EFEITO DE GLUCANAS DO FUNGO Caripia montagnei EM ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS

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NATAL

2014






NATAL

2014

Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Bioquímica. Orientadora: Edda Lisboa Leite






Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Bioquímica

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________

Dr. Edda Lisboa Leite

Orientador

___________________________________________________

Dr. Ana Katarina Menezes da Cruz

1º Examinador

____________________________________________________

Dr. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza

2º Examinador

____________________________________________________

Dr. Adeliana Silva de Oliveira

3º Examinador

___________________________________________________

Dr. Eduardo Henrique Cunha de Farias

4º Examinador

Dedico esta Tese:

À Edda Lisboa Leite, melhor orientadora do mundo, os meus sinceros e amorosos agradecimentos por todos esses anos de aprendizado e, principalmente, de

crescimento pessoal e profissional.

À minha mãe, Creuza, por ser o meu anjinho de guarda e zelar tanto por mim em todos os momentos da minha vida. Te amo!

Ao meu marido, Alexsandro, que com toda a sua paciência e amor, torna a minha

vida mais leve e feliz e que me deu o meu bem mais precioso, meu filho!

Aos meus irmãos, Abraão e Daniel, pelo apoio, torcida e amor incondicional, e a Juju e Davi, meus sobrinhos, por colorirem minha vida.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me guiar e proteger em todos os momentos. “À ele toda honra e glória todos os dias da minha vida.” Ao meu pai, Manoel, e a Cecília por todo o amor! À minha família: aos meus avós, Lindalva e Pedro, e às Marias (in memoriam), e aos meus tios, tias, cunhadas, primos e primas, por todo amor, apoio e presença constante na minha vida! Às tias Cleide e Iracema, por todo o mimo e cuidado que sempre tiveram comigo. À minha segunda família: D. Liduina e Nivaldo, meus queridos sogros, sempre nos ajudando e nos enchendo de amor. Grazi, Gilda, Juliana e D Alice, meu carinho por vocês é imenso. Muito obrigada por nos cuidarem sempre tão bem e agradeço a Deus por me trazer uma família tão especial junto com Alexsandro. A Joedyson Emmanuel de Macedo Magalhães, por todas as noites/madrugadas que ele ficou me ensinando e ajudando na realização dos experimentos. Mas, muito mais pela companhia e amizade. Você foi fundamental para a realização deste trabalho! Ao pessoal do laboratório, que entre tapas e beijos, formamos uma grande família. Hugo, Thiago, Celina, Kahena, Joedyson, Almino, Allisson, Luiza, Thuane e Monique. Muito obrigada mesmo por exercitarem minha paciência (hahaha) e por todos os momentos felizes que passamos juntos. E o que fica é muita saudade... E aos antigos também: Lissandra, Cybelle, Micheline, Tarciana, Leila, Mila, Adriane, Júlio César... À Huguinho, por todos os momentos alegres do laboratório. Inclusive por nos provar o quanto a bancada é resistente e por cair da cadeira sempre que necessário! hahaha A Almino, pelas boas conversas nessa longa jornada desde o mestrado. Ao casal mais des-gracioso que existe: Allisson e Luiza. Amor, amizade e lealdade é o que sei que transborda em vocês e que posso buscar sempre que precisar. Lu, valeu pelas madrugadas amedrontadoras e elétricas no laboratório. À Adriane. A vida, às vezes, nos faz tomar rumos diferentes e a distância afasta o que é matéria. Mas essa mesma distância não consegue afastar as boas lembranças, o carinho, a amizade e a gratidão que sentimos. Muito obrigada por tudo e sinto sua falta. À Thuane, uma pessoa linda que Deus colocou pra dar leveza a minha vida e pra me mostrar que ainda existem pessoas de espírito iluminado nessa vida... Muito

obrigada pela imensa ajuda na Cultura e por me poupar de muitos cabelos brancos... À Monique, que me mostrou que existe “amizade à segunda vista”! Muito bom ter descoberto essa pessoa super especial que você é e melhor ainda foi ter encontrado uma amizade verdadeira em você! Aos colegas do BIOPOL por toda a ajuda em todas as etapas deste trabalho. Aos meus amigos de sempre: Jéssica, Érica, Bruna, Silvia, Álvaro, Humberto, Géssica, Tiago DK, Roseane... Muito obrigada por tudo mesmo! À Érica Cristina Pinheiro de Castro e ao Prof. João Paulo Santos Lima, pela ajuda com as análises de catalase. À Leonardo Nobre e Prof. Helena B. Nader INFAR (UNIFESP), pela ajuda com as análises de apoptose a ciclo celular. Á Diego de A. Sabry e ao Prof. Guilherme Sassaki (UFPR), pela ajuda com as análises de ressonância magnética nuclear. Ao Prof. Ademir Oliveira da Silva, pela ajuda com as análises de infravermelho. Aos funcionários do Dep. de Bioquímica por toda a ajuda em todas as etapas da realização deste trabalho, em especial aos sempre prestativos Ângela e Jonas. À banca de qualificação pelos valiosos questionamentos e correções realizados. Aos professores do Departamento por transmitir o conhecimento necessário e ajudar na caminhada dessa longa jornada. À CAPES e ao CNPQ pelo suporte financeiro.

“Crianças gostam de fazer pergunta sobre tudo. ... Nem todas as respostas cabem num adulto.”

Arnaldo Antunes

RESUMO

Compostos derivados de fungos tem sido alvo de muitos estudos a fim de desenvolver o conhecimento acerca de seu potencial bioativo. Polissacarídeos de Caripia montagnei já foram descritos por possuírem propriedades anti-inflamatória e antioxidante. Neste estudo, os polissacarídeos extraídos do fungo Caripia montagnei foram caracterizados quimicamente e seus efeitos sobre as lesões intestinais foram avaliados em diferentes intervalos de tratamento no modelo de colite induzida por ácido 2,4,6 - trinitrobenzenossulfónico (TNBS), verificou-se ainda sua ação sobre células do carcinoma de cólon humano, HT-29. Na análise realizada no extrato obtido de C. montagnei foi verificado que este é formado principalmente, por carboidratos (96%) apresentando um baixo teor de compostos fenólicos (1,5%) e baixa contaminação protéica (2,5%). As análises por espectroscopia de infra vermelho (FT-IR) e ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram que os polissacarídeos desta espécie de fungo são α e β -glucanas. O dano colônico foi avaliado por análises macroscópicas, histológicas, bioquímicas e imunológicas. Os resultados mostraram a redução das lesões no cólon em todos os grupos tratados com as glucanas (GCM). GCM reduziram significativamente os níveis de IL-6 (50 e 75 mg/Kg, p < 0,05), uma importante citocina inflamatória. As análises bioquímicas mostraram que essas glucanas atuaram na redução dos níveis de fosfatase alcalina (75 mg/Kg, p < 0,01), óxido nítrico (p < 0,001) e mieloperoxidase (p < 0,001). Estes resultados foram confirmados pela redução da infiltração celular observado microscopicamente. O aumento da atividade da catalase, sugere um efeito protetor de GCM no tecido do cólon, o que confirma o seu potencial anti-inflamatório. GCM mostraram atividade citostática sobre as células HT-29, causando acúmulo de células na fase G1 e impedindo, assim, a progressão do ciclo celular. As glucanas deste estudo também mostraram habilidade em modular a adesão de células HT-29 ao Matrigel® e reduzir o estresse oxidativo nessas células. A atividade antiproliferativa contra células HT-29 exibida por GCM pode ser atribuída à sua ação citostática ou indução da apoptose por essas glucanas. Palavras-chave: Glucanas; Caripia montagnei; Colite; TNBS; inflamação; Proliferação celular; HT-29.

ABSTRACT

Compounds derived from fungi has been the subject of many studies in order to broaden the knowledge of their bioactive potential. Polysaccharides from Caripia montagnei have been described to possess anti-inflammatory and antioxidant properties. In this study, glucans extracted from Caripia montagnei mushroom were chemically characterized and their effects evaluated at different doses and intervals of treatment. It was also described their action on colonic injury in the model of colitis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), and its action on cells of the human colon carcinoma (HT-29). Compounds extracted of C. montagnei contain high level of carbohydrates (96%), low content of phenolic compounds (1.5%) and low contamination with proteins (2.5%). The (FT-IR) and (NMR) analysis showed that polysaccharides from this species of mushroom are composed of α- and β-glucans. The colonic damage was evaluated by macroscopic, histological, biochemical and immunologic analyses. The results showed a reduction of colonic lesions in all groups treated with the glucans of Caripia montagnei (GCM). GCM significantly reduced the levels of IL-6 (50 and 75 mg/kg, p < 0.05), a major inflammatory cytokine. Biochemical analyses showed that such glucans acted on reducing levels of alkaline phosphatase (75 mg/kg, p < 0.01), nitric oxide (p < 0.001), and myeloperoxidase (p < 0.001). These results were confirmed microscopically by the reduction of cellular infiltration. The increase of catalase activity suggest a protective effect of GCM on colonic tissue, confirming their anti-inflammatory potential. GCM displayed cytostatic activity against HT-29 cells, causing accumulation of cells in G1 phase, blocking the cycle cell progression. Those glucans also showed ability to modulate the adhesion of HT-29 cells to Matrigel® and reduced the oxidative stress. The antiproliferative activity against HT-29 cells displayed by GCM (p <0.001) can be attributed to its cytostatic activity and induction of apoptosis by GCM. Keywords: Glucans; Caripia montagnei; Colitis; TNBS; Inflammation; Cell proliferation; HT-29.

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Sequência de eventos envolvidos no recrutamento de leucócitos. Fonte: Adaptado de BOGLIOLO, 2006......................................................................20 FIGURA 2: Receptores de adesão celular. Fonte: HYNES, 1994..........................21 FIGURA 3: Esquema simplificado do ínício da cascata imunológica. Fonte: Adaptado de POVOA, 2009.......................................................................................23 FIGURA 4: Estágios da carcinogênese química e a evolução de cada etapa. Fonte: Adaptado de OLIVEIRA et al., 2007...............................................................31 FIGURA 5: Fórmulas estruturais de algumas glucanas. I. α-(1.4)(1.6)- glucana; II. β-(1.3)(1.6)-glucana, substituída por unidades glucosídicas com freqüência variada; III. β - (1 .3)(1 .6)-glucana, substituída por unidades glucosídicas e/ou gentiobiosídicas a cada cinco unidades da cadeia principal. Fonte: SILVA et al., 2006............................................................................................................................40 FIGURA 6: Fungo Caripia montagnei. Fonte: Arquivo próprio................................45 FIGURA 7: Desenho experimental do estudo desenvolvido com o fungo Caripia

montagnei.................................................................................................................48

FIGURA 8: Fluxograma de obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei. Legenda: PPT: Precipitado.........................................................................................50

FIGURA 9: Esquema do ensaio de colite induzida por TNBS..............................54

FIGURA 10: Composição química do composto extraído dos corpos de frutificação do fungo Caripia montagnei...............................................................61 FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa seguido de precipitação com etanol do fungo montagnei Caripia......................62 FIGURA 12: Caracterização química das glucanas de Caripia montagnei (GCM). (A) Espectro de RMN de 1H; (B) Espectro de HSQC................................................64 FIGURA 13: Lesões macroscópicas no cólon de ratos (n = 3) com colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). (A): Animais do controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada 12 e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos 12 e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com 1 mg / Kg de dexametasona; (K) o efeito de GCM na inflamação do cólon. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. *** p <0,001........................................................................................................................66

http://www.uninet.edu/

FIGURA 14: Efeito de GCM na atividade da enzima mieloperoxidase na inflamação intestinal de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001...........................................................................................................................67 FIGURA 15: Avaliação do efeito de GCM sobre a atividade da fosfatase alcalina no tecido do colônico de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.............................................................................................................................68 FIGURA 16: Efeito de diferentes doses de GCM na catalase do tecido do cólon em animais com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ** p < 0,01; *** p < 0,001......................................................69 FIGURA 17: Efeito de diferentes doses de GCM no teor de óxido nítrico no tecido do cólon no modelo de colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001...........................................70 FIGURA 18: Efeito de GCM na modulação da liberação de citocinas (A) IL-1 e (B) IL-6 no tecido do cólon (n = 4) com inflamação induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.................72 FIGURA 19: Análise histológica do cólon de diferentes grupos de animais com colite induzida por TNBS. (A): animais do controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com a 1 mg / Kg de dexametasona............................................................................................................73 FIGURA 20: Efeito de diferentes doses de GCM na viabilidade de células do carcinoma de cólon humano (HT-29) nos períodos de incubação de 24, 48 e 72 horas. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. (a): p < 0,01; (b): p < 0,001....................................................................................................................75 FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V-FITC e PI em células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram tratadas com 50 ou 100 μg de GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM, (C): células tratadas com 100 μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito: marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia); quadrante inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células viáveis); quadrante inferior direito: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células não viáveis – apoptose precoce).......................................76 FIGURA 22: Efeito de GCM na viabilidade das células de carcinoma de cólon humano (HT-29) avaliada por citometria de fluxo. Células viáveis: marcação negativa para anexina V-FITC (V) e PI; Células não viáveis: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células em apoptose precoce); marcação

negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células em necrose); marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células em apoptose tardia). Valores foram expressos por médias ± desvio padrão. (a): p < 0,005; (b): p < 0,001.......................77 FIGURA 23: Análise da distribuição no ciclo celular das células do carcinoma de cólon humano (HT-29). (A): distribuição do ciclo celular das células não tratadas (células controle), (B): distribuição do ciclo celular das células tratadas com 50 μg de GCM, (C): distribuição do ciclo celular das células tratadas com 100 μg de GCM...........................................................................................................................78 FIGURA 24: Efeito de GCM sobre a adesão de células do carcinoma de cólon humano (HT-29) ao matrigel. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001..................................................................................................80 FIGURA 25: Avaliação da atividade antioxidante in vitro de GCM em células do carcionoma de cólon humano (HT-29). Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05...........................................................................................81

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Avaliação do efeito de GCM na distribuição das células do carcinoma de cólon humano (HT-29) no ciclo celular. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. Fases do ciclo celular - G1: gap 1; G2: gap 2; S: fase de síntese...................................................................................................................79

LISTA DE ABREVIATURAS

µg micrograma

µL microlitro

CAT Catalase

CACRN Neoplasia colorretal associada a colite

CCR Câncer colorretal

CIN Instabilidade cromossômica

COX2 Ciclooxigenase 2

CUC Colite ulcerativa crônica

DC Doença de Crohn

DCFH Diclorofluoresceína

DCFH-DA Diclorofluoresceina-diacetato

DII Doença inflamatória intestinal

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FA Fosfatase alcalina

FT-IR Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier

GCM Glucanas de Caripia montagnei

H2O2 Peróxido de hidrogênio

H&E Hematoxilina e Eosina

ICAMs Moléculas de adesão intercelulares

IFN-γ Interferon gamma

IL-1 Interleucina 1

IL-2 Interleucina 2

IL-6 Interleucina 6

iNOS Óxido nítrico sintetase induzível

MEC Matriz extracelular

MPO Mieloperoxidase

MTT brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio

NF-κB Fator nuclear κB

nm Nanômetros

NO Óxido nítrico

NO2 íon nitrito

NO3 íon nitrato

ºC graus centígrados

PI Iodeto de propídio

PPT Precipitado

RMN Ressonância magnética nuclear

ROS Espécies reativas de oxigênio

TNBS Ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico

UC Colite ulcerativa

VCAMs Moléculas de adesão vascular

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18

1.1 INFLAMAÇÃO 18

1.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS 24

1.3 CÂNCER 29

1.4 COLITE E CÂNCER COLORRETAL (CCR) 32

1.4.1 Tratamentos atuais 36

1.5 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS E SEU POTENCIAL BIOATIVO 37

