EFEITO DE EXTRATOS FOLIARES DE TRÊS ESPÉCIES DE...

_________________________________________ISSN 1983-4209 – Volume 09 – Número 03 – 2013

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EFEITO DE EXTRATOS FOLIARES DE TRÊS ESPÉCIES DE Pouteria (SAPOTACEAE)

SOBRE A GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO DE Lactuca sativa L. E Lycopersicum

esculentum Mill.

Mirta Bicca Condessa1, Ísis Andrade Franco de Carvalho

2, Beatriz Taynara Araújo dos Santos

3,

José Elias de Paula4, Sueli Maria Gomes

5, Dâmaris Silveira

6, Luiz Alberto Simeoni

7.

RESUMO: Os aleloquímicos têm importante papel ecológico e sua identificação é uma etapa na

obtenção de novos herbicidas. Neste sentido, oito extratos brutos de folhas de Pouteria caimito

(Ruiz & Pav.) Radlk., P. ramiflora (Mart.) Radlk., e P. torta (Mart.) Radlk. (Sapotaceae) foram

avaliados por bioensaio de germinação e crescimento, para verificar o potencial alelopático sobre

sementes de alface (Lactuca sativa L.) e tomate (Lycopersicum esculentum Mill.), nas

concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/mL. Foram avaliados os seguintes parâmetros:

germinabilidade (G), tempo médio de germinação (tm) e comprimento da radícula (CR). Foram

propostos pela primeira vez os conceitos de taxa de inibição da germinabilidade (TIG) e de taxa de

inibição do crescimento radicular (TICR). Destacam-se como bastante promissores os extratos

etanólicos de P. caimito e P. ramiflora, por terem tido maiores valores de TIG: respectivamente

76% e 46%, a 4,0 mg/mL e, com exceção da G de L. esculentum frente a P. ramiflora, estes extratos

apresentaram inibição alelopática em todos os parâmetros testados. Todos os demais apresentaram

algum efeito alelopático sobre L. sativa e L. esculentum por meio da inibição da germinação, do

crescimento da radícula, ou de ambos. Os conceitos de TIG e TICR constituem contribuições

inéditas do presente trabalho, mostrando-se úteis em estudos sobre alelopatia por possibilitarem

uma análise direta do efeito inibitório dos extratos sobre a germinabilidade e crescimento da

radícula, respectivamente, e eles comparam os resultados do tratamento e do controle.

Unitermos: alelopatia, aleloquímicos, extrato vegetal, taxa de inibição da germinabilidade, inibição

do crescimento radicular.

EFFECT OF LEAF EXTRACTS OF THREE SPECIES OF Pouteria (SAPOTACEAE) ON

THE GERMINATION AND GROWTH OF Lactuca sativa L. AND Lycopersicum esculentum

Mill.

ABSTRACT: Allelochemicals play important ecological role and their identification can be

considered one of the ways to get new herbicides. In this sense, eight extracts from leaves of

Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk., P. ramiflora (Mart.) Radlk. and P. torta (Mart.) Radlk.

(Sapotaceae) were evaluated by germination and growth bioassays, to determine their allelopathic

potential over lettuce (Lactuca sativa L.) and tomato (Lycopersicum esculentum Mill.) seeds at the

concentrations of 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 mg/mL. The germinability (G, given in %), germination time

average (tm) and radicle length (CR) were evaluated. The concepts of germination inhibition rate

(TIG) and of root growth inhibition rate (TICR) were proposed in a first time. It is pointed out that

the ethanol extracts of P. caimito and P. ramiflora are very promising, because they had higher

values of TIG: respectively 76% and 46%, at 4.0 mg/mL and, with exception of G from L.

esculentum tested with P. ramiflora, these extracts showed allelopathic inhibition in all evaluated

parameters. All others showed some allelopathic effect on L. sativa and L. esculentum, through

germination inhibition, radicle growth inhibition, or both. The TIG and TICR concepts are novel

contributions of this work, being useful in studies of allelopathy, because they allow a direct

analysis of the inhibitory effect of extracts on germinability and radicle growth, respectively, and

they compare the treatment and the control results.


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Uniterms: allelopathy, allelochemicals, germination inhibition rate, plant extract, root growth

inhibition.

INTRODUÇÃO

As interações químicas que ocorrem nos ecossistemas têm se apresentado como uma

importante alternativa na busca de fontes de herbicidas disponíveis na própria natureza, mais

específicos e menos prejudiciais ao ambiente (Peres et al., 2004). A ampliação desse conhecimento

para a flora brasileira é de grande importância, devido à megadiversidade florística de nosso país

(Maraschin-Silva e Áquila, 2006). Esta diversidade traduz-se também do ponto de vista químico, já

que diferentes espécies variam em suas respostas aleloquímicas, liberando diversos compostos do

metabolismo secundário no ambiente (Ding et al., 2007; Magiero et al., 2009).

