Processos biológicos Aula: Sistemas de Tratamento Aeróbio Prof. Evelin Márcia Viana Acadcorp.
Efeitos do exercício físico aeróbio sobre a lesão pulmonar … · manipular e cuidar dos...
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CAMILA LIYOKO SUEHIRO Efeitos do exercício físico aeróbio sobre a lesão pulmonar induzida por exposição à fumaça de cigarro em modelo experimental de síndrome metabólica Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Programa de Patologia Orientador: Prof. Dr. Chin Jia Lin São Paulo 2018
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CAMILA LIYOKO SUEHIRO
Efeitos do exercício físico aeróbio sobre a lesão
pulmonar induzida por exposição à fumaça de cigarro
em modelo experimental de síndrome metabólica
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de Patologia
Orientador: Prof. Dr. Chin Jia Lin
São Paulo
2018
CAMILA LIYOKO SUEHIRO
Efeitos do exercício físico aeróbio sobre a lesão
pulmonar induzida por exposição à fumaça de cigarro
em modelo experimental de síndrome metabólica
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de Patologia
Orientador: Prof. Dr. Chin Jia Lin
Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018, de 13 de Outubro de 2011.
A versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP.
São Paulo
2018
Dedicatória
Aos meus pais, Dirce e Mario,
Aos meus irmãos, Adriana e Fábio,
Ao meu avô, Yoshiharu (in memoriam),
Dedico este trabalho.
Agradecimentos
Agradeço a Deus, em primeiro lugar, por proporcionar
tantas bênçãos em minha vida, guiar meus passos e colocar
pessoas especiais no meu caminho!
Finalizo uma etapa muito importante da minha vida,
tanto profissional quanto pessoal, com a escrita desta tese, que
só foi possível ser concluída devido à ajuda de várias pessoas a
quem sou muito grata...
Aos meus pais, Dirce e Mario, minha base, meus primeiros
educadores, meus exemplos de trabalhadores honestos e
dedicados, agradeço por todos os sacrifícios que fizeram para
que eu pudesse ter uma boa formação e por tantas vezes
abrirem mão dos próprios sonhos para que eu pudesse viver os
meus. Muito obrigada por tudo, amo vocês!
Aos meus irmãos, Adriana e Fábio, agradeço por sempre
se preocuparem comigo. Obrigada pelo amor e cuidado, amo
vocês!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Chin Jia Lin, agradeço pela
confiança em mim depositada para a execução deste projeto,
por estar sempre disposto a me ensinar com tanta paciência e
humildade, por me dar liberdade para fazer escolhas e tomar
decisões, por me tranquilizar nos momentos de desespero e por
aceitar me orientar à distância quando precisei me ausentar
do laboratório por motivos pessoais. Admiro-o pelo excelente
profissional que é, mas, principalmente, pela enorme bondade
que tem em seu coração! Muito obrigada por tudo!
À minha co-orientadora, Dra. Alessandra Choqueta de
Toledo-Arruda, minha “mãe” na carreira científica, agradeço
por ter me oferecido infinitas possibilidades ao me dar a
oportunidade de fazer a pós-graduação na FMUSP, por ter me
apresentado a tantas pessoas que me ajudaram durante o
Doutorado e por me orientar em todas as etapas deste projeto,
mesmo à distância! Muito obrigada, Alê, por todo carinho e
preocupação comigo!
Ao Prof. Dr. Mílton de Arruda Martins, chefe do
Laboratório de Terapêutica Experimental (LIM-20) na época
em que ingressei no Doutorado, agradeço por ter aberto as
portas do LIM-20 para mim. Muito obrigada pelas sugestões e
pelo auxílio financeiro para a execução deste projeto!
Ao Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira, coordenador do
Laboratório de Imunologia Pulmonar e do Exercício (LABPEI),
agradeço por ter oferecido seu laboratório e os materiais
necessários para a realização dos experimentos de ELISA, além
de ter disponibilizado seus alunos para me ajudar. Muito
obrigada, Rodolfo!
À Profa. Dra. Kátia de Angelis agradeço por ter
disponibilizado seu laboratório, alunos e os materiais
necessários para a realização dos experimentos de estresse
oxidativo. Muito obrigada!
À Dra. Francine Maria de Almeida agradeço por ter me
ajudado nos experimentos e nas análises histológicas. Muito
obrigada, Fran, por sempre estar disposta a me ajudar em
tudo!
À Dra. Clarice Rosa Olivo agradeço por ter me ajudado
nos experimentos e por sempre estar disposta a esclarecer
minhas dúvidas. Muito obrigada, Claris, por tudo!
Ao Me. Adilson Santos Andrade de Sousa agradeço por
ter me ajudado tantas vezes na execução dos protocolos. Muito
obrigada!
Ao Dr. Manoel Carneiro de Oliveira Jr agradeço por ter
me ajudado a realizar os experimentos de ELISA. Muito
obrigada!
À Dra. Danielle da Silva Dias agradeço por ter me
ajudado a realizar os experimentos de estresse oxidativo. Muito
obrigada!
À Sara Hamaguchi agradeço por ter me ajudado a
realizar as medidas de mecânica respiratória. Muito
obrigada!
À Dra. Dolores Helena Rivero agradeço por ter me
ajudado a realizar as medidas de variabilidade da
frequência cardíaca. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. Raymundo Soares de Azevedo Neto,
coordenador do Programa de Pós-graduação em Patologia,
agradeço por ter acreditado no projeto e disponibilizado
auxílio financeiro para apresentação do trabalho em
congresso no exterior. Muito obrigada!
À Profa. Dra. Maria Lúcia Bueno Garcia, à Dra. Elnara
Marcia Negri e à Dra Fernanda Degobbi Lopes agradeço pelas
sugestões no meu exame de qualificação. Muito obrigada!
Ao Thiago Luiz Vieira Rezende agradeço pela ajuda com
as questões burocráticas da pós-graduação e por sempre
esclarecer minhas dúvidas. Muito obrigada!
À Rosana Ap. Vilela agradeço pela ajuda com questões
burocráticas e por sempre estar disposta a esclarecer minhas
dúvidas. Muito obrigada, Rô, por toda atenção e carinho!
À Natália Gomes Gonçalves agradeço por sempre
esclarecer minhas dúvidas em relação aos experimentos de
biologia molecular. Muito obrigada!
Ao Luiz Afonso Pires agradeço por ter me ensinado a
manipular e cuidar dos animais e pela ajuda nas questões
relacionadas ao biotério. Muito obrigada!
Ao Dr. Sérgio Catanozi agradeço por ter me ajudado a
marcar os meus animais. Muito obrigada, Sérgio, por me
tranquilizar e inspirar durante as poucas, mas intensas
conversas que tivemos!
Ao Davi Francisco Ferreira agradeço por ter me ajudado
tantas vezes com os animais. Muito obrigada, Davi, por sempre
estar disposto a me ajudar!
A toda equipe do LIM-20 agradeço pelo carinho, pela
disponibilidade em ajudar e pelos momentos de descontração.
Dra. Beatriz Saraiva, Dra. Carla Prado, Dra. Fernanda Lopes,
Dra. Fernanda Arantes, Dra. Edna Leick e seus respectivos
alunos, muito obrigada por tudo!
Às minhas amigas, Isabella Genaro, Tiyaki Ito, Daniela
Cervilha e Fabíola Zambon, agradeço por todo apoio, ajuda e
broncas para finalizar este ciclo. O caminho até aqui foi mais
alegre com vocês ao meu lado! Muito obrigada, Isa, Ti, Dani e
Fabi, pela presença nos melhores e piores momentos, por
ouvirem tantos desabafos e pelos melhores abraços e risadas,
não sei o que seria do meu Doutorado sem vocês!
Ao Danilo Antônio Corrêa agradeço pelo incentivo e
total apoio para o ingresso neste projeto. Muito obrigada, Dan,
por estar ao meu lado no início deste ciclo e por tudo que me
ensinou! À Adriana Santos e ao Nicola Balozzi agradeço por
todo carinho no começo desta fase, muito obrigada!
Aos meus amigos, Márcia Oliveira e Diogo Teixeira,
agradeço por me acolherem em seu lar quando precisei e pelos
tantos momentos de alegria. Muito obrigada, Marcinha e Di,
por todo carinho!
À minha amiga Renata Martins agradeço por estar ao
meu lado nos melhores e piores momentos e por me acolher em
seu lar quando precisei. Muito obrigada, Rê, por tudo!
Aos meus familiares agradeço por todo apoio, amor e
carinho!
Aos amigos que estiveram ao meu lado durante este
período agradeço pelos momentos de descontração, pelas
risadas e pelo carinho. Muito obrigada por tudo!
À CAPES e à FAPESP agradeço pelo auxílio financeiro
para a execução do projeto.
Aos animais utilizados neste projeto agradeço porque
sem eles não seria possível realizar este trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para
a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos!
“Happiness only real when shared”
(Christopher McCandless)
Epígrafe
Eclesiastes 3
Esta tese está de acordo com as seguintes normas:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria
F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Sumário
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas
Lista de símbolos
Resumo
Abstract
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1
2 OBJETIVOS .................................................................................................... 4
2.1 Objetivo geral .......................................................................................... 4
2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 4
3 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 5
3.1 Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) ..................................... 5
3.1.1 Epidemiologia ................................................................................... 7
3.1.2 Fatores de risco ................................................................................ 7
3.1.3 Fisiopatologia.................................................................................... 8
3.1.4 Comorbidades ................................................................................. 12
3.2 Síndrome metabólica ............................................................................ 13
3.2.1 Epidemiologia ................................................................................. 13
3.2.2 Fatores de risco .............................................................................. 15
3.2.3 Fisiopatologia.................................................................................. 15
3.3 Treinamento físico ................................................................................ 17
3.4 Modelos experimentais ........................................................................ 18
4 MÉTODOS .................................................................................................... 20
4.1 Animais .................................................................................................. 20
4.2 Grupos experimentais .......................................................................... 20
4.3 Exposição à fumaça de cigarro ........................................................... 21
4.4 Treinamento físico aeróbio e teste físico ............................................ 22
4.5 Exposição à frutose .............................................................................. 23
4.6 Calorimetria indireta ............................................................................. 24
4.7 Frequência cardíaca (FC), pressão arterial (PA) e variabilidade da
frequência cardíaca (VFC) .......................................................................... 24
4.8 Mecânica respiratória ........................................................................... 25
4.9 Coleta de sangue .................................................................................. 26
4.10 Lavado Broncoalveolar (LBA) ............................................................ 26
4.11 Preparações histológicas ................................................................... 26
4.11.1 Determinação do Intercepto linear médio (Lm) .......................... 27
4.11.2 Contagem de células inflamatórias no parênquima pulmonar . 27
4.11.3 Fibras colágenas e elásticas ....................................................... 27
4.12 Dosagem de citocinas ........................................................................ 28
4.13 Expressão gênica ................................................................................ 28
4.14 Medidas de estresse oxidativo .......................................................... 30
4.14.1 Dosagem de Proteínas ................................................................. 30
4.14.2 Medida de Lipoperoxidação: Quimiluminescência iniciada por t-
BOOH (QL) ................................................................................................ 31
4.14.3 Atividade de Superóxido Dismutase (SOD) ................................ 31
4.14.4 Atividade de Catalase (CAT) ........................................................ 32
4.14.5 Poder antioxidante redutor do ferro (FRAP - Ferric Reduction
Ability Power) ........................................................................................... 32
4.15 Análise estatística ............................................................................... 32
5 RESULTADOS .............................................................................................. 34
5.1 Peso e parâmetros metabólicos .......................................................... 34
5.2 Consumo de água, ração e ingestão calórica .................................... 36
5.3 Parâmetros do metabolismo energético ............................................. 37
5.4 Consumo máximo de oxigênio (VO2max) durante o exercício ............ 40
5.5 Teste da capacidade de exercício ....................................................... 41
5.6 Frequência cardíaca, pressão arterial e variabilidade da frequência
cardíaca ....................................................................................................... 42
5.7 Mecânica respiratória ........................................................................... 43
5.8 Células inflamatórias no LBA .............................................................. 46
5.9 Células inflamatórias no parênquima pulmonar ................................ 47
5.10 Intercepto linear médio (Lm) .............................................................. 49
5.11 Conteúdo de fibras colágenas e elásticas no parênquima pulmonar
...................................................................................................................... 51
5.12 Dosagem de citocinas ........................................................................ 53
5.13 Expressão de genes envolvidos na resposta antioxidante ............. 59
5.14 Medidas de estresse oxidativo .......................................................... 61
5.15 Resumo dos resultados ..................................................................... 65
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 66
7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 72
8 ANEXO.......................................................................................................... 73
9 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 74
Lista de figuras
Figura 1: Esquema ilustrativo da câmara de inalação utilizada para a exposição
à fumaça de cigarro .......................................................................................... 22
Figura 2: Delineamento experimental ............................................................... 23
Figura 3: Ganho de peso corporal (g) dos animais após 12 semanas de protocolo
......................................................................................................................... 35
Figura 4: Consumo de oxigênio (VO2) dos animais no final dos protocolos, nos
períodos do dia e da noite ................................................................................ 37
Figura 5: Produção de dióxido de carbono (VCO2) dos animais no final dos
protocolos, nos períodos do dia e da noite. ...................................................... 38
Figura 6: Gasto energético dos animais no final dos protocolos, nos períodos do
dia e da noite .................................................................................................... 39
Figura 7: Consumo máximo de oxigênio (VO2max) durante exercício forçado no
início e no final dos protocolos. ........................................................................ 40
Figura 8: Velocidade máxima atingida no teste físico antes do início dos
protocolos e 4, 8 e 12 semanas após o início dos protocolos .......................... 41
Figura 9: Resistência de vias aéreas (Raw) ..................................................... 43
Figura 10: Elastância do tecido pulmonar (Htis) ............................................... 44
Figura 11: Resistência do tecido pulmonar (Gtis) ............................................. 45
Figura 12: Contagem total e diferencial de células inflamatórias no lavado
broncoalveolar .................................................................................................. 46
Figura 13: Contagem de células mononucleares no tecido pulmonar .............. 47
Figura 14: Contagem de células polimorfonucleares no tecido pulmonar ........ 48
Figura 15: Intercepto linear médio (Lm) ........................................................... 49
Figura 16: Fotomicrografias representativas do parênquima pulmonar distal
corado em H&E dos grupos Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício,
Frutose, Frutose+Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício ......... 50
Figura 17: Porcentagem de fibras colágenas no parênquima pulmonar .......... 51
Figura 18: Porcentagem de fibras elásticas no parênquima pulmonar ............. 52
Figura 19: Expressão do gene Keap1 no pulmão ............................................ 59
Figura 20: Expressão do gene HMOX no pulmão ............................................ 60
Figura 21: Atividade de catalase no homogenato pulmonar ............................ 61
Figura 22: Peroxidação lipídica avaliada por quimioluminescência (QL) no
homogenato pulmonar.. ................................................................................... 62
Figura 23: Atividade de SOD no homogenato pulmonar .................................. 63
Figura 24: Poder antioxidante redutor do ferro (FRAP) no homogenato pulmonar.