2 OBJETIVOS. 43

2.1 OBJETIVO GERAL 43

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 43

3 MATERIAIS E MÉTODOS 45

3.1 MATERIAIS 45

3.1.1 Fungo 45

3.1.2 Animais 46

3.1.3 Reagentes e aparelhos 46

3.2 MÉTODOS 47

3.2.1 Extração aquosa dos polissacarídeos de Caripia montagnei 49

3.2.2 Caracterização química dos polissacarídeos do fungo Caripia

montagnei 51

3.2.2.1 Análises colorimétricas 51

3.2.2.1.1 Açúcares totais 51

3.2.2.1.2 Proteínas 51

3.2.2.1.3 Sulfato 51

3.2.2.1.4 Fenóis totais 51

3.2.2.2 Análise da composição monossacarídica 52

3.2.2.3 Análise de infravermelho 52

3.2.2.4 Ressonância magnética nuclear (R.M.N) 52

3.2.3 Avaliação das atividades farmacológicas de GCM 53

3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite ulcerativa induzida por

ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) 53

3.2.3.1.1 Tratamento 53

3.2.3.1.2 Análise macroscópica 54

3.2.3.1.3 Avaliação da atividade da mieloperoxidase 55

3.2.3.1.4 Avaliação da atividade da fosfatase alcalina 55

3.2.3.1.5 Avaliação da atividade da catalase 56

3.2.3.1.6 Análise de citocinas 56

3.2.3.1.7 Análises histológicas 56

3.2.4 Ação de GCM sobre células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

56

3.2.4.1 Ação de GCM na proliferação celular in vitro (Ensaio de MTT) 56

3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas

células do carcinoma de cólon humano (HT-29) 57

3.2.4.2.1 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI 57

3.2.4.2.2 Ensaio da distribuição das células no ciclo celular 58

3.2.4.3 Ensaio de atividade antioxidante in vitro 59

3.2.4.4 Ensaio de adesão 59

3.2.5 Análises estatísticas 60

4 RESULTADOS 61

4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 61

4.1.1 Espectro FT-IR 62

4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear 63

4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE GCM NO MODELO DE INFLAMAÇÃO

COLÔNICA INDUZIDA POR TNBS EM RATOS WISTAR 65

4.2.1 Análise macroscópica 65

4.2.2 Atividade da mieloperoxidase 67

4.2.3 Atividade da fosfatase alcalina 68

4.2.4 Atividade da catalase 69

4.2.5 Óxido nítrico 70

4.2.6 Análise de citocinas 71

4.2.7 Análises histológicas 72

4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON

HUMANO (HT-29) 74

4.3.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT) 74

4.3.2 Ensaio de apoptose 75

4.3.3 Ensaio de distribuição do ciclo celular 77

4.3.4 Ensaio de adesão 79

4.3.5 Ensaio de atividade antioxidante 80

5 DISCUSSÃO 82

6 CONCLUSÕES 92

REFERÊNCIAS 94

1 INTRODUÇÃO

1.1 INFLAMAÇÃO

A inflamação é um mecanismo de defesa natural do organismo a qualquer

agressão eventualmente sofrida (COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2010). Sua

intensidade mostra-se diretamente proporcional ao tamanho do trauma sofrido.

Trata-se de um processo importantíssimo para a manutenção da saúde dos

indivíduos, sendo a maneira pela qual o organismo reage contra agentes

potencialmente danosos como: bactérias, vírus e outros patógenos (GROBMYER et

al., 2000).

O processo inflamatório consiste de fases ou momentos que são compostos

por eventos celulares e humorais inter-relacionados que muitas vezes superpõem-se

durante o processo. A fase irritativa corresponde à injúria tecidual, caracterizada por

modificações funcionais ou morfológicas nos tecidos e posterior liberação de

mediadores do processo inflamatório. As fases vascular e exsudativa correspondem

às alterações vasculares como vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular

com posterior exsudação plasmática e celular. E por fim, ocorre proliferação

conjuntiva e vascular reparadora, e, nos casos crônicos, modificações das células do

exsudato, eventos que correspondem à fase reparativa (PEREIRA; BOGLIOLO,

2006).

A resposta inicial do corpo a um trauma ou a uma infecção é chamada de

resposta inflamatória aguda (JANEWAY et al., 2004). Com a persistência do agente

lesivo, inicia-se a fase crônica, de longa duração e, na maioria das vezes, também

associada à presença de células (linfócitos, macrófagos, dentre outras), bem como à

angiogênese, fibrose e necrose de tecidos (ROBBINS; KUMAR; ABBAS, 2005). A

inflamação envolve, entre outros fatores, a ação do sistema complemento, sistema

de coagulação, resposta imunológica humoral e celular, citocinas, hormônios,

angiogênese e processos de reparo.

Desta forma, a primeira linha de defesa do hospedeiro é realizada por células

fagocitárias (macrófagos e neutrófilos), cuja função é englobar e destruir os

microorganismos e pela via alternativa do complemento, agindo de maneira não-

específica. Logo após, as imunoglobulinas e os linfócitos iniciam uma resposta

imune específica (DAS, 2000).

Um dos principais eventos que ocorre durante a inflamação é a migração de

leucócitos, sua marginação e adesão. A migração dos leucócitos para os sítios de

inflamação é crucial para as suas funções celulares tanto na imunidade inata quanto

na adaptativa (VAN MIERT, 2002).

Esse extravasamento dos leucócitos para o tecido extravascular está

relacionado a interações específicas entre os leucócitos e as células endoteliais. Os

eventos que estão envolvidos neste processo de recrutamento de leucócitos podem

ser visualizados na FIGURA 1. O recrutamento de leucócitos envolve a ativação;

marginação dos leucócitos circulantes no compartimento vascular; rolamento;

adesão; com posterior movimento através da barreira das células endoteliais,

diapedese (NOURSHARGH; MARELLI-BERG, 2005); seguido da migração

quimiotática dos mesmos (WAGNER; ROTH, 2000; WALZOG; GAEHTGENS, 2000).

Para que os leucócitos atravessem o endotélio e alcancem os locais de inflamação,

eles se utilizam de moléculas de adesão para se ligarem à superfície endotelial

vascular e migrarem para os tecidos adjacentes (MACKAI; ROSEN, 2000). Estes

fenômenos decorrem da ação de mediadores inflamatórios que induzem as células

do endotélio vascular a expressarem moléculas de adesão. Essas moléculas vão

interagir com receptores superficiais de leucócitos, os quais também passam a

expressar moléculas adesivas em sua superfície, que se ligam a receptores de

células endoteliais (MACKAI; ROSEN, 2000; NOURSHARGH; MARELLI-BERG,

2005).

FIGURA 1: Sequência de eventos envolvidos no recrutamento de leucócitos. Fonte: Adaptado

de BOGLIOLO, 2006.

As moléculas de adesão compõem um grupo heterogêneo de receptores de

superfície que medeiam o contato entre duas células ou entre a célula e a matriz

extracelular. Além disso, também atuam como moléculas sinalizadoras, participando

da regulação da inflamação e da resposta imunitária (VON ANDRIAN; MACKAI,

2000). Essas moléculas estão presentes nos leucócitos, células epiteliais e

endoteliais e são divididas em quatro grupos de acordo com características

moleculares comuns: integrinas, imunoglobulinas, caderinas e selectinas (FIGURA

2) (SZEKANECZ; KOCH, 2004). O rolamento de leucócitos é facilitado pelas

integrinas juntamente com as imunoglobulinas, que durante o processo inflamatório

estão aumentadas. As integrinas são heterodímeros que formam uma classe

especial de receptores constituídos por subunidades α e β, ambas cooperando para

a formação dos domínios usados para acoplamento (HYNES, 1987, 1992).

Diferentes interações entre essas subunidades possuem especificidade para

componentes da matriz extracelular e ligantes da superfície celular (BURRIDGE et

al., 1988; ARNAOUT, 1990; SPRINGER, 1994).

FIGURA 2: Receptores de adesão celular. Fonte: HYNES, 1994.

Na superfamília das imunoglobulinas estão incluídas as moléculas de adesão

intercelulares (ICAMs) e as moléculas de adesão vascular (VCAMs). Dentro deste

grupo podem ser destacadas a ICAM-1 (CD54), ICAM-2 e VCAM-1, como também

as moléculas ICAM-3, ICAM-4 e ICAM-5. Essas moléculas são homodímeros

glicoproteicos que possuem vários domínios extracelulares que mostram

semelhanças estruturais com os domínios das imunoglobulinas (VON ANDRIAN;

MACKAY, 2000).

As caderinas são proteínas membranares, dependentes de cálcio e

pertencentes à família de proteínas de adesão homofílicas, atuando como ligante e

receptor, sendo expressas por vários tipos de tecidos (KNUDSEN; WHEELOCK,

2005; MATOS et al., 2006).

As selectinas são glicoproteínas transmembranares, monoméricas e que se

ligam a açúcares de superfície conhecidos como lectinas. A interação das selectinas

aos seus ligantes resulta na diminuição da velocidade de migração dos leucócitos,

no qual as integrinas promovem a ligação dos neutrófilos ao endotélio. Denominadas

de acordo com os tecidos onde elas foram identificadas, as selectinas são

classificadas em L-selectina, E-selectina e P-selectina (LEY, 2003; KHAN; LANDIS;

MALHOTRA, 2003).

Um mecanismo essencial na resposta inflamatória é o recrutamento de

macrófagos para atuar contra microorganismos invasores ou suas toxinas

(HAVSTEEN, 2002). Macrófagos são células diversamente distribuídas pelo

organismo e são responsáveis por numerosos processos imunológicos,

homeostáticos e inflamatórios, constituindo uma defesa imediata contra elementos

estranhos ao corpo (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000).

Foram identificados dois meios distintos pelos quais os macrófagos podem

ser ativados: a ativação clássica e a ativação alternativa. A ativação clássica de

macrófagos desencadeia a produção de óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias,

além de estimular a fagocitose e a capacidade de eliminar o patógeno. Enquanto a

ativação alternativa leva a secreção de citocinas anti-inflamatórias e redução da

fagocitose e capacidade de eliminar o patógeno (GORDON, 2003).

Dentre as principais funções destas células relacionadas ao processo

inflamatório podem ser citados o processamento e apresentação de antígenos, a co-

ativação de linfócitos T e B, a capacidade de fagocitose, a angiogênese, o processo

de hematopoiese e reparo tecidual, além da atividade citotóxica contra células

tumorais e microorganismos (WING; REMINGTON, 1980; CAVAILLON, 1994;

POPOV et al., 1999; VADIVELOO et al., 2000; COOK et al., 2001). Além disso, os

macrófagos (FIGURA 3) secretam moléculas sinalizadoras, citocinas e quimiocinas,

as quais amplificam a resposta inflamatória e influenciam sua evolução (ABBAS;

LICHTMAN; POBER, 2000).

FIGURA 3: Esquema simplificado do ínício da cascata imunológica. Os macrófagos, estimulados

produzem citocinas como TNF-α e IL-1. Estes dois mediadores são responsáveis por uma série de

eventos que incluem adesão, ativação da coagulação e do sistema complemento bem como a

produção de outros mediadores pro-inflamatórios concomitante com a liberação de fatores anti-

inflamatórios. Fonte: Adaptado de POVOA, 2009.

1.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS

Doenças inflamatórias intestinais (DII’s) são condições inflamatórias

progressivas ou crônicas remitentes que podem afetar todo o trato gastrointestinal e

mucosa do cólon, e estão associadas com um aumento do risco de desenvolvimento

do câncer de cólon (KASER; ZEISSIG; BLUMBERG, 2010).

http://www.uninet.edu/

O primeiro relato de DII publicado na literatura médica ocorreu em 1761,

descrito por Giovanni Battista Morgagni, relatando um caso de “enterocolite

granulomatosa” fatal.

As principais manifestações clínicas das DII's são o desconforto ou dor

abdominal com alteração dos hábitos intestinais (disenteria ou constipação), perda

ponderal e náuseas (STEIDLER et al., 2000; SINGH et al., 2003).

A DII é caracterizada pelas suas duas maiores formas de desordem do trato

gastrointestinal que são a Colite Ulcerativa (UC) e a Doença de Crohn (DC). Essas

doenças compreendem condições multifatoriais por ter uma base genética que

confere predisposição ao indivíduo e que provavelmente envolve uma resposta do

sistema imunológico a algum agente ambiental (KASER; ZEISSIG; BLUMBERG,

2010).

As taxas mais altas de incidência de DII's são encontradas em países

desenvolvidos do hemisfério norte como os EUA, o Reino Unido, a Noruega e a

Suécia. Essas doenças afetam cerca de 1,4 milhões de pessoas nos Estados

Unidos e 2,2 milhões na Europa (FREITAS, 2002; LOFTUS, 2004; PICCO;

SANDBORN; LASHNER, 2007; LOFTUS et al., 2007; NEUMAN, 2007). Já os países

subdesenvolvidos apresentam menor incidência com taxas de 2-8 por 100.00

habitantes para a Colite ulcerativa e 0,1 a 4 por 100.000 habitantes para a Doença

de Crohn (FREITAS, 2002). Em um estudo desenvolvido no Estado de São Paulo

em 2009 foi observado que a incidência da UC (4,48 casos/100.000 habitantes) foi

maior que a da DC (3,5 casos/ 100.000 habitantes), embora a incidência da colite

ulcerativa tenha mostrado uma redução do período de 5 anos (VICTORIA;

SASSAK; NUNES, 2009). Entretanto, ainda não há uma relação causa-efeito bem

estabelecida para este fato.

Dados epidemiológicos acerca das DII’s no Brasil ainda são escassos, mas

nota-se uma tendência mundial para o aumento da incidência, principalmente nos

países em desenvolvimento, o que inclui o Brasil (SOUZA et al., 2002; TORRES et

al., 2011).

Este aumento da incidência poderá resultar de uma melhoria das condições

socioeconômicas neste país, uma vez que esta doença apresenta uma maior

incidência em países socioeconomicamente mais desenvolvidos (PICCO;

SANDBORN; LASHNER, 2007; FAUCI et al, 2008) .

As DII’s geralmente afetam indivíduos de qualquer idade, no entanto, apresenta

duas faixas de maior incidência: uma entre os 15 e os 30 anos e uma segunda faixa

entre os 50 e 70 anos, sendo este último mais frequentemente associado a casos de

DC (LOFTUS, 2004).

A colite ulcerativa é uma doença caracterizada por episódios inflamatórios

recorrentes que acometem predominantemente a mucosa do cólon. A colite afeta o

reto e porções variáveis proximais do cólon de forma contínua (JEWELL, 1998;

GHOSH; SHAND; FERGUSON, 2000).

A doença de Crohn é um processo inflamatório crônico de origem

desconhecida e que acomete o trato gastrointestinal, mais freqüentemente o

intestino delgado e grosso, onde pode ocorrer a formação de abscessos severos e

recorrentes, aparecimento de perfurações, estenoses e fístulas com órgãos

adjacentes (GASCHE, 2000; KNIGGE, 2002; TEIXEIRA, 2000; FIOCCHI, 1998).

As doenças inflamatórias intestinais são condições clínicas complexas cuja

etiopatogenia envolve vários fatores condicionantes que são permissivos como o

fator genético, ambiental, flora entérica e a presença de possíveis agentes

infecciosos, bem como os mecanismos efetores que medeiam o tecido danificado. O

que geralmente acontece é que componentes de algumas destas categorias se

unem para induzir a manifestação clínica de doença inflamatória intestinal

(FIOCCHI, 2000; HANAUER, 2006).

Inicialmente na patogênese da DII há uma predisposição genética, ou seja,

genes levam a desregulação do sistema imune da mucosa e/ou a defeitos na função

de barreira, no suprimento vascular ou enervação. Posteriormente, um antígeno

inicia a resposta inflamatória (KIRSNER, 2000).

