Parou MMF; redução

da azitioprina Curado [Guerard et al. 1999]5

Rim M 24 2A MMF;

ciclosporina; prednisona

Diarréia perda de

peso Intestinal E. bieneusi 278 Não Parou MMF; redução

da azitioprina Curado

Rim F 38 1,5A Tacrolimus;

MMF; prednisona

Diarréia perda de

peso Intestinal E. bieneusi 350 Albendazol e

metranidazol

Parou MMF; redução do tacrolimus e

prednisona Curado [Metge et al.

2000]

Rim 3A Tacrolimus; prednisona E. bieneusi Fumagilina Curado [Molina et al.

2002]

Coração-pulmão M 48 3A

Globulina anti-linfócitária;

ciclosporina; azatioprina;

metilprednisona

Diarréia crónica, perda de

peso

Intestinal E. bieneusi 328 Albendazol Falha [Rabodonirina et al. 1996]

Coração M 48 4A ciclosporina; azatioprina; prednisona

Diarreia, dispepsia, Intestinal E. bieneusi 406 Metranidazol

Melhoria transitória;persist

ência de E. bie

[Gumbo et al. 1999a]

Fígado F 36 5A Tacrolimus Diarréia, perda de

peso E. bieneusi 1100 Albendazol Redução do tacrolimus

Melhoria transitória;persist

ência de E. bie

[Goetz et al. 2001]

Fígado 2A Tacrolimus E. bieneusi Fumagilina Curado [Molina et al. 2002]

Rim M 49 2M Tacrolimus;

MMF; prednisona

Intestinal Fumagilina [Arzouk et al. 2006]

Rim F 71 Tacrolimus; prednisona

Diarréia, perda de

peso Intestinal Fumagilina [Arzouk et al.

2006]

Rim M 64 3A Tacrolimus; MMF

Diarréia, perda de

peso Intestinal E. bieneusi 654 Fumagilina Curado [Lanternier et

al. 2009]

Fígado M 45 3A Ciclosporina; everolimus

Diarréia, perda de

peso Intestinal E. bieneusi 189 Fumagilina Parou everolimus Curado [Lanternier et

al. 2009]

MMF: Micofenolato de mofetil


- 85 -

Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes transplantados (continuação). Adaptado de [Lanternier et al. 1999]

Orgão Sexo Idade (anos)

Intervalo após tratamento

Último tratamento IS Sintomas Localização Espécies CD4

(/mm3) Tratamento Alterações no tratamento IS

Evolução

clínica

Ref.

Rim M 39 1A ciclosporina; azatioprina; prednisona

Febre, impairment

renal Renal E.

intestinalis Albendazol Curado

[Latib et

al. 2001]

Rim M 42 5M ciclosporina; rapamicina; prednisona

Febre, tosse, dor toráxica, citopenia, hematúria, queratite,

colite

Disseminada: rim, fígado,

intestino, ocular E. cuniculi

Albendazol; transfusão de

plasma, fumagilina

tópica

Parou rapamicina e ciclosporina

Recaída após 1 ano

[Gamboa-Dominguez et

al. 2003]

Rim F 45 2M Febre,

falência renal

Disseminada: rim,

intestino, conjuntiva,

cérebro

E. cuniculi Albendazol; fumagilina

tópica Parou IS

Morte associada a

envolvimento neurológico

[Mohindra et al. 2002]

Rim F 45 2M

Febre, falência renal,

queratite

Disseminada: rim, intestino,

conjuntiva, neurológica

E. cuniculi Parou MMF; redução

do tacrolimus e prednisona

[Mahmood et al. 2003]

Medula F 27 19D ciclosporina;metotraxato

Febre, pneumonia Pulmonar ? Diagnóstico

pós-mortem [Kelkar et al.

1997]

Medula F 21 3M Globulina

antilinfócitária; ciclosporina

Pneumonia intersticial Pulmonar E. cuniculi Diagnóstico

pós-mortem

[Teachey et

al. 2004; Orenstein et

al. 2005]

Pâncreas/ rim M 43 2M

Tacrolimus; MMF;

prednisona

Febre, diarreia, falência

renal

Disseminada: rim, fígado, intestino,

coração, cérebro

Encephalito

zoon sp. Diagnóstico pós-mortem

[Carlson et al. 2004]

Fígado F 48 1,5M Tacrolimus; prednisona

Diarreia, perda de

peso Intestino ? Metranidazol Curado [Sax et al.

1995]

MMF: Micofenolato de mofetil


- 86 -

8.2. A MICROSPORIDIOSE NOUTROS ANIMAIS

As microsporidioses já foram reportadas em diversas espécies de mamíferos

domésticos e silváticos e com menor frequência, em aves, anfíbios e répteis.

O interesse, por estes parasitas, aumentou com o número crescente de casos

documentados de microsporidiose em humanos e noutros animais. Uma das razões

apontadas para o gradual interesse em estudos envolvendo diversos grupos de animais,

prende-se, com o facto de os animais poderem constituir fonte de infecção para o

Homem.

8.2.1. Mamíferos

A maioria das infecções por microsporídios, descrita em mamíferos, foi

identificada, particularmente em gado doméstico, animais de companhia e, nalguns

grupos de animais silváticos.

As quatro principais espécies de microsporidia responsáveis pelo maior número

de casos de infecção no homem, foram descritas em mamíferos. E. cuniculi, é o agente

mais frequentemente detectado em mamíferos [Snowden & Shadduck 1999]. Foi a

primeira espécie a ser descrita no cérebro e rim de coelhos, que apresentavam tremores,

letargia, assim como parastesias localizadas ou generalizadas [Wright & Craighead

1922]. A encephalitozoonose por E. cuniculi é frequente em coelhos, animais de

companhia e de laboratório. Habitualmente, ocorrem infecções crónicas que podem

persistir durante anos, sem sintomatologia. Todavia, podem desenvolver doença

neurológica grave [Mathis et al. 2005]. No passado, foram descritas elevadas

prevalências de encephalitozoonose em colónias de coelhos de laboratório [Canning &

Lom 1986; Wasson & Peper 2000]. Em coelhos, mantidos como animais de companhia,

a doença é endémica. Na Suíça e no Reino Unido foram detectados anticorpos contra E.

cuniculi em 7,5% (n=292) e em 23% (n=26) de coelhos saudáveis, respectivamente e

em 85% (n=72) e 71% (n=65) de coelhos com sintomas neurológicos ou com exposição

com animais sintomáticos, respectivamente [Deplazes et al. 1996b; Harcourt-Brown &

Holloway 2003; Mathis et al. 2005].


- 87 -

A transmissão horizontal, através da ingestão de esporos, é considerada a via de

infecção mais frequente nos coelhos, embora a transmissão transplancentária também se

encontre documentada [Canning & Lom 1986; Baneux & Pognan 2003] . Após infecção

experimental, por via oral, de coelhos, observou-se a excrecção regular de esporos na

urina, em particular entre o trigésimo oitavo e o sexagésimo terceiro dias pós-infecção

[Cox et al. 1979; Mathis et al. 2005]. Verificou-se que, nove de 11 coelhos com

sintomatologia, analisados, excretavam esporos na urina, sugerindo um papel

importante destes animais, no contexto epidemiológico da infecção [Cox & Walden

1972; Mathis et al. 2005].

Os coelhos silváticos (Oryctolagus cuniculus) foram apontados como

hospedeiros naturais de E. cuniculi , com base em evidências serológicas [Wilson 1979;

Mathis et al. 2005]. Outros dois estudos, registaram seroprevalências de 3,9% em

coelhos silváticos em França [Chalupsky et al. 1990; Mathis et al. 2005] e 25% numa

população silvática de coelhos na Austrália [Thomas et al. 1997].

Até alguns anos atrás, a espécie E. cuniculi era descrita, como sendo parasita

comum, de roedores em laboratório, tais como ratinhos, ratos, hamsters e porquinhos-

da-índia [Canning & Lom 1986; Wasson & Peper 2000]. Actualmente, com a

implementação de regras de higiene adequadas ao manuseamento e manutenção destes

animais, a infecção por este microsporídio deixou de ser considerada um problema

relevante. Por outro lado, e mais recentemente, o modelo roedor parece revelar-se uma

metodologia promissora quando aplicada aos estudos imunológicos, no contexto da

microsporidiose [Didier 2000].

Estão descritos, alguns estudos da infecção por E. cuniculi em ratos silváticos,

no Japão, no Reino Unido [Canning & Lom 1986] e Suíça (E. cuniculi estirpe II)

[Muller-Doblies et al. 2002]. Acresce, os anticorpos contra este microsporídio,

detectados em 4% de Apodemus sylvaticus e em 9% de Mus musculus na Islândia

[Hersteinsson et al. 1993]. Os autores deste estudo apontaram estes animais como

potenciais reservatórios de E. cuniculi, com relevância na infecção de raposas do ártico

e de visons. A identificação de E. cuniculi estirpe II, em todas as raposas, oriundas de

diferentes quintas, na Noruega e Filândia [Mathis et al. 1996; Akerstedt et al. 2002],

veio reforçar esta hipótese.


- 88 -

Em canídeos, a encefalitozoonose pode ser sintomática ou assintomática. O

quadro clínico parece desenvolver-se apenas, nos casos em que há transmissão

transplacentária, ou em cães adultos imunodeprimidos [Hollister et al. 1989]. As

manifestações nervosas e de insuficiência renal, são as mais comuns [Botha et al. 1979;

Stewart et al. 1979; Mathis et al. 2005]. Casos de encefalitozoonose, por E. cuniculi

estirpe III, em cães domésticos, foram reportados na Tânzania, África do Sul e EUA

[Shadduck et al. 1978; Botha et al. 1979; Canning & Lom 1986; Snowden et al. 1999].

Estão descritas infecções por E. cuniculi, em gatos domésticos [Canning & Lom 1986;

Lobo et al. 2003]. Em crias de raposas, em cativeiro, observam-se infecções

disseminadas semelhantes às dos canídeos [Nordstoga 1972; Mathis et al. 2005]. A

infecção por E. cuniculi estirpe II, constitui na actualidade, um importante problema,

para a indústria de criação de raposas azuis, em países do Noroeste Europeu [Mathis et

al. 1996; Akerstedt 2002].

Estão descritos surtos de encefalitozoonose em carníveros, de Jardim Zoológico,

[Canning & Lom 1986], mas são poucos são os registos em carnívoros silváticos

[Wilson 1979; Van Heerden et al. 1989; Hersteinsson et al. 1993; Mathis et al. 2005].

Todavia, nestes últimos estudos a microscopia óptica foi a técnica usada no diagnóstico

dos microsporídios, não permitindo assim, uma conclusão definitiva sobre a espécie e a

estirpe envolvida na infecção.

Nos cães e nas raposas, a encefalitozoonose por E. cuniculi é perpetuada na

população por transmissão horizontal e vertical [Botha et al. 1979; Mohn et al. 1982;

Mathis et al. 2005].

Mais de uma década, depois da identificação de E. bieneusi no Homem, esta

espécie foi detectada em animais, mais propriamente em suínos [Deplazes et al. 1996b].

Através da PCR, determinou-se uma prevalência de 35%, em suínos, na Suíça

[Breitenmoser et al. 1999]. A elevada percentagen de excreção de esporos em suínos

sem quadro clínico associado, levou os autores do estudo a sugerir que E. bieneusi será

um parasita comum nos suínos assintomáticos. A ausência de lesões intestinais, em

porcos gnotobióticos [Kondova et al. 1998], infectados experimentalmente por esta

espécie de microsporídios, veio acrescentar evidências a esta ideia. Estudos

subsequentes, confirmaram a ocorrência de E. bieneusi com uma elevada prevalência,

em suínos (32%) [Buckholt et al. 2002] e em gado bovino (9,5% - 11,5%) [Rinder et al.


- 89 -

2000; Santin et al. 2004; Sulaiman et al. 2004]. Este parasita, tem vindo a ser descrito

numa vasta gama de hospedeiros animais, tais como, gatos [Mathis et al. 1999a;

Dengjel et al. 2001; Lobo et al. 2003; Lobo et al. 2006c], cães [Lores et al. 2002a; Lobo

et al. 2003; Lobo et al. 2006c], cabras [Lores et al. 2002a], num lama [Dengjel et al.

2001] e em diversos grupos de animais silváticos [Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al.

2003b].

Relativamente, à espécie E. intestinalis verificou-se que ratinhos do tipo-

selvagem, infectados experimetalmente, excretavam esporos de forma intermitente, e

em baixas concentrações [Achbarou et al. 1996]. Uma situação semelhante, ao que se

havia observado na infecção por E. bieneusi, em suínos [Breitenmoser et al. 1999].

Bornay-Llinares e colaboradores [Bornay-Llinares et al. 1998] identificaram E,

intestinalis numa cabra, num suíno, numa vaca, num burro e um cão. Num estudo mais

recente, uma baixa prevalência de E. intestinalis foi detectada em gorilas silváticos

(assim como em pessoas que partilhavam o mesmo habitat), no Uganda [Graczyk et al.

2002]. Apesar de ser sugerido o carácter zoonótico deste microsporídio, ainda se

encontra por esclarecer, se esta espécie é um parasita comum nalguns grupos de

animais, ou se apenas E, intestinalis isolado dos animais está relacionado com a

infecção no Homem

São poucos os casos de infecção natural por microporídios, conhecidos em

primatas não humanos. Até à data, foram identificadas as espécies E. cuniculi e E.

bieneusi [Mansfield et al. 1998], em diferentes espécies de macacos. Infecções

experimentais por E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis, em macacos, também se

encontram reportadas, na literatura [Mathis et al. 2005].

8.2.2. Aves

As quatro espécies mais frequentes, responsáveis por microsporidiose no

Homem, E. bieneusi, E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi, foram descritas em diversas

espécies de aves. O primeiro registo de microsporidiose em aves data de 1975, por que

Kemp e Kluge [Kemp & Kluge 1975], em inseparáveis da espécie Agapornis personata,

(Illinois, EUA). Seguiu-se a identificação de microsporidia em papagaios (Amazona

ochtocephala), em pelo menos três espécies de inseparáveis (Agapornis roseicolis,


- 90 -

Agapornis personata, Agapornis fischeri), juvenis de periquitos (Melopsittacus

undulatus), papagaios-do-mar (Fratercula corniculata), capturados e mantidos em

cativeiro, e num bando de papagaios tricolores (Erithrura tricolor) [Poonacha et al.

1985; Tocidlowski et al. 1997; Gelis & Raidal 2006].

Os papagaios do género Agapornis são geralmente descritos como os

hospedeiros mais frequentes de microsporidia [Branstetter & Knipe 1982; Powell et al.

1989; Norton & Prior 1994]. O primeiro caso de microsporidiose em que a espécie

identificada foi E. hellem, registou-se em juvenis de periquitos (Melopsittacus

undulatus), em 1977 [Black et al. 1997]. Outros casos de encephalitozoonose, causados

por E. hellem, foram descritos em tecidos (estudo retrospectivo) de papagaios eclectus

(Eclectus roratus), num loris estriado (Chalcopsitta scintillata) capturado, em juvenis

de avestruzes (Struthio camelus), num inseparável-de-faces -rosadas (Agapornis

roseicolis), em colibris (Calypte anna, Archilochus alexandri e em Selasporus sasin),

em juvenis de Diamante estrela (Erithrura gouldiae), em inseparáveis (Agapornis

fischeri), e em cacatuas (Cacatua alba) [Gray et al. 1998; Pulparampil et al. 1998; Suter

et al. 1998; Snowden & Logan 1999; Snowden et al. 2000; Snowden et al. 2001;

Carlisle et al. 2002; Barton et al. 2003; Phalen et al. 2006].

Com excepção dos papagaios a espécie E. hellem, foi identificada, quer em aves

silváticas, quer em aves capturadas e mantidas em cativeiro, ou ainda em aves de

criação, incluindo patos-reais (Anas platyrhynchos), cisnes-mudos (Cygnus olor) e

cisnes de pescoço-preto (Cygnus melanocoryphus), gansos bravos (Anser anser),

gralhas (Corvus corone), pombos-de-nicobar (Caloenas nicobarica), cisnes-negros

(Cygnus atratus), cisnes-coscoroba (Coscoroba coscoroba), Grous Coroado (Balearica

pavonina), e pombos (Columba livia) [Haro et al. 2005; Slodkowicz-Kowalska et al.

2006; Bart et al. 2008].

E. bieneusi foi identificada pele primeira vez, em galinhas de aviário (Gallus

gallus) [Reetz et al. 2002]. Posteriormente foi identificada em diversas ordens de aves,

nomeadamente em Columbiformes, Passeriformes e Psittaciformes [Haro et al. 2005;

Haro et al. 2006; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Lobo et al. 2006b; Kasickova et al.

2007; Graczyk et al. 2007b; Kasickova et al. 2009], em pombos [Haro et al. 2005; Haro

et al. 2006; Lobo et al. 2006b; Graczyk et al. 2007b; Bart et al. 2008], e recentemente

em falcões de uma colecção privada, nos Emirados Árabes Unidos [Muller et al. 2008].


- 91 -

Até à data, E. cuniculi foi detectada em três espécies de aves: em galinhas [Reetz

1993], numa caturra (Nymphicus hollandicus) [Kasickova et al. 2007] e em pombos

[Haro et al. 2005; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Bart et al. 2008; Kasickova et al.

2009].

Relativamente a outros microsporídios, a espécie E. intestinalis apenas foi

identificada num grupo restrito de aves: pombos e gansos domésticos (Anser anser

domestica) [Bart et al. 2008] e mais recentemente em diversas aves das ordens

Columbiformes, Passeriformes e Psittaciformes [Haro et al. 2005; Slodkowicz-

Kowalska et al. 2006].

Até à data, não foi possível estabelecer a transmissão directa entre as aves e o

Homem. No entanto, alguns doentes portadores de infecção ocular, possuíram ou

estiveram em contacto com aves de companhia [Friedberg et al. 1990; Yee et al. 1991]

e durante um estudo com doentes infectados por VIH no Peru [Bern et al. 2005], foi

identificada uma associação entre o contacto com patos e galinhas e o risco de infecção

pelo genótipo Peru 6 de E. bieneusi. Também os dados obtidos em pombos de parques

urbanos sugerem a ausência de barreiras de transmissão entre as aves e humanos. Com a

agravente que, a maior parte dos visitantes destes parques são crianças e idosos, que

fazem parte do grupo populacional susceptível de contrair infecções em geral e, como

tal, de microsporidiose a partir de pombos [Haro et al. 2005; Lobo et al. 2006b; Bart et

al. 2008].

8.3. FONTES DE INFECÇÃO E MODOS DE TRANSMISSÃO

8.3.1. Transmissão inter-humana (vertical e horizontal)

A transmissão vertical da microsporidiose foi registada em roedores,

lagomorfos, carnívoros e, ainda, em primatas não humanos [Didier et al. 1998;

Snowden & Shadduck 1999; Baneux & Pognan 2003]. Contudo, até à data não foi

observada em humanos [Didier et al. 2004].

A probabilidade de ocorrer transmissão horizontal () dos microsporídios, é

elevada, dada a presença do parasita ao nível do intestino, aparelho genito-urinário e

respiratório do hospedeiro. Dado que as vias de eliminação dos agentes patogénicos,


- 92 -

habitualmente, estão intimamente associadas ao seu modo de transmissão, é de supor

que ocorra transmissão de microsporídios pelas vias, fecal-oral, oral-oral, sexual e aérea

[Bryan & Schwartz 1999; Weber et al. 2000; Didier et al. 2004].

A hipótese de transmissão directa, é reforçada por estudos, onde as relações

homossexuais e a coabitação com indivíduos com diarreia são considerados factores de

risco, associados à microsporidiose intestinal [Hutin et al. 1998; Gumbo et al. 1999b].

Noutro estudo, em que é também sugerido o mesmo modo de transmissão, com base

nos resultados obtidos, verificou-se que, nove das 13 crianças infectadas pelo

microsporídio (E. bieneusi), que eram seronegativas para VIH, coabitavam na mesma

casa. Pelo contrário, não foi detectada infecção nas crianças seropositivas para VIH, que

compartilhavam um alojamento à parte [Mungthin et al. 2001].

No que respeita, às infecções oculares, a hipótese de estas serem transmitidas

por auto-inoculação, através das mãos contaminadas por espécimes biológicos,

infectados com microsporídios, em pessoas com deficientes hábitos de higiene, é

formulada por alguns autores [Bryan & Schwartz 1999].

À semelhança dos exemplos de transmissão horizontal de microsporídios, que se

observam entre animais [Bywater & Kelley 1978; Liu et al. 1988], ganha força a

hipótese de que essas mesmas espécies de parasitas, possam transmitir-se da mesma

forma, entre o Homem. É possível infectar experimentalmente animais, com as espécies

E. bieneusi, Encephalitozoon spp., ou A. algerae, quer por via oral, inoculação intra-

rectal, ou administração dos organismos através da mucosa ocular, respectivamente

[Fuentealba et al. 1992; Tzipori et al. 1997; Koudela et al. 2001]. Dados estes, que mais

uma vez, sustentam a ocorrência de transmissão horizontal, entre animais e que à

semelhança, se poderá extrapolar, para os humanos.


- 93 -

8.3.2. Transmissão Zoonótica

Os microsporídios são parasitas ubíquos na natureza e com distribuição mundial,

sendo então inevitável, a exposição humana a estes organismos.

Os microsporídios são eliminados para o exterior, pela urina, fezes, secreções

pulmonares ou após a morte do hospedeiro. Humanos ou animais infectados por

microsporídios, são então potenciais fontes de infecção desta parasitose. Os animais

estão envolvidos na epidemiologia de muitas doenças definidoras de sida e de outras

doenças oportunistas em infectados por VIH [Glaser et al. 1994].

Uma questão fundamental, suscitada pela identificação de novas espécies de

microsporídios, infectantes para o Homem, é qual a sua origem natural. É o Homem o

reservatório natural do parasita, ou apenas um hospedeiro acidental, no qual a infecção

apenas ocorre quando há deterioração do sistema imunológico do indivíduo? No que

respeita à microsporidiose, ainda não é claro, o papel desempenhado pelos animais na

epidemiologia destas doenças. Contudo, são cada vez mais os indícios acumulados que

apontam, para a potencial transmissão zoonótica dos microsporídios.

Até à data, já foram identificados reservatórios animais dos microsporídios mais

frequentes, que infectam o Homem, como se pode observar nos Quadros X e XI.


- 94 -

Quadro X. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia mais frequentes

infectantes para o Homem. Adaptado de [Didier 2005].

ESPÉCIES REF.

MAIS FREQUENTES

Enterocytozoon bieneusi Outros animais hospedeiros Gado [Fayer et al. 2003c; Sulaiman et al. 2004] Gatos [Rinder et al. 2000] Galinhas [Reetz et al. 2002] Cães, cabras [Lores et al. 2002a] Primatas não-humanos [Mansfield et al. 1997; Sestak et al. 2003] Suínos e ruminantes [Rinder et al. 2000; Buckholt et al. 2002] Suínos, gado, lama, gatos [Dengjel et al. 2001] Coelhos e carnívoros [del et al. 1999] Guaxinin, rato-almiscarado, castor, raposas e lontras [Sulaiman et al. 2003b]

Encephalitozoon intestinalis Outros animais hospedeiros Burros, cães, suínos, vacas, cabras [Bornay-Llinares et al. 1998] Gorilas [Graczyk et al. 2002] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998] Encephalitozoon hellem Outros animais hospedeiros Periquitos [Black et al. 1997] Papagaios [Pulparampil et al. 1998] Catatuas [Suter et al. 1998] Avestruz [Snowden & Logan 1999] Inseparável [Snowden et al. 2000] Diamante estrela [Carlisle et al. 2002] Galinhas [Fayer et al. 2003b] Colibris [Snowden et al. 2001] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998] Encephalitozoon cuniculi Outros animais hospedeiros

Carníveros, coelhos e roedores [Canning & Lom 1986; Snowden et al. 1999; Deplazes et al. 2000]

Raposas [Akerstedt et al. 2002] Cabras [Cislakova et al. 2001] Cavalos [van, I et al. 1991; Patterson-Kane et al. 2003] Primatas não humanos [Zeman & Baskin 1985; Guscetti et al. 2003] Ratazanas silváticas [Muller-Doblies et al. 2002] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998]


- 95 -

Quadro XI. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia menos

frequentes infectantes para o Homem. Adaptado de [Didier 2005].

ESPÉCIES REF.

MENOS FREQUENTES

Anncaliia algerae Outros animais hospedeiros Mosquitos [Vavra & Undeen 1970] Anncaliia connori Outros animais hospedeiros Desconhecidos Anncaliia vesicularum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Microsporidium africanum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Microsporidium ceylonensis Outros animais hospedeiros Desconhecidos Nosema ocularum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Pleistophora ronneafiel Outros animais hospedeiros Peixes [Shaw & Kent 1999] Trachipleistophora antropophtera Outros animais hospedeiros Desconhecidos Trachipleistophora hominis Outros animais hospedeiros Desconhecidos Vittaforma corneae Outros animais hospedeiros Desconhecidos

Não obstante estarem reconhecidas várias espécies, como potenciais fontes de

infecção para o Homem, falta ainda demonstrar, se os microsporídios se transmitem dos

animais para o Homem. A única evidência de transmissão zoonótica, reporta-se a uma

criança, que desenvolveu anticorpos anti-E. cuniculi, após contacto directo com uma

ninhada de cães infectada por E. cuniculi. O autor deste estudo, sugere que a criança

terá contraído a infecção, após contacto com a urina dos cães [McInnes & Stewart

1991].


- 96 -

A alusão à exposição aos animais, é referida em vários estudos de

microsporidiose humana. Por exemplo, um estudo realizado no Zimbabwe, identifica o

contacto com as fezes de vaca, como um factor de risco, associado à infecção por E.

bieneusi [Gumbo et al. 1999b]. Também o contacto com animais, é referido na história

pregressa de diversos casos clínicos de microsporidiose humana, englobando

seropositivos e seronegativos para VIH. Recentemente, foi descrito o caso de uma

criança de dois anos de idade infectada por um genótipo de E. bieneusi pouco comum

(Peru16) identificado em porcos da Indía que coabitavam no mesmo agregado familiar.

A singularidade genética do parasita, a sua elevada ocorrência em outros animais da

mesma espécie na comunidade, bem como ausência de infecção noutras crianças da

comunidade sugerem a possibilidade de transmissão zoonótica deste microsporídio

[Cama et al. 2007].

8.3.3. Transmissão hídrica

Na população humana, estima-se que as doenças infecciosas sejam responsáveis

por aproximadamente 26% de mortalidade e 31% de morbilidade. A água desempenha

um papel fundamental na transmissão de um número significativo destas doenças. Os

surtos epidémicos devido a contaminação dos sistemas de abastecimento de água

comunitários ocorrem globalmente e têm o potencial de causar doença num vasto

número de consumidores. Estes surtos têm consequências económicas que vão para

além dos custos inerentes aos cuidados médicos das pessoas afectadas, ao provocar

perda de confiança na qualidade da água potável e na indústria da água em geral

[Cotruvo et al. 2004].

Nos últimos anos, verificou-se que grande parte destas doenças é provocada por

agentes patogénicos emergentes ou reemergentes. Uma doença infecciosa é considerada

emergente se ocorrer pela primeira vez numa população humana ou animal ou se já tiver

ocorrido previamente mas estiver a aumentar a incidência ou a expandir para outras

áreas geográficas. A emergência de doenças infecciosas é um processo complexo,

envolvendo um conjunto de factores biológicos, sociais e ecológicos. Entre os factores

identificados [Lederberg et al. 1992] contam-se: a vulnerabilidade humana, as

alterações climáticas, as alterações dos ecossistemas, a densidade demográfica, o


- 97 -

comportamento humano, a tecnologia e a indústria, o comércio e o turismo, bem como o

avanço dos conhecimentos científicos. Pelo menos 325 surtos de doenças provocadas

por protozoários foram associados à contaminação da água de consumo [Cotruvo et al.

2004][Cotruvo, 2004 TH]. Em países industrializados, os organismos pertencentes aos

géneros Cryptosporidium e Giardia são descritos como os protozoários mais comuns

transmitidos pela água.

A capacidade de transmissão de agentes infecciosos ao Homem pelo ambiente é

influenciada por múltiplos factores. Assim, a carga de microrganismos que passa para o

ambiente depende da prevalência da infecção na população humana ou animal, da

concentração do agente nas fezes ou urina e da duração do período de eliminação das

formas infectantes pelo hospedeiro. Uma vez no ambiente, vários pontos críticos podem

afectar a capacidade de transmissão do agente ao Homem. A sobrevivência do

organismo no ambiente é decisiva para a sua transmissão. Quanto maior for o tempo de

sobrevivência, maiores serão as oportunidades do agente entrar em contacto com um

hospedeiro susceptível. O tempo de sobrevivência na água depende de diversos factores

físicos (pH, temperatura, exposição solar), bem como das características intrínsecas do

microrganismo, podendo variar de horas a anos. No caso dos microsporídios, as

características destes parasitas, torna-os extremamente aptos a sobreviver no ambiente e

a serem disseminados pela água. As suas formas de transmissão, os esporos, são

imediatamente infecciosas após excretadas para o exterior. Os esporos são resistentes a

condições ambientais desfavoráveis e a processos de tratamento de águas. As suas

reduzidas dimensões e baixa densidade, potenciam a sua disseminação pela água [Didier

et al. 2004].

O elemento principal no processo de transmissão é a dose infecciosa, ou seja, o

grau de exposição necessário para transmitir a infecção. No caso dos microsporidios,

parece ser baixa, a dose considerada infecciosa, para os mamíferos [Franzen & Muller

1999a]. A inoculação com apenas 100 esporos pode vausar doença leteal em ratinhos

atímicos [Schmidt & Shadduck 1983].

Recentemente, diversos estudos epidemiológicos descrevem o contacto com a

água como um factor de risco associado à microsporidiose humana [Hutin et al. 1998;

Didier et al. 2004]. Estas observações conduziram à inclusão dos microsporídios pelo

Instituto de Defesa da Saúde (NIH) dos EUA na categoria B da lista de agentes de


- 98 -

biodefesa e lista de candidatos contaminantes da agência de protecção ambiental dos

EUA [U.S.Environmental Protection Agengy (EPA) 1998; Didier 2005] justificando a

actual preocupação da ocorrência de transmissão hídrica.

Diversas espécies de microsporídios, entre as quais E. bieneusi E. intestinalis, A.

algerae, Nosema spp., Pleistophora spp. e V. corneae foram já descritas em lençóis

subterrâneas, águas superficiais, esgotos, efluentes terciários, canais de escoamento

[Avery & Undeen 1987] e água para rega de culturas agrícolas [Sparfel et al. 1997;

Dowd et al. 1998; Fournier et al. 2002; Dowd et al. 2003; Didier et al. 2004; Coupe et

al. 2006; Donovan et al. 2008], e existe o registo de um presumível surto de origem

hídrica [Cotte et al. 1999]. Parece também haver uma associação entre os microsporidia

e a transmissão por alimentos irrigados com água contaminada. Foram identificados

microsporídios em alfaces, salsa, coentros e morangos, na Costa Rica [Calvo et al.

2004].

A identificação dos parasitas na água superficial e subterrânea permite tirar

conclusões sobre o grau de contaminação ambiental e possíveis fontes de contaminação.

Na água de consumo público, a pesquisa destes agentes é fundamental para avaliar a

eficácia do tratamento utilizado e consequente risco para a Saúde Pública Humana e

Animal.

8.3.4. Transmissão através de alimentos contaminados

Os microsporídios encontram-se entre os parasitas, cuja transmissão através de

alimentos contaminados, suscita alguma preocupação, em resultado de diversos

factores, onde se salienta, a globalização (traduzindo-se num elevado trafego

internacional de mercadorias e pessoas, provenientes de áreas endémicas), e alterações

nos padrões de consumo de alimentos [Slifko et al. 2000; Orlandi et al. 2002].

A microsporidiose humana, causada por espécies menos comuns, como os

microsporídios pertencentes ao género Pleistophora e semelhantes, pode, apenas,

resultar duma exposição acidental, por exemplo através da ingestão de peixe, mal

cozinhado, principalmente se este fenómeno ocorrer num imunodeficiente. Esta

hipótese surge das observações de McDougall e colaboradores [McDougall et al. 1993],

num doente com sida, que apresentava diarreia crónica e excretava esporos de


- 99 -

microsporídios nas fezes. Exames detalhados das amostras fecais, revelaram que estes

esporos localizavam-se em restos de fibras musculares (provavelmente de peixe).

Num estudo, mais recente, a ingestão de carne mal cozida, pelo menos, uma vez

por mês, foi associada a microsporidiose, em doentes infectados por VIH [Hutin et al.

1998]. Outro autor, identificou E. bieneusi em suínos, destinados ao consumo público,

sugerindo a possibilidade de transmissão do parasita através da ingestão desta carne

crua ou mal cozida [Buckholt et al. 2002].

Estudos moleculares e filogenéticos permitiram inferir que determinados

microsporídios com semelhanças genéticas a Pleistophora spp., que habitualmente

parasitam peixes e insectos, haviam sido identificados como causa de infecção no

Homem [Chupp et al. 1993; Vavra et al. 1998]. A espécie T. hominis,

morfologicamente semelhante a Pleistophora, foi identificada como causa de miosite,

num doente com sida [Field et al. 1996].

A detecção de E. intestinalis, em água usada para irrigação de produtos

hortícolas para consumo [Thurston-Enriquez et al. 2002], adiciona evidências

circunstanciais, que suportam a possibilidade de transmissão de microsporídios via

alimentos contaminados.

8.3.5. Transmissão aérea

Este tipo de transmissão, tem sido indicado por vários autores, como o mais

provável em alguns casos de infecção por E. hellem e por E. cuniculi. A ocorrência de

infecções nas vias respiratórias superiores e inferiores, sugere que a transmissão se

possa dar por esta via, através de poeiras contaminadas por microsporídios. Por outro

lado, os primeiros sintomas de muitas infecções por Encephalitozoon spp., surgem

devido a patologia das fossas e seios nasais, apontando para que nestes casos, a porta de

entrada seja a mucosa das vias respiratórias superiores [Bryan & Schwartz 1999];

[Weber et al. 1999b].

Outro indício de transmissão aérea, resultou da primeira autópsia completa

realizada a um doente com sida e microsporidiose disseminada. O doente apresentava

um largo número de microsporídios, da espécie E. hellem, ao longo de todo o tecido


- 100 -

epitelial da árvore traqueobrônquica, sugerindo que a via de transmissão tivesse sido a

aérea [Schwartz et al. 1992].

8.3.6. Transmissão por vectores (insectos)

Um pouco vaga é a possibilidade de transmissão da microsporidiose ao Homem,

através da picada de insectos. Os artrópodes são os hospedeiros mais comuns dos

microsporídios, tendo sido já identificados em carraças, pulgas e mosquitos, embora

nenhum destes parasitas, tenha sido registado nos humanos. Infecções experimentais

com a espécie A. algerae, um microsporídio parasita de mosquitos, foram

desenvolvidas, em ratinhos imunocomprometidos [Trammer et al., 1997]. Os resultados

destes estudos indicaram que o crescimento deste parasita estava limitado por

temperaturas abaixo de 37ºC. Desde então, contudo, A. algerae foi identificada, e

isolada da córnea de um doente imunocompetente, e colocada em crescimento em meio

de cultura a 37ºC [Moura et al. 1999a; Lowman et al. 2000]. Subsequentemente,

Koudela (2001), verificou que após a aplicação de esporos de A. algerae, nos olhos de

ratinhos SCID apesar de não se verificarem sinais clínicos no local de inoculação, eram

observadas infecções no baço e no fígado, 60 dias após a inoculação [Koudela et al.

2001].

A descrição de um caso de miosite por A. algerae, num doente com diabetes e

artrite reumatóide, veio demonstrar que este organismo pode causar patologia severa no

homem [Coyle et al. 2004].

Evidencias adicionais à transmissão de microsporídios por vectores, surgiram

com a capacidade de transmitir T. hominis a mosquitos (Anopheles quadrimaculatus e

Culex quinquefasciatus), que desenvolveram infecção [Weidner et al. 1999]. Dado que,

foram recuperados esporos do proventrículo e ceco do intestino do insecto, os autores

sugerem, que poderão ser transferidos para um hospedeiro mamífero, durante a refeição

sanguínea. A picada de abelhas, vespas, e zamgões foram descritos, num estudo

epidemiológico, como factores de risco associados a microsporidiose, em doentes

infectados por VIH [Dascomb et al. 2000].

A identificação de microsporídios, numa colónia de mosquitos de Anopheles

stephensi, com 99% e 97% de homologia na sequência da 16S rRNA com as espécies


- 101 -

geneticamente semelhantes Vavraia culicis (parasita de mosquitos) e T. hominis

(espécie apenas identificada no Homem), respectivamente, são pequenas evidências que

se vêm juntar à hipótese de que os casos exporádicos de infecção humana por espécies

pouco frequentes, tais como os reportados para T. hominis possam ser resultado de

transmissão por vectores [Lobo et al. 2006a].

Outros protozoários parasitas, tais como Leishmania spp., Plasmodium spp. ou

Trypanosoma spp., são transmitidos pela picada de insectos poiquilotérmicos aos

humanos homeotérmicos, não sendo, portanto, de descartar a hipótese dos

microsporídios também o serem [Curry, A., 1999].

9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR

- 102 -

9. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR

A epidemiologia molecular é, actualmente, considerada como um ramo da

epidemiologia que, através de técnicas de biologia molecular, proporciona um melhor

conhecimento das doenças, não só ao nível da caracterização dos agentes que estão na

sua origem, mas, também, da sua ecologia e dinâmica da transmissão [Thompson et al.

1998].

Antes da utilização destas novas técnicas, a caracterização dos microsporídios

era resultante de observações microscópicas da morfologia e ultraestrutura dos esporos

e/ou formas de desenvolvimento endógeno, da constatação do hospedeiro em que eram

encontrados e de estudos de infecção experimental. Porém, os conhecimentos

disponíveis sobre estes parasitas sofreram um progresso significativo, após a aplicação

das técnicas de biologia molecular, sobretudo as baseadas na reacção de PCR, ao estudo

da sua epidemiologia. Na verdade, o advento da biologia molecular, introduziu novas

técnicas, bastante discriminatórias, que permitem a identificação exacta da espécie e

genótipo dos microsporídios.

Esta metodologia tem-se revelado bastante promissora, esperando-se que possa

trazer algum esclarecimento a questões importantes como: i) a variabilidade entre os

microsporídios; ii) a estrutura populacional e a taxonomia deste grupo; iii) a definição

dos parasitas capazes de causar infecção humana; iv) a identificação das fontes de

contaminação e de infecção para o Homem; v) a caracterização da dinâmica da

transmissão da infecção em diferentes comunidades e situações; vi) a importância, para

a saúde pública, da presença de esporos em água de consumo e de recreio; vii) a

patogenicidade e virulência apresentadas pelas diferentes espécies/genótipos que

provocam doença humana.

9.1. IDENTIFICAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENTEROCYTOZOON BIENEUSI.

Actualmente os genótipos de E. bieneusi baseiam-se na heterogeneidade da

região ITS (243pb) do gene do rRNA [Mathis et al. 2005]. Nesta espécie a região ITS

apresenta um elevado grau de polimorfismo. A caracterização genotipica dos isolados

de E. bieneusi permite clarificar a dinâmica das infecções por este microsporídio, nas


- 103 -

diferentes populações humanas e animais. Apenas uma proporção dos genótipos

descritos foram exclusivamente isolados do Homem; diversos genótipos foram

identificados, quer em humanos, quer noutros animais, sugerindo o potencial zoonótico

deste parasita, assim como um possível grau de especificidade de hospedeiro de alguns

genótipos [Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. Foram, também, reconhecidas

diferenças na prevalência de diversos genótipos entre doentes seropositivos e

seronegativos para VIH [Liguory et al. 2001]. Com base na análise dos 243pb da região

ITS, encontram-se descritos 81 genótipos: 26 dos quais identificados exclusivamente

em humanos, oito em humanos e outros hospedeiros, 27 exclusivamente identificados

em gado bovino e suíno, seis exclusivemente detectados em cães e gatos, e 14 em

diversos grupos de hospedeiros [Santin & Fayer 2009]. Nos Quadros XII, XIII, XIV,

XVe XVI, encontram-se os genótipos descritos, incluindo informação do hospedeiro,

nome e referência.


- 104 -

Quadro XII. Genótipos de E. bieneusi caracterizados pela sequência da região ITS

rRNA, decritos no Homem. Adaptado de [Santin & Fayer 2009]

aDados não publicados; bGenotipo Q com 245 pb; cGenotipos Peru11 e Peru12 difererem de um nucleotido na posição 3 na SSU

rRNA (G vs. A).

Quadro XIII. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela região ITS e

descritos em animais de companhia (cães e gatos). Adaptado de [Santin & Fayer 2009].

anão foi atribuido nome ao genótipo correspondente a este número de acesso, nem no GenBank, nem em nenhuma publicação.

Hospedeiro Nome Original do Genótipo

(código de acesso ao GenBank)

Sinónimo (código de

acesso ao GenBank) Ref.

Homem A (AF101197, AY168419a, AY357185–AY357204, DQ683750 e DQ683753)

Peru1 (AY371276) [Rinder et al. 1997; Katzwinkel-Wladarsch et al. 1997; Sulaiman

et al. 2003a; Leelayoova et al. 2005; Breton et al. 2007]

B (AF101198 e DQ683754) Type I (AF242475) [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998; Breton et al. 2007]

C (AF101199) Type II (AF242476) [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998]

Q (AF267147) b [Rinder et al. 2000] R (AY945808) [Leelayoova et al. 2006] S (AY945809) [Leelayoova et al. 2006] T (AY945810) [Leelayoova et al. 2006] U (AY945811) [Leelayoova et al. 2006] V (AY945812) [Leelayoova et al. 2006] W (AY945813) [Leelayoova et al. 2006] Type III (AF242477) [Liguory et al. 1998] Type V (AF242479) [Liguory et al. 1998] Peru3 (AY371278) [Sulaiman et al. 2003a] Peru7 (AY371282) [Sulaiman et al. 2003a] Peru8 (AY371283) [Sulaiman et al. 2003a] Peru11 (AY371286) Peru12 (EF014428a)c [Sulaiman et al. 2003a] Peru13 (EF014429)a Peru15 (EF014431)a CAF1 (DQ683746) [Breton et al. 2007] CAF2 (DQ683747) [Breton et al. 2007] CAF3 (DQ683748) [Breton et al. 2007] CAF4 (DQ683749 e DQ683757) [Breton et al. 2007] HAN1 (EF458627) [Espern et al. 2007] NIA1 (EF458628) [Espern et al. 2007] UG2145 (AF502396) [Tumwine et al. 2002] Genotype 17 (EU140500)a

Hospedeiro Nome Original do Genótipo (código de acesso

ao GenBank)

Sinónimo (código de

acesso ao GenBank) Ref.

Gatos L (AF267142) [Dengjel et al. 2001]

PtEb IV (DQ885580) [Lobo et al. 2006c]

PtEb VIII (DQ885584) [Lobo et al. 2006a]

D-like (DQ836345) [Santin et al. 2006]

AF118144a [Mathis et al. 1999a]

Cães PtEb IX (DQ885585, AF059610, e EU650273) [Mathis et al. 1999a; Lobo et al. 2006c;

Santin et al. 2008]


- 105 -

Quadro XIV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da

região ITS rRNA, descritos no Homem e outros animais. Adaptado de [Santin & Fayer

2009].



Sinónimo (código de acesso ao

GenBank) Ref.

Homem, castor, raposa, rato-almíscarado, e guaxinin.

WL15 (AY237223)a WL16 (AY237224) Peru14 (EF014430b)

[Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b]

Homem, castor, ruminantes, cães, falcões, raposa, primata não humano, rato-almíscarado, suínos e guaxinin.

D (AF101200, DQ793213, DQ683751, DQ683755, e AF023245c)

PigITS9 (AF348477) WL8 (AY237216) Peru9 (AY371284) PtEb VI (DQ885582) CEbC (EF139197)

[Rinder et al. 1998b; Chalifoux et al. 2000; Buckholt et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b; Lobo et al. 2006c; Breton et al. 2007; Lee 2007; Muller et al. 2008]

Homem, aves, ruminantes, cães.

Peru6 (AY371281 e DQ154137)

PtEbI (DQ425107) PtEb VII (DQ885583)

[Sulaiman et al. 2003a; Santin et al. 2005; Lobo et al. 2006b; Lobo et al. 2006c]

Homem, castor, raposa, rato-almíscarado, lontra, suínos e guaxinin.

EbpC (AF076042 e U61180c)

E (AF135832)d WL13 (AY237221) WL17 (AY237225) Peru4 (AY371279)

[Breitenmoser et al. 1999; Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b]

Homem, e gatos. Peru10 (AY371285 e DQ836342) [Sulaiman et al. 2003a]Santı´n et al. (2006),

Homem e porquinhos-da-índia. Peru16 (EF014427) Cama et al. (2007)

Homem, gatos, cães, e raposa. WL11 (AY237219) Peru5 (AY371280, DQ836344, e

EU650271) [Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b; Santin et al. 2006; Santin et al. 2008]

Homem, gatos, ruminantes, e cães. Type IV (AF242478)

K (AF267141, DQ836343, DQ683752, DQ683756,e EU650272) Peru2 (AY371277) PtEb III (DQ885579) BEB5 (AY331009) BEB5-var (AY331010b)e

[Liguory et al. 1998; Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c; Breton

et al. 2007; Santin et al. 2008]


- 106 -

Quadro XV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da

região ITS rRNA e descritos em diversos grupos de hospedeiros. Adaptado de [Santin &

Fayer 2009].



Sinónimo (código de acesso

ao GenBank) Ref.

Castor WL7 (AY237215) [Sulaiman et al. 2003b] WL9 (AY237217) [Sulaiman et al. 2003b]

Aves PtEb II (DQ425108) [Lobo et al. 2006b]

Cavalo de Tróia PtEb V (DQ885581) [Lobo et al. 2006c] Lama P (AF267146) [Dengjel et al. 2001] Saguim PtEb XII (DQ885588) [Lobo et al. 2006c] Rato-almíscarado WL4 (AY237212) WL5 (AY237213)a [Sulaiman et al. 2003b] WL6 (AY237214) [Sulaiman et al. 2003b] WL10 (AY237218) [Sulaiman et al. 2003b] WL14 (AY237222) [Sulaiman et al. 2003b] Guaxinin WL2 (AY237210) [Sulaiman et al. 2003b] WL3 (AY237211) [Sulaiman et al. 2003b] Castor e lontras WL12 (AY237220) [Sulaiman et al. 2003b]

aGenótipos WL4 and WL5 tdiferem num nuclótido na posição 29 , na subunidade grande do gene rRNA (G vs. T). Quadro XVI. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da

região ITS rRNA e descritos em gado bovino e suínos. Adaptado de [Santin & Fayer

2009].



Sinónimo (código de acesso ao

GenBank) Ref.

Bovinos I (AF135836) BEB2 (AY331006) CEbE (EF139199) [Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004; Lee 2007]

J (AF135837) BEB1 (AY331005) PtEb X (DQ885586) CEbB (EF139196)

[Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004; Lobo et al. 2006c; Lee 2007]

M (AF267143) [Dengjel et al. 2001] N (AF267144) [Dengjel et al. 2001] PtEb XI (DQ885587) [Lobo et al. 2006c] BEB3 (AY331007) [Sulaiman et al. 2004] BEB4 (AY331008) [Sulaiman et al. 2004] BEB6 (EU153584) [Fayer et al. 2007] BEB7 (EU153585) [Fayer et al. 2007] CEbA (EF139195) [Lee 2007] CEbD (EF139198) [Lee 2007] CEbF (EF139194) [Lee 2007] 4948 FL-2 2004 (DQ154136) [Santin et al. 2005] Suínos EbpB (AF076041) [Breitenmoser et al. 1999] EbpD (AF076043) [Rinder et al. 2000] G (AF135834) [Rinder et al. 2000] H (AF135835) [Dengjel et al. 2001] O (AF267145) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS1 (AF348469) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS2 (AF348470) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS3 (AF348471) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS4 (AF348472) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS5 (AF348473) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS6 (AF348474) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS7 (AF348475) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS8 (AF348476) [Buckholt et al. 2002] Bovinos e suínos EbpA (AF076040) F (AF135833) [Breitenmoser et al. 1999; Rinder et al. 2000]


- 107 -

9.2. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON CUNICULI

Em 1995 [Didier et al. 1995b], a descoberta de três estirpes de E. cuniculi

através de métodos imunológicos e moleculares, não só veio permitir elucidar a situação

epidemiológica das infecções por esta espécie, em diferentes hospedeiros, e em

diferentes áreas geográficas, mas veio concumitantemente, reforçar o carácter zoonótico

de E. cuniculi.

A genotipagem da região ITS, de isolados de E. cuniculi de vários hospedeiros,

permitiu diferenciar três estirpes, que se distinguem pelo número de repetições da

sequência 5’-GTTT-3’, presentes na região ITS do gene rDNA, e que constitui um

marcador genético fiável e largamente aplicado. A estirpe I (“estirpe coelho”) tem três

repetições de GTTT, a estirpe II (“estirpe rato”) duas repetições GTTT e a estirpe III

(“estirpe cão”) tem quatro repetições de GTTT [Didier et al. 1995b]. Como se pode

verificar no Quadro XVII, no Homem estão descritas infecções pelas estirpes I e III,

também identificadas noutros hospedeiros. Este aspecto sugere o potencial zoonótico

destas estirpes.

Quadro XVII. Hospedeiros e distribuição geográfica das estirpes de E. cuniculi.

Adaptado de [Mathis et al. 2005].

E. CUNICULI

A HOSPEDEIRO ÁREA GEOGRÁFICA (Nº DE ISOLADOS) REF.

Estirpe I coelho Suíça (21), EUA (3), Alemanha (1), Austrália (1), Itália (1), Japão (1)

[Didier et al. 1995b][Katiyar et al. 1995; Mathis et al. 1997; Furuya 2002; Mathis et al. 2005]

Homem Suíça (6), Itália (1), EUA (1)

Estirpe II Rato República Checa (1), Reino Unido (1), EUA (1)

[Weber et al. 1997; Rossi et

al. 1998; Dengjel et al. 2001; Xiao et al. 2001c]

Ratazana-de-água Suíça (1) [Didier et al. 1995b; Xiao et

al., 2001c] Raposa ártica Noruega (8), Filândia (1) [Muller-Doblies et al. 2002] Estirpe III Homem EUA (2), México (1), Reino Unido (1) [Mathis et al. 1996; Akerstedt

et al. 2002] Cão EUA (10), África do Sul (1) [Snowden et al. 1999; Didier

et al. 1995b; Hollister et al. 1996a]

Saguim cabeça-de-algodão Suiça-Zoo (1) a determinada pelo número de repetições 5’-GTTT-3’ na sequência ITS

Posteriormente, uma análise multilocus gerou novos marcadores para as três

estirpes [Xiao et al. 2001b], nomeadamente com base nos genes que codificam para a


- 108 -

proteína do tubo polar (PTP) [Delbac et al. 1998] e para a proteína da parede do esporo

1 (SWP1) [Bohne et al. 2000]. Os isolados de E. cuniculi dividem-se entre três a cinco

genótipos com base no número de sequências repetidas nos genes ITS, PTP (quatro

copias de repetições com 78-pb) e SWP (cinco cópias de repetições com 15-pb e cinco

cópias de repetições com 36-pb).

9.3. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON HELLEM

A caracterização genética das estirpes de E. hellem, com recurso às sequências

do rDNA (ITS; SSU rRNA; regiões espaçadoras intergénicas (IGS) TH e HZ9 (IGS, da

sigla anglo-saxónica intergenic spacer) e do gene que codifica a PTP, revelou existir

diversidade intra-específica [Mathis et al. 1999b; Xiao et al. 2001a; del et al. 2001b;

Xiao et al. 2001b; Haro et al. 2003].