......................................................................................................................... 64
Lista de tabelas
Tabela 1 - Critérios para definir a síndrome metabólica ................................... 14
Tabela 2 - Ensaios comerciais utilizados para qPCR ....................................... 30
Tabela 3 - Consumo de água, ração e ingestão calórica semanal por animal . 36
Tabela 4 - Níveis de IL-6 no LBA, plasma e músculo esquelético .................... 53
Tabela 5 - Níveis de IL-10 no LBA, plasma e músculo esquelético .................. 54
Tabela 6 - Níveis de IL-1β no LBA, plasma e músculo esquelético.................. 55
Tabela 7 - Níveis de TNF-α no LBA, plasma e músculo esquelético ............... 56
Tabela 8 - Níveis de adiponectina no LBA, plasma e músculo esquelético ..... 57
Tabela 9 - Níveis de leptina no LBA, plasma e músculo esquelético ............... 58
Tabela 10 - Resumo dos resultados ................................................................. 65
Lista de abreviaturas
Actb Beta actina
Akt Proteina quinase B
ARE Elemento de resposta antioxidante
ATP Adenosina trifosfato
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar
C Controle
CVF Capacidade vital forçada
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
DPOC Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
DNA Ácido desoxirribonucleico
E Exercício
EE Gasto energético
ERO Espécie reativa de oxigênio
FC Frequência cardíaca
F Fumo
FE Fumo+Exercício
FoxO1 Proteína Forkhead box O1
FR Frutose
FRAP Poder antioxidante redutor do ferro
FRE Frutose+Exercício
FRF Frutose+Fumo
FRFE Frutose+Fumo+Exercício
G6PDH Glicose-6-fosfato dehidrogenase
GLUT4 Transportador de glicose tipo 4
GPX1 Glutationa peroxidase1
GSH Glutationa
GSK3 Glicogênio sintase quinase 3
GSSG Glutationa oxidada
GSR Glutationa redutase
GSTA Glutationa-S-transferase, α1B
Gtis Resistência do tecido pulmonar
HBSS Solução salina tamponada de Hank
HDL Lipoproteína de alta densidade
HE Hematoxilina e eosina
HF Alta frequência
HMOX1 Heme oxigenase1A
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
Htis Elastância do tecido pulmonar
ICAM Molécula de adesão intracelular
IL Interleucina
IL-1ra Receptor antagonista de interleucina 1
IMC Índice de massa corpórea
IRS Substratos do receptor de insulina
Keap1 Proteína de citoesqueleto análoga a Kelp associada
à ECH
LBA Lavado broncoalveolar
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LF Baixa frequência
LF/HF Relação entre baixa e alta frequência
Lm Intercepto linear médio
MCP-1 Peptídeo quimiotático para monócitos
MMP Metaloproteinases de matriz
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato reduzido
NQO1 NADPH:quinona oxidoreductase-1
Nrf2 Fator nuclear derivado de eritróide 2
OMS Organização Mundial da Saúde
PA Pressão arterial
PBS Tampão fosfato salino
PCR Proteína C-reativa
PEEP Pressão expiratória final
pH Cologaritmo da concentração de hidrogênio
PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase
Prx-1 Peroxiredoxina1B
QL Quimiluminescência
qPCR Reação de polimerização em cadeia quantitativa em
tempo real
Raw Resistência de vias aéreas
RMSSD Desvio padrão das diferenças entre intervalos RR
normais adjacentes
RNA Ácido ribonucleico
SDNN Desvio padrão da média dos intervalos RR normais
SOD Superóxido dismutase
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TRAP Total de potencial reativo antioxidante
Trx1 Tioredoxina1
TrxR Tioredoxina redutase
VCO2 Produção de dióxido de carbono
VEF1 Volume expiratório forçado no primeiro segundo
VFC Variabilidade da frequência cardíaca
VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa
VO2 Consumo de oxigênio
VO2max Consumo máximo de oxigênio
Lista de símbolos
ºC graus Celsius
μl microlitro
μm micrômetro
µmol micromol
cm centímetro
cmH20 centímetro de água
CO Monóxido de carbono
dL decilitro
g grama
G gravidade
h hora
H2O2 Peróxido de hidrogênio
kcal quilocaloria
KCl Cloreto de potássio
km quilômetro
L litro
mA miliampère
mg miligrama
min minuto
ml mililitro
mmH2O milímetro de água
mmHg milímetro de mercúrio
mmol milimol
n número
nm nanômetro
NO Óxido nítrico
O2- Radical superóxido
OH Radical hidroxila
ONOO- Peroxinitrito
ppm partes por milhão
rpm rotações por minuto
s segundo
t-BOOH Hidroperóxido de tert-butila
U unidade
x vezes
Resumo
Suehiro CL. Efeitos do exercício físico aeróbio sobre a lesão pulmonar induzida
por exposição à fumaça de cigarro modelo experimental de síndrome metabólica
[tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2018.
Introdução: A Síndrome Metabólica (MS) é uma comorbidade frequentemente
encontrada nos pacientes que apresentam Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
(DPOC). A DPOC e a MS possuem características em comum e o tabagismo é
um fator de risco comum à DPOC e à MS. Apesar da intricada associação entre
a DPOC e a MS, sabe-se muito pouco a respeito de como a co-ocorrência da
MS afeta a resposta da DPOC ao treinamento físico – um tratamento efetivo para
MS e que tem efeito protetor contra o enfisema induzido por tabaco – e à história
natural desta. Objetivo: Avaliar como a ingestão crônica de frutose interfere na
história natural e nos efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a lesão
pulmonar induzida por fumaça de cigarro. Métodos: Camundongos C57Bl/6
machos foram divididos em oito grupos (n=16-20/grupo): Controle, Fumo,
Exercício, Fumo+Exercício, Frutose, Frutose+Fumo, Frutose+Exercício e
Frutose+Fumo+Exercício; e expostos à fumaça de cigarro (30 minutos, 2x/dia),
exercício físico (1 hora/dia) ou frutose (20% em água de beber) durante 12
semanas. Após o período de tratamento os animais foram anestesiados,
submetidos à avaliação da mecânica respiratória e eutanasiados para coleta de
sangue, lavado broncoalveolar (LBA), pulmões e músculos quadríceps para
posteriores análises de histologia, dosagem de citocinas e avaliações de
expressão gênica e estresse oxidativo. Resultados: A ingestão de frutose
causou destruição do septo alveolar comparável com aquela causada pelo fumo
(p<0,001). A combinação de frutose e fumo produziu uma destruição alveolar
mais severa do que qualquer um deles sozinho (p=0,008). O exercício físico
inibiu o aumento do número total de células inflamatórias e macrófagos no LBA
(p<0,001), impediu o aumento dos níveis de interleucina (IL)-6, IL-10, IL-1β, TNF-
α, adiponectina e leptina no plasma e/ou músculo esquelético (p<0,001), alterou
a porcentagem de fibras colágenas e elásticas no parênquima pulmonar
(p<0,001) e atenuou o desenvolvimento do enfisema no grupo
Frutose+Fumo+Exercício. Não houve efeito do exercício físico na mecânica
respiratória, expressão de genes antioxidantes e estresse oxidativo. Conclusão:
O treinamento físico aeróbio atenuou parcialmente o desenvolvimento do
enfisema pulmonar em camundongos expostos à fumaça de cigarro e à frutose.
Descritores: exercício; enfisema; frutose; inflamação; estresse oxidativo
Abstract
Suehiro CL. Effects of aerobic exercise on the lung injury induced by exposure to
cigarette smoke in an experimental model of metabolic syndrome [thesis]. São
Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2018.
Introduction: The Metabolic Syndrome (MS) is a comorbidity frequently
presented by patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).
COPD shares with MS common features and tobacco use is a risk factor for both
COPD and MS. Despite of this intricate association between COPD and MS, very
little is known about how co-occurrence of MS might affect the response of COPD
to physical exercise – an effective treatment for MS that has a protective effect
against tobacco-induced COPD – and its natural history. Objective: To evaluate
how chronic fructose intake interferes in the natural history and in the effects of
aerobic exercise training on lung injury induced by exposure to CS. Methods:
Male C57Bl/6 mice were assigned to 8 groups: Control, Smoke, Exercise,
Smoke+Exercise, Fructose, Fructose+Smoke, Fructose+Exercise and
Fructose+Smoke+Exercise (n=16-20/group) and treated accordingly with CS
(30min twice/day), exercise training (1h/day) or fructose (20% in the drinking
water) for 12 weeks. After the treatment period the animals were anesthetized,
submitted to the evaluation of respiratory mechanics and were euthanized for
collect of blood plasma, bronchoalveolar lavage fluid (BALF), lungs and
quadriceps muscles for subsequent histology analysis and measures of cytokine
levels, gene expression and oxidative stress. Results: Fructose ingestion caused
destruction of alveolar septa comparable to that caused by the CS (p<0,001).
Combination of fructose and CS caused an alveolar destruction even more
severe than either one alone (p=0,008). Exercise training inhibited the increase
of the total number of inflammatory cells and macrophages in BALF (p<0,001),
inhibited the increase of the interleukin (IL)-6, IL-10, IL-1β, TNF-α, adiponectin
and leptin levels in plasma and/or skeletal muscle (p<0,001), altered the
percentage of collagen and elastic fibers in lung parenchyma (p<0,001) and
attenuated the development of emphysema in the Fructose+Smoke+Exercise
group. There was no effect of exercise training on respiratory mechanics,
antioxidant genes expression and oxidative stress. Conclusion: Aerobic
exercise training partially attenuated the development of lung emphysema in mice
exposed to cigarette smoke and fructose.
Descriptors: exercise; emphysema; fructose; inflammation; oxidative stress
1
1 INTRODUÇÃO
A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma doença
prevenível e tratável, caracterizada por persistentes sintomas respiratórios e
limitação ao fluxo aéreo, devido a anormalidades de vias aéreas e/ou alvéolos,
geralmente causada por exposição significativa a gases ou partículas nocivas
(1).
O conceito de DPOC pode ser ampliado para além do sistema
respiratório. A partir desta perspectiva, a DPOC pode ser considerada uma
síndrome inflamatória que, devido à inflamação exacerbada e estresse oxidativo
na circulação sistêmica e em outros órgãos, acomete também sistemas como o
cardiovascular e o musculoesquelético (1, 2).
A DPOC representa um pesado fardo para a saúde pública, pois é uma
das principais causas de morbidade e mortalidade mundial (1). Ela era a quinta
principal causa de morte no mundo em 2002 e as estimativas mostram que a
DPOC será a terceira causa de morte mundial em 2030. O impacto da DPOC na
mortalidade seria ainda maior se a mortalidade de comorbidades à ela
associadas fosse considerada (3).
O tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da
DPOC e a maior causa de inflamação pulmonar crônica, sendo que o processo
inflamatório não é interrompido mesmo após a cessação do tabagismo (1, 4, 5).
Dessa forma, são necessárias intervenções complementares à cessação para
controlar o curso natural da DPOC.
O tabagismo é o maior fator de risco para outras doenças não
transmissíveis além da DPOC, como doenças cardiovasculares (doença
aterosclerótica coronariana e cerebrovascular), diabetes e neoplasias malignas.
Anualmente, cerca de seis milhões de pessoas morrem no mundo devido a
doenças relacionadas ao tabaco e mais de 600.000 devido ao tabagismo
passivo, dessa forma, o tabagismo representa a principal causa de morte
evitável. Estima-se que em 2030 o tabagismo mate mais de oito milhões de
pessoas no mundo (6).
2
Interessantemente, o tabagismo também está associado ao
desenvolvimento da síndrome metabólica (7, 8) - uma das comorbidades mais
comuns em pacientes com DPOC (9, 10). Esta condição ocorre quando
coexistem num mesmo indivíduo resistência à insulina, adiposidade abdominal
excessiva, dislipidemia aterogênica (aumento dos níveis de triglicérides e
redução dos níveis de HDL) e disfunção endotelial (11). A co-ocorrência destas
alterações num mesmo paciente aumenta o risco para o desenvolvimento de
diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (12), doença aterosclerótica coronariana e
periférica (13) e está também associada a condições como doença hepática
esteatótica não alcóolica (14), apnéia obstrutiva do sono (15) e algumas formas
de neoplasias malignas (16-18). Dessa forma, o diagnóstico de síndrome
metabólica identifica um grupo de pacientes que, além de apresentar maior risco
cardiometabólico, está sujeito a um risco mais elevado de outras doenças
crônicas em virtude de uma possível fisiopatologia compartilhada (11). A
correção dos distúrbios metabólicos da síndrome metabólica tem o potencial de
reduzir o risco ou amenizar o curso natural de outras doenças crônicas.
Um dos mais bem caracterizados fatores de risco da síndrome
metabólica é a inatividade física (19). O treinamento físico é uma intervenção de
eficácia comprovada na atenuação dos múltiplos distúrbios da síndrome
metabólica (20-22) e na redução de risco cardiovascular (23). Indivíduos
fisicamente ativos apresentam menor incidência de doenças coronarianas,
menor mortalidade por eventos coronarianos e redução de mortalidade geral
(23).
Ainda, o treinamento físico é capaz de reduzir o declínio da função
pulmonar e o risco de desenvolver DPOC ao longo dos anos em tabagistas (24).
Um estudo do nosso grupo demonstrou efeito protetor do treinamento físico
aeróbio no desenvolvimento do enfisema em modelo experimental de
camundongos expostos à fumaça de cigarro. Nesse modelo, o treinamento físico
atenuou o declínio da elastância pulmonar e o aumento do intercepto linear
médio induzidos pela exposição à fumaça de cigarro. Além disso, o treinamento
também inibiu o acúmulo de espécies oxidantes e a redução de antioxidantes
induzidos pela exposição à fumaça de cigarro (25). A despeito desses efeitos
benéficos, nosso conhecimento sobre os mecanismos bioquímicos e celulares
3
subjacentes a este papel protetor do treinamento físico é, na melhor das
hipóteses, rudimentar.
A utilização de modelos animais é importante para melhor compreender
a evolução das doenças e encontrar medidas terapêuticas (26, 27). O modelo
que melhor caracteriza a DPOC humana é o que utiliza a exposição à fumaça de
cigarro, uma vez que esta é a principal substância tóxica que causa DPOC em
seres humanos (26). Além disso, o modelo que utiliza a exposição de roedores
à grande quantidade de frutose na água produz vários distúrbios metabólicos
como resistência à insulina, inflamação e dislipidemia, que caracterizam a
síndrome metabólica (28).
Dessa forma, o presente estudo pretende investigar os mecanismos
envolvidos no processo de lesão pulmonar induzida por exposição à fumaça de
cigarro em camundongos que ingerem frutose e avaliar os efeitos do treinamento
físico nesse modelo.
Nossa hipótese é de que a lesão pulmonar piore em um modelo
experimental de síndrome metabólica e que o treinamento físico atenue esse
efeito.
O entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nesse
processo e dos mecanismos regulatórios do treinamento físico é necessário para
o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da síndrome
metabólica em pacientes com DPOC.
4
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar como a ingestão crônica de frutose interfere na história natural e
nos efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a lesão pulmonar induzida por
exposição à fumaça de cigarro.
2.2 Objetivos específicos
Verificar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a lesão
pulmonar induzida por exposição à fumaça de cigarro em
camundongos que ingerem frutose, em relação aos seguintes
aspectos:
Inflamação pulmonar, muscular e sistêmica;
Estresse oxidativo pulmonar;
Mecânica respiratória e
Desenvolvimento do enfisema pulmonar.
5
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC)
A DPOC é uma doença prevenível e tratável, caracterizada por
persistentes sintomas respiratórios e limitação ao fluxo aéreo, devido a
anormalidades de vias aéreas e/ou alvéolos, geralmente causada por exposição
significativa a gases ou partículas nocivas (1).
