EB Aula 2 e 3 Elementos de Microbiologia 05-12 e19 de mar...

02/09/2015

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Elementos de Microbiologia

Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 20152

Tópicos−Introdução à Microbiologia,

−Morfologia e Estrutura das células,

−Nutrição Microbiana,

−Meios de Cultura,

−Crescimento Microbiano,

−Controle Microbiano


3Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-

USP Profa. Ines Roberto - 2015

Microbiologia

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� Ciência que estuda os micro-organismos

� Um amplo e diverso grupo de organismos

com dimensões microscópicas

� Podem ser encontrados na natureza como

células únicas ou agrupamentos celulares


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Capazes de realizar seus processos vitais sem depender de outras células

Crescimento/Reprodução

Geração de energia

Características Importantes dos Micro-organismos


Microbiologia como Ciência

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A microbiologia está associada ao estudo dasCÉLULAS VIVAS e ao seu funcionamento

Básica: Estuda a natureza fundamental e as propriedadesdos micro-organismos (fortemente influenciada pela necessidade deconhecimento sobre mos causadores de doenças)

Aplicada: Estudo da aplicação tecnológica dos micro-organismos de forma benéfica em diversas áreas(medica, agrícola e industrial).


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Ciência Básica

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−Características Morfológicas - forma e tamanho da célula; composição química e função de suas estruturas internas.

−Características Fisiológicas/Bioquímicas – condições ambientais e nutricionais necessárias ao crescimento e reprodução.

−Características Genéticas – genoma

−Características Ecológicas – ocorrência e relação com o ambiente

−Classificação - a relação taxonômica entre os grupos microbianos.


Ciência Aplicada

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−Produção de uma variedade desubstâncias de interesse econômico(Ex:ácidos orgânicos,a ntibióticos, enzimas, vitaminas)

−Processos mais eficientes para otratamento de efluentes industriais

−Produção desuplemento alimentar(proteína de célula única - SCP)

−Produção debiocombustíveis(gás metano e etanol)

−Exploração da atividade química de micro-organismos emprocessos debiorremediação(reduzir ou remover poluentes no ambiente)

−Usados como "inseticidas biológicos", no lugar de produtos químicos


MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS

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Célula: Unidade básica de todos os organismos vivos

�Parede celular

�Membrana

�Várias estruturas e componentes químicos internamente a membrana quepermitem o funcionamento celular. Ex: núcleo ou nucleóide onde abriga ainformação genética - DNA

Todos os organismos celulares correspondem aestruturasorganizadas, que apresentam alguma forma de metabolismo


MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS

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Fungo unicelular (levedura) Bactéria

Fungo multicelular (bolor)


Componentes Químicos das Células

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Célula

Proteínas

Ácidos Nucleicos

Lipídeos

Polissacarídeos

A natureza química e o arranjo destas macromoléculas é o que tornará um mo diferente do outro



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Água (70 – 80%)

Proteína

Carboidrato;LipídeoÁc nucleico


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Principais Características





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1683 - descoberta das bactérias por Antoni vanLeeuwenhoek

1864 – confirmação da existência de micro-organismos (fermentação) por Louis Pasteur

Como inserir estes seres vivos na classificaçãoexistente? (Reino ANIMAL ou VEGETAL)

1866 - E.H.Haeckel (Zoólogo) sugeriu a criação deum terceiro reino denominado de PROTISTA

Posição dos Micro-organismos no Mundo Vivo


1818

Bactérias

Algas

Fungos

Protozoários

Protistas

Classificação de Haeckel


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1919

A classificação deHaeckel foi satisfatória até que os estudosmais avançados sobre a ultra-estrutura celular (MicroscopiaEletrônica) demonstraram a existência de dois tipos estruturaisbastante distintos:

• Geralmente maiores em tamanho e demaior complexidade estrutural

• Apresentam suas estruturas internas delimitadas por membrana (organelas). Ex: núcleo

• Geralmente maiores em tamanho e demaior complexidade estrutural

• Apresentam suas estruturas internas delimitadas por membrana (organelas). Ex: núcleo

Eucarióticas

•Material genético disperso no citoplasma (o material genético (DNA) concentra-se numa dada região chamada de nucleóide)

•Material genético disperso no citoplasma (o material genético (DNA) concentra-se numa dada região chamada de nucleóide)

Procarióticas





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R.H. Wittaker (1969) – Propôs a expansão daclassificação proposta por Haeckel, baseado não sóna organização celular, mas também paraacomodar os 3 modos principais de Nutrição.