Inicialmente, Mathis e colaboradores, descreveram três genótipos caracterizados

com base na sequência ITS rRNA, cujas diferenças são resultado de pequenas inserções

ou delecções ou ainda de mutações pontuais [Mathis et al. 1999b]. No entanto estes

autores, haviam já verificado não existir uma correspondência total entre estes genótipos

e os perfis antigénicos, sugerindo este facto, que a variabilidade genética real de E.

hellem deveria ser maior.

Encontram-se descritos entre quatro a seis genótipos com base no número de

sequências repetidas nos genes SSU rRNA, ITS e PTP. A região PTP, foi considerada o

marcador genético com maior capacidade discriminatória para E. hellem. Dependendo

de a sequência PTP conter apenas uma repetição tipo-60pb ou a repetição tipo-60pb

mais uma tipo-66pb, são descritas duas famílias alélicas: 1 (1A, 1C ou 1D) e a 2 (2B ou

2C), respectivamente. A classificação de alelos em duas famílias proposta por Xiao e

colaboradores, é útil na genotipagem de E. hellem, dado que a presença ou ausência das

unidades 66pb são fáceis de identificar [Xiao et al. 2001a].

9.4. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS

Até à data, e ao contrário do que se verifica com as outras espécies do género

Encepahlitozoon, em que foram identificados genótipos, com diferenças na sua biologia

e epidemiologia, não foi possível caracterizar, nos estudos efectuados, qualquer


- 109 -

diversidade genética em E. intestinalis, com base nas regiões do rRNA. A análise, de

cinco isolados, em humanos, obtidas por electroforese em gel de poliacrilamida- dodecil

sulfato de sódio, revelou apenas pequenas variações nos seus perfis [del et al. 1998].

Através de electroforese em gel de campo-pulsado, não foram detectadas diferenças nos

cariótipos de isolados de E. intestinalis [Biderre et al. 1999a], enquanto nos isolados de

E. cuniculi e E. hellem observou-se uma variabilidade intraespecífica considerável

[Sobottka et al. 1999; Biderre et al. 1999a; Biderre et al. 1999b; Delarbre et al. 2001].

Também não foi descrita qualquer variação nas regiões ITS de E. intestinalis [Didier et

al. 1996b; Liguory et al. 2000].

Estudos futuros tendo por objectivos a determinação de fontes de infecção dos

microsporídios, a capacidade de previsão da gama de hospedeiros e do potencial

patogénico de determinado isolado, necessitam da identificação e aplicação de novos

marcadores genéticos e da comparação entre os isolados detectados pelos diversos

marcadores e avaliar a correpondência (a existir) entre a informação obtida, por

exemplo, pela análise da região ITS e da obtida com os potenciais novos marcadores.

Na verdade, novos grupos de marcadores genéticos seriam muito úteis na avaliação e

estabelecimento das relações epidemiológicas entre os diversos genótipos, da espécie E.

bieneusi. Não se pode assumir, pelo facto de se encontrar a mesma sequência ITS, em

diferentes estudos, que determinados isolados são idênticos geneticamente. Na verdade,

a interpretação de um mapa filogenético, com base na análise de um único locus, deve

ser sempre efectuada com prudência, visto que pode não ser representativa de todo o

genoma do parasita [ten Hove et al. 2009].

Não restam dúvidas, que com a contribuição de mais e melhores tecnologias de

abordagem ao diagnóstico, e da epidemiologia molecular, haverá uma clarificação dos

modos de transmissão e dos factores de risco associados à microsporidiose, os quais,

por sua vez, conduzirão ao desenvolvimento e aplicação de potenciais estratégias de

prevenção deste grupo de patologias.


- 110 -

- Segunda parte –

CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DE MICROSPORIDIOSE

EM PORTUGAL

CapítuloI

Objectivos Gerais

I. OBJECTIVOS GERAIS

- 114 -

A realização do trabalho apresentado nesta dissertação foi motivada pela escassa

informação existente acerca da epidemiologia e da transmissão da microsporidiose

humana em Portugal, em especial, sobre as espécies e genótipos de microsporidia que

infectam o Homem e outros animais e sobre os potenciais reservatórios da infecção

humana. Assim, os objectivos que nos propusemos atingir foram os seguintes:

1. Determinar a prevalência de infecção por microsporidiaem humanos, animais e

ambiente (água de consumo público) em Portugal.

2. Determinar as espécies de microsporidia responsáveis pela infecção nos

seropositivos para VIH e na população de imunocompetentes em Portugal.

3. Identificar animais potenciais reservatórios, nomeadamente os que se encontram

em estreito contacto com o Homem como é o caso dos animais de companhia,

aves de parques públicos, bem como fontes de infecção hídricas.

4. Seleccionar ou definir marcadores genotípicos das espécies de microsporidia

para caracterização dos isolados com diferentes origens, humana, animal e

ambiental; a genotipagem dos isolados do parasita permite monitorizar a sua

variação genética e determinar as fontes de infecção.

5. Avaliar a importância dos microsporídios para a Saúde Pública nos infectados

por VIH e em imunocompetentes, em Portugal. Este constitui um importante

objectivo na medida em que, no país, a pesquisa de microsporidia, não faz parte

do diagnóstico de rotina e a patogenicidade dos parasitas necessita de ser

clarificada, uma vez que são um grupo de parasitas oportunistas e emergentes.

6. Identificar factores de risco associados à infecção humana, através da análise dos

resultados obtidos e da sua relação com a informação epidemiológica e clínica

de cada doente.

7. Clarificar a epidemiologia das espécies e genótipos de microsporidia nos

humanos, nos animais e no ambiente, em Portugal.

Com o presente trabalho esperamos poder contribuir para um melhor

conhecimento da extensão e diversidade genética dos parasitas responsáveis pela

I. OBJECTIVOS GERAIS

- 115 -

microsporidiose humana, na população de seropositivos e seronegativos para VIH, no

nosso País. A identificação das espécies e genótipos de microsporidia em animais, pode

ser útil para determinar o seu potencial como fonte de contaminação ambiental e como

reservatório da infecção humana. A determinação da presença destes parasitas em

animais de companhia é importante para avaliar o seu papel como fonte de infecção

para o Homem e o risco que constituem, principalmente, para doentes com função

imunológica comprometida. Igualmente a detecção de microsporidia em água de

abastecimento é relevante para avaliar a possibilidade de transmissão hídrica destes

parasitas. A caracterização intra-específica de microsporidia, ao permitir maior

resolução da variabilidade genética dos isolados, pode contribuir para a clarificação do

papel desempenhado por cada modo de transmissão na epidemiologia da

microsporidiose humana e de animais de companhia, aves de parques públicos da

cidade de Lisboa, gado doméstico e animais silváticos de vida livre e em cativeiro,

nessa mesma transmissão, em Portugal.

- 116 -

CapítuloII

Material e Métodos

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 118 -

Com este trabalho pretendeu-se detectar por métodos parasitológicos e

moleculares e caracterizar por métodos moleculares a ocorrência das quatro principais

espécies de microsporidia patogénicas para o homem e de uma nova espécie

identificada em Portugal Vittaforma – like, na população humana e em diversos grupos

de animais. Para concretizar este propósito estabeleceram-se etapas que foram

sucessivamente realizadas e permitiram atingir os objectivos que a seguir se indicam:

1. Caracterização de população em estudo;

2. Processamento das amostras;

3. Detecção parasitológica;

4. Extracção do DNA das amostras;

5. Diagnóstico molecular de microsporidia;

6. Amplificação e sequenciação das regiões genómicas de interesse;

7. Análise e compilação dos dados clínicos recolhidos;

8. Respectiva integração dos resultados.

1. POPULAÇÃO ESTUDADA 1.1. POPULAÇÃO HUMANA

1.1.1. Amostras Fecais

Para este estudo, foram analisadas amostras fecais submetidas para diagnóstico de

parasitas intestinais, na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras

Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e provenientes, na sua

maioria, de diversos Hospitais da Região de Lisboa mas, também, de outros Hospitais

do País, nomeadamente, Setúbal, Beja e Faro. Todos os dados pessoais dos doentes

cujas amostras fecais foram estudadas, foram mantidos dentro da mais estricta

confidencialidade. A identificação do doente manteve-se desconhecida para a autora do

presente trabalho.

Para além das amostras fecais recolhidas, entre Janeiro de 2003 e Dezembro de

2009, foi efectuado o estudo retrospectivo da totalidade das amostras fecais,

correspondentes ao período entre Janeiro de 1999 e Dezembro de 2002, cuja recolha foi

anterior ao início do presente trabalho e, que se encontravam conservadas a 4ºC, em

dicromato de potássio (K2Cr2O7) a 5%.


- 119 -

Na totalidade foram estudadas 1989 amostras fecais de 856 doentes (adultos e

crianças) seropositivos e seronegativos para VIH. A percentagem de doentes

seropositivos para VIH estudados foi de 65,5% (561/856) e seronegativos para VIH foi

de 34,5% (295/856). Do total de doentes (586 do sexo masculino e 270 do sexo

feminino), 675 eram adultos e 181 crianças.

Todos os doentes analisados apresentavam sintomatologia gastrintestinal, 57,6%

(493/856) com diarreia e 42,4% (363/856) sem diarreia.

Nove dos 295 seronegativos para VIH (3,1%) apresentavam outras causas de

imunossupressão (cinco doentes submetidos a quimioterapia, um doente com

transplante de rim, um doente com imunodeficiência primária, um doente submetido a

terapêutica com corticosteróides e um infectado por vírus da hepatite C).

Todas as amostras fecais recolhidas foram submetidas a técnicas parasitológicas

e moleculares, para detecção de esporos e DNA de microsporídios. Os isolados dos

microsporídios identificados foram, posteriormente, caracterizados por meio de técnicas

de biologia molecular.

1.1.2. Amostras de Urina

Amostras de urina de 69 doentes, submetidas para diagnóstico de microsporidiose,

na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de

Higiene e Medicina Tropical, provenientes, na sua maioria, de diversos Hospitais da

Região de Lisboa assim como de outros Hospitais do País, nomeadamente, Setúbal,

Beja e Faro, foram incluídas neste estudo. Do total de amostras de urina analizado, 60

amostras haviam sido recolhidas antes do início do trabalho (Janeiro de 1999 e

Dezembro de 2002) e encontravam-se conservadas a 4ºC, e as restantes nove amostras

foram recolhidas durante o decurso deste trabalho e correspondem ao período entre

Janeiro de 2003 e Dezembro de 2005.

A maioria das amostras estudadas pertencia a doentes seropositivos para VIH

(85,5%; 59/69). Dez amostras de urina pertenciam a doentes seronegativos para VIH

(14,5%). As amostras correspondiam a 48 doentes (69,6%) do sexo masculino e a 21

doentes (30,4%) do sexo feminino, sendo que 44 (63,8%) eram adultos e 25 (36,2%)

crianças.


- 120 -

As amostras de urina incluídas neste trabalho foram submetidas a técnicas

parasitológicas e moleculares, para detecção de esporos/DNA de microsporídios. Os

isolados dos microsporídios identificados foram, posteriormente, caracterizados por

meio de técnicas de biologia molecular.

1.1.3. Secreções pulmonares

Para a pesquisa de microsporídios em secreções pulmonares, a população

escolhida, caracteriza-se por ser constituída por um grupo definido de doentes adultos,

seropositivos e seronegativos para VIH, com sintomatologia respiratória, provenientes

de dois hospitais da cidade de Lisboa. Das amostras de secreções pulmonares

submetidas para diagnóstico da pneumonia por Pneumocystis jirovecii, na Unidade de

Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e

Medicina Tropical, entre Janeiro de 1996 e Dezembro de 2008, foi escolhida, uma

amostra aleatória, englobando 200 secreções pulmonares. Todos os dados pessoais dos

doentes cujas amostras foram estudadas, foram mantidos dentro da mais estricta

confidencialidade mantendo-se desconhecida a identificação do doente para a autora do

presente trabalho.

Desta forma, nesta fase de identificação e caracterização de microsporídios,

considerados de interesse, foram analisadas 200 amostras correspondentes a 124

expectorações induzidas (EI) e 76 lavados broncoalveolares (LBA). As amostras

pertenciam a 150 doentes seropositivos para VIH (75%) e a 50 seronegativos para VIH

(25%). A percentagem de doentes do sexo masculino e do sexo feminino

correspondentes às amostras estudadas foi de 64,5% (129/200) e 35,5% (71/200),

respectivamente. A mediana de idades dos doentes foi de 33 anos, num intervalo de

idades de 9 meses a 83 anos.

Todas as amostras de secreções foram testadas através do diagnóstico

parasitológico e molecular.


- 121 -

1.2. POPULAÇÃO ANIMAL

O estudo da microsporidiose incidiu sobre diversas espécies de mamíferos e aves,

animais de companhia e silváticos. Na pesquisa de esporos e/ou na caracterização

genética das espécies de microsporídios envolvidas, foram aplicadas em paralelo as

técnicas parasitológicas e de biologia molecular, seleccionadas para este trabalho, a

todas as amostras fecais, à excepção das amostras fecais dos animais silváticos de vida

livre. As amostras fecais deste grupo só foram estudadas pelas técnicas de PCR. Neste

estudo, foram, também, incluídas amostras fecais de bovinos e de alguns animais

silváticos, cuja recolha antecedeu o início do presente trabalho.

No presente trabalho foram seleccionadas as seguintes populações de animais:

1.2.1. Cães e gatos

A população humana está largamente exposta à população canina e de felinos

nos meios rurais e urbanos. No cão, já foram identificadas espécies de microsporídios

patogénicos para o Homem (E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis), assim como no

gato. Estes animais podem assim, representar uma fonte de infecção destes

microrganismos, para o Homem.

O estudo sobre a microsporidiose, em animais de companhia, incidiu, sobre 116

cães e gatos. As amostras fecais de 66 animais com dono, nomeadamente, de oito cães e

58 gatos analizadas neste estudo foram recolhidas, no período compreendido entre

Janeiro de 2003 e Dezembro de 2005, com a colaboração de alguns Médicos

Veterinários e de particulares. Os animais estudados eram jovens e adultos, com e sem

diarreia.

Para além dos animais com dono, foram, ainda, recolhidas, entre Fevereiro e

Abril de 2004, amostras fecais de 50 cães errantes, nomeadamente de 10 albergados no

Canil Municipal de Torres Vedras e de 40 acolhidos no Canil Municipal de Lisboa. As

amostras pertenciam a animais jovens e adultos. Apenas dois animais com idade inferior

a dois meses e um adulto apresentavam diarreia.


- 122 -

1.2.2. Gado bovino de explorações leiteiras

O estudo retrospectivo da pesquisa de microsporídios foi efectuado em 100 amostras

fecais, seleccionadas aliatóriamente, de bovinos, provenientes de explorações leiteiras

de várias regiões de Portugal (Alto Alentejo-Montemor-o-Novo: 60; Baixo Alentejo

Odemira: 6; Estremadura-Lourinhã, Pêro Pinheiro, Odivelas e Sintra: 34) e recolhidas

previamente ao início deste estudo, entre Janeiro de 1996 a Junho de 2002. As fezes

encontravam-se conservadas a 4ºC, em dicromato de potássio a 5%, na Unidade de

Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e

Medicina Tropical.

Destes 100 animais, 62 tinham menos de 38 dias de vida, três tinham entre 45 e 80

dias e um tinha quatro meses de idade. Não foi possível obter informação sobre a idade

dos restantes 34 animais.

1.2.3 Animais silváticos em cativeiro

O estudo retrospectivo em animais silváticos de cativeiro foi efectuado em

amostras fecais recolhidas, previamente ao início do presente trabalho, entre o período

compreendido entre Abril de 2002 e Fevereiro de 2003. O estudo incluiu, amostras

fecais de 103 animais, correspondentes, respectivamente, a 75 espécies de mamíferos, 9

espécies de répteis e 9 espécies de aves cativas no Jardim Zoológico de Lisboa. Sempre

que possível, a recolha das amostras fecais dos mamíferos foi efectuada mensalmente.

No caso dos répteis, as amostras foram recolhidas nos meses de Abril e Junho de 2002 e

de Janeiro e Fevereiro de 2003. As amostras fecais das aves foram recolhidas uma única

vez, no mês de Agosto de 2002. As amostras foram colhidas, pelos tratadores dos

animais, do solo, ao acaso, tendo sido dada preferência a fezes diarreicas, no caso de

elas existirem. Nos Quadros XVIII, XIX e XX encontram-se descritos os nomes

comuns e científicos de todos os animais estudados (mamíferos, aves e répteis). Com

excepção de duas crias de leão, todos os mamíferos estudados eram adultos e não

apresentavam sintomatologia gastrintestinal. Entre os répteis estudados, encontravam-se

animais jovens e adultos, sem evidência de diarreia.Todas as aves estudadas eram

adultas e não apresentavam sinais de diarreia.


- 123 -

Quadro XVIII. Mamíferos do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares para

identificação de microsporídios.

NOME COMUM (ESPÉCIE) Saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) Saguim cabeça de algodão (Saguinus oedipus oedipus) Porco (Sus scrofa) Saguim prateado (Callithrix argentata) Colobo Guerezza (Colobus guereza kikuyuensis) Hipopótamo pigmeu (Choeropsis liberiensis liberiensis) Lémure de cauda anelada (Lemur catta) Preguiça de dois dedos (Choloepus didactylus) Hipopótamo (Hippopotamus amphibius) Lémure de face branca (Lemur macaco albifrons) Lobo ibérico (Canis lupus signatus) Camelo (Camelus bactrianus bactrianus) Lémure preto (Lemur macaco macaco) Raposa (Vulpes vulpes silacea) Dromedário (Camelus dromedarius) Lémure mangusto (Lemur mongoz) Urso do Tibete (Selenarctos thibetanus) Lama (Lama glama glama) Chimpanzé (Pan troglodytes) Urso pardo (Ursus arctos) Axis (Cervus axis axis) Gorila (Gorilla gorilla gorilla) Chita (Acinonyx jubatus jubatus) Veado do Canadá (Cervus elaphus canadensis) Langur de Douc (Pygathrix nemaeus nemaeus) Lince ibérico (Felis lynx lynx) Veado da Birmânia (Cervus eldi thamin) Babuíno Hamadrias (Papio hamadryas hamadryas) Ocelote (Felis pardalis) Cabra (Capra hircus hircus) Babuíno da Guiné (Papio cynocephalus papio) Serval (Felis serval) Addax (Addax nasomaculatus) Mandril (Papio sphinx) Pantera nebulosa (Neofelis nebulosa) Impala de face negra (Aepyceros melampus petersi) Langur de Douc (Pygathrix nemaeus nemaeus) Leão de Angola (Panthera leo bleyenberghi) Muflão africano (Ammotragus lervia) Macaco Goeldi (Callimico goeldii) Jaguar (Panthera onca) Cervicapra (Antilope cervicapra) Macaco cauda de leão (Macaca silenus) Leopardo (Panthera pardus) Bisonte americano (Bison bison bison) Macaco do Japão (Macaca fuscata fuscata) Tigre da Sibéria (Panthera tigris altaica) Iaque (Bos mutus grunniens) Macaco de beiço branco (Cercopithecus cephus cephus) Tigre de Sumatra (Panthera tigris sumatrae) Gnu de cauda branca (Connochaetes gnou) Macaco Diana (Cercopithecus diana diana) Pantera das neves (Pantera uncia) Gnu azul (Connochaetes taurinus taurinus) Macaco mona (Cercopithecus mona) Elefante indiano (Elephas maximus indicus) Palanca ruana (Hippotragus equinus) Macaco de Brazza (Cercopithecus neglectus) Elefante africano (Loxodonta africana africana) Palanca negra (Hippotragus niger niger) Saguim de cabeça castanha (Saguinus fuscicollis) Zebra de Grevy (Equus grevyi) Búfalo africano (Syncerus caffer caffer) Saguim imperador (Saguinus imperator subgrisescens) Burro (Equus asinus) Pacaça (Syncerus caffer nanus) Saguim de beiço branco (Saguinus labiatus labiatus) Pónei (Equus caballus) Elande (Taurotragus oryx oryx) Saguim de mãos douradas (Saguinus midas midas) Rinoceronte branco (Ceratotherium simum simum) Cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros) Saguim de mãos negras (Saguinus midas niger) Rinoceronte indiano (Rhinoceros unicornis) Girafa de Angola (Giraffa camelopardalis angolensis)


- 124 -

Quadro XIX. Aves do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a

técnicas parasitológicas e moleculares para identificação de microsporídios.

NOME COMUM (ESPÉCIE)

Faisão Lady Amherst (Chrysolophus

amherstiae) Arara maracanã (Ara maracana)

Faisão dourado (Chrysolophus pictus) Jandaia ventre de fogo (Aratinga auricapilla

aurifrons) Pombo da fruta de ventre laranja (Ptilinopus

iozonus) Jandaia (Aratinga jandaya)

Pombo da fruta de garganta preta (Ptilinopus

leclancheri) Periquito dourado (Aratinga guarouba)

Pombo da fruta soberbo (Ptilinopus

superbus) Papagaio cabeça de falcão (Deroptyus accipitrinus

accipitrinus) Catatua pequena de crista amarela (Cacatua

sulphurea sulphurea) Papagaio eclectus (Eclectus roratus polychloros)

Catatua de Leadbeater (Cacatua leadbeateri) Marianinha de cabeça branca (Pionites leucogaster) Catatua galah (Elophus roseicapillus) Papagaio de bico grosso (Rhynchopsitta

pachyrhyncha) Papagaio chuão (Amazona dufresniana

rhodocorytha) Turaco da costa dourada (Tauraco corythaix persa)

Papagaio de face verde (Amazona

viridigenalis)

Quadro XX. Répteis do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a

técnicas parasitológicas e moleculares, para identificação de microsporídios.

NOME COMUM (ESPÉCIE)

Tartaruga panqueca (Malacochersus

tornieri) Sucuri amarela (Eunectes notaeus)

Tartaruga do Egipto (Testudo kleinmanni) Serpente rei de riscas (Lampropeltis alterna) Tartaruga espinhosa (Chelydra serpentina) Cobra preta (Naja melanoleuca) Dragão do Komodo (Varanus komodoensis) Naja indiana (Naja naja kaouthia) Jibóia de Cuba (Epicrates angulifer)

1.2.4. Animais silváticos de vida livre

O estudo sobre a presença de microsporídios em produtos biológicos de animais

silváticos de vida livre foi efectuado num grupo de 134 pequenos mamíferos

(insectívoros e roedores). Os pequenos mamíferos, foram capturados em Maio, Agosto

e Novembro de 2003, nos concelhos de Moura e Aljustrel, Baixo Alentejo. Foram

estudados 52 insectívoros, todos pertencentes à espécie Crocidura russula, vulgarmente


- 125 -

denominada musaranho de dentes brancos. Entre os roedores, encontravam-se 80

ratinhos ruivos (Mus spretus) e dois ratinhos do campo (Apodemus sylvaticus). Todos os

animais estudados eram adultos e nenhum deles apresentava diarreia. Dada a reduzida

quantidade de amostra fecal recolhida, por cada animal, optou-se por submeter as

amostras fecais apenas, às técnicas de biologia molecular, para detecção de

microsporidia.

1.2.5. Aves exóticas de gaiola e pombos urbanos

Como já foi referido, a maior parte dos casos descritos de microsporidiose em

aves, inclui os psitaciformes (papagaios, periquitos, inseparáveis, etc). Contudo, nos

anos mais recentes, foram descritos casos de infecção por E. hellem, noutros grupos de

aves, sugerindo, que esta espécie pode ser frequente nas aves. E. bieneusi e E.

intestinalis também foram reportadas em diversas espécies de aves. Assim,

seleccionaram-se para este estudo, dois grupos de aves, que contactam mais

directamente com o Homem: as aves de gaiola e os pombos urbanos (Columba livia var.

domestica). Do primeiro grupo, fazem parte os psitaciformes e os passeriformes, nos

quais já foi isolado E. hellem e E. bieneusi. As aves de gaiola, correspondem aquelas

aves que, habitualmente se adquirem nas lojas de animais de estimação. O segundo

grupo, os pombos urbanos, foi seleccionado, por se tratar de aves com grande

proliferação nos centros urbanos e de estarem associadas à transmissão de várias

doenças no Homem. Os pombos foram capturados na cidade de Lisboa.

Das 39 aves exóticas de gaiola estudadas, 31 (79,5%) pertenciam a um criador

de aves, da freguesia de Sarilhos Grandes, no concelho do Montijo e oito (20,5%)

pertenciam a agregados familiares, da região da grande Lisboa, que possuem estas aves

como animais de estimação. As espécies de aves exóticas pertencentes à Ordem

Psittaciformes foram as seguintes: Agapornis spp. (n=1); Agapornis fischeri (n=5);

Agapornis personatus (n=3); Agapornis roseicollis (n=4); Amazona aestiva (n=1);

Forpus coelestis (n=1); Forpus conspicilattus (n=1); Melopsittacus undulatus (n=4);

Nymphicus hollandicus (n=3); Platycercus eximius (n=1); Psittacus erithacus (n=8). As

espécies de aves pertencentes à Ordem Passeriforme foram as seguintes: Bathilda

ruficauda (n=1); Erythrura gouldiae (n=1); Leiothrix lutea (n=1); Lonchura domestica

(n=2); Padda oryzivora (n=1); Serinus canaria (n=1).


- 126 -

Quatro cadáveres da espécie Psittacus erithacus incluída na amostra, e com

origens diferentes, foram entregues para necrópsia após morte súbita na gaiola.

Dos 52 pombos urbanos estudados, 23 (44,2%) foram capturados na Praça do

Império (freguesia de Santa Maria de Belém) e 29 (55,8%) na Rua Epifânio Dias

(freguesia de São João de Brito). Os 52 cadáveres de pombos urbanos, foram entregues,

por elementos do Departamento de Higiene Urbana e Resíduos Sólidos da Câmara

Municipal de Lisboa, que regularmente procedem à captura de pombos, para controlo da

população columbícula.

Os produtos biológicos analisados foram os dejectos das aves (compostos pelas

excreções urinárias e fezes) recolhidos nas gaiolas, as zaragatoas da traqueia e o

conteúdo intestinal, colhidos durante o exame post mortem das aves. Os dejectos

colhidos nas gaiolas, devem ser considerados como amostras de grupo, uma vez que,

em cada gaiola, havia habitualmente, vários indivíduos da mesma espécie.

Os dejectos de aves, foram acondicionados em recipientes individuais de

plástico, estéreis, devidamente identificados. As amostras foram transportadas em sacos

isotérmicos, junto com acumuladores térmicos e armazenados a 4ºC.

1.3. AMOSTRAS AMBIENTAIS

Todas as amostras utilizadas neste trabalho (n=184) foram fornecidas pela Empresa

Portuguesa de Águas Livres (EPAL). As amostras correspondem a alíquotas de água

concentrada, recolhidas e analizadas pela EPAL, pelo método USEPA 1623 (método

desenvolvido pela Environmental Protection Agency- EPA, nos EUA, o qual baseia-se

na separação de oocistos de Cryptosporidium e quistos de Giardia através de partículas

imunomagnéticas revestidas por anticorpos monoclonais) para detecção de oocistos de

Cryptosporidium e quistos de Giardia e amostras de água concentrada sem qualquer

tratamento específico para separação de protozoários. A concentração das amostras de

água foi efectuada no local de colheita, por filtração de volumes variáveis de água, entre

nove e 300 litros.

Refira-se que as amostras de água analisadas pela técnica USEPA 1623,

enviadas pela EPAL, correspondem apenas a 1/3 (33 microlitros - μl) do volume obtido


- 127 -

após separação pelas particulas imunomagnéticas (100 μl), diluído num mililitro (ml) de

água destilada.

No que diz respeito à água concentrada por filtração, mas sem aplicação das

partículas imunomagnéticas, foram-nos enviadas amostras, não diluídas, de 2 ml,

retiradas de um volume inicial de 10 ml.

A recolha de 184 amostras de águas foi efectuada nas regiões do Ribatejo e na

Estremadura, em locais de amostragem envolvidos no processo conducente ao

abastecimento de água da cidade de Lisboa. O estudo envolveu amostras de água

tratada, provenientes de três Estações de Tratamento de Água (ETA), ETA1, ETA2,

ETA3 e reservatórios de água de abastecimento da cidade de Lisboa, bem como águas

não tratadas, obtidas nas captações superficiais de TR1 e CB2 e na captação subterrânea

de OA3.

A água captada em TR1 é tratada na ETA1.O processo de tratamento inicia-se

junto á captação, onde tem lugar a macrotamização e pré-cloragem I. Na ETA realizam-

se as seguintes fases: pré-cloragem II, condicionamento do pH, coagulação/floculação,

decantação, filtração, correcção de pH e pós-cloragem. Na ETA2 é tratada a água

captada na albufeira CB2. O tratamento compreende etapas de pré-cloragem,

remineralização e correcção de agressividade, coagulação, filtração, equilíbrio e ajuste

do pH e pós-cloragem. A água captada na nascente OA3 é tratada por um sistema de

ultra-violetas na ETA3.

O número de amostras de água utilizadas para este estudo, correspondem a:

1) 175 amostras processadas de acordo com o método 1623 da USEPA e purificados

por separação imunomagnética (IMS) (Dynabeads anti-Cryptosporidium kit, Dynal)

a) Água não tratada (n=69): 39 captações subterrâneas, 30 captações superficiais

b) Água tratada/ETA (n=106): 42 captações subterrâneas, 25 captações

superficiais, 39 de água de abastecimento.

2) Nove amostras de água superficial não tratada e sem IMS.

Em virtude da quantidade reduzida das alíquotas de água entregues as amostras

só foram submetidas aos protocolos de PCR seleccionados no presente trabalho.


- 128 -

1.4. DEFINIÇÃO DO CRITÉRIO DE POSITIVIDADE

A identificação dos microsporídios foi realizada, em paralelo, por duas técnicas:

coloração histoquímica Gram-chromotrope (GC) e PCR.

Uma amostra foi considerada positiva, quando obedecia aos seguintes critérios

de positividade:

1) positiva sempre que eram detectados esporos de microsporídios pela técnica

de coloração parasitológica, se confirmada por um dos protocolos de PCR

adoptados neste estudo;

2) positiva quando se conseguia detectar a presença de DNA de microsporídios

por uma das técnicas de PCR.

2. PROCESSAMENTO E CONCENTRAÇÃO DE AMOSTRAS FECAIS, URINA E

SECREÇÕES PULMONARES (EXPECTORAÇÃO INDUZIDA E LAVADOS

BRONCOALVEOLARES)

2.1. AMOSTRAS FECAIS

A pesquisa de microsporídios efectuou-se a partir de fracções de amostras, mais

precisamente em 0,5 g de fezes ou conteúdo intestinal. Para a concentração de esporos a

partir de amostras fecais ou de conteúdo intestinal, foi adoptado o método modificado

de sedimentação água/éter [Matos et al. 2002]. Num tubo de centrífuga cónico, com

capacidade de 12,0 ml, foi ressuspendida uma alíquota (0,5 g) de fezes, em 3,0 ml de

água desionizada. Após a adição de 3,0 ml de éter dietílico (C4H10O - Merck) e agitação

vigorosa no vortéx, a suspensão foi filtrada através de uma gaze para um novo tubo,

com a finalidade de remover os detritos fecais de maior dimensão. Uma vez completado

o volume final, com água desionizada, a amostra foi centrifugada a 400 g, durante

cinco minutos. Depois de desprezada a fase etérea, o sobrenadante foi retirado para um

tubo limpo, perfez-se o volume final com água desionizada e realizou-se nova

centrifugação, desta vez a 4.100 g, durante 10 minutos. O sedimento, originado na

primeira centrifugação, foi guardado, para posterior pesquisa de ovos, quistos e

parasitas. Após a segunda centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e, com o


- 129 -

sedimento resultante, prepararam-se esfregaços, em três lâminas tratadas com poli-L-

lisina.

Depois de secarem, à temperatura ambiente, um dos esfregaços era submetido à

técnica de coloração Gram-Chromotrope. As lâminas restantes foram conservadas a –

20ºC, para posterior estudo ou para confirmação de algum resultado, caso fosse

necessário. Ambos os sedimentos obtidos das duas centrifugações, foram reunidos num

mesmo eppendorf de 2 ml e conservados a 4ºC. Todas as centrifugações foram

efectuadas à temperatura ambiente. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a

uma técnica de extracção de DNA.

2.2. AMOSTRAS DE URINA

As amostras de urina, foram colhidas em recipientes estéreis e enviadas

imediatamente para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e

Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, onde se iniciou o seu

processamento. Da totalidade do líquido, retiraram-se, aproximadamente, 2,0 ml de

suspensão, procedendo-se à sua centrifugação a 1500 g, durante 10 min. O

sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspenso em 0,5 ml de soro

fisiológico. Uma gota, 20-30 l da amostra, foi aplicada com uma pipeta descartável,

em três lâminas, tratadas com poli-L-lisina com o cuidado de espalhar em círculo com

uma área de 15-20 mm de diâmetro, após o que eram deixadas a secar, à temperatura

ambiente. Uma das lâminas era utilizada para posterior observação pela técnica de

Gram-Chromotrope e as restantes foram conservadas a –20º C. O restante produto

tratado foi conservado a 4º C. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a uma

técnica de extracção de DNA.

2.3.SECREÇÕES PULMONARES

O presente estudo compreendeu amostras de secreções pulmonares enviadas

para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses,

do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, cujo objectivo principal, era o diagnóstico

da pneumocistose. Ao chegarem ao laboratório, as amostras de secreções pulmonares

(EI e LBA), foram identificadas e processadas de imediato. O material biológico foi


- 130 -

concentrado e dividido para procedimentos de diagnóstico e para posteriores estudos

moleculares. O protocolo de processamento, para os dois tipos de amostra, encontra-se

descrito abaixo:

2.3.1. Expectoração induzida (EI)

Com o objectivo de garantir uma boa higiene oral e uma hidratação adequada,

previamente à recolha das EI, todos os doentes respeitaram um período de jejum para

alimentos sólidos de 12 horas. A todos os doentes administrou-se uma solução salina

hipertónica a 1,8 %, durante 15 minutos, através de um nebulizador ultrassónico. As

amostras, obtidas por este processo, foram recolhidas em recipientes estéreis e enviadas

para o laboratório. Todos os procedimentos posteriores foram por nós executados.

O processamento das expectorações iniciou-se com a adição de um mucolítico, o

ditiotreitol 0,3 % (DTT; Sigma), às amostras, a 37º C, durante 30 minutos, com o

objectivo de solver e solubilizar as partículas e agregados de muco. A amostra liquefeita

foi transferida para um tubo de centrífuga, adicionou-se PBS, 150 mM, com pH 7,2

(SIGMA), até preencher o volume do tubo, levando-se a centrifugar a 4100 g, durante

20 minutos. O PBS comporta-se como um tampão estabilizante e a centrifugação serve

para concentrar os esporos de microsporídios que ficam no sedimento. O sobrenadante é

rejeitado, seguindo-se a ressuspensão do sedimento em 0,5 ml de PBS. Com a ajuda de

uma pipeta descartável, aplicou-se uma gota de cerca de 20-30 l da amostra, em três

lâminas de microscopia pré-tratadas com poli-L-lisina (vide Anexo ), que foi espalhada

em círculo de aproximadamente 10-15 mm de diâmetro. Deixou-se secar, à temperatura

ambiente (no interior de “hotte”), dividindo-se o restante volume da amostra para

microtubos de 1,5 ml.

As lâminas foram conservadas a –20º C, à excepção de uma em que o esfregaço

foi submetido à coloração pelo Gram-Chromotrope. A restante expectoração tratada foi

conservada a –80º C.

2.3.2. Lavado broncoalveolar (LBA)

O LBA foi obtido, após encravamento do fibroscópio no lobo médio do pulmão,

instilando 150 ml de soro fisiológico pré-aquecido a 37º C, dividido por três seringas de

50 ml, tendo sido aspirado suavemente. Todos os procedimentos prévios foram


- 131 -

efectuados por técnicos especializados. O produto obtido foi enviado, de imediato para

o laboratório.

O protocolo de preocessamento é bastante semelhante ao apresentado para as

amostras de EI, no entanto, como as amostras de LBA, normalmente, não apresentam

muco, iniciou-se o processamento transferindo a amostra directamente para um tubo de

centrífuga, perfazendo-se o volume do tubo com PBS e centrifugando-se a mistura

(4100 g). A partir deste ponto, o procedimento foi igual ao indicado para as amostras de

EI.

No final de ambos os procedimentos, uma lâmina de microscopia com o

esfregaço (material biológico concentrado) foi usada para efectuar a técnica de Gram-

Chromotrope (GC) e as restantes foram conservadas a -20ºC, para posterior estudo ou

para confirmação de algum resultado, caso seja necessário. Os tubos contendo a amostra

concentrada foram armazenados a -80ºC, de modo a conservar intacto todo o material

biológico.

2.4. OBTENÇÃO DO CONTEÚDO INTESTINAL E EXSUDADO TRAQUEAL POST MORTEM DE UM

GRUPO DE AVES.

As amostras de conteúdo intestinal e exsudado traqueal, de uma parte do grupo

de aves estudado, foram recolhidas durante o exame post mortem da totalidade dos

pombos e de quatro papagaios (Psittacus erithacus). As necrópsias foram realizadas,

por um Médico veterinário auxiliado pela autora deste estudo, sempre que possível, no

próprio dia de chegada dos cadáveres ao Instituto de Higiene e Medicina Tropical.

Quando não foi possível necropsiar no próprio dia, conservaram-se os cadáveres a –20

ºC. Em cada necrópsia, efectuaram-se esfragaços da traqueia. Os intestinos foram

retirados e, posteriormente, esvaziados do seu conteúdo e conservados a 4ºC. As

zaragatoas da traqueia foram mergulhadas em 1,0 ml de solução de fosfato tamponado

salino (PBS, sigla anglo-saxónica para phosphate buffered saline) com pH 7,2

(SIGMA), fortemente comprimidas contra o tubo, e conservadas a 4ºC.


- 132 -

3. COLORAÇÃO DIFERENCIAL 3.1. COLORAÇÃO PELO GRAM-CHROMOTROPE (GC) (adaptada de [Moura et al. 1997])

Tradicionalmente, a técnica do tricrómio modificado, constituía a coloração

histológica, mais aplicada à identificação morfológica dos esporos de microsporídios.

Tal como o seu nome indica, esta técnica utiliza três corantes distintos: um para os

núcleos, outro para o citoplasma e um terceiro para as estruturas de sustentação. O

tricrómio é preparado com base no método de Weber e colaboradores [Weber et al.

1992a], modificado por Ryan e colaboradores [Ryan et al. 1993], que substituiu o

contracorante verde sólido, pelo azul de anilina e diminuiu a quantidade de ácido

fosfotúnstico, de modo a obter um melhor contraste entre a cor dos esporos e a

coloração de fundo, e por Didier e colaboradores [Didier et al. 1995a] que introduziu

alterações no tempo de incubação e na temperatura. No método original, as amostras

eram coradas durante 90 minutos, à temperatura ambiente, enquanto aqui o período de

execução da técnica demora apenas 30 minutos, a incubar na estufa, a 37º C (fornece

uma coloração mais intensa dos microsporídios e prolonga a vida da solução por mais

uma ou duas semanas).

Com base na metodologia referida anteriormente, Moura e colaboradores

desenvolveram a técnica de Gram-Chromotrope, para a detecção parasitológica dos

microsporídios [Moura et al. 1997]. Esta técnica de coloração histológica, combina as

vantagens das duas colorações, a do tricrómio modificado e a de Gram potenciando a

capacidade tintorial dos corantes e resultando numa maior capacidade de detecção dos

esporos destes parasitas. A técnica de Gram-Chromotrope foi a metodologia adoptada,

para o presente estudo.

As amostras, destinadas para coloração pelo Gram-Chromotrope, foram fixadas

pelo calor seco a 60ºC, fornecido por uma placa térmica, durante 5 minutos e deixados a

arrefecer à temperatura ambiente. Após a fixação, os esfregaços foram corados com

uma solução de violeta de genciana (Eurotubo), durante 30 segundos e lavados sob um

fio de água da torneira. De seguida, foram corados com lugol (Eurotubo), durante 30

segundos. O lugol foi removido por uma solução descorante (Eurotubo), que por sua

vez, foi removida sob um fio de água da torneira). Depois de secos, foram corados com

a solução de tricrómio modificado (Scientific Device Laboratory, Inc.) e incubados em

camâra húmida a 37ºC, durante 30 minutos. Decorrido este período de incubação, os


- 133 -

esfregaços foram lavados sucessivamente por uma solução com ácido álcool (90 %

etanol e 0,45 % de ácido acético), seguida de uma solução de etanol (95%) (Merck) e

por último, por uma solução de etanol 100%. Depois de secos à temperatura ambiente,

procedeu-se à leitura do esfregaço, após aplicação de uma gota de meio de montagem

entellan new (Merck) e de uma lamela de vidro 24 50 mm. A leitura foi efectuada,

sempre pelo mesmo observador, com apoio da microscopia óptica (Olympus BX51),

com objectiva de imersão ( 1000).

A amostra foi considerada positiva, sempre que foram identificados três ou mais

esporos [Weber et al. 1992a; DeGirolami et al. 1995], redondos ou ovais, de parede fina

corada de violeta a rosa escuro, com uma pequena zona polar ou central não corada. A

solução chromotrope, realça a cinta que rodeia o esporo e minimiza a coloração

Gram-variável, observada em algumas espécies de microsporídios [Moura et al. 1997].

Como controlo positivo, processaram-se, em idênticas condições, amostras

clínicas de humanos, que se sabia estarem contaminadas por microsporídios.

3.1.1. Quantificação da carga parasitária

Para além do diagnóstico parasitário, a técnica de Gram-Chromotrope foi

aplicada na quantificação das cargas parasitárias das amostras em estudo. Assim, a

carga parasitária de cada uma das amostras, foi estimada com base na média do número

de esporos observados nos esfregaços efectuados, em vinte campos de visão, com a

ampliação de ×1000. A média obtida foi classificada segundo o descrito no Quadro

XXI.

Quadro XXI. Critério para a determinação da carga parasitária dos isolados de

microsporídios, englobados no presente estudo.

CARGA PARASITÁRIA MÉDIA DE ESPOROS/CAMPO DE VISÃO*

Baixa (+) 1 a 5 Média (++) 6 a 10

Elevada (+++) 11 a 15 Muito elevada (++++) Mais de 15

* Com a ampliação de ×1000 (ocular ×10 e objectiva ×100)


- 134 -

4. EXTRACÇÃO DE DNA

A extracção do DNA dos microsporídios, dos diversos produtos biológicos (fezes,

conteúdo intestinal, urina, suspensões das zaragatoas da traqueia e secrecções

pulmonares) e ambientais (amostras de água), incluídos neste estudo, foi efectuada a

partir dos sedimentos obtidos durante o processamento das amostras e das aliquotas da

água concentradas, enviadas pela EPAL, respectivamente.

O DNA genómico de microsporídios foi extraído, recorrendo-se a um protocolo

comercial (FastDNA® SPIN Kit for Soil, Q.BIOgene) e a técnica foi executada com

base nas instruções do fabricante:

1) Lise celular: aos tubos E, de 2 ml, contendo uma matriz de lise celular,

adicionaram-se 978 l de tampão Fosfato de Sódio (SPB, sigla do anglo-saxónico para

Sodium Phosphate Buffer), 122 l de tampão MT e, por último, 400 l do sedimento

obtido no processamento das amostras. Agitaram-se os tubos à velocidade máxima

(2800 oscilações/minuto), durante dois minutos, no aparelho Mini Beadbeeter (Biospec

Products – HowawrdTH Industries). Os tubos E, contêm uma mistura de particulas de

cerâmica e sílica, desenhadas de modo a promover uma lise eficaz. O rebentamento

celular resulta, então, do stress mecânico, promovido pela acção destas partículas a alta

velocidade. Por seu lado, os tampões SPB e MT, actuam como homogenizadores e

solventes de matéria orgânica proveniente da lise celular, sendo, por isso, indicados para

protocolos de purificação de ácidos nucleicos. Estes regentes permitem a extracção de

DNA genómico, minimizando os riscos de contaminação por RNA. Prosseguiu-se com

uma centrifugação a 20200 g, durante 30 segundos, de forma a sedimentar os detritos

insolúveis, as partículas de cerâmica e sílica e a dissipar a espuma que é produzida

durante o processo de agitação no Mini Beadbeeter. Em seguida, procedeu-se à

transferência do sobrenadante resultante da centrifugação para um microtubo de 1,5 ml,

a que foi adicionado 250 l da solução de precipitação proteica (PPS, sigla do anglo-

saxónico para protein precipitation solution). Os tubos foram agitados procedendo-se à

sua inversão, à mão, cerca de 10 vezes. Seguiu-se uma nova centrifugação a 20200 g,

durante 5 minutos, para que ocorresse precipitação do pellet. Esta etapa terminou com a

transferência do sobrenadante resultante da centrifugação para um tubo falcon (Sarstedt)

de 15 ml.


- 135 -

2) Adsorção de DNA: ao tubo de 15 ml, adicionou-se 1 ml da suspensão aquosa

da matrix de ligação (contém sílica e tiocianato de guadinina). A mistura foi agitada

vigorosamente e deixada a incubar à temperatura ambiente, no agitador rotativo (Fröbel

Labortechnik GmbH), a velocidade moderada, durante 15 minutos. Neste período de

agitação constante, o DNA, por ter forte afinidade para as partículas da matrix, fica

adsorvido a estas, saindo de solução. Após esta incubação, deixou-se os tubos na

vertical, em repouso, durante 10 minutos, com o objectivo de sedimentar a sílica

activada da solução da matrix de ligação, com o DNA adsorvido. Desprezou-se

aproximadamernte cerca de 500 l do sobrenadante. Ressuspendeu-se a matrix de

ligação sedimentada no tubo, com o restante sobrenadante e transferiu-se o conteúdo

para a coluna de filtração (SPINTM Filter), contida no kit indo a centrifugar a 20200 g,

durante 1 minuto. Removeu-se o conteúdo do tubo que contem a coluna, e procedeu-se

à adição do restante sobrenadante do tubo falcon, e nova centrifugação.

3) Lavagem: adicionou-se 500 l do reagente SEWS-M (sigla anglo-saxónica

para salt ethanol wash) à coluna de filtração, e centrifugou-se a 20200 g, durante 1

minuto. Descartou-se o tubo com o filtrado, colocou-se a coluna num tubo colector e

submeteu-se a uma nova centrifugação à mesma velocidade, durante 2 minutos, de

modo a eliminar resíduos da solução de lavagem. A coluna foi colocada num microtubo

novo, e deixada a secar, à temperatura ambiente, durante 5 minutos.

4) Eluição de DNA: ressuspendeu-se a sílica activada com o DNA adsorvido, na

coluna, em 50 l do reagente DES (sigla anglo-saxónica para DNA elution solution

ultra-pure water), incubando-se a 60ºC, durante cinco minutos, no aparelho Block

Heater, de forma a facilitar a eluição do DNA. Esta é considerada a temperatura ideal

para que ocorra uma boa eluição do DNA da sílica para o DES. Submeteu-se a coluna,

no microtubo a uma última centrifugação a 20200 g, durante 1 minuto. Descartou-se a

coluna. Os microtubos com as amostras de DNA em solução aquosa foram devidamente

guardados a –20ºC.

A utilização dos reagentes incluidos no kit de extracção, tais como a matriz de

sílica, o SEWS-M e o DES, permitem eliminar uma grande quantidade de


- 136 -

contaminantes e de moléculas que podem provocar interferências no decorrer da

experimentação.

5. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ESPÉCIES ENTEROCYTOZOON BIENEUSI,

ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS, ENCEPHALITOZOON CUNICULI,

ENCEPHALITOZOON HELLEM E VITTAFORMA-LIKE

As tecnologias de biologia molecular, em especial a PCR, descrita pela primeira

vez em meados dos anos 80 por Saiki e colaboradores [Saiki et al. 1985] têm vindo a

ganhar um relevo crescente no âmbito das técnicas de diagnóstico clínico e

epidemiológico nas várias vertentes da parasitologia Médica e Veterinária. A

simplicidade, rapidez e economia, permitindo a obtenção de um largo número de cópias

de DNA a partir de quantidades diminutas de ácidos nucleicos, mesmo em presença de

DNA de baixa qualidade, são características que tornam a PCR um instrumento de

trabalho particularmente aliciante relativamente às técnicas convencionais.

A técnica de PCR baseia-se no desenho de primers específicos em regiões

genómicas conhecidas e em protocolos criteriosamente estabelecidos. Sumariamente, a

PCR consiste num método in vitro para a síntese enzimática de sequências específicas

de DNA, utilizando um par de oligonucleótidos iniciadores (primers) que flanqueiam a

região de interesse no DNA alvo em locais opostos das cadeias complementares. A

amplificação exponencial do fragmento específico, cujas terminações são delimitadas

pelas extremidades 5’ dos primers resulta de uma série de ciclos repetitivos, incluindo a

desnaturação do DNA a temperaturas elevadas (91-97 ºC), a hibridação (annealing) dos

primers a temperaturas mais baixas (45-65 ºC) e a extenção destes pela DNA

polimerase (68-73 ºC) [Sachse & Frey 2003].

O sucesso de qualquer técnica de PCR em termos de sensibilidade e especificidade

é determinado por diversos factores críticos, como a concentração de Mg2+, os

desoxirribonucleótidos (dNTPs), a polimerase na mistura de reacção, as condições de

amplificação e, sobretudo, pelo desenho dos primers.

Para os microsporídios no geral, e em particular, para os potencialmente

patogénicos para o homem, é reduzido o número de sequências genéticas conhecidas,

acessíveis para aplicação das técnicas de biologia molecular.


- 137 -

A região genómica que codifica para o RNA dos ribossomas contém genes

funcionais e conservados em termos evolutivos separados por regiões não codificantes e

por regiões intergénicas que ligam as diferentes unidades genicas. O espaço entre

regiões codificantes dos genes rRNA (ITS) é particularmente útil para a discriminação

dos organismos ao nível da espécie e do género, porque a taxa de acumulação de

mutações nesta região aproxima-se muitas vezes da taxa de especiação, razão pela qual

muitas das estratégias de identificação e caracterização molecular, por PCR, dos

microsporídios se baseiam na amplificação desta região do genoma [Weiss &

Vossbrinck 1999]. A informação genética disponível para a maioria dos microsporídios

corresponde às sequências do gene da SSU rRNA. Por outro lado, também a

caracterização intra-específica, só é possivel para algumas espécies de microsporídios,

devido à existência de um número limitado de marcadores genéticos: a região ITS

rRNA, pode apresentar desde um elevado grau de polimorfismo, como o que se verifica

na espécie E. bieneusi, ou não ser detectada qualquer variabilidade genética como se

encontra descrito para E. intestinalis.

No presente estudo, após pesquisa bibliográfica, o diagnóstico molecular das

espécies de microsporidia em estudo consistiu na amplificação e detecção de um

segmento de DNA específico (SSU rRNA ou fragmento contendo uma região parcial da

SSU, a totalidade da ITS e, uma região parcial da LSU rRNA), através das técnicas de

PCR e PCR nested, após extracção do DNA genómico do microrganismo. Em termos

práticos a PCR nested consiste numa primeira reacção com um par de primers iniciais,

cujo amplicão constituirá o DNA molde para uma segunda reacção PCR a realizar com

primers desenhados para o interior da sequência inicialmente amplificada; técnica mais

sensível e específica comparativamente à PCR simples.

As reacções de PCR, efectuadas no presente estudo, sofreram alguns ajustes, em

relação ao descrito pelos autores referenciados, nomeadamente, ao nível da temperatura

de ligação, dos tempos de ligação e de extensão, da concentração de cloreto de

magnésio (MgCl2) e de primers e/ou da concentração da enzima DNA polimerase.