Um fator genético relacionado à fisiopatologia da DII estudado em 2001 foi o

gene CARD15. Neste estudo foi descrita uma associação entre mutações no gene

CARD15, o qual codifica a proteína NOD-2, com a ocorrência da DC, em indivíduos

com mutações neste gene ( HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001). Mutações

em NOD-2 afetam a capacidade desta proteína ativar adequadamente a expressão

de NF-KB, um fator necessário para manter uma adequada homeostasia intestinal

(BELTRÁN et al., 2005; PAULSEN; ROSTION, 2007).

É provável que as DII também possam decorrer de anormalidades

imunológicas como a resposta anormal dos linfócitos T da mucosa gastrointestinal à

microflora normal não patogênica do indivíduo geneticamente susceptível

(MATSUMOTO et al., 2001).

Outras evidências sugerem, ainda, que a atividade inflamatória intestinal

crônica seja desencadeada a partir de bactérias pertencentes à flora normal que, em

condições ainda desconhecidas, passam a assumir um papel patológico capaz de

ativar o sistema imunológico local (PINHO, 2008; STROBER; FUSS; MANNON,

2007).

As causas exatas permanecem incertas, mas, o que se observou até agora é

que a inflamação intestinal é o resultado de uma ativação contínua e anormal do

sistema imunitário mucoso impulsionado pela flora normal de um hospedeiro

geneticamente suscetível (SARTOR, 2006; BAUMGART; CARDING, 2007).

Adicionalmente, ao desenvolvimento de uma resposta imunológica anormal

ocorre a resposta inflamatória, a qual é mediada predominantemente por neutrófilos

ativados, monócitos e macrófagos e caracterizada por uma maior formação de

espécies reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio (MARTIN et al. 2006). A

resposta à ativação de células imunes na mucosa intestinal, incluindo os

macrófagos, é o desencadeamento da superprodução de citocinas, tais como TNF,

IL-12 e IL-23 (KAMADA et al., 2005; BAY; OUYANG, 2006). As células do sistema

imune em conjunto com estas citocinas pró-inflamatórias, contribuem para manter a

resposta inflamatória descontrolada culminando no dano tecidual intestinal

(MAHIDA, 2000; OGATA; HIBI, 2003).

Além disso, essas respostas podem ativar diversas vias de sinalização que

conduzem à ativação de fatores de transcrição como o fator nuclear kappa (NF-κB)

ou ativador da proteína 1 (AP-1), modulando uma série de diferentes etapas da

cascata inflamatória. Estes incluem a produção de citocinas pró-inflamatórias como

o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), IL -1, Interferon gamma (INF-γ), IL-12 e IL-6

em diferentes tipos de células, a desgranulação de neutrófilos, assim como a

expressão de importantes moduladores da resposta inflamatória como

ciclooxigenase (COX-2) e óxido nítrico sintase indutível (iNOS) (COLLINO et al.,

2006; PECCHI et al., 2009.). Dessa forma, o desequilíbrio entre citocinas pró-

inflamatórias e anti-inflamatórias e a alteração de proteínas inflamatórias incluindo

COX-2 e iNOS, que são expressas como uma resposta rápida a mediadores pró-

inflamatórios e estímulos mitogénicos, desempenham um papel importante na

fisiopatologia da doença (TALERO et al., 2008). Além disso, estudos recentes

relataram que a ativação de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs),

tais como c-Jun N-terminal quinase (JNK) desempenha um importante papel na

inflamação intestinal em pacientes com DII (ROY et al., 2008).

A destruição imunológica na DII resulta em anormalidades funcionais como a

perda da capacidade absortiva normal e a secreção aumentada de eletrólitos e

fluidos intestinais, manifestando-se clinicamente como má absorção e diarréia

(KIRSNER, 2000).

Vários modelos animais de inflamação intestinal, têm sido desenvolvidos

(HIBI et al., 2002). Entre eles, a colite induzida com ácido trinitrobenzeno sulfónico

(TNBS), tem sido amplamente utilizada (TOZAKI et al, 2002; JUNG et al, 2006;

CRCAREVSKA et al, 2009). O TNBS é utilizado por ser um hapteno e presume-se

que ele se liga a proteínas endógenas na mucosa do cólon e induz uma resposta

imunológica local através de macrófagos e ativação da célula T (ISHIGURO et al.,

2010).

Inflamação da mucosa na UC é caracterizada por um infiltrado de células das

quais são citadas as células plasmáticas, eosinófilos e neutrófilos que se

correlacionam com a severidade da doença (GEBOES et al., 2000; 2003).

Intervenções direcionadas ao sistema imunológico, incluindo os anticorpos anti-

fator de necrose tumoral-α (TNF)-α têm demonstrado eficácia clínica em pacientes

com UC moderada e grave, incluindo a colite distal. Isto sugere a participação da

ativação de citocinas da cascata inflamatória na UC e o seu valor como um alvo

terapêutico potencial. No entanto, podem haver alvos alternativos neste grupo de

pacientes (RUTGEERTS et al., 2005; HUANG et al., 2011; FILIPPI et al., 2011).

Ainda é conflitante o perfil de resposta que direciona a liberação de citocinas

(MASUDA et al., 1995; INOUE et al., 1999; STROBER; FUSS, 2011).

Uma série de fatores podem contribuir para os achados inconsistentes na

literatura, como a heterogeneidade natural dos perfis basais de citocinas, bem como

a influência das características do paciente, incluindo regimes de medicamentos ou

fatores epidemiológicos (YAGOOB; NEWSHOLME; CALDER, 1999).

Também foram observados que as espécies reativas de oxigenio iniciam um

importante papel nas doenças inflamatórias intestinais. O aumento da produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS) resultante da explosão respiratória (burst

respiratório) da infiltração de células fagocíticas que causam e diminuem a

capacidade antioxidante, é tido como um importante mecanismo patogênico

(MOHSEN et al., 2011).

O processo inflamatório tem sido epidemiologicamente associado com o câncer

desde 1863 por Virchom, mas apenas nos últimos 10 anos tornou-se evidente que

um microambiente inflamatório é um componente essencial na defesa e/ou

desenvolvimento de tumores (MANTOVANI et al., 2008; HANAHAN; WEINBERG,

2011).

1.3 CÂNCER

Segundo a última estimativa mundial, o câncer de cólon e reto configura-se

como o terceiro tipo de câncer mais comum entre os homens e o segundo entre as

mulheres. No entanto, o câncer colorretal figura entre as cinco primeiras causas de

morte por câncer no Brasil. Estima-se que para o ano de 2014, surjam 15070 novos

casos de câncer de cólon e reto em homens e 17530 em mulheres. Esses valores

correspondem a um risco estimado de 15,44 casos a cada 100 mil homens e 17,24 a

cada 100 mil mulheres. Mais especificamente no Nordeste, o câncer colorretal é o 3º

de incidência mais comum em homens e o 2º em mulheres (INCA, 2014).

Câncer é um termo genérico utilizado para designar uma doença que é

caracterizada pelo descontrole no crescimento e propagação de formas anormais de

células corporais (LEMKE; WILLIANS, 2008).

Carcinogênese é o processo de formação e desenvolvimento de neoplasias.

Este processo envolve mutações seqüenciais que dá as células mutantes

dominância no crescimento em relação às células vizinhas normais, resultando em

um aumento das células mutadas. A carcinogênese é um processo composto por

várias etapas e essas etapas refletem as alterações genéticas que conduzem para a

transformação progressiva do tecido normal a condições malignas (HANAHAN;

WEINBERG, 2000).

Em geral, os termos câncer, neoplasia maligna e tumor maligno são utilizados

como sinônimos e apresentam características que os diferem dos chamados

tumores benignos pela sua capacidade de invasão e metástase. Entretanto, tanto os

tumores malignos como os benignos apresentam proliferação descontrolada,

causando mutações genéticas que decorrem em conseqüência dos padrões

alterados das anormalidades celulares e perda de função (RANG, 2004).

As células cancerosas apresentam algumas características que as distinguem

das células normais: potencial replicativo ilimitado, perda de função, perda de

inibição por contato, poder de invasão, imortalidade e capacidade de sofrer

metástases (HANAHAN; WEINGERG, 2000). Com relação as características

morfológicas das células, podem ocorrer anormalidades nucleares, citoplasmáticas,

perda de inibição por contato e modificação na adesividade (APTSIAURI et al.,

2007).

No câncer ocorrem mudanças citogenéticas através de uma série de

mutações sequenciais somáticas em genes específicos. Este fato pode ocorrer em

decorrência da exposição a um ou vários agentes químicos ou físicos, erros de

replicação de genes, pelas mudanças nos genes que controlam a progressão do

ciclo celular e do processo de reparação do DNA. As alterações somáticas em

conjunto com os eventos epigenéticos que se relacionam com alterações na

expressão (fenótipo), determinam o desenvolvimento da transformação maligna

(FELLER et al., 2010).

Muita atenção tem sido dirigida para elucidar a relação entre a metilação do

DNA e o desenvolvimento de câncer. Na verdade, acredita-se que padrões

aberrantes de metilação do DNA podem servir como poderosos biomarcadores de

avaliação, diagnóstico e risco (LAIRD, 2005).

Foi sugerido que a organização complexa normal da metilação do DNA e

conformação da cromatina (conhecida por regular a homeostase celular normal de

padrões de expressão gênica) de alguma forma se torna

irreconhecível nas células cancerosas que levam a expressão de perfis aberrantes

de diversos genes (ESTELLER; HERMAN, 2002).

Especificamente, os dados indicam que a hipermetilação das regiões ricas em

GC (guanina e citosina) do DNA (chamadas ilhas CpG) desempenham um

importante papel no desenvolvimento do câncer, principalmente pela sua

capacidade de inativar e assim silenciar genes supressores de tumor (NEPHEW;

HUANG, 2003).

A carcinogênese, como um processo complexo, compreende algumas etapas

como a iniciação, a promoção e a progressão tumoral (FIGURA 4).

FIGURA 4: Estágios da carcinogênese química e a evolução de cada etapa. Fonte: Adaptado de

OLIVEIRA et al., 2007.

A iniciação tumoral é ocasionada por mudanças genéticas irreversíveis que

predispõem células normais suscetíveis a evolução maligna e imortalidade. A célula

iniciada não é uma célula neoplásica, mas tomou o seu primeiro passo para esse

estado, após sucessivas mudanças genotípicas e fenotípicas terem ocorrido. Do

ponto de vista fenotípico, a célula iniciada é semelhante às células restantes. A

proliferação das células é essencial para essa fase. Se a divisão celular ocorre antes

que os sistemas de reparo do DNA possam agir a injúria torna-se permanente e

irreversível. O desenvolvimento neoplásico depende da dose de carcinógeno, o

aumento da dose aumenta a incidência e a multiplicidade de neoplasias e também

reduz o período de latência da sua manifestação (TROSKO, 2001; SHACTER;

WEITZMAN, 2002; TROSKO, 2003; SANTELLA et al. 2005; PLAYER et al., 2004).

As células iniciadas podem reagir aos danos por mecanismos como a eliminação

das células danificadas por promover a apoptose ou morte celular durante a mitose,

reagindo contra as espécies reativas de oxigênio quando o aumento é provocado

por estresse oxidativo ou, ainda, estimulando os sistemas de reparo do DNA

(TUBIANA, 2008).

Na etapa da promoção, as células que foram alteradas geneticamente sofrem

o efeito dos carcinógenos classificados como oncopromotores. A célula iniciada é

transformada em célula maligna, fato que ocorre de forma lenta e gradual. No

entanto, para que essa transformação ocorra, é necessário um longo e continuado

período de contato com o agente promotor. A suspensão do contato pode

interromper o processo nesse estágio (ALMEIDA et al., 2005).

As alterações podem ocorrer em genes denominados proto-oncogenes, que

são genes promotores de crescimento e diferenciação celular, que a princípio, são

inativos em células normais. Quando ativados, os proto-oncogenes transformam-se

em oncogenes, responsáveis pela malignização (cancerização) das células normais

(INCA, 2013).

Na progressão, um fenótipo neoplásico é adquirido através de mecanismos

genéticos e epigenéticos (SHACTER; WEITZMAN, 2002). Durante esta fase, a

proliferação das células ocorre independente da presença do estímulo. A progressão

é caracterizada pela irreversibilidade, instabilidade genética, o crescimento mais

rápido, invasão, metastização, e alterações nas características bioquímicas,

metabólicas e morfológicas de células (GUTIÉRREZ; SALSAMENDI, 2001; DIXON;

KOPRAS, 2004).

A angiogênese é essencial para a progressão neoplásica. A aquisição de um

fenótipo angiogênico precede o desenvolvimento de características que contribuem

para a malignidade e sua inibição atrasa o desenvolvimento neoplásico

(HAWIGHORST et al., 2001).

1.4 COLITE E CÂNCER COLORRETAL (CCR)

Tanto a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (DC) estão associadas com

um risco aumentado de câncer colorretal (CCR) (ULLMAN; ITZKOWITZ, 2011).

Bargen, em 1928, foi o primeiro a relatar 20 casos de CCR em conseqüência da UC.

Em 1971, Dombal relatou um risco cumulativo de desenvolvimento de CCR em

pacientes com UC extensa em 5% depois de 10 anos e 41,8% após 25 anos. Trinta

anos mais tarde, uma estudo de meta-análise descobriu que o risco cumulativo de

CCR para qualquer paciente com UC foi de 2% em 10 anos, de 8% em 20 anos, e

18% em 30 anos (EADEN; ABRAMS; MAYBERRY, 2001).

O risco de câncer colorretal (CCR) na colite ulcerativa crônica (CUC) parece

depender de um equilíbrio de fatores diagnósticos e de proteção. Foi sugerido que a

inflamação crônica promove o carcinoma como seqüência da CUC (ITZKOWITZ;

YIO, 2004). Na DC, é aceita a hipótese de que a instalação precoce e a longa

evolução da doença inflamatória sejam fatores associados de risco associados ao

desenvolvimento do câncer (RIBEIRO et al., 1991; LASHNER, 1992; MARCHETTI,

FAZIO, OZUNER, 1996; RAMOS et al., 1997).

Mesmo com esse conhecimento, permanece incerto os motivos pelos quais

somente alguns pacientes irão desenvolver CCR mesmo em um grupo em cuja

duração da inflamação do cólon e a extensão da colite sejam similares. Ao

investigar a importância de algumas variáveis para CCR dentro da população do

mesmo estudo, importantes estratégias de prevenção do câncer e subgrupos de alto

risco podem ser identificados.

A importância dos vários conhecidos fatores de proteção associados com

CCR não é bem descrito. Isso pode ser em parte porque esses fatores não têm sido

avaliados dentro do mesmo estudo. Muitos estudos são preliminares, tornando-se

difícil de avaliar e ajustar essas diversas variáveis simultaneamente. O início da

CUC, histórico familiar de CCR, alergia a sulfa, colangite esclerosante primária

(PSC) e a atividade clínica foram relatados por serem fatores preditivos do risco de

câncer apenas em alguns casos. Já os estudos populacionais, consultas médicas

regulares, tabagismo, ácido fólico, colonoscopia de vigilância, e terapia crônica com

Ácido 5-aminossalicílico (5-ASA), têm sido relatados por serem protetores em

apenas alguns estudos. (GREENSTEIN 1979; PRIOR et al., 1982; LASHNER et al.,

1989; EKBOM et al., 1990; BERNSTEIN et al., 1994; PINCZOWSKI et al., 1994;

LOFTUS et al., 1996; KORNFELD et al., 1997; KARLEN et al., 1998; NUAKO et al.,

1998a; NUAKO et al., 1998b; SHETTY et al., 1999; EADEN et al., 2000; ASKLING et

al., 2001; HEUSCHENET et al., 2001; BERNSTEIN, 2003; RUTTER et al., 2004).

Evidências da forte ligação genética entre a doença inflamatória intestinal

(DII) e câncer são escassas e o risco de transformação neoplásica está mais

relacionada à duração e extensão da colite e confirmação histológica da inflamação

da mucosa (GUPTA et al., 2007).

Apesar dos dados implicarem a inflamação no desenvolvimento da

tumorigênese, a avaliação de risco em pacientes individuais permanece imprecisa.

No entanto, a consideração do papel da inflamação na patobiologia da

transformação neoplásica tem implicações tanto para a compreensão da progressão

da doença quanto para a prática clínica (CAMPBELL; MAXWELL, 2009).

Relatos na literatura atestam que a inflamação tem um papel na homeostase

do tumor e, também é a chave para a transformação neoplásica (KORNFIELD,

1997; PERWEZ, HARRIS, 2007; GUPTA et al., 2007b).

Inversamente, as drogas anti-inflamatórias podem inibir o desenvolvimento de

tumores (ORII et al., 2003). Os radicais livres produzidos pela resposta inflamatória

são altamente reativos com praticamente todos os tipos de biomoléculas, incluindo o

DNA. O estresse oxidativo crônico pode promover eventos de mutação, incluindo

instabilidade cromossômica (CIN) (LIMOLI; GIEDZINSKI, 2003). Apesar da

instabilidade de microssatélites, as mudanças de metilação e outros eventos

mutacionais também estão envolvidos. CIN é considerada por representar a principal

via de carcinogênese na DII. As anormalidades moleculares na neoplasia colorretal

associada a colite (CACRN) são semelhantes a aqueles envolvidos no CCR embora

diferenças substantivas ocorram na temporização dos eventos (ITZKOWITZ; YIO,

2004).

Foi visto que CIN seminais, em particular, pode ocorrer em estágios iniciais de

desenvolvimento de CACRN (WILLENBUCHER et al., 1999).

A inflamação pode induzir diferentes categorias de proliferação celular em

tecidos afetados, dependendo da gravidade da lesão induzida. Citocinas pró-

inflamatórias tem um efeito mitogênico direto, enquanto a necrose do tecido é

normalmente seguida por uma cura regenerativa (PANJA et al., 1998; FARBER,

1995). Estudos utilizando o fígado como órgão modelo demonstraram que a

proliferação regenerativa de células têm um papel significativo na inflamação

associada a tumorigênese. Por outro lado, a proliferação mitogênica tem um risco

pouco demonstrável (LEDDA-COLUMBANO et al., 1992; 1993).

No intestino ou cólon, o fenômeno notável de rápida melhora após a lesão

inflamatória com restauração completa da morfologia da cripta/vilosidade em todas

as linhagens celulares ocorre pelo processo de regeneração da mucosa (PATEL et

al., 1996; POTTEN, 1991). As cicatrizações regenerativas recorrentes na colite, no

entanto, podem conferir aumento do risco de câncer (OKAYASU et al., 2002).

Uma evidência suportou o conceito de que a cura regenerativa por si só

contribui para a instabilidade do genoma. O DNA isolado a partir da mucosa

regenerativa não-neoplásica na colite apresenta microssatélites de instabilidade,

considerados como indicativos de uma hipermutabilidade transiente, em vez que

mimetisa a reparação de genes do DNA sem qualquer alteração prévia (HEINEN,

1997).

A colite recorrente pode promover o desenvolvimento e expansão de

manchas mutantes das mucosas, antes da formação do tumor. Assim, a

regeneração poderia aumentar a tumorigênese por diminuição metabólica das

defesas contra as espécies oxidativas mutagênicas ou por aumento da frequência

de mutação celular e expansão clonal mutante. Episódios recorrentes poderiam

promover o desenvolvimento de subclones cada vez mais instáveis que re-

epitelizariam áreas ulceradas, levando, finalmente, para displasia multifocal ou

câncer, típico de CACRN (DONNELLY et al., 2004; 2005).

A transformação neoplásica na colite funciona em um longo curso

caracterizado por instabilidade genômica progressiva. A displasia progride através

da displasia de baixo grau para a displasia de alto grau (HGD) por aquisição de

mutações adicionais em k-ras, APC e outros genes. Manchas displásicas podem

atingir um tamanho grande (AHNEN, 1992).

Os cânceres são considerados por surgir dentro dessas manchas displásicas

circunscritas em 78-94% dos casos (CONNEL et al., 1994; VONHERBAY; OTTO,

1994). A displasia de alto grau tem 83% de valor preditivo positivo para câncer

(CONNEL et al., 1996). Em pacientes com estabelecida displasia de alto grau ou

câncer, CIN é detectável na mucosa morfologicamente normal em toda a área

lesionada ou no cólon inteiro (RABINOVITCH et al., 1999).

1.4.1 Tratamentos atuais para o câncer

Atualmente no tratamento do câncer são utilizados três principais tipos de

procedimentos: a radioterapia, a quimioterapia e a cirurgia.

No caso de não haver metástases, a técnica cirúrgica pode levar a remoção

de tumores.

A radioterapia é um método comumente utilizado no tratamento que emprega

um feixe de radiações ionizantes (geralmente raios gama, radioisótopos como

cobalto-60, raios-X e outros) e que pode regredir o tamanho de tumores, atuar na

redução da recorrência e chance de metástase. É uma técnica muito utilizada em

conjunto com a cirurgia, para aumentar a eficiência do tratamento (MURAD, 1996;

ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2013).

A quimioterapia tem como objetivo inicial a destruição de células malignas,

preservando as células normais. No entanto, a maioria dos agentes quimioterápicos

atua de forma não-específica, lesando tanto células malignas quanto as células

normais (MURAD, 1996; MACHADO, 2000). Esta técnica é uma associação de

medicamentos que são administrados nos pacientes por via intravenosa ou por via

oral. Entretanto, em um determinado estágio do tratamento, as células tumorais

submetidas a essa terapia passam a desenvolver mecanismos de resistência

(MARIUZZO, 2007). Essa perda de resposta é um dos maiores problemas

encontrados no tratamento com quimioterapia (LONGLEY; JOHNSTON, 2005).

Ultimamente, muitos estudos buscando maior eficiência na terapia contra

tumores enfocam a imunoterapia. Esta, é uma abordagem molecular na qual o

sistema imunológico autólogo é utilizado como braço efetor. Nesta técnica, as

moléculas alvo são antígenos de tumores. Estas moléculas podem ser peptidios,

proteínas ou carboidratos, por meio da qual o sistema imunológico reconhece os

tumores (LUCAS; COULIE, 2008). Embora o sistema imunológico seja capaz de

reconhecer os antígenos superexpressos, a discriminação entre tumores e tecidos

normais pode não ser o ideal. Antígenos novos criados por uma mutação no tumor

são alvos, teoricamente, mais apropriados para discriminação imunoterapêutica

entre as células malignas e normais. Além disso, mutações comuns compartilhadas

por tumores, mas não por tecidos normais também podem ser úteis (PARMIANI et

al., 2007).

Estudos estão sendo realizados a fim de buscar novos compostos que possam

contribuir para a prevenção e tratamento das DII's e CCR. Dentre estes, pode-se

destacar compostos derivados de plantas e fungos (SOCCA et al., 2014; SILVA et

al., 2012).

1.5 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS E SEU POTENCIAL BIOATIVO

Os fungos, durante muito tempo, foram considerados vegetais e, somente a

partir de 1969, passaram a ser classificados em um reino à parte, o Reino Fungi

(WHITTAKER, 1969). Estes são organismos que possuem características comuns

tanto aos animais quanto aos vegetais, apresentando, desta forma, morfologia

bastante diversificada. Crescem rapidamente e formam filamentos celulares

microscópicos denominados hifas, cujo conjunto constitui uma espécie de tecido

próprio dos fungos, o micélio, responsável por todas as funções vegetativas do

organismo. Os fungos são heterótrofos, não sintetizando matéria orgânica a partir de

carbono inorgânico, eucariontes, maioria multicelulares e essencialmente terrestres.

Todos apresentam parede celular em alguma fase do ciclo de vida, sendo esta

constituída de quitina, conferindo rigidez e resistência à degradação microbiana e o

glicogênio é o carboidrato de reserva (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001). Esses

organismos são divididos em quatro filos de acordo com seus mecanismos

reprodutivos: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota

(ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996).

Os fungos representantes do filo Basidiomycota, comumente conhecidos

como basidiomicetos, constituem um grupo diverso, sendo os cogumelos e orelhas-

de-pau, os mais conhecidos (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001).

Os cogumelos são utilizados desde a antiguidade pelo homem como alimento

de alto valor nutritivo e terapêutico. Na natureza, existem diversas espécies de

diferentes cogumelos, sendo alguns venenosos, alucinógenos e outros que possuem

propriedades medicinais e até afrodisíacas (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL,

1996).

Os maiores produtores mundiais de cogumelos são os Estados Unidos,

França, Alemanha, Holanda, China e Japão e como principais consumidores podem

ser destacados a Alemanha, Holanda, Japão e China (MODA et al., 2005). Em

contraste, o consumo de cogumelos no Brasil ainda é muito pequeno quando

comparado aos povos europeu e asiático e está restrito a certos grupos étnicos ou

de maior status cultural e econômico (DIAS; ABE; SCHAWN, 2004).

Foi estimado que existam mais de 1,5 milhão de espécies de fungos no

mundo embora apenas 5% tenham sido descritas (HAWKSWORTH, 2001). Apesar

do pouco relato que se tem sobre esses organismos, reconhece-se que muitos deles

já se tornaram imprescindíveis para a saúde humana (HERRERA, 2001).

Polissacarídeos são moléculas naturais constituídos por monossacarídeos

conectados entre si por ligações glicosídicas. Esses polímeros diferenciam-se,

basicamente, pelos monômeros constituintes, tipo de ligação, comprimento da

cadeia e número de ramificações e grupos substituintes como fosfatos, carboxila e

sulfato, por exemplo (FREIMUND et al., 2003).

Uma porcentagem significativa da biomassa fúngica é devido à presença de

polissacarídeos como, por exemplo, a parede da hifa, que contém mais de 75%

deste tipo de biomolécula (BARBOSA et al., 2004).

Polissacarídeos isolados da parede celular de fungos têm sido comumente

caracterizados como homopolímeros, heteropolímeros ou, ainda, podem estar

associados a resíduos de proteínas formando complexos polissacarídeo-proteína

(ZHANG et al., 2002; KIM et al., 2003). E dentre os polissacarídeos mais

freqüentemente encontrados nestes organismos podem ser citados a quitina,

glucanas e galactomananas, embora sua quantidade varie entre as diferentes

espécies (ADAMS, 2004).

Dentre os diversos polissacarídeos isolados de basidiomicetos, estão

glucanas, heterogalactanas, heteromananas, entre outras (SCHEPETKIN; QUINN,

2006). Acerca destes polissacarideos, as glucanas são os mais abundantes nas

paredes celulares dos fungos (RUIZ-HERRERA, 1991).

As glucanas são polímeros de glucose amplamente distribuídos na natureza e

classificadas conforme o tipo de ligação glicosídica [α, β] da cadeia principal

(FIGURA 5). Nos fungos, estas moléculas participam como componentes menores

do citosol, da parede celular e como polissacarídeos excretados ao meio

(WILLIAMS, 1997). As funções desses polissacarídeos na parede celular, sejam

estruturais ou fisiológicas, são determinadas pelas suas propriedades físicas e estão

diretamente relacionadas às diferenças de composição, à estrutura (primária,

secundária e terciária) das cadeias poliméricas individuais e à maneira pela qual se

arranjam para formar a parede celular (BUSH; HORISBERGER, 1972; SUGAWARA

et al., 2004).

Muitas funções biológicas têm sido atribuídas às glucanas e muito se têm

investigado com relação ao seu potencial farmacológico. Muitas atividades já foram

relatadas na literatura por possuírem propriedades terapêuticas como, por exemplo,

efeitos antitumoral (HUANG; ZHANG; CHEUNG, 2006), imunomodulatórios e

antioxidantes (YUAN et al., 2009), anti-inflamatórios (SMIRDELE et al., 2008) e

antimutagênico (OLIVEIRA et al., 2006).

FIGURA 5: Fórmulas estruturais de algumas glucanas. I. α-(1.4)(1.6)- glucana; II. β-(1.3)(1.6)-

glucana, substituída por unidades glucosídicas com freqüência variada; III. β - (1 .3)(1 .6)-glucana,

substituída por unidades glucosídicas e/ou gentiobiosídicas a cada cinco unidades da cadeia

principal. Fonte: SILVA et al., 2006.

Esses polissacarídeos têm efeitos intensos sobre uma grande variedade de

leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células NK, assim como

as células não-imunes: como as células endoteliais, células do epitélio alveolar e

fibroblastos. Estas possuem receptores capazes de reconhecer as -glucanas,

resultando na ativação dessas células (BATTLE et al., 1998).

Recentemente, foram identificados três receptores celulares de β-glucanas:

CR3, dectin-1 e lactosilceramida (ZIMMERMAN et al., 1998; ROSS et al., 1999;

BROWN; GORDON, 2003). Os CR3 são receptores celulares responsáveis por

diversas atividades in vitro e in vivo, atuando, principalmente, na migração

transendotelial de neutrófilos ativados (TSIKITIS et al., 2004). Os receptores do tipo

dectina-1são responsáveis por uma série de respostas celulares incluindo a

fagocitose, endocitose, explosão respiratória, além da produção de citocinas pró-

inflamatórias e quimiocinas (BROWN et al., 2003; GANTNER et al., 2003; HERRE

et al., 2004). Alguns estudos demonstraram que esses receptores celulares e

também o lactosilceramida de linfócitos reconhecem β-glucanas, principalmente com

estrutura do tipo β-(1→3) e β-(1→6) (ZIMMERMAN et al., 1998; BROWN; GORDON,

2003).

Cerca de 700 espécies de fungos já foram descritas por possuírem

significativas propriedades farmacológicas (LULL, WICHERS, SAVELKOUL, 2005).

Dentre os inúmeros compostos testados, os polissacarídeos fúngicos vêm sendo

alvo de vários estudos.

Tem sido relatado na literatura o potencial anti-inflamatório de

polissacarídeos extraídos de fungos (PADILHA, 2009; CARBONERO et al., 2008,

SMIRDELE et al., 2008). Outros estudos, ainda, buscam explicar o possível

mecanismo pelo qual esses compostos agem (LIN et al., 2005; HAN et al., 2007).

Caripia montagnei (Berk.) Kuntze é um basidiomiceto presente em regiões

neotrópicas das quais podem ser citados os países da América Central e da América

do Sul, como o Brasil. Este fungo é encontrado em troncos de angiospermas

descascados ou deteriorados, como também em galhos caídos (GINNS, 2011).

Estudos iniciais com o extrato aquoso de Caripia montagnei constataram seu

potencial anti-inflamatório utilizando dois modelos de inflamação in vivo. Neste

estudo, os polissacarídeos foram capazes de reduzir o edema inflamatório, reduzir

os níveis de migração leucocitária, como também diminuir significativamente os

níveis de óxido nítrico. Além disso, também foi verificada diminuição dos níveis de

IL-10 e IFN-γ, bem como inibição da expressão do fator nuclear κB (QUEIROZ et al.,

2010).

Castro et al., (2014) também relataram efeitos anti-inflamatórios para os

polissacarídeos de C. montagnei no modelo de pleurisia induzida por carragenana.

Além disso, também constataram o potencial antioxidante e antiangiogênico destes

polissacarídeos.

Assim, as constatações de que polissacarídeos de Caripia montagnei são

compostos com importantes efeitos imunomoduladores motivaram este estudo que

visa ampliar o conhecimento e suas possíveis aplicações farmacológicas.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Verificar as propriedades físico-químicas e farmacológicas como a atividade

anti-inflamatória intestinal em ratos e antitumoral contra células do carcinoma de

cólon humano (HT-29) dos polissacarídeos de C. montagnei.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar fisico-quimicamente os polissacarídeos extraídos dos corpos de

frutificação do fungo C. montagnei através de dosagens de açúcares totais,

proteínas, sulfato e fenóis totais; espectroscopia de infravermelho, análise da

composição monossacarídica e ressonância magnética nuclear de 13C, 1H e HSQC;

• Analisar o efeito anti-inflamatório intestinal das glucanas do fungo Caripia

montagnei (GCM) no modelo de colite induzida por TNBS em ratos Wistar;

• Avaliar os efeitos macroscópicos e microscópicos de GCM no tecido colônico

de ratos com colite induzida por TNBS;

• Verificar a atividade de GCM utilizando marcadores bioquímicos (catalase,

mieloperoxidase e fosfatase alcalina) no tecido colônico de ratos com colite induzida

por TNBS;

• Analisar os efeitos de GCM sobre marcadores imunológicos da inflamação

colônica, IL-1 e IL-6, no modelo de colite induzida por TNBS;

• Avaliar in vitro a atividade antiproliferativa de GCM sobre células do

carcinoma de cólon humano HT-29;

• Verificar o possível efeito de GCM na apoptose e distribuição do ciclo celular

nas células HT-29;

• Avaliar o efeito antioxidante de GCM em células HT-29;

• Analisar a ação de GCM sobre a adesão de células HT-29.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 Fungo

Os fungos Caripia montagnei (Berk.) Kuntze (FIGURA 6) foram coletados em

áreas de mata atlântica, na cidade de Natal (Rio Grande do Norte-Brasil), e, após a

coleta, os fungos foram identificados pelo Prof Dr. Iuri Goulart Baseia do

Departamento de Zoologia, Botânica e Ecologia da UFRN. Os especimes foram

depositados no Herbário da UFRN (UFRN-fungos 836).

Reino: Fungi

Filo: Basidiomycota

Classe: Holobasídiomycetes

Ordem: Aphylloporales

Família: Podoscyphaceae

Gênero: Caripia

Espécie: Caripia montagnei

FIGURA 6: Fungo Caripia montagnei. Fonte: Arquivo próprio.

3.1.2 Animais

Os estudos para avaliação da atividade antiinflamatória foram realizados com

ratos Wistar (150-200 g) mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica da

UFRN. Todos os animais utilizados na fase experimental foram submetidos à água e

alimentação ad libitum em condições de iluminação controlada (12 h de luz / escuro)

e temperatura constante a 23 ± 2 º C. Os animais foram aclimatizados no laboratório

durante pelo menos 24 horas antes das experiências e foram utilizados apenas uma

vez. Os ensaios realizados foram aprovados (n º 014/2010) pelo Comitê de Ética da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), e seguiu as normas

estabelecidas.

3.1.3 Reagentes e aparelhos

Fenol, metanol, acetona, etanol, ácido etilenodiaminotetracético, acetato de

sódio, clorofórmio, ácido sulfúrico, formaldeído, Cloreto de sódio, Hidróxido de sódio,

ácido clorídrico, fosfato de sódio monobásico e dibásico da Reagen Quimibrás

Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

Citrato de sódio (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);

Folin-Ciocalteu da Cromoline Qumica Fina Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

Bacto-gelatin da Difco Laboratories

Coomasie brilliant blue R 250, peróxido de hidrogênio, brometo de

hexadeciltrimetilamônio, albumina sérica bovina, glicose, 3,3’,5,5’-

tetramethylbenzidine, ácido etilenodiaminotetracético, brometo de

hexadeciltrimetilamónio, ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico, MTT (brometo de 3-

[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium), 2,2 diclorofluoresceina diacetato (DCFH-

DA) e padrões de monossacarídeos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA );

Cristal violeta da Inlab (São Paulo, SP, Brasil);

Citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA).

Solução de EBSS (solução salina balanceada de Earle sem cálcio e sem

magnésio) preparada no INFAR, UNIFESP (São Paulo, SP) contendo 6,8 g NaCl;

0,4 g KCl; 1,14 g Na2HPO4; 0,2 g KH2PO4; 0,14 g Na2HPO4 x 1H2O; 2,2 g NaHCO3;

1,0 g D-glucose e 0,01 g de vermelho de fenol em um litro de água;

Kit ELISA para detecção de IL-1 e IL-6, kit de detecção de apoptose BD

Pharmingen Annexin V-FITC e Matrigel (BD Pharmingen San Diego, CA, USAouri,

USA);

Banhos e estufas de temperatura controlada da FANEM Ltda. (São Paulo, SP,

Brasil);

Espectrofotômetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd.

(Springvale, Vico, Austrália) e Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão);

3.2 MÉTODOS

Os corpos de frutificação foram coletados, secos a 40 ºC e pulverizados.

Estes, foram submetidos a extração aquosa para obtenção de polissacarídeos

seguida por precipitação com etanol. Após obtenção dos polissacarídeos, foram

realizadas sua caracterização química parcial além das análises de algumas

possíveis propriedades farmacológicas como as atividades anti-inflamatória e

antitumoral. A estratégia geral de estudo pode ser visualizada na FIGURA 7.

FIGURA 7: Desenho experimental do estudo desenvolvido com o fungo Caripia montagnei.

3.2.1 Extração aquosa dos polissacarídeos de Caripia montagnei

A obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei foi realizada por

modificações na metodologia proposta por Souza-Paccola et al., (2004). Para

obtenção dos polissacarídeos, os corpos de frutificação dos fungos foram lavados e

dessecados a 40 ºC em estufa, e, posteriormente foram pulverizados. Para a

extração dos polissacarídeos utilizou-se 50 g de tecido do fungo. A este pó foi

adicionado dois volumes de acetona 80% (2:1, p/v) permanecendo a mistura a 25 °C

por 24 horas e em seguida filtrado. Posteriormente, foi realizada extração com

clorofórmio-metanol (2:1, v/v) por 2 horas a 60 ºC, sob refluxo, e em seguida filtrado.

O sobrenadante foi descartado e ao precipitado adicionou-se 500 mL de água

destilada, permanecendo a mistura em banho-maria a 100 ºC por 3 h. O

sobrenadante foi tratado com três volumes de etanol resultando em um precipitado

que foi separado do sobrenadante por centrifugação (8000 rpm por 20 min, a 25º C).

A seguir o precipitado obtido foi seco e pulverizado (FIGURA 8).

FIGURA 8: Fluxograma de obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei. Legenda: PPT:

Precipitado.

Água destilada 100 °C/3 h

Filtração

PPT SOBRENADANTE

2V etanol Centrifugação

8000 rpm/20 min

SOBRENADANTE PPT (GCM)

Secagem e pulverização

PPT SOBRENADANTE

Clorofórmio-metanol, 60 ºC/2 h Filtração

50g fungo

PPT SOBRENADANTE

2V acetona 80% 25 °C/24 h Filtração

3.2.3 Caracterização química dos polissacarídeos do fungo Caripia

montagnei

3.2.2.1 Análises colorimétricas

3.2.2.1.1 Açúcares totais

Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico

como previamente descrito (DUBOIS, 1956) empregando-se como padrão D-glicose,

sendo as leituras realizadas a 490 nm.

3.2.2.1.2 Proteínas

O conteúdo de proteínas foi determinado com o reagente de Coomassie blue

G 250 segundo o método de BRADFORD (1976) e a leitura realizada a 595 nm. A

curva de calibração foi feita utilizando albumina sérica bovina.

3.2.2.1.3 Sulfato

O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6 N, 6 horas,

100 ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON; PRICE, 1962).

O sulfato de sódio (1 mg/mL) foi utilizado como curva padrão sendo submetido as

mesmas condições das amostras em estudo.

3.2.2.1.5 Fenóis totais

A concentração de fenóis totais foi determinada colorimetricamente conforme

o procedimento padrão de Folin-Ciocalteu (SINGLETON; ROSSI, 1965) e as leituras

foram realizadas a 755 nm. Para a curva de calibração foram usadas soluções

aquosas de ácido gálico. O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação das

absorbâncias das amostras contra a respectiva curva de calibração.

3.2.2.2 Análise da composição monossacarídica

Os polissacarideos foram hirolisados (HCl, 2N, 3 horas 100 °C).

Posteriormente, o material foi neutralizado, seco e aplicado em papel Whatman N°1.

Este foi submetido a cromatografia descendente em papel no seguinte sistema de

solvente: Butanol: Piridina: Água ( 2: 3: 1,5) v/v/v. Os monossacarídeos foram

revelados por redução com prata (TREVELYAN, 1950).

3.2.2.3 Análise de infravermelho

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectômetro FT-IR ABB

Bomen modelo MB 104, de 4000 a 400 cm-1. O polissacarídeo foi analisado após

secagem sob a forma de pastilha de KBr. As análises foram realizadas no

Departamento de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob

orientação do Prof. Ademir Oliveira da Silva.

3.2.2.4 Ressonância magnética nuclear (R.M.N)

As análises de R.M.N foram realizadas na Universidade Federal do Paraná

(UFPR), sob orientação do Prof. Guilherme Lanzi Sassaki, num magneto BRUKER,

modelo DRX 400, série AVANCE, em tubo (widebore probe) de 5 mm de diâmetro

externo. Os espectros foram obtidos a 80ºC utilizando 10mg dos polissacarídeos

dissolvidos em 0,5mL de água deuterada (D2O) a 99,75%.

3.2.3 Avaliação das atividades farmacológicas das glucanas do fungo

Caripia montagnei (GCM)

3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-

trinitrobenzeno sulfônico (TNBS)

A colite experimental é um modelo de inflamação intestinal bem estabelecido

e foi induzida em ratos Wistar (n=10) como descrito por MORRIS et al., (1989).

Animais em jejum por 24 horas antes do experimento e com livre acesso à solução

de glicose 5%, foram anestesiados com a administração intreperitonial de ketamina

(80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg). A indução da colite foi realizada pela

administração intracolônica de 30 mg de ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico em

0,25 mL de solução de etanol a 40% (v/v) através de um catéter de polietileno

inserido no lúmen do cólon. Este mesmo procedimento foi realizado nos grupo

controle negativo, entretanto, os animais controle receberam 0,25 mL de solução

salina (0,9%) (FIGURA 9).

3.2.3.1.1 Tratamento

Os ratos foram tratados por via intraperitoneal e divididos em diferentes

grupos experimentais: 1) Ratos do grupo controle negativo e positivo receberam

como tratamento apenas solução fisiológica; 2) todos os outros ratos dos demais

grupos foram tratados com diferentes doses de glucanas (25, 50 e 75 mg/Kg). Os

tratamentos tiveram início 24h após a indução da colite experimental e foram

realizados de duas formas: de 12 em 12 horas ou de 24 em 24 horas, ambos

durante 60 h. Após 12 horas do último tratamento, os animais foram eutanasiados e

a cavidade abdominal foi rapidamente aberta, o cólon retirado e aberto para análise

do dano macroscópico e, posteriormente, foram realizados cortes transversais que

foram distribuídos aleatoriamente para as análises macroscópicas, microscópicas,

bioquímicas e imunológicas.

FIGURA 9: Esquema do ensaio de colite induzida por TNBS.

3.2.3.1.2 Análise macroscópica

Para a analises macroscópica os animais foram avaliados quanto à presença

aos prejuízos intestinais pela atribuição de escore segundo uma escala previamente

descrita por BELL, GALL e WALLACE (1995).

Escore 0: Ausência de lesões.

Escore 1: Hiperemia, sem ulcerações.

Escore 2: Ulceração linear sem inflamação.

Escore 3: Ulceração linear com inflamação.

Escore 4: Duas ou mais ulcerações e inflamação.

Escore 5: Duas ou mais ulcerações e inflamação ou uma ulceração

com extensão superior a 1 cm longitudinalmente no cólon.

Escore 6-10: Se as lesões forem superiores a 2 cm de extensão

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bell%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7733288

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gall%20DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7733288

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wallace%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7733288

longitudinalmente, será atribuído 1 ponto para cada centímetro

adicional.

3.2.3.1.3 Avaliação da atividade da mieloperoxidase

Para avaliar a atividade da MPO, amostras do cólon dos diferentes grupos

foram obtidas e congeladas a -20 ºC até o uso. Após descongelamento, as amostras

foram pesadas e homogeneizadas em PBS 50 mM, pH 7,4. Os homogenatos foram

centrifugados a 8.000 rpm, por 20 min, a 4 ºC. Os pellets foram ressuspendidos em

PBS 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5% brometo de hexadeciltrimetilamónio (HETAB) e

10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Os homogenatos resultantes

foram submetidos a ciclos de congelamento/degelo e sonicados. A uma amostra do

homogeneizado (0,5 µL) foi adicionado 0,5 mL se solução contendo PBS 80 mM, pH

5,4, 0,5% de HETAB e 1,6 mM 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB). A mistura foi

incubada a 37 ºC e a reação foi iniciada pela adição de 0,3 mM de peróxido de

hidrogênio. As leituras foram realizadas a 655 nm. Uma unidade da atividade de

MPO foi definida como a quantidade de enzima presente que produzirá uma

mudança na absorbância de 1,0 U/min a 37 ºC no volume final da reação contendo o

acetato. Os resultados foram quantificados como mU/g da amostra (GRISHAM,

BENIOT, GRANGER, 1990).

3.2.3.1.4 Avaliação da atividade da fosfatase alcalina

Neste método a fosfatase alcalina age como catalisador para a hidrólise do

nitrofenilfosfato sódico (5,5 mM) em tampão glicina (50 mM, pH =10,5), que

incorpora MgCl2 e forma p-nitrofenol, molécula que apresenta absorção máxima de

405 nm. Os resultados foram expressos em mU/mg de proteína (Smith et al., 1985).

3.2.4.1.5 Avaliação da atividade da catalase

Amostras do cólon dos diferentes grupos foram utilizados para verificar a

atividade da catalase (CAT). A determinação da atividade da CAT presente nas

amostras de cólon foi realizada com base no método de LOCK (1963). Amostras do

cólon foram homogeneizadas em tampão fosfato 50 mM pH 7. Em uma cubeta de

quartzo a 2950 μL de solução reação (Tampão fosfato de potássio 50 mM, pH7,0 +

peróxido de hidrogênio 20 mM, 30 0C) foram adicionadas a 50 μL da amostra diluída.

A absorbância foi medida em comprimento de onda de 240 nm por 5 minutos.

3.2.3.1.6 Análise de citocinas

Amostras do cólon dos diferentes grupos foram pesadas e homogeneizadas

em solução de 0,3 mL de tampão fosfato (PBS, pH 7,2) a 4ºC. Em seguida, foram

centrifugados a 4000 rpm por 5 min. Os níveis de IL-1 e IL-6 foram determinados

utilizando-se kits específicos de Elisa (enzyme immuno sorbent assay) de acordo

com as recomendações do fabricante.

3.2.3.1.7 Análises histológicas

Amostras do cólon de todos os grupos foram removidos, fixados em formol,

incluídos em parafina e seccionados. As seções foram coradas em hematoxilina e

eosina.

3.2.4 Ação de GCM sobre células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

3.2.4.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT)

O método de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium)

é um ensaio de viabilidade celular utilizado para determinar a citotoxicidade após a

exposição das células a substâncias testes. A citotoxicidade de GCM foi avaliada

como previamente descrita por Mosmann (1983) utilizando células do carcinoma de

cólon humano HT-29. As culturas foram expostas a 25, 50 e 100 μg dos

polissacarídeos e incubadas a 37 °C por 24, 48 ou 72 horas. Após a incubação, 100

μL de meio DMEM contendo MTT (concentração final de 5 mg/mL), foi adicionado a

cada poço, e as placas foram incubadas a 37 °C por 4 horas. Decorrido o tempo, o

sobrenadante foi removido e 100 μL de etanol P.A. foram adicionados a cada poço

para solubilizar os cristais de formazan. Após homogeneização, a leitura foi

realizada a 570 nm. Para o controle da reação (100% de proliferação), os

polissacarídeos foram substituídos por meio DMEM.

3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas

células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

3.2.4.2.1 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI)

A morte das células HT-29 foi avaliada utilizando a anexina V- isotiocianato de

fluorosceína – anexina V-FITC (detecção da exposição da fosfatidilserina na

membrana celular) e o iodeto de propídio (PI), de acordo com o kit de detecção de

apoptose BD Pharmingen Annexin V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). As

células HT-29 foram cultivadas em meio DMEM, a 37 °C sob atmosfera de 2,5% de

CO2. As células foram cultivadas em placas de 6 poços (100.000 células por poço) e

deixadas por 24 h, até atingirem confluência. Após a incubação, as células foram

carenciadas por 18 h e em seguida foram tratadas com 50 ou 100 μg de GCM

(diluído em meio DMEM) por 24 h. O sobrenadante, contendo as células não

aderentes, foi removido e reservado em um tubo Falcon, o qual foi centrifugado a

1000 g por 15 min. As células aderentes na placa foram lavadas duas vezes com

tampão EBSS (contendo o indicador de pH vermelho de fenol) e em cada poço foi

adicionado tripsina para descolar as células da placa. Em seguida, foi adicionado a

cada poço meio DMEM contendo soro bovino fetal e a suspensão de células

descoladas foi transferida para o tubo Falcon contendo as células não aderentes e

que já foram submetidas ao processo de centrifugação. A suspensão de células

aderentes e não aderentes na placa foram homogeneizadas e lavadas duas vezes

com tampão do kit diluído em PBS para ensaio de anexina V-PI e as células foram

ressuspendidas em 50 μL. As células foram incubadas com 3 μL de anexina V e 5

μL de iodeto de propídio por 20 minutos a temperatura ambiente no escuro. Após a

incubação, em cada tubo teste foi adicionado 350 μL do tampão do kit e as células

foram imediatamente analisadas em citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton

Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em triplicata.

3.2.4.2.2 Ensaio da distribuição das células no ciclo celular

Para realização da análise da progressão do ciclo celular, as células de

carcinoma de cólon humano (HT-29) foram submetidas a mesma metodologia

aplicada para o ensaio de apoptose anexina V-FITC/ PI (item 3.2.4.3.1). A

suspensão de células aderentes e não aderentes foram fixadas com formaldeído

2%, e incubadas a 4 °C por 30 minutos. Após incubação, as células foram lavadas

com PBS (150 mM, pH 7,4). Posteriormente, foi adicionado PBS contendo 0,01% de

saponina, para permeabilizar as células. A seguir, foi adicionado uma solução

estoque de RNase a 4 mg/mL em tampão acetato de sódio 0,05M, pH 5,0 contendo

0,02 M de MgSO4. E a suspensão foi incubada por 1 h a 37 °C. Após este tempo, foi

adicionado 5 μL de solução estoque de PI (5 mg/mL) a temperatura ambiente, e as

células foram homogeneizadas e em seguida transferidas para tubo de FACS, no

qual foi adicionado 300 μL de PBS e as células foram analisadas em citômetro de

fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em triplicata.

3.2.4.3 Ensaio de atividade antioxidante in vitro

Células HT-29 foram incubadas a uma densidade de 3x104 células por poço

em placas de 96 poços a uma atmosfera de 5% CO2 por 24 horas. Após esse

período, as células foram incubadas com 25, 50 ou 100 µg/100 µL de GCM

juntamente com 100 μL de DCFH-DA a 25 µM e deixadas ao abrigo da luz por 4

horas. Após esse período, o sobrenadante foi removido e os poços foram lavados 2

vezes com PBS (0,1M, pH 7,4). Para avaliar o efeito protetor de GCM, peróxido de

hidrogênio (15 µM) foi adicionado e deixado por 30 minutos em contato. A leitura foi

realizada em leitor de microplacas sigma D-6883, sob excitação de 485 nm e

emissão de 530nm.

3.2.4.4 Ensaio de adesão

Células HT-29 foram incubadas em placas de 96 poços a uma densidade de

3x104 células por poço. Anteriormente a incubação de células, os poços foram

revestidos com Matrigel® (250 ng/mL) diluído em tampão PBS (0,1 M, pH 7,0) por

16 horas a 4ºC. O controle de adesão inespecífica foi avaliado em poços que não

continham Matrigel®. Em seguida cada poço foi lavado 4 x com PBS. Em seguida,

as células foram adicionadas, juntamente com solução de 25, 50 ou 100 µg/100 µL

de GCM ou DMEM. Após 4 horas de incubação a uma atmosfera de 5% CO2, os

poços foram lavados novamente com PBS (por 3 vezes). as células aderidas foram

fixadas com metanol por 10 minutos e novamente lavadas com PBS por 3 vezes. as

células HT-29 foram, então, coradas com cristal violeta (0,2% em 2%) por 5 minutos

e, posteriormente, lavadas exaustivamente com PBS por 10 vezes. Então, as células

foram lisadas com citrato de sódio (0,1 M) em etanol (1:1) e a absorbancia medida

em leitor de microplacas a 550 nm sendo o branco substituido por solução de lise.

3.2.5 Análises estatísticas

Todos os resultados foram submetidos a análise estatística, sendo analisadas

as repetições e as formas de tratamento. Os resultados foram submetidos à análise

de variância ANOVA. Para avaliar as diferenças entre os tratamentos e controle foi

utilizado o teste de Tukey-Kramer, que permite estabelecer a diferença mínima

significante entre duas médias, com nível de significância de p < 0,001.

4 RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA

O tecido do cogumelo Caripia montagnei foi submetido a extração e as

dosagens revelaram que o composto extraído é formado, principalmente, por

polissacarídeos (96%) e apresenta um baixo teor de proteínas (2,5%) e compostos

fenólicos (1,5%) (FIGURA 10). A composição monossacarídica foi realizada por

cromatografia descendente em papel e mostrou a glicose como açúcar

predominante existente na fração polissacarídica obtida de C. montagnei (dado não

mostrado). Não foi verificada a presença de sulfato na amostra. Estes dados são

similares aos encontrados também por QUEIROZ et al., (2010) estudando um

extrato rico em polissacarídeos de Caripia montagnei.

FIGURA 10: Composição química do composto extraído dos corpos de frutificação do fungo

Caripia montagnei.

4.1.1 Espectro FT-IR

A análise de FT-IR (FIGURA 11) revelou a banga larga em torno de 3500 cm-

1, cujo sinal é característico do estiramento axial do grupo OH. O sinal existente na

faixa de 2900 e 2800 cm-1 demonstrou a presença do grupamento aldeído (C-H) em

deformação axial. As análises também revelaram absorções entre 1300-1800 cm-1,

características da presença de carboidratos (PAGLIA; VALENTINE, 1967;

WORTHINGTON; ROSEMEYER, 1974). Além disso, foi observada a presença da

banda entre 1000 e 1100 cm-1, ou seja, 1045 cm-1 sendo característico da presença

de β-glucanas devido aos resíduos de glucose O-substituídos (MATHLOUTHI;

KOENIG, 1986; STONE; CLARKE, 1992). Um sinal foi encontrado na faixa dos 855

cm-1 o qual corresponde a presença de α-glucanas (FANG et al., 2012).

FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa seguido de

precipitação com etanol do fungo Caripia montagnei.

4.1.2 RMN

O espectro de 1H dos polissacarídeos de C. montagnei mostrou sinais na

região anomérica a 4-5 ppm (FIGURA 12A). Os sinais existentes em 5.07 e 5.09

ppm são atribuídos a presença de α-glucanas. Sinais existentes em 4.96 e 4.98 ppm

correspondem à presença de -glucanas (ROY et al., 2009). Os principais sinais

anoméricos (C-1/H-1) no “Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy”

(HSQC) (FIGURA 12B) encontram-se 100.55/5.01 e 103.32/5.01 e 103.99/4.97

correspondendo ao C-1 das unidades A, B e C, respectivamente, de acordo com a

diminuição dos deslocamentos químicos anoméricos (PERLIN; CASU, 1969). Os

sinais em baixa freqüência de ressonância em C-1 a 100,32 e 103,55 e em alta

freqüência em H-1 a 5.01 apontam para a presença de (GHOSH

et al., 2008; HUANG; ZHANG, 2009). Enquanto o sinal a 103,99/4.97 indica a

presença de Glc terminal (β-Glc; H-1 a 4,97 ppm) (SADOVSKAYA et al., 2010).

Desta forma, podemos afirmar que as glucanas foram os polissacarídeos extraídos

de Caripia montagnei corroborando com os dados obtidos nas análises de FT-IR.

α-D-Glc

FIGURA 12: Caracterização química das glucanas de Caripia montagnei (GCM). (A) Espectro de

RMN de 1H; (B) Espectro de HSQC.

4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE GCM NO MODELO DE INFLAMAÇÃO COLÔNICA

INDUZIDA POR TNBS EM RATOS WISTAR

4.2.1 Análise macroscópica

Como podemos observar na FIGURA 13, a administração intracolônica de

TNBS promoveu um aumento significativo de lesões macroscópicas. No grupo

controle positivo foram comumente encontradas lesões como ulcerações e necrose

(13A) em contraste ao grupo controle negativo no qual não houve lesões (13B). O

tratamento dos animais com dexametasona (13I-J) e com GCM em diferentes

intervalos e doses foi capaz de reduzir os danos observados (13C-H). Na analise

macroscópica a extensão e a severidade do dano intestinal foram avaliadas de

acordo com uma escala descrita por BELL et al. (1995). Nesta análise, o escore, o

qual mostra a severidade do dano intestinal, mostrou que o grupo não tratado,

controle positivo, apresenta escore alto (13,6 ± 0,51) mostrando o prejuízo intestinal

dos animais induzidos à inflamação colônica (FIGURA 13K). Também pode ser visto

que há uma redução significativa do dano entre os grupos controle positivo e o grupo

tratado com dexametasona (0,5 ± 0,54) para ambos os intervalos de tempo e os

grupos tratados com glucanas a 75 mg/ Kg nos intervalos de 12 h (6,6 ± 0,81) e 24

h (6,5 ± 0,83). Os grupos tratados com dexametasona em diferentes intervalos de

tempo não exibiram diferenças estatísticas com o controle negativo (ns; p > 0,05).

FIGURA 13: Lesões macroscópicas no cólon de ratos (n = 3) com colite induzida por ácido

2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). (A): Animais do controle positivo - TNBS, (B): controle

negativo, (C e D): tratado a cada 12 e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F):

tratado a intervalos 12 e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12

e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h,

respectivamente, com 1 mg / Kg de dexametasona; (K) o efeito de GCM na inflamação do cólon. Os

dados são expressos como a média ± desvio padrão. *** p <0,001.

K

4.2.2 Atividade da mieloperoxidase

A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi avaliada como parâmetro

para verificar a atividade anti-inflamatória de GCM. A FIGURA 14 mostra que a

administração do TNBS elevou em mais de 6 vezes a atividade da MPO quando

comparado com o controle negativo. Os resultados mostraram também que os

tratamentos realizados em diferentes intervalos (24/24 h e 12/12 h) e com variadas

doses de GCM foram capazes de reduzir a atividade enzimática de forma

significativa. A dose de 75 mg/Kg de glucanas reduziu em cerca de 3,7 e 3,8 vezes a

atividade de MPO quando administrada em intervalos de 12 h e 24 h,

respectivamente. A redução da atividade enzimática com relação ao controle

positivo foi dose-dependente e os diferentes intervalos de tratamentos não mostrou

interferir de forma estatisticamente significativa no efeito de GCM.

FIGURA 14: Efeito de GCM na atividade da enzima mieloperoxidase na inflamação intestinal de

animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio

padrão. *** p < 0,001.

4.2.3 Atividade da fosfatase alcalina

A atividade da enzima fosfatase alcalina (FA) colônica foi outro parâmetro

bioquímico analisado no modelo de colite induzida por TNBS. Foi verificado altos

níveis (1,14 ± 0,011 U/mg e 1,12 ± 0,097 U/mg, para os grupos tratados a cada 12 h

e 24 h, respectivamente) de FA nos grupos com colite induzida com TNBS (FIGURA

15). A razão para o aumento da FA colônica encontrado na retocolite ulcerativa é

desconhecida, mas essa relação foi demonstrada pela primeira vez por SÁNCHES

DE MEDINA et al. (1996) quando relataram que a FA constitui um marcador sensível

e seguro de colite experimental em ratos. A atividade da enzima fosfatase alcalina

(FA) colônica foi reduzida significativamente apenas nos grupos tratados com 50

mg/Kg (0,77 ± 0,13 U/mg; p < 0,05) e 75 mg/Kg (0,75 ± 0,028 U/mg; p < 0,01) de

GCM em intervalos de 24 horas. O efeito observado foi dose-dependente e foi

verificada a redução de até 33 ± 2,5% na atividade da FA. O grupo tratado com 75

mg/Kg de GCM em intervalos de 24 h não exibiu diferença estatística com os grupos

tratados com dexametasona (ns; p >0,05).

FIGURA 15: Avaliação do efeito de GCM sobre a atividade da fosfatase alcalina no tecido do

colônico de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a

média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.

4.2.4 Atividade da catalase (CAT)

O sistema antioxidante é usualmente utilizado para avaliar o efeito protetor de

compostos diversos na inflamação colônica. Os níveis de catalase na região

colônica de grupo de animais que não recebeu TNBS foi de 537,23 ± 17,5 nmol

H2O2/mim/g de proteina. A administração de TNBS aumentou os níveis de CAT para

723,52 ± 137 nmolH2O2/mim/g de proteina. Em todos os grupos tratados com GCM

foi verificado aumento moderado dos níveis de CAT de forma dose-dependente até

1300,61 ± 141 (p < 0.05) e 1577,28 ± 37,5 (p < 0,05) nos grupos tratados com 75

mg/Kg em intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente, com relação ao grupo controle

positivo (FIGURA 16). O leve aumento da atividade da catalase observado no grupo

controle positivo não apresentou diferença estatística significativa com o grupo

controle negativo (ns; p > 0,05).

FIGURA 16: Efeito de diferentes doses de GCM na catalase do tecido do cólon em animais

com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ** p <

0,01; *** p < 0,001

4.2.5 Óxido nítrico

O óxido nítrico, na maioria dos fluidos corporais é rapidamente metabolizado

em produtos estáveis, tais como nitrito e nitrato. De acordo com os resultados

obtidos (FIGURA 17), as glucanas mostraram reduzir significativamente (p < 0,001)

o teor de NO2/NO3 em todos os grupos (n = 4) tratados com GCM em intervalos de

12 e 24 h. Em reações inflamatórias, o oxido nítrico derivado de células estimuladas

pela ação de citocinas estão envolvidos com alterações na permeabilidade vascular

do tecido inflamado (CHANG; CHAN; CHAN, 2003). Assim, é possível que a redução

deste mediador inflamatório esteja relacionado com o potencial anti-inflamatório de

GCM.

FIGURA 17: Efeito de diferentes doses de GCM no teor de óxido nítrico no tecido do cólon no

modelo de colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ***

p < 0,001

4.2.6 Análise de citocinas

As alterações do ambiente colônico observadas no processo inflamatório

intestinal geralmente estão associadas a respostas imunes atípicas de células T que

frequentemente levam a alteração dos níveis de citocinas. Foi verificado que nos

grupos tratados com TNBS os níveis de IL-1 e IL-6 aumentaram cerca de 4,7 e 4,1

vezes, respectivamente, quando comparado ao grupo não-tratado. GCM não foram

capazes de alterar os níveis de IL-1 em nenhum dos grupos testados (FIGURA 18A).