�Fotossíntese – Utilização da luz para converterdióxido de carbono em água e açúcares

�Absorção – Captação de nutrientes químicosdissolvidos na água

�Ingestão - Entrada de partículas de alimentosnão dissolvidas

Classificação de Wittaker (5 Reinos)

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REINO PROTISTA

(foto; Abs e Ing)

REINO PLANTAE

Fotossintéticos

REINO FUNGI

Absorção

REINO ANIMALIA

Ingestão

REINO MONERA(absortivos)

Procariotos - Bactérias

Microalgas, protozoários e fungos limosos

Plantas e algas superiores

Fungos e Leveduras Animais



2323

Carl Woese e George Fox (1979) –estudando as similaridades e diferenças doRNA ribossômico dos micro-organismosdescobriu um novo tipo de procarioto(Archaea)

Propôs uma nova classificação dos seresvivos: Domínio ou Supra-Reino

Classificação de Woese e Fox (3 Domínios)

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� As arqueobactérias (archeo = antigo / primitivo)

� Representam um restrito grupo de organismos procariontesque sobrevivem sob condições ambientais extremas(metanogênicas; termoacidófilas e halófilas)

� Manifestam características que as diferenciam daseubactérias (eu = verdadeiro), de acordo com a estruturação dealgumas moléculas como: ácidos nucleicos (RNA ribossômico) eelementos integrantes da membrana plasmática e parede celular.


2626

Metanogênicas → caracterizadas pelo metabolismo anaeróbio utilizam oelemento químico hidrogênio como co-fator de reações que catabolizam o gáscarbônico (CO2) em metano (CH4).

Termófilas → são arqueobactérias que sobrevivem em temperaturas altíssimas,(atingindo cerca de 100° C) e acidez muito baixa, representando os ambientesaquáticos situados próximos à falhas na crosta oceânica (fendas vulcânicas). Essesorganismos realizam quimiossíntese, utilizando compostos inorgânicos (ácidosulfídrico – H2S) para sintetizar matéria orgânica e obter energia.

Halófitas → bactérias primitivas que vivem em locais com alta concentração desal, em que a solução do meio (ambiente aquático) é extremamente hipertônica,por exemplo, a salinidade do Mar Morto.


USP Profa. Ines Roberto - 2015Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-


Bactérias


2929

�São micro-organismos PROCARIOTOS

�A maioria UNICELULAR

�Forma simples (apesar dos 4 bilhões de anos que tem evoluído)

�Muitas possuem sistema de locomoção (flagelos)

�Reprodução assexuada (fissão binária)

�Variedade de tamanho e forma

�Utilização de nutrientes por absorção

�Diversidade (ocorre em todos ambientes do planeta onde exista

H2O)

�Grande importância industrial

Morfologia e Estrutura


3030

Tamanho:0,5 a 1,0 µm (visualizadas em microscópio em umamagnitude de 1000 X)

Forma:� Esféricas ou ovalada (cocos): 0,8µm� Cilíndricas (bacilos): 1 x 3 µm� Espiraladas (bacilos curvos) (espirilos):� Formas incomuns: espiroquetas,apendiculadas e filamentosas

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�Algumas das propriedades biológicas (taxasmetabólicas e de crescimento) são afetadas pelo seupequeno tamanho.

�Ex: A velocidade da entrada de nutrientes e saídade produtos de uma célula éinversamenteproporcional ao seu tamanho.

�Como a velocidade de transporte é uma função daárea superficial da membrana, e se comparadas aovolume; células pequenas apresentam maior relaçãoentre área superficial:volume (S/V).



3535

�As técnicas de microscopia revelaram quea célula tem uma diversidade de estruturasfuncionando juntas.

�Algumas, encontradas externamentefixadas a parede celular e outrasinternamente


Estrutura Bacteriana

3636

Parede Celular

Membrana Celular

“Mesossoma”

Ribossoma

Genoma

Fundamentais


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Flagelo

Pili

Capsula

Grânulo de Inclusão

Endósporo

Auxiliares

Estrutura Bacteriana


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Flagelos

Estruturas Auxiliares


3939

Os flagelos são apêndices longos e sinuosos

�Função: responsáveis pela locomoção; Participa daQuimiotaxia e Fototaxia (movimento a estímulos)

�Constituição Química: proteínas (flagelina)

�Teoria da Locomoção: cadeias protéicas contraem e relaxamalternadamente, fazendo assim um movimento ondulatório quepuxa e empurra o mo.

* Em Archaea, os tipos de flagelina e estrutura do flagelo sãodiferentes das Bactérias.(incomuns em cocos)


4040

Pili ou Fimbrias




4141

Os pilis, são apêndices curtos e retilíneos, sem qualquerenvolvimento na locomoção; Comuns em bactérias Gramnegativas

�Função:Aderência

� Específica (Fatores de Colonização);

� Aderência para a Conjugação Bacteriana (transferência

de plasmideos). Ex.Pili Sexual

�Constituição Química: proteínas

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Glicocálice



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A glicocálice é uma camada de material viscoso queenvolvem as células bacterianas (polissacarideos oupeptídeos)

�Se a camada estiver bem organizada e rigidamenteacoplada a parede celular (Capsula)

�Se estiver desorganizada, sem forma e acopladofrouxamente à parede celular (Camada limosa)

A determinação dos constituintes da cápsula é normalmente um passoimportante na identificação de certas bactérias patogênicas.Ex: o Bacillusanthracis (antrax)possui material capsular de natureza polipeptídica formadopor ácido glutâmico.Os esporos desta bactéria podem ser usados em ataques bélicos



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� Aderência: é a principal delas (em pedras onde passa água emgrande movimento; em raízes de plantas; na superfície lisa dosdentes humanos provocando a cárie);

� Proteção (contra dessecamento temporário) devido ao grandenúmero que grupos polares na molécula que podem ligar a água.Evitar a adsorção e lise das células por bacteriófagos que sãovírus que atacam as células (protege da fagocitose)

� Reserva Nutritiva: Fonte de alimentos

*Sob o aspecto industrial podem ser uma praga. Elas são responsáveis peloacúmulo de lodo nos equipamentos, o que pode entupir filtros e tubosafetando a qualidade final do produto.

Função da glicocálice

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Grânulos de Inclusão

�Grânulos Lipídicos: formados de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) -material lipídico solúvel em clorofórmio.

�Grânulos Inorgânicos→ formados de polifosfato

�Grânulos Polissacarídicos→ (amido; glicogênio);

São substâncias químicas que se acumulamintracelularmente formando depósitos insolúveis.

Geralmente utilizados como material de reserva e fontede energia;.

Os grânulos de inclusão não são comuns a todas ascélulas bacterianas.


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�Esporos que se formam dentro da célula e são exclusivos dasbactérias (gram positivas). Sua principal função é a proteção.

�Durante o processo de esporulação ocorre desidrataçãocelular, o que também contribui para a sua elevada resistênciaao calor;

�Possuem parede celular espessa, brilham muito com a luz domicroscópico, e são altamente resistente às mudançasambientais - a maioria suportam ate 80oC/10min;

�São muito relevantes para áreas de Medicina e indústriaalimentícia, principalmente pelo fato de serem resistentes aocalor e à esterilização química, quando comparados comcélulas em estado vegetativo

Endósporo Bacteriano


4747

Endósporo Bacteriano


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Parede Celular

Estruturas Fundamentais


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O peptideoglicano é um heteropolissacarídeo composto peloácido N-acetil-murâmico e N-acetilglucosamina) comcadeias laterais tetrapeptidicas

Função: manutenção da forma bacteriana; proteçãoosmótica da bactéria.

Previne o rompimento das células devido à entrada de água;serve como uma barreira a algumas substâncias prevenindoa evasão de certas enzimas que poderiam causar danos àcélula

Composição da Parede celular:peptideoglicano oumureína:


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� As paredes celulares não são homogêneas(possuem camadas de diferentes substâncias quevariam de acordo com o tipo de bactéria envolvida,diferindo emespessura e composição).

� A composição da parede celular de bactérias permitea classificação de 2 grupos distintos de bactérias:Gram+ e Gram-;

� Método de coloração diferencial – Técnica de Gram:



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Características Gram-Positivas Gram-Negativas

Teor de Peptídeoglicano

(PPG)

Elevado(15-50% da parede)

Baixo( 5%)

ResistênciaMenor resistência (pode ser destruída completamente por

certas enzimas)

Maior resistência

Outros Componentes

Ácido teicóico(antígenos)

Membrana externa (lipopolissacarídeo)

cobrindo o PPGAcido teicóico - polímero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente podeajudar no transporte de íons para dentro e fora da célula; e noarmazenamento de fósforo.Se encontram ligados ao peptidioglicano ou à membrana citoplasmática.


53

Mecanismo de Coloração de Gram


5454

�Composição:bicamada fosfolipídica (lipídeos formados por umamolécula de glicerol, duas cadeias de ácidos graxos (saturado einsaturado) e um grupo fosfato através de ligações do tipo éster,com proteínas entremeadas.

MEMBRANA CELULAR


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MEMBRANA CELULAR

Normalmente, as membranas de organismos procariotosapresentam maiores concentrações de proteínas que asmembranas eucarióticas, tendo em vista a ausência deorganelas citoplasmáticas nas bactérias.



5656

Funções:

�Permeabilidade Seletiva;

�Transporte Ativo;

�Respiração Celular

As membranas de muitas bactérias estendem-se no citoplasma para formar túbulos chamados MESOSSOMOS

Pode ser uma forma da bactéria de aumentar a superfície damembrana celular, potencializando as funções executadas por ela

5757

�Os ribossomos são partículas densas dispersas no citoplasmacomposto por RNA Ribossômico (RNAr);

�São encontrados em todas as células procarióticas eeucarióticas. Podem estar livres no citoplasma ou associados aMC;

�O citoplasma tem em torno de 80% de água, além de ácidosnúcléicos, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons inorgânicos,muitos compostos de baixo peso molecular, e partículas comvárias funções

�Sua principal função é a síntese proteica

Ribossomos


58

Em bactérias consistem em 2 subunidades de tamanhos diferentes (50S e30S), que juntas formam o ribossomo bacteriano 70S (isto porque o ISdepende do tipo e tamanho).

Os ribossomos são alvos de antibióticos que inibem a síntese de proteínas(ex: estreptomicina e tetraciclina)

S= unidade de quão rápido apartícula sedimenta quandocentrifugada em alta velocidade


5959

Estrutura e Composição:

�DNA

�Pode ocupar até 20% da área do citoplasma

Função:

�Armazenamento das informações genéticas

Genoma Bacteriano


6060

�As arqueobactérias possuem umamembrana celularcom lipídeos compostos de uma associação deglicerol-éter, enquanto que os das eubactérias eeucariotos são compostos de glicerol-éster;

�Ao contrário das bactérias, os Archaea não possuemumaparede celulardepeptidoglicanos.