Para cada gene estudado, foram seleccionados três isolados pertencentes a cada

uma das espécies de microsporídios identificadas, nos quais, para confirmação do


- 138 -

resultado da análise da PCR, se procedeu à sequenciação dos fragmentos amplificados

por este método.

5.1. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE MICROSPORÍDIOS NO GERAL

A identificação, pela técnica de PCR, de microsporídios no geral, onde se incluem

as quatro principais espécies patogénicas para o homem, é baseada na amplificação do

gene que codifica o RNA da pequena subunidade do ribossoma (SSU rRNA). Para a

identificação molecular de isolados de microsporídios, de amostras em que houve

detecção parasitológica de esporos, mas em que não foi possível, a amplificação pelas

outras técnicas de PCR adoptadas neste estudo, foram utilizados os seguintes primers,

previamente descritos [Raynaud et al. 1998] e designados na literatura, por pan-

específicos, por permitirem a detecção de diversas espécies de microsporidia (Quadro

XXII)

Quadro XXII. Sequências dos primers pan-específicos utilizados na amplificação do

gene SSU rRNA de microsporídios por PCR, e suas características (dimensão do

oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e

tamanho do fragmento de amplificação para as quatro espécies mais frequentes

infectantes para o homem).

PRIMERS

SEQUÊNCIA (5’→3’)

DIMENSÃO

(pb)

GC

(%)

Ta

(ºC)

AMPLICÃO

(pb)

C1 CACCAGGTTGATTCTGCC 18 56 50 Eb 1170 C2 GTGACGGGCGGTGTCTAC 18 67 55 Ec 1190

Eh1205 Ei1186

As reacções de amplificação dos genes ribossomais, foram realizadas num volume

final de 25 μl, contendo, a mistura de amplificação 1× tampão de reacção (16 mM

(NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma

mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada

primer (C1 e C2; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) (Bioline),

0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de albumina sérica bovina

(BSA, sigla anglo-saxónica para bovine serum albumin) (SIGMA), entre 2 a 8 μl de


- 139 -

DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA® SPIN Kit for Soil, e

água desionizada estéril, para perfazer o volume final da reacção. Em cada reacção de

PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de microsporídio em condições

óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura

reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação por

DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril.

As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1

Thermocycler; Biometra) tendo, em todas elas, o passo de desnaturação inicial sido a 95

ºC durante 10 minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro

XXIII encontram-se descritas as restantes condições de amplificação para o locus

estudado.

QUADRO XXIII. Condições de amplificação do DNA, para o gene da SSU rRNA.

CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS

Desnaturação 95 ºC, 1 min

40 Ligação 56 ºC, 1 min

Extensão 72 ºC, 1 min

5.2. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS,

ENCEPHALITOZOON CUNICULI, ENCEPHALITOZOON HELLEM.

A identificação, pela técnica de PCR, das espécies E. intestinalis, E. cuniculi e E.

hellem, é baseada na amplificação do gene que codifica o RNA da pequena subunidade

do ribossoma SSU rRNA. Para a identificação molecular ao nível da espécie, foram

utilizados os seguintes primers: SINTF1/SINTR1, específico para E. intestinalis

[Visvesvara et al. 1995; da Silva et al. 1997]; ECUNF/ECUNR específico para E.

cuniculi [Visvesvara et al. 1994]; EHELF/EHELR específico para E. hellem

[Visvesvara et al. 1994] (Quadro XXIV).


- 140 -

Quadro XXIV- Sequências dos primers utilizados na amplificação do gene SSU rRNA

de E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem, por PCR, e suas características (dimensão do

oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e

tamanho do fragmento de amplificação).

PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)

DIMENSÃO

(pb)

GC

(%)

Ta

(ºC)

AMPLICÃO

(pb)

SINTF1 TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA 20 45 50 520 SINTR1 CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG 21 71 62 ECUNF ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG 21 48 52 549 ECUNR TGCCATGCACTCACAGGCATC 21 57 66 EHELF TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA 21 33 47 547 EHELR GTAAAAACACTCTCACACTCA 21 38 49

A técnica de PCR comporta determinadas componentes e condições reaccionais

indispensáveis. Assim, por cada amostra, preparou-se uma mistura de amplificação

contendo 1x tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01%

tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP)

(Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (SINTF1 e SINTR1, ECUNF e ECUNR,

EHELF e EHELR; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2)

(Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de BSA (SIGMA),

entre 2 a 8 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA®

SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de 25 μl.

Para monitorizar a qualidade dos resultados, em cada ensaio de amplificação,

foram incluídos, um controlo positivo (suspensão de DNA da espécie de microsporídio

em estudo) e um controlo negativo (água desionizada estéril), substituindo, nas

respectivas reacções, os 2 μl de DNA genómico das amostras. As componentes térmicas

da reacção, descritas no QuadroXXV, foram aplicadas num termociclador (T1

Thermocycler; Biometra), onde decorreu a amplificação do DNA.


- 141 -

QUADRO XXV. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.


Desnaturação 95 ºC, 30 seg.

30 Ligação* 55 ºC, 30 seg

Extensão 72 ºC, 1 min

* Para E. intestinalis a temperatura de ligação é de 45 ºC. 5.3. AMPLIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE DNA GENÓMICO DE

ENTEROCYTOZOON BIENEUSI

5.3.1. Amplificação de DNA genómico de Enterocytozoon bieneusi.

A amplificação de um fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade

da região ITS, e parte da LSU do gene rRNA de E. bieneusi foi efectuada através de

PCR nested. No Quadro XXVI encontram-se descritas as sequências dos primers

utilizados.

Quadro XXVI. Sequências dos primers (AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040)

utilizados na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade

da região ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested e suas características

(dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo

em GC e tamanho do fragmento de amplificação).

PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)

DIMENSÃO

(pb)

GC

(%)

Ta

(ºC)

AMPLICÃO

(pb)

1ª Parte

AL 4037 GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT 24 46 56 410 AL4039 TATGCTTAAGTCCAGGGAG 19 47 49 2ª

Parte AL 4038 AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG 23 57 59 392 AL4040 AGTGATCCTGTATTAGGGATATT 23 35 50

O procedimento de amplificação da região alvo foi efectuado num volume de 50

μl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 μl de 10× tampão de reacção (160

mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de

MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega),


- 142 -

10 pmol de cada primer (MWG Biotech), 0,02 mg de BSA (SIGMA), 1,5 U de

Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 μl de DNA genómico e água

desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 μl

do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira,

com excepção da BSA, que foi excluída.

Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo controlo positivo contendo uma

amostra de DNA de E. bieneusi e um controlo negativo (no lugar do DNA, foi

adicionada água desionizada estéril) .

As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador GeneAmp

PCR System 9700, tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de cinco

minutos a 95ºC e o de extensão final de 10 minutos a 72ºC. No Quadro XXVII estão

descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos da região SSU, ITS LSU

do rRNA.

Quadro XXVII. Condições de amplificação do DNA, para a região do gene estudado.


Desnaturação 95ºC, 50 seg.

30 Ligação 55ºC, 30 seg

Extensão 72ºC, 30 seg

A amplificação, por PCR, efectuada segundo este procedimento, nas condições

já descritas foi utilizada apenas para um grupo de amostras, caracterizadas na Division

of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, EUA, pela autora e que compreendeu 20 isolados

de E. bieneusi de origem humana e 32 de origem animal.

5.3.2 Desenvolvimento e optimização de uma nova técnica de PCR nested

Durante o início do trabalho foram sentidas algumas dificuldades práticas com a

primeira técnica de PCR usada para a detecção e amplificação da região ITS do gene

rRNA de E. bieneusi, nomeadamente a nível de sensibilidade e da posterior

sequenciação dos produtos amplificados.

Com o objectivo de ultrapassar estes obstáculos foi desenvolvida uma nova PCR

nested, em que foram desenhados primers tendo como alvos específicos a amplificação


- 143 -

e posterior sequenciação da referida região ITS rRNA, com recurso às diversas

sequências descritas para E. bieneusi na base de dados do GeneBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed) utilizando-se o programa

bioinformático Primer 3.0 Program (versão 0.4.0), disponível on-line

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi). A escolha dos primers para

amplificação das regiões de interesse, obedeceu a critérios gerais e empíricos, descritos

na bibliografia existente e de programas de desenhos de primers, que incluíram, as

dimensões das sequências oligonuclotídicas, as características conservadas das zonas de

ligação (annealing), a temperatura de hibridação, o conteúdo CG, a ausência de

estruturas secundárias e de dímeros de primers. Estes primers foram desenhados para

uma temperatura de hibridação de 61,5ºC, tendo sido sintetizados pela MWG Biotech

Quadro XXVIII.

Quadro XXVIII. Sequências dos primers (MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2) utilizados

na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade da região

ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested, e suas características

(dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo

em GC e tamanho do fragmento de amplificação).


DIMENSÃO

(pb)

GC

(%)

Ta

(ºC)

AMPLICÃO

(pb)

1ª Parte

MLLF1 CGCCCGTCACTATTTCAGAT 20 50 52 514 MLLR1 GCTTAAGTCCAGGGAGTATCCA 22 50 55 2ª

Parte MLLF2 AGTCGTAACAAGGTTTCAGTTGG 23 43 53 386 MLLR2 GGACTTTTCGCATTCTTTCG 20 45 50

Optimizaram-se as reacções de PCR, para os amplicões, para um volume

reacional de 25 μl, contendo 1× tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-

HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (MLLF1 E

MLLR1 na 1ª parte; MLLF2 e MLLR2 na 2ª parte; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto

de magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01

μg/μl de BSA (SIGMA), 2 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do

FastDNA® SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de


- 144 -

25 μl. A segunda PCR foi realizada com 4 μl do DNA amplificado na primeira reacção,

sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída.

Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de E.

bieneusi em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como

controlo positivo da mistura reaccional e um controlo negativo, como indicador da

inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada

água desionizada estéril.

As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1

Thermocycler; Biometra) e submetidas ao passo de desnaturação inicial a 95 ºC durante

cinco minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro XXIX

estão descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.

Quadro XXIX. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.



30 Ligação 55ºC, 30 seg

Extensão 72ºC, 30 seg

A nova metodologia desenvolvida confirmou que os primers desenhados para todo

o sistema testado apresentaram uma elevada sensibilidade e especificidade molecular

para a amplificação e sequenciação do fragmento com 386pb do DNA alvo de E.

bieneusi permitindo uma adequada detecção e caracterização genética dos isolados

obtidos durante o estudo.

5.3.3. Caracterização génetica dos isolados de Enterocytozoon bieneusi.

A disponibilidade e facilidade de utilização de técnicas de biologia molecular

possibilitaram a sua utilização na descoberta e aperfeiçoamento de marcadores

moleculares para a caracterização intra-específica.

Até à data, a região ITS rRNA constitui o único marcador genético disponível para

a caracterização de genótipos de E. bieneusi. A sequência nucleotídica desta região,


- 145 -

apresenta uma elevada heterogeneidade discriminativa entre os isolados desta espécie de

microsporidia.

A avaliação da variabilidade intra-específica da região ITS rRNA, foi realizada

através da amplificação, por reacção de PCR nested, seguida de sequenciação,

alinhamento das sequências obtidas e construção de uma árvore filogenética, que

permitiu visualizar a distribuição dos diferentes genótipos da região ITS rRNA, nos

isolados de E. bieneusi de origem humana, animal e ambiental.

Esta componente do presente trabalho foi inicialmente realizada, pela autora, na

Division of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, EUA, em particular a amplificação e

sequenciação da região ITS rRNA num grupo de 52 isolados de humanos e de outros

animais e toda a análise bioinformática das sequências obtidas. A amplificação, por

PCR, do fragmento alvo, foi efectuada no CDC, segundo o procedimento 2.4.3.1, nas

condições já descritas.

Os restantes isolados foram amplificados e caracterizados na Unidade de

Protozoários Oportunistas/VIH e outras Protozooses, no Instituto de Higiene e Medicina

Tropical, recorrendo ao procedimento 2.4.3.2, nas condições descritas.

5.4. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE UMA NOVA ESPÉCIE DE MICROSPORÍDIO -

VITTAFORMA-LIKE

5.4.1 Detecção da espécie Vittaforma-like

A detecção de uma nova espécie de microsporídio em amostras fecais de

humanos em Portugal, resultou de conjunto de estudos que envolveram técnicas

parasitologicas e moleculares, e duas equipas de investigação. A observação por

microscopia óptica e de fluorescência de estruturas compatíveis com esporos de

microsporidia em amostras fecais de seropositivos e seronegativos para VIH, mas em

que não era possivel obter amplificação por diversos protocolos de PCR, suscitou o

interesse à equipa de investigação na qual a autora deste trabalho se encontra integrada.

Após vários esforços e em colaboração com a equipa do CDC, foi possível a

identificação de uma nova espécie de microsporídio. A caracterização genética da SSU

rRNA, foi efectuada com recurso à técnica de PCR e a sequenciação conforme descrito

por Sulaiman e colaboradores [Sulaiman et al. 2003c]. A análise dos resultados permitiu


- 146 -

verificar que esta espécie apresenta 96% de homologia genética para a referida região

com a espécie V. cornea descrita na córnea de humanos.

Até à data não foi possivel a caracterização ultraestrutural deste microsporídio,

mantendo por enquanto a nomenclatura provisória de Vittaforma-like.

5.4.2. Amplificação de DNA genómico de Vittaforma-like

Com o objectivo de detecção da espécie Vittaforma-like foi desenvolvida uma

PCR nested, em que foram desenhados primers tendo como alvo específico a

amplificação e posterior sequenciação da SSU rRNA, com recurso às sequências

descritas para esta espécie na base de dados do GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed) utilizando-se o programa

bioinformático Primer 3.0 Program (versão 0.4.0), disponível on-line

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi). A escolha dos primers para

amplificação das regiões de interesse, obedeceu a critérios gerais e empíricos, descritos

na bibliografia existente e de programas de desenhos de primers. No Quadro XXX estão

descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.

Quadro XXX. Sequências dos primers utilizados na amplificação do gene SSU rRNA,

de Vittaforma-like, por PCR nested, e suas características (dimensão do oligonucleótido,

temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e tamanho do fragmento

de amplificação).


DIMENSÃO

(pb)

GC

(%)

Ta

(ºC)

AMPLICÃO

(pb)

1ª Parte

AL 4605 TAGTCGTAGGAAACGAAAC 19 42 47 ~600 AL 4607 TCTGTCTTGCTCGTTTCTA 19 42 47 2ª

Parte AL 4606 AGGGATGTGAAGTCTCGA 18 50 48 386 AL 4608 CACAACACTTGGCCCTGGTAAGT 23 52 57

O procedimento de amplificação da SSU rRNA foi efectuado num volume de 25

μl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 1× tampão de reacção (16 mM

(NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma

mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada

primer (AL4605 e AL4607 na 1ª parte; AL4606 e AL4608 na 2ª parte; MWG Biotech),


- 147 -

2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA

polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de BSA (SIGMA), 2 μl de DNA genómico, obtido após

extracção pelo método do FastDNA® SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para

perfazer o volume final de 25 μl. A segunda PCR foi realizada com 4 μl do DNA

amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com

excepção da BSA, que foi excluída.

Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de E.

bieneusi em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como

controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da

inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada

água desionizada estéril.

As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador (T1

Thermocycler; Biometra), tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de cinco

minutos a 95ºC e o de extensão final de 10 minutos a 72ºC. No Quadro XXXI estão

descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos da região SSU rRNA.

Quadro XXXI – Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.



30 Ligação 55ºC, 45 seg.

Extensão 72ºC, 1 min.

5.5. VISUALIZAÇÃO DO DNA AMPLIFICADO

A electroforese através de uma matriz de gel de agarose é considerada o método

mais simples e económico para determinar a eficiência da amplificação e o tamanho dos

fragmentos gerados durante a reacção de amplificação. Os produtos de PCR são

carregados em poços moldados durante a preparação do gel e de seguida aplica-se um

campo eléctrico para separar os amplicões. A deposição de produtos de PCR é

conseguida através da adição de um tampão de aplicação. Este contem bromofenol,

permitindo visualizar a migração do DNA no gel. A distância percorrida pelo DNA

depende do peso molecular dos fragmentos, da concentração da agarose, do tampão

utilizado e da concentração de brometo de etídio. O peso molecular dos fragmentos


- 148 -

gerados pode ser estimado por comparação com um marcador de tamanho de

fragmentos (pb). O brometo de etídio é um corante que se liga exclusivamente ao DNA

de cadeia dupla dos ácidos nucleicos. Quando exposto à luz ultravioleta, o brometo de

etídio emite fluorescência que pode ser visualizada e registada com o auxílio de um

sistema de captação de imagem [Newton 1995].

Os fragmentos de DNA amplificados, por PCR, foram submetidos a

electroforese em gel de agarose SeaKem® LE (FMC BioProducts) a 1,5% em tampão

TAE (Tris-Acetato 0,04 M; EDTA 0,001 M; pH 8,3), onde foi incorporado brometo de

etídio (SIGMA), numa concentração final de 0,5 μg/ml. A 19 μl de produto de reacção,

adicionou-se 1 μl de tampão de aplicação (Fermentas). Da mesma forma, a 1 μl de

marcador molecular (Gene RulerTM 100 pb; Fermentas), adicionou-se 1 μl de tampão de

aplicação e 9 μl de água desionizada estéril. Aplicaram-se as amostras nos respectivos

poços e, a separação electroforética foi efectuada a 60 volts (V), durante,

aproximadamente, uma hora. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados,

por acção de luz ultravioleta, num transiluminador (ECX-20.M; Vilber Lourmat). Os

resultados foram registados com uma máquina fotográfica digital do sistema de

aquisição de imagem incorporado ao transiluminador (PowerShot A710 IS; Canon).

6. PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR

PCR. Os produtos de PCR contêm sais, primers e dDNTPs não incorporados, que

podem condicionar o sucesso da reacção de sequenciação, sendo necessário, antes da

sua realização, proceder à remoção dos referidos compostos.

O procedimento adoptado com o propósito de sequenciar os fragmentos das

regiões alvo, amplificados por PCR, foi distinto para as amostras estudadas no CDC e

no Instituto de Higiene e Medicina Tropical.

O trabalho desenvolvido no CDC foi realizado conforme a descrição que se

segue. Os fragmentos da região SSU ITS LSU do gene rRNA de E. bieneusi

amplificados, na segunda reacção, da PCR nested, foram purificados através do

Microcon-PCRCentrifugal Filter Devices (Amicon, Millipore), conforme as instruções

do fabricante: a um filtro (Amicon, Millipore) colocado num microtubo de 1,5 ml

(Amicon, Millipore), foram adicionados 460 l de água desionizada estéril e o produto


- 149 -

de PCR a purificar. Depois de fechado, o tubo com o filtro foi a centrifugar a 1.000 g,

durante 15 minutos. Em seguida, foram adicionados ao filtro 20 l de água desionizada

estéril, pré-aquecida a 70ºC. Após um minuto de repouso, à temperatura ambiente, o

filtro foi invertido, colocado num novo microtubo e centrifugado a 1.000 g, durante dois

minutos. Por fim, o filtro foi eliminado e o tubo com o produto de PCR purificado

armazenado a –20ºC.

Relativamente à metodologia de sequenciação, adoptada para os fragmentos

amplificados e purificados, no CDC, foram realizadas duas reacções de sequenciação,

uma no sentido directo e outra no sentido reverso. O protocolo deste procedimento é

descrito em seguida. Em cada uma das 96 reacções foi utilizado, apenas, um dos

primers (AL4038 ou AL4040), resultando na amplificação de apenas uma das cadeias

do DNA alvo. A reacção de sequenciação foi preparada, segundo o método ABI

PRISM®

BigDyeTM

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied

Biosystems). Em cada mistura reaccional foram adicionados 4 l de Terminator Ready

Reaction Mix, composta por quatro didesoxirribonucleótidos terminadores marcados

com quatro fluorocromos diferentes (A-Dye Terminator, C-Dye Terminator, G-Dye

Terminator e T-Dye Terminator), quatro dNTPs (dATP, dCTP, dITP e dUTP),

AmpliTaq DNA Polymerase FS, MgCl2, e Tris-HCl buffer, pH 9.0 (Applied

Biosystems), 4 l de 5xtampão de sequenciação (Applied Biosystems), 1,5 l de

produto de PCR purificado, 2 l de um dos primers e água desionizada estéril para

completar um volume final de 20 l. As reacções de sequenciação foram realizadas num

termociclador (GeneAmp PCR System 9700; Perkin Elmer), durante 25 ciclos de 10

segundos a 96ºC, cinco segundos a 50ºC e quatro minutos a 60ºC.

Os produtos de sequenciação foram, posteriormente, purificados de sais e dos

primers, ddNTPs terminadores e dNTPs não incorporados que interferem com a

electroforese capilar. Para tal, foi utilizado o protocolo comercial (Centri-Sep Columns;

Princeton Separations), de acordo com a descrição que se segue: para hidratar a resina

da coluna, foram-lhe adicionados 800 l de água desionizada estéril e, após forte

agitação, esta foi deixada a repousar durante uma hora, à temperatura ambiente. Depois,

retiraram-se as tampas superior e inferior da coluna que foi, em seguida, colocada num

tubo de recolha a eluir, durante 15 minutos. Após eliminação do eluído, foi efectuada


- 150 -

uma centrifugação de três minutos a 750 g e a coluna foi transferida para um microtubo

de 1,5 ml. O produto da sequenciação foi adicionado à coluna, tendo, em seguida, sido

realizada nova centrifugação a 750 g, durante três minutos. Por fim, a coluna foi

eliminada e o eluído concentrado num Vacufuge Concentrator 5301 (Eppendorf), até

completa evaporação do solvente. Os produtos de sequenciação purificados e

concentrados foram ressuspendidos em 15 l de formamida ABI PRISM® Hi-Di™

(Applied Biosystems). Em seguida, foram colocados numa microplaca (MicroAmp®

Optical 96-well Reaction Plate; Applied Biosystems), tapados com uma tampa (96-Well

Septa; Applied Biosystems), submetidos a 94ºC, durante três minutos, num

termociclador (GeneAmp PCR System 9700; Perkin Elmer) e, de imediato, congelados

a –20ºC.

A resolução dos produtos de sequenciação foi realizada num sequenciador

automático (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems), por

electroforese capilar, numa matriz de polímero POP4™ (Applied Biosystems). A

recolha e o processamento dos resultados da electroforese foi efectuada pelos programas

ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer Data Collection Software e DNA Sequencing

Analysis Software (Applied Biosystems). Os cromatogramas, com as sequências directa

e reversa, de cada fragmento sequenciado, foram comparados, através do programa

AutoAssembler 2.0 (Applied Biosystems) e, após a correcção manual de alguns erros

nas sequências directa e/ou reversa, foi obtida uma sequência consenso, para cada

fragmento amplificado.

Na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses do Instituto

de Higiene e Medicina Tropical, os produtos de amplificação das PCR realizadas para

submeter à técnica de sequenciação, foram purificados, através do protocolo comercial

(JETQUICK PCR Product Purification Spin kit; Genomed), que permite a remoção

rápida de impurezas e de contaminantes de produtos de PCR, após corrida

electroforética em gel de agarose. No caso das PCR nested, foram purificados os

produtos da segunda reacção.

De acordo com as instruções do fabricante, o referido protocolo consiste em

quatro passos definidos:


- 151 -

1) Solubilização da agarose: cortam-se, cuidadosamente, as regiões do gel de agarose,

correspondentes às bandas com as dimensões pretendidas, excluindo as moléculas de

tamanho indesejado, o que permite, desde logo, a eliminação de dímeros de primers e

de outros produtos inespecíficos. As porções de gel de agarose são colocadas em

microtubos de 1,5 ml. De acordo com o fabricante, por cada 100 mg de gel, adicionam-

se, proporcionalmente, 300 l da solução L1. A mistura vai a incubar a 50ºC durante 30

minutos, agitando-se vigorosamente, em intervalos de 10 minutos. A solução L1 contém

percloreto de sódio, um agente que, quando utilizado em elevadas concentrações,

remove complexos proteicos presentes em solução, acetato de sódio, cuja acção visa

precipitar os ácidos nucleicos em solução, e Tris-Borato-EDTA (TBE), um tampão que,

em conjunto com o aumento da temperatura, auxilia na solubilização da agarose.

2) Adsorção: a adsorção do DNA é realizada numa coluna específica (JETQUICK spin

column; Genomed), que é colocada num tubo colector de 2 ml e para onde se transfere a

mistura (aproximadamente 400 l). Esta coluna possui uma matriz de sílica que é um

material com alta afinidade para as moléculas de DNA, carregadas negativamente.

Centrifuga-se à velocidade máxima (23100 g), durante um minuto, sendo que no final se

descarta o tubo com o filtrado.

3) Lavagem: esta etapa consiste na remoção de contaminantes, onde se volta a colocar

a coluna num tubo colector de 2 ml, adicionando-se 500 l de solução H2. A solução

H2 é composta por EDTA, um forte agente quelante, aplicado para aprisionar iões

monovalentes, Tris-HCl, um tampão que auxilia na manutenção do pH, funcionando

como agente estabilizador da solução, etanol, que funciona como um forte solvente

orgânico, e cloreto de sódio, utilizado para manter e estabilizar as cargas iónicas. Volta-

se a centrifugar à velocidade máxima, durante um minuto. Despreza-se o filtrado,

coloca-se novamente a coluna no tubo colector e promove-se nova centrifugação, igual

à anterior, descartando-se, no final, o tubo com o filtrado. Esta segunda centrifugação

tem por objectivo remover a totalidade do etanol, composto orgânico considerado como

um contaminante limitante da reacção de sequenciação.


- 152 -

4) Eluição do DNA: coloca-se a coluna num microtubo de 1,5 ml e adicionam-se 50 l

de água desionizada estéril, pré-aquecida no aparelho Block Heater (Stuart Scientific) a

60ºC. A água deve ser vertida no centro da matriz de sílica, de forma a ter uma

distribuição uniforme e a solver o máximo de moléculas de DNA. Centrifuga-se à

velocidade máxima, durante dois minutos e no final recupera-se o filtrado com o DNA

purificado, conservando-o a -20ºC. O controlo de qualidade da purificação é realizado

através da técnica de electroforese em gel de agarose (1%).

Após a etapa de purificação, os produtos de PCR foram submetidos a

sequenciação directa, no Laboratório de Sequenciação da Macrogen (Seuol, Coreia do

Sul), num sequenciador automático (3730 XL DNA Analyser; Applied Biosystems)

com tecnologia de electroforese capilar em gel de poliacrilamida. Triplicados de todas

as sequências de DNA, foram determinadas em ambos os sentidos.

A análise das sequências nucleotídicas consenso obtidas foi efectuada,

recorrendo-se a programas de bioinformática específicos, como, o ChromasPro (versão

1.22, Technelysium Pty Ltd.), o BLAST (sigla do ango-saxónico para Basic Local

Alignment Search Tool) (versão 2.2) disponível no sítio do National Centre for

Biotechnology Information’s (www.ncbi.nlm.nih.gov) e o CLUSTAL W2 (versão

2.0.12) disponível no sítio do European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk).

6.1. ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DA REGIÃO ITS RRNA DE E. BIENEUSI DE

ANIMAIS (MAMÍFEROS)

As sequências nucleotídicas da região ITS rRNA, obtidas para os isolados

identificados nos animais (cães, gatos e bovídeos), foram alinhadas com diversas

sequências de genótipos E. bieneusi disponíveis no GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), para a mesma região, com recurso ao

programa CLUSTAL W2 (versão 2.0.12) disponível no sítio do European

Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk). Através do programa MEGA 3.1 (Kumar et

al. 2004) e do método neighbour-joining, foi construída uma árvore filogenética, tendo

por base distâncias genéticas, calculadas pelo modelo de dois parâmetros de Kimura.

Como grupo externo (outgroup), foi utilizada a sequência do gene SSU rRNA mais

divergente reportada para Enterocytozoon sp. (GenBank AF059610), identificada num

http://www.ebi.ac.uk/

http://www.ebi.ac.uk/


- 153 -

cão. Os valores de confiança, para os ramos individuais da árvore, foram determinados

por análise de “bootstrap” com 1.000 réplicas.

7. ANÁLISE ESTATÍSTICA.

Considerando o número e a natureza das variáveis e o tipo de resposta

pretendida, o teste estatístico seleccionado foi o teste do Chi-Quadrado (χ2). Assim, o

teste χ2 foi aplicado para investigar a associação entre variáveis qualitativas, recorrendo-

se ao programa informático SPSS (sigla do anglo-saxónico para statistical package for

social sciences, (versão 16.0; SPSS Inc., Chicago, USA). Os dados foram agrupados em

tabelas de contingência de duas entradas e a análise foi efectuada com um intervalo de

confiança de 95%, de onde resultaram associações, estatisticamente significativas,

quando o valor de P foi inferior ou igual a 0,05.


- 154 -

Capítulo III

DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE

MICROSPORIDIA EM HUMANOS

(SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)

III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)

1. INTRODUÇÃO

Os microsporidia inicialmente reconhecidos como agentes patogénicos de

insectos e peixes, emergiram nas últimas décadas como um importante grupo de

microrganismos responsáveis por infecção no Homem, associada à pandemia da sida.

Apesar de pessoas imunocompetentes desenvolverem, geralmente, doença auto-

limitada, a infecção pode ser causa de morbilidade e mortalidade em imunossuprimidos,

especialmente em seropositivos para VIH. Diversos aspectos da epidemiologia das

infecções por microsporidia mantêm-se ainda por esclarecer. Todavia, o seu

conhecimento é de extrema importância, e só a determinação de prevalências

fidedignas, a identificação da(s) via(s) e da(s) fonte(s) de transmissão dos

microsporidíos possibilitará a definição de meios de prevenção e controlo da

microsporidiose.

Uma grande parte dos registos de microsporidiose, reportam-se a estudos

efectuados em países desenvolvidos, onde as infraestruturas de saúde e laboratórios

existentes conferem vantagem no diagnóstico e estudo destes parasitas, dispondo de

uma maior capacidade de resposta ao problema, relativamente aos países em vias de

desenvolvimento. No entanto a infecção humana por microsporidia, já foi reportada em

todos os continentes. Mantêm-se, porém, diversas lacunas, nomeadamente no que diz

respeito a estudos de prevalência desta doença, assentes numa amostragem exacta e

precisa. Outro dos problemas na caracterização epidemiológica das microsporidioses

está associado aos métodos de diagnóstico utilizados. De acordo com a localização

geográfica, o método de diagnóstico usado e a população estudada, a prevalência da

doença oscila entre 0% e 50% [Didier et al. 2004; Didier & Weiss 2006].

Inicialmente, o diagnóstico da microsporidiose humana constituía um processo

invasivo, com recurso a metodologia laboriosa como se verificava com a microscopia

electrónica aplicada a biópsias dos tecidos afectados. Hoje em dia, o diagnóstico pode

ser efectuado pela pesquisa directa dos esporos de microsporidia em amostras de fezes,

urina ou outros produtos biológicos (i.e. secrecções pulmonares, exsudado da conjuntiva

ou nasal). O diagnóstico destes microrganismos é dificultado por características

inerentes ao próprio parasita, como sejam as reduzidas dimensões e fraco poder tintorial

dos seus esporos. Face aos métodos clássicos de coloração utilizados, o

desenvolvimento e optimização de novas técnicas, vieram introduzir melhorias


- 158 -

consideráveis ao diagnóstico dos microsporídios. Embora ainda em número reduzido, a

caracterização total ou parcial do genoma de alguns microsporídios veio proporcionar o

desenvolvimento de metodologia molecular sensível, tais como a PCR, adicionando

vantagens acrescidas ao diagnóstico e diferenciação dos microsporidia, nomeadamente

das espécies responsáveis por infecção no Homem.

2. RESULTADOS

2.1 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM AMOSTRAS FECAIS,

AMOSTRAS DE URINA E SECRECÇÕES PULMONARES DE DOENTES INFECTADOS POR

VIH.

2.1.1 Microsporidia em amostras fecais

Nos Quadros XXXII e XXXIII, encontram-se sumarizados os resultados da

distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade, género dos doentes,

serologia para VIH e presença ou ausência de diarreia dos doentes englobados no

estudo.

No total dos 856 doentes estudados, incluindo seropositivos e seronegativos para

VIH, através da técnica histoquímica do Gram-Chromotrope, foram detectados esporos

de microsporídios, em amostras de 152 doentes (17,8%). A percentagem de 33,7 %

correspondente a crianças com esporos identificados nas fezes foi superior à

percentagem de 13,5% observada de adultos. Este valor apresenta significância

estatística (ᵡ2=39,959; p≤0,001). Percentagens semelhantes de microsporídios nas fezes

foram encontradas entre elementos do sexo masculino (17,2%) e do sexo feminino

(18,9%) (Quadro XXXII). O número de doentes seropositivos para VIH com

microsporídios nas fezes foi superior ao número observado para os seronegativos para

VIH, 122 (21,7%) e 30 (10,2%) respectivamente (ᵡ2=17,744; p≤0,001). Este valor

apresenta também significância estatística. A presença de diarreia foi observada em

17,2% dos doentes com microsporídios nas fezes enquanto 18,5% não apresentava

quadro diarreico (Quadro XXXIII).

A carga parasitária determinada nas amostras fecais, estimada com base no

critério referido nos métodos (vide Capítulo II– Material e Métodos, pág 133.), oscilou


- 159 -

entre baixa e média. Nos Quadros XXXVI e XXXVII podem ser observadas as cargas

parasitárias registadas nas amostras dos doentes positivos para microsporidia pela

técnica do Gram-Chromotrope.

Os esporos apresentavam uma forma oval, com dimensões da ordem dos 1,0 e

2,5 m, de parede fina corada de rosa com uma pequena zona polar ou central não

corada (Figura 8).

Figura 8. Fotografia de esporos de microsporidia, em esfregaço fecal, corado por

Gram-Chromotrope. (×1000). Original da autora.

Do número total de doentes positivos para microsporídios pela técnica

parasitológica, em 49 doentes, apesar das diligências efectuadas nesse sentido, não foi

possível obter a confirmação do resultado pelas técnicas moleculares. Refira-se que

relativamente a estes doentes, sempre que existia amostra fecal disponível procedia-se

sempre a um adicional processo de extracção de DNA e a amostra era novamente

submetida aos protocolos da PCR em uso.

Assim, de entre os 856 doentes estudados e de acordo com o critério de

positividade adoptado no presente trabalho, a percentagem de resultados positivos foi de

12,0% (103/856). A percentagem de crianças positivas para microsporidia foi superior à

dos adultos, 18,8% e 10,2% respectivamente. Este valor apresenta significância


- 160 -

estatística (ᵡ2=9,886; p=0,002). Os doentes positivos para microsporidia correpondiam a

12,5% de doentes do sexo masculino e 11,1% do sexo feminino.

Relativamente à serologia para VIH verificou-se que 13,9% eram seropositivos e

8,5% eram seronegativos para VIH, sendo esta diferença de valores estatisticamente

significativa (ᵡ2=5,384; p=0,020).

A presença de diarreia foi observada em 13,4% dos doentes positivos para

microsporidia e 10,2% não manifestavam diarreia.

As técnicas de PCR, identificaram duas espécies de microsporídios nas amostras

fecais dos doentes estudados no presente trabalho. As espécies E. bieneusi e Vittaforma-

like foram identificadas em 6,3% (54/856) e 6,8% (58/856), respectivamente dos

doentes estudados (Figura 9)

Figura 9. Fotografias do gel de agarose dos produtos de PCR, após

electroforese. (A) Os produtos de amplificação da SSU ITS LSU do rRNA de E.

bieneusi apresentam uma banda com 392 pb; Nos poços 1 e 3 encontram os controlos

positivo e negativo respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um

isolado de E. bieneusi, identificado numa amostra fecal. (B) Os produtos de

amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma banda com com 386 pb. Nos poços

1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo respectivamente. No poço 2 encontra-

se o produto de PCR de um isolado de Vittaforma-like, identificado numa amostra fecal.

M- marcador de peso molecular (100 pb)

(A) (B)

392pb 386pb


- 161 -

Atente-se que, a discrepância que se observa entre a soma do número de casos

das duas espécies de microsporídios identificadas (112) entre os doentes e o valor de

doentes positivos para microsporidia determinado (103/856) é devida à existência de

nove doentes com infecção simultânea por ambas as espécies, e que embora

referênciados foram contabilizados separadamente na análise estatística dos resultados.

Entre os 54 doentes com E. bieneusi observou-se uma população de: 5,6%

adultos e 8,8% crianças; 6,7% de elementos do sexo masculino e 5,6% do sexo

feminino; 7,0% de seropositivos para VIH e 5,1% de seronegativos para VIH; 7,3% de

doentes com diarreia e 5,0% sem diarreia.

A espécie Vittaforma-like foi identificada numa percentagem de crianças

superior à dos adultos, 12,2% e 5,3%, respectivamente. Esta diferença de valores

apresenta significância estatística (ᵡ2=10,514; p=0,001). Ao contrário, frequências

semelhantes desta espécie foram observadas entre o sexo masculino (7,0%) e feminino

(6,3%). A percentagem de seropositivos para VIH infectados por Vittaforma-like foi

superior à dos seronegativos para VIH, 8,2% e 4,1% respectivamente. Também neste

caso observa-se uma diferença de valores estatisticamente significativa (ᵡ2=5,225;

p=0,022). A presença de diarreia foi registada em 7,5% dos doentes positivos para

Vittaforma-like e 5,8% dos doentes não apresentavam quadro diarreico.

Quadro XXXII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade e

género dos doentes englobados no estudo.

GRUPO ETÁRIO GÉNERO

ADULTO

N=675

% (n)

CRIANÇA

N=181

% (n)

MASCULINO

N=586

% (n)

FEMININO

N=270

% (n)

MICROSPORIDIA

Pos por GC 13,5 (91) 33,7 (61)A

17,2 (101) 18,9 (51)

Pos* 10,2 (69) 18,8 (34)A

12,5 (73) 11,1 (30)

ESPÉCIES

E. bieneusi 5,6 (38) 8,8 (16) 6,7 (39) 5,6 (15)

Vittaforma-like 5,3 (36) 12,2 (22)A

7,0 (41) 6.3 (17)

Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo; Niveis de significância: AP≤ 0,05


- 162 -

Quadro XXXIII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à serologia

para VIH e presença ou ausência de diarreia, dos doentes englobados no estudo.

SEROLOGIA PARA VIH QUADRO CLÍNICO

VIH+

N=561

% (n)

VIH-

N=295

% (n)

COM

DIARREIA

N=493

% (n)

SEM

DIARREIA

N=363

% (n)

MICROSPORIDIA

Pos por GC 21,7 (122)A

10,2 (30) 17,2 (85) 18,5 (67)

Pos* 13,9 (78)A

8,5 (25) 13,4 (66) 10,2 (37)

ESPÉCIES

E. bieneusi 7,0 (39) 5,1 (15) 7,3 (36) 5,0 (18)

Vittaforma-like 8,2 (46)A

4,1 (12) 7,5 (37) 5,8 (21)

Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de

positividade adoptado no presente estudo; Niveis de significância: AP≤ 0,05

2.1.1.1 Seropositivos para o VIH

O diagnóstico parasitológico das amostras fecais dos 561 seropositivos para VIH

revelou estruturas ovaladas compatíveis com microsporídios em 122 doentes (21,7%)

(Quadro XXXIII) Destes doentes positivos para microsporidia observou-se uma

frequência de crianças com esporos nas fezes superior à frequência de adultos, 31,7% e

18,9% respectivamente. Esta diferença de valores é considerada com significância

estatística (ᵡ2=9,547; p=0,002). Entre a população de doentes infectados por

microsporidia registaram-se as seguintes frequências: 20,8% de doentes do sexo

masculino e 24,2% do sexo feminino; 19,5% apresentavam diarreia e 25,2% sem

diarreia (Quadro XXXIV).

No entanto a percentagem de resultados positivos para microsporidia decresce,

nesta população de imunossuprimidos, quando consideramos como amostras positivas

apenas as que satisfazem o critério de positividade. A percentagem de amostras

positivas determinada foi de 13,9% (78/561) (Quadro XXXIII). O decréscimo neste

valor deve-se ao número de amostras positivas parasitologicamente mas em que não foi

obtida confirmação por pelo menos uma das técnicas de PCR aplicadas no estudo. Dos

78 doentes positivos para microsporidia, 12,4% eram adultos e 19,0% eram crianças. A


- 163 -

frequência de amostras positivas determinada nos doentes do sexo masculino e feminino

foi de 14,7% e de 11,8%, respectivamente. Tal como para os parâmetros anteriores, não

foi encontrada qualquer diferença estatisticamente significativa entre a frequência de

doentes positivos para microsporidia com quadro diarreico (15,3%) e os doentes que

não apresentavam diarreia (11,7%) (Quadro XXXIV).

As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em 7,0% (39/561)

e 8,2% (46/561), respectivamente dos seropositivos para VIH (Quadro XXXIII). Em

seis doentes foi registada co-infecção por ambas as espécies de microsporidia.

Entre os 39 doentes com E. bieneusi registaram-se as seguintes frequências:

6,0% de adultos e 10,3% de crianças; 7,4% do sexo masculino e 5,9% do sexo

feminino; 8,6% com diarreia e 4,5% sem diarreia.

No que respeita aos 46 doentes infectados por Vittaforma-like, a população era

contituida por 7,4% de adultos e 11,1% de crianças, 8,8% pertenciam ao sexo masculino

e 6,5% ao sexo feminino. A presença de diarreia observa-se am 8,6% dos doentes,

enquanto que em 7,7% não se verificou o quadro diarreico. No Quadro XXXIV,

encontram-se sumarizados os resultados da distribuição das frequências de

microsporidia, em relação à idade, género dos doentes e presença ou ausência de

diarreia dos doentes seropositivos para VIH englobados no estudo.

Quadro XXXIV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade,

género e quadro clínico, em seropositivos para VIH.

GRUPO ETÁRIO GÉNERO QUADRO CLÍNICO

ADULTO

N=435

% (n)

CRIANÇA

N=126

% (n)

MASCULINO

N=408

% (n)

FEMININO

N=153

% (n)

COM DIARREIA

N=339

% (n)

SEM DIARREIA

N=222

% (n)

MICROSPORIDIA

Pos por GC 18,9 (82)A

31,7 (40) 20,8 (85) 24,2 (37) 19,5 (66) 25,2 (56)

Pos* 12,4 (54) 19,0 (24) 14,7 (60) 11,8 (18) 15,3 (52) 11,7 (26)

ESPÉCIES

E. bieneusi 6,0 (26) 10,3 (13) 7,4 (30) 5,9 (9) 8,6 (29) 4,5 (10)

Vittaforma-like 7,4 (32) 11,1 (14) 8,8 (36) 6,5 (10) 8,6 (29) 7,7 (17)

Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo

Niveis de significância: AP≤ 0,05


- 164 -

2.1.1.2. Seronegativos para VIH

O diagnóstico parasitológico das amostras fecais dos 295 seronegativos para

VIH revelou estruturas ovaladas compatíveis com microsporídios em 30 doentes

(10,2%) (Quadro XXXIII). A frequência de crianças com microsporidia foi muito

superior à registada nos adultos, 38,2% e 3,8% respectivamente. Esta diferença de

valores obtidos para os adultos e as crianças foi considerada com significância

estatística (ᵡ2=58,070; p≤0,001). Os doentes positivos para microsporidia correpondiam

a 9,0% de doentes do sexo masculino e 12,0% do sexo feminino. Relativamente ao

quadro clínico verificou-se que 12,3% apresentavam diarreia e 7,8% não tinham diarreia

(Quadro XXXV).

A percentagem de amostras positivas para microsporidia determinada, segundo o

critério de positividade, foi de 8,5% (25/295) (Quadro XXXIII). Também aqui se

registou uma percentagem de crianças infectadas (18,2%) por microsporidia superior à

percentagem determinada para os adultos (6,3%) (ᵡ2=8,213; p=0,012). A população de

doentes positivos era constituída por 7,3% de pessoas do sexo masculino e 10,3% do

sexo feminino; a presença de diarreia foi observada em 9,1% dos doentes, enquanto que

7,8% não tinham quadro diarreico (Quadro XXXV).

As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em 5,1% (15/295)

e 4,1% (12/295), respectivamente dos doentes estudados (Quadro XXXIII). Dois

seronegativos para VIH apresentavam co-infecção por ambas as espécies de

microsporídios.

Os 15 casos de E. bieneusi correspondiam a 12 adultos (5,0%) e três crianças

(5,5%), nove doentes do sexo masculino (5,1%) e seis do sexo feminino (5,1%), sete

doentes com diarreia (4,5%) e oito sem diarreia (5,7%) (Quadro XXXV).

A frequência de crianças infectadas por Vittaforma-like foi superior à observada

nos adultos, 14,5% e 1,7% respectivamente. Sendo esta diferença de valores

estatisticamente significativa (ᵡ2=19,019; p≤0,001). Pelo contrário não foram registadas

diferenças com significância estatística entre as frequências de doentes do sexo

masculino (2,8%) e do sexo feminino (6,0%) infectados por esta espécie. A presença de

diarreia foi observada em 5,2% dos doentes e 2,8% não manifestavam diarreia. No

Quadro XXXV, encontram-se sumarizados os resultados da distribuição das frequências


- 165 -

de microsporidia, em relação à idade, género dos doentes e presença ou ausência de

diarreia dos seronegativos para VIH incluídos no estudo.

Quadro XXXV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade,

género e quadro clínico, em seronegativos para VIH.

GRUPO ETÁRIO GÉNERO QUADRO CLÍNICO

ADULTO

N=240

% (n)

CRIANÇA

N=55

% (n)

MASCULINO

N=178

% (n)

FEMININO

N=117

% (n)

COM DIARREIA

N=154

% (n)

SEM DIARREIA

N=141

% (n)

MICROSPORIDIA

Pos por GC 3,8 (9) 38,2 (21)A

9,0 (16) 12,0 (14) 12,3 (19) 7,8 (11)

Pos* 6,3 (15) 18,2 (10)A

7,3 (13) 10,3 (12) 9,1 (14) 7,8 (11)

Espécies

E. bieneusi 5,0 (12) 5,5 (3) 5,1 (9) 5,1 (6) 4,5 (7) 5,7 (8)

Vittaforma-like 1,7 (4) 14,5 (8)A

2,8 (5) 6,0 (7) 5,2 (8) 2,8 (4)

Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo ; Niveis de significância: AP≤ 0,05

2.1.1.3. Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon bieneusi e

Vittaforma-like

No presente trabalho, foram submetidos à caracterização do locus ITS rRNA, os

54 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, e do locus SSU rRNA, os 58 isolados da

espécie Vittaforma-like, identificados nas amostras fecais da população humana

estudada.

A totalidade dos 58 isolados de Vittaforma-like obtidos foi caracterizada

geneticamente com recurso à sequenciação nucleotídica do fragmento amplificado pela

PCR. Dois genótipos diferentes foram identificados entre as sequências em análise,

Isolado 5830 (código de acesso ao GenBank AY375043) (39 amostras) e Isolado 5843

(código de acesso ao GenBank AY375044) (19 amostras), com frequências de 67,2% e

32,8%, respectivamente.

Dos 54 isolados de E. bieneusi foram caracterizados geneticamente 48 isolados,

com sucesso. A determinação da sequência nucleotídica de todos os fragmentos da

região ITS rRNA amplificados e o seu alinhamento com outras sequências de identidade


- 166 -

conhecida, a partir de todas as sequências alinhadas, permitiu identificar o genótipo de

48 dos isolados com amplificação positiva. Nestes foram encontrados um total de seis

genótipos diferentes, Tipo IV (18 amostras), Peru 6 (14 amostras), D (seis amostras), A

(quatro amostras), PtEb II (três amostras) e C (três amostras).

No Quadro XXXVI (seropositivos para VIH) e Quadro XXXVII (seronegativos

para VIH) encontram-se sumarizados os dados demográficos, clínicos, laboratoriais e

epidemiológicos da população estudada com microsporidia nas amostras fecais, cujos

isolados foram caracterizados no presente trabalho.


- 167 -

Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras

fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.

Nº AMOSTRA DATA GRUPO

ETÁRIO

IDADE

(ANOS)

SEXO SEROLOGIA

PARA VIH DIARREIA GC

CARGA

PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE(S)

GENÓTIPO(S)

EB/VL OUTROS

39 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like A/ Isolado 5830 Giardia lamblia

41 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like TipoIV/ Isolado 5830 - 42 2000 A M Pos Sim Pos ++ Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 45 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 49 2000 C 7 F Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 Isoapora belli

52 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 54 2000 A 40 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 56 2000 C 5 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 58 2000 C 4 F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 62 2000 A M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 72 2000 C 6 F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 73 2000 C 6 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 74 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 77 2000 A F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 90 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 92 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 93 2000 C 1 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -

124 2001 A 36 M Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV - 141 2001 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 145 2001 C 0,67 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 151 2001 A M Pos Não Neg Pos E. bieneusi ND - 155 2001 A M Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi A - 182 2001 C 9 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi ND - 189 2001 A 27 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 190 2001 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 213 2002 C 11 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 Giardia lamblia

228 2002 C 1 M Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 265 2002 C 5 F Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV -

A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like; ND: não determinado.


- 168 -

Quadro XXXVI – Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras

fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho (continuação).

NºAMOSTRA DATA GRUPO ETÁRIO

IDADE (ANOS) SEXO SEROLOGIA

PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE (S) GENÓTIPO(S)

EB/VL OUTROS

291 2002 A 35 F Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi TipoIV - 322 2003 C 5 M Pos Sim Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV - 428 2004 C 9 F Pos Não Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 434 2004 C 9 F Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 435 2004 C 11 M Pos Não Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like D/ Isolado 5830 - 437 2004 A 61 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 439 2004 A M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 443 2004 C 13 M Pos Não Pos + Pos E. bieneusi TipoIV - 446 2004 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 449 2004 C 11 F Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 451 2004 C 3 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi A - 482 2004 A M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 515 2004 C 33 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi D - 519 2005 A 41 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 526 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII - 532 2005 A 39 F Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 538 2005 A 44 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi D - 540 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII - 541 2005 A 37 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 544 2005 C 13 F Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like D/ Isolado 5843 Isospora belli

559 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 560 2005 A 40 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 567 2005 A 32 F Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 569 2005 A 55 M Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 574 2005 A 45 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 575 2005 A 33 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 576 2005 C 0,75 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 580 2005 A F Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -

A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade

adoptado no estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR). EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like.


- 169 -

Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras

fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho (continuação).



PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO(S)

EB/VL OUTROS

581 2005 A 33 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 592 2005 A 35 F Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 595 2005 A 46 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 598 2005 A M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 601 2006 C 16 M Pos S Neg Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 609 2006 C 14 F Pos S Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 623 2006 A 44 M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 625 2006 A 25 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 627 2006 C 5 M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 630 2006 A 26 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 639 2006 A 39 M Pos S Neg Pos E. bieneusi C - 640 2006 A 73 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 641 2007 A 51 M Pos S Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 649 2007 A 61 F Pos S Neg Pos E. bieneusi C - 684 2008 A 32 M Pos S Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 707 2009 A M Pos S Pos + Pos E. bieneusi ND - 711 2009 A M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 720 2008 A 27 M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 721 2008 A 72 M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 729 2008 A 83 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 788 2008 A 31 F Pos S Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 832 2008 A 48 F Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV -

A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade

adoptado neste estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like; ND: não determinado.


- 170 -

Quadro XXXVII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seronegativos para VIH com microsporidia nas amostras

fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.



PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO(S)

EB/VL OUTROS

34 1999 C 3 F Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 40 2000 C 3 F Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 46 2000 C 1 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 53 2000 C 5 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -

104 2000 C F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 177 2001 A 76 M Neg Sim Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV quimioterapia 232 2002 C F Neg Sim Pos + Pos E. bieneusi D - 266 2002 C 20m M Neg Não Pos + Pos E. bieneusi D - 375 2003 C M Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 381 2003 C 3 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 391 2003 C 8 F Neg Não Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like Peru6/Isolado 5843 Giardia lamblia

440 2004 A M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi /Vittaforma-like A/ Isolado 5830 Transplantado renal 543 2005 A 15 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 606 2006 A 48 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -

631 2006 A 39 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 Regressou de África

731 2008 A 50 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi TipoIV viajante 734 2008 A 48 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 Pancreatite crónica 742 2008 A 70 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 769 2008 A 56 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV asma 770 2008 A 55 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII emagrecimento 780 2008 A 45 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 Vírus da hepatite C 797 2008 A 23 F Neg Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 816 2008 A 69 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 833 2008 A 85 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi C - 834 2008 A 28 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 -

A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; m: meses; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos

segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi;

VL: Vittaforma-like.


- 171 -

2.1.2. Microsporidia em amostras de urina

No total dos 69 doentes estudados detectou-se microsporidia numa amostra de urina

de um doente (1,5%). A amostra pertencia a um adulto, do sexo masculino com

serologia positiva para VIH.

2.1.2.1. Seropositivos para VIH

Entre os 59 seropositivos para VIH estudados, apenas num doente foram

encontrados esporos de microsporídios, o que corresponde à percentagem de infecção

de 1,7%.

Na Figura 10 podem observar-se os produtos de PCR do locus SSU rRNA,

correspondentes aos resultados da amplificação do fragmento com 520 pb característico

da espécie E. intestinalis.

Figura 10. Fotografia do gel de agarose dos produtos de PCR de E. intestinalis, após

electroforese. Os produtos de amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma

banda com 520 pb. Nos poços 1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo

respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um isolado de E.

intestinalis, identificado numa amostra de urina. M- marcador de peso molecular (100

pb)

520 pb


- 172 -

O amplicão submetido a sequenciação nucleotídica e posterior alinhamento com outras

sequências de identidade conhecida revelou 100% de homologia para a referida região

com isolados de E. intestinalis registados previamente no Genbank, por outros autores

(Código de acesso ao GenBank SIU09929).

2.1.2.2. Seronegativos para VIH

Em nenhuma das amostras de urina dos 10 seronegativos para VIH foram

detectados microsporídios.

2.1.3. Microsporidia em secrecções pulmonares

No total dos 200 doentes estudados, incluindo seropositivos e seronegativos para

VIH, através da técnica histoquímica do Gram-Chromotrope, foram detectadas

estruturas ovaladas compatíveis com esporos de microsporídios, apenas numa amostra

de um doente (0,5%) (Figura 11).

Figura 11. Fotografias de esporos de E. cuniculi, em esfregaço de lavado brocoalveolar,

corado por Gram-Chromotrope. (×1000). Original da autora.

De acordo com o critério de positividade definido no presente trabalho, a

frequência de secrecções pulmonares positivas para microsporidia foi de 1,0% (2/200),

no total da população estudada.


- 173 -

2.1.3.1. Seropositivos para VIH

A pesquisa e identificação de microsporídios em secreções pulmonares

(expectoração induzida e LBA) dos 150 seropositivos para VIH revelaram que dois se

encontravam parasitados, o que corresponde a uma percentagem de infecção por

microsporidia nesta população de 1,3%. Os dados demográficos, clínicos, laboratoriais

e epidemiológicos dos doentes, em cujas secreções pulmonares foram identificados

microsporídios podem ser observados no Quadro XXXVIII.

Quadro XXXVIII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos dois

doentes, cujos isolados de Encepalitozoon cuniculi e Vittaforma-like foram caracterizados no

presente trabalho.

Nº

AMOSTRA DATA IDADE SEXO

SEROLOGIA

PARA VIH

GRUPO

DE RISCO GC CP POS* ESPÉCIE GENÓTIPO ESPÉCIME

216 1997 37A M Positivo T Pos ++ Pos E. cuniculi ND LBA

576 2000 26A F Positivo T Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830/

AY375043 EI

A- Anos; M- masculino; F- feminino; T- toxicodependente; GC: Gram-Chromotrope; Pos- positivo; Neg- negativo; CP: carga parasitária; Pos*:positivos segundo o critério de positividade adoptado neste estudo; ND: não determinado; EI: expectoração induzida; LBA: lavado broncoalveolar;

A amplificação do fragmento alvo da SSU rRNA permitiu identificar a espécie

Vittaforma-like numa das amostras, cujo resultado pela técnica histoquímica fora

negativo.

Por outro lado, registou-se a detecção parasitológica de estruturas compatíveis

com esporos de microsporídios numa amostra em que se verificou a ausência de

amplificação de DNA por uma das cinco técnicas principais de PCR a que foram

submetidas todas as amostras englobadas no presente trabalho. Porém com recurso a

técnica de PCR que permite a detecção de várias espécies de microsporidia foi possível

a amplificação de um fragmento da SSU rRNA com aproximadamente 1100 pb (Figura

12).


- 174 -

Figura 12. Fotografia do gel de agarose dos produtos de PCR de microsporidia, após

electroforese. Os produtos de amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma

banda com 1124 pb. Nos poços 1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo

respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um isolado de E.

cuniculi,, identificado num lavado broncoalveolar. M- marcador de peso molecular

(1kb)

A determinação da sequência nucleotídica do amplicão (1124pb) e os resultados

produzidos pelo seu alinhamento com outras sequências de identidade conhecida,

permitiu demonstrar que o isolado obtido apresentava na referida região 99% de

homologia com isolados de E.cuniculi previamente descritos por outros autores (código

de acesso ao GenBank AL391737). Da caracterização genética do isolado de E. cuniculi

obtido verifica-se a ocorrência de uma única alteração nucleotídica na sequência, em

que a base T (posição 201864 da 16S rRNA), corresponde a uma base A na sequência

descrita por outros autores (código de acesso ao GenBank AL391737).

A caracterização genética do fragmento amplificado do gene SSU rRNA de

Vittaforma-like revelou homologia com o Isolado 5830 previamente descrito no

GeneBank (código de acesso ao AY375043).

1124 pb


- 175 -

3. DISCUSSÃO

E.bieneusi, E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem são consideradas as quatro

principais espécies de microsporídios patogénicas para o Homem. As duas primeiras

espécies, são os principais agentes da microsporidiose intestinal humana. A doença

encontra-se particularmente associada a seropositivos para VIH com níveis de

contagens de linfócitos TCD4+≤ 100 céls/mm3 [Bern et al. 2005; Endeshaw et al. 2006;

Samie et al. 2007; Espern et al. 2007; Thellier & Breton 2008] ou pessoas com outras

causas de imunossupressão.

Apesar de E. bieneusi ser responsável por aproximadamente 90% dos registos de

infecção, outras espécies de microsporídios têm sido reportadas na literatura [Orenstein

et al. 1994; Didier 2005; Endeshaw et al. 2006; Espern et al. 2007; Thellier & Breton

2008]. É o caso da nova espécie Vittaforma-like, isolada em amostras fecais de doentes

seropositivos e seronegativos para VIH e até agora apenas descrita em Portugal

[Sulaiman et al. 2003c].

É provável que a microsporidiose seja uma infecção subdiagnosticada, qualquer

que seja a metodologia de diagnóstico adoptada. Por um lado, as reduzidas dimensões e

o fraco poder de coloração dos esporos do parasita, podendo ser facilmente confundidos

com outros microrganismos (bactérias, leveduras) existentes em abundância em

determinados produtos biológicos, tais como nas fezes, requer a presença de técnicos

especializados nos laboratórios de rotina, para um diagnóstico correcto. A existência nas

amostras clínicas de inibidores da PCR pode também condicionar pela negativa a

correcta interpretação dos resultados obtidos por estas técnicas. Acresce ainda, que a

pesquisa de microsporídios em geral não é incluída no diagnóstico diferencial efectuado

a pessoas com quadro diarreico, nem em amostras de urina para avaliar os microsporidia

como uma possível causa de infecção sistémica.

A epidemiologia dos microsporidia continua com diversos aspectos por clarificar

e os valores das prevalências descritas para estes parasitas, apresentam diferenças

significativas nas diversas regiões do globo. Em Portugal, a informação sobre a

microsporidiose humana é escassa sendo reduzido o número de estudos registados até à

data.


- 176 -

Metodologia adoptada. No presente trabalho foram seleccionadas duas

metodologias complementares tendo por objectivo potenciar a detecção e a identificação

dos microsporidia nas amostras biológicas da população a estudar. As dificuldades

criadas pelas reduzidas dimensões destes agentes e o elevado grau de contaminação

microbiana próprio de certo tipo de amostras, recomendam que se utilizem em

simultâneo, vários métodos de diagnóstico laboratorial, de modo a aumentar a

sensibilidade do rastreio. Idealmente, um desses métodos deveria ser a microscopia

electrónica, pois trata-se da técnica de referência para o diagnóstico laboratorial das

microsporidioses. Porém, são raros os laboratórios que dispõem deste equipamento,

para além de ser uma técnica onerosa e demorada. Assim, neste trabalho a escolha para

efectuar o diagnóstico parasitológico, recaiu sobre a coloração histoquímica pelo Gram-

Chromotrope e a técnica para o diagnóstico molecular, baseou-se na PCR para

amplificação da região conservada do gene que codifica o rRNA, e/ou amplificação da

região polimórfica ITS rRNA, consoante as espécies a estudar. O critério de selecção

adoptado fundamentou-se nas técnicas mais usadas no diagnóstico da microsporidiose,

de acordo com a pesquisa bibliográfica efectuada e com a experiência na área em

questão, obtida em trabalhos prévios, pela equipa de investigação de que faz parte a

autora deste estudo [Matos et al. 2001; Matos et al. 2002; Lobo et al. 2003].

A interpretação dos resultados da técnica de Gram-Chromotrope é de maior

subjectividade e requer alguma experiência do examinador. Por conseguinte, um doente

com uma amostra biológica positiva por esta técnica, só foi considerado positivo, se

confirmado por, pelo menos um dos protocolos da PCR utilizados no estudo.

Da análise dos resultados obtidos pelas diferentes técnicas, parasitológica e

molecular, verifica-se que nem sempre houve conformidade dos resultados, entre as

técnicas aplicadas. Dos 152 casos com amostras fecais positivas, através do Gram-

Chromotrope apenas 103 (12,0%) casos foram confirmados pelas técnicas da PCR.

Inicialmente, a técnica de PCR foi repetida, e como o resultado persistiu, procedeu-se

sempre que existia amostra fecal, a nova extracção de DNA e a nova amplificação.

Todos os resultados mantiveram-se inalterados. O insucesso experimentado na

amplificação por PCR, poderá dever-se à presença de inibidores de polimerases,

frequentemente presentes, nas amostras fecais. Aliás, esta hipótese é frequentemente

aludida por vários autores [van & Dankert 1995; Raynaud et al. 1998; Muller et al.


- 177 -

1999; Wolk et al. 2002; Lores et al. 2002a]. Outra explicação, poderá ser devida a

ineficiência na extracção de DNA, apesar de nalguns casos se ter repetido a operação.

Noutros casos não foi possível a repetição, devido a ausência de mais amostra fecal.

Uma outra interpretação poderá ser dada, se as espécies de microsporídios detectadas

pela técnica de coloração, não forem as espécies pesquisadas pela técnica de PCR, com

os pares de primers utilizados neste trabalho. É também possível que na presença de

esfregaços espessos, com elevada contaminação microbiana, outros microrganismos tais

como bactérias ou pequenas leveduras que mimetizam em tamanho, forma e coloração,

os esporos dos microsporídios, possam ser confundidos com estes parasitas. Nestes dois

casos, os resultados da técnica de coloração seriam considerados falsos positivos.

Por outro lado, nos 69 doentes cujas amostras de urina foram estudadas, o único

caso positivo pela PCR, havia sido negativo pelo Gram-Chromotrope. Também no total

das secrecções pulmonares estudadas, correspondentes a 200 doentes, a percentagem de

amostras positivas foi maior com a técnica da PCR (1,0%; 2 amostras) do que com a

coloração histoquímica (0,5%;1 amostra). Em seguida são mencionadas algumas das

possíveis razões da discordância observada entre as duas técnicas:

a) Relacionado com o limite de detecção de esporos de cada técnica. Um estudo

cego, realizado com o objectivo de comparar a qualidade dos parâmetros de

detecção, obtida pela técnica de PCR e pela observação ao microscópio

óptico, de preparações coradas pelo tricrómio modificado, indicou um limite

de detecção de 102 esporos por ml, e de 104 esporos por ml, respectivamente

[Rinder et al. 1998a]. Outro estudo chegou a uma conclusão semelhante

quando comparou as duas técnicas referidas, mais a coloração pelo

calcoflúor, aplicadas em fezes de animais [Fayer et al. 2003a]. Assim a

técnica de PCR poderá ser mais sensível, para as amostras que apresentem

uma concentração baixa de esporos. Outros autores, que também

empregaram métodos de coloração e a técnica de PCR no rastreio da

microsporidiose, também obtiveram mais casos positivos, por este último

método [Gumbo et al. 1999b; Fayer et al. 2003b; Endeshaw et al. 2005;

Abreu-Acosta et al. 2005; Notermans et al. 2005].

b) Outros dos aspectos, inerentes à técnica de coloração, como esfregaços

espessos, ou a existêntia de muco como se pode observar nas secreções


- 178 -

pulmonares, ou a propensão que os esporos exibem para se aglomerarem,

podem explicar os falsos negativos obtidos pela técnica de coloração.

Frequência de microsporidia nas fezes da população estudada. A

comparação de prevalências ou percentagens da infecção por microsporidia, entre os

diversos estudos descritos na literatura é difícil de estabelecer e deve ser efectuada com

algum cuidado. As diferenças ou semelhanças observadas entre os diversos trabalhos

publicados podem não ser comparáveis, por constituirem o reflexo de abordagens

distintas à detecção e identificação dos microsporídios, no que respeita à selecção da

população, ao tipo de espécimes analisados ou à aplicação de diferentes metodologias

(técnicas parasitológicas para microscopia óptica ou PCR). Maioritariamente os estudos

de prevalência da microsporidiose intestinal publicados, referem-se especificamente à

identificação de E. bieneusi.

As percentagens de doentes com microsporidia, de 17,8% (técnica de coloração)

e de 12,0% (segundo o critério de positividade adoptado) determinadas durante este

trabalho enquadram-se dentro dos valores descritos nos vários estudos na literatura.

Contudo, em Portugal, na região de Lisboa, num total de 280 seropositivos para VIH

havia sido detectada anteriormente uma percentagem superior, de 33,5% de infecção

por microsporídios, apenas por técnicas parasitológicas, a partir de diferentes amostras

biológicas (estudo efectuado pela equipa de investigação de que faz parte a autora deste

trabalho) [Matos et al. 2002]. A recente aplicação de técnicas de diagnóstico mais

específicas são a razão que certamente influenciou os valores de frequência de infecçâo

por microsporidia obtidos no presente trabalho. Certamente, a metodologia adoptada

conduziu a resultados mais verídicos quando comparados com a percentagem de

infecção apenas por técnicas parasitológicas. Noutro estudo conduzido na cidade do

Porto, num total de 215 doentes com sida, em que foram identificados 92 casos (42,8%)

de microsporidiose [Ferreira et al. 2001]. Outra razão sugerida, para o decréscimo da

frequência de infecção por microsporidia registada no presente estudo, prende-se com a

diminuição das infecções oportunistas entre os seropositivos para VIH ao longo da

última década, em Portugal, resultado da corrente administração da HAART e outras

terapêuticas profilácticas com concomitante restabelecimento dos níveis de linfócitos T

CD4+ dos doentes.


- 179 -

Serologia para VIH e microsporidia. A maioria dos casos de microsporidiose,

ocorrem em seropositivos para VIH-1, embora também já tenha sido reportada em

infectados por VIH-2 [Lebbad et al. 2001]. De acordo com a localização geográfica e o

método de diagnóstico utilizado, a prevalência da doença, em grupos de seropositivos

para VIH, oscila entre 1,7% e 30% [Lebbad et al. 2001; Okhuysen 2001].

No presente trabalho, considerando a totalidade dos 856 doentes estudados

registou-se uma associação com significância estatística entre a presença de

microsporidia nas fezes e a seropositividade para VIH. A frequência de microsporídios

nas fezes foi superior à frequência observada nos seronegativos para VIH, 13,9% e

8,5%, respectivamente (vide Quadro XXXIII). Atendendo a que a infecção por

microsporidia é considerada uma doença oportunista, os resultados obtidos enquadram-

se dentro do esperado. Assim, seria de prever que doentes com um sistema imunológico

debilitado, como o que se verifica com os seropositivos para VIH tivessem uma maior

probabilidade de contrair a infecção por microsporidia. Tuli e colaboradores, num

estudo conduzido na India, em que registaram uma prevalência de 23,1% de

microsporídios em fezes de seropositivos para VIH, através de técnicas parasitológicas,

também verificaram uma associação da infecção por microsporidia com os seropositivos

para VIH [Tuli et al. 2010].

Grupo etário e microsporidia. Neste estudo, as amostras fecais

correspondentes a 18,8% das crianças e 10,2% dos adultos foram positivas para

microsporidia (Quadro XXXII). Registando-se uma associação estatisticamente

significativa entre o grupo etário das crianças e a infecção por microsporidia. Entre as

razões sugeridas para estes resultados incluem-se a presença neste grupo etário de um

sistema imunológico ainda em desenvolvimento e, no geral, caracterizam-se por um

deficit de hábitos de higiene e de um contacto mais directo e desprotegido com

potenciais fontes de infecção por microsporídios (animais e ambiente)

comparativamente aos adultos. Diversos estudos descrevem a infecção por

microsporidia em crianças (a maioria seropositivas para VIH) com valores de

frequência variados e em que a maioria se refere à espécie E. bieneusi: Uganda - 32,9%

[Tumwine et al. 2005]; Zimbabué até 50% [Gumbo et al. 1999b]; África do Sul - 4,5%

[Samie et al. 2007]; Nigéria – 0,8% (8/990) [Bretagne et al. 1993]; Tailândia – 14,9%

(13/87) [Wanachiwanawin et al. 2002] e Espanha – 2% [del et al. 1997b].


- 180 -

Quadro diarreico e microsporidia. A diarreia é a manifestação clínica mais

comum associada à infecção por microsporidia reportada na literatura [Eeftinck

Schattenkerk et al. 1991; Molina et al. 1993; Kotler & Orenstein 1994; Asmuth et al.

1994; Abreu-Acosta et al. 2005; Satheeshkumar et al. 2005; Endeshaw et al. 2006].

Neste trabalho, a frequência de doentes positivos para microsporidia que apresentavam

quadro diarreico foi de 13,4% e sem diarreia de 10,2% (vide Quadro XXXIII). Contudo,

não foi observada associação significativa entre a presença de diarreia e a percentagem

de doentes com microsporídios nas fezes. Este facto é corroborado por estudos de

Sarfati e colaboradores nos Camarões e de Chacin-Bonillana na Venuzuela [Sarfati et

al. 2006; Chacin-Bonilla et al. 2006] e, ainda, por outros autores [Rabeneck et al. 1993;

Clarridge, III et al. 1996].

A maioria dos casos descritos na literatura, associa a presença de diarreia a

doentes seropositivos para VIH com contagem de linfócitos T CD4+ inferiores a 100

céls/mm3. Todavia, não foi possivel obter estes dados para a maior parte dos doentes,

englobados neste estudo. Pode-se especular se a ausência de correlação observada no

presente trabalho pode ser devida aos doentes estudados apresentarem níveis de

linfócitos T CD4+ superiores ao referido limite, ou ainda se a intensidade da infecção

não era suficiente para causar patologia, como já foi referido por outros investigadores

[Rabeneck et al. 1993]. Acresce ainda referir que a administração da HAART pode

influenciar directa ou indirectamente o estabelecimento e grau de severidade da

microsporidiose resultando na remissão da doença associada à infecção por VIH

[Goguel et al. 1997; Carr et al. 1998; Conteas et al. 1998b; Miao et al. 2000; Nannini &

Okhuysen 2002].

Espécies de microsporidia em amostras fecais. Nas amostras fecais dos

doentes estudados foram identificadas as espécies E. bieneusi e Vittaforma-like, com

frequências de 6,3% (54 amostras) e 6,8% (58 amostras), respectivamente. No grupo de

infectados por E. bieneusi não foram encontradas associações significativas entre os

doentes positivos para este microsporídio e as variáveis grupo etário (adulto/criança),

sexo, serologia para VIH ou a presença ou ausência de diarreia (vide Quadros XXXII e

XXXIII). Ao contrário, dos 58 infectados por Vittaforma-like a percentagem de crianças

infectadas (12,2%) foi significativamente superior à dos adultos (5,3%) (vide Quadro

XXXII), sugerindo a susceptibilidade deste grupo etário para contrair infecção por esta


- 181 -

espécie. A análise de resultados permitiu também verificar uma associação

estatísticamente significativa entre os seropositivos para VIH e a infecção por

Vittaforma-like. Em quarenta e seis seropositivos e 12 seronegativos para VIH foi

identificada esta espécie (Quadro XXXIII). Este resultado sugere também o possível

carácter oportunista desta espécie, como se observa para os microsporídios no geral.

Ocorrência e caracterização genética dos isolados de E. bieneusi e

Vittaforma-like. Tal como descrito na literatura por outros autores [Sulaiman et al.

2003a; Sulaiman et al. 2003b], também o nosso estudo veio corroborar a ocorrência

simultânea de diferentes genótipos de E. bieneusi em estudos com humanos de

diferentes áreas geográficas assim como a predominância de um dos genótipos entre a

população. No presente trabalho, nos 48 isolados obtidos desta espécie foram

identificados seis genótipos diferentes, previamente descritos. Não foram encontradas

associações entre as variáveis sexo, grupo etário, serologia para VIH, presença de

diarreia com os genótipos determinados. O Tipo IV, foi o genótipo identificado com

maior frequência 37,5%, seguido do Peru 6 com 29,2% e dos genótipos D e A com

12,5% e 8,3%, respectivamente. Os genótipos C e PtEb II foram identificados com

idêntica frequência, 6,3%. Até à data, os genótipos A e C só foram identificados no

Homem. Em contrapartida os genótipos Tipo IV, Peru 6 e genótipo D já foram descritos

numa vasta gama de hospedeiros, incluído o Homem e outros animais (inclusive em

cães, gatos e ruminantes em Portugal). O genótipo PtEb II apenas foi previamente

descrito em aves, em Portugal. A presença de genótipos associados apenas ao homem, e

outros que infectam o homem e outros animais sugerem a ocorrência, em Portugal, de

transmissão pessoa-a-pessoa e transmissão zoonótica de microsporídios.

No que diz respeito à espécie Vittaforma-like os isolados identificados

correspondem a dois genótipos previamente descritos exclusivamente em amostras

fecais, em Portugal [Sulaiman et al. 2003c], com predominância do Isolado 5830

(67,2%) sobre o Isolado 5843 (32,8%). Também para esta espécie não foram

encontradas associações entre as variáveis sexo, grupo etário, serologia para VIH,

presença de diarreia com qualquer um dos dois genótipos determinados.


- 182 -

Subgrupo da população estudada: amostras fecais de seropositivos para

VIH. Na análise dos resultados referentes ao subgrupo populacional dos 561

seropositivos para VIH verificou-se que 13,9% apresentavam microsporidia nas fezes.

Nestes 78 doentes positivos, identificaram-se as espécies E. bieneusi e Vittaforma-like

em 7,0 % e 8,2%, respectivamente (Quadro XXXIII). Em sete doentes foi registada co-

infecção por ambas as espécies. Dentro deste subgrupo de seropositivos para VIH foi

apenas detectada uma associação significativa entre o grupo etário das crianças com

microsporídios detectados apenas por Gram-Chromotrope (31,7% nas crianças vs 18,9%

nos adultos), comparativamente ao dos adultos (Quadro XXXIV). Nas restantes

variáveis comparadas com a infecção por microsporidia (no geral ou com isoladamente

de E. bieneusi e/ou Vittaforma-like isoladamente), nomeadamente grupo etário, sexo,

presença de diarreia, ou genótipo não foram encontradas quaisquer associações com

significância estatística. Todavia as percentagens de infecção por microsporídios

(19,0%), por E. bieneusi (10,3%) e por Vittaforma-like (11,1%) encontradas nas

crianças foram superiores às dos adultos (vide Quadro XXXIV). A infecção por E.

bieneusi é considerada como uma das infecções oportunistas mais comuns em crianças

seropositivas para VIH, na Tailândia registando-se percentagens que variam entre

valores de 4,1%, 10,8% até 25,3% [Leelayoova et al. 2001; Wanachiwanawin et al.

2002; Leelayoova et al. 2005]. Ao contrário do observado no presente trabalho,

Tumwine e colaboradores num estudo conduzido no Uganda, verificaram uma

associação significativa entre crianças seropositivas para VIH e a infecção por E.

bieneusi [Tumwine et al. 2005]. A frequência de E. bieneusi foi de 76,9% (70/91) e

6,6% (10/152) para as crianças seropositivas e seronegativas para VIH,

respectivamente.

Subgrupo da população estudada: amostras fecais de seronegativos para

VIH. Quando analisámos o subgrupo dos 295 seronegativos para VIH observou-se

8,5% de frequência de infecção por microsporidia, sendo que dos 25 doentes positivos,

em 5,1% foi identificada E. bieneusi e em 4,1% a espécie Vittaforma-like (vide Quadro

XXXIII). Em dois doentes foi detectada co-infecção por ambas as espécies. Ao

contrário do registado para os seropositivos para VIH, neste subgrupo foram

encontradas várias associações estatisticamente significativas. Nomeadamente,

verificou-se mais uma vez associação entre o grupo etário das crianças e a infecção por


- 183 -

microsporídios nas fezes, quer seja detectada apenas pela técnica do Gram-Chromotrope

(38,0% de crianças vs 3,8% de adultos), quer quando consideramos como casos

positivos os definidos pelo critério de positividade (18,2% de crianças vs 6,3% de

adultos). Acresce ainda, a associação com significância estatística observada entre as

crianças e a infecção por Vittaforma-like, comparativamente ao grupo etário dos adultos

(Quadro XXXV). No subgrupo dos seronegativos para VIH, não foram observadas

diferenças significativas entre doentes positivos e negativos para microsporidia e as

variáveis, sexo, presença de quadro diarreico e genótipo.

As microsporidioses também podem ser contraídas por pessoas com diversas

causas de imunossupressão e mesmo por imunocompetentes. Em seronegativos para

VIH, a microsporidiose foi descrita em doentes submetidos a transplantes [Gumbo et al.

1999a; Gamboa-Dominguez et al. 2003; Lanternier et al. 2009] e a quimioterapia, em

portadores de lentes de contacto [Theng et al. 2001], viajantes [Sandfort et al. 1994;

Raynaud et al. 1998; Muller et al. 2001; Okhuysen 2001], em crianças [Bretagne et al.

1993; Hautvast et al. 1997; Desportes-Livage et al. 1998] e em idosos [Lores et al.

2002b]. Como já foi discutido anteriormente as crianças representam um grupo

susceptível de contrair microsporidiose assim como, a população de idosos devido aos

processos fisiológicos de envelhecimento e às doenças crónicas, entre outros factores,

os quais dimunuem as suas defesas imunológicas.

No presente estudo, sugere-se que a frequência de infecção por microsporidia

(8,5%) observada neste subgrupo de seronegativos para VIH possa ter sido influenciada

por características específicas da população em análise. Dos 25 positivos para

microsporidia, 10 correspondiam a crianças e os restantes 15 eram adultos. Do total de

adultos positivos, sete correspondiam a (vide Quadro XXXVII): um doente submetido a

quimioterapia com 76 anos de idade (nºamostra 177); um doente transplantado renal

(nºamostra 440); dois idosos com 70 anos (nºamostra 742) e 85 anos (nºamostra 833);

um doente com asma severa; um doente que apresentava emagrecimento sem causa

determinada (nºamostra770); e um doente com infecção por vírus da hepatite C

(nºamostra 780). Assim, verificou-se que alguns dos adultos incluídos no estudo, apesar

da serologia negativa para VIH, caracterizavam-se por apresentar um maior ou menor

grau de imunossupressão, que puderá ter aumentado a sua susceptibilidade à infecção.


- 184 -

Ao longo da última década, têm surgido evidências de que a infecção por E.

bieneusi pode persistir em imunocompetentes portadores assintomáticos. E. bieneusi foi

isolado em 0,8% (8/990) de crianças africanas seronegativas para VIH, sem

sintomatologia [Bretagne et al. 1993]. Os autores do estudo sugeriram a existência de

portadores do parasita sem sintomatologia entre os imunocompetentes residentes em

regiões tropicais. Outros casos de infecção assintomática foram descritos em crianças

em África [Cegielski et al. 1999] e em crianças (5,9%) de um orfanato e adultos (1,9%)

dessa instituição, na Ásia [Mungthin et al. 2001]. No presente trabalho não foi

observada correlação entre a presença de diarreia e a infecção por qualquer das duas

espécies de microsporidíos identificadas, sugerindo-se que alguns dos seronegativos

para VIH estudados possam constituir portadores assintomáticos destes parasitas.

Frequência e caracterização específica de microsporidia em amostras de

urina da população estudada. Relativamente às amostras de urina dos doentes

estudados registou-se uma frequência de infecção baixa por microsporidia (1,7%) nos

seropositivos para VIH. Em nenhum seronegativo para VIH incluído no estudo foi

detectado microsporidia na urina.

A espécie E. intestinalis foi identificada na amostra de urina de um seropositivo

para VIH. E. intestinalis é considerada a segunda espécie mais comum responsável por

microsporidiose humana tendo sido descritos mais de 200 casos em

imunocomprometidos e também em imunocompetentes, embora num número reduzido

de registos [Raynaud et al. 1998; Graczyk et al. 2002; Lono et al. 2010]. A frequência

detectada no presente trabalho enquadra-se dentro dos estudos de outros autores, em que

as frequências descritas são em geral baixas e reportam-se a seropositivos para VIH:

0,9% (Suiça) [Weber et al. 1999a]; 2% (Alemanha) [Sobottka et al. 1998]; 3% (Zâmbia)

[Kelly et al. 1994]; 7,3% (EUA) [Coyle et al. 1996]. Em Portugal, E. intestinalis foi

identificada em 42,8% de fezes em seropositivos para VIH [Ferreira et al. 2001].

Todavia, não foi detectada nas amostras fecais analizadas no presente trabalho. Diversos

casos de E. intestinalis isolada na urina de doentes, encontram-se descritos. A espécie

foi detectada na urina e fezes de um doente, e na urina, fezes, exsudado nasal e da

conjuntiva de outro doente ambos com sida, que apresentavam microsporidiose

disseminada [Molina et al. 1995; Svedhem et al. 2002]. Boldorini e colaboradores

identificaram uma infecção renal por E. intestinalis, durante a autópsia a um doente com


- 185 -

sida [Boldorini et al. 1998]. A espécie foi também descrita como causadora de infecção

renal num doente transplantado de rim, tendo ocorrido cura após tratamento com

albendazol [Latib et al. 2001].

Frequência e caracterização específica de microsporidia em secreções

pulmonares da população estudada. A frequência de infecção por microsporidia

registada foi de 1,5%, sendo que as duas amostras positivas pertenciam a seropositivos

para VIH. Na população de seronegativos para VIH estudada não foram detectados

esporos de microsporídios.

Nas secreções pulmonares estudadas foram identificadas as espécies E. cuniculi

e Vittaforma-like, num lavado broncoalveolar e numa expectoração induzida,

respectivamente. E. cuniculi é uma espécie responsável por diversas patologias

localizadas e infecção disseminada em doentes imunocomprometidos [Schwartz et al.

1996; Mertens et al. 1997; Weber et al. 1997; Weitzel et al. 2001; Mohindra et al.

2002] assim como em imunocompetentes, tais como idosos, viajantes e residentes em

regiões tropicais [Didier et al. 2000; Gamboa-Dominguez et al. 2003]. Existem diversos

registos de infecção pulmonar por E. cuniculi, tais como os casos de dois doentes

transplantados de medula cuja identificação foi feita em exames pos mortem [Teachey

et al. 2004; Orenstein et al. 2005]. Em seropositivos para VIH, a espécie E. cuniculi já

foi detectada na expectoração, em casos esporádicos em países, como os EUA [De

Groote et al. 1995; Didier et al. 1996c; Croppo et al. 1997], Alemanha [Franzen et al.

1995b], Suiça [Weber et al. 1997], França [Fournier et al. 2000b] e em Espanha [del et

al. 2001a]. Em Portugal, desconhecem-se quaiquer registos de infecção humana ou de

outros animais por E. cuniculi, constituindo a descrição no presente trabalho o primeiro

caso de E. cuniculi num seropositivo para VIH, no país.

O achado da espécie Vittaforma-like numa expectoração induzida e com

genótipo idêntico a um dos isolados desta espécie previamente descrito apenas em

amostras fecais, constitui o primeiro caso identificado desta nova espécie em secreções

pulmonares. Não foi possível determinar se o doente apresentava uma infecção limitada

aos pulmões, ou uma infecção disseminada. A colheita da amostra data do ano de 2000

(incluída no estudo retrospectivo), não existindo a possibilidade de pesquisa do parasita

noutros produtos biológicos do doente. Embora, ainda, permaneça por clarificar a

epidemiologia associada a Vittaforma-like, a presença desta espécie nas vias aéreas


- 186 -

superiores pode sugerir que além da transmissão fecal-oral, possa ocorrer, também

transmissão por via aérea através da inalação dos esporos de reduzidas dimensões.

Capítulo IV


MICROSPORIDIA EM ANIMAIS

IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS

- 189 -

1. INTRODUÇÃO

A primeira descrição de um microsporídio, remonta a meados do século XIX,

nas indústrias de sericicultura de França e Itália. O agente em causa, Nosema bombycis,

provoca uma doença no bicho-da-seda, denominada pebrina [Wittner 1999]. Em 1922,

foi identificada, acidentalmente, a primeira infecção por microsporídios em coelhos de

laboratório, os quais desenvolveram sintomatologia nervosa. Este caso, constituiu o

primeiro registo de microsporidiose em mamíferos, sendo E. cuniculi a causa da doença

[Wright & Craighead 1922; Wittner 1999].

No entanto, poucos anos após o advento da sida, começaram a surgir casos de

microsporidiose humana, em doentes com esta síndrome, provocados por espécies de

microsporídios, até então desconhecidas. A microsporidiose humana está, com

frequência, associada a seropositivos para VIH mas afecta também doentes com outros

défices imunológicos e imunocompetentes [Wittner 1999].

Nos últimos anos, as espécies de microsporidia mais vezes reportadas no

Homem E. bieneusi, E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi foram identificadas em

diversas espécies de animais domésticos e silváticos. Nos mamíferos, E. cuniculi é o

agente causador da encefalitozoonose, afectando em particular, os coelhos, algumas

espécies de roedores e os cães [Snowden & Shadduck 1999]. Relativamente às aves, há

autores que sugerem, que estes animais constituem o reservatório de E. hellem [Suter et

al. 1998; Snowden & Logan 1999].

Os animais estão envolvidos na epidemiologia de muitas doenças definidoras de

sida [Glaser et al. 1994]. No que respeita à microsporidiose humana, apesar do estudo

desta infecção suscitar um interesse crescente, ainda pouco se sabe, sobre a gama de

hospedeiros, das várias espécies de microsporidia e o papel que os animais podem

desempenhar na cadeia epidemiológica da microsporidiose. Todavia, são cada vez mais

as evidências que apontam para a transmissão zoonótica destes agentes infecciosos,

fundamentadas em diversos estudos envolvendo maioritariamente E. bieneusi, a espécie

mais comum, responsável por infecção nos humanos [Mathis et al. 2005]. A recente

aplicação das técnicas moleculares, ao estudo deste microsporídio permitiu o

reconhecimento de diferenças genéticas intra-específicas que têm vindo a contribuir

para uma melhor compreenção da epidemiologia e transmissão zoonótica de E. bieneusi


- 190 -

[Mathis et al. 2005]. Diversos genótipos associados a grupos específicos de hospedeiros

e outros potencialmente zoonóticos, com capacidade de infectar uma vasta gama de

hospedeiros, inclusive os humanos encontram-se descritos em grupos de animais

domésticos e selvagens [Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al.

2000; Dengjel et al. 2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al.

2003a; Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004].

A ampliação de estudos abrangendo um maior número de espécies de animais

potenciais reservatórios de microsporidia e fontes de infecção humana e ambiental,

aliada à metodologia molecular, com o aperfeiçoamento e/ou desenvolvimento de

marcadores genéticos com elevado poder descriminativo irá, no futuro permitir

clarificar estes aspectos epidemiológicos deste grupo de parasitas.

2. RESULTADOS

2.1. DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM ANIMAIS.

2.1.1. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais domésticos - cães e

gatos e cães errantes.

A presença de microsporídios nas fezes foi detectada em 13 (quatro cães e nove

gatos; 11,2%) dos 116 cães e gatos (animais de companhia e cães errantes) estudados,

através da técnica de coloração de Gram-Chromotrope. Na maioria das amostras

verificou-se carga parasitária baixa (quatro cães e sete gatos). Em dois gatos, observou-

se uma amostra com carga parasitária média e outra elevada.

Tendo em consideração o critério de positividade adoptado no presente estudo

(amostra positiva: positiva simultâneamente por Gram-Chromotrope e por PCR, ou

exclusivamente por PCR), a frequência de animais infectados por microsporidia foi de

12,1% (14/116), segundo A percentagem de cães e gatos infectados foi de 8,6 % (5/58)

e 15,5% (9/58), respectivamente. Os nove gatos e três cães positivos para microsporidia

pertenciam a agregados familiares e dois cães eram procedentes do Canil Municipal de

Torres Vedras. Os animais positivos para microsporidia não apresentavam


- 191 -

sintomatologia, com excepção de dois gatos que manifestavam um quadro diarreico. Os

cães do Canil Municipal de Torres Vedras, permaneciam no canil há duas semanas.

E. bieneusi foi a única espécie identificada nas amostras fecais deste grupo de

animais analizados. A caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E.

bieneusi, amplificados por PCR e o seu alinhamento com outras sequências de

identidade conhecida, veio revelar a presença de seis genótipos distintos: TipoIV

(código de acesso ao GenBank AF242478), PtEbIV, Peru6 (código de acesso ao

GenBank AY371281 e DQ154137), D (código de acesso ao GenBank AF101200,

DQ793213, DQ683751, DQ683755, e AF023245), PtEbVIII e PtEbIX. Os genótipos

PtEbIV (código de acesso ao GenBank DQ885580), PtEbVIII (código de acesso ao

GenBank DQ885584) e PtEbIX (código de acesso ao GenBank DQ885585, AF059610,

e EU650273), foram descritos pela primeira vez no decurso deste estudo. Nos cães

foram identificados os genótipos D (20%; 1/5), Peru6 (60,0%; 3/5) e PtEbIX (20%;1/5).

Nos gatos, uma elevada frequência de infecção 77,8% (7/9) foi observada para o

genótipo TipoIV, comparativamente à de 11,1% (1/9) registada para o genótipo PtEbIV

e também à de 11,9% (1/9) para PtEbVIII. A análise dos resultados obtidos para a

distribuição dos diferentes genótipos nos cães e nos gatos, permitiu verificar a

associação com significância estatística da infecção pelo genótipo Tipo IV ao grupo dos

gatos (χ2=12,996; p=0,003), relativamente aos cães estudados.

2.1.2. Ocorrência e identificação de microsporídios em bovinos.

Através da técnica de coloração do Gram-Chromotrope foram detectadas

estruturas compatíveis com esporos de microsporídios em dois dos 100 bovinos

estudados. Ambas as amostras apresentavam baixas cargas parasitárias.

Segundo o critério de positividade seleccionado no presente estudo, a frequência

de microsporidia determinada foi de 6% (6/100) nas fezes de bovinos. Quatro de seis

amostras positivas não foram detectadas pela coloração de Gram-Chromotrope.

Também neste grupo de animais, a espécie E. bieneusi foi o único microsporidia

identificado nas seis amostras positivas estudadas. A análise de sequenciação dos

fragmentos da região ITS rRNA, amplificados por PCR e o posterior alinhamento com

sequências de identidade conhecida, permitiu revelar a existência de três genótipos


- 192 -

diferentes (dois dos quais já previamente reportados): TipoIV (50%; 3/6) (código de

acesso ao GenBank AF242478), PtEbXI (33,3%; 2/6) e J (16,7%; 1/6) (código de

acesso ao GenBank AF135837). O genótipo PtEbXI (código de acesso ao GenBank

DQ885587) foi caracterizado pela primeira vez no decurso deste estudo.

2.1.3. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais silváticos em

cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa).

A técnica parasitológica de Gram-Chromotrope identificou estruturas

compatíveis com esporos de microsporídios em amostras fecais de três animais do

Jardim Zoológico de Lisboa: um saguim de face branca (Callithrix geoffroyi), um lama

(Lama glama glama), e uma Naja indiana (Naja naja kaouthia). Nestas duas últimas

espécies não foi possível, apesar dos esforços, obter amplificação por nenhum dos

protocolos de PCR adoptados no presente trabalho. As cargas parasitárias registadas

oscilaram entre um valor baixo (no lama e no naja indiana) a médio (no sanguim de face

branca).

A frequência de infecção por microsporidia, determinada com base no critério de

positividade, observada nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa foi de 1,9%

(2/103).

Apenas a espécie E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois

mamíferos: o saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) e o cavalo de Timor

(Tragelaphus strepsiceros strepsiceros). A genotipagem das sequências ITS rRNA

obtidas dos dois isolados e posterior comparação com sequências de identidade

conhecida, permitiu caracterizar, pela primeira vez, durante o decurso deste trabalho,

dois genótipos distintos: PtEbV (código de acesso ao GenBank DQ885581) e PtEbXII

(código de acesso ao GenBank DQ885588), identificados no cavalo de Timor e no

saguim de face branca, respectivamente (Quadro XXXIX).


- 193 -

2.1.4. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais silváticos de vida

livre.

No presente estudo, realizado em 134 pequenos mamíferos (musaranhos de

dentes brancos-Crocidura russula, ratinhos ruivos-Mus spretus e ratinhos do campo-

Apodemus sylvaticus), na região do Baixo Alentejo, não foi observado nenhum animal

com infecção por microsporidia. As amostras fecais recolhidas para cada animal eram

em quantidade muito reduzida, tendo-se optado, por canalizar toda a amostra para a

aplicação das técnicas de PCR. Todavia, os resultados obtidos podem ter sido

condicionados pela pequena quantidade de amostra fecal inicial, submetida à técnica de

extração de DNA obtida para cada animal.

No Quadro XXXIX encontram sumarizados os dados dos animais – cães, gatos,

gado bovino e animais silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia e cujos

isolados foram caracterizados no presente trabalho.


- 194 -

Quadro XXXIX. Dados dos animais – cães, gatos, gado bovino e animais silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia e cujos isolados foram

caracterizados no presente trabalho.

NºAMOSTRA ORIGEM NOME COMUM/NOME CIENTÍFICO ESPÉCIMES CG CARGA

PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO (S)

Animais de companhia e cães errantes

G1 AF Gato / Felis catus F Pos +++ Pos E. bieneusi TipoIV G2 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi PtEbIV G3 AF Gato / Felis catus F Pos + Pos E. bieneusi TipoIV G4 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G5 AF Gato / Felis catus F Pos ++ Pos E. bieneusi PtEbVIII G6 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G7 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G8 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G9 AF Gato / Felis catus F Pos + Pos E. bieneusi TipoIV C10 CMTV Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi D C11 CMTV Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6 C12 AF Câo / Canis familiaris F Pos + Pos E. bieneusi PtEbIX C13 AF Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6 C14 AF Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6

Bovinos

B1 M Bovino / Bovis bovis F Pos + Pos E. bieneusi J B2 M Bovino / Bovis bovis F Pos + Pos E. bieneusi PtEbXI B3 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV B4 A Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi PtEbXI B5 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV B6 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV

Animais silváticos em

cativeiro

Z243 JZL Saguim de face branca / Callithrix geoffroyi F Pos ++ Pos E. bieneusi PtEbXII

Z188 JZL Cavalo de Timor /Tragelaphus strepsiceros strepsiceros F Neg Pos E. bieneusi PtEbV

AF: Agregado familiar; CMTV: Canil Municipal de Torres Vedras; M: Moura; BA: Baixo Alentejo; Aljustrel; JZL: Jardim Zoológico de Lisboa; F: fezes; GC: Gram-

Chromotrope; Pos: positivo; Neg: negativo; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por

GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR).


- 195 -

2.1.5. Diversidade genética da região ITS rRNA de Enterocytozoon bieneusi na

população de animais estudada

A totalidade dos 22 isolados de E. bieneusi caracterizados geneticamente, entre os

diversos grupos de animais estudados (animais domésticos, cães errantes, bovinos,

animais silváticos em cativeiro e de vida livre) foram identificados em mamíferos (cinco

cães, nove gatos, sete bovídeos e um primata) (Quadro XXXIX).

A extensão dos polimorfismos genéticos entre os isolados de E. bieneusi foi

determinada através do alinhamento múltiplo das sequências ITS rRNA obtidas. A

análise destes resultados revelou a presença de 10 genótipos distintos (TipoIV, PtEbIV,

PtEbV, D, Peru6, PtEbVIII, PtEbIX, J, PtEbXI, PtEbXII) entre este grupo de mamíferos

estudado. Com o objectivo de conhecer a relação genética existente entre os isolados de

E. bieneusi obtidos foi construída uma árvore filogenética, com as 22 sequências ITS

obtidas neste estudo, e diversas sequências ITS rRNA de E. bieneusi previamente

publicadas [Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al. 2000; Dengjel

et al. 2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et

al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. A combinação destes dados permite evidenciar a

existência de seis grupos principais (Figura 13).


- 196 -

Figura 13. Relação filogenética entre os genótipos de E. bieneusi identificados nos

mamíferos e outros genótipos de E. bieneusi, previamente descritos, inferida pela

análise de sequências do gene ITS rRNA através do método “neighbor joining”, tendo

por base distâncias genéticas calculadas pelo modelo de dois parâmetros de Kimura. A

árvore foi construída utilizando como grupo externo a sequência mais divergente para

Enterocytozoon sp. isolada de um cão, com o código de acesso ao GenBank AF059610.

Os números sobre os ramos indicam os valores de confiança, determinados por análise

de “bootstrap” com 1.000 réplicas.


- 197 -

O primeiro grupo mais importante, engloba diversas sequências de E. bieneusi

publicadas e identificadas nos humanos, e noutros animais domésticos e silváticos

[Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al. 2000; Dengjel et al.

2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al.

2003b; Sulaiman et al. 2004], assim como a maioria das sequências ITS obtidas no

presente estudo. O segundo grupo inclui sequências previamente descritas em bovinos

[Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004] e duas das sequências ITS identificadas em

bovinos neste trabalho. O terceiro grupo é constituído por isolados de E. bieneusi

descritos em ratos-almíscarados, e um isolado de um gato analizado neste estudo. O

quarto grupo é representado exclusivamente pelo genótipo único do saguim de face

branca (primata) registado neste trabalho. Genótipos de E. bieneusi associados aos

guaxinins e a cães, constituem o quinto e o sexto grupo, respectivamente, colocados na

base da árvore filogenética.

2.2. Microsporidia em aves exóticas de gaiola e pombos urbanos de Lisboa

2.2.1. Ocorrência e identificação de microsporídios

De entre as 91 aves pertencentes às três ordens estudadas (Psittaciformes,

Passeriformes e Columbiformes), foram identificadas 11 positivas (12,1%), para

microsporídios, através da técnica de coloração do Gram-Chromotrope. correspondentes

a quatro aves exóticas e sete pombos domésticos, das Ordens Psittaciformes e

Columbiformes, respectivamente. A carga parasitária da maioria das amostras positivas,

estimada de acordo com o critério adoptado (vide Capítulo – Material e Métodos)

oscilou entre um valor baixo a médio. Apenas, na amostra de exudado traqueal de um

papagaio cinzento se registou uma carga parasitária elevada. No esfregaço submetido ao

Gram-Chromotrope, correspondente a esta amostra, observaram-se estruturas ovaladas

de parede fina corada de rosa com uma pequena zona polar ou central não corada

compatíveis com esporos de microsporídios (Figura 14)


- 198 -

Figura 14. Fotografia de esporos de E. hellem em esfregaço da mucosa traqueal de um

papagaio cinzento (Psittacus erithacus). Coloração pelo Gram-Chromotrope. (×1000).

Original da autora.

A percentagem de amostras positivas para microsporidia determinada, segundo o

critério de positividade foi de 40,7% (37/91). A proporção de resultados positivos em

cada Ordem de aves estudada, distribui-se do seguinte modo: Psittaciformes 15,5%

(5/32); Passeriformes 42,8% (3/7); Columbiformes 55,8% (29/52).

À excepção de um papagaio cinzendo em que se observou perda de apetite e

emagrecimento na semana anterior ao óbito e de três papagaios cinzentos em que

ocorreu morte súbita, as restantes aves estudadas não apresentavam manifestações

clínicas.

As espécies E. bieneusi e E. hellem foram identificadas, em 35,2% (32/91) e

13,2% (12/91), respectivamente das aves estudadas.

E. bieneusi foi a única espécie registada nas seguintes aves estudadas: um

inseparável e 24 pombos domésticos. Num papagaio cinzento, dois tentilhões japoneses

e dois pombos domésticos apenas se identificou E. hellem. Numa caturra, dois

papagaios cinzentos, um diamante estrela e três pombos domésticos foi detectada co-

infecção por ambas as espécies (Quadro XL). Ambos os microsporidia foram

identificados nas três Ordens de aves estudadas: Psittaciformes (E. bieneusi- 12,5%; E.


- 199 -

hellem- 12,5%); Passeriformes (E. bieneusi- 14,3%; E. hellem- 42,9%) e

Columbiformes (E. bieneusi- 51,9%; E. hellem- 6,9%). Contudo, nos pombos

domésticos (Columbiformes) registou-se uma elevada frequência de infecção por E.

bieneusi, estatísticamente significativa (ᵡ2=14,954; p=0,001), comparativamente à

observada nas outras duas Ordens de aves. Para a espécie E. hellem, embora tenha-se

verificado uma percentagem mais elevada de infecção nos Passeriformes (42,9%; 3/7), a

diferença não apresentava significância estatística. Não foi encontrada associação entre

as espécies de aves estudadas e a presença de E. bieneusi e/ou E. hellem.

Das 56 raspagens traqueais (52 pombos domésticos e quatro papagaios

cinzentos) analizadas, apenas numa amostra pertencente a um papagaio cinzento, foram

identificados esporos de microsporídios, nomeadamente a espécie E. hellem (Figura ).

Nos restantes produtos biológicos estudados (fezes e conteúdo intestinal) ambas as

espécies E. bieneusi e E. hellem foram encontradas.

2.2.2. Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon bieneusi e


No presente trabalho, foram submetidos à caracterização do locus ITS rRNA, os

32 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, e do locus SSU rRNA, os 12 isolados da

espécie E. hellem, identificados nas amostras fecais e/ou conteúdo intestinal e numa

raspagem da traqueia da população de aves analizada.

A totalidade dos 32 isolados de E. bieneusi obtidos foi caracterizada

geneticamente com sucesso. A determinação da sequência nucleotídica de todos os

fragmentos da região ITS rRNA amplificados e o seu alinhamento com outras

sequências de identidade conhecida, conduziu à identificação dos genótipos envolvidos.