Entretanto, foi verificado o efeito de GCM sobre a liberação de IL-6 nos grupos

tratados em diferentes intervalos e de forma dose-dependente chegando a reduzir

até 64,8 ± 4,11% e 57,2 ± 6,45% os níveis desta citocina no tecido colônico do grupo

tratado com 75 mg/Kg de glucanas nos intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente

(FIGURA 18B).

FIGURA 18: Efeito de GCM na modulação da liberação de citocinas (A) IL-1 e (B) IL-6 no tecido

do cólon (n = 4) com inflamação induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ±

desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.

4.2.7 Análises histológicas

O alto infiltrado de neutrófilos é uma conseqüência bem característica deste

modelo experimental de inflamação aguda. A avaliação histopatológica revelou a

destruição das criptas e um proeminente infiltrado de células inflamatórias na

submucosa (FIGURA 19A). O grupo controle negativo não exibiu alteração

morfológica, no qual as camadas teciduais (mucosa, submucosa e muscular da

muscosa) podem ser claramente identificadas (FIGURA 19B).

O tratamento com dexametasona (FIGURA 19I-J) e com GCM em diferentes

intervalos de tempo e dose (FIGURA 19C-H) foram capazes de reduzir o dano às

criptas intestinais bem como o infiltrado, fato corroborado com a redução observada

na atividade da enzima mieloperoxidase.

FIGURA 19: Análise histológica do cólon de diferentes grupos de animais com colite induzida

por TNBS. (A): animais do controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada

12 h e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos de 12 h e 24 h,

respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com

75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com a 1 mg / Kg de

dexametasona.

4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON HUMANO

(HT-29)

4.3.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT)

Para avaliar o efeito de GCM sobre as células do carcinoma de colon humano

foi utilizado o método do MTT (FIGURA 20).

A viabilidade mitocondrial (através da avaliação da atividade de

desidrogenases mitocondriais), e conseqüentemente, a viabilidade celular, é

quantificada pela redução do sal MTT pelas células a um produto de coloração

arroxeada e insolúvel em água chamado formazan. Este produto, acumulado dentro

da célula, é extraído através da adição de um solvente apropriado (MOSMANN,

1983).

Neste ensaio foi verificado que as concentrações mais baixas (6,25, 12,5 e 25

µg/100 µL) não apresentaram efeito tóxico em até 72h de incubação com as

glucanas em estudo. Entretanto, o aumento da concentração para 50 e 100 µg/100

µL de GCM reduz a viabilidade em 46,7% e 64,8%, respectivamente, quando

incubadas por um período de 24 horas. Além disso, o aumento do período de

incubação para 48 e 72 horas resultou na inibição significativa da viabilidade das

células HT-29 da ordem de 90% em ambas as concentrações.

FIGURA 20: Efeito de diferentes doses de GCM na viabilidade de células do carcinoma de

cólon humano (HT-29) nos períodos de incubação de 24, 48 e 72 horas. Os dados foram

expressos como a média ± desvio padrão. (a): p < 0,01; (b): p < 0,001.

4.3.2 Ensaio de apoptose

Células em apoptose apresentam alterações na membrana plasmática como,

por exemplo, a transferência da fosfatidilserina da camada interior da membrana

plasmática para a exterior (BRATTON et al., 1997). A fosfatidilserina foi quantificada

pela sua ligação a anexina V, uma proteína de recombinação que apresenta uma

afinidade específica para moléculas de fosfatidilserina. Neste ensaio, as células

necróticas foram quantificados por coloração de PI, composto somente permeável a

células mortas.

As FIGURAS 21 e 22 mostram o efeito de GCM na apoptose em células HT-

29 por coloração com anexina V-FITC/PI. A porcentagem de células em apoptose

precoce (anexina V-positiva/PI-negativo) aumentou de 9,27% no grupo não tratado

para 11,66% no grupo tratado com 0,5mg/mL (p < 0,05) e para 14,06% no grupo

tratado com 1 mg/mL (p < 0,001) de GCM, resultando em um aumento de cerca de

20% e 36%, respectivamente. Além disso, houve uma considerável redução de

células necróticas (anexina V-positiva/PI-negativo) de 67,5% e 66,8% para os

grupos tratados com 0,5 e 1 mg/mL (p < 0,01) de GCM. Estes resultados

demonstraram que GCM suprimiram a proliferação de células HT-29 através da

indução de apoptose.

FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V-FITC e PI em

células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram tratadas com 50 ou 100 μg de

GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM,

(C): células tratadas com 100 μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para

anexina V-FITC e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito:

marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia); quadrante

inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células viáveis); quadrante inferior

direito: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células não viáveis – apoptose

precoce).

FIGURA 22: Efeito de GCM na viabilidade das células de carcinoma de cólon humano (HT-29)

avaliada por citometria de fluxo. Células viáveis: marcação negativa para anexina V-FITC (V) e PI;

Células não viáveis: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células em apoptose

precoce); marcação negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células em necrose); marcação

positiva para anexina V-FITC e PI (células em apoptose tardia). Valores foram expressos por médias

± desvio padrão. (a): p < 0,005; (b): p < 0,001.

4.3.3 Ensaio de distribuição do ciclo celular

A proliferação celular descontrolada é uma característica típica de câncer

(HANAHAN; WEINBERG, 2011). Controlando a progressão do ciclo celular das

células cancerosas pode-se impedir ou atrasar a progressão do tumor. Muitos

agentes anticâncer aprisionam o ciclo de células cancerosas em G1, S e G2 / M fase

(MORK; FALLER; SPANJAARD, 2005).

A análise da influência de GCM na progressão do ciclo celular das células HT-

29 foi avaliada pela coloração com iodeto de propídio e posterior analise por

citometria de fluxo (FIGURA 23 e TABELA 1). O iodeto de propídio é um agente que

se intercala às duplas fitas de DNA de células danificadas emitindo fluorescência. A

excitação do iodeto de propídio resulta na emissão de fluorescência celular

proporcionalmente ao conteúdo de DNA.

Não houve alteração significativa na fase S e uma leve alteração ocorreu na

fase G2/M de células tratadas com a concentração de 1 mg/mL de GCM (p < 0,05).

No entanto, foi verificado que o tratamento com as glucanas induziram um acúmulo

de células na fase G1 com relação às células não tratadas (37,93%). O aumento

verificado foi da ordem de 29% e 32,8% para as células tratadas com 0,5 e 1 mg/mL

(p < 0,001), respectivamente, de GCM.

FIGURA 23: Análise da distribuição no ciclo celular das células do carcinoma de cólon humano

(HT-29). (A): distribuição do ciclo celular das células não tratadas (células controle), (B): distribuição

do ciclo celular das células tratadas com 50 μg de GCM, (C): distribuição do ciclo celular das células

tratadas com 100 μg de GCM.

TABELA 1: Avaliação do efeito de GCM na distribuição das células do carcinoma de cólon

humano (HT-29) no ciclo celular. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. Fases

do ciclo celular - G1: gap 1; G2: gap 2; S: fase de síntese.

4.3.4 Ensaio de adesão

Este ensaio foi realizado visto que, eventos de adesão célula-célula e célula

matriz extracelular (MEC) são de grande importância no organismo.

Matrigel® é um composto constituído por diferentes proteínas da matriz

extracelular que incluem laminina, colágeno IV e entactina (KLEINMAN; MARTIN,

2005). A capacidade de células tumorais de alterar a sua migração e adesão aos

componentes da matriz extracelular (MEC), faz com que essas células contornem

obstáculos mais facilmente e alcançem a circulação, não se depositando em outros

locais do organismo.

Foi investigado a capacidade do tratamento com GCM de alterar a aderência

das células HT-29 (FIGURA 24). Os resultados mostram que o tratamento com as

glucanas na concentração de 25 mg/mL afetou de forma moderada (68,72%) a

aderência das células HT-29 ao matrigel. Além disso, o aumento das concentrações

para 50 e 100 mg/mL, reduziu significativamente em cerca de 84,75% e 85,25%,

essa aderência ao Matrigel.

FIGURA 24: Efeito de GCM sobre a adesão de células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

ao matrigel. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001.

4.3.5 Ensaio de atividade antioxidante

As concentrações intracelulares de ROS foram avaliadas de acordo com as

alterações na intensidade de fluorescência de DCF.

Diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) é um indicador útil de espécies

reativas de oxigênio (ROS) e estresse oxidativo. DCFH-DA atravessa as membranas

celulares e é hidrolisada por esterases intracelulares a um composto não

fluorescente diclorohidrofluoresceina (DCFH). Na presença de ROS, tal como

peróxido de hidrogénio (H2O2), hidroperóxidos lipídicos e peroxinitrito, DCFH é

oxidado para fluorescente diclorofluoresceína (DCF) (GIRARD-LALANCETTE;

PICHETTE; LEGAULT, 2009).

A FIGURA 25 mostra que a incubação das células com H202 provocou um

aumento na geração de ROS intracelular nas células HT-29. Entretanto, também foi

visto que quando as células foram tratadas com as diferentes concentrações de

GCM, foi verificado uma redução significativa de ROS intracelular para todas as

concentrações testadas.

FIGURA 25: Avaliação da atividade antioxidante in vitro de GCM em células do carcionoma de

cólon humano (HT-29). Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05.

5 DISCUSSÃO

Polissacarídeos são compostos biologicamente ativos que podem ser úteis

para a utilização farmacêutica (ZHU et al., 2013; MA et al., 2013).

Diversos polissacarídeos fúngicos têm sido investigados por apresentarem

uma ampla variedade de ações farmacológicas. Entretanto, sua aplicação

terapêutica parece estar relacionada à estrutura química. A conformação espacial de

cada biomolécula e pequenas diferenças estruturais de cada polímero podem

resultar em características únicas para diferentes aplicações biotecnológicas

(WASSER, 2002; COLLEONI-SIRGHIE; FULTON; WHITE, 2003).

A extração aquosa de polissacarídeos é uma das técnicas mais utilizadas nos

estudos científicos (GIACOMINI et al., 2003; BELLINI et al., 2006; KOZARSKI et al.,

2011; FINIMUNDY et al., 2013). Sua eficiência na obtenção dos polissacarídeos, o

alto rendimento e o baixo custo podem ser os principais motivos de sua larga

utilização.

Jeong et al., (2004) também mostraram que extratos solúveis em água e o

precipitado etanólico obtido a partir dos corpos de frutificação do fungo Coriolus

versicolor apresenta altos teores de polissacarídeos (74%). Assim, após extração

aquosa do fungo Caripia montagnei, os valores ficaram em torno de 96% para

açúcares totais, demonstrando que o composto extraído de Caripia montagnei é

composto prioritariamente por polissacarídeos. Estudos anteriores com

polissacarídeos de C. montagnei obtidos após extração aquosa, também mostraram

altos teores de carboidratos (QUEIROZ et al., 2010; CASTRO et al., 2014). Esse

resultado mostra que a extração aquosa dos corpos de frutificação de fungos é uma

forma eficiente de obtenção de polissacarídeos.

Uma das primeiras medidas a serem tomadas a respeito da análise estrutural

de um polissacarídeo é conhecer os resíduos monossacarídicos que o constituem

(NELSON; COX, 2000). No presente estudo com C. montagnei foram encontrados

resíduos de glicose, como sendo seu principal constituinte. Esta mesma composição

monossacarídica foi encontrada por QUEIROZ et al., (2010) ao estudar um extrato

rico em polissacarídeos de C. montagnei.

A análise de infravermelho é comumente aplicada à identificação de

características estruturais específicas, como a configuração das ligações glicosídicas

e a presença de proteína (GUTIÉRREZ; PRIETO; MARTÍNEZ, 1996; KRCMAR et al.,

1999). Neste estudo, observamos a presença de sinais em algumas bandas do

espectro que estariam possivelmente relacionadas com a presença α- e β- glucanas.

Isto foi confirmado pelas análises de RMN.

Foi previamente relatado que o extrato aquoso rico em polissacarídeos dos

corpos de frutificação de Caripia montagnei apresentou potencial anti-inflamatório

utilizando-se modelos de edema plantar induzido por carragenana e peritonite

induzida por tioglicolato. Observou-se, também, redução no edema inflamatório e

nos níveis de migração leucocitária diminuindo os níveis de óxido nítrico, IL-10 e

IFN-γ, além da inibição da expressão do fator nuclear κB no lavado peritoneal de

camundongos (QUEIROZ et al., 2010). Polissacarídeos de C. montagnei também

apresentaram atividade anti-inflamatória no modelo de pleurisia induzida por

carragenana, além de ações anti-angiogênica e antioxidante (CASTRO et al., 2014).

Neste estudo, as glucanas extraídas do fungo Caripia montagnei (GCM)

foram utilizadas para avaliar seu potencial anti-inflamatório em um modelo bem

descrito de colite induzida por TNBS e sua ação sobre células do carcinoma do

cólon humano, HT-29.

Doenças inflamatórias do intestino (DII), que incluem a Colite Ulcerosa (UC) e

Doença de Crohn (DC), são inflamações idiopáticas crônicas no intestino,

caracterizadas por disfunção das células T da mucosa, produção anormal de

citocinas e inflamação celular resultando em danos no intestino delgado distal e

mucosa colônica, o que resulta em friabilidade difusa e sangramento (MAGALHAES,

1993; FIOCCHI, 1998; CHENG et al, 2007).

Ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e sulfato de sódio utilizando dextrano

(DSS) ou oxazolina são normalmente utilizados em modelos de doenças

inflamatórias intestinais (DII) quimicamente induzidas devido à imediata inflamação,

a elevada reprodutibilidade e a simplicidade do processo de indução (HOFFMANN et

al., 2002).

Após a indução da colite com TNBS foi observada a presença de lesões

colônicas, como hiperemia e ulcerações. Nas análises histológicas também foram

observadas a destruição da camada mucosa e um proeminente e difuso infiltrado de

leucócitos.

A inflamação crônica e o aumento da proliferação de células epiteliais são

observados no exame patológico das DII’s. Em seguida, a infiltração de células

inflamatórias é encontrada na mucosa com inflamação crônica, resultando na

liberação de mediadores inflamatórios, espécies reativas de oxigênio e metabólitos

de nitrogênio (ZHOU et al., 2006; STROBER; FUSS; MANNON, 2007).

Três parâmetros bioquímicos associados com o desenvolvimento do processo

lesivo promovido pelo TNBS foram determinados para avaliar o possível mecanismo

de ação de GCM confirmado nas análises macroscópicas.

Dentre os parâmetros bioquímicos destacam-se as alterações da atividade da

mieloperoxidase (MPO), da fosfatase alcalina (FA) e da catalase (CAT).

A MPO é a enzima encontrada nos grânulos azurofílicos de neutrófilos e que

catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de cloro, a

ácido hipocloroso (HClO). Este é um potente oxidante envolvido no mecanismo de

defesa contra agentes infecciosos, mas que também pode atuar sobre as células,

resultando em danos (KETTLE; WINTERBOURN, 1991).

Esses neutrófilos ativados produzem espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio na mucosa intestinal induzindo estresse oxidativo, que desempenha um

papel significativo na patogênese das doenças inflamatórias intestinais (MARTIN et

al., 2006; TALERO et al., 2008). Neutrófilos também foram sugeridos por contribuir

marcadamente no dano tecidual e disfunção da mucosal em humanos com IBD bem

como em modelos animais de colite (GUO et al., 1999). Além disso, a inibição da

função dos neutrófilos levou a redução do dano tecidual (CASTRO, 1985; PALMEN

et al., 1995).

Assim, níveis teciduais de atividade da MPO são usados como um

quantitativo para medir a infiltração de neutrófilos na resposta inflamatória tanto na

clínica como em estudos experimentais (KRAWISZ et al., 1984).