�Finalmente, oflagelo dos Archaea é diferente emcomposição e desenvolvimento do das bactérias.


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�Fungos Limosos�Fungos Inferiores Flagelados�Fungos Terrestres (espécies mais conhecidas)

São reconhecidos 3 principais grupos de fungos:

Bolores(Penicillium sp. Aspergillus sp)

Cogumelos(Agaricus sp, Pleurotus sp)

Leveduras(Saccharomyces sp, Candida sp)

Reino Fungi



62

Fungo unicelular (levedura) Ex.Saccharomyces sp

Fungo multicelular (cogumelos)

Ex.Agaricus sp

Fungo multicelular (Bolores)

Ex.Aspergillus sp

Fungos

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CARACTERISTICAS GERAIS DOS FUNGOS

São micro-organismos Eucariontes

São heterotróficos e assimilam nutrientes por absorção

Não realizam a fotossíntese(não possuem clorofila)

Parede celular formada por quitina (com exceção aos Parede celular formada por quitina (com exceção aos fungos limosos)

Reprodução assexuada e sexuada

Multicelulares (maioria) e unicelulares


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Hifas = filamentos tubulares microscópicos (septadas ou nãoseptadas)Micélio = conjunto de hifas – frouxo (bolores) ou compactos(cogumelos); Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-


6565

Tipos de Hifas


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Reprodução de Fungos

Assexuada• Brotamento (leveduras)

• Esporos (formados em estruturas internas ou nas extremidades das hifas)

Sexuada• Esporos (fusão de núcleos e meiose)


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Reprodução de Fungos


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Reprodução assexuada

Brotamento de levedura(Saccharomyces cerevisiae)

Formação de esporos esféricos (conidiósporos) nas extremidades de uma hifa especializada, o conidióforo

(Penicillium sp)


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Reprodução Sexuada

Esquema da formação de ascósporosAula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-


Esquema da formação de basidiósporos

Reprodução Sexuada


7171

Tabela 14.2 Classificação e principais propriedades dos fungos

Grupo Nome comum Hifas Representantes

típicos

Tipo de

esporo

sexual

Hábitat Doenças comuns

Ascomicetos Fungos com

estrutura em

forma de saco

Septadas Neurospora,

Saccharomyces,

Morchella

(“moráceas”)

Ascósporo Solo, matéria

vegetal em

decomposição

Doença do olmo

holandês, praga da

castanha, ferrugem das

gramíneas,

apodrecimento

Basidiomicetos Fungos com

estrutura em

forma de

clava,

cogumelos

Septadas Amanita (cogumelo

venenoso)

Agaricus (cogumelo

comestível)

Basidiósporo Solo, matéria

vegetal em

decomposição

Haste negra, ferrugem

do trigo, alforra do

milho

Zigomicetos Bolores de

pão

Cenocíticas Mucor, Rhizopus

(bolor comum de

pão)

Zigósporo Solo, matéria

vegetal em

decomposição

Deterioração de

alimentos; raramente

envolvido em doenças

parasitárias

Oomicetos Bolores de

água

Cenocíticas Allomyces Oósporo Aquático Praga da batata, certas

doenças em peixes

Deuteromicetos Fungos

imperfeitos

Septadas Penicillium,

Aspergillus,

Candida

Nenhum

conhecido

Solo, matéria

vegetal em

decomposição,

superfície de

corpos de

animais

Murchamento de

plantas, infecções de

animais como tínea, pé-

de-atleta, infecções

superficiais ou

sistêmicas (Candida)Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015



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Estrutura Fúngica


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� Confere resistência as pressões osmóticas e mecânicas

� Natureza: polissacarídica (80 a 90%) contendo tb proteínas,lipídeos, polifosfatos e íons inorganicos.

� Nos Boloreso polissacarídeo estrutural é aquitina (é umpolimero de N-acetilglicosamina, um derivado de glicose)

� Nas Leveduraso polissacarídeo estrutural é oglicano emanano.

Parede Celular


7575

� Estrutura lipoproteica: Constituída por uma camada dupla defosfolipídios e um arranjo de proteínas embebidas nabicamada lipídica (regula troca com o meio ambiente)

� A membrana plasmática dos fungos apresentam oergosterolcomo o principal esterol da membrana plasmática.

� Os esteróis da membrana conferem estrutura, modulação dafluidez e possivelmente controlam alguns eventosfisiológicos.

Membrana Citoplasmática



7676

� Mitocôndrias

� Retículo Endoplasmático (RE)

� Complexo de Golgi

� Peroxissomos

� Núcleo

Organelas Celulares

7777

Mitocôndrias


7878

�As mitocôndrias são responsáveis pela conversãoaeróbica de energia (síntese de ATP)

�Diâmetro de 0,5 a 1µm e comprimento de até 3µm.

�A ME é desprovida de esteróis (menos rígida doque a MC). Apresenta numerosos canais que sãoresponsáveis pela passagem do ATP para ocitoplasma.


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7979

Retículo Endoplasmático (RE)


8080

�O retículo endoplasmático constitui uma rede demembranas, próximas a membrana nuclear.

�RE liso (não possui ribossomas): síntese delipídeos, glicogênio e esteroides.

�RE rugoso (possui ribossomos): síntese deglicoproteinas e componentes de membrana que sãotransportados por toda a célula.


8181

Complexo de Golgi


82

�O CG consiste em um conjunto de membranas empilhadasque atuam juntamente com o RE.

�Empacotamento de certas enzimas sintetizadas pelo RErugoso (proteases, nucleases, lípases etc.). Proteção da célulaao ataque de suas próprias enzimas.

�Responsável pelo transporte seguro dos compostossintetizados para o exterior das células

�Contem enzimas glicosil transferases que unem moléculas decarboidratos com proteínas (glicoproteinas)



8383

Peroxissomos


8484

�Os peroxissomos são bolsas membranosasesféricas (0,5 a 1 µm de diâmetro) que contéminumeras enzimas;

�Função oxidativa/respiratória (não conservaenergia na forma de ATP)

�Oxidação de ácidos graxos e aminoácidos

�Possuem grandes quantidades da enzimacatalase - degradação do H2O2 (destoxificaçãocelular),

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Núcleo

�Organela bem definida, circundada por umpar de unidades de membrana. Contem ogenoma celular;

�Contem um corpúsculo chamado denucléolo, rico em RNAr.

NUTRIÇÃO MICROBIANA


8686

Mecanismo que fornece às células as ferramentasquímicas (NUTRIENTES) necessárias à síntesedos diversos monômeros.


8787

�Macronutrientes: (C,N,P,S,K,Mg,Ca,Na) Uma célulatípica contem cerca de 50% de carbono e 12% denitrogênio (em peso seco)

�Micronutrientes (elementos traços), embora requeridosem pequenas quantidades, são de fundamental importânciapara as funções celulares como os macronutrientes Ex:Cr,Co,Cu,Mn,Mo,Ni,Fe,Zn

�Fatores de Crescimento: São definidos como compostosorgânicos que alguns tipos de mos necessitam dequantidades muito pequenas. Ex: vitaminas, amino ácidos,etc


8888

Os 4 elementos mostram uma boaaproximação da composição dabiomassa

δβα NOCH


8989

23,9 molecular Massa :

20,7 molecular Massa :

50,015,075,1

27,02,066,1

=

=

ONCHLevedura

ONCHBactéria

Célula

zyxw NOHC

Substrato

2aO

ihg NObH

Nitrogênio

δβα NOHcC

Biomassa

2dCO

OeH 2

mlkj NOHfC

Produto


9090

Elemento Função ou constituinte

Bactérias Leveduras Fungos filamentosos

Carbono FC energia 46-52 45-50 40-63 Nitrogênio Proteínas,

ac.nuceicos, polímeros da

parede

10-14 5-9 3-7

Hidrogênio 8-12 8-12 8-12 Oxigênio 18-24 18-24 18-24 Fósforo Ac nucléicos,

fofolipídeos, polímeros da

parede

2-3 0,8-2,5 0,4-4,5

Enxofre Aa, biotina, coenz A

0,1-1,0 0,01-0,25 0,1-0,5

Potássio RNA, co-fator 1,0-4,5 1,0-4,0 0,2-2,5 Sódio 0,5-1,0 0,01-0,1 0,02-0,5 Cálcio Esporos bac,

co-fator 0,01-1,0 0,1-0,3 0,1-1,4

Magnésio Ribossomos, co-fator

0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5

Ferro Citrossomos, co-fator

0,02-0,2 0,01-0,5 0,1-0,2

Proteínas 50-60 35-45 25-40 Carboidratos 6-15 30-45 40-55

Lipídios 5-10 5-10 5-10 Ac. Nucléicos 15-25 5-15 2-10 Cinzas totais 4-10 4-10 4-10

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9191

Como são fornecidos estes elementos?

Meios de Cultura

Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada,

capazes de promover o crescimento de micro-organismos, em

condições de laboratório.


9292

Constituintes Químicos

•Sintéticos (Definidos)

•Complexos (Naturais)

Estado Físico

• Líquidos

• Sólidos

Finalidade

• Seletivos

• Diferenciais

Classificação do Meios de Cultura


9393

Meios de cultura sintéticos ou definidos –composição química é totalmente conhecida.

Meios de cultura complexos - composiçãoquímica não é totalmente definida, poisapresentam ingredientes cuja formulação não seconhece a exata composição (peptonas, extratode levedura).

Constituintes Químicos


9494


9595

Meios de cultura líquidos: Apresentam-se como caldos.(ativação de culturas)

Meios de cultura sólidos: Contém agentes solidificantes,como o ágar com cerca de 1.5-2% p/v.(conservação deculturas)

Estado FísicoTÉCNICA ASSEPTICA


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97

Seletivo

• contém substâncias que inibem o crescimento dedeterminados grupos de micro-organismos,permitindo o crescimento de outros.

Diferencial

• contém substâncias que permitem estabelecerdiferenças entre micro-organismos muitoparecidos

Seletivo/Diferenciall

Finalidade


9898

Exemplo de meio seletivo: Agar verde brilhantepermite a identificação de Salmonella (G-) causadora deinfecções alimentares.O meio contendo o corante inibe as bactérias G+ que sãohabitantes comuns no trato intestinal (sem afetar G-).

Exemplo de meio diferencial: Agar de sanguePermite a distinção entre bactérias do gênero Streptococcusatraves do padrão de hemólise (α β γ)

Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia) lisaparcialmente os glóbulos vermelhos do sangue – padrão αααα

Streptococcus pyogenes (causadora da faringite) lisacompletamente os glóbulos vermelhos do sangue produzindohalos transparentes à volta das colônias – padrão β

Streptococcus mutans (causa cárie dentária), não éhemolítica – padrão γ.


9999

Ágar MacConkey (seletivo e diferencial)

As bactérias fermentadoras de lactose, utilizam a lactose disponível no meio e produzem ácido como produto final. Este ácido diminui o pH do meio para valores inferiores a 6.8, resultando na observação de colônias rosa choque/vermelhas.

Destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose


100

Um dos fatores mais importantes naotimização de um processo fermentativo(bioprocesso) é a composição do meio.

Considerações Importantes

Satisfazer as necessidades nutricionais (máximorendimento)

Minimizar os custos

Planejamento de Experimentos


101101

É o conjunto de todas as reações catalisadasenzimaticamente que ocorrem dentro dascélulas.

METABOLISMO MICROBIANO

�Cada sequencia da reação é uma rotametabólica e os produtos destas reações são osmetabólitos.

�Do ponto de vista da EngenhariaBioquímica, as reações importantes sãoaquelas que produzem substâncias bioquímicasem quantidades superiores as necessidadesdas células.


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103103

Catabolismo é a fase de degradação dometabolismo, as moléculas orgânicas tais comocarboidratos, lipídeos e proteínas são degradadosaté produtos finais tais como: ácido lático, acético,CO2, etc . Liberação de energia ATP.

Anabolismo é a fase de construção dometabolismo, moléculas pequenas irão formarcomponentes moleculares relativamente grandestais como polissacarídeos, lipídeos e proteínas.Requer energia livre ATP.


104

Opções metabólicas para obtenção de energia


105105

Fototróficos: possuem pigmentos fotossintéticos quepermitem a utilização da luz como fonte de energia.Ex.: algas e bactérias fotossintetizantes.

Quimiolitotróficos: obtêm energia a partir daoxidação de um substrato inorgânico, geralmenteespecífico para o microrganismo em particular, comohidrogênio, enxôfre, amônia, nitritos e sais ferrosos.Ex.: bactérias dos gêneros Thiobacillus,Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas eDesulphovibrio.

Quimiorganotróficos: obtêm energia a partir docatabolismo de substratos orgânicos, açúcares emparticular. A este grupo pertence a grandemaioria dos microrganismos utilizadosindustrialmente. Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-


A energia obtida pela célula a partir de substânciasnutritivas do meio ou da luz solar é utilizada narealização de:

�Trabalho químico (biossíntese de proteínas,ácidos nucleicos, lipídeos, polissacarídeos e váriosoutros componentes celulares)

�Trabalho osmótico (transporte de substânciasnutritivas através da membrana celular)

�Trabalho mecânico (contração e locomoção)


107107

Autotróficos: Utilizam CO2 como únicafonte de carbono

Heterotróficos: Utilizam substanciasorganicas como fonte de carbono (glicose)

FONTE DE CARBONO


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Classificação Nutricional dos Micro-organismos

Fonte de Energia

Quimiotróficos

(organotróficos ou litotróficos)

Fonte de Carbono

Quimio-heterotrófico

Quimio-autotrófico

Fototróficos

Fonte de Carbono

Foto-heterotrófico

Fotoautotrófico

Compostos químicos

Luz

Compostosorgânicos CO2

Compostosorgânicos

CO2

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Requerimentos Ambientais

Para que ocorra o crescimento celular, além dofornecimento adequado das substâncias nutritivas(Meio de Cultivo), deve-se conduzir o processo sobcondições ambientais apropriadas

1.Temperatura2.pH3.[solutos]4.[O2]

Os valores ótimos para crescimento podem serdiferentes do ótimo para produção demetabólitos.


110110

A atividade microbiana (crescimento) édependente de reações químicas que sãoafetadas pela temperatura.

Variações térmicas influenciam nosprocessos metabólicos e morfologia celular.

Classificação em 3 grandes grupos, no quese refere a temperatura ótima decrescimento.

Temperatura


111111

Psicrófilos

• Crescem na faixa de 0°C a 20°C, com um ótimo em torno de 10°C

• Se a temperatura é muito alta, certas enzimas e/ou a membrana citoplasmática podem ser danificadas.

Mesófilos

• Crescem na faixa de 5°C a 50°C, com um ótimo entre 25°C e 40°C.

• A maioria dos mos de interesse são mesófilos.

Termófilos

• Crescem na faixa de 35°C a 90°C, com um ótimo em torno de60°C.

• mos encontrados em áreas vulcânicas e em nascentes quentes.

• A maioria desses mos são procarióticos, não se conheceeucariótico que cresça acima de 60o C.

Classificação em resposta a temperatura


112112


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114114

Os microrganismos também se diferenciam em funçãode suas exigências de oxigênio:

Estritamente aeróbios: desenvolvem-se unicamenteem presença de O2 (Streptomyces sp) e a maioria dosfungos filamentosos;

Estritamente anaeróbios: desenvolvem-seunicamente na ausência de O2 (Clostridios sp);

Facultativos: desenvolvem-se em situação deaerobiose e anaerobiose (leveduras industriais);

Microaerófilos: crescem na presença de diminutasconcentrações de oxigênio livre. Não resistem aos níveisde O2 atm (21%).

Classificação em resposta ao oxigênio

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Crescimento aeróbio (a); anaeróbio (b); facultativo(c); microaerófilo (d) e anaeróbios aerotolerantes (e).


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A acidez ou alcalinidade de uma solução é expressa porseu pH, em uma escala na faixa de 0 a 14 onde aneutralidade corresponde ao pH = 7,0.

É importante lembrar que o pH é uma funçãologarítmica, ou seja: a alteração de 1 unidade de pHrepresenta uma variação de 10 vezes na concentraçãode íons hidrogênio.

Assim como para a temperatura, existe um valor ótimode pH para o crescimento dos micro-organismosdentro de limites mínimos e máximos.

pH


117117

� As bactérias suportam variações de pH do meiona faixa de 4,0 a 9,0, com valores ótimos entre6,5 e 7,5.

� Os fungos suportam variações na faixa de 2,0 a8,0. No caso de bolores, o pH ótimo situa-seem 5,6, enquanto as leveduras tem ocrescimento favorecido em pH 4,0-4,5.

� Organismos que crescem em pHs baixos ouelevados são conhecidos como acidófilos (pH<1) e alcalifílicos (pH>9).


118118

Durante o cultivo de um micro-organismos, podemocorrer alterações no pH do meio, como resultadodas atividades metabólicas que consomem ouproduzem substâncias ácidas ou básicas. Asvariações de pH podem ser contornadas de duasmaneiras:

Considerações Importantes sobre o pH

1. Uso de soluções tampão apropriados:tampão fosfato KH2PO4/ K2HPO4

2. Adição de ácido ou base ao sistema:HCl ou NaOH


119119

� A água é o solvente universal da vida

� A disponibilidade de água é também função da concentraçãode solutos, como sais açúcares e outros

� A atividade de água é expressa em termos físicos comoatividade de água (Aw).

� Os valores de (Aw) variam de 0 a 1 (Ex: a água pura tem aw =1, Cereais, balas e frutas secas tem Aw = 0,70.

Efeitos Osmóticos no Crescimento Microbiano


120120

Limite de Solubilidade para Solutos Comuns

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121121

� Os mos que suportam certo grau de redução na Aw são

chamados de HALOTOLERANTES

� Os mos que apresentam crescimento ótimo em meio com

baixa atividade de água (concentração de sal de 2 a 4 %) são

denominados HALÓFILOS (halófilos extremos podem

crescer em meios contendo de 15 a 30% de NaCl)

� Os mos capazes de sobreviver em ambientes ricos em

açúcar são denominados OSMÓFILOS


122122

Limite mínimo de Aw para os diferentes tipos microbianos

Micro-organismos Aw mínima

Maioria das bactérias 0,88 – 0,90

Maioria das leveduras 0,88

Maioria dos bolores 0,80

Bactérias halófilas 0,75

Leveduras osmófilas 0,60 – 0,62

Requerimentos Ambientais


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124124

As células microbianas quando cultivadas em sistemasfechados (reatores, frascos ou tubos) contendo meio decultura líquido onde nenhum nutriente é adicionado aosistema e nenhum produto é removido chamamos deCultura em Batelada.

As células inicialmente se dividem e o número de célulasaumenta por um período de tempo.

Este aumento cessa quando os nutrientes são esgotadosou quando os produtos formados se acumulam emquantidades suficientes para interromper o crescimento(intoxicação pelos produtos).

Crescimento Microbiano


125125

Curva Típica do Crescimento Microbiano


126126

Medidas do Crescimento Microbiano

1. Determinação da massa seca ou úmida

•Medida da massa das células •São necessárias amostras relativamente grandes•Não se aplica a baixas densidades celulares•Podem ocorrer perdas durante o processo de lavagem das células

•Não se aplica quando o meio contém partículas sólidas

2. Determinação Química dos componentes celulares

• Dosagem de proteínas e ácidos nucleicos

• Aplicáveis a pequenas amostras (sensíveis e precisos)

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127127

Medidas do Crescimento Microbiano

3. Turbidimetria

• Medida da turvação do meio (absorbância em espectrofotômetro)

• A turvação está relacionada com a massa seca das células( Lei de Lambert -Beer)

• Permite a construção de curvas de calibração para um conjunto de condiçõesexperimentais

• As equações de correlação são fundamentais para a determinação da massa decélulas através da medida de absorbância com o tempo

4. Determinação do Número de células em uma suspensão

• Contagem do número total (amostras são colocadas em câmaras de contagem“Neubauer” e leitura é feita em microscópio). Os resultados são expressos emNúmero de células por mL.