A análise das sequências revelou a presença num inseparável, uma caturra, um papagaio

cinzento, um diamante estrela e 22 pombos domésticos do genótipo Peru6 (código de

acesso ao GenBank AY371281, DQ154137 e DQ425107), descrito pela primeira vez

em humanos, no Peru [Sulaiman et al. 2003a]. Nos isolados de E. bieneusi de um

papagaio cinzento e sete pombos domésticos foi caracterizado, pela primeira vez, no

decurso do presente trabalho, o genótipo PtEbII (código de acesso ao GenBank

DQ425108) muito semelhante ao Peru6, com uma única alteração nucleotídica (G para

A) junto da extremidade 3’ do fragmento amplificado por PCR. Em dois pombos


- 200 -

domésticos, com base na análise das sequências de DNA e de repetidas amplificações

por PCR, registou-se a presença simultânea dos dois genótipos.

Os 12 isolados de E. hellem foram caracterizados com recurso à sequenciação

nucleotídica do fragmento do gene da SSU rRNA amplificado pela PCR. As sequências

parciais da SSU rRNA obtidas foram alinhadas entre si, e com outras sequências de

identidade conhecida descritas no GenBank. As sequências obtidas dos isolados das

aves deste estudo registaram entre 99% a 100% de homologia genética com sequências

do gene da SSU rRNA, previamente reportadas no homem e em aves (código de acesso

ao GenBank AF338366, AF338365, AF177920, AF272836, AF338364, AF118143,

AF118142, L19070 e L39108). No interior das regiões alvo amplificadas por PCR

registaram-se três locais polimórficos, que permitem agrupar em três tipos diferentes as

12 sequências dos isolados de E. hellem obtidos neste estudo. As sequências da SSU

rRNA dos isolados de três papagaios cinzentos e uma caturra (PtEh I) são idênticas entre

si e à sequência correspondente ao genótipo1 (código de acesso ao GenBank

AF272836), descrito no GenBank. As cinco sequências identificadas nos pombos

domésticos (PtEh II) eram semelhantes entre si, e com elevada homologia genética com

o genótipo 2 (código de acesso ao GenBank AF110327), previamente reportado no

GenBank, revelando apenas uma única diferença nucleotídica, na posição

imediatamente a seguir ao terceiro local polimórfico característico desta região. As

restantes três sequências da SSU rRNA, pertencentes a dois tentilhões japoneses e a um

diamante estrela revelaram homologia total entre elas (PtEh III), divergindo das

sequências registadas para os pombos domésticos, em apenas um nucleótido, na posição

correspondente ao segundo local polimórfico. Todavia, as sequências determinadas

neste estudo não são consideradas ainda genótipos definitivos. A caracterização

genética exacta da diversidade intra-especifica entre os isolados de E. hellem obtidos

terá que ser efectuada com recurso a outros marcadores genéticos mais descriminativos

(PTP, ITS). As três sequências do gene da SSU rRNA de E. hellem determinadas neste

estudo encontram-se descritas no GenBank com os seguintes códigos de acesso

DQ425104 (PtEhI), DQ425105 (PtEhII) e DQ425106 (PtEhIII).


- 201 -

No Quadro XL podem observar-se sumarizados os dados correspondentes às

diversas espécies de aves incluídas na população estudada, identificadas com

microsporidia nas amostras fecais e cujos isolados foram caracterizados no presente

trabalho


- 202 -

Quadro XL. Dados das diversas espécies de aves identificadas com microsporidia e cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.

ORDEM NºAMOSTRA ORIGEM NOME COMUM/NOME CIENTÍFICO ESPÉCIMES CG CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE (S) GENÓTIPO (S)

Psittaciformes

1 Criador de aves Inseparáveis/Agapornis sp. F Pos + Pos E. bieneusi Peru6 6 Particular Caturra/Nymphicus hollandicus F Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 3 Criador de aves Papagaio cinzento/Psittacus erithacus F Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 5 Particular Papagaio cinzento/Psittacus erithacus F Neg Pos E. bieneusi e E. hellem PtEbII / ND 8 Criador de aves Papagaio cinzento/Psittacus erithacus ET Pos +++ Pos E. hellem ND

Passeriformes

2 Criador de aves Diamante estrela/Bathilda ruficauda F Neg Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 4 Criador de aves Tentilhão japonês/Lonchura domestica F Neg Pos E. hellem ND 7 Criador de aves Tentilhão japonês/Lonchura domestica F Neg Pos E. hellem ND

Columbiformes

2 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 3 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 5 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos ++ Pos E. bieneusi Peru6 6 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 8 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6

10 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 11 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 13 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 15 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 16 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 17 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 18 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 21 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 22 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 23 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 26 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos ++ Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 27 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 e PtEbII / ND 28 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 e PtEbII /ND 30 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. hellem ND 33 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. hellem ND 35 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 36 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 40 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 42 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 45 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 48 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 49 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 51 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 52 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbI

F: fezes; ET: exsudado traqueal; CI: conteúdo intestinal; GC: Gram-Chromotrope; Pos: positivo; Neg: negativo; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no estudo; ND: não determinado (As sequências do fragmento do gene da SSU rRNA obtidas para os isolados de E.hellem não são consideradas como genótipos)


- 203 -

3. DISCUSSÃO

Ocorrência de microsporidia em animais de companhia (cães e gatos),

bovinos, animais silváticos em cativeiro e de vida livre. A frequência de animais

domésticos (cães e gatos) infectados por microsporidia foi de 12,1%, segundo o critério

de positividade seleccionado no presente estudo. A percentagem de cães e gatos

infectados foi de 8,6 % (5/58) e 15,5% (9/58), respectivamente. Todos os gatos e três

dos cães positivos para microsporidia pertenciam a agregados familiares, e dois cães

eram procedentes do Canil Municipal de Torres Vedras. Os cães deste canil, em virtude

do facto de terem sido capturados duas semanas antes da recolha de fezes para estudo,

não permite determinar, se contraíram a infecção dentro ou fora do canil.

E. bieneusi foi a única espécie identificada nas amostras fecais dos cães e dos

gatos analisados. Diversos autores referem frequências de infecção por E. bieneusi em

cães, semelhantes ou superiores à encontrada no nosso estudo: 8, 3% na Suiça [Mathis

et al. 1999a], 10,8% e 11,7% em Espanha [del et al. 1999; Lores et al. 2002a], 15,0% na

Colômbia [Santin et al. 2008], e 23,0% nos EUA [Jafri et al. 1993]. No respeitante à

infecção por E. bieneusi em gatos são registadas prevalências da ordem dos 8,3% na

Suiça [Mathis et al. 1999a] e de 17,0% na Colômbia [Santin et al. 2006].

A técnica parasitologica de coloração só detectou quatro das amostras

consideradas positivas, para o estudo, embora tenha detectado em nove amostras

estruturas compatíveis com esporos de microsporídios, que não foram contudo

confirmadas por PCR. Assim, sumariamente, dado que algumas das justificações

sugeridas para a discrepância entre os resultados obtidos pelas técnicas seleccionadas

para este estudo já foram discutidas com maior detalhe, sugere-se que a maior

capacidade de detecção de amostras positivas, pela PCR, se encontra associada à

elevada sensibilidade desta técnica, nomeadamente em presença de baixas cargas

parasitárias. Por outro lado, a presença de diversos inibidores em determinados produtos

biológicos, tal como se verifica na generalidade das amostras fecais pode conduzir a

resultados falsos negativos por técnicas moleculares, podendo ser apontada como uma

das razões para a obtenção de amostras positivas por Gram-Chromotrope, mas negativas

por PCR. Igualmente, as reduzidas dimensões dos esporos dos microsporídios e o seu

fraco poder tintorial, aliada a amostras biológicas com cargas parasitárias baixas e à

presença de elevados número de outros microrganismos de morfologia e coloração


- 204 -

semelhante, pode conduzir a falsos negativos obtidos pela técnica de Gram-

Chromotrope, mas que são detectados por PCR.

Todos os animais infectados por microsporidia não apresentavam

sintomatologia, à excepção de dois gatos com diarreia de etiologia desconhecida.

Assim, sugere-se que estes animais correspondam a portadores assintomáticos de E.

bieneusi.

A caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E. bieneusi,

obtidos de cães e gatos, amplificados por PCR e o seu alinhamento com outras

sequências de identidade conhecida, permitiu a identificação de seis genótipos

diferentes: TipoIV, PtEbIV, Peru6, D, PtEbVIII e PtEbIX, em que os genótipos PtEbIV,

PtEbVIII e PtEbIX, foram descritos pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et

al. 2006c]. Nos cães foram identificados os genótipos D (20%), Peru6 (60,0%) e

PtEbIX (20%). Enquanto, nos gatos, uma elevada frequência de infecção 77,8%

registou-se para o genótipo TipoIV, comparativamente à de 11,1% observada para o

genótipo PtEbIV e também à de 11,9% para PtEbVIII. Da análise dos resultados obtidos

para a distribuição dos diferentes genótipos nos cães e nos gatos, verificou-se a

existência de associação estatisticamente significativa da infecção pelo genótipo Tipo

IV aos gatos.

A frequência de microsporidia determinada segundo o critério de positividade

seleccionado no presente estudo foi de 6% (6/100) nas fezes de bovinos. Também nos

bovinos a espécie E. bieneusi foi o único microsporidia identificado nas amostras

positivas estudadas. Diversos estudos reportam a infecção por E. bieneusi em bovinos.

Sulaiman e colaboradores registaram 9,5% de bovinos infectados por esta espécie, nos

EUA [Sulaiman et al. 2004]. Uma percentagem de infecção superior correspondente a

13% foi registada, na Colômbia [Santin et al. 2004].

Quatro de seis amostras positivas por PCR não foram detectadas pelo Gram-

Chromotrope. Mais uma vez, sugere-se como causas para este facto, a existência de

cargas parasitárias baixas nas amostras, assim como a presença de um número elevado

de outros microrganismos (bactérias e leveduras) e ainda as características morfológicas

e de coloração inerentes aos microsporídios, que podem comprometer um diagnóstico

correcto.


- 205 -

A caracterização genética das sequências ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi,

obtidos em bovinos revelou a existência de três genótipos diferentes (dois dos quais já

previamente reportados): TipoIV (50%), PtEbXI (33,3%) e J (16,7%), em que o

genótipo PtEbXI foi identificado pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et al.

2006c].

A frequência de infecção por microsporidia, determinada com base no critério de

positividade, observada nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa foi de 1,9%

(2/103). Também neste grupo de animais silváticos em cativeiro, apenas a espécie E.

bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois mamíferos: um saguim de face

branca (Callithrix geoffroyi) e um cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros

strepsiceros). Slokowicz-Kowalska e colaboradores registaram 1,6% (3/193) de

infecção por E. bieneusi em animais do zoológico, nomeadamente em lémures e um

suíno sem sintomatologia associada. Assim, no estudo destes autores, tal como no

presente trabalho, verificou-se percentagens semelhantes de infecção por esta espécie de

microsporidia, que também foram registadas apenas no grupo dos mamíferos em

cativeiro.

A técnica parasitológica de Gram-Chromotrope identificou estruturas

compatíveis com esporos de microsporídios em duas amostras fecais, de um lama

(Lama glama glama) e de uma Naja indiana (Naja naja kaouthia), das quais não foi

possível obter amplificação por nenhum dos protocolos de PCR adoptados no presente

trabalho. Como possíveis causas para a ausência de amplificação nestas amostras,

sugere-se a existência de inibidores de técnica de PCR, ou ainda, especialmente no caso

do réptil, estar-se em presença de outra espécie de microsporidia em que os primers

seleccionados neste trabalho, não permitiram a sua detecção.

A genotipagem das sequências ITS rRNA obtidas dos dois isolados de E. bienusi

permitiu caracterizar pela primeira vez, durante o decurso deste trabalho, dois genótipos

distintos: PtEbV e PtEbXII, identificados no cavalo de Timor e no saguim de face

branca, respectivamente [Lobo et al. 2006c].

No estudo, realizado em pequenos mamíferos (musaranhos de dentes brancos-

Crocidura russula, ratinhos ruivos-Mus spretus e ratinhos do campo-Apodemus

sylvaticus), da região do Baixo Alentejo, não foi identificado nenhum animal com

infecção por microsporidia. As reduzidas quantidades de amostra fecal, recolhidas para


- 206 -

cada animal, podem ter condicionado os resultados obtidos conduzindo a falsos

negativos entre a população estudada.

Os 22 isolados de E. bieneusi cujas sequências ITS rRNA foram caracterizadas

geneticamente, pertencentes a diferentes espécies de animais dos diversos grupos

estudados (animais domésticos, cães errantes, bovinos, animais silváticos em cativeiro e

de vida livre) foram todos identificados em mamíferos (cinco cães, nove gatos, sete

bovídeos e um primata) (vide Quadro XXXIX). A análise para determinar a extensão da

heterogeneidade genética entre os isolados de E. bieneusi obtidos revelou a presença de

10 genótipos diferentes, entre este grupo de mamíferos estudado: TipoIV, PtEbIV,

PtEbV, D, Peru6, PtEbVIII, PtEbIX, J, PtEbXI e PtEbXII.

A diversidade da região ITS rRNA de E. bieneusi, entre os 22 isolados identificados

em mamíferos obtidos neste estudo, pode ser observada na árvore filogenética

construída (Figura 13). A combinação dos resultados obtidos, permitiu evidenciar a

existência de seis grupos principais. Dentro do primeiro grupo, que reune os genótipos

patogénicos para o Homem, os isolados de E. bieneusi de sete gatos e três bovinos,

caracterizados neste estudo, revelaram sequências ITS idênticas ao genótipo TipoIV

(código de acesso ao Genbank AF242478), descrito previamente no homem

(seropositivos e seronegativos para VIH) [Liguory et al. 1998; Tumwine et al. 2002;

Sulaiman et al. 2003a; Breton et al. 2007], gatos, cães e ruminantes [Dengjel et al.

2001; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c; Santin et al. 2008]. O

isolado do cavalo de Tróia, cujo genótipo (PtEbV; Genbank DQ885581) foi descrito

pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et al. 2006c], apresenta uma sequência

ITS semelhante ao Peru3 (Genbank AY371278), descrito em seropositivos para VIH, no

Peru [Sulaiman et al. 2003a]. Um isolado identificado num cão, incluído neste trabalho,

apresenta uma sequência ITS semelhante à do genótipo D (códigos de acesso ao

Genbank AF101200, DQ793213, DQ683751, DQ683755 e AF023245), previamente

reportado em seropositivos para VIH em diversos países (Peru, Gabão, Alemanha,

Inglaterra e Portugal) [Rinder et al. 1998b; Sulaiman et al. 2003a; Breton et al. 2007],

assim como em animais (castor, ruminantes, cães, raposas, primatas não humanos, rato-

almíscarado, suínos e guaxinins) [Chalifoux et al. 2000; Buckholt et al. 2002; Lee

2007]. Igualmente, a sequência ITS de E. bieneusi caracterizada noutro isolado de um

cão (PTEbVII) é idêntica à sequência registada para o genótipo Peru6 (códigos de


- 207 -

acesso ao Genbank AY371281 e DQ154137), descrito em humanos [Sulaiman et al.

2003a], vitelos [Santin et al. 2005] e aves [Lobo et al. 2006b].

Três dos genótipos isolados dos bovinos identificados neste estudo integram-se

no grupo dos genótipos associados aos bovinos. Uma das sequências ITS isolada

apresenta uma sequência idêntica à do genótipo J (código de acesso ao Genbank

AF135837) [Rinder et al. 2000; Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al. 2004; Lobo et al.

2006c; Lee 2007], e a outra sequência (PtEbXI; código de acesso ao Genbank

DQ885587) [Lobo et al. 2006c] que se registou pela primeira vez neste trabalho é muito

semelhante à do genótipo I (código de acesso ao Genbank AF135836) [Rinder et al.

2000; Sulaiman et al. 2004; Lee 2007] . Estes isolados diferem entre si em apenas 2pb.

No presente trabalho foi identificado um genótipo único PtEbVIII (código de acesso ao

Genbank DQ885584) [Lobo et al. 2006c], num gato integrado no grupo de genótipos

associados aos ratos-almíscarados.

Verificou-se que o quarto grupo era exclusivamente constituído por um genótipo

único (PtEbXII; código de acesso ao Genbank DQ885588) identificado no sanguin de

face branca [Lobo et al. 2006c]. Nenhum genótipo associado ao grupo dos guaxinins foi

detectado no nosso estudo. No entanto foi caracterizado num cão um genótipo (PtEbIX;

códigos de acesso ao Genbank DQ885585, AF059610, e EU650273) [Mathis et al.

1999a; Lobo et al. 2006c; Santin et al. 2008] idêntico à sequência de Enterocytozoon sp.

(código de acesso ao Genbank AF059610) mais divergente, descrita também num cão.

Sumarizando, no presente estudo, foi identificada exclusivamente a presença da

espécie E. bieneusi em animais de companhia (cães e gatos), bovinos de exploração e

animais silváticos em cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa) em frequências que

oscilaram entre 1,9% e os 15,5%. No decurso do trabalho foram caracterizados diversos

genótipos de E. bieneusi, entre os quais alguns foram registados pela primeira vez. Este

facto vem corroborar estudos prévios conduzidos em mamíferos em que se observa em

determinada área geográfica a presença de múltipos genótipos responsáveis por infecção

em humanos e outros animais [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998; Dengjel et al.

2001; Tumwine et al. 2002; Sulaiman et al. 2003b].

A identificação de genótipos idênticos a outros previamente reportados em

humanos e animais vem adicionar novas evidências ao potencial papel zoonótico

desempenhado pela espécie E. bieneusi. Assim como, reforça a hipótese de ausência de


- 208 -

barreiras entre diversas espécies de animais ou mesmo entre diferentes classes

taxonómicas de hospedeiros.

A análise da diversidade genética da região ITS rRNA observada entre os 22

isolados de E. bieneusi, identificados em diferentes espécies de mamíferos em estreito

contacto com o Homem, revelou a presença de genótipos patogénicos para os humanos

assim como genótipos específicos de hospedeiro. Os resultados obtidos no presente

trabalho sugerem que cães, gatos e bovídeos identificados com genótipos patogénicos

para os humanos possam constituir fontes de infecção de microsporídios para o homem,

bem como fonte de contaminação do ambiente, a partir de fezes ou da decomposição de

cadáveres.

Ocorrência de microsporidia em aves exóticas e pombos urbanos. No

presente trabalho verificou-se que 40,7% (37/91) das aves exóticas e pombos urbanos

encontravam-se infectados por microsporidia. Da análise dos resultados obtidos, pelas

diferentes técnicas, verifica-se que nem sempre houve conformidade dos resultados.

Dos 37 casos positivos, identificados de acordo com o critério de positividade adoptado,

apenas 11 foram detectados pela técnica de Gram-Chromotrope. A discordância de

resultados pode, estar relacionada com a diferente metodologia utilizada na

determinação de cada uma destas percentagens. Tal como já foi discutido neste trabalho

mais em pormenor, a PCR é descrita na literatura como sendo uma técnica mais

sensível, com um limite de detecção dos esporos inferior comparativamente ao dos

métodos parasitológicos de coloração [Rinder et al. 1998a; Gumbo et al. 1999b; Fayer

et al. 2003a; Fayer et al. 2003b; Endeshaw et al. 2005]. Assim, teoricamente, em

presença de amostras com baixa carga parasitária a PCR possui uma maior capacidade

de detecção de amostras positivas. À excepção da amostra positiva de exsudado traqueal

com carga parasitária elevada, as restantes amostras positivas por Gram-Chromotrope

apresentavam maioritáriamente uma baixa carga parasitária, podendo ser uma das

justificações apontadas para a discrepância de resultados obtidos. Outra das razões

sugeridas para este facto, consiste na dificuldade de detectar os esporos de

microsporídios, através da microscopia óptica, em amostras com baixa carga parasitária

e com um elevado número de bactérias e/ou pequenas leveduras, com características

morfológicas e de coloração semelhantes aos microsporídios. A presença de elevada

carga microbiana com estas características foi observada na maioria das amostras dos


- 209 -

espécimes analizados, o que puderá ter conduzido a resultados falsos negativos pelo

Gram-Chromotrope.

Relativamente aos aspectos clínicos da maioria das aves infectadas por

microsporidia, não havia sintomas nem sinais, que levassem a pensar que as aves

estivessem doentes. Apenas para o papagaio cinzento em cujo exsudado traqueal foram

detectados microsporídios, foi registada falta de apetite e emagrecimento na semana

antecedente à morte da ave. Aos outros três papagaios cinzentos em que ocorreu morte

súbita não foi detectado qualquer microsporídio. Diversos estudos referem que a

ocorrência de manifestações clínicas em aves infectadas por microsporidia encontra-se

associada a hospedeiros juvenis ou com infecção simultânea por outros agentes

patogénicos (vírus e bactérias) [Pulparampil et al. 1998; Mathis et al. 2005]. Assim, e à

semelhança do que acontece no Homem, a microsporidiose poderá ser, também, uma

doença oportunista nas aves.

Inicialmente, a maioria dos casos de microsporidiose em aves citados na

literatura, eram reportados em espécies da Ordem Psittaciformes, sendo quase sempre E.

hellem o microsporídio responsável pela infecção [Poonacha et al. 1985; Black et al.

1997; Pulparampil et al. 1998; Suter et al. 1998; Snowden et al. 2000; Snowden &

Phalen 2004]. Sugere-se que, para a maior ocorrência de infecções descritas nesta

Ordem, tivesse contribuído a popularidade destas aves (papagaios, periquitos, caturras,

inseparáveis) como animais de companhia, que acabariam por receber uma maior

atenção veterinária em caso de doença. Mais recentemente, começaram a ser descritos

vários casos de infecção em aves de diferentes Ordens, envolvendo outras espécies de

microsporidia, tais como E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis [Reetz et al. 2002;

Haro et al. 2005; Haro et al. 2006; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Lobo et al.

2006b; Kasickova et al. 2007; Graczyk et al. 2007b; Bart et al. 2008; Muller et al.

2008; Kasickova et al. 2009]. O nosso estudo permitiu verificar a presença de E.

bieneusi e E. hellem em diversas espécies de aves das três Ordens incluídas neste estudo

e, ainda, verificar uma percentagem de infecção superior associada aos Columbiformes.

Haro e colaboradores, em Espanha, registaram 9,7% de pombos urbanos infectados por

E. bieneusi, e 4,8% das aves apresentavam co-infecção com E. hellem [Haro et al.

2005]. Também no nosso estudo foi detectada a presença simultânea de E. bieneusi e E.

hellem em 7,7% (7/91) das aves estudadas (vide Quadro XL).


- 210 -

Como já foi referido, alguns autores postulam a hipótese de as aves serem os

reservatórios de E. hellem e os humanos serem, apenas, hospedeiros acidentais,

desenvolvendo a doença apenas em condições de imunodepressão. Mas, como poderá

E. hellem ser transmitido das aves para o Homem? Um investigador inglês, traça um

modo possível de transmissão dos esporos de microsporídios, das aves para o Homem

[Curry 1999], que pode ser extrapolado também para E. bieneusi, uma vez que esta

espécie, também, já foi identificada nos pulmões de doentes com sida [Lores et al.

1999; Sodqi et al. 2004]. Nas aves as infecções por microsporidia localizam-se, com

frequência, no intestino e nos rins, sendo os esporos eliminados nos dejectos. Como o

teor de água dos dejectos das aves é muito reduzido, estes secam rapidamente,

propiciando à formação de poeiras. A inalação destas poeiras orgânicas, contendo

esporos viáveis, pode desencadear infecção no Homem, particularmente se estiver

imunodeprimido. Saliente-se que, os microsporídios patogénicos para o Homem medem

entre 1 e 3 μm, podendo, assim, ser transportados pelas poeiras ditas inaláveis (<5 μm),

isto é, que podem atingir o alvéolo pulmonar. Este modo de transmissão está descrito

para outros agentes patogénicos, nomeadamente Histoplasma capsulatum e

Chlamydophila psittaci.

No respeitante à espécie E. hellem, diversos estudos descrevem uma elevada

variabilidade intra-específica, com base em resultados obtidos a partir da análise de

diferentes marcadores moleculares [Vossbrinck et al. 1993; Suter et al. 1998; Mathis et

al. 1999b; Peuvel et al. 2000; Xiao et al. 2001a; Haro et al. 2003]. A elevada homologia

da sequência do gene SSU rRNA observada entre os isolados de E. hellem pertencentes

às aves incluídas neste estudo, e diversos isolados em humanos, previamente descritos

por outros autores, sugere que estas aves possam constituir um potêncial reservatório

para este microsporídio. Todavia, para determinar com exactidão se os isolados de E.

hellem das aves, obtidos no presente trabalho, correspondem a genótipos previamente

identificados no homem, os isolados teriam que ser estudados com recurso a outros

marcadores genéticos mais discriminativos (a região ITS rRNA, a região variável do

gene que codifica a PTP).

Uma elevada viariabilidade intra-específica é descrita para E. bieneusi, com base

na heterogeneidade da região ITS do gene do rRNA. Até há pouco tempo, encontravam-

se registados pelo menos 80 genótipos de Enterocytozoon sp, sendo que muitos deles


- 211 -

são específicos de hospedeiro e estão associados a determinados grupos de animais.

Assim, estes genótipos não deverão constituir uma preocupação importante para a

Saúde Pública [Xiao et al. 2004; Santin & Fayer 2009]. No entanto, um vasto grupo de

genótipos de E. bieneusi com proximidade genética, não apresenta especificidade de

hospedeiro sendo frequentemente identificados no Homem e noutros animais [Sulaiman

et al. 2003b]. No presente estudo, os genótipos identificados nas aves exóticas e nos

pombos domésticos, revelaram sequências da região ITS rRNA idênticas ou semelhantes

as do genótipo Peru6, previamente descrito em doentes com sida no Peru [Sulaiman et

al. 2003a]. Diversos estudos, envolvendo mamíferos, verificaram que os humanos e

outros animais numa determinada área geográfica, encontravam-se infectados por

múltiplos genótipos de E. bieneusi [Buckholt et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a;

Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. Pelo contrário, no presente trabalho

conduzido em aves observou-se a presença de apenas dois genótipos com elevada

semelhança genética. Sugere-se que este facto possa estar ligado a características

específicas deste grupo de animais, tais como a grande mobilidade natural das aves,

permanecendo num determinado local geográfico durante curtos períodos de tempo.

Teoricamente, estes factores ao limitarem as aves a uma menor exposição temporal aos

genótipos de E. bieneusi circulantes, com diferentes capacidades infectantes,

conduziriam apenas à selecção dos genótipos mais transmissíveis.

A caracterização de um genótipo de E. bieneusi nas aves estudadas, com

sequência ITS rRNA idêntica à do genótipo previamente reportado em humanos, sugere

o elevado potêncial zoonótico destes isolados de E. bieneusi. A identificação deste

genótipo, vem também adicionar evidências à hipótese de que para a espécie E.

bieneusi, se verifica ausência de barreiras de transmissão entre diferentes espécies de

animais ou até entre diferentes classes taxonómicas de hospedeiros. Acrescente-se

ainda, que a elevada frequência de infecção determinada nos pombos domésticos, aliada

ao grande número destas aves em Portugal assim como noutros países Europeus [Haro

et al. 2005; Bart et al. 2008], apontam os pombos como potenciais fontes de infecção

humana e de contaminação ambiental.

A dose mínima infecciosa de microsporídios é desconhecida, mas diversos

autores sugerem que possa ser comparável à que se verifica para outros parasitas

intestinais, ou seja, entre 10-100 esporos [Ford 1999]. Graczyk e colaboradores, num


- 212 -

estudo envolvendo detritos fecais de pombos, detectaram cerca de 3.500 esporos de E.

bieneusi/g [Graczyk et al. 2007b]. Os resultados do trabalho revelaram que uma pessoa

exposta durante 30 minutos aos detritos fecais, por exemplo, junto a alguém que se

encontre a varrer com uma vassoura pode inalar mais de 1.000 esporos viáveis de E.

bieneusi. A interação de pombos urbanos com os seres humanos (especialmente

crianças, idosos e turistas) é muito comum. Além disso, os ninhos de pombos são

construídos muitas vezes perto de entradas de ventilação o que potencia a inalação de

esporos.

Estes dados em associação com os resultados obtidos no presente trabalho

ressaltam a importância de desenvolver estratégias para monitorizar e controlar o

número de pombos em áreas urbanas. Por exemplo, pode ser necessário implementar

métodos de controlo de natalidade e evitar a nidificação das espécies de aves perto de

sistemas de ar condicionado dos edifícios, nomeadamente dos que albergam uma

população susceptível de contrair infecções, ou seja, em hospitais, creches e asilos.

Sugere-se a aplicação de redes de proteção que permitam cobrir os sistemas ventilação

dos edifícios. Esta medida poderia constituir um método útil para evitar a transmissão

de outros agentes patogénicos das aves.

Capítulo V


MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS

V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS

- 215 -

1. INTRODUÇÃO

Actualmente, os estudos epidemiológicos referidos na literatura descrevem o

contacto com água, como um factor de risco associado à microsporidiose humana

[Hutin et al. 1998; Dascomb et al. 2000].

As espécies E. bieneusi, E. intestinalis, A. algerae, Nosema spp., Pleistophora

spp. e V. corneae já foram identificadas em lençóis subterrâneos, águas superficiais,

esgotos, efluentes terciários, canais de escoamento [Avery & Undeen 1987; Sparfel et

al. 1997; Dowd et al. 1998; Fournier et al. 2000a; Fournier et al. 2002] e água para rega

de culturas agrícolas [Thurston-Enriquez et al. 2002; Coupe et al. 2006]. O registo de

um presumível surto de origem hídrica foi reportado por Cotte e colaboradores em

França [Cotte et al. 1999]. Parece também verificar-se associação entre os

microsporidia e a transmissão por alimentos irrigados com água contaminada. Foram

identificados microsporídios em produtos hortícolas, tais como alface, salsa, coentros e

morangos, na Costa Rica [Calvo et al. 2004]. Esporos de E. bieneusi também foram

identificados em animais em estreito contacto com água superficial [Sulaiman et al.

2003b]. Até à data, a espécie Vittaforma-like, descrita em seropositivos e seronegativos

por VIH em Portugal [Sulaiman et al. 2003c] não foi identificada na água.

Diversas características específicas dos microsporidia favorecem a possibilidade

da sua transmissão por via hídrica. Entre estes factores incluem-se, a relativa ausência

de especificidade de hospedeiro, que se verifica nas espécies infectantes dos mamíferos;

a excrecção de esporos através da urina e fezes por animais infectados que podem

contaminar águas de abastecimento público; os esporos dos microsporídios são

resistentes a condições ambientais adversas, sobrevivendo por longos períodos de tempo

na água; os esporos infectantes dos mamíferos são de reduzidas dimensões e de difícil

remoção por filtração; e por último crê-se que a dose infectante seja baixa para os

mamíferos [Franzen & Muller 1999a; Didier 2005].

Conjuntamente, estes factores levaram a que os microsporídios fossem incluídos

pelo Instituto de Defesa da Saúde (NIH) dos EUA na categoria B da lista de agentes de

biodefesa e lista de candidatos contaminantes da agência de protecção ambiental dos

EUA [U.S.Environmental Protection Agengy (EPA) 1998; Didier 2005].


- 216 -

Na maioria dos países as doenças de transmissão hídrica, em geral, são

subdiagnosticadas ou os possíveis casos existentes não são reportados publicamente,

havendo a necessidade urgente de optimizar a detecção e monitorização destes agentes

patogénicos na água.

2. RESULTADOS

2.1. DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM ÁGUA SUBTERRÂNEA E

SUPERFICIAL, TRATADA E NÃO TRATADA.

A percentagem de microsporidia detectada nas 184 amostras de água estudadas

foi de 2,7% (5/184). As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em

1,6% e 1,1%, respectivamente das águas analisadas, neste estudo.

E. bieneusi foi identificada em água subterrânea, no local de colheita OA3,

correspondente a água não tratada, e na respectiva Estação de Tratamento de Águas

(ETA3) em água já submetida ao tratamento. Igualmente, na água tratada recolhida de

reservatórios que abastecem directamente a cidade de Lisboa (LX) foi identificada esta

espécie. Apenas um dos isolados de E. bieneusi foi caracterizado genéticamente com

sucesso (Quadro XLI).

A caracterização da sequência ITS rRNA do isolado de E. bieneusi, amplificado

por PCR e o seu alinhamento com outras sequências de identidade conhecida, veio

revelar a presença do genótipo TipoIV (Código de acesso ao GenBank AF242478),

previamente descrito em humanos e animais [Liguory et al. 1998; Dengjel et al. 2001;

Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c;

Breton et al. 2007; Santin et al. 2008] (Quadro XLI ).

A espécie Vittaforma-like, foi identificada em água superficial, não tratada e sem

purificação imunomagnética (IMS), correspondente ao local de colheita TR1 (Quadro

XLI). Ambos os isolados foram recolhidos no mesmo local, mas em diferentes meses do

ano.

As duas sequências SSU rRNA de Vittaforma-like, foram caracterizadas

geneticamente com recurso à sequenciação nucleotídica dos fragmentos amplificados

pela PCR. Foi identificado um único genótipo nas sequências obtidas neste estudo,


- 217 -

correpondente ao Isolado 5830 (Código de acesso ao GeneBank AY375043),

previamente descrito em humanos, em Portugal [Sulaiman et al. 2003c] (Quadro XLI).

Quadro XLI. Ocorrência de microsporidia em 184 amostras de água tratada e não

tratada em locais de amostragem envolvidos no processo conducente ao abastecimento

de água da cidade de Lisboa.

TIPO DE ÁGUA TRATAMENTO

LOCAIS DE

COLHEITA

(N)

PCR

(N) ESPÉCIE (S) GENÓTIPO (S)

POTENCIAL FONTE

DE INFECÇÃO

Água subterrânea

Água não tratata OA3 (39) 1 E. bieneusi ND Homem e outros

animais Água

tratada/ETA ETA3 (42) 1 E. bieneusi TipoIV Homem,gatos, ruminantes e cães

Água superficial

Água não tratata TR1 (28)a 2 Vittaforma-like

b Isolate 5830 Homem

Água tratada/ETA ETA1 (14) 0 - - -

Água superficial

Água não tratata

CB2 (11) 0 - - -

Água tratada/ETA ETA (11) 0 - - -

Água de abastecimento

Água tratada LX (39)

1 E. bieneusi ND Homem e outros animais

a Nove amostras de água não foram submetidas a IMS; b Especie identificada em duas amostras de água

sem IMS.

3. DISCUSSÃO

Relativamente à metodologia de identificação dos microsporídios observou-se

dificuldades na amplificação de algumas amostras que se sugere estejam associadas ao

produto analisado. Na verdade, as principais vias de inibição da reacção de PCR

utilizando amostras de água são a degradação dos ácidos nucleicos devidos à presença

de DNases, a oclusão do DNA e a existência de inibidores na água concentrada, que, ao

interferir na interacção entre a DNA polimerase e o DNA, comprometem a eficiência da

PCR. A água superficial e subterrânea à semelhança da água de esgotos, são matrizes

complexas, contendo numerosas substâncias orgânicas e inorgânicas com potencial

inibidor da reação de PCR. Os principais inibidores identificados são os compostos

fenólicos, os ácidos húmicos e os metais pesados [Bruzzoniti et al. 2000]. Por outro

lado, os constituintes das paredes bacterianas e a presença de DNA de outros


- 218 -

microrganismos na água podem contribuir para inibir a amplificação específica dos

ácidos nucleicos. Apesar de existerem métodos que permitem contornar este problema,

na maioria dos casos, a remoção completa dos inibidores é impossível.

Nas 184 amostras de água analisadas foram obtidas cinco amostras positivas

para microsporidia. E. bieneusi e Vittaforma-like foram as espécies identificadas em três

e em duas amostras positivas, respectivamente (Quadro XLI).

A detecção de DNA de microsporidia, mais precisamente da espécie E. bieneusi

em amostras submetidas a separação imunomagnética constitui um facto surpreendente

na medida em que este processo de purificação utilisa anticorpos monoclonais

específicos para os géneros Cryptosporidium e Giardia no revestimento das partículas

imunomagnéticas. Este resultado pode ser explicado por algum arrastamento

inespecífico de DNA de outros microrganismos durante o processo de separação pelas

partículas imunomagnéticas. Este arrastamento puderá derivar de fenómenos

electrostáticos entre as partículas imunomagnéticas e as cargas superficiais dos

microsporídios.

E. bieneusi foi observada em água subterrânea não tratada e na correspondente

estação de tratamento de resíduos, após ter sido submetida a tratamento. A outra

amostra de água positiva para esta espécie era proveniente de um reservatório de água

de abastecimento à cidade de Lisboa. A espécie E. bieneusi já foi descrita em águas

superficiais, piscinas e no Rio Sena [Sparfel et al. 1997; Dowd et al. 1998; Fournier et

al. 2000a; Fournier et al. 2002].

Numa primeira abordagem, poderíamos supor que a contaminação da água

deriva da contaminação ambiental com esporos de E. bieneusi eliminados por um

hospedeiro. No entanto, uma análise mais profunda do meio envolvente da nascente do

rio que circula na região em questão sugere indícios de uma potencial fonte de

contaminação para esta espécie. Nesta região situa-se a maior concentração nacional da

indústria de curtimento e acabamento em couro (incluindo bovinos). Do pré curtimento

ao acabamento, o tratamento do couro consiste em várias etapas, produzindo grandes

quantidades de água suja e poluente. A descarga das águas residuais das fábricas de

curtumes em condutas degradadas, devido à corrosão pelos produtos químicos

utilizados no curtimento das peles, bem como a ineficiência do tratamento das águas

residuais nas ETAR, podem ser uma causa de contaminação dos aquíferos. A ocorrência


- 219 -

de um genótipo (Tipo IV) que já foi detectado em bovinos em Portugal, pode ser

resultado deste tipo de contaminação. A presença de DNA de E. bieneusi numa amostra

de água tratada recolhida num reservatório de abastecimento da cidade de Lisboa,

embora não tenha sido possível determinar o seu genótipo, sugere também uma possível

contaminação humana ou animal. A associação dos microsporidia em biofilmes

localizados no reservatório ou condutas, pode constituir uma explicação para a detecção

deste microsporídio em amostras de água tratada.

A espécie Vittaforma-like foi identificada em água subterrânea não tratada, e

sem ter sofrido separação imunomagnética. Ambos os isolados obtidos correspondem a

um genótipo descrito previamente em humanos em Portugal [Sulaiman et al. 2003c]. A

detecção do DNA do parasita nas amostras de água sugere a presença deste

microrganismo na água subterrânea desta região, levantando dúvidas relativamente à

sua origem. Até à data, desconhecem-se possíveis fontes de infecção ou hospedeiros

animais, para além do Homem. O local de colheita das amostras insere-se numa área de

lazer onde se desenvolvem actividades de recreio ligadas à água, tais como natação ou

outros desportos naúticos. Sugere-se que a presença mais ou menos constante do

Homem nesta área e na respectiva colecção de água possa constituir a fonte de infecção

responsável pela detecção desta espécie.

Em conclusão, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem a água como

uma potencial via de transmissão de microsporidiose ao Homem e a outros animais. A

presença de microsporídios patogénicos para o Homem em água de abastecimento

tratada e não tratada deverá ser encarada não só como um potencial risco para a saúde

pública, em especial para a crescente população susceptivel (imunocomprometidos,

idosos e crianças), mas também como indicador da deterioração da qualidade

microbiologica da água e da possivel ineficiência do tratamento aplicado nas Estações

de Tratamento de Águas.


- 220 -

Capítulo VI

CONCLUSÃO

VI. CONCLUSÃO

- 223 -

A microsporidiose humana, actualmente considerada uma doença oportunista

emergente, continua contudo a ser uma infecção subdiagnosticada mundialmente. A

informação sobre a infecção humana e a epidemiologia dos microsporidia em Portugal é

escassa, e só muito recentemente têm sido dados passos no intuito de colmatar estas

lacunas.

O presente estudo, constitui um trabalho pioneiro na pesquisa e caracterização

de microsporidia, potencialmente, patogénicos para o Homem, englobando duas

populações de humanos com serologia positiva e negativa para VIH, diversas espécies

de animais e amostras ambientais (água), em Portugal.

Durante o presente trabalho foi possível observar uma frequência de infecção de

12,0%, nas fezes da população humana estudada. No grupo de seropositivos para VIH a

percentagem de infecção nas fezes, urina e secrecções pulmonares foi de 13,9%, 1,7% e

1,5%, respectivamente. Por outro lado, no subgrupo dos seronegativos para VIH só foi

detectado microsporidia em 8,5% das amostras fecais. O facto de se verificar, neste

estudo, uma associação significativa entre a presença de infecção por microsporidia e os

seropositivos para VIH não constitui um dado surpreendente em virtude do carácter

oportunista largamente atribuído a esta doença, por outros autores. Evidências

adicionais, observadas neste estudo, que corroboram esta hipótese, correspondem à

identificação de infecção por microsporidia nas fezes de doentes, que, embora sendo

seronegativos para VIH, apresentam outro tipo de deficit imunológico, com destaque

para um doente transplantado renal, um doente com neoplasia submetido a

quimioterapia, um doente com asma severa submetido a terapêutica com

corticosteróides e um doente infectado por vírus da hepatite C. Igualmente, no subgrupo

dos seronegativos para VIH, verificou-se a presença de idosos e crianças entre a

população positiva para microsporidia. Embora por razões diferentes das observadas

para os doentes com maior ou menor grau de imunussupressão induzido por diversas

causas, as crianças e os idosos são considerados uma população mais susceptível de

contrair infecções, dentro do grupo dos imunocompetentes. Neste estudo foi, inclusive,

possível observar a associação de amostras fecais positivas para microsporidia, assim

como especificamente de Vittaforma-like ao grupo etário das crianças. Estes resultados,

parecem evidenciar a elevada probabilidade de seropositivos para VIH ou com outras

VI. CONCLUSÃO

- 224 -

causas de imunossupressão, assim como crianças e idosos de contrair infecção por

microsporidia.

Na análise dos dados obtidos, não se verificou que a infecção por microsporidia,

em geral, nem, especificamente, por nenhuma das duas espécies identificadas nas fezes

(E. bieneusi e Vittaforma-like) estivesse, significativamente, associada a doentes com

quadro diarreico, corroborando alguns estudos conduzidos por outros autores. Da

literatura disponível, verifica-se que na maioria dos casos descritos a presença de

diarreia ocorre em doentes com níveis de contagem dos linfócitos TCD4+ abaixo dos

100 células por mm3. Todavia, a inexistência destes dados laboratoriais para os doentes

com imunossupressão, incluídos neste estudo, não permite esclarecer se a ausência da

manifestação clínica mais comum observada na microsporidiose intestinal, a presença

de diarreia, poderá estar associada nestes doentes a contagens de linfócitos TCD4+

acima deste valor limite. Outra das razões sugeridas para a ausência de quadro diarreico

nos doentes infectados por microsporidia reside na possibilidade desta população ser

constituída por portadores assintomáticos. Igualmente, na maioria dos

imunocompetentes positivos para microsporidia estudados não foi significativa a

presença de diarreia associada à infecção, apontando para que estes doentes constituem

portadores assintomáticos dos microsporídios. Casos de portadores assintomáticos de

microsporidia têm sido reportados, por diversos autores, quer na população de doentes

com imunossupressão quer em imunocompetentes.

E. bieneusi e Vittaforma-like foram as espécies identificadas nas amostras fecais

dos seropositivos e seronegativos para VIH. Por outro lado, só foram identificados

microsporidia nas amostras de urina e secrecções pulmonares de seropositivos para

VIH, nomeadamente, a espécie E. intestinalis na urina e E. cuniculi e Vittaforma-like

num lavado broncoalveolar e numa expectoração, respectivamente. Vittaforma-like é

descrita neste estudo, pela primeira vez, numa secreção pulmonar dum doente.

A detecção de E. intestinalis na urina de um seropositivo para VIH e posterior

caracterização da sequência de um fragmento da região SSU rRNA, com total homologia

com diversas sequências previamente descritas por outros autores, em humanos e outros

animais, permitiu revelar a presença de mais uma espécie, considerada patógenica para

o homem, entre a população englobada neste estudo. Igualmente, a identificação e

caracterização genética da SSU rRNA de E. cuniculi, para além de constituir o primeiro

VI. CONCLUSÃO

- 225 -

registo desta espécie em secreções pulmonares no Homem em Portugal, indica a

presença desta espécie patogénica no país.

A caracterização genética da região ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi de

humanos permitiu identificar um total de seis genótipos diferentes, Tipo IV, Peru 6, D,

A, C e PtEbII, com predominância do referido em primeiro lugar. Até à data os

genótipos A e C só foram identificados no Homem. Os restantes genótipos observados,

à excepção do PtEbII, que só foi descrito em aves em Portugal, já foram registados

numa vasta gama de hospedeiros, incluindo os humanos e outros animais (inclusive

cães, gatos e ruminantes em Portugal).

A selecção das diversas espécies de animais englobadas neste estudo, baseou-se

não só na análise bibliográfica dos grupos mais infectados por microsporidia

patogénicos de humanos, mas, fundamentalmente, obedeceu a um critério de

proximidade geográfica ao homem. Nos diversos grupos de animais estudados foram

identificados microsporidia em amostras fecais de 8,6% de cães, 15,5% de gatos 40,7%

de aves de gaiola e pombos urbanos, 6,0% de bovinos e 1,9% de animais silváticos em

cativeiro (Jardim Zoológico).

E. bieneusi foi a única espécie de microsporidia identificada em todos os

diversos grupos de animais estudados, com excepção das aves de gaiola e pombos

domésticos em que foi registada também a espécie E. hellem. Uma elevada percentagem

de infecção por E. bieneusi foi observada na população de pombos domésticos (Ordem

Columbiformes). Para além da transmissão fecal-oral, sugere-se a potencial transmissão

por via aérea para ambas as espécies de microsporidia.

A maioria dos animais estudados infectados por E. bieneusi e/ou E. hellem não

apresentavam sintomatologia sugerindo-se, tal como se verifica na população humana

estudada, a existência de portadores assintomáticos destes microsporidia entre os

animais examinados: destacando-se o importante papel que terão na transmissão das

espécies E. bieneusi e E. hellem.

A caracterização genética da espécie E. hellem, obtida neste estudo, permitiu

identificar, em aves exóticas de gaiola e pombos urbanos da cidade de Lisboa, isolados

deste microsporídio com homologia idêntica ou semelhante a sequências do gene da

SSU rRNA, previamente reportadas no homem e em aves, sugerindo que estas aves

VI. CONCLUSÃO

- 226 -

possam constituir um reservatório deste parasita e uma fonte de infecção para o

Homem.

Relativamente aos isolados de E. bieneusi dos animais estudados, no presente

trabalho, verificou-se a presença de seis genótipos diferentes nos cães (Peru6, D e

PtEbIX) e gatos (TipoIV, PtEbIV e PtEbVIII); três genótipos nos bovinos (TipoIV,

PtEbXI e J); dois genótipos nos animais do Jardim Zoológico (PtEbV e PtEbXII). Uma

associação significativa entre os gatos e a infecção pelo genótipo Tipo IV foi observada.

Todos os diferentes 10 genótipos referidos foram isolados de mamíferos. A análise da

diversidade genética da região ITS rRNA de E. bieneusi permitiu verificar a presença na

maioria dos mamíferos (cães, gatos e bovídeos), de genótipos patogénicos para o

Homem e de outros genótipos específicos de hospedeiro (cão, gato, bovinos e primata

não humano), que, possivelmente, não terão impacte na saúde pública humana. Nas

diversas espécies de aves pertencentes a três Ordem diferentes (Psittaciformes,

Passerifores e Columbiformes) a caracterização dos isolados de E. bieneusi revelou,

apenas, a presença de dois genótipos geneticamente muito semelhantes, Peru6 (genótipo

patogénico para o Homem) e PtEbII. Facto este, contrário ao observado para os

humanos e outros mamíferos neste estudo, infectados por múltiplos genótipos de E.

bieneusi, com predominância de um deles.

As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em água de

abastecimento da cidade de Lisboa, tanto na água de origem superficial como

subterrânea. A genotipagem de Vittaforma-like revelou a presença de um genótipo,

descrito em humanos, em Portugal. O genótipo Tipo IV de E. bieneusi potencialmente

infectante do homem e outros animais foi identificado em água tratada com origem

subterrânea.

Considerações finais:

Ao efectuar-se uma análise global dos resultados da detecção e caracterização

genética de E. bieneusi, verificou-se que esta espécie de microsporídio e, mais

concretamente, o genótipo Tipo IV foi identificado em humanos seropositivos e

seronegativos para VIH, animais (mamíferos e aves) e no ambiente (água) neste estudo.

Dos genótipos identificados nos humanos, com excepção dos genótipos A e C, os

VI. CONCLUSÃO

- 227 -

restantes foram encontrados também nos animais e/ou ambiente: o Tipo IV foi

identificado em gatos, bovinos e na água; o genótipo Peru6 registou-se, também, em

cães e aves exóticas e pombos urbanos; o genótipo D num cão; e o genótipo PtEbII foi

identificado em aves exóticas e pombos urbanos. O facto de determinados animais, tais

como cães, gatos, bovídeos em estreito contacto com humanos se encontrarem

infectados pelos mesmos genótipos de E. bieneusi, faz destes hospedeiros possíveis

reservatórios da parasitose humana. Deste modo, caso se verifiquem condições

epidemiológicas favoráveis, sugere-se que a infecção nestes animais, poderá constituir

fonte de contaminação para o Homem, quer por contacto directo com os animais

infectados, quer indirecto, através de água ou de alimentos contaminados. Contudo, é

importante salientar que a presença desta espécie, tanto em animais, como em humanos,

não constitui, por si só, evidência da ocorrência de transmissão zoonótica, na medida em

que a hipótese da transmissão antroponótica desta espécie não pode, também, ser

excluída.

No presente estudo, verificou-se a ocorrência de microsporidia na água de

abastecimento da cidade de Lisboa, tanto na água de origem superficial como

subterrânea. As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like , e o(s) genótipo(s) identificados

para cada caso, foram ambos registados na população humana estudada neste trabalho,

sendo que E. bieneusi foi observada em todos os grupos de animais estudados, e o

genótipo Tipo IV em gatos e bovinos. Estes resultados sugerem a água como potencial

fonte de infecção do Homem e outros animais, assim como a possível ocorrência de

transmissão hídrica destes parasitas em Portugal. Contudo, salienta-se a importância de

estender aos novos estudos abordagens, que incluam, não só a detecção, mas também a

determinação da viabilidade dos microsporidia na água.

A elevada percentagem de Vittaforma-like (dois genótipos ) em amostras fecais

de humanos seropositivos e seronegativos para VIH, especialmente no grupo etário das

crianças, a identificação da espécie na secreção pulmonar pertencente a um seropositivo

para VIH e a detecção de DNA desta espécie em água de abastecimento público

constituem dados importantes, que vêm contribuir para o esclarecimento da ocorrência e

epidemiologia desta nova espécie de microsporídio, até à data, apenas descrito em

Portugal. Todavia, são necessários futuros estudos adicionais que passem pela

caracterização ultraestrutural e análise genética de outros loci deste parasita com intuito

VI. CONCLUSÃO

- 228 -

de compreender e clarificar os diversos aspectos que envolvem esta espécie e que,

ainda, permanecem desconhecidos entre a comunidade científica.

Os resultados que obtivemos demonstraram, também, que a identificação das

diferentes espécies e genótipos dos microsporidia só pode ser conseguida através da sua

caracterização molecular. Esta identificação reveste-se de grande importância, na

medida em que permite conhecer quais as espécies e genótipos infectantes para o

Homem, e avaliar o risco que a infecção em animais domésticos e silváticos e a

contaminação dos recursos hídricos constitui para a saúde pública, contribuindo para a

melhor compreensão dos diversos aspectos da epidemiologia da microsporidiose

gerando informação essencial ao desenvolvimento de medidas que visem prevenir e

controlar a transmissão de microsporidia ao Homem.