A limitação ao fluxo aéreo é causada por uma mistura de doença das
pequenas vias aéreas (bronquiolite obstrutiva) e destruição do parênquima
pulmonar (enfisema), sendo que a contribuição relativa de cada uma varia de
indivíduo para indivíduo (1).
Vários mecanismos reduzem o fluxo aéreo e podem ser divididos em
fatores que aumentam a resistência de vias aéreas ou que reduzem a força
elástica pulmonar. Nas vias aéreas, pode ocorrer espessamento epitelial,
formação de folículos linfoides e deposição de colágeno, reduzindo o diâmetro
interno e a capacidade de distensão dessas vias (29). Esses fatores podem
aumentar a resistência das vias aéreas e, consequentemente, reduzir o fluxo
aéreo observado nos pacientes. O aumento de secreção de muco também pode
contribuir para essa redução do fluxo aéreo e, em fases avançadas da doença,
está correlacionada com a mortalidade dos pacientes (30, 31). Além disso, a
destruição da arquitetura pulmonar pode alterar a disposição das vias aéreas,
contribuindo para o aumento da resistência dessas vias. A destruição do
parênquima pulmonar e de fibras elásticas provoca redução da elastância,
produzindo um menor fluxo expiratório. No entanto, as alterações anatômicas e
consequente aumento da resistência das vias aéreas parecem ser
predominantes na limitação ao fluxo aéreo (29).
Devido a essas alterações, a DPOC se manifesta clinicamente pela
dispneia crônica e progressiva, tosse e produção de escarro que pode variar
conforme o dia. A tosse crônica e a produção de escarro podem preceder o
6
desenvolvimento da limitação ao fluxo aéreo por vários anos, dessa forma, o
diagnóstico clínico de DPOC deve ser considerado em qualquer paciente que
apresentar esses sintomas e histórico de exposição aos fatores de risco. O valor
da relação VEF1/CVF abaixo de 70% do predito na espirometria após uso de
broncodilatador é o critério utilizado para diagnosticar a doença (1).
Pacientes com DPOC também apresentam disfunção muscular
esquelética, depleção nutricional e perda de peso, que está associada ao
aumento da mortalidade desses indivíduos (1, 32). Um desequilíbrio entre a
ingestão e o gasto energético, causado pela diminuição da ingestão ou aumento
do gasto energético, parece ser o principal fator envolvido na perda de peso
desses pacientes (33). O aumento de mediadores inflamatórios pode acelerar o
metabolismo, diminuir a ingestão energética e gerar resposta inadequada à
ingestão alimentar, contribuindo, dessa forma, para a depleção nutricional
observada em pacientes com DPOC. Citocinas pró-inflamatórias como o fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 1 beta (IL-1β) podem provocar
anorexia e alterações no metabolismo da leptina também podem ser
responsáveis pelo desenvolvimento de alterações nutricionais nesses pacientes
(34).
Pacientes com DPOC aumentam a demanda ventilatória ao realizar
atividades dinâmicas e, consequentemente, apresentam aumento de dispneia.
Dessa forma, os pacientes evitam realizar tais atividades e são acometidos pelo
sedentarismo. O descondicionamento físico reduz a força e massa muscular e a
capacidade aeróbia, resultando em demanda ventilatória ainda mais intensa;
assim, ocorre um ciclo dispneia-sedentarismo-dispneia (35). O aumento da
inflamação sistêmica e do estresse oxidativo e a depleção nutricional também
estão relacionados à disfunção muscular periférica. A consequente redução da
capacidade de realizar atividade física contribui para a piora da qualidade de vida
e esses fatores são importantes determinantes do prognóstico e sobrevida de
pacientes com DPOC (36, 37).
7
3.1.1 Epidemiologia
A DPOC representa um pesado fardo para a saúde pública, pois é uma
das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo (1). A prevalência
mundial de DPOC, em adultos com mais de 40 anos, é de aproximadamente 9-
10% (38). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 65 milhões
de pessoas apresentam diagnóstico de DPOC moderada à grave no mundo (3).
O estudo PLATINO (Latin American Project for the Investigation of Obstructive
Lung Disease) mostrou uma prevalência de DPOC em 15,8% da população na
cidade de São Paulo (39).
A DPOC era a quinta principal causa de morte no mundo em 2002 e as
estimativas mostram que a DPOC será a terceira causa de morte mundial em
2030. O impacto da DPOC na mortalidade seria ainda maior se a mortalidade de
comorbidades à ela associadas fosse considerada (3). A prevalência e o impacto
da DPOC devem aumentar nas próximas décadas devido à exposição contínua
aos fatores de risco e ao envelhecimento populacional (40). Portanto, essa é
uma doença que continuará a afetar grande parcela da população durante vários
anos.
3.1.2 Fatores de risco
A DPOC é resultado de uma interação entre gene e meio ambiente. Os
fatores de risco para o desenvolvimento da doença podem ser genéticos, como
a deficiência hereditária de alfa-1 antitripsina, estar relacionados à idade,
crescimento e desenvolvimento pulmonar, infecções na infância, condição
socioeconômica e exposição a partículas nocivas, como a exposição
ocupacional e à poluição atmosférica; no entanto, o principal fator de risco para
o desenvolvimento da DPOC é o tabagismo (1, 4).
A fumaça de cigarro contém grandes quantidades de radicais livres e
oxidantes, apresentando aproximadamente 5000 compostos altamente reativos
(41). Os principais compostos reativos presentes na fumaça de cigarro incluem
radical superóxido (O2-), óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2),
8
radical hidroxila (OH), quinonas/semiquinonas e compostos de ferro que podem
participar de diversas reações, produzindo outros metabólitos tóxicos e reativos
no pulmão, como o peroxinitrito (ONOO-) (42). Tabagistas apresentam aumento
da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (43) e de produtos de
peroxidação lipídica (44), além de diminuição de antioxidantes, como a glutationa
(GSH), comparados a não tabagistas (45).
O tabagismo é a maior causa de inflamação pulmonar crônica (1, 5).
Tabagistas apresentam aumento de diversos marcadores inflamatórios, como
neutrófilos (46), linfócitos T (47), proteína C-reativa (PCR), fibrinogênio (48),
molécula de adesão intracelular (ICAM)-1, TNF-α e IL-6 (49). O aumento dos
níveis de PCR e fibrinogênio está associado ao risco de eventos
cardiovasculares subsequentes (50, 51) e o aumento dos níveis de TNF-α e IL-
6 são fatores que predizem o risco de infarto do miocárdio, doença cardíaca
coronariana e acidente vascular cerebral (52, 53).
O tabagismo é uma epidemia e a principal causa de morte evitável
mundial. Anualmente, cerca de seis milhões de pessoas morrem devido ao
hábito de fumar e mais de 600.000 devido ao tabagismo passivo. Estima-se que
em 2030 o tabagismo mate mais de oito milhões de pessoas no mundo (6).
3.1.3 Fisiopatologia
Alterações características da DPOC são encontradas nas vias aéreas,
parênquima pulmonar e vasculatura dos pacientes. Essas alterações incluem
inflamação crônica, desequilíbrios oxidante-antioxidante e protease-antiprotease
e alterações estruturais (1, 54).
O aumento do processo inflamatório e do estresse oxidativo é observado
não apenas no pulmão, mas também na circulação sistêmica e em vários outros
órgãos, como na musculatura periférica de pacientes com DPOC, o que enfatiza
ainda mais a natureza sistêmica da doença (1, 55). A partir desta perspectiva a
DPOC pode ser considerada uma síndrome inflamatória que acomete também
outros sistemas, como o cardiovascular e o musculoesquelético (2).
9
3.1.3.1 Inflamação
As principais células envolvidas no processo inflamatório da DPOC são
os macrófagos, neutrófilos e linfócitos T CD8+. Essas células estimulam a
liberação de diversos mediadores inflamatórios, como fatores quimiotáticos,
citocinas e fatores de crescimento (1).
Os macrófagos são encontrados frequentemente em estudos de
pacientes com DPOC e podem ser ativados pela exposição à fumaça de cigarro.
Quando ativados, estimulam a liberação de mediadores inflamatórios como TNF-
α, IL-8, peptídeo quimiotático para monócitos (MCP-1), leucotrieno B4 (LBT) e
diversos tipos de EROs. Também estimulam a secreção de metaloproteinases
de matriz (MMP)-2, MMP-9 e MMP-12, catepsinas K, L e S e elastase
neutrofílica. Dessa forma, os macrófagos podem agir como mediadores do
processo inflamatório iniciado pelas toxinas do cigarro e/ou efetores da lesão
pulmonar, promovendo destruição do parênquima (56, 57).
Os neutrófilos podem ser encontrados em fases mais avançadas da
DPOC e estar relacionados à produção de muco. Secretam proteases
neutrofílicas, como proteinase-3, catepsinas e elastase neutrofílica, além das
MMP-8 e MMP-9, que contribuem para a destruição do parênquima pulmonar e
das fibras elásticas (58).
O aumento de linfócitos em pacientes com DPOC está relacionado ao
grau de destruição alveolar e à severidade da obstrução. Os linfócitos T CD8+
promovem citólise e apoptose de células epiteliais alveolares por meio de
liberação de perforinas e TNF-α (56).
Eosinófilos são mais raramente encontrados em pacientes com DPOC e
sua presença pode marcar a coexistência de asma (59).
Níveis de diversas citocinas, quimiocinas e adipocinas estão alterados
na circulação sistêmica de pacientes com DPOC, como IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α
e leptina. O aumento de mediadores inflamatórios contribui para as
manifestações sistêmicas da doença, como a disfunção muscular periférica, e
pode piorar as comorbidades associadas à DPOC. O aumento das
concentrações de IL-6 e TNF-α estão associados à atrofia dos músculos
esqueléticos e inibição de regeneração muscular, respectivamente (60, 61).
10
3.1.3.2 Desequilíbrio oxidante-antioxidante
O estresse oxidativo, um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes,
está aumentado em pacientes com DPOC (62). A exposição à fumaça de cigarro,
diretamente ou por meio das células inflamatórias, pode aumentar a
concentração de oxidantes, como EROs, e reduzir a capacidade antioxidante
pulmonar (5).
As EROs são moléculas muito instáveis formadas a partir da redução do
oxigênio (O2). Em concentrações moderadas, essas moléculas participam de
funções importantes no organismo, como na mediação de processos de
sinalização celular, eliminação de microorganismos invasores e modulação dos
processos inflamatórios. No entanto, em excesso, EROs podem levar ao
estresse oxidativo e conduzir a peroxidação de lipídios de membrana, ruptura do
citoesqueleto e danos ao DNA (63).
As principais EROs são o ânion superóxido (-O2), o peróxido de
hidrogênio (H2O2), o radical hidroxila (OH-) e o óxido nítrico (NO). A mitocôndria
e o complexo enzimático da NADPH-oxidase são considerados as principais
fontes celulares de EROs no organismo (64). Já no pulmão, as principais fontes
de EROs são os neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células epiteliais e células
endoteliais brônquicas (65, 66).
Os principais antioxidantes não enzimáticos nos pulmões são a
glutationa (GSH), vitaminas C e E, beta-caroteno e ácido úrico, já os enzimáticos
são a superóxido dismutase (SOD), catalase e peroxidases. Esses antioxidantes
constituem as primeiras linhas de defesa contra os oxidantes (67).
A SOD está presente em todas as células do corpo e desempenha um
importante papel na proteção das células e dos tecidos contra o estresse
oxidativo, cujo mecanismo consiste na dismutação do ânion superóxido (-O2)
para uma molécula menos potente, o peróxido de hidrogênio (H2O2) (64).
A glutationa peroxidase reduz o peróxido de hidrogênio (H2O2) em H2O
pela oxidação da glutationa (GSH) (66). A glutationa oxidada, (GSSG) é, em
seguida, reduzida pela glutationa redutase através do ciclo da glutationa (68). A
capacidade de reciclar GSH faz desse ciclo um mecanismo crucial de defesa
antioxidante de uma célula (69).
11
A redução da capacidade antioxidante pulmonar na DPOC pode ser
resultado da diminuição da expressão do fator nuclear derivado de eritróide 2
(Nrf2), que regula diversos genes antioxidantes (70).
O Nrf2 é um fator de transcrição que interage com o elemento de
resposta antioxidante (ARE) presente na região promotora de vários genes para
a regulação de enzimas antioxidantes e de detoxificação, como glutationa-S-
transferase A1 (GSTA) e NADPH:quinona oxidoredutase (NQO1). Em condições
basais, a proteína de citoesqueleto análoga a Kelp associada à ECH (Keap1)
está ligada ao Nrf2 no citoplasma e age como um supressor, promovendo a
ubiquitinação e degradação do Nrf2. Na presença de EROs, Keap1 é inativado
e libera Nrf2, que se transloca para o núcleo e interage com ARE para a síntese
das enzimas detoxificantes (71).
A deficiência de Nrf2 em camundongos A/J impediu a indução de vários
genes antioxidantes em resposta à exposição à fumaça de cigarro, como SOD,
glutationa peroxidases, peroxiredoxina1B, glutationa redutase, tioredoxina
redutase1B e enzimas detoxificantes, como as glutationa-S-transferases (72).
Além disso, camundongos da linhagem A/J com deficiência de Nrf2
desenvolveram enfisema mais precocemente e com maior gravidade (73).
Dessa forma, o estresse oxidativo pode ser uma via para o
desenvolvimento da DPOC, no entanto, o exato papel e sua relação com os
mecanismos inflamatórios na fisiopatologia da doença ainda precisam ser
melhor esclarecidos.
3.1.3.3 Desequilíbrio protease-antiprotease
O desequilíbrio entre proteases e antiproteases é o mecanismo mais
aceito para explicar a destruição tecidual nos pulmões de pacientes com DPOC.
A exposição à fumaça de cigarro induz um aumento na liberação de proteases,
derivadas de células inflamatórias e epiteliais, que não são totalmente inibidas
pelas antiproteases, o que leva à proteólise das fibras constituintes do
parênquima pulmonar, com perda das paredes alveolares e alargamento dos
espaços aéreos e consequente redução da elasticidade tecidual (74-76).
12
Diversas proteases estão aumentadas em pacientes com DPOC, como
as serino proteases (elastase neutrofílica, catepsina G e proteinase 3), as
cisteíno proteinases (catepsinas B, K, L e S), e as MMPs (MMP-12, MMP-8,
MMP-1, MMP-13 e MMP-9) (77, 78).
Esse desequilíbrio está intimamente ligado ao dano tecidual,
remodelamento de fibras elásticas e colágenas e ativação de respostas
inflamatórias (29).
3.1.3.4 Remodelamento tecidual
Os processos de destruição do parênquima pulmonar estão associados
a uma posterior reparação tecidual, em que o tecido reparado é semelhante ao
original, porém, geralmente com arquitetura e funções alteradas (79).
A destruição das paredes alveolares no enfisema pulmonar é
consequente, sobretudo, à degradação de fibras elásticas e colágenas
constituintes da parede alveolar. Um processo de remodelamento tecidual é
iniciado por ação enzimática e ocorre um aumento na produção e depósito de
novas fibras. No entanto, elas apresentam formas alteradas, sendo ineficientes
para manutenção funcional do tecido e prejudicando, assim, as trocas gasosas
(80).