• Contagem do número de viáveis (semeadura das amostras através de seuespalhamento em meio sólido). As colônias formadas serão contadas e osresultados expressos em Unidade Formadora de Colônias por volume de amostra(UFC/mL)


128128

Turbidimetria

As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. Elas são tratadassimultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por umadeterminada solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução (l).

Onde:A= absorbânciaα= absortividade molarl= distância que a luz atravessa pelo corpo -caminho óptico (1 cm)c = Concentração da solução

clA α=


129129

Lei de Beer-Lambertt

Para os micro-organismos em geral o valor de λ máx é de 500 -600 nm.

(λ)


130130

Curva de calibração de massa seca

Relação entre a absorbância e a concentração celular de Pichia stipitis cultivada em hidrolisado hemicelulósico da palha de arroz in natura.


131131

Câmara de Contagem


132132

Câmara de Contagem

Volume total do quadrante central da câmara deNeubauer é de 0,1 mm3

Volume de cada quadrado vermelho é de0,004mm3

Volume de 1 quadrado vermelho =4 x 10-6 mLVolume de 5 quadrados vermelhos = 2 x 10-5 mL

Como a contagem é feita em 5 quadradosvermelhos, os resultados expressos em Númerode Células/mL será dado pela equação:1 mL = 1cm3

1cm3 = 10x10x10 mm3 = 1000mm3

diluiçãodefatorxxxvermelhosquadradosnoscelulasmL

célulasdeNúmero 41055∑=

diluiçãodefatorxvermelhosquadradosdosVolume

vermelhosquadradosnoscelulas

mL

célulasdeNúmero

5

5∑=

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133133

Contagem de Células Viáveis


134134


O ideal é contar de 30 – 300 colônias

diluiçãodefatorxamostadaVolume

formadasdecoloniasNúmero

mL

UFC=


135135


O ideal é contar de 30 – 300 colônias

mL

UFCxxviáveisdeNúmero 7103000.10

1,0

300==

Água potável < 500 UFC/mL


136136

Curva Típica do Crescimento Microbiano


137137

Nesta fase as células estão fisiologicamenteativas e sintetizando novas enzimas para seadaptarem ao meio novo.

A contagem não revela aumento do número decélulas, mas a massa pode aumentar comoreflexo do aumento do tamanho da célula.

Esta fase ocorre quando as células do inóculoprovem de cultura velhas ou quando as célulasdo não são cultivadas em meios adequados.Nesta fase a velocidade de crescimento (dX/dt) ézero

Fase Lag


138138

As células estão em condições de crescimento balanceado(aumento ordenado de todos os constituintes).

Não há limitação de nutrientes

As células são aproximadamente uniformes em termos decomposição química, atividades metabólicas e fisiológicas.

É a fase mais importante para estudos de fisiologia ecinética

Há um aumento exponencial do número de células com otempoA velocidade de crescimento (dX/dt) é proporcional aconcentração de micro-organismos

Fase Log

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139139

Fase Log

Tratando os micro-organismos como bactérias que se multiplicam por divisãobinária, temos:

nNN 2.0=N = número de micro-organismos ao final de n divisões (gerações)

N0 = número inicial de micro-organismos

2logloglog 0 nNN +=

2log

loglog 0NNn

−=

A velocidade exponencial de crescimento (R) pode ser expressa pelo número degerações na unidade de tempo:

0tt

nR

−= A recíproca de R é o tempo de geração

n

ttt

R G01 −

==


140140

Nesta fase o número de células novas é igual ao número

de células que morrem.

Acúmulo de metabólicos tóxicos e/ou exaustão de

nutrientes e limitação de oxigênio.

A duração desta fase varia consideravelmente com as

condições do cultivo

A velocidade de crescimento (dX/dt) é zero

Fase Estacionária


141141

Nesta fase, o número de organismos que morre torna-

se muito superior em relação aos que surgem. O

número de viáveis diminui de forma exponencial.

Completa exaustão de nutrientes e acúmulo de

metabólitos inibitórios.

A velocidade de crescimento (dX/dt) é negativa

Fase de Morte (ou declínio)


142142

Taxonomia

Organização Classificação Nomenclatura

Baseada em 7 níveis descendentes•Reino•Divisão•Classe •Ordem Família•Gênero•Espécie

É o arranjo dos micro-organismos em grupos obedecendo relações evolutivas

É o processo de darnomes as espéciesexistentes. É latinobinomial combinando onome genérico(gênero) seguido daespécie

Ex: Saccharomyces cerevisiae

gênero espécie

Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015 143143

Biotecnologia Industrial. Willibaldo Schmidell; Urgel deAlmeida Lima; Eugenio Aquarone; Walter Borzani(Coordenadores). Volume 1. Engenharia Bioquímica. 2001.Editora Edgard Blucher.

Microbiologia de Brock - Michael T. Madigan; John M.Martinko & Jack Parker. 10ª Edição. 2004. Editora PearsonEducation, Inc.

Bibliografia

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