A presença de espécies e genótipos de microsporidia patogénicos para o

Homem, confirmada pela análise dos resultados obtidos no presente estudo, sugere um

papel relevante a nível da Saúde Pública, para os microsporidia circulantes, entre a

população portuguesa, salientando a importância da implementação da pesquisa de

microsporídios no diagnóstico de rotina. Acresce, ainda, que a identificação destas

espécies e genótipos em amostras fecais e outros produtos biológicos de doentes e

animais infectados realça a conveniência de adopção de medidas protectoras para evitar

a possível contaminação através destes espécimes. Estas medidas são particularmente

relevantes para a população mais susceptível de contrair a infecção: os seropositivos

para VIH, ou a crescente população de doentes que apresentam outras causas de

imunossupressão, tais como doentes submetidos a transplantes de órgãos, ou com

doença neoplásica ou autoimune submetidos a quimioterapia e terapêuticas

imunossupressoras. No grupo da população susceptivel à infecção por microsporídios

incluem-se as crianças e os idosos.

Concluindo, os presentes resultados, representam uma contribuição para o

estudo das microsporidioses, no âmbito da epidemiologia, mais precisamente, nos

processos envolvidos na circulação e transmissão deste grupo de microrganismos

oportunistas e emergentes à população susceptível, em Portugal e espera-se que

constituam uma motivação para despertar o interesse e abrir caminho para estudos

futuros.

Capítulo VII

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- 231 -

Aarons, E. J., Woodrow, D., Hollister, W. S., Canning, E. U., Francis, N. & Gazzard, B. G. (1994). Reversible renal failure caused by a microsporidian infection. AIDS, 8, 1119-1121.

Abreu-Acosta, N., Lorenzo-Morales, J., Leal-Guio, Y., Coronado-Alvarez, N., Foronda, P., coba-Florez, J., Izquierdo, F., Batista-Diaz, N., del, A. C. & Valladares, B. (2005). Enterocytozoon bieneusi (microsporidia) in clinical samples from immunocompetent individuals in Tenerife, Canary Islands, Spain. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 99, 848-855.

Accoceberry, I., Carriere, J., Thellier, M., Biligui, S., Danis, M. & Datry, A. (1997a). Rat model for the human intestinal microsporidian Enterocytozoon bieneusi. J.Eukaryot.Microbiol., 44, 83S.

Accoceberry, I., Greiner, P., Thellier, M., Achbarou, A., Biligui, S., Danis, M. & Datry, A. (1997b). Rabbit model for human intestinal microsporidia. J.Eukaryot.Microbiol., 44, 82S.

Accoceberry, I., Thellier, M., sportes-Livage, I., Achbarou, A., Biligui, S., Danis, M. & Datry, A. (1999). Production of monoclonal antibodies directed against the microsporidium Enterocytozoon bieneusi. J.Clin.Microbiol., 37, 4107-4112.

Achbarou, A., Ombrouck, C., Gneragbe, T., Charlotte, F., Renia, L., sportes-Livage, I. & Mazier, D. (1996). Experimental model for human intestinal microsporidiosis in interferon gamma receptor knockout mice infected by Encephalitozoon intestinalis. Parasite Immunol., 18, 387-392.

Akerstedt, J. (2002). An indirect ELISA for detection of Encephalitozoon cuniculi

infection in farmed blue foxes (Alopex lagopus). Acta Vet.Scand., 43, 211-220.

Akerstedt, J., Nordstoga, K., Mathis, A., Smeds, E. & Deplazes, P. (2002). Fox encephalitozoonosis: isolation of the agent from an outbreak in farmed blue foxes (Alopex lagopus) in Finland and some hitherto unreported pathologic lesions. J.Vet.Med.B Infect.Dis.Vet.Public Health, 49, 400-405.

Albrecht, H. & Sobottka, I. (1997). Enterocytozoon bieneusi infection in patients who are not infected with human immunodeficiency virus. Clin.Infect.Dis., 25, 344.

Aldras, A. M., Orenstein, J. M., Kotler, D. P., Shadduck, J. A. & Didier, E. S. (1994). Detection of microsporidia by indirect immunofluorescence antibody test using polyclonal and monoclonal antibodies. J.Clin.Microbiol., 32, 608-612.

Alfa, C. O., Ouattara, A., Thellier, M., Accoceberry, I., Biligui, S., Minta, D., Doumbo, O., sportes-Livage, I., Thera, M. A., Danis, M. & Datry, A. (2002). Evaluation of an immunofluorescent-antibody test using monoclonal antibodies directed against Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis for diagnosis of intestinal microsporidiosis in Bamako (Mali). J.Clin.Microbiol., 40, 1715-1718.


- 232 -

Amato, J. G., Amato, V. S. & Amato, N., V (1999). [Trichome staining method applied to stools from HIV-infected patients with diarrhea, for microsporidia investigation]. Rev.Soc.Bras.Med.Trop., 32, 277-283.

Aoun, K., Barbouche, R., Bouratbine, A., Bejaoui, M., Dellagi, K. & Ben, I. R. (1997a). [Intestinal microsporida infections in children with primary immunologic deficiencies]. Parasite, 4, 386-387.

Aoun, K., Bouratbine, A., Datry, A., Biligui, S. & Ben, I. R. (1997b). [Presence of intestinal microsporidia in Tunisia: apropos of 1 case]. Bull.Soc.Pathol.Exot., 90, 176.

Arzouk, N., Michelon, H., Snanoudj, R., Taburet, A. M., Durrbach, A. & Furlan, V. (2006). Interaction between tacrolimus and fumagillin in two kidney transplant recipients. Transplantation, 81, 136-137.

Ashton, N. & Wirasinha, P. A. (1973). Encephalitozoonosis (nosematosis) of th cornea. Br.J.Ophthalmol., 57, 669-674.

Asmuth, D. M., DeGirolami, P. C., Federman, M., Ezratty, C. R., Pleskow, D. K., Desai, G. & Wanke, C. A. (1994). Clinical features of microsporidiosis in patients with AIDS. Clin.Infect.Dis., 18, 819-825.

Attili, S. V., Gulati, A. K., Singh, V. P., Varma, M., Rai, M. M. & Sundar, S. (2006). Diarrhea,CD4 counts and enteric infections in a hospital-based cohort of HIV-infected patients around varanasi,India. BMC.Infect.Dis., 6, 39.

Avery, S. W. & Undeen, A. H. (1987). The isolation of microsporidia and other pathogens from concentrated ditch water. J.Am.Mosq.Control Assoc., 3, 54-58.

Bacchi, C. J., Rattendi, D., Faciane, E., Yarlett, N., Weiss, L. M., Frydman, B., Woster, P., Wei, B., Marton, L. J. & Wittner, M. (2004). Polyamine metabolism in a member of the phylum Microspora (Encephalitozoon cuniculi): effects of polyamine analogues. Microbiology, 150, 1215-1224.

Bachur, T. P., Vale, J. M., Coelho, I. C., Queiroz, T. R. & Chaves, C. S. (2008). Enteric parasitic infections in HIV/AIDS patients before and after the higly active antiretroviral therapy. Braz.J.Infect.Dis., 12, 115-122.

Baker, M. D., Vossbrinck, C. R., Didier, E. S., Maddox, J. V. & Shadduck, J. A. (1995). Small subunit ribosomal DNA phylogeny of various microsporidia with emphasis on AIDS related forms. J.Eukaryot.Microbiol., 42, 564-570.

Balbiani, G. (1882). Sur les microsporidies ou sporogspermies des articules. C.R.Acad.Sci., 95, 1168-1171.

Baneux, P. J. & Pognan, F. (2003). In utero transmission of Encephalitozoon cuniculi

strain type I in rabbits. Lab Anim, 37, 132-138.

Barsoum, R. S. (2004). Parasitic infections in organ transplantation. Exp.Clin.Transplant., 2, 258-267.


- 233 -

Barsoum, R. S. (2006). Parasitic infections in transplant recipients. Nat.Clin.Pract.Nephrol., 2, 490-503.

Bart, A., Wentink-Bonnema, E. M., Heddema, E. R., Buijs, J. & van, G. T. (2008). Frequent occurrence of human-associated microsporidia in fecal droppings of urban pigeons in amsterdam, the Netherlands. Appl.Environ.Microbiol., 74, 7056-7058.

Barton, C. S., Phalen, D. N. & Snowden, K. F. (2003). Prevalence of microsporidian spores shed by asymptomatic lovebirds:evidence for a potential emerging zoonosis. J.Avian Med.Surg., 17, 197-202.

Beauvais, B., Sarfati, C., Challier, S. & Derouin, F. (1994). In vitro model to assess effect of antimicrobial agents on Encephalitozoon cuniculi. Antimicrob.Agents

Chemother., 38, 2440-2448.

Beckers, P. J., Derks, G. J., Gool, T., Rietveld, F. J. & Sauerwein, R. W. (1996). Encephalocytozoon intestinalis-specific monoclonal antibodies for laboratory diagnosis of microsporidiosis. J.Clin.Microbiol., 34, 282-285.

Bergquist, N. R., Stintzing, G., Smedman, L., Waller, T. & Andersson, T. (1984a). Diagnosis of encephalitozoonosis in man by serological tests. Br.Med.J.(Clin.Res.Ed), 288, 902.

Bergquist, R., Morfeldt-Mansson, L., Pehrson, P. O., Petrini, B. & Wasserman, J. (1984b). Antibody against Encephalitozoon cuniculi in Swedish homosexual men. Scand.J.Infect.Dis., 16, 389-391.

Bern, C., Kwai, V., Vargas, D., Rabke-Verani, J., Williamson, J. & Chavez-Valdez, R. (2005). The epidemiology of intestinal microsporidiosis in patients with HIV/AIDS in Lima, Peru. J.Infect.Dis., 191, 1658-1664.

Bernard, E., Carles, M., Pradier, C., Boissy, C., Roger, P. M., Hebuterne, X., Mondain, V., Michiels, J. F., Le, F. Y. & Dellamonica, P. (1995). [Persistent diarrhea in HIV infected patients: role of Enterocytozoon bieneusi]. Presse Med., 24, 671-674.

Biderre, C., Canning, E. U., Metenier, G. & Vivares, C. P. (1999a). Comparison of two isolates of Encephalitozoon hellem and E. intestinalis (Microspora) by pulsed field gel electrophoresis. Eur.J.Protistol., 35, 194-196.

Biderre, C., Mathis, A., Deplazes, P., Weber, R., Metenier, G. & Vivares, C. P. (1999b). Molecular karyotype diversity in the microsporidian Encephalitozoon cuniculi. Parasitology, 118 ( Pt 5), 439-445.

Biderre, C., Pages, M., Metenier, G., Canning, E. U. & Vivares, C. P. (1995). Evidence for the smallest nuclear genome (2.9 Mb) in the microsporidium Encephalitozoon

cuniculi. Mol.Biochem.Parasitol., 74, 229-231.

Black, S. S., Steinohrt, L. A., Bertucci, D. C., Rogers, L. B. & Didier, E. S. (1997). Encephalitozoon hellem in budgerigars (Melopsittacus undulatus). Vet.Pathol., 34, 189-198.


- 234 -

Bohne, W., Ferguson, D. J., Kohler, K. & Gross, U. (2000). Developmental expression of a tandemly repeated, glycine- and serine-rich spore wall protein in the microsporidian pathogen Encephalitozoon cuniculi. Infect.Immun., 68, 2268-2275.

Boldorini, R., Monga, G., Tosoni, A., Didier, E. S., Nebuloni, M., Costanzi, G., Mazzucco, G. & Orenstein, J. M. (1998). Renal Encephalitozoon (Septata) intestinalis infection in a patient with AIDS. Post-mortem identification by means of transmission electron microscopy and PCR. Virchows Arch., 432, 535-539.

Bornay-Llinares, F. J., da Silva, A. J., Moura, H., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Pieniazek, N. J., Cruz-Lopez, A., Hernandez-Jauregui, P., Guerrero, J. & Enriquez, F. J. (1998). Immunologic, microscopic, and molecular evidence of Encephalitozoon

intestinalis (Septata intestinalis) infection in mammals other than humans. J.Infect.Dis., 178, 820-826.

Botha, W. S., van Dellen, A. F. & Stewart, C. G. (1979). Canine encephalitozoonosis in South Africa. J.S.Afr.Vet.Assoc., 50, 135-144.

Botterel, F., Minozzi, C., Vittecoq, D. & Bouree, P. (2002). Pulmonary localization of Enterocytozoon bieneusi in an AIDS patient: case report and review. J.Clin.Microbiol., 40, 4800-4801.

Branstetter, D. G. & Knipe, S. M. (1982). Microsporidian infection in the love-bird Agapornis roseicollis. Micron, 13, 61-62.

Brasil, P., de Lima, D. B., de Paiva, D. D., Lobo, M. S., Sodre, F. C., Silva, S. P., Villela, E. V., Silva, E. J., Peralta, J. M., Morgado, M. & Moura, H. (2000). Clinical and diagnostic aspects of intestinal microsporidiosis in HIV-infected patients with chronic diarrhea in Rio de Janeiro, Brazil. Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paulo, 42, 299-304.

Brasil, P., de Paiva, D. D., de Lima, D. B., da Silva, E. J., Peralta, J. M., da Silva, A. J., Sodre, F. C., Villela, E. V. & Moura, H. (1998). A 3-year follow-up of a Brazilian AIDS patient with protracted diarrhea caused by Enterocytozoon bieneusi. Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paulo, 40, 215-218.

Brasil, P., Sodre, F. C., Cuzzi-Maya, T., Gutierrez, M. C., Mattos, H. & Moura, H. (1996). Intestinal microsporidiosis in HIV-positive patients with chronic unexplained diarrhea in Rio de Janeiro, Brazil: diagnosis, clinical presentation and follow-up. Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paulo, 38, 97-102.

Breitenmoser, A. C., Mathis, A., Burgi, E., Weber, R. & Deplazes, P. (1999). High prevalence of Enterocytozoon bieneusi in swine with four genotypes that differ from those identified in humans. Parasitology, 118 ( Pt 5), 447-453.

Bretagne, S., Foulet, F., Alkassoum, W., Fleury-Feith, J. & Develoux, M. (1993). [Prevalence of Enterocytozoon bieneusi spores in the stool of AIDS patients and African children not infected by HIV]. Bull.Soc.Pathol.Exot., 86, 351-357.

Breton, J., Bart-Delabesse, E., Biligui, S., Carbone, A., Seiller, X., Okome-Nkoumou, M., Nzamba, C., Kombila, M., Accoceberry, I. & Thellier, M. (2007). New highly


- 235 -

divergent rRNA sequence among biodiverse genotypes of Enterocytozoon bieneusi

strains isolated from humans in Gabon and Cameroon. J.Clin.Microbiol., 45, 2580-2589.

Brown, J. R. & Doolittle, W. F. (1995). Root of the universal tree of life based on ancient aminoacyl-tRNA syntetase gene duplications. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 92, 2441-2445.

Brown, J. R. & Doolittle, W. F. (1999). Gene descent, duplication, and horizontal transfer in the evolution of glutamyl- and glutaminyl-tRNA synthetases. J.Mol.Evol., 49, 485-495.

Bruzzoniti, M. C., Sarzanini, C. & Mentasti, E. (2000). Preconcentration of contaminants in water analysis. J.Chromatogr.A., 902, 289-309.

Bryan, R. T. (1995). Microsporidiosis as an AIDS-related opportunistic infection. Clin.Infect.Dis., 21 Suppl 1, S62-S65.

Bryan, R. T., Cali, A., Owen, R. L. & Spencer, H. C. (1991). Microsporidia: opportunistic pathogens in patients with AIDS. Prog.Clin.Parasitol., 2, 1-26.

Bryan, R. T. & Schwartz, D. A. (1999). Epidemiology of Microsporidiosis. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 502-516). Washington,DC: American Society of Microbiology.

Buckholt, M. A., Lee, J. H. & Tzipori, S. (2002). Prevalence of Enterocytozoon

bieneusi in swine: an 18-month survey at a slaughterhouse in Massachusetts. Appl.Environ.Microbiol., 68, 2595-2599.

Bywater, J. E. & Kelley, S. T. (1978). The erradication of Encephalitozoon cuniculi from a specific pathogen-free rabbit colony. Lab Anim Sci., 28, 402-404.

Cali, A. (1991). General microsporidian features and recent findings on AIDS isolates. J.Protozool., 38, 625-630.

Cali, A., Kotler, D. P. & Orenstein, J. M. (1993). Septata intestinalis N. G., N. Sp., an intestinal microsporidian associated with chronic diarrhea and dissemination in AIDS patients. J.Eukaryot.Microbiol., 40, 101-112.

Cali, A., Meisler, D. M., Lowder, C. Y., Lembach, R., Ayers, L., Takvorian, P. M., Rutherford, I., Longworth, D. L., McMahon, J. & Bryan, R. T. (1991a). Corneal microsporidioses: characterization and identification. J.Protozool., 38, 215S-217S.

Cali, A., Meisler, D. M., Rutherford, I., Lowder, C. Y., McMahon, J. T., Longworth, D. L. & Bryan, R. T. (1991b). Corneal microsporidiosis in a patient with AIDS. Am.J.Trop.Med.Hyg., 44, 463-468.

Cali, A., Orenstein, J. M., Kotler, D. P. & Owen, R. (1991c). A comparison of two microsporidian parasites in enterocytes of AIDS patients with chronic diarrhea. J.Protozool., 38, 96S-98S.


- 236 -

Cali, A. & Takvorian, P. M. (1999). Developmental morphology and life cycles of the microsporidia. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and

Microsporidiosis (pp. 85-128).

Cali, A. & Takvorian, P. M. (2003). Ultrastructure and development of Pleistophora

ronneafiei n. sp., a microsporidium (Protista) in the skeletal muscle of an immune-compromised individual. J.Eukaryot.Microbiol., 50, 77-85.

Cali, A., Takvorian, P. M., Lewin, S., Rendel, M., Sian, C., Wittner, M. & Weiss, L. M. (1996). Identification of a new Nosema-like microsporidian associated with myositis in an AIDS patient. J.Eukaryot.Microbiol., 43, 108S.

Cali, A., Takvorian, P. M., Lewin, S., Rendel, M., Sian, C. S., Wittner, M., Tanowitz, H. B., Keohane, E. & Weiss, L. M. (1998). Brachiola vesicularum, n. g., n. sp., a new microsporidium associated with AIDS and myositis. J.Eukaryot.Microbiol., 45, 240-251.

Calvo, M., Carazo, M., Arias, M. L., Chaves, C., Monge, R. & Chinchilla, M. (2004). [Prevalence of Cyclospora sp., Cryptosporidium sp, microsporidia and fecal coliform determination in fresh fruit and vegetables consumed in Costa Rica]. Arch.Latinoam.Nutr., 54, 428-432.

Cama, V. A., Pearson, J., Cabrera, L., Pacheco, L., Gilman, R., Meyer, S., Ortega, Y. & Xiao, L. (2007). Transmission of Enterocytozoon bieneusi between a child and guinea pigs. J.Clin.Microbiol., 45, 2708-2710.

Canning, E. U., Curry, A., Vavra, J. & Bonshek, R. E. (1998). Some ultrastructural data on Microsporidium ceylonensis, a cause of corneal microsporidiosis. Parasite, 5, 247-254.

Canning, E. U. & Hollister, W. S. (1987). Microsporidia of mammals--widespread pathogens or opportunistic curiosities? Parasitol.Today, 3, 267-273.

Canning, E. U. & Hollister, W. S. (1991). In vitro and in vivo investigations of human microsporidia. J.Protozool., 38, 631-635.

Canning, E. U. & Hollister, W. S. (1992a). Human infections with microsporidia. Rev.Med.Microbiol., 3, 35-42.

Canning, E. U. & Hollister, W. S. (1992b). The importance of microsporidia as opportunistic infections in patients with acquired immune deficiency syndrome. Eur.J.Gastroenterol.Hepatol., 4, 422-427.

Canning, E. U. & Lom, J. (1986). The Microsporidia of vertebrates. New York: Academic Press.

Carey, C. M., Lee, J. H. & Trevors, J. T. (2004). Biology persistence and detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis oocysts. Water Res., 38, 818-862.


- 237 -

Carlisle, M. S., Snowden, K., Gill, J., Jones, M., O'Donoghue, P. & Prociv, P. (2002). Microsporidiosis in a Gouldian finch (Erythrura [Chloebia] gouldiae). Aust.Vet.J., 80, 41-44.

Carlson, J. R., Li, L., Helton, C. L., Munn, R. J., Wasson, K., Perez, R. V., Gallay, B. J. & Finkbeiner, W. E. (2004). Disseminated microsporidiosis in a pancreas/kidney transplant recipient. Arch.Pathol.Lab Med., 128, e41-e43.

Carr, A., Marriott, D., Field, A. S., Vasak, E. & Cooper, D. A. (1998). Treatment of HIV-1 associated microsporidiosis and cryptosporidiosis with combination antiretroviral therapy. Lancet, 351, 256-261.

Carville, A., Mansfield, K., Widmer, G., Lackner, A., Kotler, D., Wiest, P., Gumbo, T., Sarbah, S. & Tzipori, S. (1997). Development and application of genetic probes for detection of Enterocytozoon bieneusi in formalin-fixed stools and in intestinal biopsy specimens from infected patients. Clin.Diagn.Lab Immunol., 4, 405-408.

Cavalier-Smith, T. (1983). A 6-kingdom classification and a unified phylogeny. In H. E. A. Shenck & W. S. Schwemmler (Eds) Endocytobiology.II. Intracellular Space as

Oligogenetic (pp. 1027-1034). Berlin.

Cavalier-Smith, T. (1987). Eukaryotes with no mitochondria. Nature, 326, 332-333.

Cavalier-Smith, T. (1993). Kingdom protozoa and its 18 phyla. Microbiol.Rev., 57, 953-994.

Cavalier-Smith, T. (1998). A revised six-kingdom system of life. Biol.Rev.Camb.Philos.Soc., 73, 203-266.

Cegielski, J. P., Ortega, Y. R., McKee, S., Madden, J. F., Gaido, L., Schwartz, D. A., Manji, K., Jorgensen, A. F., Miller, S. E., Pulipaka, U. P., Msengi, A. E., Mwakyusa, D. H., Sterling, C. R. & Reller, L. B. (1999). Cryptosporidium, Enterocytozoon, and Cyclospora infections in pediatric and adult patients with diarrhea in Tanzania. Clin.Infect.Dis., 28, 314-321.

Chacin-Bonilla, L., Panunzio, A. P., Monsalve-Castillo, F. M., Parra-Cepeda, I. E. & Martinez, R. (2006). Microsporidiosis in Venezuela: prevalence of intestinal microsporidiosis and its contribution to diarrhea in a group of human immunodeficiency virus-infected patients from Zulia State. Am.J.Trop.Med.Hyg., 74, 482-486.

Chalifoux, L. V., Carville, A., Pauley, D., Thompson, B., Lackner, A. A. & Mansfield, K. G. (2000). Enterocytozoon bieneusi as a cause of proliferative serositis in simian immunodeficiency virus-infected immunodeficient macaques (Macaca mulatta). Arch.Pathol.Lab Med., 124, 1480-1484.

Chalupsky, J., Vavra, J., Gaudin, J. C., Vandewalle, P., Arthur, C. P., Guenezan, M. & Launay, H. (1990). Mise en evidence serologique de la presence d'encephalitozoonose et de toxoplasmose chez le lapin de Garenne (Oryctolagus cuniculus) en France. Bull.Soc.Fr.Parasitol., 8, 95.


- 238 -

Chan, C. M., Theng, J. T., Li, L. & Tan, D. T. (2003). Microsporidial keratoconjunctivitis in healthy individuals: a case series. Ophthalmology, 110, 1420-1425.

Chan, K. S. & Koh, T. H. (2008). Extraction of microsporidial DNA from modified trichrome-stained clinical slides and subsequent species identification using PCR sequencing. Parasitology, 135, 701-703.

Chioralia, G., Trammer, T., Kampen, H. & Seitz, H. M. (1998). Relevant criteria for detecting microsporidia in stool specimens. J.Clin.Microbiol., 36, 2279-2283.

Choudhry, N., Korbel, D. S., Zaalouk, T. K., Blanshard, C., Bajaj-Elliott, M. & McDonald, V. (2009). Interferon-gamma-mediated activation of enterocytes in immunological control of Encephalitozoon intestinalis infection. Parasite Immunol., 31, 2-9.

Chu, P. & West, A. B. (1996). Encephalitozoon (Septata) intestinalis: cytologic, histologic, and electron microscopic features of a systemic intestinal pathogen. Am.J.Clin.Pathol., 106, 606-614.

Chupp, G. L., Alroy, J., Adelman, L. S., Breen, J. C. & Skolnik, P. R. (1993). Myositis due to Pleistophora (Microsporidia) in a patient with AIDS. Clin.Infect.Dis., 16, 15-21.

Cislakova, L. & Halanova, M. (2003). [Microsporidial infections in immunocompromised hospitalized patients]. Epidemiol.Mikrobiol.Imunol., 52, 81-83.

Cislakova, L., Literak, I., Balent, P., Hipikova, V., Levkutova, M., Travnicek, M. & Novotna, A. (2001). Prevalence of antibodies to Encephalitozoon cuniculi (microsporidia) in angora goats--a potential risk of infection for breeders. Ann.Agric.Environ.Med., 8, 289-291.

Clarridge, J. E., III, Karkhanis, S., Rabeneck, L., Marino, B. & Foote, L. W. (1996). Quantitative light microscopic detection of Enterocytozoon bieneusi in stool specimens: a longitudinal study of human immunodeficiency virus-infected microsporidiosis patients. J.Clin.Microbiol., 34, 520-523.

Conners, M. S., Gibler, T. S. & Van Gelder, R. N. (2004). Diagnosis of microsporidia keratitis by polymerase chain reaction. Arch.Ophthalmol., 122, 283-284.

Conteas, C. N., Berlin, O. G., Ash, L. R. & Pruthi, J. S. (2000). Therapy for human gastrointestinal microsporidiosis. Am.J.Trop.Med.Hyg., 63, 121-127.

Conteas, C. N., Berlin, O. G., Lariviere, M. J., Pandhumas, S. S., Speck, C. E., Porschen, R. & Nakaya, T. (1998a). Examination of the prevalence and seasonal variation of intestinal microsporidiosis in the stools of persons with chronic diarrhea and human immunodeficiency virus infection. Am.J.Trop.Med.Hyg., 58, 559-561.

Conteas, C. N., Berlin, O. G., Speck, C. E., Pandhumas, S. S., Lariviere, M. J. & Fu, C. (1998b). Modification of the clinical course of intestinal microsporidiosis in acquired


- 239 -

immunodeficiency syndrome patients by immune status and anti-human immunodeficiency virus therapy. Am.J.Trop.Med.Hyg., 58, 555-558.

Conteas, C. N., Sowerby, T., Berlin, G. W., Dahlan, F., Nguyen, A., Porschen, R., Donovan, J., LaRiviere, M. & Orenstein, J. M. (1996). Fluorescence techniques for diagnosing intestinal microsporidiosis in stool, enteric fluid, and biopsy specimens from acquired immunodeficiency syndrome patients with chronic diarrhea. Arch.Pathol.Lab

Med., 120, 847-853.

Corradi, N., Akiyoshi, D. E., Morrison, H. G., Feng, X., Weiss, L. M., Tzipori, S. & Keeling, P. J. (2007). Patterns of genome evolution among the microsporidian parasites Encephalitozoon cuniculi, Antonospora locustae and Enterocytozoon bieneusi. PLoS.One., 2, e1277.

Corradi, N. & Keeling, P. J. (2009). Microsporidia. a journey through radical taxonomical revisions. Fungal Biology Reviews, 23, 1-8.

Cotruvo, J. A., Dufour, A., Rees, G., Bartram, J., Carr, R., Cliver, D. O., Craun, G. F., Fayer, R. & Gannon, V. P. J. (2004). World Health Organization.Waterborne

Zoonoses:Identification, Causes and Control. London: IWA Publishing.

Cotte, L., Rabodonirina, M., Chapuis, F., Bailly, F., Bissuel, F., Raynal, C., Gelas, P., Persat, F., Piens, M. A. & Trepo, C. (1999). Waterborne outbreak of intestinal microsporidiosis in persons with and without human immunodeficiency virus infection. J.Infect.Dis., 180, 2003-2008.

Cotte, L., Rabodonirina, M., Piens, M. A., Perreard, M., Mojon, M. & Trepo, C. (1993). Prevalence of intestinal protozoans in French patients infected with HIV. J.Acquir.Immune.Defic.Syndr., 6, 1024-1029.

Coupe, S., Delabre, K., Pouillot, R., Houdart, S., Santillana-Hayat, M. & Derouin, F. (2006). Detection of Cryptosporidium, Giardia and Enterocytozoon bieneusi in surface water, including recreational areas: a one-year prospective study. FEMS

Immunol.Med.Microbiol., 47, 351-359.

Cox, J. C., Hamilton, R. C. & Attwood, H. D. (1979). An investigation of the route and progression of Encephalitozoon cuniculi infection in adult rabbits. J.Protozool., 26, 260-265.

Cox, J. C. & Walden, N. B. (1972). Presuntive diagnosis of Nosema cuniculi in rabbits by immunofluorescence. Res.Vet.Sci., 13, 595-597.

Coyle, C., Kent, M., Tanowitz, H. B., Wittner, M. & Weiss, L. M. (1998). TNP-470 is an effective antimicrosporidial agent. J.Infect.Dis., 177, 515-518.

Coyle, C. M., Weiss, L. M., Rhodes, L. V., III, Cali, A., Takvorian, P. M., Brown, D. F., Visvesvara, G. S., Xiao, L., Naktin, J., Young, E., Gareca, M., Colasante, G. & Wittner, M. (2004). Fatal myositis due to the microsporidian Brachiola algerae, a mosquito pathogen. N.Engl.J.Med., 351, 42-47.


- 240 -

Coyle, C. M., Wittner, M., Kotler, D. P., Noyer, C., Orenstein, J. M., Tanowitz, H. B. & Weiss, L. M. (1996). Prevalence of microsporidiosis due to Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon (Septata) intestinalis among patients with AIDS-related diarrhea: determination by polymerase chain reaction to the microsporidian small-subunit rRNA gene. Clin.Infect.Dis., 23, 1002-1006.

Croppo, G. P., Visvesvara, G. S., Leitch, G. J., Wallace, S. & De Groote, M. A. (1997). Western blot and immunofluorescence analysis of a human isolate of Encephalitozoon

cuniculi established in culture from the urine of a patient with AIDS. J.Parasitol., 83, 66-69.

Curry, A. (1999). Human microsporidial infections and possible animal sources. Curr.Opin.Infect.Dis., 12, 473-480.

Curry, A., Beeching, N. J., Gilbert, J. D., Scott, G., Rowland, P. L. & Currie, B. J. (2005). Trachipleistophora hominis infection in the myocardium and skeletal muscle of a patient with AIDS. J.Infect., 51, e139-e144.

Curry, A. & Smith, H. V. (1998). Emerging pathogens: Isospora, Cyclospora and microsporidia. Parasitology, 117 Suppl, S143-S159.

da Silva, A. J., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., de, M. H., Slemenda, S. B. & Pieniazek, N. J. (1996). Sensitive PCR diagnosis of Infections by Enterocytozoon

bieneusi (microsporidia) using primers based on the region coding for small-subunit rRNA. J.Clin.Microbiol., 34, 986-987.

da Silva, A. J., Slemenda, S. B., Visvesvara, G. S., Schwartz, D. A., Wilcox, C. M., Wallace, S. & Pieniazek, N. J. (1997). Detection of Septata intestinalis (Microsporidia) Cali et al. 1993 Using Polymerase Chain Reaction Primers Targeting the Small Submit Subunit Ribosomal RNA Coding Region. Mol.Diagn., 2, 47-52.

Dascomb, K., Frazer, T., Clark, R. A., Kissinger, P. & Didier, E. (2000). Microsporidiosis and HIV. J.Acquir.Immune.Defic.Syndr., 24, 290-292.

David, F., Schuitema, A. R., Sarfati, C., Liguory, O., Hartskeerl, R. A., Derouin, F. & Molina, J. M. (1996). Detection and species identification of intestinal microsporidia by polymerase chain reaction in duodenal biopsies from human immunodeficiency virus-infected patients. J.Infect.Dis., 174, 874-877.

Davis, M. R., Font, R. L., Keisler, M. S. & Shadduck, J. A. (1990). Corneal microsporidiosis:A case report including ultrastructural observations. Ophthalmology, 97, 953-957.

De Groote, M. A., Visvesvara, G., Wilson, M. L., Pieniazek, N. J., Slemenda, S. B., Dasilva, A. J., Leitch, G. J., Bryan, R. T. & Reves, R. (1995). Polymerase chain reaction and culture confirmation of disseminated Encephalitozoon cuniculi in a patient with AIDS: successful therapy with albendazole. J.Infect.Dis., 171, 1375-1378.

DeGirolami, P. C., Ezratty, C. R., Desai, G., McCullough, A., Asmuth, D., Wanke, C. & Federman, M. (1995). Diagnosis of intestinal microsporidiosis by examination of stool


- 241 -

and duodenal aspirate with Weber's modified trichrome and Uvitex 2B strains. J.Clin.Microbiol., 33, 805-810.

del, A. C., Croppo, G. P., Moura, H., da Silva, A. J., Leitch, G. J., Moss, D. M., Wallace, S., Slemenda, S. B., Pieniazek, N. J. & Visvesara, G. S. (1998). Ultrastruture,immunofluorescence,Western blot,and PCR analysis of eight isolates of Encephalitozoon (Septata) intestinalis established in culture from sputum and urine samples and duodenal aspirates of five patients with AIDS. J.Clin.Microbiol., 36, 1201-1208.

del, A. C., Izquierdo, F., Navajas, R., Pieniazek, N. J., Miro, G., Alonso, A. I., da Silva, A. J. & Fenoy, S. (1999). Enterocytozoon bieneusi in animals: rabbits and dogs as new hosts. J.Eukaryot.Microbiol., 46, 8S-9S.

del, A. C., Lopez-Velez, R., Fenoy, S., Turrientes, C., Cobo, J., Navajas, R., Visvesvara, G. S., Croppo, G. P., da Silva, A. J. & Pieniazek, N. J. (1997a). Identification of Enterocytozoon bieneusi spores in respiratory samples from an AIDS patient with a 2-year history of intestinal microsporidiosis. J.Clin.Microbiol., 35, 1862-1866.

del, A. C., Moura, H., Fenoy, S., Navajas, R., Lopez-Velez, R., Li, L., Xiao, L., Leitch, G. J., da, S. A., Pieniazek, N. J., Lal, A. A. & Visvesvara, G. S. (2001a). In vitro culture, ultrastructure, antigenic, and molecular characterization of Encephalitozoon

cuniculi isolated from urine and sputum samples from a Spanish patient with AIDS. J.Clin.Microbiol., 39, 1105-1108.

del, A. C., Navajas, R., Gurbindo, D., Ramos, J. T., Mellado, M. J., Fenoy, S., Munoz Fernandez, M. A., Subirats, M., Ruiz, J. & Pieniazek, N. J. (1997b). Microsporidiosis in HIV-positive children in Madrid (Spain). J.Eukaryot.Microbiol., 44, 84S-85S.

del, A. C., Rueda, C., Haro, M., Scaglia, M., Gatti, S., Bornay-Llinares, F. J., Fenoy, S. & Henriques-Gil, N. (2001b). Genetic and immunologic characterization of seven Encephalitozoon hellem human strains. J.Eukaryot.Microbiol., Suppl, 66S-68S.

Delarbre, S., Gatti, S., Scaglia, M. & Drancour, M. (2001). Genetic diversity in the microsporidian Encephalitozoon hellem demonstrated by pulsed-field gel electrophoresis. J.Eukaryot.Microbiol., 48, 471-474.

Delbac, F., Peyret, P., Metenier, G., David, D., Danchin, A. & Vivares, C. P. (1998). On proteins of the microsporidian invasive apparatus: complete sequence of a polar tube protein of Encephalitozoon cuniculi. Mol.Microbiol., 29, 825-834.

Dengjel, B., Zahler, M., Hermanns, W., Heinritzi, K., Spillmann, T., Thomschke, A., Loscher, T., Gothe, R. & Rinder, H. (2001). Zoonotic potential of Enterocytozoon

bieneusi. J.Clin.Microbiol., 39, 4495-4499.

Deplazes, P., Mathis, A., Baumgartner, R., Tanner, I. & Weber, R. (1996a). Immunologic and molecular characteristics of Encephalitozoon-like microsporidia isolated from humans and rabbits indicate that Encephalitozoon cuniculi is a zoonotic parasite. Clin.Infect.Dis., 22, 557-559.


- 242 -

Deplazes, P., Mathis, A., Muller, C. & Weber, R. (1996b). Molecular epidemiology of Encephalitozoon cuniculi and first detection of Enterocytozoon bieneusi in faecal samples of pigs. J.Eukaryot.Microbiol., 43, 93S.

Deplazes, P., Mathis, A., van, S. M., Iten, A., Keller, R., Tanner, I., Glauser, M. P., Weber, R. & Canning, E. U. (1998). Dual microsporidial infection due to Vittaforma corneae and Encephalitozoon hellem in a patient with AIDS. Clin.Infect.Dis., 27, 1521-1524.

Deplazes, P., Mathis, A. & Weber, R. (2000). Epidemiology and zoonotic aspects of microsporidia of mammals and birds. Contrib.Microbiol., 6, 236-260.

Desportes, I., Le, C. Y., Galian, A., Bernard, E., Cochand-Priollet, B., Lavergne, A., Ravisse, P. & Modigliani, R. (1985). Ocurrence of a new microsporidian: Enterocytozoon bieneusi n.g., n.sp., in the enterocytes of a human patient with AIDS. J.Protozool., 32, 250-254.

Desportes-Livage, I., Doumbo, O., Pichard, E., Hilmarsdottir, I., Traore, H. A., Maiga, I. I., El, F. Y. & Dolo, A. (1998). Microsporidiosis in HIV-seronegative patients in Mali. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 92, 423-424.

Didier, E. S. (1998). Microsporidiosis. Clin.Infect.Dis., 27, 1-7.

Didier, E. S. (2000). Immunology of microsporidiosis. Contrib.Microbiol., 6, 193-208.

Didier, E. S. (2005). Microsporidiosis: an emerging and opportunistic infection in humans and animals. Acta Trop., 94, 61-76.

Didier, E. S. & Bessinger, G. T. (1999). Host-parasite relationships in microsporidiosis. animal models and immunology. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia

and Microsporidiosis (pp. 225-257). Washington,DC: American Society of Microbiology.

Didier, E. S., Didier, P. J., Friedberg, D. N., Stenson, S. M., Orenstein, J. M., Yee, R. W., Tio, F. O., Davis, M. R., Vossbrinck, C., Millichamp, N. & Shadduck, J. A. (1991a). Isolation and characterization of a new human microsporidian, Encephalitozoon hellem (n.sp.),from three AIDS patients with keratoconjunctivitis. J.Infect.Dis., 163, 617-621.

Didier, E. S., Didier, P. J., Snowden, K. F. & Shadduck, J. A. (2000). Microsporidiosis in mammals. Microbes.Infect., 2, 709-720.

Didier, E. S., Maddry, J. A., Brindley, P. J., Stovall, M. E. & Didier, P. J. (2005). Therapeutic strategies for human microsporidia infections. Expert.Rev.Anti.Infect.Ther., 3, 419-434.

Didier, E. S., Orenstein, J. M., Aldras, A., Bertucci, D., Rogers, L. B. & Janney, F. A. (1995a). Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids. J.Clin.Microbiol., 33, 3138-3145.


- 243 -

Didier, E. S., Phillips, J. N., Kuebler, D. J., Nasr, M., Brindley, P. J., Stovall, M. E., Bowers, L. C. & Didier, E. S. (2006). Antimicrosporidial activities of fumagillin, TNP-470, ovalicin, and ovalicin derivatives in vitro and in vivo. Antimicrob.Agents

Chemother., 50, 2146-2155.

Didier, E. S., Rogers, L. B., Brush, A. D., Wong, S., Traina-Dorge, V. & Bertucci, D. (1996a). Diagnosis of disseminated microsporidian Encephalitozoon hellem infection by PCR-Southern analysis and successful treatment with albendazole and fumagillin. J.Clin.Microbiol., 34, 947-952.

Didier, E. S., Rogers, L. B., Orenstein, J. M., Baker, M. D., Vossbrinck, C. R., van, G. T., Hartskeerl, R., Soave, R. & Beaudet, L. M. (1996b). Characterization of Encephalitozoon (Septata) intestinalis isolates cultured from nasal mucosa and bronchoalveolar lavage fluids of two AIDS patients. J.Eukaryot.Microbiol., 43, 34-43.

Didier, E. S., Shadduck, J. A., Didier, P. J., Millichamp, N. & Vossbrinck, C. R. (1991b). Studies on ocular microsporidia. J.Protozool., 38, 635-638.

Didier, E. S., Snowden, K. F. & Shadduck, J. A. (1998). Biology of microsporidian species infecting mammals. Adv.Parasitol., 40, 283-320.

Didier, E. S., Stovall, M. E., Green, L. C., Brindley, P. J., Sestak, K. & Didier, P. J. (2004). Epidemiology of microsporidiosis: sources and modes of transmission. Vet.Parasitol., 126, 145-166.

Didier, E. S., Varner, P. W., Didier, P. J., Aldras, A. M., Millichamp, N. J., Murphey-Corb, M., Bohm, R. & Shadduck, J. A. (1994). Experimental microsporidiosis in immunocompetent and immunodeficient mice and monkeys. Folia Parasitol.(Praha), 41, 1-11.

Didier, E. S., Visvesvara, G. S., Baker, M. D., Rogers, L. B., Bertucci, D. C., De Groote, M. A. & Vossbrinck, C. R. (1996c). A microsporidian isolated from an AIDS patient corresponds to Encephalitozoon cuniculi III, originally isolated from domestic dogs. J.Clin.Microbiol., 34, 2835-2837.

Didier, E. S., Vossbrinck, C. R., Baker, M. D., Rogers, L. B., Bertucci, D. C. & Shadduck, J. A. (1995b). Identification and characterization of three Encephalitozoon

cuniculi strains. Parasitology, 111 ( Pt 4), 411-421.

Didier, E. S. & Weiss, L. M. (2006). Microsporidiosis: current status. Curr.Opin.Infect.Dis., 19, 485-492.

Didier, P. J., Didier, E. S., Orenstein, J. M. & Shadduck, J. A. (1991c). Fine structure of a new human microsporidian, Encephalitozoon hellem, in culture. J.Protozool., 38, 502-507.

Diesenhouse, M. C., Wilson, L. A., Corrent, G. F., Visvesvara, G. S., Grossniklaus, H. E. & Bryan, R. T. (1993). Treatment of microsporidial keratoconjunctivitis with topical fumagillin. Am.J.Ophthalmol., 115, 293-298.


- 244 -

Dobbins, W. O., III & Weinstein, W. M. (1985). Electron microscopy of the intestine and rectum in acquired immunodeficiency syndrome. Gastroenterology, 88, 738-749.

Dong, S., Shen, Z., Xu, L. & Zhu, F. (2010). Sequence and phylogenetic analysis of SSU rRNA gene of five microsporidia. Curr.Microbiol., 60, 30-37.

Donovan, E. P., Staskal, D. F., Unice, K. M., Roberts, J. D., Haws, L. C., Finley, B. L. & Harris, M. A. (2008). Risk of gastrointestinal disease associated with exposure to pathogens in the sediments of the Lower Passaic River. Appl.Environ.Microbiol., 74, 1004-1018.

Dore, G. J., Marriott, D. J., Hing, M. C., Harkness, J. L. & Field, A. S. (1995). Disseminated microsporidiosis due to Septata intestinalis in nine patients infected with the human immunodeficiency virus: response to therapy with albendazole. Clin.Infect.Dis., 21, 70-76.

Dowd, S. E., Gerba, C. P. & Pepper, I. L. (1998). Confirmation of the human-pathogenic microsporidia Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, and Vittaforma corneae in water. Appl.Environ.Microbiol., 64, 3332-3335.

Dowd, S. E., John, D., Eliopolus, J., Gerba, C. P., Naranjo, J., Klein, R., Lopez, B., de, M. M., Mendoza, C. E. & Pepper, I. L. (2003). Confirmed detection of Cyclospora

cayetanesis, Encephalitozoon intestinalis and Cryptosporidium parvum in water used for drinking. J.Water Health, 1, 117-123.

Drobniewski, F., Kelly, P., Carew, A., Ngwenya, B., Luo, N., Pankhurst, C. & Farthing, M. (1995). Human microsporidiosis in African AIDS patients with chronic diarrhea. J.Infect.Dis., 171, 515-516.

Drosten, C., Laabs, J., Kuhn, E. M. & Schottelius, J. (2005). Interspecies transmission of Enterozytozoon bieneusi supported by observations in laboratory animals and phylogeny. Med.Microbiol.Immunol., 194, 207-209.

Dyer, P. S. (2008). Evolutionary biology: microsporidia sex--a missing link to fungi. Curr.Biol., 18, R1012-R1014.

Edlind, T., Visvesvara, G., Li, J. & Katiyar, S. (1994). Cryptosporidium and microsporidial beta-tubulin sequences: predictions of benzimidazole sensitivity and phylogeny. J.Eukaryot.Microbiol., 41, 38S.

Edlind, T. D., Li, J., Visvesvara, G. S., Vodkin, M. H., McLaughlin, G. L. & Katiyar, S. K. (1996). Phylogenetic analysis of beta-tubulin sequences from amitochondrial protozoa. Mol.Phylogenet.Evol., 5, 359-367.

Eeftinck Schattenkerk, J. K., van, G. T., van Ketel, R. J., Bartelsman, J. F., Kuiken, C. L., Terpstra, W. J. & Reiss, P. (1991). Clinical significance of small-intestinal microsporidiosis in HIV-1-infected individuals. Lancet, 337, 895-898.

Endeshaw, T., Kebede, A., Verweij, J. J., Wolday, D., Zewide, A., Tsige, K., Abraham, Y., Messele, T., Polderman, A. M. & Petros, B. (2005). Detection of intestinal


- 245 -

microsporidiosis in diarrhoeal patients infected with the human immunideficiency virus (HIV-1) using PCR and Uvitex-2B stain. Ethiop.Med.J., 43, 97-101.

Endeshaw, T., Kebede, A., Verweij, J. J., Zewide, A., Tsige, K., Abraham, Y., Wolday, D., Woldemichael, T., Messele, T., Polderman, A. M. & Petros, B. (2006). Intestinal microsporidiosis in diarrheal patients infected with human immunodeficiency virus-1 in Addis Ababa, Ethiopia. Jpn.J.Infect.Dis., 59, 306-310.

Espern, A., Morio, F., Miegeville, M., Illa, H., Abdoulaye, M., Meyssonnier, V., Adehossi, E., Lejeune, A., Cam, P. D., Besse, B. & Gay-Andrieu, F. (2007). Molecular study of microsporidiosis due to Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon

intestinalis among human immunodeficiency virus-infected patients from two geographical areas: Niamey, Niger, and Hanoi, Vietnam. J.Clin.Microbiol., 45, 2999-3002.

Fast, N. M. & Keeling, P. J. (2001). Alpha and beta subunits of pyruvate dehydrogenase E1 from the microsporidian Nosema locustae: mitochondrion-derived carbon metabolism in microsporidia. Mol.Biochem.Parasitol., 117, 201-209.

Fast, N. M., Logsdon, J. M., Jr. & Doolittle, W. F. (1999). Phylogenetic analysis of the TATA box binding protein (TBP) gene from Nosema locustae: evidence for a microsporidia-fungi relationship and spliceosomal intron loss. Mol.Biol.Evol., 16, 1415-1419.

Fayer, R., Santin, M. & Palmer, R. (2003a). Comparison of microscopy and PCR for detection of three species of Encephalitozoon in feces. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 572-573.

Fayer, R., Santin, M., Palmer, R. & Li, X. (2003b). Detection of Encephalitozoon

hellem in feces of experimentally infected chickens. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 574-575.

Fayer, R., Santin, M. & Trout, J. M. (2003c). First detection of microsporidia in dairy calves in North America. Parasitol.Res., 90, 383-386.

Fayer, R., Santin, M. & Trout, J. M. (2007). Enterocytozoon bieneusi in mature dairy cattle on farms in the eastern United States. Parasitol.Res., 102, 15-20.

Fedorko, D. P. & Hijazi, Y. M. (1996). Application of molecular techniques to the diagnosis of microsporidial infection. Emerg.Infect.Dis., 2, 183-191.

Feng, X., Akiyoshi, D. E., Sheoran, A., Singh, I., Hanawalt, J., Zhang, Q., Widmer, G. & Tzipori, S. (2006). Serial propagation of the microsporidian Enterocytozoon bieneusi of human origin in immunocompromised rodents. Infect.Immun., 74, 4424-4429.

Ferreira, F. M., Bezerra, L., Santos, M. B., Bernardes, R. M., Avelino, I. & Silva, M. L. (2001). Intestinal microsporidiosis: a current infection in HIV-seropositive patients in Portugal. Microbes.Infect., 3, 1015-1019.


- 246 -

Field, A. S., Hing, M. C., Milliken, S. T. & Marriott, D. J. (1993). Microsporidia in the small intestine of HIV-infected patients. A new diagnostic technique and a new species. Med.J.Aust., 158, 390-394.

Field, A. S., Marriott, D. J., Milliken, S. T., Brew, B. J., Canning, E. U., Kench, J. G., Darveniza, P. & Harkness, J. L. (1996). Myositis associated with a newly described microsporidian, Trachipleistophora hominis, in a patient with AIDS. J.Clin.Microbiol., 34, 2803-2811.

Flegel, T. W. & Pasharawipas, T. (1995). A proposal for typical meiosis in microsporidiosis. Can.J.Microbiol., 41, 1-11.

Fogla, R., Padmanabhan, P., Therese, K. L., Biswas, J. & Madhavan, H. N. (2005). Chronic microsporidial stromal keratitis in an immunocompetent, non-contact lens wearer. Indian J.Ophthalmol., 53, 123-125.

Ford, T. E. (1999). Microbiological safety of drinking water: United States and global perspectives. Environ.Health Perspect., 107, 191-206.

Fournier, S., Dubrou, S., Liguory, O., Gaussin, F., Santillana-Hayat, M., Sarfati, C., Molina, J. M. & Derouin, F. (2002). Detection of Microsporidia, cryptosporidia and Giardia in swimming pools: a one-year prospective study. FEMS

Immunol.Med.Microbiol., 33, 209-213.

Fournier, S., Liguory, O., Santillana-Hayat, M., Guillot, E., Sarfati, C., Dumoutier, N., Molina, J. & Derouin, F. (2000a). Detection of microsporidia in surface water: a one-year follow-up study. FEMS Immunol.Med.Microbiol., 29, 95-100.

Fournier, S., Liguory, O., Sarfati, C., vid-Ouaknine, F., Derouin, F., Decazes, J. M. & Molina, J. M. (2000b). Disseminated infection due to Encephalitozoon cuniculi in a patient with AIDS: case report and review. HIV.Med., 1, 155-161.

Franzen, C. (2004). Microsporidia: how can they invade other cells? Trends Parasitol., 20, 275-279.

Franzen, C. (2008). Microsporidia: A Review of 150 Years of Research. The Open

Parasitology Journal, 2, 1-34.

Franzen, C., Hartmann, P. & Salzberger, B. (2005a). Cytokine and nitric oxide responses of monocyte-derived human macrophages to microsporidian spores. Exp.Parasitol., 109, 1-6.

Franzen, C., Kuppers, R., Muller, A., Salzberger, B., Fatkenheuer, G., Vetten, B., Diehl, V. & Schrappe, M. (1996a). Genetic evidence for latent Septata intestinalis infection in human immunodeficiency virus-infected patients with intestinal microsporidiosis. J.Infect.Dis., 173, 1038-1040.