A alelopatia é definida como a interferência positiva ou negativa de substâncias produzidas

por uma planta e pode representar uma alternativa interessante na busca de fitotoxinas naturais com

atividade inibitória ou estimulante sobre outras espécies (Ferreira e Borghetti, 2004). Aleloquímicos

liberados por meio da decomposição de resíduos vegetais podem ter papel importante na

germinação e estabelecimento de sementes individuais, influenciando no padrão da vegetação na

medida em que geram variações químicas no solo (Silva et al., 2006). Tal característica torna-se de

extrema importância em biomas que apresentem alto endemismo como o Cerrado, onde há áreas em

que as estimativas de espécies endêmicas podem ultrapassar 40% (Méio et al., 2003).

Adicionalmente, a identificação de tais espécies pode ser uma estratégia interessante para o

manejo natural e redução do uso de herbicidas, inseticidas e outros produtos artificiais na

agricultura (Mclaughlin et al., 1998; Anaya, 2006).

Diversas espécies que interferem no metabolismo de outras são relatadas na literatura.

Extratos de Rhynchostegium pallidifolium (Mitt.) A. Jaeger mostraram atividade inibitória de

crescimento em monocotiledôneas e dicotiledôneas (Kato-Noguchi et al., 2010b). O extrato

etanólico de Syzygium aromaticum (L.) Merr & Perry (cravo-da-índia), bem como eugenol puro,

diminuíram a geminação e crescimento de diversas sementes (Mazzafera, 2003). O arroz (Oriza

sativum L.) inibe o crescimento de espécies invasoras e de plantas com as quais é cultivado em

consórcio, sendo que os diterpenos momilactona A e momilactona B, isolados do exsudado da raiz,

parecem ser os responsáveis por esta atividade (Kato-Noguchi et al., 2002; Duke et al., 2007).

Testes in vitro mostraram que estes exsudados inibem o crescimento de raízes e brotos de

Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. em concentrações de 0,8-2,2% e 59-82%, respectivamente

(Kato-Noguchi et al., 2010a). Folhas e frutos de Solanum lycocarpum St. Hill. apresentaram

propriedades alelopáticas (inibitórias e estimulantes), que se manifestaram numa ampla faixa de

temperatura (Aires et al., 2005).

O estudo da influência de extratos sobre a germinação e o crescimento de determinadas

espécies-alvo, comumente Lactuca sativa L., também pode ser utilizado para avaliação preliminar

de citotoxicidade (Anderson et al., 1991). Este tipo de abordagem revelou o potencial fitotóxico de

extratos aquosos de folhas frescas e secas de Persea americana Mill., o abacateiro (Borella et al.,

2009); do extrato volátil de Pilocarpus microphyllus Stapf. ex Wardleworth, o jaborandi (Alves et

al., 2004); e de Artemisia annua L., a artemísia (Magiero et al., 2009).

A atividade aleloquímica já foi relatada também para espécies de Pouteria. Espécies desse

gênero são utilizadas para fins medicinais, embora nem todos estes usos tenham sido comprovados,

ou mesmo estudados cientificamente.

Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. é usada como antimicrobiano, antimalárico (Pérez,

2002), antioxidante (Silva et al., 2009), com relatada atividade fotoprotetora contra raios UVA e

UVB (Silva et al., 2009). Pouteria torta (Mart.) Radlk. tem sido popularmente usada como


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antidiarreico (Silva et al., 2009) e os constituintes da planta têm comprovada atividade

antimicrobiana (Alves et al., 2000), antifúngica e inseticida (Boleti et al., 2007), toxicidade a larvas

de Artemia salina (Perfeito et al., 2005; Silva et al., 2009), bem como atividades inibitória da α-

amilase (Silva et al., 2009), antimicrobiana (Alves et al., 2000; Silva et al., 2009), fotoprotetora

contra raios UVA e UVB (Silva et al., 2009), atividade frente a receptores nucleares (Silva et al.,

2009) e também inibição da germinação de Lactuca sativa (Nascimento et al., 2007). Pouteria

ramiflora (Mart.) Radlk. tem sido usada no tratamento de verminoses, disenteria, dor e inflamação

(Fontes et al., 2009), com as seguintes atividades biológicas comprovadas: antinociceptiva, anti-

inflamatória (Fontes et al., 2009), antioxidante, toxicidade a larvas de Artemia salina, fotoprotetora

contra raios UVA e UVB e inibitória da α-amilase e da germinação de Lactuca sativa (Silva et al.,

2009) e antimicrobiana (Alves et al., 2000).

Além disso, várias espécies desse gênero são bastante conhecidas por possuírem frutos

comestíveis, que são comercializados in natura ou utilizados na indústria de alimentos (sorvetes,

polpas, geleias e outros).

Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. (abiu), P. ramiflora (Mart.) Radlk. (curiola) e P.

torta (Mart.) Radlk. (guaipeva) podem ser encontradas no Cerrado do entorno de Brasília, Distrito

Federal, Brasil. Essas espécies são utilizadas na medicina popular e a P. torta é a mais estudada sob

o ponto de vista químico e de atividades biológicas. Frutos comestíveis grandes, com polpa

abundante, ocorrem em P. caimito e P. torta, contudo somente a primeira é explorada

comercialmente. Do extrato hexânico de folhas de P. caimito foi extraído o espinasterol (Silva et

al., 2009); do extrato benzênico do fruto foram isolados α-amirina, lupeol, eritrodiol e damarenediol

II e do extrato das cascas foram identificados taraxerol, acetato de taraxerol, taraxerona e β-

sistosterol (Pellicciari et al., 1972).

Por meio de estudos sobre a composição química dos extratos hexânico e diclorometanólico

das flores e frutos de P. torta, foram obtidas misturas de ácidos graxos, compostos poli-

isoprenoides, mistura de hidrocarbonetos e triterpenos (David, 1993). Do extrato metanólico dos

ramos foram obtidos os triterpenos acetato de α-amirina, acetato de β-amirina, ácido betulínico e

ácido ursólico (Che et al., 1980); do extrato hexânico das folhas, hidrocarbonetos, acetato de

lupeíla e álcoois de cadeia longa; e também misturas dos triterpenos α- e β-friedelinol e α- e β-

amirina. O flavonoide miricitrina foi obtido da fração acetonitrila: clorofórmio e da fração aquosa

do extrato etanólico (Silva et al., 2009).

Os flavonoides e triterpenos são classes de substâncias muito comuns em Sapotaceae e estão

relacionados a diversas atividades biológicas, sendo anti-inflamatórios, anti-helmínticos,

antitumorais, estrogênicos e inibidores enzimáticos, por exemplo, da transcriptase reversa do HIV

(Silva et al., 2009).

Considerando a importância dos aleloquímicos nos ecossistemas, bem como sua possível

correlação com atividades citotóxicas, o objetivo deste estudo foi investigar as propriedades

alelopáticas de diversos extratos das folhas de Pouteria caimito, P. ramiflora e P. torta na

germinação e crescimento de L. sativa e L. esculentum, visando contribuir para o conhecimento

sobre a atividade biológica dessas espécies.

MATERIAL E MÉTODOS

Folhas de três espécies de Sapotaceae foram coletadas e desidratadas em temperatura

ambiente (25 ºC), tendo as seguintes exsicatas testemunhas: Pouteria caimito - S. M. Gomes

UB27284, P. ramiflora - J. Elias de Paula UB3671, P. torta - J. Elias de Paula UB3674, que estão

depositadas no Herbário da Universidade de Brasília (Herbário UB), Brasília, DF.

Obtenção dos extratos brutos


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Todos os extratos usados foram oriundos do banco de extratos do grupo de pesquisa

“Desenvolvimento e Controle da Qualidade de Fármacos e Medicamentos”, do Laboratório de

Produtos Naturais da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília.

Para a obtenção do extrato bruto hexânico, o material botânico foi pulverizado e submetido à

extração por maceração a frio, por quatro vezes, durante sete dias cada, utilizando primeiramente

hexano como solvente. Após decantação, as soluções extrativas foram concentradas à secura, sob

vácuo, a uma temperatura de aproximadamente 40 °C. Com o material botânico restante, o mesmo

processo foi realizado utilizando etanol 95% como solvente.

Na obtenção do extrato aquoso bruto, a técnica de extração utilizada foi a infusão de acordo

com Silva (2007). Ao material botânico pulverizado foi adicionada água destilada submetida

previamente à ebulição e posterior arrefecimento até 70 °C. A mistura foi mantida em contato até

arrefecimento a 50 °C e filtrada a quente. A solução extrativa obtida foi mantida a -30 oC e

posteriormente submetida a liofilização, sendo os rendimento dos extratos apresentados na Tabela

1.

Tabela 1. Rendimento dos extratos brutos de espécies de Pouteria.

Espécie Nome popular Parte usada Extrato

Rendimento

(%)

Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. Abiu Folha

Hexânico 2,8

Etanólico 5,6

Aquoso

7,7

Pouteria ramiflora (Mart.) Radlk. Curiola Folha

Hexânico 5,2

Etanólico 18,3

Aquoso

9,2

Pouteria torta (Mart.) Radlk. Guaipeva Folha

Hexânico 5,1

Aquoso 11,2

Os extratos das espécies vegetais foram ensaiados com Lactuca sativa (Asteraceae)

variedade crespa “grand Rapids TBR”, marca Isla Pak e Lycopersicum esculentum Mill.

(Solanaceae) variedade super marmande, marca Isla Pak. As placas de Petri (Ø 9,0 cm) foram

desinfetadas com solução 0,01% de hipoclorito de sódio durante três horas, lavadas com água

destilada e revestidas internamente por discos de papel-filtro (Whatman nº 1), sendo o conjunto

submetido à esterilização em autoclave.


5

As plantas-alvo foram testadas com os extratos brutos quanto a sua germinabilidade e tempo

médio de germinação (para a atividade fitotóxica na germinação) e comprimento radicular (para a

atividade fitotóxica no crescimento).

Bioensaio de germinação e crescimento

Estudos sobre efeitos fitotóxicos de extratos de plantas, comumente analisam os parâmetros

de germinabilidade, tempo médio de germinação e crescimento inicial, este último avaliado por

meio do comprimento da radícula e/ou hipocótilo (Alves et al., 2000; Alves et al., 2004; Maraschin-

Silva e Áquila, 2006). O crescimento inicial também pode ser avaliado por meio do comprimento

da parte aérea da plântula (Alves et al., 2004). A análise da entropia informacional da germinação

proposta por Labouriau (Laboriau, 1983; Aires et al., 2005) tem sido utilizada por alguns autores

(Maraschin-Silva e Áquila, 2006).

Para ambos os ensaios, foi utilizada a metodologia descrita por Ferreira e Borghetti (2004),

que preconiza a verificação da ocorrência de efeitos inibitórios ou estimulantes na germinação e no

crescimento das sementes, frente às amostras testadas, em diferentes concentrações. As placas de

Petri foram montadas com discos de papel-filtro (Ø 6 mm) umedecidas com 10 mL de solução do

extrato (etanólico, hexânico ou aquoso) nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/mL (Ferreira e

Borghetti, 2004).

Para o bioensaio de germinação, após a evaporação do solvente, foram adicionados 10 mL

de água em cada placa. Em seguida, cada disco de papel recebeu 30 diásporos da espécie-alvo (L.

sativa ou L. esculentum), distribuídos aleatoriamente, com três repetições para cada extrato. Como

controle, o mesmo procedimento foi utilizado, entretanto, sem o extrato vegetal. A verificação da

ocorrência de germinação foi realizada nos intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 h (total de 5 dias),

procedendo a retirada das sementes germinadas. O critério de germinação foi emergência da

radícula (±2 mm) seguida de curvamento geotrópico da raiz.

Para o bioensaio de crescimento, após a evaporação do solvente, foram adicionados 10 mL

de água. Em seguida, cada disco de papel recebeu 10 diásporos das espécies-alvo (L. sativa ou L.

esculentum), distribuídos aleatoriamente, com três repetições para cada extrato. Como controle o

mesmo procedimento foi utilizado, entretanto, com a ausência do extrato vegetal. Os diásporos

estavam em período de crescimento prévio de três dias e foram escolhidos pela semelhança de

tamanho de crescimento neste período, evitando diferenças significativas que pudessem influenciar

os resultados do teste. As medidas da radícula das 10 plântulas foram feitas após sete dias de

crescimento, utilizando-se paquímetro digital.

Cálculo da taxa de inibição da germinabilidade (TIG)

A avaliação da taxa de inibição da germinabilidade teve como base a comparação entre

controle e demais tratamentos e dada em porcentagem por meio da fórmula:

TIG = (GC - GT) / GC x 100%

Onde TIG = taxa de inibição da germinabilidade; GC = germinabilidade do controle; GT =

germinabilidade do tratamento. Valores positivos de TIG revelam inibição da germinação, enquanto

valores negativos indicam estímulo à germinação.

Cálculo da taxa de inibição do crescimento radicular (TICR)

Para a avaliação da taxa de inibição do crescimento radicular, foi tomada como base a

comparação entre controle e demais tratamentos, sendo expressa em porcentagem:


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TICR = (CRC - CRT) / CRC x 100%

Onde TICR = taxa de inibição do crescimento radicular; CRC = comprimento da radícula no

controle; CRT = comprimento da radícula no tratamento. Valores positivos de TICR revelam

inibição do crescimento, enquanto valores negativos indicam estímulo ao crescimento.

Análise Estatística

Para as variáveis do teste de germinação e crescimento foram utilizadas análises estatísticas

aplicando o pacote SigmaPlot, versão 11.0 e GraphPad Prism 5. Nas análises de germinação, os

parâmetros avaliados foram germinabilidade e tempo médio de germinação (Laboriau, 1983; Araújo

et al., 2010). Nos ensaios de crescimento o parâmetro avaliado foi o crescimento radicular após 7

dias em contato com os extratos testados. Os dados de germinabilidade foram submetidos à Análise

de Variância (ANOVA) One way, seguida do método Holm-Sidak (P<0,05); para os dados não

paramétricos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido de teste Tukey (p<0,05). Enquanto que

os dados de tempo médio de germinação foram submetidos à ANOVA Two way (p<0,001) e os

dados de crescimento foram submetidos à ANOVA não paramétrica e Dunn post hoc (P<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A resistência ou tolerância aos metabólitos secundários é uma característica espécie-

específica, existindo plantas mais sensíveis, como Lactuca sativa L. (alface), Lycopersicon

esculentum Mill. (tomate) e Cucumis sativus L. (pepino), consideradas indicadoras de atividade

alelopática (Alves et al., 2004). Outros fatores sustentaram a escolha de L. sativa como espécie-

alvo: curto período necessário para germinação (24 a 48 h), não requer foto-período, apresenta

tamanho considerado uniforme, germinação potencial a temperatura ambiente, eixo único da

plântula facilita a leitura do crescimento e seus diásporos são facilmente encontrados (Carballeira e

Reigosa, 1999; Ferreira e Aquila, 2000). Como as espécies nativas, amiúde, possuem algum tipo de

dormência, o uso de sementes de espécies cultivadas de boa qualidade é aconselhável e L.

esculentum e L. sativa são duas espécies em que as “sementes” (alface é um aquênio) são

facilmente encontradas e bastante sensíveis a vários aleloquímicos (Klink e Machado, 2005).

Germinabilidade e taxa de inibição da germinabilidade

Na Tabela 2, observa-se a germinabilidade e a taxa de inibição de sementes de L. sativa

submetidas aos extratos testados, constatando-se que alguns resultados foram dose-dependentes.

Os valores de TIG expressam diretamente o efeito inibitório da germinabilidade das

sementes, facilitando a análise dos resultados. As maiores taxas de inibição em relação ao controle

foram observadas para os extratos etanólicos de P. caimito (4 mg/mL, 76%) e P. ramiflora (4

mg/mL, 46%). Para o extrato hexânico de P. ramiflora houve inibição na concentração de 2 mg/mL

no valor de 21% e para o extrato aquoso desta mesma espécie não houve diferença estatística em

relação ao controle.

Tabela 2. Germinabilidade (G) e respectiva taxa de inibição da germinabilidade (TIG) de sementes

de Lactuca sativa submetidas a diferentes extratos foliares de espécies de Pouteria (Sapotaceae)

com resposta dose-dependente ao final de 5 dias.

Espécie e tipo de extrato Concentração do extrato (mg/mL)

0 0,5 1 2 4


7

Pouteria caimito (etanólico) G (%) 90 87 80 64* 22*

TIG (%) 0 3 11 29* 76*

Pouteria ramiflora (etanólico) G (%) 97 88 87 80 52*

TIG (%) 0 9 10 18 46*

Pouteria ramiflora (hexânico) G (%) 94 93 88 74* 86

TIG (%) 0 1 6 21* 9

Pouteria ramiflora (aquoso) G (%) 91 97 86 91 82

TIG (%) 0 -7 5 0 10

*P< 0,05 vs controle.

Para os extratos testados utilizando L. esculentum como planta-alvo (Tabela 3), somente o

extrato etanólico de P. caimito, embora apresentando sutil estímulo da germinabilidade nas

concentrações mais baixas (0,5 e 1 mg/mL), apresentou TIG de 32% e 94% nas concentrações de 2

e 4 mg/mL, respectivamente.

Tabela 3. Germinabilidade (G) e respectiva taxa de inibição da germinabilidade (TIG) de sementes

de Lycopersicon esculentum submetidas ao extrato etanólico de folhas de Pouteria caimito

(Sapotaceae) ao final de 5 dias.

Espécie e tipo de extrato Concentração do extrato (mg/mL)

0 0,5 1 2 4

Pouteria caimito (etanólico) G(%) 72 89 83 49* 4*

TIG(%) 0 -24 -15 32* 94*

*P< 0,05 vs controle.

Tempo Médio de Germinação

A germinabilidade informa o número de sementes germinadas, entretanto, não reflete quanto

tempo foi necessário para que as sementes atingissem tal porcentagem de germinação (Ferreira e

Borghetti, 2004). Desta forma, se dois ou mais lotes de sementes apresentarem germinabilidade

semelhante, isso não quer dizer que seu comportamento germinativo seja o mesmo, pois os tempos

e a distribuição da germinação das sementes podem ser diferentes. Considerando que a 22 ºC todo

um lote de L. sativa L. pode germinar em 48 ou, no máximo, 72 h e que poderia haver efeito dos

extratos testados na distribuição deste tempo de germinação, o cálculo do tempo médio foi

realizado, pois fornece um caráter cinético ao processo e permite a realização de inferências sobre

vias metabólicas envolvidas (Ferreira e Borghetti, 2004).

Na Figura 1, observa-se que o extrato etanólico de P. ramiflora inibiu significativamente o

tempo de germinação de L. sativa nas 24 h (2 mg/mL e 4 mg/mL) e 48 h (4 mg/mL) de análise,

alterando a curva de germinação não cumulativa no tempo inicial, assim como o extrato aquoso da

mesma espécie em sua maior concentração nas 48 h de análise. Por outro lado, o extrato etanólico

de P. caimito atrasou o tempo médio de germinação nos tempos finais de análise e alterou a curva

de crescimento em 96 h nas três maiores concentrações.


8

Figura 1. Curvas de crescimento não cumulativo de Lactuca sativa sob tratamento com várias

concentrações do extrato etanólico de folhas de Pouteria caimito, em comparação com o controle

(sem extrato), (A) 0,5 mg/mL, (B) 1,0 mg/mL, (C) 2,0 mg/mL, (D) 4,0 mg/mL, (E) todas as

concentrações. Os pontos representam a média ± erro padrão. *P<0,001 vs controle, n=9. Para uma

melhor visualização os asteriscos referentes às diferenças estatísticas não estão colocados no gráfico

(E).

Para os tratamentos com as sementes de L. esculentum (Figura 2), os extratos de folhas de P.

caimito apresentaram o seguinte comportamento: o extrato hexânico deslocou a curva de

germinação nas 72 h de análise nas concentrações de 1 mg/mL e 2 mg/mL e em 48 h e 72 h na

concentração de 4 mg/mL; o extrato etanólico alterou a germinação de L. esculentum ao longo do

tempo nas 48 h na concentração de 0,5 mg/mL; em 24 h e 48 h nas concentrações de 2 mg/mL e 4

mg/mL; no extrato aquoso de folhas de P. caimito, as inibições no tempo médio de germinação nas

primeiras 24 h foram significativas em todas as concentrações testadas.

0 24 48 72 96 1200

5

10

15 0,0 mg/mL

0,5 mg/mL

(A)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

0 24 48 72 96 1200

5

10

15 0,0 mg/mL

1,0 mg/mL

(B)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

*

0 24 48 72 96 1200

5

10

15 0,0 mg/mL

2,0 mg/mL

(C)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

*

0 24 48 72 96 1200

5

10

15 0,0 mg/mL

4,0 mg/mL

(D)

*

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

**

0 24 48 72 96 1200

5

10

15 0,0 mg/mL

0,5 mg/mL

1,0 mg/mL

2,0 mg/mL

4,0 mg/mL

(E)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas


9

Figura 2. Curvas de crescimento não cumulativo de Lycopersicum esculentum sob tratamento com

várias concentrações do extrato aquoso de folhas de Pouteria caimito, em comparação com o

controle (sem extrato), (A) 0,5 mg/mL, (B) 1,0 mg/mL, (C) 2,0 mg/mL, (D) 4,0 mg/mL, (E) todas

as concentrações. Os pontos representam a média ± erro padrão. *P<0,001 vs controle, n=9. Para

uma melhor visualização, os asteriscos referentes às diferenças estatísticas não estão colocados no

gráfico (E).

Para os extratos foliares de P. ramiflora testados com as sementes de L. esculentum, os

extratos aquoso e etanólico inibiram a germinação nas 48h de análise na concentração de 4 mg/mL.

O extrato hexânico, contudo, deslocou a curva de germinação nas 24 h e 72 h na concentração de 1

mg/mL e em 24 h, 48 h e 72 h nas duas maiores concentrações (2 mg/mL e 4 mg/mL).

As sementes de L. esculentum frente aos extratos foliares de P. torta também tiveram seu

crescimento não cumulativo afetado. Para o extrato hexânico, a curva foi deslocada nas 48 h e 72 h

nas concentrações de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL; em 48 h de análise na concentração de 4

mg/mL. Para o extrato aquoso da mesma planta, não houve alteração da curva de crescimento não

cumulativa.

Comprimento radicular (CR) e taxa de inibição do crescimento radicular (TICR)

Verifica-se na Figura 3 que houve algumas reduções no CR de L. sativa de forma dose-

dependente. O extrato hexânico de P. ramiflora apresentou atividade inibitória em todas as

concentrações testadas (0,5 mg/mL, 27%; 1,0 mg/mL, 31%; 2,0 mg/mL, 58% e 4,0 mg/mL, 67%).

Os dados de CR para o extrato etanólico de P. ramiflora mostram a inibição nas seguintes

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

20

25 0,0 mg/mL

0,5 mg/mL

(A)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

*

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

20

25 0,0 mg/mL

1,0 mg/mL

(B)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

*

*

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

20

25 0,0 mg/mL

2,0 mg/mL

*

(C)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

*0 24 48 72 96 120

0

5

10

15

20

25 0,0 mg/mL

4,0 mg/mL

(D)

*

*

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

20

25 0,0 mg/mL

0,5 mg/mL

1,0 mg/mL

2,0 mg/mL

4,0 mg/mL

(E)

tempo (h)

núm

ero

de

sem

ente

s g

erm

inadas


10

concentrações: 2,0 mg/mL, 61% e 4,0 mg/mL, 75%. O extrato aquoso apresentou inibição somente

na maior concentração (4,0 mg/mL, 38%). O extrato aquoso de P. torta apresentou inibição nas

concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL (45 e 53%, respectivamente); e o extrato hexânico apresentou

ação inibitória nas seguintes concentrações: 1,0 mg/mL, 19%; 2,0 mg/mL, 23% e 4,0 mg/mL, 35%.

O extrato etanólico de P. caimito teve ação inibitória no crescimento da radícula em todas as

concentrações testadas (0,5 mg/mL, 62%; 1,0 mg/mL, 62%; 2,0 mg/mL, 59%; 4,0 mg/mL, 61%), o

extrato aquoso apresentou efeito inibitório nas concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL, 33 e 49%,

respectivamente.


11

Figura 3. Efeito alelopático dos extratos de folhas de espécie do gênero Pouteria sobre o

crescimento de sementes de Lactuca sativa. (A) Extrato hexânico de Pouteria ramiflora; (B)

Extrato etanólico de P. ramiflora; (C) Extrato aquoso de P. ramiflora; (D) Extrato aquoso de P.

torta; (E) Extrato hexânico de P. torta; (F) Extrato etanólico de P. caimito; (G) Extrato aquoso de

P. caimito. As barras representam a média ± desvio padrão. *P<0,05 vs controle, n=9.

Na verificação dos efeitos alelopáticos dos extratos no CR de L. esculentum, Figura 4, o

extrato hexânico de P. ramiflora apresentou efeitos inibitórios nas 3 maiores concentrações em

relação ao controle (1,0 mg/mL, 36%; 2,0 mg/mL, 21%; 4,0 mg/mL, 46%), com discreto estímulo

na concentração de 2,0 mg/mL em relação as outras duas. Os dados de CR para o extrato etanólico

de P. ramiflora mostram inibição da planta-alvo em todas as concentrações testadas (0,5 mg/mL,

47%; 1,0 mg/mL, 49%; 2,0 mg/mL, 56% e 4,0 mg/mL, 75%). O extrato aquoso de P. ramiflora

apresentou inibições somente nas duas maiores concentrações com TICR de 64% (2,0 mg/mL) e

78% (4,0 mg/mL).

Assim como foi observado para L. sativa, o extrato aquoso de folhas de P. torta apresentou

inibição nas concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL (50 e 74%, respectivamente), enquanto o extrato

hexânico apresentou comportamento distinto, sem efeitos fitotóxicos sobre L. esculentum (Figura

4).

Algumas reduções no comprimento radicular (CR) de L. esculentum, Figura 4, também

foram dose-dependentes. O extrato aquoso das folhas de P. caimito inibiu o CR em L. esculentum

em todas as concentrações testadas (0,5 mg/mL, 22%; 1,0 mg/mL, 29%; 2,0 mg/mL, 35%; 4,0

mg/mL, 51%) e o extrato etanólico teve esta ação inibitória nas três maiores concentrações testadas

(1,0 mg/mL, 45%; 2,0 mg/mL, 64%; 4,0 mg/mL, 74%). Assim como nos testes realizados com L.

sativa , o extrato hexânico não apresentou efeito fitotóxico sobre o CR de L. esculentum.


12

Figura 4. Efeito alelopático dos extratos de folhas de espécies do gênero Pouteria sobre o

crescimento de sementes de Lycopersicum esculentum. (A) Extrato hexânico de Pouteria ramiflora;

(B) Extrato etanólico de P. ramiflora; (C) Extrato aquoso de P. ramiflora; (D) Extrato aquoso de P.

torta; (E) Extrato etanólico de P. caimito; (F) Extrato aquoso de P. caimito. As barras representam

a média ± desvio padrão. *P<0,05 vs controle, n=9.

Existe uma grande expectativa de que abordagens genômicas modernas irão identificar

novos alvos e modos de ação de metabólitos de plantas. Algumas moléculas, especialmente

triterpenoides, que promovem apoptose ou autofagia em células tumorais, são de particular interesse

nestes estudos. Embora seja aceito que estes metabólitos secundários e produtos naturais de plantas

estejam envolvidos em diversas atividades, a função de fenóis, quinonas, terpenos, flavonoides e

outros metabólitos de baixo peso molecular permanecem desconhecidos (Morrissey, 2009). Desta

forma, existe a necessidade de conhecimento das espécies vegetais brasileiras, que são utilizadas

pela população como medicinais, sem comprovação de sua atividade farmacológica.

A triagem de extratos brutos possibilita a constatação de atividade fitotóxica para posterior

fracionamento e isolamento na determinação de substâncias específicas responsáveis por esta

atividade, a exemplo do que foi feito por (Kpoviessi et al., 2008) e (Kato-Noguchi, 2003), bem

como sua correlação com atividade antioxidante (Cespedes et al., 2001). Os resultados desse ensaio

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

**

*

(A)

[extrato](mg/mL)

Radíc

ula

(m

m)

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

* * **

(B)

[extrato](mg/mL)

Radíc

ula

(m

m)

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

* * **

(C)

[extrato](mg/mL)

Radíc

ula

(m

m)

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

(D)

*

*

[extrato](mg/mL)R

adíc

ula

(m

m)

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

(E)

** *

[extrato](mg/mL)

Radíc

ula

(m

m)

0,0

0,5

1,0

2,0

4,0

0

50

100

150

* * **

(F)

[extrato](mg/mL)

Radíc

ula

(m

m)


13

preliminar também podem servir de referência para que os extratos selecionados sejam avaliados

como modelo de citotoxicidade, por meio de sua resposta alelopática.

Com base nas respostas obtidas, foi possível constatar que os extratos apresentaram

atividade fitotóxica em, ao menos, um dos parâmetros avaliados (Tabela 4). O extrato etanólico de

P. caimito apresentou fitotoxicidade em todos os parâmetros testados frente às duas plantas-alvo.

Um estudo conduzido por Nascimento et al., (2007) já havia mostrado a ação de extratos das

folhas de P. torta sobre a germinação de L. sativa. Naquele estudo foi verificado também se

alterações de pH, efeito osmótico e iônico estariam influenciando tal inibição, que foi melhor

observada nas maiores concentrações do extrato. Os autores concluíram que não havia interferência

destes fatores e que esta inibição estaria associada a compostos presentes nas folhas de P. torta

(Nascimento et al., 2007). Ao contrário dos resultados publicados, nas condições do nosso

experimento, observamos que os extratos etanólico e hexânico das folhas de P. torta não inibiram a

germinação, mas influenciaram no crescimento radicular de maneira dose-dependente.

Em outro estudo conduzido com frações do extrato de P. ramiflora utilizando substrato solo,

foi verificada a atividade inibitória na germinação de L. sativa (Silva et al., 2006); contudo nos

ensaios in vitro tal resultado não foi observado, ou seja, P. ramiflora não apresentou atividade

inibitória significativa na germinação da planta-alvo. Naquele trabalho, os autores postularam que,

na natureza, essa espécie só influencia no desenvolvimento de outras se a quantidade de folhas em

degradação for capaz de produzir altos teores dos compostos ativos (Silva et al., 2006).

No presente estudo, contudo, o extrato hexânico das folhas de P. ramiflora foi capaz de

inibir tanto a germinação quanto o crescimento radicular, este último, em L. sativa e L. esculentum;

o extrato aquoso de P. ramiflora inibiu o tempo médio de germinação e o CR nas duas plantas-alvo

testadas e o extrato etanólico, com exceção da germinabilidade de L. esculentum, apresentou

atividade inibitória em todos os parâmetros testados (Tabela 4).

Dessa forma, os extratos brutos testados, apresentaram efeito fitotóxico sobre germinação e

crescimento radicular de plântulas de L. sativa e L. esculentum, não sendo constatado neste estudo

qual foi o composto responsável pela ação, visto que o extrato utilizado não foi fracionado.

Contudo, a presença de determinados compostos nesses extratos pode justificar, ao menos em parte,

a atividade observada na espécie-alvo. Miricitrina, considerada marcador do gênero Pouteria, tem

atividade inibitória sobre a germinação de L. esculentum (Nicollier e Thompson, 1983) -sitosterol

inibe a germinação de L. sativa de modo dose-dependente (Macias et al., 1997; Choi et al., 1998). A

atividade alelopática foi observada em triterpenos presentes em espécies de Pouteria tais como

lupeol, ácido ursólico e α-friedelinol (atividade inibitória) e friedelina e acetato de α-amirina

(atividade estimulante) (Chou et al., 2009). Assim, tais compostos podem justificar, ao menos em

parte, a atividade observada nas amostras avaliadas.

Tabela 4. Atividade fitotóxica de extratos brutos de espécies vegetais do gênero Pouteria sobre

sementes de Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum.

ATIVIDADE FITOTÓXICA

ESPÉCIE-ALVO

Lactuca sativa Lycopersicum esculentum

Espécie Extrato G tm CR G tm CR

Pouteria caimito etanólico I I I I I I

hexânico NS NS NS NS I NS


14

aquoso

NS NS I NS I I

Pouteria

ramiflora

etanólico I I I NS I I

hexânico I NS I NS I I

aquoso

NS I I NS I I

Pouteria torta hexânico NS NS I NS I NS

aquoso NS NS I NS NS I

G: germinabilidade; tm: tempo médio de germinação; CR: comprimento radicular; I: inibição; NS:

não significativo.

Os extratos que se mostraram mais promissores foram etanólico de P. caimito e P. ramiflora

(Tabela 4), pois apresentaram atividade inibitória frente a todos os parâmetros testados para L.

sativa, com valores de TIG de 76% e 46%, respectivamente, a 4 mg/mL e com resultados

expressivos quando testado com L. esculentum, com TICR de 61% e 75%, respectivamente, a 4

mg/mL.

Os efeitos fitotóxicos de extratos de plantas têm sido analisados por diversos parâmetros,

tais como tempo médio de germinação e crescimento inicial (Alves et al., 2000; Alves et al., 2004;

Maraschin-Silva e Áquila, 2006) e entropia informacional da germinação (Laboriau, 1983; Aires et

al., 2005; Maraschin-Silva e Áquila, 2006). No presente trabalho são apresentados pela primeira vez

os conceitos de TIG e TICR, que constituem contribuições inéditas para os estudos sobre

fitotoxicidade. São conceitos claros e que possibilitam uma interpretação direta dos resultados, pois

quanto maiores forem estes valores, maior será o efeito inibitório. Além disto, os valores de TIG e

TICR possibilitam relacionar o efeito inibitório dos extratos sobre a germinabilidade e crescimento

da radícula, respectivamente, e valores obtidos no controle. A vantagem disto é a minimização do

efeito de variações nos lotes de sementes nas comparações entre os tratamentos.

CONCLUSÃO

No presente trabalho foram analisados germinabilidade, tempo médio de germinação e

crescimento radicular, parâmetros estes comumente utilizados para avaliação de efeitos fitotóxicos.

São apresentados pela primeira vez os conceitos de TIG e TICR, que constituem contribuições

inéditas para os estudos sobre fitotoxicidade. São conceitos claros e que possibilitam uma

interpretação direta dos resultados, pois quanto maiores forem estes valores, maior será o efeito

inibitório. Além disto, os valores de TIG e TICR possibilitam relacionar o efeito inibitório dos

extratos sobre a germinabilidade e crescimento da radícula, respectivamente, e valores obtidos no

controle. A vantagem disto é a minimização do efeito de variações nos lotes de sementes nas

comparações entre os tratamentos. Assim, considerando que esses conceitos propostos mostraram-

se muito úteis no presente trabalho, é recomendado o uso dos mesmos em estudos sobre alelopatia.

Todos os oito extratos brutos de folhas testados apresentaram algum efeito alelopático sobre

L. sativa e L. esculentum.

Mediante as respostas obtidas com as técnicas empregadas, ressalta-se o resultado alcançado

com o extrato etanólico da Pouteria caimito, que inibiu a atividade alelopática em todos os

parâmetros testados para ambas as sementes. Os resultados desse ensaio preliminar podem servir de

referência para que os extratos selecionados sejam avaliados como modelo de citotoxicidade, por

meio de sua resposta alelopática.


15

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