Carlson et al., (2002) sugeriram que o influxo de neutrófilos ativos nos sítios

de inflamação governa o processo inflamatório de diversas doenças. As analises

histológicas corroboram com a redução dos níveis de MPO, de modo que pode ser

visualizada a redução da infiltração celular no tecido inflamado.

Um extrato aquoso de Innonotus obliquos mostrou também reduzir os níveis

de MPO no tecido colônico de camundongos com colite induzida por DSS (MISHRA

et al., 2012). Entretanto, o pleuran, uma beta-glucana isolada do cogumelo Pleurotus

ostreatus, mostrou não prevenir contra o aumento da MPO no tecido colônico de

animais com inflamação induzida por ácido acético (NOSÁL'OVÁ et al., 2001).

Os mediadores do processo inflamatório estão em intensa atividade após a

administração de TNBS, dados que podem ser observados pela atividade da

mieloperoxidase (FIGURA 13) e da fostatase alcalina (FIGURA 14), quando

comparados os animais do grupo controle positivo e negativo. As doses de 75 e 50

mg/Kg, respectivamente, conseguiram reduzir significativamente os níveis destas

enzimas no tecido colônico.

A fosfatase alcalina (FA) compreende um grupo de enzimas fosfohidrolases

que apresentam atividade máxima em pH alcalino próximo a 10. Esta é uma enzima

de ocorrência natural presente nas células e nos tecidos. A isoforma da FA intestinal

é expressa em grande quantidade no revestimento intestinal (GOLDBERG et al.,

2008; TUIN et al., 2009), sendo, assim, considerada um marcador de diferenciação

das células epiteliais do intestino (FUKUSHIMA et al., 1998; LEE et al., 2005).

A razão para o aumento da FA colônica encontrado na retocolite ulcerativa é

desconhecida, mas essa relação foi demonstrada pela primeira vez por Sánches de

Medina et al., (1996) quando relataram que a FA constitui um marcador sensível e

seguro de colite experimental em ratos.

Sánches de Medina et al., (2004) demonstraram que a atividade da fosfatase

alcalina estava aumentada em diferentes modelos de colite, fato que foi atribuído a

presença excepcional de células epiteliais e células da lâmina própria,

principalmente leucócitos.

A geração aumentada de espécies reativas de oxigênio também foi

considerada como um papel chave na patogênese da DII (BUFFINTON; DOE, 1995;

PAVLICK et al., de 2002).

Sob condições fisiológicas normais, as defesas antioxidantes protegem os

tecidos dos danos causados pelos radicais livres, que podem causar lesões nos

tecidos quando em excesso. Alguns mecanismos de defesa do organismo, como a

catalase, são relativamente deficientes no cólon quando comparados aos do fígado.

Este fato pode sugerir que o dano oxidativo na mucosa colônica ocorra de forma

intensa (THAM et al., 2002).

A catalase (CAT) é uma enzima presente no sangue, na medula óssea, nas

mucosas, no rim e no fígado (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; RAHMAN et al.,

2006), que tem função antioxidante e atua catalisando a redução do peróxido de

hidrogênio (H2O2) a água (H2O) e oxigênio (O2).

GCM mostraram aumentar os níveis desta enzima no tecido colônico de

animais com colite induzida por TNBS. É possível que este aumento nos níveis da

catalase seja considerado um importante fator de proteção contra os altos índices de

oxidantes gerados durante o processo inflamatório colônico.

Um extrato do fungo Pleurotus ostreatus também mostrou elevar os níveis de

catalase em ratos Wistar com dano hepático induzido por tetracloreto de carbono

(CCL4-). Além disso, o tratamento com este extrato restabeleceu os níveis da

enzima fosfatase alcalina, que foram aumentados significativamente em decorrência

da administração do CCL4- (JAYAKUMAR; RAMESH; GERALDINE, 2006).

Os fármacos convencionais mais utilizados no tratamento da colite ulcerativa

são os aminosalicilatos que auxiliam a manter a remissão das crises, os corticóides

que são utilizados durante os episódios agudos e os imunomoduladores (HEAD;

JURENKA, 2003). Um grande número de drogas que atuam como anti-inflamatórios

gerais ou seletivos têm sido empregados, porém consegue-se a remissão das

crises, mas não a cura da doença (BIONDO-SIMÕES et al., 2003).

A maioria dos efeitos dos derivados de cogumelos inclui mitogenicidade e

ativação de células do sistema imunológico como células hematopoiéticas, linfócitos,

macrófagos e células NK, resultando na produção de citocinas (LULL; WICHERS;

SAVELKOUL, 2005). A ativação de macrófagos pela via clássica leva a secreção de

óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias enquanto a ativação pela via alternativa

leva a liberação de citocinas anti-inflamatórias (GORDON, 2003).

Diversos estudos já comprovaram efeitos dos polissacarídeos fúngicos sobre

macrófagos. O extrato aquoso de Clinopodium vulgare mostrou reduzir os níveis de

IL-1β e IL-10 em cultura de células RAW 264.7 (BURK et al., 2009). Polissacarídeos

isolados de Phellinus linteus apresentaram atividade tumoricida de macrófagos

induzida pelo aumento de óxido nítrico (HAN et al., 1999; KIM; OH; PARK, 2003).

O sistema imunológico do intestino juntamente com as citocinas

desempenham um papel fundamental no mecanismo de patogênese em UC. A IL-10

já foi estudada por ser uma citocina reguladora que influencia e contribui para

homeostasia da mucosa gastrointestinal e tem sido considerada uma citocina anti-

inflamatória em modelos de doenças inflamatórias do intestino (KUHN et al., 1993;

SANCHEZ-MUNOZ; DOMINGUEZ-LOPES; YAMAMOTO-FURUSHO, 2008; LIU et

al., 2012) . Além disso, a citocina pró-inflamatória IL-4 também foi estudada em

modelos de inflamação colônica e foi vista que sua superexpressão está associada

com colite ulcerosa grave (KAMPEN; GAULDIE; COLLINS, 2005).

Dentre as substancias mais utilizadas nos tratamentos das doenças

inflamatórias intestinais pode-se destacar a tocilizumab que atua na inibição da Il-6

(STALLMACH; HAGEL; BRUNS, 2010). GCM também mostraram reduzir

potencialmente os níveis desta citocina no tecido colônico, bem como os níveis de

óxido nítrico (FIGURAS 16 e 17).

O óxido nítrico, um outro importante mediador inflamatório, participa da

regulação de muitas funções do intestino como absorção, secreção e motilidade. A

expressão da sua isoforma induzível (iNOS) e a alta concentração de NO produzido

desempenham um papel importante na patogênese da DII. Kolios et al., 2004,

observaram que biópsias do reto de pacientes com colite ulcerativa apresentaram

elevada concentração de citrulina, um co-produto do óxido nítrico.

Um extrato aquoso de Inonotus obliquus, também demonstrou efeito anti-

inflamatório no modelo de colite induzida por DSS atuando na redução da atividade

da MPO bem como nos níveis de citocinas como a IL-6 (MISHRA et al., 2012).

Há relatos que pacientes portadores de doenças inflamatórias intestinais

apresentam um aumento no risco de desenvolvimento de câncer colorretal,

principalmente na doença crônica (ITZKOWITZ; YIO, 2004; SHANAHAN;

BERNSTEIN, 2009).

A estrutura do polissacarideo fúngico está fortemente relacionada com o seu

potencial antitumoral. Estudos anteriores tem-se centrado principalmente na

estrutura da β-glucana e sugeriu que a (1,3) -β-glucana com ligações -β- (1,6) é

importante para a atividade antitumoral, aumentando a atividade das células imuno-

competentes (KODAMA et al, 2002;. WASSER, 2002). No entanto, existem alguns

polissacarideos antitumorais com diferentes estruturas químicas, tais como α-

glucana (KIHO et al., 1989).

O desenvolvimento e crescimento de tumores são consideradas como um

resultado da elevada capacidade proliferativa das células tumorais. A relação entre a

apoptose e suas vias de sinalização têm um profundo efeito sobre a progressão do

câncer (LOWE; LIN, 2000).

CASTRO et al., 2014 mostraram que polissacarídeos de C. montagnei

interferem na viabilidade de células normais e tumorais de forma diferenciada. Em

48 horas de tratamento, a concentração de 50 μg/100μL de polissacarídeos não

afetou a viabilidade de fibroblastos (3T3), enquanto que essa mesma concentração

matou em torno de 50% das células de câncer cervical (HeLa). A inibição da

proliferação de células HT-29 foi observada neste estudo no qual o efeito de GCM

mostrou ser dose e tempo-dependente.

A maioria dos agentes antineoplásicos podem atuar inibindo a proliferação de

células tumorais por induzir diretamente o dano ao DNA ou induzir indiretamente

vias de sinalização secundárias sensíveis ao estresse. Dessa forma, desencadeiam

a apoptose pela ativação da via apoptótica intrínseca, e alguns podem, ainda, ativar

simultaneamente a via do receptor extrínseco. Uma evidência crescente sugere que

proteínas da família a Bcl-2 desempenham um papel central na apoptose celular

(BURLACU, 2003)

Os resultados obtidos neste estudo mostraram que células HT-29 tratadas

com GCM aumentaram consideravelmente o número de células em apoptose, com a

concomitante redução do numero de células necróticas.

Ha muito tempo, a apoptose é reconhecida como o principal mecanismo pelo

qual os agentes quimioterapicos do câncer e da radioterapia matam as células. A

apoptose pode ser desencadeada por diversas formas de estímulos ou tensões

fisiológicas, tais como as citocinas, os radicais livres e dano ao DNA (BRUNNER et

al, 2003;. HARMAN, 1992; ROOS; KAINA, 2006).

Espécies reativas de oxigênio (ROS) podem iniciar a transformação das

células, causando alterações que levam a mutações durante a replicação do DNA,

enquanto que em células já transformadas, ROS desempenha um papel importante

na iniciação e execução da apoptose (GACKOWSKI et al., 2002; JUAN et al., 2008).

Neste sentido, as propriedades quimiopreventivas de antioxidantes para o câncer,

acredita-se ser devido à sua capacidade de sequestrar ROS endógeno. O estresse

oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre a produção de oxidantes celular e

capacidade antioxidante. Estudos anteriores utilizando extratos polissacarídicos

aquosos de C. montagnei mostraram que estes polissacarideos atuavam na

varredura de radicais superoxido, hidroxila, como também na inibição da

peroxidação lipídica, demonstrando que estes polissacarídeos possuem forte

potencial antioxidante (CASTRO et al., 2014). Neste estudo foi verificado que GCM

nas concentrações de 25 e 50 μg/100μL apresentam apenas uma leve habilidade

varredora de ROS intracelular em células HT-29.

Por outro lado, também é possível que o fraco efeito de GCM sobre ROS

possa ser um fator importante na indução da apoptose.

Em um outro estudo, o aumento na geração de ROS pelo tratamento com

EPS, um exoplissacarídeo extraido da levedura Trichoderma pseudokoningii, foi

apontado como um estímulo apoptótico para as células K562 (HUANG et al., 2012).

A indução de parada do ciclo celular tem sido considerada como a maior

causa de anti-proliferação (HSIAO et al., 2007)

A proliferação celular descontrolada é uma característica típica do câncer

(HANAHAN; WEINBERG, 2011). Portanto, a regulação do ciclo celular é

considerado como um importante alvo para terapia do câncer. Checkpoints do ciclo

celular são as vias-chave de regulação e monitoramento de transição de fases do

ciclo celular (HARTWELL; WEINERT, 1989). Resposta ao estresse celular, tais

como tóxico ou quebra do DNA, podem parar a divisão das aberrantes células

cancerosas (BJELLAND; SEEBERG, 2003).

Numerosos estudos tem mostrado que polissacarídeos podem induzir arrasto

do ciclo celular em diferentes fases (ALVES et al., 2012; DORE et al., 2012).

Neste estudo, células HT-29 tratadas com GCM mostraram a tendência a se

acumular em G1. Estudos anteriores têm demonstrado que um polissacarideo ligado

a proteínas do Phellinus Linteus induz apoptose e parada do ciclo celular em G2 / M,

diminuindo a Bcl-2 e ciclina B1 expressões em células SW480 (LI et al., 2004). Por

outro lado, outro estudo mostrou que polissacarídeos extraídos de P. linteus

mostraram indução de arrasto no ciclo celular na fase S mas sem indução de

apoptose (ZHONG et al., 2013).

Também foi investigado o efeito de GCM na adesão de células HT-29.

Metástase do câncer tem sido descrita como uma série complexa de etapas,

isto é, adesão de células cancerosas, invasão, migração e circulação no sangue e

linfa (STACKER et al., 2002; PLAYFORD; SCHALLER, 2004; HANNIGAN;

TROUSSARD; DEDHAR, 2005). Destes eventos, a adesão celular é um importante

fenómeno biológico necessário para o funcionamento dos organismos vivos. As

células dentro do corpo estão firmemente ligadas ao apoio matricial ou seja, a matriz

extracelular (MEC). Este MEC não só fornece suporte estrutural, mas também

fornece um meio de regular o comportamento celular (KIM et al., 2011).

As proteínas da MEC promovem adesão celular por ligação ao receptor de

superfície celular, as integrinas (KLEINMAN et al., 1986; KRAMER et al., 1989).

Após a ligação à MEC, as células cancerosas apresentam tendência a invadi-la.

Essas células partem do tumor primário, aos quais estão ligadas, e penetram nas

paredes do vaso sanguíneo, daí migrando para novos locais, e finalmente, formando

os tumores secundários.

Neste estudo, observou-se que GCM diminuiram a adesão de células HT-29

ao matrigel, mistura complexa de proteinas de matriz extraceular. Já que a adesão

celular desempenha um papel fundamental na migração celular, os efeitos de GCM

na adesão de células HT-29 pode estar relacionado com o retardamento da

migração celular, indicando seu possível potencial anti-metastático.

Assim, este estudo corrobora com os resultados obtidos em estudos

anteriores e vem ampliar os conhecimentos acerca dessas glucanas que

apresentam importante potencial imunomodulador, atuando como anti-inflamatório

no tecido colônico como demonstrado pelas análises bioquímicas, imunológicas e

histológicas no modelo de colite induzido por TNBS. Adicionalmente, GCM

apresentou potencial antitumoral contra células HT-29, atuando principalmente na

indução da apoptose, no arrasto do ciclo celular e na prevenção da adesão da celula

tumoral.

6 CONCLUSÕES

As análises colorimétricas mostraram que o composto obtido de Caripia

montagnei apresenta prioritariamente carboidratos e indicam um baixo teor de

proteínas e compostos fenólicos;

Os polissacarídeos extraídos de Caripia montagnei por cromatografia

descendente em papel apresentaram glicose como componente monossacarídico;

As análises de infravermelho dos extratos do fungo C. montagnei

demonstraram a presença de polissacarídeos, enquanto as análises de RMN

confirmaram as α- e β- glucanas como constituinte polissacarídico deste composto

(GCM);

A ação anti-inflamatória intestinal de GCM no modelo de colite induzida por

TNBS foi observada em análises macro e microscópicas, em que houve redução de

dano tecidual e de células inflamatórias;

GCM mostraram habilidade em modular os níveis de importantes marcadores

bioquímicos como mieloperoxidase, fosfatase alcalina e catalase em animais com

colite induzida por TNBS;

GCM também modularam os níveis de importantes marcadores imunológicos,

como óxido nítrico e IL-6, uma importante citocina inflamatória;

A ação citostática foi promovida por GCM, uma vez que atuaram na inibição

da proliferação de células HT-29, fato este que pode ter sido ocasionado pela

parada do ciclo celular (não progressão da fase G1 para fase G2);

GCM mostrou induzir apoptose em células HT-29 quando avaliadas por

citometria de fluxo;

GCM também apresentaram leve antioxidante e alta ação antiadesiva em

células HT-29, sugerindo seu potencial como agente antimetastático.

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