Franzen, C. & Muller, A. (1999a). Cryptosporidia and microsporidia--waterborne diseases in the immunocompromised host. Diagn.Microbiol.Infect.Dis., 34, 245-262.


- 247 -

Franzen, C. & Muller, A. (1999b). Molecular techniques for detection, species differentiation, and phylogenetic analysis of microsporidia. Clin.Microbiol.Rev., 12, 243-285.

Franzen, C., Muller, A., Hartmann, P., Hegener, P., Schrappe, M., Diehl, V., Fatkenheuer, G. & Salzberger, B. (1998). Polymerase chain reaction for diagnosis and species differentiation of microsporidia. Folia Parasitol.(Praha), 45, 140-148.

Franzen, C., Muller, A., Hartmann, P. & Salzberger, B. (2005b). Cell invasion and intracellular fate of Encephalitozoon cuniculi (Microsporidia). Parasitology, 130, 285-292.

Franzen, C., Muller, A., Hegener, P., Hartmann, P., Salzberger, B., Franzen, B., Diehl, V. & Fatkenheuer, G. (1996b). Polymerase chain reaction for microsporidian DNA in gastrointestinal biopsy specimens of HIV-infected patients. AIDS, 10, F23-F27.

Franzen, C., Muller, A., Salzberger, B., Fatkenheuer, G., Eidt, S., Mahrle, G., Diehl, V. & Schrappe, M. (1995a). Tissue diagnosis of intestinal microsporidiosis using a fluorescent stain with Uvitex 2B. J.Clin.Pathol., 48, 1009-1010.

Franzen, C., Nassonova, E. S., Scholmerich, J. & Issi, I. V. (2006). Transfer of the members of the genus Brachiola (microsporidia) to the genus Anncaliia based on ultrastructural and molecular data. J.Eukaryot.Microbiol., 53, 26-35.

Franzen, C., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Muller, A., Schwenk, A., Salzberger, B., Fatkenheuer, G., Hartmann, P., Mahrle, G., Diehl, V. & . (1995b). Immunologically confirmed disseminated, asymptomatic Encephalitozoon cuniculi infection of the gastrointestinal tract in a patient with AIDS. Clin.Infect.Dis., 21, 1480-1484.

Friedberg, D. N. & Ritterband, D. C. (1999). Ocular microsporidiosis. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 292-314). Washington,DC: American Society of Microbiology.

Friedberg, D. N., Stenson, S. M., Orenstein, J. M., Tierno, P. M. & Charles, N. C. (1990). Microsporidial keratoconjunctivitis in acquired immunodeficiency syndrome. Arch.Ophthalmol., 108, 504-508.

Fuentealba, I. C., Mahoney, N. T., Shadduck, J. A., Harvill, J., Wicher, V. & Wicher, K. (1992). Hepatic lesions in rabbits infected with Encephalitozoon cuniculi administered per rectum. Vet.Pathol., 29, 536-540.

Furuya, K. (2002). Genotyping of Encephalitozoon cuniculi isolates found in Hokkaido. Jpn.J.Infect.Dis., 55, 128-130.

Furuya, K., Asakura, T., Igarashi, M. & Morita, T. (2009). Microsporidian Encephalitozoon cuniculi antibodies in rabbit urine samples. Vet.Rec., 165, 85-86.

Gainzarain, J. C., Canut, A., Lozano, M., Labora, A., Carreras, F., Fenoy, S., Navajas, R., Pieniazek, N. J., da Silva, A. J. & del, A. C. (1998). Detection of Enterocytozoon

bieneusi in two human immunodeficiency virus-negative patients with chronic diarrhea


- 248 -

by polymerase chain reaction in duodenal biopsy specimens and review. Clin.Infect.Dis., 27, 394-398.

Gamboa-Dominguez, A., De, A. J., Donis, J., Ruiz-Maza, F., Visvesvara, G. S. & Diliz, H. (2003). Disseminated Encephalitozoon cuniculi infection in a Mexican kidney transplant recipient. Transplantation, 75, 1898-1900.

Garcia, L. S. (2002). Laboratory identification of the microsporidia. J.Clin.Microbiol., 40, 1892-1901.

Gatti, S., Sacchi, L., Novati, S., Corona, S., Bernuzzi, A. M., Moura, H., Pieniazek, N. J., Visvesvara, G. S. & Scaglia, M. (1997). Extraintestinal microsporidiosis in AIDS patients: clinical features and advanced protocols for diagnosis and characterization of the isolates. J.Eukaryot.Microbiol., 44, 79S.

Gelis, S. & Raidal, S. R. (2006). Microsporidiosis in a flock of tricolor parrot finches (Erythrura tricolor). Vet.Clin.North Am.Exot.Anim Pract., 9, 481-486.

Gerba, C. P., Riley, K. R., Nwachuku, N., Ryu, H. & Abbaszadegan, M. (2003). Removal of Encephalitozoon intestinalis, calicivirus, and coliphages by conventional drinking water treatment. J.Environ.Sci.Health A Tox.Hazard.Subst.Environ.Eng, 38, 1259-1268.

Germot, A., Philippe, H. & Le, G. H. (1997). Evidence for loss of mitochondria in Microsporidia from a mitochondrial-type HSP70 in Nosema locustae. Mol.Biochem.Parasitol., 87, 159-168.

Ghosh, K. & Weiss, L. M. (2009). Molecular diagnostic tests for microsporidia. Interdiscip.Perspect.Infect.Dis., 2009, 926521.

Glaser, C. A., Angulo, F. J. & Roodney, J. A. (1994). Animal-associated opportunistic infections among persons infected with the human immunodeficiency virus. Clin.Infect.Dis., 18, 14-24.

Goetz, M., Eichenlaub, S., Pape, G. R. & Hoffmann, R. M. (2001). Chronic diarrhea as a result of intestinal microsposidiosis in a liver transplant recipient. Transplantation, 71, 334-337.

Goguel, J., Katlama, C., Sarfati, C., Maslo, C., Leport, C. & Molina, J. M. (1997). Remission of AIDS-associated intestinal microsporidiosis with highly active antiretroviral therapy. AIDS, 11, 1658-1659.

Goldberg, A. V., Molik, S., Tsaousis, A. D., Neumann, K., Kuhnke, G., Delbac, F., Vivares, C. P., Hirt, R. P., Lill, R. & Embley, T. M. (2008). Localization and functionality of microsporidian iron-sulphur cluster assembly proteins. Nature, 452, 624-628.

Gomez Morales, M. A., Atzori, C., Ludovisi, A., Rossi, P. & Pozio, E. (1995). Opportunistic and non-opportunistic parasites in HIV-positive and negative patients with diarrhoea in Tanzania. Trop.Med.Parasitol., 46, 109-114.


- 249 -

Goodgame, R., Stager, C., Marcantel, B., Alcocer, E. & Segura, A. M. (1999). Intensity of infection in AIDS-related intestinal microsporidiosis. J.Infect.Dis., 180, 929-932.

Graczyk, T. K., Bosco-Nizeyi, J., da Silva, A. J., Moura, I. N., Pieniazek, N. J., Cranfield, M. R. & Lindquist, H. D. (2002). A single genotype of Encephalitozoon

intestinalis infects free-ranging gorillas and people sharing their habitats in Uganda. Parasitol.Res., 88, 926-931.

Graczyk, T. K., Johansson, M. A., Tamang, L., Visvesvara, G. S., Moura, L. S., Dasilva, A. J., Girouard, A. S. & Matos, O. (2007a). Retrospective species identification of microsporidian spores in diarrheic fecal samples from human immunodeficiency virus/AIDS patients by multiplexed fluorescence in situ hybridization. J.Clin.Microbiol., 45, 1255-1260.

Graczyk, T. K., Sunderland, D., Rule, A. M., da Silva, A. J., Moura, I. N., Tamang, L., Girouard, A. S., Schwab, K. J. & Breysse, P. N. (2007b). Urban feral pigeons (Columba livia) as a source for air- and waterborne contamination with Enterocytozoon

bieneusi spores. Appl.Environ.Microbiol., 73, 4357-4358.

Grau, A., Valls, M. E., Williams, J. E., Ellis, D. S., Muntane, M. J. & Nadal, C. (1996). [Myositis caused by Pleistophora in a patient with AIDS]. Med.Clin.(Barc.), 107, 779-781.

Gray, M. L., Puette, M. & Latimer, K. S. (1998). Microsporidiosis in a young ostrich (Struthio camelus). Avian Dis., 42, 832-836.

Green, L. C., Didier, P. J., Bowers, L. C. & Didier, E. S. (2004). Natural and experimental infection of immunocompromised rhesus macaques (Macaca mulatta) with the microsporidian Enterocytozoon bieneusi genotype D. Microbes.Infect., 6, 996-1002.

Grohmann, G. S., Glass, R. I., Pereira, H. G., Monroe, S. S., Hightower, A. W., Weber, R. & Bryan, R. T. (1993). enteric viruses and diarrhea in HIV-infected patients. N.Engl.J.Med., 329, 14-20.

Guerard, A., Rabodonirina, M., Cotte, L., Liguory, O., Piens, M. A., Daoud, S., Picot, S. & Touraine, J. L. (1999). Intestinal microsporidiosis occurring in two renal transplant recipients treated with mycophenolate mofetil. Transplantation, 68, 699-707.

Gumbo, T., Gangaidzo, I. T., Sarbah, S., Carville, A., Tzipori, S. & Wiest, P. M. (2000). Enterocytozoon bieneusi infection in patients without evidence of immunosuppression: two cases from Zimbabwe found to have positive stools by PCR. Ann.Trop.Med.Parasitol., 94, 699-702.

Gumbo, T., Hobbs, R. E., Carlyn, C., Hall, G. & Isada, C. M. (1999a). Microsporidia infection in transplant patients. Transplantation, 67, 482-484.

Gumbo, T., Sarbah, S., Gangaidzo, I. T., Ortega, Y., Sterling, C. R., Carville, A., Tzipori, S. & Wiest, P. M. (1999b). Intestinal parasites in patients with diarrhea and human immunodeficiency virus infection in Zimbabwe. AIDS, 13, 819-821.


- 250 -

Guscetti, F., Mathis, A., Hatt, J. M. & Deplazes, P. (2003). Overt fatal and chronic subclinical Encephalitozoon cuniculi microsporidiosis in a colony of captive emperor tamarins (Saguinus imperator). J.Med.Primatol., 32, 111-119.

Halanova, M., Cislakova, L., Valencakova, A., Balent, P., Adam, J. & Travnicek, M. (2003). Serological screening of occurrence of antibodies to Encephalitozoon cuniculi in humans and animals in Eastern Slovakia. Ann.Agric.Environ.Med., 10, 117-120.

Harcourt-Brown, F. M. & Holloway, H. K. (2003). Encephalitozoon cuniculi in pet rabbits. Vet.Rec., 152, 427-431.

Haro, M., del, A. C., Fenoy, S. & Henriques-Gil, N. (2003). Intraspecies genotype variability of the microsporidian parasite Encephalitozoon hellem. J.Clin.Microbiol., 41, 4166-4171.

Haro, M., Henriques-Gil, N., Fenoy, S., Izquierdo, F., Alonso, F. & del, A. C. (2006). Detection and genotyping of Enterocytozoon bieneusi in pigeons. J.Eukaryot.Microbiol., 53 Suppl 1, S58-S60.

Haro, M., Izquierdo, F., Henriques-Gil, N., Andres, I., Alonso, F., Fenoy, S. & del, A. C. (2005). First detection and genotyping of human-associated microsporidia in pigeons from urban parks. Appl.Environ.Microbiol., 71, 3153-3157.

Hartskeerl, R. A., van, G. T., Schuitema, A. R., Didier, E. S. & Terpstra, W. J. (1995). Genetic and immunological characterization of the microsporidian Septata intestinalis Cali, Kotler and Orenstein, 1993: reclassification to Encephalitozoon intestinalis. Parasitology, 110 ( Pt 3), 277-285.

Hautvast, J. L., Tolboom, J. J., Derks, T. J., Beckers, P. & Sauerwein, R. W. (1997). Asymptomatic intestinal microsporidiosis in a human immunodeficiency virus-seronegative, immunocompetent Zambian child. Pediatr.Infect.Dis.J., 16, 415-416.

Hersteinsson, P., Gunnarsson, E., Hjartardottir, S. & Skirnisson, K. (1993). Prevalence of Encephalitozoon cuniculi antibodies in terrestrial mammals in Iceland, 1986 to 1989. J.Wildl.Dis., 29, 341-344.

Hester, J. D., Lindquist, H. D., Bobst, A. M. & Schaefer, F. W., III (2000). Fluorescent in situ detection of Encephalitozoon hellem spores with a 6-carboxyfluorescein-labeled ribosomal RNA-targeted oligonucleotide probe. J.Eukaryot.Microbiol., 47, 299-308.

Hester, J. D., Varma, M., Bobst, A. M., Ware, M. W., Lindquist, H. D. & Schaefer, F. W., III (2002). Species-specific detection of three human-pathogenic microsporidial species from the genus Encephalitozoon via fluorogenic 5' nuclease PCR assays. Mol.Cell Probes, 16, 435-444.

Hibbett, D. S., Binder, M., Bischoff, J. F., Blackwell, M., Cannon, P. F., Eriksson, O. E., Huhndorf, S., James, T., Kirk, P. M., Lucking, R., Thorsten, L. H., Lutzoni, F., Matheny, P. B., McLaughlin, D. J., Powell, M. J., Redhead, S., Schoch, C. L., Spatafora, J. W., Stalpers, J. A., Vilgalys, R., Aime, M. C., Aptroot, A., Bauer, R., Begerow, D., Benny, G. L., Castlebury, L. A., Crous, P. W., Dai, Y. C., Gams, W.,


- 251 -

Geiser, D. M., Griffith, G. W., Gueidan, C., Hawksworth, D. L., Hestmark, G., Hosaka, K., Humber, R. A., Hyde, K. D., Ironside, J. E., Koljalg, U., Kurtzman, C. P., Larsson, K. H., Lichtwardt, R., Longcore, J., Miadlikowska, J., Miller, A., Moncalvo, J. M., Mozley-Standridge, S., Oberwinkler, F., Parmasto, E., Reeb, V., Rogers, J. D., Roux, C., Ryvarden, L., Sampaio, J. P., Schussler, A., Sugiyama, J., Thorn, R. G., Tibell, L., Untereiner, W. A., Walker, C., Wang, Z., Weir, A., Weiss, M., White, M. M., Winka, K., Yao, Y. J. & Zhang, N. (2007). A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycol.Res., 111, 509-547.

Hinkle, G., Morrison, H. G. & Sogin, M. L. (1997). Genes coding for reverse transcriptase, DNA-directed RNA polymerase, and chitin synthase from the microsporidian Spraguea lophii. Biol.Bull., 193, 250-251.

Hirt, R. P., Healy, B., Vossbrinck, C. R., Canning, E. U. & Embley, T. M. (1997). A mitochondrial Hsp70 orthologue in Vairimorpha necatrix: molecular evidence that microsporidia once contained mitochondria. Curr.Biol., 7, 995-998.

Hirt, R. P., Logsdon, J. M., Jr., Healy, B., Dorey, M. W., Doolittle, W. F. & Embley, T. M. (1999). Microsporidia are related to Fungi: evidence from the largest subunit of RNA polymerase II and other proteins. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 96, 580-585.

Hollister, W. S. & Canning, E. U. (1987). An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to Encephalitozoon cuniculi and its use in determination of infections in man. Parasitology, 94 ( Pt 2), 209-219.

Hollister, W. S., Canning, E. U. & Anderson, C. L. (1996a). Identification of Microsporidia causing human disease. J.Eukaryot.Microbiol., 43, 104S-105S.

Hollister, W. S., Canning, E. U., Colbourn, N. I. & Aarons, E. J. (1995). Encephalitozoon cuniculi isolated from the urine of an AIDS patient, which differs from canine and murine isolates. J.Eukaryot.Microbiol., 42, 367-372.

Hollister, W. S., Canning, E. U., Colbourn, N. I., Curry, A. & Lacey, C. J. (1993). Characterization of Encephalitozoon hellem (Microspora) isolated from the nasal mucosa of a patient with AIDS. Parasitology, 107 ( Pt 4), 351-358.

Hollister, W. S., Canning, E. U. & Viney, M. (1989). Prevalence of antibodies to Encephalitozoon cuniculi in stray dogs as determined by an ELISA. Vet.Rec., 124, 332-336.

Hollister, W. S., Canning, E. U., Weidner, E., Field, A. S., Kench, J. & Marriott, D. J. (1996b). Development and ultrastructure of Trachipleistophora hominis n.g., n.sp. after in vitro isolation from an AIDS patient and inoculation into athymic mice. Parasitology, 112 ( Pt 1), 143-154.

Hollister, W. S., Canning, E. U. & Willcox, A. (1991). Evidence for widespread occurrence of antibodies to Encephalitozoon cuniculi (Microspora) in man provided by ELISA and other serological tests. Parasitology, 102 Pt 1, 33-43.


- 252 -

Hutin, Y. J., Sombardier, M. N., Liguory, O., Sarfati, C., Derouin, F., Modai, J. & Molina, J. M. (1998). Risk factors for intestinal microsporidiosis in patients with human immunodeficiency virus infection: a case-control study. J.Infect.Dis., 178, 904-907.

Ignatius, R., Henschel, S., Liesenfeld, O., Mansmann, U., Schmidt, W., Koppe, S., Schneider, T., Heise, W., Futh, U., Riecken, E. O., Hahn, H. & Ullrich, R. (1997). Comparative evaluation of modified trichrome and Uvitex 2B stains for detection of low numbers of microsporidial spores in stool specimens. J.Clin.Microbiol., 35, 2266-2269.

Jafri, H. S., Reedy, T. & Moorhead, A. R. Detection of pathogenic protozoa in fecal specimens from urbem dwelling dogs. Am.J.Trop.Med.Hyg. 49[3], 269. 1993. Ref Type: Abstract

John, D. E., Nwachuku, N., Pepper, I. L. & Gerba, C. P. (2003). Development and optimization of a quantitative cell culture infectivity assay for the microsporidium Encephalitozoon intestinalis and application to ultraviolet light inactivation. J.Microbiol.Methods, 52, 183-196.

Johnson, C. H., Marshall, M. M., DeMaria, L. A., Moffet, J. M. & Korich, D. G. (2003). Chlorine inactivation of spores of Encephalitozoon spp. Appl.Environ.Microbiol., 69, 1325-1326.

Johnson, L. R. (1988). Regulation of gastrointestinal mucosal growth. Physiol.Rev., 68, 456-469.

Joseph, J., Vaddavalli, P. K., Gopinathan, U. & Sharma, S. (2006). Can donor cornea transmit microsporidial infection? Indian J.Med.Microbiol., 24, 305-306.

Joseph, J., Vemuganti, G. K. & Sharma, S. (2005). Microsporidia: emerging ocular pathogens. Indian J.Med.Microbiol., 23, 80-91.

Juarez, S. I., Ichinose, A., Jongwutiwes, S., Yanagi, T. & Kanbara, H. (2003). A species of microsporidium isolated from an HIV-infected patient and identified as Trachipleistophora anthropophthera by transmission electron microscopy. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 576.

Juarez, S. I., Putaporntip, C., Jongwutiwes, S., Ichinose, A., Yanagi, T. & Kanbara, H. (2005). In vitro cultivation and electron microscopy characterization of Trachipleistophora anthropophthera isolated from the cornea of an AIDS patient. J.Eukaryot.Microbiol., 52, 179-190.

Kakrania, R., Joseph, J., Vaddavalli, P. K., Gangopadhyay, N. & Sharma, S. (2006). Microsporidia keratoconjunctivitis in a corneal graft. Eye (Lond), 20, 1314-1315.

Kamaishi, T., Hashimoto, T., Nakamura, Y., Masuda, Y., Nakamura, F., Okamoto, K., Shimizu, M. & Hasegawa, M. (1996a). Complete nucleotide sequences of the genes encoding translation elongation factors 1 alpha and 2 from a microsporidian parasite,


- 253 -

Glugea plecoglossi: implications for the deepest branching of eukaryotes. J.Biochem., 120, 1095-1103.

Kamaishi, T., Hashimoto, T., Nakamura, Y., Nakamura, F., Murata, S., Okada, N., Okamoto, K., Shimizu, M. & Hasegawa, M. (1996b). Protein phylogeny of translation elongation factor EF-1 alpha suggests microsporidians are extremely ancient eukaryotes. J.Mol.Evol., 42, 257-263.

Kasickova, D., Sak, B., Kvac, M. & Ditrich, O. (2007). Detection of Encephalitozoon

cuniculi in a new host--cockateel (Nymphicus hollandicus) using molecular methods. Parasitol.Res., 101, 1685-1688.

Kasickova, D., Sak, B., Kvac, M. & Ditrich, O. (2009). Sources of potentially infectious human microsporidia: molecular characterisation of microsporidia isolates from exotic birds in the Czech Republic, prevalence study and importance of birds in epidemiology of the human microsporidial infections. Vet.Parasitol., 165, 125-130.

Katinka, M. D., Duprat, S., Cornillot, E., Metenier, G., Thomarat, F., Prensier, G., Barbe, V., Peyretaillade, E., Brottier, P., Wincker, P., Delbac, F., El, A. H., Peyret, P., Saurin, W., Gouy, M., Weissenbach, J. & Vivares, C. P. (2001). Genome sequence and gene compaction of the eukaryote parasite Encephalitozoon cuniculi. Nature, 414, 450-453.

Katiyar, S. K., Visvesvara, G. S. & Edlind, T. D. (1995). Comparisons of ribosomal RNA sequences from amitochondrial protozoa: implications for processing, mRNA binding and paromomycin susceptibility. Gene, 152, 27-33.

Katznelson, H. & Jamiesin, C. A. (1952). Control of nosema disease of honey-bees with fumagillin. Science, 115, 70-71.

Katzwinkel-Wladarsch, S., Deplazes, P., Weber, R., Loscher, T. & Rinder, H. (1997). Comparison of polymerase chain reaction with light microscopy for detection of microsporidia in clinical specimens. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 16, 7-10.

Katzwinkel-Wladarsch, S., Lieb, M., Helse, W., Loscher, T. & Rinder, H. (1996). Direct amplification and species determination of microsporidian DNA from stool specimens. Trop.Med.Int.Health, 1, 373-378.

Keeling, P. J. & Doolittle, W. F. (1996). Alpha-tubulin from early-diverging eukaryotic lineages and the evolution of the tubulin family. Mol.Biol.Evol., 13, 1297-1305.

Kelkar, R., Sastry, P. S., Kulkarni, S. S., Saikia, T. K., Parikh, P. M. & Advani, S. H. (1997). Pulmonary microsporidial infection in a patient with CML undergoing allogeneic marrow transplant. Bone Marrow Transplant., 19, 179-182.

Kelly, P., McPhail, G., Ngwenya, B., Luo, N., Karew, A. H., Pankhurst, C., Drobniewski, F. & Farthing, M. (1994). Septata intestinalis: a new microsporidian in Africa. Lancet, 344, 271-272.


- 254 -

Kemp, R. L. & Kluge, J. P. (1975). Encephalitozoon sp. in the blue-masked lovebird, Agapornis personata (Reichenow):first confirmed report of microsporidian infection in birds. J.Protozool., 22, 489-491.

Khalifa, A. M., El Temsahy, M. M. & Abou, E. N., I (2001). Effect of ozone on the viability of some protozoa in drinking water. J.Egypt.Soc.Parasitol., 31, 603-616.

Kock, N. P., Petersen, H., Fenner, T., Sobottka, I., Schmetz, C., Deplazes, P., Pieniazek, N. J., Albrecht, H. & Schottelius, J. (1997). Species-specific identification of microsporidia in stool and intestinal biopsy specimens by the polymerase chain reaction. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 16, 369-376.

Kodjikian, L., Garweg, J. G., Nguyen, M., Schaffner, T., Deplazese, P. & Zimmerli, S. (2005). Intraocular microsporidiosis due to Encephalitozoon cuniculi in a patient with idiopathic CD4+ T-lymphocytopenia. Int.J.Med.Microbiol., 294, 529-533.

Kokoskin, E., Gyorkos, T. W., Camus, A., Cedilotte, L., Purtill, T. & Ward, B. (1994). Modified technique for efficient detection of microsporidia. J.Clin.Microbiol., 32, 1074-1075.

Kondova, I., Mansfield, K., Buckholt, M. A., Stein, B., Widmer, G., Carville, A., Lackner, A. & Tzipori, S. (1998). Transmission and serial propagation of Enterocytozoon bieneusi from humans and Rhesus macaques in gnotobiotic piglets. Infect.Immun., 66, 5515-5519.

Kotler, D. P., Giang, T. T., Garro, M. L. & Orenstein, J. M. (1994). Light microscopic diagnosis of microsporidiosis in patients with AIDS. Am.J.Gastroenterol., 89, 540-544.

Kotler, D. P. & Orenstein, J. M. (1994). Prevalence of intestinal microsporidiosis in HIV-infected individuals referred for gastroenterological evaluation. Am.J.Gastroenterol., 89, 1998-2002.

Kotler, D. P. & Orenstein, J. M. (1998). Clinical syndromes associated with microsporidiosis. Adv.Parasitol., 40, 321-349.

Kotler, D. P. & Orenstein, J. M. (1999). Clinical syndromes associated with microsporidiosis. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and

Microsporidiosis (pp. 258-292). Washington,DC: American Society of Microbiology.

Koudela, B., Kucerova, S. & Hudcovic, T. (1999). Effect of low and high temperatures on infectivity of Encephalitozoon cuniculi spores suspended in water. Folia

Parasitol.(Praha), 46, 171-174.

Koudela, B., Visvesvara, G. S., Moura, H. & Vavra, J. (2001). The human isolate of Brachiola algerae (Phylum Microspora): development in SCID mice and description of its fine structure features. Parasitology, 123, 153-162.

Kramer, J. P. (1970). Longevity of microsporidian spores with special reference to Octosporea muscae-domesticae flu. Acta Protozool., 8, 217-224.


- 255 -

Kucerova, Z., Moura, H., Visvesvara, G. S. & Leitch, G. J. (2004). Differences between Brachiola (Nosema) algerae isolates of human and insect origin when tested using an in vitro spore germination assay and a cultured cell infection assay. J.Eukaryot.Microbiol., 51, 339-343.

Kucerova-Pospisilova, Z., Carr, D., Leitch, G., Scanlon, M. & Visvesvara, G. S. (1999). Environmental resistance of Encephalitozoon spores. J.Eukaryot.Microbiol., 46, 11S-13S.

Kucerova-Pospisilova, Z. & Ditrich, O. (1998). The serological surveillance of several groups of patients using antigens of Encephalitozoon hellem and E. cuniculi antibodies to microsporidia in patients. Folia Parasitol.(Praha), 45, 108-112.

Kucerova-Pospisilova, Z., Moura, H., Secor, E. & Visvesvara, G. (2003). Immunoblot analysis to evaluate serologic reactivity of HIV-1-negative blood donors to microsporidia. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 577-578.

Kucerova-Pospisilova, Z., Secor, W. E., Moura, H., sportes-Livage, I., Datry, A., Bern, C., Leitch, G. & Visvesvara, G. S. (2001). An ELISA test to detect human serum antibodies reactive with Encephalitozoon intestinalis. J.Eukaryot.Microbiol., Suppl, 73S-74S.

Kudo, R. (1925). MICROSPORIDIA. Science, 61, 366.

Kudo, R. R. (1947). Protozoology. Illinois: Springfield.

Kyaw, T., Curry, A., Edwards-Jones, V., Craske, J. & Mandal, B. K. (1997). The prevalence of Enterocytozoon bieneusi in acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) patients from the north west of England: 1992-1995. Br.J.Biomed.Sci., 54, 186-191.

Lamps, L. W., Bronner, M. P., Vnencak-Jones, C. L., Tham, K. T., Mertz, H. R. & Scott, M. A. (1998). Optimal screening and diagnosis of microsporida in tissue sections: a comparison of polarization, special stains, and molecular techniques. Am.J.Clin.Pathol., 109, 404-410.

Lanternier, F., Boutboul, D., Menotti, J., Chandesris, M. O., Sarfati, C., Mamzer Bruneel, M. F., Calmus, Y., Mechai, F., Viard, J. P., Lecuit, M., Bougnoux, M. E. & Lortholary, O. (2009). Microsporidiosis in solid organ transplant recipients: two Enterocytozoon bieneusi cases and review. Transpl.Infect.Dis., 11, 83-88.

Larsson, J. I. (2005). Molecular versus morphological approach to microsporidian classification. Folia Parasitol.(Praha), 52, 143-144.

Latib, M. A., Pascoe, M. D., Duffield, M. S. & Kahn, D. (2001). Microsporidiosis in the graft of a renal transplant recipient. Transpl.Int., 14, 274-277.

Lebbad, M., Norrgren, H., Naucler, A., Dias, F., Andersson, S. & Linder, E. (2001). Intestinal parasites in HIV-2 associated AIDS cases with chronic diarrhoea in Guinea-Bissau. Acta Trop., 80, 45-49.


- 256 -

Leder, K., Ryan, N., Spelman, D. & Crowe, S. M. (1998). Microsporidial disease in HIV-infected patients: a report of 42 patients and review of the literature. Scand.J.Infect.Dis., 30, 331-338.

Lederberg, J., Shope, R. F. & Oaks, S. (1992). Institute of Medicine.Emerging

infections:Microbial threats to health in the United States. Washington, DC.

Ledford, D. K., Overman, M. D., Gonzalvo, A., Cali, A., Mester, S. W. & Lockey, R. F. (1985). Microsporidiosis myositis in a patiente with the adquired immunodeficiency syndrome. Ann.Intern.Med., 102, 628-630.

Lee, J. H. (2007). Prevalence and molecular characteristics of Enterocytozoon bieneusi in cattle in Korea. Parasitol.Res., 101, 391-396.

Lee, S. C., Corradi, N., Byrnes, E. J., III, Torres-Martinez, S., Dietrich, F. S., Keeling, P. J. & Heitman, J. (2008). Microsporidia evolved from ancestral sexual fungi. Curr.Biol., 18, 1675-1679.

Leelayoova, S., Subrungruang, I., Rangsin, R., Chavalitshewinkoon-Petmitr, P., Worapong, J., Naaglor, T. & Mungthin, M. (2005). Transmission of Enterocytozoon

bieneusi genotype a in a Thai orphanage. Am.J.Trop.Med.Hyg., 73, 104-107.

Leelayoova, S., Subrungruang, I., Suputtamongkol, Y., Worapong, J., Petmitr, P. C. & Mungthin, M. (2006). Identification of genotypes of Enterocytozoon bieneusi from stool samples from human immunodeficiency virus-infected patients in Thailand. J.Clin.Microbiol., 44, 3001-3004.

Leelayoova, S., Vithayasai, N., Watanaveeradej, V., Chotpitayasunondh, T., Therapong, V., Naaglor, T. & Mungthin, M. (2001). Intestinal microsporidiosis in HIV-infected children with acute and chronic diarrhea. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 32, 33-37.

Leitch, G. J. & Ceballos, C. (2008). Effects of host temperature and gastric and duodenal environments on microsporidia spore germination and infectivity of intestinal epithelial cells. Parasitol.Res., 104, 35-42.

Levaditi, C., Nicolau, S. & Schoen, R. (1923). L'agent étiologique de l'encéphalite épizootique du lapin (Encephalitozoon cuniculi). C.R.Acad.Sci.Biol., 89, 984-986.

Lewthwaite, P., Gill, G. V., Hart, C. A. & Beeching, N. J. (2005). Gastrointestinal parasites in the immunocompromised. Curr.Opin.Infect.Dis., 18, 427-435.

Li, J., Katiyar, S. K., Hamelin, A., Visvesvara, G. S. & Edlind, T. D. (1996). Tubulin genes from AIDS-associated microsporidia and implications for phylogeny and benzimidazole sensitivity. Mol.Biochem.Parasitol., 78, 289-295.

Li, X., Trout, J. M., Jenkins, M. C., Palmer, R. & Fayer, R. (2002). Effects of gamma radiation on viability of Encephalitozoon spores. J.Parasitol., 88, 812-813.


- 257 -

Liguory, O., David, F., Sarfati, C., Derouin, F. & Molina, J. M. (1998). Determination of types of Enterocytozoon bieneusi strains isolated from patients with intestinal microsporidiosis. J.Clin.Microbiol., 36, 1882-1885.

Liguory, O., David, F., Sarfati, C., Schuitema, A. R., Hartskeerl, R. A., Derouin, F., Modai, J. & Molina, J. M. (1997). Diagnosis of infections caused by Enterocytozoon

bieneusi and Encephalitozoon intestinalis using polymerase chain reaction in stool specimens. AIDS, 11, 723-726.

Liguory, O., Fournier, S., Sarfati, C., Derouin, F. & Molina, J. M. (2000). Genetic homology among thirteen Encephalitozoon intestinalis isolates obtained from human immunodeficiency virus-infected patients with intestinal microsporidiosis. J.Clin.Microbiol., 38, 2389-2391.

Liguory, O., Sarfati, C., Derouin, F. & Molina, J. M. (2001). Evidence of different Enterocytozoon bieneusi genotypes in patients with and without human immunodeficiency virus infection. J.Clin.Microbiol., 39, 2672-2674.

Lippert, U., Schottelius, J. & Manegold, C. (2003). [Disseminated microsporidiosis (Encephalitozoon intestinalis) in a patient with HIV infection]. Dtsch.Med.Wochenschr., 128, 1769-1772.

Liu, J. J., Greeley, E. H. & Shadduck, J. A. (1988). Murine encephalitozoonosis: the effect of age and mode of transmission on occurrence of infection. Lab Anim Sci., 38, 675-679.

Lobo, M. L., Silveira, H., Ramos, S., Xiao, L. & Matos, O. (2006a). Characterization of a pathogen related to Vavraia culicis detected in a laboratory colony of Anopheles stephensi. J.Eukaryot.Microbiol., 53 Suppl 1, S65-S67.

Lobo, M. L., Teles, A., da Cunha, M. B., Henriques, J., Lourenco, A. M., Antunes, F. & Matos, O. (2003). Microsporidia detection in stools from pets and animals from the zoo in Portugal: a preliminary study. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 581-582.

Lobo, M. L., Xiao, L., Cama, V., Magalhaes, N., Antunes, F. & Matos, O. (2006b). Identification of potentially human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi genotypes in various birds. Appl.Environ.Microbiol., 72, 7380-7382.

Lobo, M. L., Xiao, L., Cama, V., Stevens, T., Antunes, F. & Matos, O. (2006c). Genotypes of Enterocytozoon bieneusi in mammals in Portugal. J.Eukaryot.Microbiol., 53 Suppl 1, S61-S64.

Lom, J. & Vavra, J. (1961). [Some results in the study on the microstructure of spores of the fish parasite, Plistophora hyphessobryconis (Microsporidia).]. Wiad.Parazytol., 7, 828-832.

Lono, A., Kumar, G. S. & Chye, T. T. (2010). Prevalence of microsporidia in an indigenous Orang Asli community in Pahang, Malaysia. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 104, 214-218.


- 258 -

Lono, A. R., Kumar, S. & Chye, T. T. (2008). Incidence of microsporidia in cancer patients. J.Gastrointest.Cancer, 39, 124-129.

Lopez-Velez, R., Turrientes, M. C., Garron, C., Montilla, P., Navajas, R., Fenoy, S. & del, A. C. (1999). Microsporidiosis in travelers with diarrhea from the tropics. J.Travel.Med., 6, 223-227.

Lores, B., Arias, C., Fenoy, S., Iglesias, I., Ocampo, A., Miralles, C., Garcia Estevez, J. M. & del, A. C. (1999). Enterocytozoon bieneusi: a common opportunistic parasite in lungs of HIV-positive patients? J.Eukaryot.Microbiol., 46, 6S-7S.

Lores, B., del, A. C. & Arias, C. (2002a). Enterocytozoon bieneusi (microsporidia) in faecal samples from domestic animals from Galicia, Spain. Mem.Inst.Oswaldo Cruz, 97, 941-945.

Lores, B., Lopez-Miragaya, I., Arias, C., Fenoy, S., Torres, J. & del, A. C. (2002b). Intestinal microsporidiosis due to Enterocytozoon bieneusi in elderly human immunodeficiency virus--negative patients from Vigo, Spain. Clin.Infect.Dis., 34, 918-921.

Lowman, P. M., Takvorian, P. M. & Cali, A. (2000). The effects of elevated temperatures and various time-temperature combinations on the development of Brachiola (Nosema) algerae N. Comb. in mammalian cell culture. J.Eukaryot.Microbiol., 47, 221-234.

Luna, V. A., Stewart, B. K., Bergeron, D. L., Clausen, C. R., Plorde, J. J. & Fritsche, T. R. (1995). Use of the fluorochrome calcofluor white in the screening of stool specimens for spores of microsporidia. Am.J.Clin.Pathol., 103, 656-659.

Maggi, P., Larocca, A. M., Quarto, M., Serio, G., Brandonisio, O., Angarano, G. & Pastore, G. (2000). Effect of antiretroviral therapy on cryptosporidiosis and microsporidiosis in patients infected with human immunodeficiency virus type 1. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 19, 213-217.

Mahmood, M. N., Keohane, M. E. & Burd, E. M. (2003). Pathologic quiz case: a 45-year-old renal transplant recipient with persistent fever. Arch.Pathol.Lab Med., 127, e224-e226.

Maiga, I., Doumbo, O., Dembele, M., Traore, H., sportes-Livage, I., Hilmarsdottir, I., Giboyau, E., Maiga, L., Kassambara, L., El, F. Y., Datry, A., Gentilini, M. & Pichard, E. (1997). [Human intestinal microsporidiosis in Bamako (Mali): the presence of Enterocytozoon bieneusi in HIV seropositive patients]. Sante, 7, 257-262.

Mak, J. W. (2004). Important zoonotic intestinal protozoan parasites in Asia. Trop.Biomed., 21, 39-50.

Malone, L. A. & McIvor, C. A. (1995). DNA probes for two Microsporidia, Nosema

bombycis and Nosema costelytrae. J.Invertebr.Pathol., 65, 269-273.


- 259 -

Malone, L. A. & McIvor, C. A. (1996). Use of nucleotide sequence data to identify a microsporidian pathogen of Pieris rapae (Lepidoptera, Pieridae). J.Invertebr.Pathol., 68, 231-238.

Mansfield, K. G., Carville, A., Hebert, D., Chalifoux, L., Shvetz, D., Lin, K. C., Tzipori, S. & Lackner, A. A. (1998). Localization of persistent Enterocytozoon bieneusi infection in normal rhesus macaques (Macaca mulatta) to the hepatobiliary tree. J.Clin.Microbiol., 36, 2336-2338.

Mansfield, K. G., Carville, A., Shvetz, D., MacKey, J., Tzipori, S. & Lackner, A. A. (1997). Identification of an Enterocytozoon bieneusi-like microsporidian parasite in simian-immunodeficiency-virus-inoculated macaques with hepatobiliary disease. Am.J.Pathol., 150, 1395-1405.

Marangi, A., Maggi, P., Panaro, M. A., Angarano, G., Pastore, G., Lisi, S., Romanelli, C. & Brandonisio, O. (1995). Intestinal microsporidiosis in AIDS patients with diarrhoeal illness in Apulia (south Italy). New Microbiol., 18, 435-439.

Margileth, A. M., Strano, A. J., Chandra, R., Neafie, R., Blum, M. & McCully, R. M. (1973). Disseminated nosematosis in an immunologically compromised infant. Arch.Pathol., 95, 145-150.

Marshall, M. M., Hayes, S., Moffett, J., Sterling, C. R. & Nicholson, W. L. (2003). Comparison of UV inactivation of spores of three encephalitozoon species with that of spores of two DNA repair-deficient Bacillus subtilis biodosimetry strains. Appl.Environ.Microbiol., 69, 683-685.

Mathis, A., Akerstedt, J., Tharaldsen, J., Odegaard, O. & Deplazes, P. (1996). Isolates of Encephalitozoon cuniculi from farmed blue foxes (Alopex lagopus) from Norway differ from isolates from Swiss domestic rabbits (Oryctolagus cuniculus). Parasitol.Res., 82, 727-730.

Mathis, A., Breitenmoser, A. C. & Deplazes, P. (1999a). Detection of new Enterocytozoon genotypes in faecal samples of farm dogs and a cat. Parasite, 6, 189-193.

Mathis, A., Michel, M., Kuster, H., Muller, C., Weber, R. & Deplazes, P. (1997). Two Encephalitozoon cuniculi strains of human origin are infectious to rabbits. Parasitology, 114 ( Pt 1), 29-35.

Mathis, A., Tanner, I., Weber, R. & Deplazes, P. (1999b). Genetic and phenotypic intraspecific variation in the microsporidian Encephalitozoon hellem. Int.J.Parasitol., 29, 767-770.

Mathis, A., Weber, R. & Deplazes, P. (2005). Zoonotic potential of the microsporidia. Clin.Microbiol.Rev., 18, 423-445.

Matos, O., Lobo, M. L. & Antunes, F. (2001). Methodology of the diagnosis of microsporidiosis in urine and pulmonary specimens from AIDS patients. J.Eukaryot.Microbiol., Suppl, 69S-70S.


- 260 -

Matos, O., Lobo, M. L., Goncalves, L. & Antunes, F. (2002). Diagnostic use of 3 techniques for identification of microsporidian spores among AIDS patients in Portugal. Scand.J.Infect.Dis., 34, 591-593.

Matsubayashi, H., Koike, T., Mikata, I., Takei, H. & Hagiware, S. (1959). A case of Encephalitozoon-like body infection in man. A.M.A.Arch.Pathol., 67, 181-187.

McDougall, R. J., Tandy, M. W., Boreham, R. E., Stenzel, D. J. & O'Donoghue, P. J. (1993). Incidental finding of a microsporidian parasite from an AIDS patient. J.Clin.Microbiol., 31, 436-439.

McInnes, E. F. & Stewart, C. G. (1991). The pathology of subclinical infection of Encephalitozoon cuniculi in canine dams producing pups with overt encephalitozoonosis. J.S.Afr.Vet.Assoc., 62, 51-54.

Menotti, J., Cassinat, B., Porcher, R., Sarfati, C., Derouin, F. & Molina, J. M. (2003a). Development of a real-time polymerase-chain-reaction assay for quantitative detection of Enterocytozoon bieneusi DNA in stool specimens from immunocompromised patients with intestinal microsporidiosis. J.Infect.Dis., 187, 1469-1474.

Menotti, J., Cassinat, B., Sarfati, C., Liguory, O., Derouin, F. & Molina, J. M. (2003b). Development of a real-time PCR assay for quantitative detection of Encephalitozoon

intestinalis DNA. J.Clin.Microbiol., 41, 1410-1413.

Menotti, J., Santillana-Hayat, M., Cassinat, B., Sarfati, C., Derouin, F. & Molina, J. M. (2005). Inhibitory activity of human immunodeficiency virus aspartyl protease inhibitors against Encephalitozoon intestinalis evaluated by cell culture-quantitative PCR assay. Antimicrob.Agents Chemother., 49, 2362-2366.

Mertens, R. B., Didier, E. S., Fishbein, M. C., Bertucci, D. C., Rogers, L. B. & Orenstein, J. M. (1997). Encephalitozoon cuniculi microsporidiosis: infection of the brain, heart, kidneys, trachea, adrenal glands, and urinary bladder in a patient with AIDS. Mod.Pathol., 10, 68-77.

Metcalfe, T. W., Doran, R. M., Rowlands, P. L., Curry, A. & Lacey, C. J. (1992). Microsporidial keratoconjunctivitis in a patient with AIDS. Br.J.Ophthalmol., 76, 177-178.

Metenier, G. & Vivares, C. P. (2001). Molecular characteristics and physiology of microsporidia. Microbes.Infect., 3, 407-415.

Metge, S., Van Nhieu, J. T., Dahmane, D., Grimbert, P., Foulet, F., Sarfati, C. & Bretagne, S. (2000). A case of Enterocytozoon bieneusi infection in an HIV-negative renal transplant recipient. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 19, 221-223.

Miao, Y. M., wad-El-Kariem, F. M., Franzen, C., Ellis, D. S., Muller, A., Counihan, H. M., Hayes, P. J. & Gazzard, B. G. (2000). Eradication of cryptosporidia and microsporidia following successful antiretroviral therapy. J.Acquir.Immune.Defic.Syndr., 25, 124-129.


- 261 -

Mittleider, D., Green, L. C., Mann, V. H., Michael, S. F., Didier, E. S. & Brindley, P. J. (2002). Sequence survey of the genome of the opportunistic microsporidian pathogen, Vittaforma corneae. J.Eukaryot.Microbiol., 49, 393-401.

Modigliani, R., Bories, C., Le, C. Y., Salmeron, M., Messing, B., Galian, A., Rambaud, J. C., Lavergne, A., Cochand-Priollet, B. & Desportes, I. (1985). Diarrhoea and malabsorption in acquired immune deficiency syndrome: a study of four cases with special emphasis on opportunistic protozoan infestations. Gut, 26, 179-187.

Mohandas, K., Sehgai, R., Sud, A. & Malla, N. (2002). Prevalence of intestinal parasitic pathogens in HIV-seropositive individuals in noerthern India. Jpn.J.Infect.Dis., 55, 83-84.

Mohindra, A. R., Lee, M. W., Visvesvara, G., Moura, H., Parasuraman, R., Leitch, G. J., Xiao, L., Yee, J. & del, B. R. (2002). Disseminated microsporidiosis in a renal transplant recipient. Transpl.Infect.Dis., 4, 102-107.

Mohn, S. F., Nordstoga, K. & Moller, O. M. (1982). Experimental encephalitozoonosis in the blue fox. Transplacental transmission of the parasite. Acta Vet.Scand., 23, 211-220.

Molina, J. M., Goguel, J., Sarfati, C., Chastang, C., sportes-Livage, I., Michiels, J. F., Maslo, C., Katlama, C., Cotte, L., Leport, C., Raffi, F., Derouin, F. & Modai, J. (1997). Potential efficacy of fumagillin in intestinal microsporidiosis due to Enterocytozoon

bieneusi in patients with HIV infection: results of a drug screening study. The French Microsporidiosis Study Group. AIDS, 11, 1603-1610.

Molina, J. M., Oksenhendler, E., Beauvais, B., Sarfati, C., Jaccard, A., Derouin, F. & Modai, J. (1995). Disseminated microsporidiosis due to Septata intestinalis in patients with AIDS: clinical features and response to albendazole therapy. J.Infect.Dis., 171, 245-249.

Molina, J. M., Sarfati, C., Beauvais, B., Lemann, M., Lesourd, A., Ferchal, F., Casin, I., Lagrange, P., Modigliani, R., Derouin, F. & . (1993). Intestinal microsporidiosis in human immunodeficiency virus-infected patients with chronic unexplained diarrhea: prevalence and clinical and biologic features. J.Infect.Dis., 167, 217-221.

Molina, J. M., Tourneur, M., Sarfati, C., Chevret, S., de, G. A., Gobert, J. G., Balkan, S. & Derouin, F. (2002). Fumagillin treatment of intestinal microsporidiosis. N.Engl.J.Med., 346, 1963-1969.

Monis, P. T. & Giglio, S. (2006). Nucleic acid amplification-based technique for pathogen detection and identificatio. Genetics and Evolution, 6, 2-12.

Monteiro, L., Bonnemaison, D. & Vekris, A. (1997). Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces:helicobacter pylori model. J.Clin.Microbiol., 35, 995-998.

Morakote, N., Siriprasert, P., Piangjai, S., Vitayasai, P., Tookyang, B. & Uparanukraw, P. (1995). Microsporidium and Cyclospora in human stools in Chiang Mai, Thailand. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 26, 799-800.


- 262 -

Moretto, M., Weiss, L. M. & Khan, I. A. (2004). Induction of a rapid and strong antigen-specific intraepithelial lymphocyte response during oral Encephalitozoon

cuniculi infection. J.Immunol., 172, 4402-4409.

Morpeth, S. C. & Thielman, N. M. (2006). Diarrhea in patients with AIDS. Curr.Treat.Options.Gastroenterol., 9, 23-37.

Moura, H., da Silva, A. J., Moura, I. N., Schwartz, D. A., Leitch, G., Wallace, S., Pieniazek, N. J., Wirtz, R. A. & Visvesvara, G. S. (1999a). Characterization of Nosema

algerae isolates after continuous cultivation in mammalian cells at 37 degrees C. J.Eukaryot.Microbiol., 46, 14S-16S.

Moura, H., Schwartz, D. A., Bornay-Llinares, F., Sodre, F. C., Wallace, S. & Visvesvara, G. S. (1997). A new and improved "quick-hot Gram-chromotrope" technique that differentially stains microsporidian spores in clinical samples, including paraffin-embedded tissue sections. Arch.Pathol.Lab Med., 121, 888-893.

Moura, H., Sodre, F. C., Bornay-Llinares, F. J., Leitch, G. J., Navin, T., Wahlquist, S., Bryan, R., Meseguer, I. & Visvesvara, G. S. (1999b). Detection by an immunofluorescence test of Encephalitozoon intestinalis spores in routinely formalin-fixed stool samples stored at room temperature. J.Clin.Microbiol., 37, 2317-2322.

Muller, A., Bialek, R., Kamper, A., Fatkenheuer, G., Salzberger, B. & Franzen, C. (2001). Detection of microsporidia in travelers with diarrhea. J.Clin.Microbiol., 39, 1630-1632.

Muller, A., Stellermann, K., Hartmann, P., Schrappe, M., Fatkenheuer, G., Salzberger, B., Diehl, V. & Franzen, C. (1999). A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clin.Diagn.Lab Immunol., 6, 243-246.

Muller, M. (1997). What are the microsporidia? Parasitol.Today, 13, 455-456.

Muller, M. G., Kinne, J., Schuster, R. K. & Walochnik, J. (2008). Outbreak of microsporidiosis caused by Enterocytozoon bieneusi in falcons. Vet.Parasitol., 152, 67-78.

Muller-Doblies, U. U., Herzog, K., Tanner, I., Mathis, A. & Deplazes, P. (2002). First isolation and characterisation of Encephalitozoon cuniculi from a free-ranging rat (Rattus norvegicus). Vet.Parasitol., 107, 279-285.

Mungthin, M., Subrungruang, I., Naaglor, T., Aimpun, P., Areekul, W. & Leelayoova, S. (2005). Spore shedding pattern of Enterocytozoon bieneusi in asymptomatic children. J.Med.Microbiol., 54, 473-476.

Mungthin, M., Suwannasaeng, R., Naaglor, T., Areekul, W. & Leelayoova, S. Asymptomatic intestinal microsporidiosis in Thai orphans and child-care workers. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 95, 304-306. 2001. Ref Type: Generic


- 263 -

Nageli, K. W. (1857). Uber die neue Krankheit der Seidenraupe und verwandte Organismen. Bot.Z., 15, 760-761.

Nannini, E. C. & Okhuysen, P. C. (2002). HIV1 and the gut in the era of highly active antiretroviral therapy. Curr.Gastroenterol.Rep., 4, 392-398.

Newton, C. R. (1995). PCR Essential Data. West Sussex: John Willey & Sons Ltd.

Nordstoga, K. (1972). Nosematosis in blue foxes. Nord.Vet.Med., 24, 21-24.

Norton, J. H. & Prior, H. C. (1994). Microsporidiosis in a peach-faced lovebird (Agapornis roseicollis). Aust.Vet.J., 71, 23-24.

Notermans, D. W., Peek, R., de, J., Wentink-Bonnema, E. M., Boom, R. & van, G. T. (2005). Detection and identification of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon species in stool and urine specimens by PCR and differential hybridization. J.Clin.Microbiol., 43, 610-614.

Okhuysen, P. C. (2001). Traveler's diarrhea due to intestinal protozoa. Clin.Infect.Dis., 33, 110-114.