As fibras elásticas e colágenas estão intimamente relacionadas às
propriedades viscoelásticas do pulmão, que podem ser avaliadas por parâmetros
como resistência, elastância e complacência pulmonar, portanto, são de grande
importância para o funcionamento adequado do pulmão, principalmente em
relação a aspectos fisiológicos de mecânica respiratória (80).
3.1.4 Comorbidades
Muitos pacientes com DPOC apresentam comorbidades que contribuem
para a gravidade global da doença (1), tem um grande impacto na qualidade de
vida e sobrevida dos indivíduos (62) e aumentam os custos com a saúde (81).
13
Além das doenças cardiovasculares, osteoporose, depressão e câncer
de pulmão, uma das comorbidades mais comuns em pacientes com DPOC é a
síndrome metabólica (9, 10). A prevalência de síndrome metabólica em
pacientes com DPOC varia de 36,8% a 57%, dependendo da população
estudada e dos critérios utilizados para caracterizar a síndrome metabólica (82-
87).
3.2 Síndrome metabólica
A síndrome metabólica ocorre quando coexistem num mesmo indivíduo
resistência à insulina, adiposidade abdominal excessiva, dislipidemia
aterogênica (aumento dos níveis de triglicérides e redução dos níveis de HDL) e
disfunção endotelial (11). Todos esses componentes contribuem para disfunção
e inflamação vascular, promovendo doença aterosclerótica (7).
A co-ocorrência destas alterações num mesmo paciente aumenta o risco
para o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (12), doença
aterosclerótica coronariana e periférica (13) e está também associada a
condições como doença hepática esteatótica não alcóolica, apnéia obstrutiva do
sono e algumas formas de neoplasias malignas. Dessa forma, o diagnóstico de
síndrome metabólica identifica um grupo de pacientes que, além de apresentar
maior risco cardiometabólico, está sujeito a um risco mais elevado de outras
doenças crônicas em virtude de uma possível fisiopatologia compartilhada (11).
A correção dos distúrbios metabólicos da síndrome metabólica tem o potencial
de reduzir o risco ou amenizar o curso natural de outras doenças crônicas.
3.2.1 Epidemiologia
A prevalência mundial da síndrome metabólica é bastante divergente,
pois além das diferenças nas composições demográficas e étnicas das
populações, os estudos utilizam diferentes critérios para definir a síndrome
metabólica (Tabela 1). Algumas têm como enfoque a confirmação laboratorial de
resistência à insulina, como a definição da OMS e do European Group for the
14
Study of Insulin Resistance (EGIR); já outras consideram obrigatória a
adiposidade visceral, como a definição da International Diabetes Foundation
(IDF); ou não exigem nenhum critério obrigatório, como a da National Cholesterol
Education Program Adult Treatment Panel (NCEP-ATP III) (11).
Tabela 1 - Critérios para definir a síndrome metabólica
NCEP-ATP III (revisão 2005)
WHO (1998) EGIR (1999) IDF (2005)
Critério obrigatório
Nenhum Resistência à
insulina Hiperinsulinemia
Obesidade central
Circunferência abdominal >94
cm (H) e >80 cm (M)
Diagnóstico da síndrome
metabólica
Pelo menos 3 dos 5 critérios
abaixo
Resistência à insulina mais 2
dos critérios abaixo
Hiperinsulinemia mais 2 dos
critérios abaixo
Obesidade mais 2 dos critérios
abaixo
Obesidade
Circunferência abdominal >102
cm (H) e >88 cm (M)
Circunferência abdominal >90
cm (H) e >85 cm (M) ou IMC >30kg/m²
Circunferência abdominal >94
cm (H) e >80 cm (M)
Obesidade já exigida
Hiperglicemia Glicemia de jejum ≥100
mg/dL
Resistência à insulina já exigida
Resistência à insulina já exigida
Glicemia de jejum ≥100 mg/dL
Dislipidemia Triglicérides ≥150 mg/dL
Triglicérides ≥150 mg/dL ou HDL <35mg/dL (H) e <39mg/dL (M)
Triglicérides ≥177 mg/dL ou HDL
<39mg/dL
Triglicérides ≥150 mg/dL
Dislipidemia critério
secundário
HDL <40mg/dL (H) e <50mg/dL
(M)
HDL <40mg/dL (H) e <50mg/dL
(M)
Hipertensão
Pressão sistólica
≥130mmHg e/ou pressão
diastólica ≥85mmHg
≥140/90mmHg ≥140/90mmHg
Pressão sistólica ≥130mmHg e/ou
pressão diastólica ≥85mmHg
Outro critério Microalbuminuria
(H) homens; (M) mulheres
O estudo National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES),
realizado entre 1988 e 1994, mostrou que a prevalência de síndrome metabólica
em indivíduos com idade superior a 20 anos era de 23,7% pelos critérios da
NCEP/ATP III comparado a 25,1% segundo o critério da OMS (88). No Brasil, a
prevalência de síndrome metabólica varia de 19 a 56,6%, uma média de 37,8%,
o que indica que a síndrome metabólica é uma das condições mórbidas mais
prevalentes na população brasileira (89-91).
15
3.2.2 Fatores de risco
Vários fatores de risco estão associados ao desenvolvimento de
síndrome metabólica, como idade, etnia, obesidade e ganho de peso, baixo nível
educacional, alta ingestão de carboidratos, nenhuma ingestão de bebidas
alcoólicas, falta de atividade física e fraqueza muscular. Além desses, o
tabagismo também está associado ao desenvolvimento da síndrome metabólica.
Diversos estudos mostram que tabagistas apresentam maior risco de
desenvolver síndrome metabólica (7, 8, 92, 93).
O tabagismo está associado a alterações metabólicas características da
síndrome, como aumento da adiposidade abdominal e da pressão arterial e
resistência à insulina (92, 94). Um dos possíveis mecanismos que pode explicar
a relação entre resistência insulínica e tabagismo envolve a participação de
efeitos tóxicos diretos e indiretos que as substâncias provenientes do cigarro
exercem nas diversas células do organismo, inclusive células hepáticas,
adiposas e musculares (95-97).
O tabagismo produz aumento dos níveis de marcadores inflamatórios
que predizem risco de DM2, como PCR, IL-6 e TNF-α (98-100). Isso indica que
a inflamação sistêmica de baixo grau pode ter um papel importante na gênese
da resistência insulínica e, consequentemente, do DM2 e da síndrome
metabólica. Dessa forma, a resposta inflamatória crônica sistêmica de baixo grau
pode ser o elo entre o tabagismo e a desregulação do metabolismo de glicose.
3.2.3 Fisiopatologia
A resistência à insulina pode ser definida como o estado em que uma
determinada concentração de insulina está associada à uma resposta subnormal
de glicose. Observada no DM2 e na síndrome metabólica, a resistência insulínica
também pode estar presente em portadores de alterações gênicas raras severas
e em pacientes que apresentam algumas alterações hormonais, mas,
independentemente da causa, o estado de resistência à insulina envolve prejuízo
na sinalização intracelular e/ou no mecanismo efetor da ação da insulina no
tecido (101).
16
O tecido adiposo, músculo esquelético e fígado apresentam um papel
primordial na regulação da homeostase glicêmica. O tecido adiposo representa
um grande reservatório energético e secreta uma série de substâncias que
podem interferir na sensibilidade de outros tecidos à insulina. O músculo
esquelético é um território de utilização de glicose e responsável pela captação
de até 80% de glicose circulante no período pós-prandial. Já o fígado contribui
para homeostase glicêmica, com a neoglicogênese, além de ser um sítio em que
ocorre a lipogênese. O comprometimento da sensibilidade do tecido adiposo,
músculo esquelético ou fígado à insulina provoca as manifestações laboratoriais
ou clínicas da resistência insulínica (101).
Em estado normal, a ligação da insulina ao seu receptor na superfície
das células ligação provoca a fosforilação dos resíduos de tirosina da porção
intracelular do receptor de insulina e leva à fosforilação das tirosinas de
substratos proteicos intracelulares do receptor de insulina (IRS). Consequente à
fosforilação de tirosinas do IRS no metabolismo da glicose, ocorre a ativação da
via da fostatidil inositol 3-quinase (PI3K, do inglês phosphatidyilinositol 3-
kinase)/proteína quinase B (PKB/Akt,, do inglês protein kinase B) (. A PI3K ativa
o Akt através da sua fosforilação nos resíduos serina e treonina. O Akt, então,
fosforila diversos substratos, ativando fatores anti-apoptóticos e inativando
fatores pró-apoptóticos, aumentando o metabolismo de glicose, a produção de
ATP, a atividade da enzima degradadora de insulina e diminuindo a atividade da
GSK3 (do inglês, glycogen synthase kinase-3). Além disso, essa via medeia a
translocação da glicose do espaço extracelular para o espaço intracelular
(mediante a translocação de vesículas que contêm GLUT4 para superfície
celular) e a inibição da neoglicogênese hepática (fosforilando e inibindo o fator
de transcrição FoxO1) (101). O estado de resistência à insulina causa
interrupção da cascata de sinais da via do receptor de insulina/PI3K/Akt/GSK3
(102).
Baixa aptidão cardiorrespiratória e inatividade física são fatores de risco
comuns para desenvolvimento de resistência insulínica e doenças
cardiovasculares (103). Uma relação dose-resposta inversa entre atividade física
e sensibilidade à insulina já foi descrita na literatura (104-106). A inatividade
física também pode representar um fator relevante para o desenvolvimento de
17
síndrome metabólica em pacientes com DPOC (87). Pacientes com DPOC se
tornam progressivamente inativos, o que representa fator de risco para ganho de
peso e obesidade, agravando ainda mais a inatividade (107).
3.3 Treinamento físico
O exercício físico aeróbio realizado regularmente (treinamento físico)
desencadeia diversas adaptações crônicas benéficas em todo o organismo,
como redução da pressão arterial e da frequência cardíaca de repouso em
indivíduos hipertensos (108, 109), aumento do consumo máximo de oxigênio
(VO2max), aumento da massa muscular e densidade óssea (110), melhora da
resposta imunológica (se a atividade for predominantemente realizada em
intensidade leve ou moderada) (111) e aumento da expressão e atividade de
enzimas antioxidantes (112). O treinamento físico aumenta a resistência contra
o estresse oxidativo, proporcionando uma maior proteção (113-115).
De maneira geral, os efeitos protetores do treinamento físico aeróbio
são mediados via interação dos sistemas imunológico e neuroendócrino,
através de sinais moleculares na forma de hormônios, citocinas e
neurotransmissores. Um dos mecanismos de ação do treinamento físico é a
produção de citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-10 e IL-1ra, e a ativação
de enzimas antioxidantes, como a SOD, consequentes à liberação inicial de IL-
6, IL-1β e TNF-α (23).
Os efeitos do treinamento físico descritos acima credenciam a atividade
física como uma modalidade terapêutica para doenças crônicas. O treinamento
físico atenua os múltiplos aspectos da síndrome metabólica: melhora as
características metabólicas e a sensibilidade à insulina e reduz a gordura
abdominal (104-106, 116), além de reduzir a inflamação sistêmica comumente
observada nesses pacientes (117-119).
Os resultados benéficos de programas de reabilitação pulmonar com
treinamento físico para pacientes com DPOC são bem documentados e esses
programas tem sido recomendados como um meio efetivo para o tratamento
desses pacientes (120-123).
18
Além disso, existem dados que mostram que mesmo indivíduos
tabagistas beneficiam-se dos efeitos protetores de um programa de atividade
física regular (24, 124). Um estudo mostrou que a prática de atividade física de
moderado ou alto grau por fumantes reduz o declínio da função pulmonar e o
risco de desenvolver DPOC (24).
Um estudo do nosso grupo de pesquisa demonstrou um efeito protetor
do treinamento físico aeróbio no desenvolvimento do enfisema em modelo
experimental de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Nesse modelo, o
treinamento físico atenuou o declínio da elastância pulmonar e o aumento do
intercepto alveolar médio induzidos pela exposição à fumaça de cigarro. Além
disso, o treinamento também inibiu o acúmulo de espécies oxidantes e a redução
de antioxidantes induzidos pela exposição à fumaça de cigarro (25). No entanto,
os mecanismos regulatórios envolvidos no processo ainda não foram totalmente
esclarecidos.
3.4 Modelos experimentais
Os modelos experimentais de DPOC representam uma ferramenta
importante, pois possibilitam um melhor entendimento da fisiopatologia da
doença através da compreensão dos mecanismos envolvidos, em nível celular
e molecular, além de permitirem a aplicação de novas abordagens terapêuticas.
No entanto, a utilização desses modelos apresenta algumas limitações, visto
que a doença não ocorre de forma espontânea e nem todas as características
apresentadas em seres humanos conseguem ser mimetizadas
experimentalmente (125).
Diversos modelos animais de DPOC foram desenvolvidos em diferentes
espécies com o objetivo de melhor compreender a evolução da doença e
encontrar medidas terapêuticas (26, 27), no entanto, o modelo que aparenta ser
o mais próximo da doença humana é o que utiliza a exposição crônica à fumaça
de cigarro, visto que essa é a principal substância tóxica que causa DPOC em
seres humanos (26).
Os modelos com camundongos parecem ser particularmente úteis, pois
permitem estudos dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da
19
doença. Nessa espécie há maior disponibilidade de marcadores inflamatórios e
é possível utilizar linhagens geneticamente modificadas para avaliar o
desenvolvimento da doença em condições biológicas distintas (26).
Os modelos de exposição à fumaça de cigarro mostram que os
camundongos suportam bem a exposição à fumaça por cerca de 24 semanas,
tolerando níveis de carboxihemoglobina de 10-14% (126). Exposições à fumaça
de cigarro por oito semanas levam a alterações epiteliais com infiltrado
inflamatório, alargamento de espaços aéreos e até mesmo histologia
semelhante à do enfisema humano (27, 126, 127).
Além disso, a exposição de roedores à grande quantidade de frutose na
dieta ou na água produz várias perturbações metabólicas. Esses animais
apresentam elevação da concentração sérica de triglicérides, consequente ao
aumento da secreção hepática de VLDL, e da pressão sanguínea com a
exposição aguda (28, 128), enquanto a hiperinsulinemia, elevação de ácidos
graxos livres, resistência à insulina e deterioração de controle glicêmico
aparecem com a exposição crônica (28). Dessa forma, esse modelo mimetiza
muitos dos aspectos da síndrome metabólica: resistência à insulina, inflamação
e dislipidemia.
Não foi encontrado na literatura nenhum modelo experimental de lesão
pulmonar com distúrbios metabólicos para caracterizar a síndrome metabólica
na DPOC.
Considerando a alta prevalência da síndrome metabólica em pacientes
com DPOC, o tabagismo como fator de risco comum, a inflamação e inatividade
física associadas a ambas e os efeitos benéficos do treinamento físico, é de
extrema relevância estudar os mecanismos envolvidos no processo de lesão
pulmonar induzida por exposição à fumaça de cigarro em um modelo
experimental de síndrome metabólica e os efeitos do treinamento físico nesse
modelo para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da
síndrome metabólica em pacientes com DPOC.
20
4 MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEP-FMUSP), com o
protocolo de pesquisa n° 001/14 (Anexo).
4.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57Bl/6, machos, com idade entre seis
e oito semanas, com peso inicial de 20-25 g, provenientes do Biotério Central da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).
Os animais foram mantidos em gaiolas específicas para camundongos
no biotério do Laboratório de Terapêutica Experimental I (LIM-20) da FMUSP,
em condições controladas de temperatura (202ºC) e luminosidade (ciclo claro-
escuro de 12 horas) e alimentados com ração (Purina, Labina®, SP, Brasil, 2,99
kcal/g) e água ad libitum.
Todos os animais receberam cuidados de acordo com o “Guia de
cuidados e uso de animais de laboratório” (Guide for the care and use of
laboratory animals – National Research Council of the National Academies)
(129).
4.2 Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em oito grupos experimentais
(n=16-20 animais por grupo):
1. Grupo Controle (C): animais não expostos à fumaça de cigarro, não
submetidos a treinamento físico e não receberam frutose;
2. Grupo Fumo (F): animais expostos à fumaça de cigarro, não
submetidos a treinamento físico e não receberam frutose;
21
3. Grupo Exercício (E): animais não expostos à fumaça de cigarro,
submetidos a treinamento físico e não receberam frutose;
4. Grupo Fumo+Exercício (FE): animais expostos à fumaça de cigarro,
submetidos a treinamento físico e não receberam frutose;
5. Grupo Frutose (FR): animais não expostos à fumaça de cigarro, não
submetidos a treinamento físico e receberam solução de frutose 20%;
6. Grupo Frutose+Fumo (FRF): animais expostos à fumaça de cigarro,
não submetidos a treinamento físico e receberam solução de frutose
20%;
7. Grupo Frutose+Exercício (FRE): animais não expostos à fumaça de
cigarro, submetidos a treinamento físico e receberam solução de frutose
20%;
8. Grupo Frutose+Fumo+Exercício (FRFE): animais expostos à
fumaça de cigarro, submetidos a treinamento físico e receberam solução
de frutose 20%.
4.3 Exposição à fumaça de cigarro
Os animais foram expostos à fumaça de cigarro em duas sessões
diárias de 30 minutos cada, cinco dias por semana, durante 12 semanas, numa
câmara de inalação (130).
A câmara de inalação é uma caixa de plástico com volume de
aproximadamente 28 L instalada no interior de uma capela de exaustão. A caixa
é dividida em baias com uma tela de metal para manter os grupos de animais
separados e possui uma saída de ar, uma entrada para o ar comprimido e outra
para a fumaça. A fumaça é proveniente de um cigarro aceso aspirada por um
sistema de Venturi (Figura 1).
Os fluxos nas entradas de ar foram controlados por um fluxômetro
conectado aos cilindros de ar comprimido. Um fluxo constante de 2 L/min foi
mantido na entrada de ar comprimido. Na segunda entrada o fluxo variou de 1,5
a 2 L/min para produzir uma concentração de monóxido de carbono (CO) de
250 a 300 ppm. A concentração de CO foi monitorada por um detector (PhD
Plus Gas Detector, Fisher) mantido no interior da câmara.
22
Em cada sessão de exposição foram utilizados 10-12 cigarros da marca
Derby® vermelho (Souza Cruz SA, RJ, Brasil). A combustão de cada cigarro
libera 10 mg de alcatrão, 0,8 mg de nicotina e 10 mg de CO.
Figura 1: Esquema ilustrativo da câmara de inalação utilizada para a exposição
à fumaça de cigarro (Adaptado de Biselli, 2008) (131)
4.4 Treinamento físico aeróbio e teste físico
Uma esteira ergométrica adaptada para camundongos (Inbrasport
Master ATL, Inbramed®, RS, Brasil) foi utilizada no treinamento físico aeróbio
dos animais. Os treinos consistiram em 60 minutos diários de corrida a uma
intensidade moderada de 60% do teste de esforço máximo em esteira
ergométrica com inclinação de 25%, cinco dias por semana, durante 12 semanas
(130).
Na semana anterior ao início do treinamento, os animais foram
submetidos a três dias de adaptação na esteira, em sessões de 10 minutos de
corrida à velocidade de 0,2 km/h com inclinação de 25%. Os animais foram
submetidos a um teste de esforço máximo 48 horas após o terceiro dia de
adaptação.
O teste foi iniciado com cinco minutos de aquecimento com inclinação
de 25% e velocidade de 0,2 km/h. A velocidade foi aumentada em 0,1 km/h a
cada 2,5 minutos até a exaustão dos animais. Os animais foram considerados
exaustos quando não conseguiram permanecer correndo após 10 estímulos
23
mecânicos. A velocidade utilizada para o treinamento corresponde a 60% da
velocidade máxima atingida neste teste. O teste físico foi repetido após quatro,
oito e 12 semanas de treinamento para reavaliar o condicionamento físico dos
animais.
A sessão de treino dos animais dos grupos FE e FRFE foi realizada entre
as duas sessões de exposição à fumaça de cigarro, com uma hora de intervalo
entre as sessões.
4.5 Exposição à frutose
A solução de frutose 20% (peso/volume) foi preparada adicionando-se
frutose (Lowçucar®, PR, Brasil, 4 kcal/g) na água para beber e foi oferecida ad
libitum durante 12 semanas.
A quantidade de água e de ração consumida foi mensurada diariamente
e a ingestão calórica foi calculada posteriormente.
Os animais dos grupos FR, FRF, FRE e FRFE começaram a receber
solução de frutose no mesmo dia em que os protocolos de exposição à fumaça
de cigarro e/ou treinamento físico começaram.
Figura 2: Delineamento experimental
24
4.6 Calorimetria indireta
O metabolismo respiratório dos animais foi avaliado pelo sistema de
calorimetria indireta OxyletPro (Panlab®, Harvard Apparatus, Espanha).
Para avaliar o metabolismo respiratório de repouso, os animais
(n=4/grupo) foram mantidos em uma gaiola individual com tampa hermética
conectada a um analisador de gases durante 36h. As primeiras 12h foram
consideradas um período de adaptação e apenas os dados das últimas 24h
foram utilizados para análise. Os dados foram separados em dois períodos: dia
(12h iniciais) e noite (12h finais). O sistema foi calibrado antes das avaliações e
permitiu a monitorização do consumo de oxigênio (VO2) e produção de dióxido
de carbono (VCO2) e gasto energético (EE) dos animais.
Já para avaliar o metabolismo respiratório durante exercício forçado, foi
realizado um teste de esforço máximo em uma esteira individual hermeticamente
fechada, conectada a um analisador de gases. Um dia antes do teste, os animais
(n=4/grupo) realizaram adaptação na esteira, com 25% de inclinação, velocidade
de 5,5 cm/s (0,2 km/h), durante 10 minutos. O teste consistiu em aquecimento
de cinco minutos com 25% de inclinação e velocidade de 5,5 cm/s. A cada dois
minutos a velocidade foi aumentada em 2,7 cm/s (0,1 km/h) até a exaustão dos
animais. Os animais foram considerados exaustos quando não conseguiram
permanecer correndo após 10 estímulos elétricos (0,2 mA). No final do teste, foi
obtido o valor do VO2max.
As avaliações foram realizadas antes do início dos protocolos e no final
do período de 12 semanas.
4.7 Frequência cardíaca (FC), pressão arterial (PA) e variabilidade
da frequência cardíaca (VFC)
A frequência cardíaca (FC), pressão arterial (PA) e variabilidade da
frequência cardíaca (VFC) foram avaliados no final do período de 12 semanas.
Os animais (n=8-10/grupo) foram anestesiados com injeção intraperitoneal de
ketamina (100 mg/kg) e xylasina (10 mg/kg) e depois um cuff específico para
25
camundongos foi ajustado na base da cauda do animal. Foi utilizado um sistema
digital de aquisição de dados (PowerLab®, ADInstruments) para o registro dos
parâmetros durante três minutos. Os parâmetros da VFC foram analisados no
domínio do tempo (desvio padrão da média dos intervalos RR normais [SDNN]
e desvio padrão das diferenças entre intervalos RR normais adjacentes
[RMSSD]) e no domínio da frequência (baixa frequência [LF], alta frequência [HF]
e relação entre baixa e alta frequência [LF/HF]) (132).
Ao término dos protocolos, no final do período de 12 semanas, 24h após
a última exposição à fumaça de cigarro ou treinamento físico, metade dos
animais de cada grupo (n=8-10/grupo) foi submetida à avaliação da mecânica
respiratória, coleta de sangue e de lavado broncoalveolar e retirada dos pulmões
para análises histológicas. A metade restante dos animais foi submetida à coleta
de sangue e pulmões para dosagem de citocinas e medidas de expressão gênica
e estresse oxidativo.
4.8 Mecânica respiratória
Os animais utilizados para avaliação da mecânica respiratória foram
pesados, anestesiados (Tiopental, 50 mg/kg, intraperitoneal), traqueostomizados
e conectados a um ventilador mecânico (FlexiVent, Scireq, Montreal, Canadá).
O protocolo de ventilação teve os seguintes parâmetros: volume corrente de 10
ml/kg, frequência respiratória de 120 ciclos/min e pressão expiratória final
(PEEP) de 2 mmH2O. O esforço respiratório foi abolido com pancurônio (0,2
mg/kg, intraperitoneal) e os dados para o cálculo da mecânica foram obtidos
quando não havia mais movimentação espontânea do animal. Utilizamos o
modelo de fase constante para obter as seguintes variáveis de mecânica
respiratória: Raw (resistência de vias aéreas), Gtis (resistência do tecido
pulmonar) e Htis (elastância do tecido pulmonar) (133).
26
4.9 Coleta de sangue
Após a avaliação da mecânica respiratória os animais, ainda sob efeito
anestésico, foram exsanguinados. O sangue foi coletado via punção da aorta
abdominal, heparinizado e centrifugado (3000 rpm, 5ºC, 10 min). O plasma foi
retirado e armazenado a -80ºC para posterior dosagem de glicose, insulina e
triglicérides por métodos laboratoriais convencionais. Os animais permaneceram
em jejum de 12h antes da eutanásia.
4.10 Lavado Broncoalveolar (LBA)
Após a coleta de sangue, 0,5 ml de solução salina estéril foi injetado pela
cânula de traqueostomia e recuperado em seguida para obtenção do lavado
broncoalveolar (LBA). Este procedimento foi realizado três vezes em cada animal
e os fluidos recuperados foram reunidos em um mesmo tubo e centrifugados
(1000 rpm, 5°C, 10 min). Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -
80°C para posterior análise de citocinas. Os botões de células foram
ressuspensos em 300 µl de PBS e utilizado para contagem total e diferencial do
número de células inflamatórias. Foram utilizados 18μl para contagem total numa
câmara de Neubauer e 100 μl para confecção de lâminas para contagem
diferencial. As lâminas foram centrifugadas (450 rpm, 6 min, Cytospin, Cheshire,
UK) e coradas com o kit Diff-Quick (Biochemical Sciences Inc., Swedesboro, NJ).
Foram contadas 300 células por lâmina utilizando um microscópio óptico em
aumento de 1000x (134).
4.11 Preparações histológicas
Após a coleta do LBA, a caixa torácica dos animais foi aberta e os
pulmões foram retirados em bloco com o coração. Os pulmões foram fixados
com formaldeído 4% a uma pressão constante de 20 cmH2O por 24h e, em
seguida, armazenados em etanol 70% por até sete dias. Os pulmões foram
cortados transversalmente e os fragmentos foram incluídos em parafina para o
preparo de cortes histológicos de 5 μm de espessura. As lâminas foram coradas
27
com hematoxilina e eosina (HE), para avaliação do intercepto linear médio e
contagem de células inflamatórias; picrossírius, para avaliação de fibras
colágenas; e resorcina-fucsina, para avaliação de fibras elásticas.
4.11.1 Determinação do Intercepto linear médio (Lm)
O intercepto linear médio (Lm) é uma medida do grau de distensão
alveolar e foi avaliado por meio de um retículo de 50 retas e 100 pontos acoplado
à ocular de um microscópio óptico. O número de intersecções entre o
parênquima pulmonar e as retas do retículo foi contado em 15 campos aleatórios
de cada lâmina, em regiões próximas à pleura, no aumento de 200x. Nesse
aumento o comprimento somado das 50 retas é de 2500 µm. Portanto, o Lm foi
calculado dividindo-se 2500 pela média do número de intersecções dos 15
campos analisados. Quanto maior o valor do Lm, maior o grau de distensão
alveolar (135).
4.11.2 Contagem de células inflamatórias no parênquima pulmonar
A contagem de células inflamatórias mono e polimorfonucleares no
parênquima pulmonar foi realizada nas lâminas coradas com HE, utilizando um
retículo de 50 retas e 100 pontos de área conhecida acoplado à ocular de um
microscópio óptico, em 15 campos aleatórios no aumento de 400x. O número de
células em relação ao número de pontos que caiam no parênquima na área do
retículo foi determinado (136).
4.11.3 Fibras colágenas e elásticas
A quantificação das fibras colágenas e elásticas em relação à área do
parênquima pulmonar foi realizada por meio do método de análise de imagens.
As lâminas coradas com picrossírius e resorcina-fucsina foram fotografadas
utilizando um microscópio óptico comum (Leica DM 4000B, Leica Microsystems
Wetzlar GmbH, Wetzlar, Alemanha) acoplado à uma câmera fotográfica digital
(DFC295, Leica Microsystems Ltd, Heerbrugg, Suíça). As imagens foram
28
capturadas em 15 campos aleatórios no aumento de 400x e enviadas para um
computador. Para análise de todas as imagens o programa Image Pro Plus 4.5
para Windows foi utilizado (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MS, EUA). A
proporção de cada tipo de fibra foi calculada pelo software, através da relação
de área corada por área de tecido, e dada em percentual (%) (137).
4.12 Dosagem de citocinas
A metade restante dos animais foi pesada, anestesiada (Tiopental, 50
mg/kg, intraperitoneal) e o sangue foi coletado via punção da aorta abdominal,
heparinizado e centrifugado (3000 rpm, 5ºC, 10 min). O plasma foi retirado e
armazenado a -80ºC para ser utilizado para a dosagem de citocinas.
O tecido adiposo epididimal foi retirado, pesado e armazenado a -80ºC
para análises futuras.
Os quadríceps femorais direito e esquerdo foram retirados. O direito foi
congelado em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenado a -80ºC para ser
utilizado para análise de citocinas.
O lobo esquerdo do pulmão foi armazenado em tubos contendo solução
para preservar o RNA (RNAlater, Ambion®, Austin, TX, EUA) e saturado neste
produto durante 24h a 4°C. Após este período, os tecidos foram retirados da
solução e armazenados a -80ºC para extração de RNA para avaliação de
expressão gênica. O lobo direito do pulmão foi congelado em nitrogênio líquido
e depois armazenado a -80ºC para medidas de estresse oxidativo.
As concentrações das citocinas IL-6, IL-10, IL-1, IL-1ra, TNF-, leptina
e adiponectina no LBA, plasma e homogenato muscular foram avaliados por
ELISA de acordo com as instruções do fabricante (BioLegend®, San Diego, CA,
USA) (136).
4.13 Expressão gênica
O acúmulo de mRNA de Nrf2, Keap1, GSTA (glutationa-S-transferase
A1), GPX1 (glutationa peroxidase1), GSR (glutationa redutase), Trx1
(tioredoxina1), TrxR (tioredoxina redutase), Prx-1 (peroxiredoxina1B), NQO1
29
(NADPH:quinona oxidoreductase-1), G6PDX (glicose-6-fosfato dehidrogenase)
e HMOX-1 (heme oxigenase1A) foi avaliado por reação em cadeia da polimerase
quantitativa em tempo real (qPCR).
O lobo esquerdo do pulmão foi submetido à extração de RNA total pelo
método isotiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio em etapa única com a
utilização de um produto comercial (TRI-Reagent, Sigma, St Louis, MO) (138). A
qualidade do RNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1% para
verificação da integridade das sub-unidades 28S e 18S do RNA ribossomal. O
RNA total das amostras foi quantificado por espectrofotometria de luz ultravioleta
no comprimento de onda de 260 nm. O RNA das amostras que passaram pelo
controle de qualidade foram submetido à transcrição reversa utilizando a
transcriptase reversa de vírus de leucemia murina de Moloney (MMLV-RT) e
iniciadores (primers) aleatórios por meio de um kit comercial (High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems by Life
Technologies,Carlsbad, CA) . Os transcritos correspondentes a cada um dos
alvos estudados foram amplificados com o uso de iniciadores específicos e a
geração de produtos de qPCR dupla-fita foi monitorada pela ligação dos mesmos
com uma sonda marcada com corante fluorescente. Tanto os iniciadores como
as sondas específicas foram obtidos de ensaios comerciais prontos (Taqman
Gene Expression Assay, Life Techonologies, Carlsbad, CA), listados na Tabela
2.
30
Tabela 2 - Ensaios comerciais utilizados para qPCR
Gene Sigla Taqman Assay
code
Fator nuclear derivado de eritróide 2 Nrf2 Mm00477784_m1
Kelch-like ECH-associated protein 1 Keap1 Mm00497268_m1
Glicose-6-fosfato dehidrogenase G6PDX Mm00656735_g1
NADPH:quinona oxidoredutase 1 NQO1 Mm01253561_m1
Heme oxigenase 1 HMOX1 Mm00516005_m1
Glutationa S-transferase A1 GSTA Mm03646559_mH
Glutationa peroxidase 1 GPX1 Mm01621996_g1
Glutationa reductase GSR Mm00439154_m1
Tioredoxina Trx1 Mm00726847_s1
Tioredoxina redutase 1 TrxR Mm00443675_m1
Beta actina Actb Mm00607939_s1
4.14 Medidas de estresse oxidativo
O lobo direito dos pulmões foi homogeneizado durante 30 segundos em
um homogeneizador Ultra-Turrax com KCl 1,15% e fluoreto de fenil metil sulfonila
(PMSF), na concentração de 100 mmol/L em isopropanol e na quantidade de 10
μl/ml de KCl adicionado. Em seguida, o homogenato foi centrifugado a 3000 rpm
por 10 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi congelado a -80ºC para posterior
dosagem (139).
4.14.1 Dosagem de Proteínas
As proteínas foram quantificadas pelo método descrito por Lowry et al.,
que utiliza como padrão uma solução de albumina bovina na concentração de 1
mg/ml (140).
31
4.14.2 Medida de Lipoperoxidação: Quimiluminescência iniciada
por t-BOOH (QL)
O método consiste em adicionar um hidroperóxido orgânico de origem
sintética (o hidroperóxido de tert-butila – t-BOOH) ao homogeneizado de tecido,
avaliando-se a capacidade de resposta produzida pela amostra. A
quimiluminescência foi medida em um contador beta (TriCrab 2800TR,
PerkinElmer) com o circuito de coincidência desconectado e utilizando o canal
de trício. As determinações foram realizadas em câmara escura, em frascos de
vidro mantidos na penumbra para evitar a fosforescência ativada pela luz
fluorescente. O meio de reação no qual foi realizado o ensaio consiste em 3,5 ml
de uma solução tampão de fosfatos 20 mmol/L, contendo 39 KCl 140 mmol/L
(pH 7,4), à qual foi adicionado 0,5 ml de homogeneizado. Após esse momento,
foi realizada uma leitura inicial, considerada como a emissão basal de luz pelo
homogeneizado. O hidroperóxido de tert-butila foi usado na concentração de 400
mmol/L, dos quais foram adicionados 30 l no meio de reação para obter-se uma
concentração final de 3 mmol/L. Foi medida a emissão de luz e desta foi
descontada a emissão basal do homogeneizado para fins de cálculo (141).
4.14.3 Atividade de Superóxido Dismutase (SOD)
A técnica utilizada foi baseada na inibição da reação do radical
superóxido com o piragalol. Uma vez que não se consegue determinar a
concentração da enzima nem sua atividade em termos de substrato consumido
por unidade de tempo, se utiliza a quantificação em unidades relativas. Uma
unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima que inibe em 50% a
velocidade de oxidação do detector. A oxidação do pirogalol leva à formação de
um produto colorido, detectado espectrofotometricamente a 420 nm durante 2
minutos. A atividade da SOD foi determinada medindo-se a velocidade de
formação do pirogalol oxidado. No meio de reação, foram utilizados 20 µl de
plasma 973 µl de tampão Tris-Fosfato a 50 mmol/L (pH 8,2), 8 µl de pirogalol a
24 mmol/L, 4 µl de CAT a 30 µmol/L. Esta curva obtida foi utilizada como branco.
Foi também realizado uma curva padrão utilizando três concentrações distintas
32
de SOD (0,25U, 0,5U e 1U), através da qual foi obtida a equação da reta para
realização dos cálculos (142).
4.14.4 Atividade de Catalase (CAT)
A taxa de decomposição do peróxido de hidrogênio é diretamente
proporcional à atividade da CAT. Desta forma, o consumo de H2O2 pode ser
utilizado como uma medida de atividade da enzima CAT. O ensaio consiste em
medir a diminuição da absorbância a 240 nm, comprimento de onda onde há a
maior absorção pelo peróxido de hidrogênio, utilizando-se cubetas de quartzo.
Para a realização das medidas foi usada uma solução tampão constituída de
fosfatos a 50 mmol/L em pH 7,4. Foram adicionados 9 l deste tampão e 10 l
de amostra de plasma na cubeta do espectrofotômetro, sendo esta mistura
descontada contra um branco de tampão fosfato. A seguir foram adicionados 35
l de peróxido de hidrogênio (0,3 mol/L) e foi monitorada a diminuição da
absorbância no espectrofotômetro (143).
4.14.5 Poder antioxidante redutor do ferro (FRAP - Ferric Reduction
Ability Power)
O método FRAP foi realizado para avaliação da capacidade antioxidante
das amostras. Foram adicionados 400 l de homogenato diluído à 3,6 ml da
solução de FRAP e a mistura foi incubada à 37°C durante 10 minutos. A
absorbância das amostras foi determinada a 593 nm (144).
4.15 Análise estatística
Os dados foram analisados pelo software SigmaStat 11.0 (Califórnia,
EUA). Os efeitos dos diferentes fatores (fumo, exercício e frutose) sobre os
parâmetros de interesse foram avaliados com a utilização de análise de variância
de três fatores (Three Way ANOVA) quando os dados obedecem à distribuição
normal. A comparação entre os grupos foi feita por análise de variância e o teste
33
de Holm-Sidak foi utilizado para correção de múltiplas comparações. Os dados
que não obedecem à distribuição normal foram submetidos ao teste de Kruskall-
Wallis com a utilização do teste de Dunn para correção de múltiplas
comparações. As diferenças entre os grupos foram consideradas
estatisticamente significantes quando o valor de p foi menor que 0,05.
34
5 RESULTADOS
Os resultados foram apresentados de acordo com a diferença entre os
efeitos dos fatores (fumo, exercício e frutose).
5.1 Peso e parâmetros metabólicos
Todos os grupos ganharam peso após 12 semanas de protocolo. O
ganho de peso dos animais expostos à frutose foi o maior (p<0,05, Figura 3), já
o dos animais que realizaram treinamento físico foi menor (p<0,001, Figura 3) e
a exposição à fumaça de cigarro induziu ganho de peso ainda menor (p<0,001,
Figura 3). Não houve diferença entre os grupos que realizaram treinamento físico
associado à exposição à fumaça de cigarro comparado aos que apenas foram
expostos à fumaça de cigarro.
Não houve diferença significativa entre os grupos em relação aos níveis
de glicemia, insulina e triglicérides. Os dados não foram apresentados.
35
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6
8 * †* *# # &
Figura 3: Ganho de peso corporal (g) dos animais após 12 semanas de protocolo. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle, Exercício, Frutose e Frutose+Exercício; # p<0,001 vs Controle e Frutose, † p=0,040 vs Controle; & p<0,001, vs Controle, Frutose e Frutose+Exercício
36
5.2 Consumo de água, ração e ingestão calórica
A exposição à fumaça de cigarro e o treinamento físico diminuíram o
consumo de água dos animais (p<0,001, Tabela 3), já a exposição à frutose
aumentou o consumo hídrico (p=0,009, Tabela 3).
A exposição à fumaça de cigarro e à frutose diminuíram o consumo de
ração dos animais (p≤0,001, Tabela 3), já o treinamento físico atenuou a
diminuição do consumo alimentar provocada pela exposição à fumaça de cigarro
ou frutose nos grupos treinados (p<0,001, Tabela 3).
A exposição à fumaça de cigarro e à frutose também diminuíram a
ingestão calórica dos animais (p<0,001, Tabela 3).
Tabela 3 - Consumo de água, ração e ingestão calórica semanal por animal
Consumo de
água (ml)
Consumo de
ração (g)
Ingestão
calórica
(kcal)
Controle 30,66±2,96 24,96±2,70 74,64±8,08
Fumo 26,97±2,88 $ 21,79±1,52 $$ 65,15±4,55 &
Exercício 25,98±3,71 † 23,45±1,46 70,12±4,38
Fumo+Exercício 28,57±2,71 23,10±2,14 69,08±6,40 $
Frutose 39,77±5,89 * 11,77±1,57 ## 67,02±6,65
&&
Frutose+Fumo 28,65±2,67 9,72±1,29 ** 52,01±4,33 **
Frutose+Exercício 25,68±2,61 $ 13,07±1,36 †† 59,63±4,76 $$
Frutose+Fumo+Exercício 23,30±3,38 # 13,76±2,01 †† 59,78±7,50 ††
Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,009 vs demais grupos; $ p<0,001
vs Controle; † p<0,001 vs Controle e Frutose+Fumo; & p<0,001 vs Controle, Exercício;
# p<0,001 vs Controle, Fumo, Fumo+Exercício, Frutose+Fumo e Frutose+Exercício; **
p<0,001 vs demais grupos; $$ p=0,001 vs Controle, Exercício e Fumo+Exercício; †† p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício; && p<0,001 vs Controle,
Frutose+Exercício, Frutose+Fumo+Exercício; ## p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose+Fumo+Exercício
37
5.3 Parâmetros do metabolismo energético
Não houve diferença significativa entre os grupos em relação ao
consumo de oxigênio (VO2), produção de dióxido de carbono (VCO2) e gasto
energético (EE) de repouso dos animais antes do início dos protocolos, tanto no
período do dia quanto no da noite (dados não apresentados).
Após 12 semanas, a exposição à fumaça de cigarro aumentou o VO2
(p<0,001, Figura 4), o VCO2 (p<0,001, Figura 5) e o gasto energético de repouso
(p<0,001, Figura 6) dos animais, tanto no período do dia quanto no da noite. O
treinamento físico aeróbio também aumentou o VCO2 (p<0,001, Figura 5) e o
gasto energético (p<0,05, Figura 6) dos animais no final dos protocolos, nos
períodos do dia e da noite.
VO
2 (
ml/k
g/m
in^
0.7
5)
0
10
20
30
40
Dia final Noite final
** * * * ** *
Figura 4: Consumo de oxigênio (VO2) dos animais no final dos protocolos, nos períodos do dia e da noite. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle e Frutose
38
VC
O2 (
ml/kg
/min
^0.7
5)
0
10
20
30
Dia final Noite final
** $ * * &* *† † *#
Figura 5: Produção de dióxido de carbono (VCO2) dos animais no final dos protocolos, nos períodos do dia e da noite. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle e Frutose; # p<0,001 vs Controle; † p<0,001 vs Controle, Exercício e Frutose; $ p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose e Frutose+Exercício; & p<0,001 vs Controle, Exercício, Frutose e Frutose+Exercício
39
Ga
sto
en
erg
éti
co
(k
ca
l/d
ia/k
g^
0.7
5)
0
50
100
150
200
250
Dia final Noite final
** * * * *#* * #† †
Figura 6: Gasto energético dos animais no final dos protocolos, nos períodos do dia e da noite. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle e Frutose; † p=0,023 vs Controle; # p=0,013 vs Controle e Frutose
40
5.4 Consumo máximo de oxigênio (VO2max) durante o exercício
O consumo máximo de oxigênio (VO2max) durante exercício forçado não
foi diferente entre os grupos antes do início dos protocolos (Figura 7). Após 12
semanas de protocolo, o treinamento físico não provocou diferença significativa
em relação ao VO2max (p=0,087, Figura 7).
Figura 7: Consumo máximo de oxigênio (VO2max) durante exercício forçado no início e no final dos protocolos. Valores expressos como média e desvio padrão.
41
5.5 Teste da capacidade de exercício
A velocidade máxima atingida no teste físico antes do início dos
protocolos não foi diferente entre os grupos. Após quatro semanas, os animais
que realizaram treinamento físico aumentaram a velocidade no teste (p<0,001,
Figura 8), independente da exposição à fumaça de cigarro e/ou frutose. O
aumento da velocidade no teste físico dos animais treinados foi mantido após
oito (p<0,001, Figura 8) e 12 semanas (p<0,001, Figura 8). A velocidade do teste
dos animais sedentários do início ao final do protocolo foi mantida.
Tempo (semanas)
0 4 8 12
Ve
loc
ida
de
(k
m/h
)
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
* * *
Figura 8: Velocidade máxima atingida no teste físico antes do início dos protocolos e 4, 8 e 12 semanas após o início dos protocolos. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle, Fumo, Frutose e Frutose+Fumo
42
5.6 Frequência cardíaca, pressão arterial e variabilidade da
frequência cardíaca
Não houve diferença significativa entre os grupos em relação à FC, PA
e VFC. Os dados não foram apresentados.
43
5.7 Mecânica respiratória
Não houve diferença significativa entre os grupos em relação a Raw
(Figura 9) e Htis (Figura 10). No entanto, o grupo exposto à frutose e que realizou
treinamento físico apresentou Gtis significativamente mais elevada do que os
demais grupos (p=0,026, Figura 11).
Figura 9: Resistência de vias aéreas (Raw). Valores expressos como média e desvio padrão.
44
Figura 10: Elastância do tecido pulmonar (Htis). Valores expressos como média e desvio padrão.
45
Gti
s (
cm
H2O
.s.k
g/m
L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20 *
Figura 11: Resistência do tecido pulmonar (Gtis). Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,026 vs demais grupos
46
5.8 Células inflamatórias no LBA
A exposição à fumaça de cigarro aumentou a quantidade total de células
inflamatórias no LBA (p=0,007, Figura 12), principalmente pelo recrutamento de
macrófagos (p=0,004, Figura 12), tanto no grupo exposto à frutose quanto no
grupo não exposto. O treinamento físico impediu o aumento da quantidade total
de células inflamatórias (p<0,001, Figura 12) e de macrófagos (p=0,001, Figura
12) nos grupos expostos à fumaça de cigarro, independente da exposição à
frutose. A quantidade de neutrófilos, linfócitos, eosinófilos e células epiteliais foi
muito pequena e não houve diferença significativa entre os grupos, portanto,
esses dados não foram apresentados.
10
4 c
els
/mL
0
1
2
3
4
Células totais Macrófagos
** ** **
Figura 12: Contagem total e diferencial de células inflamatórias no lavado broncoalveolar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,007 vs Controle, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose, Frutose+Fumo e Frutose+Fumo+Exercício; ** p=0,004 vs Controle, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose, Frutose+Fumo e Frutose+Fumo+Exercício
47
5.9 Células inflamatórias no parênquima pulmonar
A exposição à fumaça de cigarro aumentou a quantidade de células
mononucleares no parênquima pulmonar (p=0,005, Figura 13). O mesmo
ocorreu coma exposição à frutose (p=0,018, Figura 13). Não foi observado
nenhum efeito do treinamento físico na contagem de células mononucleares
(p=0,980, Figura 13).
No entanto, o treinamento físico aumentou a quantidade de células
polimorfonucleares no parênquima pulmonar (p=0,003, Figura 14).
Mo
no
nu
cle
are
s (
ce
ls/m
m²)
0
20
40
60
80
100
120* * ** ** * * **
Figura 13: Contagem de células mononucleares no tecido pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,005 vs Controle e Exercício; ** p=0,018 vs Controle
48
Po
lim
orf
on
uc
lea
res
(c
els
/mm
²)
0
5
10
15
20
25
30 * ** *
Figura 14: Contagem de células polimorfonucleares no tecido pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,003 vs Controle, Fumo, Frutose e Frutose+Fumo
49
5.10 Intercepto linear médio (Lm)
A exposição à fumaça de cigarro aumentou o Lm (p<0,001, Figura 15).
O mesmo ocorreu com a exposição à frutose (p<0,001, Figura 15). A combinação
da fumaça de cigarro e frutose provocou um aumento ainda mais acentuado do
Lm (p=0,008, Figura 15). O treinamento físico impediu o aumento do Lm
associado à exposição à fumaça de cigarro (p<0,001, Figura 15). Já nos grupos
expostos à frutose, o treinamento físico apenas atenuou o aumento do Lm,
independentemente da exposição ou não à frutose (p=0,339 e p=0,069, Figura
15).
* *
Inte
rce
pto
lin
ea
r m
éd
io (
µm
)
0
10
20
30
40
50
60
70 * ** *
Figura 15: Intercepto linear médio (Lm). Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle, Exercício e Fumo+Exercício; ** p=0,008 vs demais grupos
50
Figura 16: Fotomicrografias representativas do parênquima pulmonar distal
corado em H&E dos grupos Controle (A), Fumo (B), Exercício (C),
Fumo+Exercício (D), Frutose (E), Frutose+Fumo (F), Frutose+Exercício (G) e
Frutose+Fumo+Exercício (H). Aumento de 200x.
A
B
C
D
E
F
G
H
51
5.11 Conteúdo de fibras colágenas e elásticas no parênquima
pulmonar
A exposição à frutose diminuiu a porcentagem de fibras colágenas no
parênquima pulmonar (p<0,001, Figura 17). O mesmo foi observado com o
treinamento físico isolado (p<0,001, Figura 17).
O treinamento físico isolado diminuiu a porcentagem de fibras elásticas
(p<0,001, Figura 18), no entanto, quando associado à exposição de frutose, o
treinamento físico aumentou a porcentagem de fibras elásticas no parênquima
pulmonar (p<0,001, Figura 18).
Fib
ras c
olá
gen
as (
%)
0
1
2
3
4
* ** * * *
Figura 17: Porcentagem de fibras colágenas no parênquima pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle, Fumo e Fumo+Exercício; ** p<0,001 vs Controle, Fumo e Frutose+Fumo
52
Fib
ras e
lásti
cas (
%)
0
5
10
15
20
25
30* ** * **
Figura 18: Porcentagem de fibras elásticas no parênquima pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle e Fumo; ** p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose e Frutose+Fumo
53
5.12 Dosagem de citocinas
A exposição à fumaça de cigarro associada ao treinamento físico
aumentou os níveis de IL-6 no plasma (p=0,019, Tabela 4) e no músculo
esquelético (p=0,040, Tabela 4) no grupo não exposto à frutose. A exposição à
frutose também aumentou os níveis de IL-6 no plasma e no músculo esquelético
e o treinamento físico protegeu contra esse aumento nos grupos expostos à
frutose (p=0,004 e p<0,001, respectivamente, Tabela 4).
Tabela 4 - Níveis de IL-6 no LBA, plasma e músculo esquelético
IL-6 (pg/mL)
LBA
IL-6 (pg/mL)
Plasma
IL-6 (pg/mL)
Músculo
C 16,569±2,616 21,272±5,766 19,802±3,090
F 17,271±3,068 10,365±5,338 25,279±3,303
E 15,212±3,280 13,831±5,338 19,228±3,090
FE 18,527±3,543 27,377±5,766 * 33,600±3,568 #
FR 15,683±2,744 31,726±4,993 ** 34,775±3,090 ##
FRF 12,542±2,744 32,079±5,338 ** 43,101±3,568 ###
FRE 13,458±2,744 20,030±4,077 18,546±3,090
FRFE 12,160±2,744 9,370±4,466 16,593±2,913
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. * p=0,019 vs Fumo e Frutose+Fumo+Exercício; ** p=0,004 vs Fumo, Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; # p=0,040 vs Controle, Exercício, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; ## p<0,001 vs Fumo, Exercício, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; ### p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício
54
A exposição à frutose aumentou os níveis de IL-10 no LBA (p=0,034,
Tabela 5). O treinamento físico associado ou não à exposição à fumaça de
cigarro aumentou os níveis de IL-10 no LBA nos grupos não expostos à frutose
(p<0,001, Tabela 5).
No plasma e no músculo esquelético, a exposição à fumaça de cigarro
associada ao treinamento físico aumentou os níveis de IL-10 no grupo não
exposto à frutose (p<0,001, Tabela 5). A exposição à frutose também aumentou
os níveis de IL-10 no plasma e no músculo esquelético e o treinamento físico
impediu esse aumento (p<0,001, Tabela 5).
Tabela 5 - Níveis de IL-10 no LBA, plasma e músculo esquelético
IL-10 (pg/mL)
LBA
IL-10 (pg/mL)
Plasma
IL-10 (pg/mL)
Músculo
C 15,131±1,353 33,949±29,773 23,256±10,609
F 13,570±1,586 71,319±27,565 29,343±9,188
E 18,530±1,696 * 111,505±27,565 32,928±9,188
FE 22,465±1,832 ** 169,352±29,773 # 151,909±9,822 †
FR 18,220±1,419 *** 149,976±25,784 ## 88,877±10,609 ††
FRF 16,492±1,419 **** 197,309±27,565 ### 124,697±11,622 †††
FRE 13,527±1,353 93,233±21,053 31,222±9,188
FRFE 12,161±1,419 62,125±23,062 39,676±9,188
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. * p<0,001 vs Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; ** p<0,001 vs Controle, Fumo, Frutose+Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; *** p=0,034 vs Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; p=0,034 vs Frutose+Fumo+Exercício; # p<0,001 vs Controle, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; ## p<0,001 vs Controle, Fumo e Frutose+Fumo+Exercício; ### p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose+Exercício e
Frutose+Fumo+Exercício; † p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose,
Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; †† p<0,001 vs Fumo; ††† p<0,001 vs
Controle, Fumo, Exercício, e Frutose+Exercício
55
A exposição à fumaça de cigarro associada ao treinamento físico
aumentou os níveis de IL-1β no LBA (p=0,008, Tabela 6) e no músculo
esquelético (p<0,001, Tabela 6) no grupo não exposto à frutose. A exposição à
frutose aumentou os níveis de IL-1β no plasma (p=0,019, Tabela 6) e no músculo
esquelético e o treinamento físico impediu esse aumento (p<0,001, Tabela 6).
Tabela 6 - Níveis de IL-1β no LBA, plasma e músculo esquelético
IL-1β (pg/mL)
LBA
IL-1β (pg/mL)
Plasma
IL-1β (pg/mL)
Músculo
C 122,571±9,423 295,596±34,310 136,936±8,623
F 108,786±11,050 270,962±31,765 139,332±9,218
E 108,755±11,813 227,385±31,765 145,464±8,130
FE 161,235±12,759 * 263,056±34,310 213,833±9,957 †
FR 130,961±9,883 397,272±29,713 # 175,210±8,623 ††
FRF 123,419±9,883 280,087±31,765 182,130±9,218 ††
FRE 124,666±9,883 289,172±24,261 142,583±8,623
FRFE 132,882±9,883 301,005±26,576 139,581±8,130
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. *
p=0,008 vs Fumo e Exercício; # p=0,019 vs demais grupos; † p<0,001 vs demais grupos; †† p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose+Exercício e
Frutose+Fumo+Exercício
56
A exposição à fumaça de cigarro associada ao treinamento físico
aumentou os níveis de TNF-α no músculo esquelético no grupo não exposto à
frutose (p<0,001, Tabela 7). A exposição à frutose aumentou os níveis de TNF-
α no músculo esquelético e o treinamento físico impediu esse aumento (p<0,001,
Tabela 7).
Tabela 7 - Níveis de TNF-α no LBA, plasma e músculo esquelético
TNF-α (pg/mL)
LBA
TNF-α (pg/mL)
Plasma
TNF-α (pg/mL)
Músculo
C 46,075±3,090 24,409±3,934 20,020±1,422
F 47,989±3,624 21,996±3,642 18,572±1,521
E 43,255±3,874 28,226±3,642 17,413±1,521
FE 56,278±4,184 29,268±3,934 27,643±1,799 *
FR 47,514±3,241 24,230±3,407 23,786±1,422 **
FRF 52,908±3,241 25,897±3,642 27,888±1,521 ***
FRE 45,922±3,241 21,125±2,781 20,048±1,422
FRFE 46,946±3,241 23,075±3,047 18,642±1,422
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. * p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; ** p<0,001 vs Fumo; *** p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício
57
A exposição à fumaça de cigarro associada ao treinamento físico
aumentou os níveis de adiponectina no LBA e no músculo esquelético no grupo
não exposto à frutose (p<0,001, Tabela 8). A exposição à frutose também
aumentou os níveis de adiponectina no LBA e no músculo esquelético (p<0,001,
Tabela 8). Observamos uma interação entre consumo de frutose e treinamento
físico pois este diminuiu os níveis de adiponectina nos grupos expostos à frutose
(p<0,001, Tabela 8).
Tabela 8 - Níveis de adiponectina no LBA, plasma e músculo esquelético
Adiponectina
(pg/mL) LBA
Adiponectina
(pg/mL) Plasma
Adiponectina
(pg/mL) Músculo
C 35,752±68,460 2013,072±570,731 91,846±115,046
F 32,683±80,277 2262,935±528,395 82,094±115,046
E 34,108±113,529 2400,683±528,395 82,526±108,466
FE 558,040±80,277 * 1934,448±570,731 1024,573±115,046 †
FR 772,782±71,802 ** 1819,221±494,268 1148,719±115,046
††
FRF 375,217±71,802 *** 3388,850±528,395 820,123±122,989 †
FRE 50,896±71,802 873,289±403,568 # 202,836±115,046
FRFE 532,355±71,802 *** 454,783±442,087 ## 828,818±108,466 †
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. * p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Frutose+Fumo e Frutose+Exercício; ** p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose+Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício; *** p<0,001 vs Controle, Fumo, Exercício e Frutose+Exercício; # p=0,011 vs Fumo, Exercício e Frutose+Fumo; ## p=0,011 vs
Controle, Fumo, Exercício, Fumo+Exercício, Frutose e Frutose+Exercício; † p<0,001 vs
Controle, Fumo, Exercício e Frutose+Exercício; †† p<0,001 vs Controle, Fumo,
Exercício, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício
58
O treinamento físico aumentou os níveis de leptina no LBA (p<0,001,
Tabela 9), exceto no grupo que foi exposto à frutose. Já no plasma, o treinamento
físico diminuiu os níveis de leptina (p=0,003, Tabela 9). A exposição à fumaça
de cigarro diminuiu os níveis de leptina no plasma no grupo exposto à frutose
(p=0,009, Tabela 9). O treinamento físico aumentou os níveis de leptina no
músculo esquelético nos grupos não expostos à frutose (p<0,001, Tabela 9) e
impediu o aumento dos níveis de leptina no músculo esquelético nos grupos
expostos à frutose (p<0,001, Tabela 9).
Tabela 9 - Níveis de leptina no LBA, plasma e músculo esquelético
Leptina (pg/mL)
LBA
Leptina (pg/mL)
Plasma
Leptina (pg/mL)
Músculo
C 133,994±110,606 2149,409±414,716 1715,085±666,798
F 292,699±129,697 1596,220±414,716 1346,756±666,798
E 562,758±138,652 * 768,520±414,716 # 5090,876±628,663 †
FE 1187,191±149,761 ** 576,875±414,716 # 5172,477±666,798 †
FR 184,198±116,004 2615,494±414,716 5708,343±666,798 †
FRF 163,878±116,004 373,860±443,350 ## 4747,476±712,837 †
FRE 123,647±116,004 981,936±443,350
###
1671,485±666,798
FRFE 793,957±116,004 *** 773,463±390,998 # 1996,705±628,663
Valores expressos como média e desvio padrão. LBA=Lavado broncoalveolar, C=Controle, F=Fumo, E=Exercício, FE=Fumo+Exercício, FR=Frutose, FRF=Frutose+Fumo, FRE=Frutose+Exercício e FRFE=Frutose+Fumo+Exercício. * p<0,001 vs Controle, Frutose, Frutose+Fumo e Frutose+Exercício; ** p<0,001 vs demais grupos; *** p<0,001 vs Controle, Fumo, Frutose, Frutose+Fumo e Frutose+Exercício; # p=0,003 vs Controle e Frutose; ## p=0,009 vs Controle, Fumo e Frutose; ### p=0,003
vs Frutose; † p<0,001 vs Controle, Fumo, Frutose+Exercício e Frutose+Fumo+Exercício
59
5.13 Expressão de genes envolvidos na resposta antioxidante
A exposição à frutose diminuiu a expressão do gene Keap1 no pulmão
(p<0,001, Figura 19), assim como a exposição à fumaça de cigarro (p=0,034,
Figura 19). A exposição à fumaça de cigarro, assim como à frutose, diminuiu a
expressão do gene HMOX no pulmão (p=0,040, Figura 20). A expressão de Nrf2,
GSTA, GPX1, GSR, Trx1, TrxR, Prx-1, NQO1 e G6PDH não foi afetada pela
exposição à fumaça de cigarro ou à frutose. O treinamento físico não apresentou
efeito na expressão dos genes estudados.
Ke
ap
1 (
Re
lati
ve
mR
NA
ex
pre
ss
ion
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
* ** * ** *
Figura 19: Expressão do gene Keap1 no pulmão. Valores expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 vs Controle, Exercício e Fumo+Exercício; ** p<0,001 vs Controle e Fumo+Exercício
60
HM
OX
(R
ela
tive
mR
NA
exp
res
sio
n)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2* ** * ** *
Figura 20: Expressão do gene HMOX no pulmão. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,040 vs Controle; ** p=0,040 vs Controle e Exercício
61
5.14 Medidas de estresse oxidativo
A exposição à fumaça de cigarro aumentou a atividade de catalase no
homogenato pulmonar (p=0,003, Figura 21). A exposição à frutose aumentou a
peroxidação lipídica (p=0,042, Figura 22) e a atividade de SOD no homogenato
pulmonar (p=0,032, Figura 23). Não houve diferença nas medidas de FRAP
(Figura 24). O treinamento físico não apresentou efeitos nas medidas de
estresse oxidativo.
Ca
tala
se
(n
mo
l/m
g d
e p
rote
ína
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
* ** *
Figura 21: Atividade de catalase no homogenato pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,003 vs Controle, Exercício, Frutose e Frutose+Exercício
62
QL
(c
ps/m
g d
e p
rote
ína)
0
1000
2000
3000
4000
5000* ***
Figura 22: Peroxidação lipídica avaliada por quimioluminescência (QL) no homogenato pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,042 vs Controle, Fumo, Exercício e Fumo+Exercício
63
SO
D (
US
OD
/mg
de p
rote
ína)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
* ***
Figura 23: Atividade de SOD no homogenato pulmonar. Valores expressos como média e desvio padrão. * p=0,032 vs Controle, Fumo, Exercício e Fumo+Exercício
64
FR
AP
(m
M F
e)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Figura 24: Poder antioxidante redutor do ferro (FRAP) no homogenato pulmonar.
Valores expressos como média e desvio padrão.
65
5.15 Resumo dos resultados
Tabela 10 – Resumo dos resultados
Frutose Fumo Exercício
Lm
Fibras colágenas
Fibras elásticas
Células inflamatórias
(LBA)
Células inflamatórias
(parênquima)
Citocinas
Keap1
HMOX
Atividade de catalase
Peroxidação lipídica
Atividade de SOD
Lm = Intercepto linear médio, LBA = Lavado broncoalveolar
66
6 DISCUSSÃO
O presente estudo mostrou que a ingestão crônica de frutose promoveu
destruição e remodelamento do parênquima pulmonar. Tais alterações na
estrutura do tecido pulmonar estão associadas a perfis distintos de citocinas no
LBA, plasma sanguíneo e músculo esquelético. Ainda, os efeitos combinados da
ingestão crônica de frutose e exposição à fumaça de cigarro na destruição do
parênquima pulmonar são mais pronunciados do que os efeitos isolados de
qualquer um deles. Além disso, o treinamento físico impediu o aumento dos
níveis de citocinas pró-inflamatórias no plasma e/ou músculo esquelético, alterou
a porcentagem de fibras colágenas e elásticas no parênquima pulmonar e
atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar no grupo que realizou
treinamento físico associado à exposição à fumaça de cigarro e sobrecarga de
frutose.
Esses resultados sugerem que a ingestão excessiva de frutose pode
provocar enfisema pulmonar em camundongos C57Bl/6 em vez de apenas
alterar sua história natural ao facilitar a instalação de um meio inflamatório
sistêmico de baixo grau. Esse é um achado inesperado dado a já conhecida
relação entre o peso corporal excessivo ou adiposidade, resistência à insulina e
limitação do fluxo aéreo (145). Para o nosso conhecimento, este é o primeiro
relato de uma conexão direta entre a ingestão crônica de um macronutriente e
uma doença respiratória crônica e ilustra a importância de uma compreensão
mais profunda sobre a relação entre hábitos alimentares e doenças não
transmissíveis.
Nossos resultados também mostraram que o treinamento físico atenuou
parcialmente o desenvolvimento do enfisema nos animais que realizaram
treinamento físico associado à exposição à fumaça de cigarro e sobrecarga de
frutose, com efeitos benéficos em relação à inflamação, mas sem apresentar
efeitos nas medidas de estresse oxidativo. O grau de enfisema pulmonar
apresentado pelos animais que realizaram treinamento físico associado apenas
à ingestão crônica de frutose foi semelhante ao dos animais expostos à fumaça
67
de cigarro, mostrando que o treinamento físico associado à frutose não
apresenta efeito no desenvolvimento do enfisema.
Um estudo do nosso grupo de pesquisa demonstrou um efeito protetor
do treinamento físico aeróbio no desenvolvimento do enfisema pulmonar em
modelo experimental de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Nesse
modelo, o treinamento físico atenuou o aumento do Lm e o declínio da elastância
pulmonar induzidos pela exposição à fumaça de cigarro. Além disso, o
treinamento também inibiu o acúmulo de espécies oxidantes e a redução de
antioxidantes induzidos pela exposição à fumaça de cigarro (25). O exercício
físico aeróbio realizado regularmente desencadeia diversas adaptações crônicas
benéficas em todo o organismo, como redução da pressão arterial e da
frequência cardíaca de repouso em indivíduos hipertensos (108, 109), aumento
do VO2max, aumento da massa muscular e densidade óssea (110), melhora da
resposta imunológica (se a atividade for predominantemente realizada em
intensidade leve ou moderada) (111) e aumento da expressão e atividade de
enzimas antioxidantes (112). O treinamento físico aumenta a resistência contra
o estresse oxidativo, proporcionando uma maior proteção (113-115).
Tais efeitos do treinamento físico o credenciam como uma modalidade
terapêutica para doenças crônicas. Além de o treinamento físico atenuar os
múltiplos aspectos da síndrome metabólica, como melhorar as características
metabólicas e a sensibilidade à insulina, reduzir a gordura abdominal (104-106,
116) e a inflamação sistêmica comumente observada nesses pacientes (117-
119), os resultados benéficos de programas de reabilitação pulmonar com
treinamento físico para pacientes com DPOC são bem documentados e esses
programas tem sido recomendados como um meio efetivo para o tratamento
desses pacientes (120-123). Além disso, existem dados que mostram que
mesmo indivíduos tabagistas beneficiam-se dos efeitos protetores de um
programa de atividade física regular (24, 124). Um estudo mostrou que a prática
de atividade física de moderado ou alto grau por fumantes reduz o declínio da
função pulmonar e o risco de desenvolver DPOC (24).
No entanto, alguns efeitos benéficos do treinamento físico já
demonstrados anteriormente não foram observados no nosso modelo,
mostrando que a exposição crônica à frutose interferiu nos efeitos do treinamento
68
físico aeróbio sobre a lesão pulmonar induzida por exposição à fumaça de
cigarro. Os dados do presente trabalho estão em consonância com resultados
de outro estudo do nosso grupo em que observamos que a frutose atenuou a
expressão muscular de genes que medeiam os efeitos metabólicos benéficos do
treinamento físico (146). As observações desses trabalhos do nosso grupo
sugerem que os efeitos deletérios potenciais da frutose não se limitam apenas a
um órgão ou sistema, e sim poderiam ter manifestações bem além de simples
sobrecarga calórica.
A lesão pulmonar apresentada por nossos animais expostos à frutose
tem semelhanças com o enfisema causado pela exposição à fumaça de cigarro,
uma vez que ambos são caracterizados pelo aumento de Lm e acompanhados
de infiltrado celular no parênquima pulmonar. No entanto, ao contrário dos
animais expostos à fumaça de cigarro neste estudo, nossos camundongos
expostos à frutose apresentaram diminuição do conteúdo de fibras colágenas
em seus septos alveolares. Um estudo usando espécimes de tecido pulmonar
humano (147) e as observações do nosso grupo que utilizaram modelos animais
de enfisema induzido experimentalmente (25, 148) mostraram que o enfisema
induzido por exposição à fumaça de cigarro é acompanhado por um aumento do
teor de colágeno na parede alveolar. Essas características específicas da lesão
pulmonar associada à frutose sugerem que a sobrecarga de frutose e a
exposição à fumaça de cigarro dependem de diferentes mecanismos
fisiopatológicos para produzir lesão alveolar.
Além da diferença no conteúdo de colágeno dos septos alveolares,
nossos camundongos expostos à frutose apresentam um perfil distinto de
leucócitos no LBA no e parênquima pulmonar quando comparados aos animais
expostos à fumaça de cigarro. A exposição à fumaça de cigarro aumentou o
número de células inflamatórias no LBA, principalmente devido ao aumento do
número de macrófagos, sem alteração significativa no número de neutrófilos e
linfócitos. Em contraste, a exposição crônica à frutose não alterou o número ou
a composição das células no LBA. Vale ressaltar que tanto a exposição à fumaça
de cigarro como a sobrecarga de frutose causaram um aumento no número de
células mononucleares que infiltram o parênquima pulmonar. As diferenças no
padrão citológico podem ser explicadas por diferenças na forma como a
69
exposição à fumaça de cigarro e a exposição crônica à frutose causaram
inflamação no parênquima pulmonar. No primeiro caso, a irritação causada pela
fumaça de cigarro no epitélio das vias aéreas e na superfície alveolar recruta
células inflamatórias para o parênquima pulmonar e o espaço alveolar, enquanto
a ingestão de frutose provoca resposta inflamatória em outro lugar que se
propaga ao parênquima pulmonar causando o acúmulo de células
mononucleares neste tecido.
Neste estudo, os camundongos expostos à fumaça de cigarro não
apresentaram alterações significativas no perfil das citocinas no LBA. Os animais
expostos à frutose, em contraste, exibiram múltiplas alterações no perfil de
citocinas. As concentrações aumentadas de IL-10, IL-6, IL-1β e TNFα no
homogenato muscular são provavelmente marcadores da inflamação do
músculo esquelético causada pela sobrecarga crônica de frutose, enquanto o
acúmulo elevado de leptina e adiponectina neste material pode ser visto como
uma resposta protetora para limitar os efeitos deletérios da sobrecarga
metabólica induzida por frutose (149). Da mesma forma, a concentração elevada
de IL-10, IL-6, IL-1β no plasma sanguíneo podem ser indicadores do estado
inflamatório sistêmico induzido pela carga de frutose. Finalmente, a alta
concentração de leptina e adiponectina no LBA de camundongos expostos à
frutose pode ter uma conexão com o acúmulo de colágeno nos septos
alveolares, uma vez que ambos modulam o remodelamento da matriz
extracelular em tecidos cardiovasculares (150, 151).
Tanto os perfis citológicos como os perfis de citocinas de nossos animais
alimentados com frutose são compatíveis com a interpretação de que a
destruição alveolar que eles apresentam é resultado do estado inflamatório
sistêmico iniciado em um local extrapulmonar. Se for esse o caso, a questão que
se segue é naturalmente a identidade do site onde o insulto relacionado à frutose
provocou um processo de inflamação. Como o principal sítio do metabolismo da
frutose ingerida por via oral (152), o fígado é um candidato natural para o local
de iniciação do estado inflamatório. Nos modelos de roedores, a ingestão de
frutose foi relatada como causa de resposta ao estresse hepático, ativação de
quinases c-Jun N-terminais e resposta inflamatória (153). Alternativamente, a
ingestão excessiva de frutose pode estimular o fígado para libertar produtos do
70
metabolismo da frutose (por exemplo, ácidos graxos não esterificados) que
podem causar resposta inflamatória no músculo esquelético ou no tecido
adiposo. As concentrações aumentadas de leptina e adiponectina no LBA e
homogenato muscular de nossos animais alimentados com frutose são mais
compatíveis com o último cenário. Mais estudos são necessários para confirmar
esta hipótese.
Outra diferença entre nosso modelo de exposição à fumaça de cigarro e
de ingestão crônica de frutose foi em relação ao equilíbrio oxidante-antioxidante.
Os animais expostos à frutose apresentaram aumento da peroxidação lipídica e
da atividade de SOD. A SOD está presente em todas as células do corpo e
desempenha um importante papel na proteção das células e dos tecidos contra
o estresse oxidativo, cujo mecanismo consiste na dismutação do ânion
superóxido (-O2) para uma molécula menos potente, o peróxido de hidrogênio
(H2O2) (64). O aumento da atividade de SOD pode ser visto como uma resposta
protetora para limitar os efeitos deletérios do estresse oxidativo consequente à
exposição à frutose. Da mesma forma, o aumento da atividade de catalase nos
animais expostos à fumaça pode ser uma resposta protetora para reestabelecer
o equilíbrio oxidante-antioxidante. A catalase é a enzima que se encarrega de
fazer a conversão de altas concentrações de peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio. Quando o peróxido de hidrogênio está presente em baixas
concentrações, a glutationa peroxidase é quem se encarrega de transformá-lo
em água Nossos resultados sugerem que um desequilíbrio oxidante-antioxidante
possa ser um dos mediadores do processo lesivo iniciado pelas toxinas do
cigarro, bem como efetores da lesão pulmonar, produzindo destruição do
parênquima pulmonar.
As limitações dos modelos animais devem ser consideradas, mas os
resultados obtidos a partir desses modelos podem proporcionar avanços
significativos na compreensão dos mecanismos envolvidos nas doenças e
colaborar para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da
síndrome metabólica em pacientes com DPOC.
Nosso estudo apresenta algumas limitações. Não avaliamos os efeitos
da ingestão crônica de frutose e da exposição à fumaça de cigarro no equilíbrio
protease-antiprotease no desenvolvimento do enfisema. A avaliação desse
71
equilíbrio poderia explicar melhor a fisiopatologia do enfisema pulmonar induzido
por frutose se esse sistema estiver envolvido no mecanismo de lesão pulmonar.
Além disso, não avaliamos os efeitos de outros macronutrientes, como a glicose,
além da frutose. Por essa razão, não podemos afirmar se o efeito observado é
específico da frutose. Outra limitação foi que tivemos que acomodar os animais
em grupo nas gaiolas. Isso poderia ter causado um desequilíbrio na ingestão de
frutose por efeito de animal dominante, o que levaria a alterações apenas
modestas dos parâmetros metabólicos. Esse último pode ser a causa de não
termos observado animais que cumprissem os critérios diagnósticos de
síndrome metabólica. Estudos futuros devem ser realizados para esclarecer
esses pontos.
Em resumo, mostramos que a ingestão crônica de frutose promove
destruição e remodelamento do parênquima pulmonar, associada a perfis
distintos de citocinas no LBA, plasma sanguíneo e músculo esquelético; e o
treinamento físico é capaz de atenuar parcialmente o desenvolvimento do
enfisema quando a exposição à fumaça de cigarro é associada à ingestão
crônica de frutose. A conexão direta entre a ingestão crônica de um
macronutriente e uma doença respiratória crônica relatada neste estudo ilustra
a importância de uma compreensão mais profunda sobre a relação entre hábitos
alimentares e doenças não transmissíveis para o desenvolvimento de
estratégias de prevenção e tratamento de doenças.
72
7 CONCLUSÕES
A ingestão crônica de frutose promoveu enfisema pulmonar em
camundongos C57Bl/6. A destruição e o remodelamento do parênquima
pulmonar estão associados a perfis distintos de citocinas no LBA, plasma
sanguíneo e músculo esquelético.
Os efeitos combinados da ingestão crônica de frutose e exposição à
fumaça de cigarro na destruição do parênquima pulmonar são mais
pronunciados do que os efeitos isolados de qualquer um deles.
O treinamento físico impediu o aumento dos níveis de citocinas pró-
inflamatórias no plasma e/ou músculo esquelético, alterou a
porcentagem de fibras colágenas e elásticas no parênquima pulmonar e
atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar no grupo que realizou
treinamento físico associado à exposição à fumaça de cigarro e
sobrecarga de frutose.
Nossos dados sugerem que o treinamento físico não protege contra os
efeitos da exposição à frutose na lesão e remodelamento de alvéolos.
73
8 ANEXO
74
9 REFERÊNCIAS
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![719D[1]_Processos Aeróbio e Anaeróbios_modelagem Matemática](https://static.fdocumentos.com/doc/165x107/55cf8f8b550346703b9d5809/719d1processos-aerobio-e-anaerobiosmodelagem-matematica.jpg)