Omalu, I. C., Duhlinska, D. D., Anyanwu, G. I., Pam, V. A. & Inyama, P. U. (2007). Immune responsiveness associated with experimental Encephalitozoon intestinalis infection in immunocompetent rats. Indian J.Med.Microbiol., 25, 209-213.

Ombrouck, C., Ciceron, L., Biligui, S., Brown, S., Marechal, P., van, G. T., Datry, A., Danis, M. & sportes-Livage, I. (1997). Specific PCR assay for direct detection of intestinal microsporidia Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis in fecal specimens from human immunodeficiency virus-infected patients. J.Clin.Microbiol., 35, 652-655.

Ombrouck, C., Ciceron, L. & sportes-Livage, I. (1996). Specific and rapid detection of Microsporidia in stool specimens from AIDS patients by PCR. Parasite, 3, 85-86.

Omura, M., Furuya, K., Kudo, S., Sugiura, W. & Azuma, H. (2007). Detecting immunoglobulin M antibodies against microsporidian Encephalitozoon cuniculi polar tubes in sera from healthy and human immunodeficiency virus-infected persons in Japan. Clin.Vaccine Immunol., 14, 168-172.

Orenstein, J. M. (1991). Microsporidiosis in the acquired immunodeficiency syndrome. J.Parasitol., 77, 843-864.

Orenstein, J. M. (2003). Diagnostic pathology of microsporidiosis. Ultrastruct.Pathol., 27, 141-149.

Orenstein, J. M., Benator, D. & Kotler, D. P. (1994). Microsporidia and HIV-related diarrhea. Ann.Intern.Med., 120, 973-974.


- 264 -

Orenstein, J. M., Chiang, J., Steinberg, W., Smith, P. D., Rotterdam, H. & Kotler, D. P. (1990). Intestinal microsporidiosis as a cause of diarrhea in human immunodeficiency virus-infected patients: a report of 20 cases. Hum.Pathol., 21, 475-481.

Orenstein, J. M., Russo, P., Didier, E. S., Bowers, C., Bunin, N. & Teachey, D. T. (2005). Fatal pulmonary microsporidiosis due to Encephalitozoon cuniculi following allogeneic bone marrow transplantation for acute myelogenous leukemia. Ultrastruct.Pathol., 29, 269-276.

Orlandi, P. A., Chu, D. T., Bier, J. W. & Jackson, G. J. (2002). Parasites and the food supply. Food Technol., 56, 72-81.

Pariyakanok, L. & Jongwutiwes, S. (2005). Keratitis caused by Trachipleistophora

anthropopthera. J.Infect., 51, 325-328.

Patterson, D. J. Protozoa:evolution and systematics. Hausmann, K and Hülsmann, N. IX International Congress of Protozoology. 1-13. 1994. Stuttgart, Gustav Fischer-Verlag. Ref Type: Conference Proceeding

Patterson-Kane, J. C., Caplazi, P., Rurangirwa, F., Tramontin, R. R. & Wolfsdorf, K. (2003). Encephalitozoon cuniculi placentitis and abortion in a quarterhorse mare. J.Vet.Diagn.Invest, 15, 57-59.

Peacock, C. S., Blanshard, C., Tovey, D. G., Ellis, D. S. & Gazzard, B. G. (1991). Histological diagnosis of intestinal microsporidiosis in patients with AIDS. J.Clin.Pathol., 44, 558-563.

Peek, R., Delbac, F., Speijer, D., Polonais, V., Greve, S., Wentink-Bonnema, E., Ringrose, J. & van, G. T. (2005). Carbohydrate moieties of microsporidian polar tube proteins are targeted by immunoglobulin G in immunocompetent individuals. Infect.Immun., 73, 7906-7913.

Peuvel, I., Delbac, F., Metenier, G., Peyret, P. & Vivares, C. P. (2000). Polymorphism of the gene encoding a major polar tube protein PTP1 in two microsporidia of the genus Encephalitozoon. Parasitology, 121 Pt 6, 581-587.

Peyretaillade, E., Biderre, C., Peyret, P., Duffieux, F., Metenier, G., Gouy, M., Michot, B. & Vivares, C. P. (1998a). Microsporidian Encephalitozoon cuniculi, a unicellular eukaryote with an unusual chromosomal dispersion of ribosomal genes and a LSU rRNA reduced to the universal core. Nucleic Acids Res., 26, 3513-3520.

Peyretaillade, E., Broussolle, V., Peyret, P., Metenier, G., Gouy, M. & Vivares, C. P. (1998b). Microsporidia, amitochondrial protists, possess a 70-kDa heat shock protein gene of mitochondrial evolutionary origin. Mol.Biol.Evol., 15, 683-689.

Phalen, D. N., Logan, K. S. & Snowden, K. F. (2006). Encephalitozoon hellem infection as the cause of a unilateral chronic keratoconjunctivitis in an umbrella cockatoo (Cacatua alba). Vet.Ophthalmol., 9, 59-63.


- 265 -

Pinnolis, M., Egberg, P. R., Font, R. L. & Winter, F. C. (1981). Nosematosis of the cornea. case report, including electronic microscopic studies. Arch.Ophthalmol., 99, 1044-1047.

Polonais, V., Prensier, G., Metenier, G., Vivares, C. P. & Delbac, F. (2005). Microsporidian polar tube proteins: highly divergent but closely linked genes encode PTP1 and PTP2 in members of the evolutionarily distant Antonospora and Encephalitozoon groups. Fungal.Genet.Biol., 42, 791-803.

Poonacha, K. B., William, P. D. & Stamper, R. D. (1985). Encephalitozoonosis in a parrot. J.Am.Vet.Med.Assoc., 186, 700-702.

Pospisilova, Z., Ditrich, O., Stankova, M. & Kodym, P. (1997). Parasitic opportunistic infections in Czech HIV-infected patients--a prospective study. Cent.Eur.J.Public

Health, 5, 208-213.

Powell, S., Tang, K. & Chandler, F. (1989). Microsporidiosis in a lovebird. Vet.Diag.Invest., 1, 69-71.

Procop, G. W. (2007). Molecular diagnostics for the detection and characterization of microbial pathogens. Clin.Infect.Dis., 45, S99-S111.

Pulparampil, N., Graham, D., Phalen, D. & Snowden, K. (1998). Encephalitozoon

hellem in two eclectus parrots (Eclectus roratus): identification from archival tissues. J.Eukaryot.Microbiol., 45, 651-655.

Rabeneck, L., Gyorkey, F., Genta, R. M., Gyorkey, P., Foote, L. W. & Risser, J. M. (1993). The role of Microsporidia in the pathogenesis of HIV-related chronic diarrhea. Ann.Intern.Med., 119, 895-899.

Rabodonirina, M., Bertocchi, M., sportes-Livage, I., Cotte, L., Levrey, H., Piens, M. A., Monneret, G., Celard, M., Mornex, J. F. & Mojon, M. (1996). Enterocytozoon bieneusi as a cause of chronic diarrhea in a heart-lung transplant recipient who was seronegative for human immunodeficiency virus. Clin.Infect.Dis., 23, 114-117.

Rabodonirina, M., Cotte, L., Radenne, S., Besada, E. & Trepo, C. (2003). Microsporidiosis and transplantation: a retrospective study of 23 cases. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 583.

Rauz, S., Tuft, S., Dart, J. K., Bonshek, R., Luthert, P. & Curry, A. (2004). Ultrastructural examination of two cases of stromal microsporidial keratitis. J.Med.Microbiol., 53, 775-781.

Raynaud, L., Delbac, F., Broussolle, V., Rabodonirina, M., Girault, V., Wallon, M., Cozon, G., Vivares, C. P. & Peyron, F. (1998). Identification of Encephalitozoon

intestinalis in travelers with chronic diarrhea by specific PCR amplification. J.Clin.Microbiol., 36, 37-40.

Reetz, J. (1993). [Naturally-acquired microsporidia (Encephalitozoon cuniculi) infections in hens]. Tierarztl.Prax., 21, 429-435.


- 266 -

Reetz, J., Rinder, H., Thomschke, A., Manke, H., Schwebs, M. & Bruderek, A. (2002). First detection of the microsporidium Enterocytozoon bieneusi in non-mammalian hosts (chickens). Int.J.Parasitol., 32, 785-787.

Ribeiro, M. F. & Guimaraes, A. M. (1998). Encephalitozoon-like microsporidia in the ticks Amblyomma cajennense and Anocentor nitens (Acari: Ixodidae). J.Med.Entomol., 35, 1029-1033.

Rinder, H., Janitschke, K., Aspock, H., da Silva, A. J., Deplazes, P., Fedorko, D. P., Franzen, C., Futh, U., Hunger, F., Lehmacher, A., Meyer, C. G., Molina, J. M., Sandfort, J., Weber, R. & Loscher, T. (1998a). Blinded, externally controlled multicenter evaluation of light microscopy and PCR for detection of microsporidia in stool specimens. The Diagnostic Multicenter Study Group on Microsporidia. J.Clin.Microbiol., 36, 1814-1818.

Rinder, H., Katzwinkel-Wladarsch, S. & Loscher, T. (1997). Evidence for the existence of genetically distinct strains of Enterocytozoon bieneusi. Parasitol.Res., 83, 670-672.

Rinder, H., Katzwinkel-Wladarsch, S., Thomschke, A. & Loscher, T. (1998b). Strain differentiation in microsporidia. Tokai J.Exp.Clin.Med., 23, 433-437.

Rinder, H., Thomschke, A., Dengjel, B., Gothe, R., Loscher, T. & Zahler, M. (2000). Close genotypic relationship between Enterocytozoon bieneusi from humans and pigs and first detection in cattle. J.Parasitol., 86, 185-188.

Rosberger, D. F., Serdarevic, O. N., Erlandson, R. A., Bryan, R. T., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S. & Keenan, P. C. (1993). Successful treatment of microsporidial keratoconjunctivitis with topical fumagillin in a patient with AIDS. Cornea, 12, 261-265.

Rosselló-Mora, R. & Amann, R. (2001). The species concept for prokariotes. FEMS

Microbiol.Reviws, 25, 39-67.

Rossi, P., La, R. G., Ludovisi, A., Tamburrini, A., Gomez Morales, M. A. & Pozio, E. (1998). Identification of a human isolate of Encephalitozoon cuniculi type I from Italy. Int.J.Parasitol., 28, 1361-1366.

Ryan, N. J., Sutherland, G., Coughlan, K., Globan, M., Doultree, J., Marshall, J., Baird, R. W., Pedersen, J. & Dwyer, B. (1993). A new trichrome-blue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. J.Clin.Microbiol., 31, 3264-3269.

Sachse, K. & Frey, J. (2003). PCR detection of microbial pathogens.Methods in

molecular biology. Totowa, New Jersey: Humana Press.

Sagoo, M. S., Mehta, J. S., Hau, S., Irion, L. D., Curry, A., Bonshek, R. E. & Tuft, S. J. (2007). Microsporidium stromal keratitis: in vivo confocal findings. Cornea, 26, 870-873.


- 267 -

Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restrition site analysis for diagnosis sickle cell anemia. Science, 230, 1350-1354.

Sak, B., Salat, J., Horka, H., Sakova, K. & Ditrich, O. (2006). Antibodies enhance the protective effect of CD4+ T lymphocytes in SCID mice perorally infected with Encephalitozoon cuniculi. Parasite Immunol., 28, 95-99.

Salat, J., Sak, B., Le, T. & Kopecky, J. (2004). Susceptibility of IFN-gamma or IL-12 knock-out and SCID mice to infection with two microsporidian species, Encephalitozoon cuniculi and E. intestinalis. Folia Parasitol.(Praha), 51, 275-282.

Same-Ekobo, A., Lohoue, J. & Mbassi, A. (1997). [A clinical and biological study of parasitic and fungal diarrhea in immunosuppressed patients in an urban and suburban area of Yaounde]. Sante, 7, 349-354.

Samie, A., Obi, C. L., Tzipori, S., Weiss, L. M. & Guerrant, R. L. (2007). Microsporidiosis in South Africa: PCR detection in stool samples of HIV-positive and HIV-negative individuals and school children in Vhembe district, Limpopo Province. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 101, 547-554.

Sandfort, J., Hannemann, A., Gelderblom, H., Stark, K., Owen, R. L. & Ruf, B. (1994). Enterocytozoon bieneusi infection in an immunocompetent patient who had acute diarrhea and who was not infected with the human immunodeficiency virus. Clin.Infect.Dis., 19, 514-516.

Santillana-Hayat, M., Sarfati, C., Fournier, S., Chau, F., Porcher, R., Molina, J. M. & Derouin, F. (2002). Effects of chemical and physical agents on viability and infectivity of Encephalitozoon intestinalis determined by cell culture and flow cytometry. Antimicrob.Agents Chemother., 46, 2049-2051.

Santin, M., Cortes Vecino, J. A. & Fayer, R. (2008). Enterocytozoon bieneusi genotypes in dogs in Bogota, Colombia. Am.J.Trop.Med.Hyg., 79, 215-217.

Santin, M. & Fayer, R. (2009). Enterocytozoon bieneusi genotype nomenclature based on the internal transcribed spacer sequence: a consensus. J.Eukaryot.Microbiol., 56, 34-38.

Santin, M., Trout, J. M. & Fayer, R. (2004). Prevalence of Enterocytozoon bieneusi in post-weaned dairy calves in the eastern United States. Parasitol.Res., 93, 287-289.

Santin, M., Trout, J. M. & Fayer, R. (2005). Enterocytozoon bieneusi genotypes in dairy cattle in the eastern United States. Parasitol.Res., 97, 535-538.

Santin, M., Trout, J. M., Vecino, J. A., Dubey, J. P. & Fayer, R. (2006). Cryptosporidium, Giardia and Enterocytozoon bieneusi in cats from Bogota (Colombia) and genotyping of isolates. Vet.Parasitol., 141, 334-339.

Sarfati, C., Bourgeois, A., Menotti, J., Liegeois, F., Moyou-Somo, R., Delaporte, E., Derouin, F., Ngole, E. M. & Molina, J. M. (2006). Prevalence of intestinal parasites


- 268 -

including microsporidia in human immunodeficiency virus-infected adults in Cameroon: a cross-sectional study. Am.J.Trop.Med.Hyg., 74, 162-164.

Satheeshkumar, S., Ananthan, S. & Joyee, A. G. (2005). Detection of Enterocytozoon

bieneusi (Microsporidia) by polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primer in stool samples of hiv patients. Indian J.Med.Res., 121, 215-219.

Sax, P. E., Rich, J. D., Pieciak, W. S. & Trnka, Y. M. (1995). Intestinal microsporidiosis occurring in a liver transplant recipient. Transplantation, 60, 617-618.

Scaglia, M., Bandi, C., Novati, S., Gatti, S., Bernuzzi, A. M., Corona, S. & Sacchi, L. (1998a). Respiratory microsporidiosis due to Encaphalitozoon hellem:the first case report in an immunocompetent subject. Parasitol.Int., 47, 203S.

Scaglia, M., Gatti, S., Sacchi, L., Corona, S., Chichino, G., Bernuzzi, A. M., Barbarini, G., Croppo, G. P., da Silva, A. J., Pieniazek, N. J. & Visvesvara, G. S. (1998b). Asymptomatic respiratory tract microsporidiosis due to Encephalitozoon hellem in three patients with AIDS. Clin.Infect.Dis., 26, 174-176.

Scaglia, M., Sacchi, L., Croppo, G. P., da, S. A., Gatti, S., Corona, S., Orani, A., Bernuzzi, A. M., Pieniazek, N. J., Slemenda, S. B., Wallace, S. & Visvesvara, G. S. (1997). Pulmonary microsporidiosis due to Encephalitozoon hellem in a patient with AIDS. J.Infect., 34, 119-126.

Schmidt, E. C. & Shadduck, J. A. (1983). Murine encephalitozoonosis model for studying the host-parasite relationship of a chronic infection. Infect.Immun., 40, 936-942.

Schmidt, W., Schneider, T., Heise, W., Schulzke, J. D., Weinke, T., Ignatius, R., Owen, R. L., Zeitz, M., Riecken, E. O. & Ullrich, R. (1997). Mucosal abnormalities in microsporidiosis. AIDS, 11, 1589-1594.

Schuitema, A. R., Hartskeerl, R. A., van, G. T., Laxminarayan, R. & Terpstra, W. J. (1993). Application of the polimerase chain reaction for the diagnosis of microsporidiosis. AIDS, 7, S57-S61.

Schwartz, D. A., Bryan, R. T., Hewan-Lowe, K. O., Visvesvara, G. S., Weber, R., Cali, A. & Angritt, P. (1992). Disseminated microsporidiosis (Encephalitozoon hellem) and acquired immunodeficiency syndrome. Autopsy evidence for respiratory acquisition. Arch.Pathol.Lab Med., 116, 660-668.

Schwartz, D. A., Sobottka, I., Leitch, G. J., Cali, A. & Visvesvara, G. S. (1996). Pathology of microsporidiosis: emerging parasitic infections in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Arch.Pathol.Lab Med., 120, 173-188.

Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Diesenhouse, M. C., Weber, R., Font, R. L., Wilson, L. A., Corrent, G., Serdarevic, O. N., Rosberger, D. F., Keenen, P. C. & . (1993a). Pathologic features and immunofluorescent antibody demonstration of ocular microsporidiosis (Encephalitozoon hellem) in seven patients with acquired immunodeficiency syndrome. Am.J.Ophthalmol., 115, 285-292.


- 269 -

Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Leitch, G. J., Tashjian, L., Pollack, M., Holden, J. & Bryan, R. T. (1993b). Pathology of symptomatic microsporidial (Encephalitozoon

hellem) bronchiolitis in the acquired immunodeficiency syndrome: a new respiratory pathogen diagnosed from lung biopsy, bronchoalveolar lavage, sputum, and tissue culture. Hum.Pathol., 24, 937-943.

Sestak, K., Aye, P. P., Buckholt, M., Mansfield, K. G., Lackner, A. A. & Tzipori, S. (2003). Quantitative evaluation of Enterocytozoon bieneusi infection in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys. J.Med.Primatol., 32, 74-81.

Shadduck, J. A. (1969). Nosema cuniculi: in vitro isolation. Science, 166, 516-517.

Shadduck, J. A., Bendele, R. & Robinson, G. T. (1978). Isolation of the causative organism of canine encephalitozoonosis. Vet.Pathol., 15, 449-460.

Shadduck, J. A., Meccoli, R. A., Davis, R. & Font, R. L. (1990). Isolation of a microsporidian from a human patient. J.Infect.Dis., 162, 773-776.

Shadduck, J. A. & Orenstein, J. M. (1993). Comparative pathology of microsporidiosis. Arch.Pathol.Lab Med., 117, 1215-1219.

Shadduck, J. A. & Polley, M. B. (1978). Some factors influencing the in vitro infectivity and replication of Encephalitozoon cuniculi. J.Protozool., 25, 491-496.

Sharpstone, D., Rowbottom, A., Francis, N., Tovey, G., Ellis, D., Barrett, M. & Gazzard, B. (1997). Thalidomide: a novel therapy for microsporidiosis. Gastroenterology, 112, 1823-1829.

Sharpstone, D., Rowbottom, A., Nelson, M. & Gazzard, B. (1995). The treatment of microsporidial diarrhoea with thalidomide. AIDS, 9, 658-659.

Shaw, R. W. & Kent, M. L. (1999). Fish microsporidia. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 418-446). Washington,DC: American Society Microbiology.

Sheikh, R. A., Prindiville, T. P., Yenamandra, S., Munn, R. J. & Ruebner, B. H. (2000). Microsporidial AIDS cholangiopathy due to Encephalitozoon intestinalis: case report and review. Am.J.Gastroenterol., 95, 2364-2371.

Silveira, H. & Canning, E. U. (1995). Vittaforma corneae n. comb. for the human microsporidium Nosema corneum Shadduck, Meccoli, Davis & Font, 1990, based on its ultrastructure in the liver of experimentally infected athymic mice. J.Eukaryot.Microbiol., 42, 158-165.

Silveira, H., Canning, E. U. & Shadduck, J. A. (1993). Experimental infection of athymic mice with the human microsporidian Nosema corneum. Parasitology, 107 ( Pt 5), 489-496.


- 270 -

Silverstein, B. E., Cunningham, E. T., Jr., Margolis, T. P., Cevallos, V. & Wong, I. G. (1997). Microsporidial keratoconjunctivitis in a patient without human immunodeficiency virus infection. Am.J.Ophthalmol., 124, 395-396.

Singh, M., Kane, G. J., Mackinlay, L., Quaki, I., Yap, E. H., Ho, B. C., Ho, L. C. & Lim, K. C. (1982). Detection of antibodies to Nosema cuniculi (Protozoa : Microscoporidia) in human and animal sera by the indirect fluorescent antibody technique. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 13, 110-113.

Slamovits, C. H., Fast, N. M., Law, J. S. & Keeling, P. J. (2004). Genome compaction and stability in microsporidian intracellular parasites. Curr.Biol., 14, 891-896.

Slifko, T. R., Smith, H. V. & Rose, J. B. (2000). Emerging parasite zoonoses associated with water and food. Int.J.Parasitol., 30, 1379-1393.

Slodkowicz-Kowalska, A., Graczyk, T. K., Tamang, L., Jedrzejewski, S., Nowosad, A., Zduniak, P., Solarczyk, P., Girouard, A. S. & Majewska, A. C. (2006). Microsporidian species known to infect humans are present in aquatic birds: implications for transmission via water? Appl.Environ.Microbiol., 72, 4540-4544.

Snowden, K. & Logan, K. (1999). Molecular identification of Encephalitozoon hellem in an ostrich. Avian Dis., 43, 779-782.

Snowden, K., Logan, K. & Didier, E. S. (1999). Encephalitozoon cuniculi strain III is a cause of encephalitozoonosis in both humans and dogs. J.Infect.Dis., 180, 2086-2088.

Snowden, K. & Phalen, D. N. (2004). Encephalitozoon infection in birds . Semin.Avian

Exotic Pet Med., 13, 94-99.

Snowden, K. F., Daft, B. & Nordhausen, R. W. (2001). Morphological and molecular characterization of Encephalitozoon hellem in hummingbirds. Avian Pathol., 30, 251-255.

Snowden, K. F., Didier, E. S., Orenstein, J. M. & Shadduck, J. A. (1998). Animal models of human microsporidial infections. Lab Anim Sci., 48, 589-592.

Snowden, K. F., Logan, K. & Phalen, D. N. (2000). Isolation and characterization of an avian isolate of Encephalitozoon hellem. Parasitology, 121 ( Pt 1), 9-14.

Snowden, K. F. & Shadduck, J. A. (1999). Microsporidia in higher vertebrates. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 393-417). Washington, DC: American Society of Microbiology.

Sobottka, I., Albrecht, H., Schottelius, J., Schmetz, C., Bentfeld, M., Laufs, R. & Schwartz, D. A. (1995). Self-limited traveller's diarrhea due to a dual infection with Enterocytozoon bieneusi and Cryptosporidium parvum in an immunocompetent HIV-negative patient. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 14, 919-920.

Sobottka, I., Albrecht, H., Visvesvara, G. S., Pieniazek, N. J., Deplazes, P., Schwartz, D. A., Laufs, R. & Elsner, H. A. (1999). Inter- and intra-species karyotype variations


- 271 -

among microsporidia of the genus Encephalitozoon as determined by pulsed-field gel electrophoresis. Scand.J.Infect.Dis., 31, 555-558.

Sobottka, I., Schwartz, D. A., Schottelius, J., Visvesvara, G. S., Pieniazek, N. J., Schmetz, C., Kock, N. P., Laufs, R. & Albrecht, H. (1998). Prevalence and clinical significance of intestinal microsporidiosis in human immunodeficiency virus-infected patients with and without diarrhea in Germany: a prospective coprodiagnostic study. Clin.Infect.Dis., 26, 475-480.

Sodqi, M., Brazille, P., Gonzalez-Canali, G., Cornet, M., Piketty, C. & Weiss, L. (2004). Unusual pulmonary Enterocytozoon bieneusi microsporidiosis in an AIDS patient: case report and review. Scand.J.Infect.Dis., 36, 230-231.

Sparfel, J. M., Auget, J. L. & Miegeville, M. (1998). [Optimization of parasitological diagnosis of human intestinal microsporidiosis]. Bull.Soc.Pathol.Exot., 91, 138-141.

Sparfel, J. M., Sarfati, C., Liguory, O., Caroff, B., Dumoutier, N., Gueglio, B., Billaud, E., Raffi, F., Molina, J. M., Miegeville, M. & Derouin, F. (1997). Detection of microsporidia and identification of Enterocytozoon bieneusi in surface water by filtration followed by specific PCR. J.Eukaryot.Microbiol., 44, 78S.

Sprague, V. (1977). Annotated list of species of microsporidia. In L. A. Bulla & T. C. Cheng (Eds) Comparative Pathology 2. Systematics of th microsporidia (pp. 1-333). New York: Plenum Press.

Sridhar, M. S. & Sharma, S. (2003). Microsporidial keratoconjunctivitis in a HIV-seronegative patient treated with debridement and oral itraconazole. Am.J.Ophthalmol., 136, 745-746.

Stark, D., Barratt, J. L., van, H. S., Marriott, D., Harkness, J. & Ellis, J. T. (2009). Clinical significance of enteric protozoa in the immunosuppressed human population. Clin.Microbiol.Rev., 22, 634-650.

Stewart, C. G., van Dellen, A. F. & Botha, W. S. (1979). Canine encephalitozoonosis in kennels and the isolation of Encephalitozoon. J.S.Afr.Vet.Assoc., 50, 165-168.

Sulaiman, I. M., Bern, C., Gilman, R., Cama, V., Kawai, V., Vargas, D., Ticona, E., Vivar, A. & Xiao, L. (2003a). A molecular biologic study of Enterocytozoon bieneusi in HIV-infected patients in Lima, Peru. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 591-596.

Sulaiman, I. M., Fayer, R., Lal, A. A., Trout, J. M., Schaefer, F. W., III & Xiao, L. (2003b). Molecular characterization of microsporidia indicates that wild mammals Harbor host-adapted Enterocytozoon spp. as well as human-pathogenic Enterocytozoon

bieneusi. Appl.Environ.Microbiol., 69, 4495-4501.

Sulaiman, I. M., Fayer, R., Yang, C., Santin, M., Matos, O. & Xiao, L. (2004). Molecular characterization of Enterocytozoon bieneusi in cattle indicates that only some isolates have zoonotic potential. Parasitol.Res., 92, 328-334.


- 272 -

Sulaiman, I. M., Matos, O., Lobo, M. L. & Xiao, L. (2003c). Identification of a new microsporidian parasite related to Vittaforma corneae in HIV-positive and HIV-negative patients from Portugal. J.Eukaryot.Microbiol., 50 Suppl, 586-590.

Suter, C., Mathis, A., Hoop, R. & Deplazes, P. (1998). Encephalitozoon hellem infection in a yellow-streaked lory (Chalcopsitta scintillata) imported from Indonesia. Vet.Rec., 143, 694-695.

Svedhem, V., Lebbad, M., Hedkvist, B., del, A. C., Hedman, P., Larsson, R., Navajas, R. & ust-Kettis, A. (2002). Disseminated infection with Encephalitozoon intestinalis in AIDS patients: report of 2 cases. Scand.J.Infect.Dis., 34, 703-705.

Svedhem, V., Lebbad, M., Struve, J., Veress, B., Andstrom, E., ust-Kettis, A. & Linder, E. (1998). Microsporidia in duodenal biopsies from 72 HIV-infected patients with abdominal complaints. APMIS, 106, 535-538.

Svenungsson, B., Capraru, T., Evengard, B., Larsson, R. & Lebbad, M. (1998). Intestinal microsporidiosis in a HIV-seronegative patient. Scand.J.Infect.Dis., 30, 314-316.

Talal, A. H., Kotler, D. P., Orenstein, J. M. & Weiss, L. M. (1998). Detection of Enterocytozoon bieneusi in fecal specimens by polymerase chain reaction analysis with primers to the small-subunit rRNA. Clin.Infect.Dis., 26, 673-675.

Taupin, V., Metenier, G., Delbac, F., Vivares, C. P. & Prensier, G. (2006). Expression of two cell wall proteins during the intracellular development of Encephalitozoon

cuniculi: an immunocytochemical and in situ hybridization study with ultrathin frozen sections. Parasitology, 132, 815-825.

Teachey, D. T., Russo, P., Orenstein, J. M., Didier, E. S., Bowers, C. & Bunin, N. (2004). Pulmonary infection with microsporidia after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant., 33, 299-302.

ten Hove, R. J., Van, L. L., Beadsworth, M. B., Perez, M. A., Spee, K., Claas, E. C. & Verweij, J. J. (2009). Characterization of genotypes of Enterocytozoon bieneusi in immunosuppressed and immunocompetent patient groups. J.Eukaryot.Microbiol., 56, 388-393.

Thellier, M. & Breton, J. (2008). Enterocytozoon bieneusi in human and animals, focus on laboratory identification and molecular epidemiology. Parasite, 15, 349-358.

Theng, J., Chan, C., Ling, M. L. & Tan, D. (2001). Microsporidial keratoconjunctivitis in a healthy contact lens wearer without human immunodeficiency virus infection. Ophthalmology, 108, 976-978.

Thomarat, F., Vivares, C. P. & Gouy, M. (2004). Phylogenetic analysis of the complete genome sequence of Encephalitozoon cuniculi supports the fungal origin of microsporidia and reveals a high frequency of fast-evolving genes. J.Mol.Evol., 59, 780-791.


- 273 -

Thomas, C., Finn, M., Twigg, L., Deplazes, P. & Thompson, R. C. (1997). Microsporidia (Encephalitozoon cuniculi) in wild rabbits in Australia. Aust.Vet.J., 75, 808-810.

Thompson, R. C. A., Constantine, C. C. & Morgan, U. M. (1998). Overview and significance of molecular methods:what role for molecular epidemiology. Parasitology, 117, S161-S175.

Thurston-Enriquez, J. A., Watt, P., Dowd, S. E., Enriquez, R., Pepper, I. L. & Gerba, C. P. (2002). Detection of protozoan parasites and microsporidia in irrigation waters used for crop production. J.Food Prot., 65, 378-382.

Tocidlowski, M. E., Cornish, T. E., Loomis, M. R. & Stoskopf, M. K. (1997). Mortality in captive wild-caught horned puffin chicks (Fratercula corniculata). J.Zoo.Wildl.Med., 28, 298-306.

Tosoni, A., Nebuloni, M., Ferri, A., Bonetto, S., Antinori, S., Scaglia, M., Xiao, L., Moura, H., Visvesvara, G. S., Vago, L. & Costanzi, G. (2002). Disseminated microsporidiosis caused by Encephalitozoon cuniculi III (dog type) in an Italian AIDS patient: a retrospective study. Mod.Pathol., 15, 577-583.

Tsaousis, A. D., Kunji, E. R., Goldberg, A. V., Lucocq, J. M., Hirt, R. P. & Embley, T. M. (2008). A novel route for ATP acquisition by the remnant mitochondria of Encephalitozoon cuniculi. Nature, 453, 553-556.

Tuli, L., Singh, D. K., Gulati, A. K., Sundar, S. & Mohapatra, T. M. (2010). A multiattribute utility evaluation of different methods for the detection of enteric protozoa causing diarrhea in AIDS patients. BMC.Microbiol., 10, 11.

Tumwine, J. K., Kekitiinwa, A., Bakeera-Kitaka, S., Ndeezi, G., Downing, R., Feng, X., Akiyoshi, D. E. & Tzipori, S. (2005). Cryptosporidiosis and microsporidiosis in ugandan children with persistent diarrhea with and without concurrent infection with the human immunodeficiency virus. Am.J.Trop.Med.Hyg., 73, 921-925.

Tumwine, J. K., Kekitiinwa, A., Nabukeera, N., Akiyoshi, D. E., Buckholt, M. A. & Tzipori, S. (2002). Enterocytozoon bieneusi among children with diarrhea attending Mulago Hospital in Uganda. Am.J.Trop.Med.Hyg., 67, 299-303.

Tzipori, S., Carville, A., Widmer, G., Kotler, D., Mansfield, K. & Lackner, A. (1997). Transmission and establishment of a persistent infection of Enterocytozoon bieneusi, derived from a human with AIDS, in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys. J.Infect.Dis., 175, 1016-1020.

U.S.Environmental Protection Agengy (EPA) (1998). Announcement of the drinking water contaminant candidate list:notice. Fed.Regist., 63, 10272-10287.

Undeen, A. H. (1975). The growth of Nosema algerae in pig kidney cell cultures. J.Protozool., 22, 107-110.


- 274 -

van Hal, S. J., Muthiah, K., Matthews, G., Harkness, J., Stark, D., Cooper, D. & Marriott, D. (2007). Declining incidence of intestinal microsporidiosis and reduction in AIDS-related mortality following introduction of HAART in Sydney,Australia. Transpl.Int., 101, 1096-1100.

Van Heerden, J., Bainbridge, N., Burroughs, R. E. & Kriek, N. P. (1989). Distemper-like disease and encephalitozoonosis in wild dogs (Lycaon pictus). J.Wildl.Dis., 25, 70-75.

van, G. T., Biderre, C., Delbac, F., Wentink-Bonnema, E., Peek, R. & Vivares, C. P. (2004). Serodiagnostic studies in an immunocompetent individual infected with Encephalitozoon cuniculi. J.Infect.Dis., 189, 2243-2249.

van, G. T., Canning, E. U. & Dankert, J. (1994a). An improved practical and sensitive technique for the detection of microsporidian spores in stool samples. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 88, 189-190.

van, G. T., Canning, E. U., Gilis, H., van den Bergh Weerman MA, Eeftinck Schattenkerk, J. K. & Dankert, J. (1994b). Septata intestinalis frequently isolated from stool of AIDS patients with a new cultivation method. Parasitology, 109 ( Pt 3), 281-289.

van, G. T. & Dankert, J. (1995). Human microsporidiosis: Clinical, diagnostic and therapeutic aspects of an increasing infection. Clin.Microbiol.Infect., 1, 75-85.

van, G. T. & Dankert, J. (1996). [3 emerging protozoal infections in The Netherlands: Cyclospora, Dientamoeba, and Microspora infections]. Ned.Tijdschr.Geneeskd., 140, 155-160.

van, G. T., Luderhoff, E., Nathoo, K. J., Kiire, C. F., Dankert, J. & Mason, P. R. (1995). High prevalence of Enterocytozoon bieneusi infections among HIV-positive individuals with persistent diarrhoea in Harare, Zimbabwe. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg., 89, 478-480.

van, G. T., Snijders, F., Reiss, P., Eeftinck Schattenkerk, J. K., van den Bergh Weerman MA, Bartelsman, J. F., Bruins, J. J., Canning, E. U. & Dankert, J. (1993). Diagnosis of intestinal and disseminated microsporidial infections in patients with HIV by a new rapid fluorescence technique. J.Clin.Pathol., 46, 694-699.

van, G. T., Vetter, J. C., Weinmayr, B., Van, D. A., Derouin, F. & Dankert, J. (1997). High seroprevalence of Encephalitozoon species in immunocompetent subjects. J.Infect.Dis., 175, 1020-1024.

van, R., I, Volkmann, D. H., Soley, J. T. & Stewart, C. G. (1991). Encephalitozoon

infection in a still-born foal. J.S.Afr.Vet.Assoc., 62, 130-132.

Vavra, J., Bedrnik, P. & Cinalt, J. (1972). Isolation and in vitro cultivation of the mammalian microsporidian Encephalitozoon cuniculi. Folia Parasitol.(Praha), 19, 349-354.


- 275 -

Vavra, J. & Larsson, J. I. (1999). Struture of the Microsporidia. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) Tha Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 7-84). Washington,DC: American Society of Microsbiology Press.

Vavra, J. & Undeen, A. H. (1970). Nosema algerae n. sp. (Cnidospora, Microsporidia) a pathogen in a laboratory colony of Anopheles stephensi Liston (Diptera, Culicidae). J.Protozool., 17, 240-249.

Vavra, J., Yachnis, A. T., Shadduck, J. A. & Orenstein, J. M. (1998). Microsporidia of the genus Trachipleistophora--causative agents of human microsporidiosis: description of Trachipleistophora anthropophthera n. sp. (Protozoa: Microsporidia). J.Eukaryot.Microbiol., 45, 273-283.

Velasquez, J. N., Carnevale, S., Guarnera, E. A., Labbe, J. H., Chertcoff, A., Cabrera, M. G. & Rodriguez, M. I. (1996). Detection of the microsporidian parasite Enterocytozoon bieneusi in specimens from patients with AIDS by PCR. J.Clin.Microbiol., 34, 3230-3232.

Velasquez, J. N., Carnevale, S., Labbe, J. H., Chertcoff, A., Cabrera, M. G. & Oelemann, W. (1999). In situ hybridization: a molecular approach for the diagnosis of the microsporidian parasite Enterocytozoon bieneusi. Hum.Pathol., 30, 54-58.

Verweij, J. J., Ten, H. R., Brienen, E. A. & Van, L. L. (2007). Multiplex detection of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon spp. in fecal samples using real-time PCR. Diagn.Microbiol.Infect.Dis., 57, 163-167.

Visvesvara, G. S. (2002). In vitro cultivation of microsporidia of clinical importance. Clin.Microbiol.Rev., 15, 401-413.

Visvesvara, G. S., Belloso, M., Moura, H., da Silva, A. J., Moura, I. N., Leitch, G. J., Schwartz, D. A., Chevez-Barrios, P., Wallace, S., Pieniazek, N. J. & Goosey, J. D. (1999a). Isolation of Nosema algerae from the cornea of an immunocompetent patient. J.Eukaryot.Microbiol., 46, 10S.

Visvesvara, G. S., da Silva, A. J., Croppo, G. P., Pieniazek, N. J., Leitch, G. J., Ferguson, D., de, M. H., Wallace, S., Slemenda, S. B., Tyrrell, I. & . (1995). In vitro culture and serologic and molecular identification of Septata intestinalis isolated from urine of a patient with AIDS. J.Clin.Microbiol., 33, 930-936.

Visvesvara, G. S., Leitch, G. J., da Silva, A. J., Croppo, G. P., Moura, H., Wallace, S., Slemenda, S. B., Schwartz, D. A., Moss, D., Bryan, R. T. & . (1994). Polyclonal and monoclonal antibody and PCR-amplified small-subunit rRNA identification of a microsporidian, Encephalitozoon hellem, isolated from an AIDS patient with disseminated infection. J.Clin.Microbiol., 32, 2760-2768.

Visvesvara, G. S., Moura, H., Leitch, G. J. & Schwartz, D. A. (1999b). Culture and propagation of microsporidia. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia

and Microsporidiosis (pp. 363-392). Washington,DC: American Society of Microbiology.


- 276 -

Visvesvara, G. S., Moura, H., Leitch, G. J., Schwartz, D. A. & Xiao, L. X. (2005). Public health importance of Brachiola algerae (Microsporidia)--an emerging pathogen of humans. Folia Parasitol.(Praha), 52, 83-94.

Vivares, C. P. & Metenier, G. (2000). Towards the minimal eukaryotic parasitic genome. Curr.Opin.Microbiol., 3, 463-467.

Voglino, M. C., Donelli, G., Rossi, P., Ludovisi, A., Rinaldi, V., Goffredo, F., Paloscia, R. & Pozio, E. (1996). Intestinal microsporidiosis in Italian individuals with AIDS. Ital.J.Gastroenterol., 28, 381-386.

Vossbrinck, C. R., Baker, M. D., Didier, E. S., brunner-Vossbrinck, B. A. & Shadduck, J. A. (1993). Ribosomal DNA sequences of Encephalitozoon hellem and Encephalitozoon cuniculi: species identification and phylogenetic construction. J.Eukaryot.Microbiol., 40, 354-362.

Vossbrinck, C. R. & brunner-Vossbrinck, B. A. (2005). Molecular phylogeny of the Microsporidia: ecological, ultrastructural and taxonomic considerations. Folia


Vossbrinck, C. R., Maddox, J. V., Friedman, S., brunner-Vossbrinck, B. A. & Woese, C. R. (1987). Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely ancient eukaryotes. Nature, 326, 411-414.

Waller, T. (1979). Sensitivity of Encephalitozoon cuniculi to various temperatures, disinfectants and drugs. Lab Anim, 13, 227-230.

Wanachiwanawin, D., Chokephaibulkit, K., Lertlaituan, P., Ongrotchanakun, J., Chinabut, P. & Thakerngpol, K. (2002). Intestinal microsporidiosis in HIV-infected children with diarrhea. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 33, 241-245.

Wanachiwanawin, D., Manatsathit, S., Lertlaituan, P., Thakerngpol, K. & Suwanagool, P. (1998). Intestinal microsporidiosis in HIV infected patients with chronic diarrhea in Thailand. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 29, 767-771.

Wang, Z., Orlandi, P. A. & Stenger, D. A. (2005). Simultaneous detection of four human pathogenic microsporidian species from clinical samples by oligonucleotide microarray. J.Clin.Microbiol., 43, 4121-4128.

Wanke, C. A., DeGirolami, P. C. & Federman, M. (1996a). Enterocytozoon bieneusi and diarrheal disease in patients who were not infected with human immunodeficiency virus:case report and review. Clin.Infect.Dis., 23, 816-818.

Wanke, C. A., Pleskow, D., DeGirolami, P. C., Lambl, B. B., Merkel, K. & Akrabawi, S. (1996b). A medium chain triglyceride-based diet in patients with HIV and chronic diarrhea reduces diarrhea and malabsorption: a prospective, controlled trial. Nutrition, 12, 766-771.

Wasson, K. & Peper, R. L. (2000). Mammalian microsporidiosis. Vet.Pathol., 37, 113-128.


- 277 -

Waywa, D., Kongkriengdaj, S., Chaidatch, S., Tiengrim, S., Kowadisaiburana, B., Chaikachonpat, S., Suwanagool, S., Chaiprasert, A., Curry, A., Bailey, W., Suputtamongkol, Y. & Beeching, N. J. (2001). Protozoan enteric infection in AIDS related diarrhea in Thailand. Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 32 Suppl 2, 151-155.

Weber, R. & Bryan, R. T. (1994). Microsporidial infections in immunodeficient and immunocompetent patients. Clin.Infect.Dis., 19, 517-521.

Weber, R., Bryan, R. T., Owen, R. L., Wilcox, C. M., Gorelkin, L. & Visvesvara, G. S. (1992a). Improved light-microscopical detection of microsporidia spores in stool and duodenal aspirates. The Enteric Opportunistic Infections Working Group. N.Engl.J.Med., 326, 161-166.

Weber, R., Deplazes, P., Flepp, M., Mathis, A., Baumann, R., Sauer, B., Kuster, H. & Luthy, R. (1997). Cerebral microsporidiosis due to Encephalitozoon cuniculi in a patient with human immunodeficiency virus infection. N.Engl.J.Med., 336, 474-478.

Weber, R., Deplazes, P. & Schwartz, D. (2000). Diagnosis and clinical aspects of human microsporidiosis. Contrib.Microbiol., 6, 166-192.

Weber, R., Kuster, H., Keller, R., Bachi, T., Spycher, M. A., Briner, J., Russi, E. & Luthy, R. (1992b). Pulmonary and intestinal microsporidiosis in a patient with the acquired immunodeficiency syndrome. Am.Rev.Respir.Dis., 146, 1603-1605.

Weber, R., Kuster, H., Visvesvara, G. S., Bryan, R. T., Schwartz, D. A. & Luthy, R. (1993). Disseminated microsporidiosis due to Encephalitozoon hellem: pulmonary colonization, microhematuria, and mild conjunctivitis in a patient with AIDS. Clin.Infect.Dis., 17, 415-419.

Weber, R., Ledergerber, B., Zbinden, M., Altwegg, M., Pfyffer, G. E., pycher, M. A., riner, J., aiser, L., pravil, M., Meyenberger, C. & Flepp, M. (1999a). Enteric infections and diarrhea in human immunodeficiency virus-infected persons: prospective community-based cohort study. Arch.Intern.Med., 159, 1473-1480.

Weber, R., Muller, A., Spycher, M. A., Opravil, M., Ammann, R. & Briner, J. (1992c). Intestinal Enterocytozoon bieneusi microsporidiosis in an HIV-infected patient: diagnosis by ileo-colonoscopic biopsies and long-term follow up. Clin.Investig., 70, 1019-1023.

Weber, R., Sauer, B., Spycher, M. A., Deplazes, P., Keller, R., Ammann, R., Briner, J. & Luthy, R. (1994). Detection of Septata intestinalis in stool specimens and coprodiagnostic monitoring of successful treatment with albendazole. Clin.Infect.Dis., 19, 342-345.

Weber, R., Schwartz, D. A. & Deplazes, P. (1999b). Laboratory diagnosis of microsporidiosis. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and

Microsporidiosis (pp. 315-362). Washington,DC: American Society for Microbiology.


- 278 -

Weidner, E., Canning, E. U., Rutledge, C. R. & Meek, C. L. (1999). Mosquito (Diptera: Culicidae) host compatibility and vector competency for the human myositic parasite Trachipleistophora hominis (Phylum Microspora). J.Med.Entomol., 36, 522-525.

Weiser, J. (1976). Contribution to the classification of microsporidia. Vest.Cesk.Spol.Zool., 41, 308-320.

Weiser, J. (1993). Early experiences with microsporidia of man and mammals. Folia


Weiss, L. M. (2000). Molecular phylogeny and diagnostic approaches to microsporidia. Contrib.Microbiol., 6, 209-235.

Weiss, L. M. (2001). Microsporidia: emerging pathogenic protists. Acta Trop., 78, 89-102.

Weiss, L. M., Edlind, T. D., Vossbrinck, C. R. & Hashimoto, T. (1999). Microsporidian molecular phylogeny: the fungal connection. J.Eukaryot.Microbiol., 46, 17S-18S.

Weiss, L. M. & Vossbrinck, C. R. (1999). Molecular biology, molecular phylogeny, and molecular dignostic approaches to the microsporidia. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 129-171). Washington,DC: American Society for Microbiology.

Weiss, L. M., Zhu, X., Cali, A., Tanowitz, H. B. & Wittner, M. (1994). Utility of microsporidian rRNA in diagnosis and phylogeny: a review. Folia Parasitol.(Praha), 41, 81-90.

Weitzel, T., Wolff, M., Dabanch, J., Levy, I., Schmetz, C., Visvesvara, G. S. & Sobottka, I. (2001). Dual microsporidial infection with Encephalitozoon cuniculi and Enterocytozoon bieneusi in an HIV-positive patient. Infection, 29, 237-239.

Wichro, E., Hoelzl, D., Krause, R., Bertha, G., Reinthaler, F. & Wenisch, C. (2005). Microsporidiosis in travel-associated chronic diarrhea in immune-competent patients. Am.J.Trop.Med.Hyg., 73, 285-287.

Williams, B. A., Cali, A., Takvorian, P. M. & Keeling, P. J. (2008a). Distinct localization patterns of two putative mitochondrial proteins in the microsporidian Encephalitozoon cuniculi. J.Eukaryot.Microbiol., 55, 131-133.

Williams, B. A., Haferkamp, I. & Keeling, P. J. (2008b). An ADP/ATP-specific mitochondrial carrier protein in the microsporidian Antonospora locustae. J.Mol.Biol., 375, 1249-1257.

Williams, B. A., Hirt, R. P., Lucocq, J. M. & Embley, T. M. (2002). A mitochondrial remnant in the microsporidian Trachipleistophora hominis. Nature, 418, 865-869.

Wilson, J. M. (1979). Encephalitozoon cuniculi in wild European rabbits and a fox. Res.Vet.Sci., 26, 114.


- 279 -

Wittner, M. (1999). Historic perspective on the microsporidia: expanding horizons. In M. Wittner & L. M. Weiss (Eds) The Microsporidia and Microsporidiosis (pp. 1-6). Washington,DC: American Society for Microbiology.

Wiwanitkit, V. (2006). Intestinal parasite infestation in HIV infected patients. Curr.HIV.Res., 4, 87-96.

Wolk, D. M., Schneider, S. K., Wengenack, N. L., Sloan, L. M. & Rosenblatt, J. E. (2002). Real-time PCR method for detection of Encephalitozoon intestinalis from stool specimens. J.Clin.Microbiol., 40, 3922-3928.

Wright, J. H. & Craighead, E. M. (1922). Infectious motor paralysis in young rabbits. J.Exp.Med., 36, 135-140.

Wuhib, T., Silva, T. M., Newman, R. D., Garcia, L. S., Pereira, M. L., Chaves, C. S., Wahlquist, S. P., Bryan, R. T., Guerrant, R. L., Sousa, A. Q. & . (1994). Cryptosporidial and microsporidial infections in human immunodeficiency virus-infected patients in northeastern Brazil. J.Infect.Dis., 170, 494-497.

Xiao, L., Li, L., Moura, H., Sulaiman, I., Lal, A. A., Gatti, S., Scaglia, M., Didier, E. S. & Visvesvara, G. S. (2001a). Genotyping Encephalitozoon hellem isolates by analysis of the polar tube protein gene. J.Clin.Microbiol., 39, 2191-2196.

Xiao, L., Li, L., Moura, H., Sulaiman, I. M., Lal, A. A., Gatti, S., Scaglia, M., Didier, E. S. & Visvesvara, G. S. (2001b). Genotyping Encephalitozoon parasites using multilocus analyses of genes with repetitive sequences. J.Eukaryot.Microbiol., Suppl, 63S-65S.

Xiao, L., Li, L., Visvesvara, G. S., Moura, H., Didier, E. S. & Lal, A. A. (2001c). Genotyping Encephalitozoon cuniculi by multilocus analyses of genes with repetitive sequences. J.Clin.Microbiol., 39, 2248-2253.

Xiao, L., Sulaiman, I., Cama, V. & Gilman, R. H. (2004). Molecular epidemiology of human microsporidiosis caused by Enterocytozoon bieneusi. Southeast Asian

J.Trop.Med.Public Health, 35, 40-44.

Xu, Y. & Weiss, L. M. (2005). The microsporidian polar tube: a highly specialised invasion organelle. Int.J.Parasitol., 35, 941-953.

Yachnis, A. T., Berg, J., Martinez-Salazar, A., Bender, B. S., Diaz, L., Rojiani, A. M., Eskin, T. A. & Orenstein, J. M. (1996). Disseminated microsporidiosis especially infecting the brain, heart, and kidneys. Report of a newly recognized pansporoblastic species in two symptomatic AIDS patients. Am.J.Clin.Pathol., 106, 535-543.

Yee, R. W., Tio, F. O., Martinez, J. A., Held, K. S., Shadduck, J. A. & Didier, E. S. (1991). Resolution of microsporidial epithelial keratopathy in a patient with AIDS. Ophthalmology, 98, 196-201.

Zeman, D. H. & Baskin, G. B. (1985). Encephalitozoonosis in squirrel monkeys (Saimiri sciureus). Vet.Pathol., 22, 24-31.


- 280 -

Zhang, H., Huang, H., Cali, A., Takvorian, P. M., Feng, X., Zhou, G. & Weiss, L. M. (2005). Investigations into microsporidian methionine aminopeptidase type 2: a therapeutic target for microsporidiosis. Folia Parasitol.(Praha), 52, 182-192.

Zhu, X., Wittner, M., Tanowitz, H. B., Kotler, D., Cali, A. & Weiss, L. M. (1993). Small subunit rRNA sequence of Enterocytozoon bieneusi and its potential diagnostic role with use of the polymerase chain reaction. J.Infect.Dis., 168, 1570-1575.

Zierdt, C. H., Gill, V. J. & Zierdt, W. S. (1993). Detection of microsporidian spores in clinical samples by indirect fluorescent-antibody assay using whole-cell antisera to Encephalitozoon cuniculi and Encephalitozoon hellem. J.Clin.Microbiol., 31, 3071-3074.

MARIA - Universidade NOVA de Lisboa · “Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado...

Documents

Transcript of MARIA - Universidade NOVA de Lisboa · “Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado...