EFETORES NAS INTERAÇÕES PLANTA-PATÓGENOS

Dalio, Ronaldo J. D.1; Magalhães, Diogo M.

1; Atílio, Lísia B.

1; Rodrigues,

Carolina M.1; Breton, Michèle C.

1; Pichi, Simone

1; Pascholati, Sérgio F.

2;

Machado, Marcos A.1

1 Laboratório de Biotecnologia de Citros, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, IAC

Cordeirópolis-SP

2 Departameto de Nematologia e Fitopatologia, Escola Superior de Agricultura Luiz

de Queiroz, USP, Piracicaba-SP

RESUMO

Durante milhões de anos convivendo no mesmo ambiente, plantas e patógenos

desenvolveram um complexo sistema de interação entre eles. Patógenos utilizam um

grande número de estratégias para superar as barreiras de defesas e iniciarem a

colonização nos tecidos do hospedeiro. Enquanto isso, as plantas apresentam um

complexo sistema de defesa para impedir a invasão dos patógenos e, em consequência,

o desenvolvimento da doença. Esta batalha resulta em uma constante pressão de

seleção entre os organismos envolvidos. Nesta revisão são apresentados os principais

componentes envolvidos na interação planta-patógeno, que vão desde a ativação da

defesa desencadeada por reconhecimento de padrões moleculares associados aos

patógenos (PAMPs), o papel fundamental de efetores e proteínas de resistência no

desenvolvimento de doenças, as ferramentas de bioinformática utilizadas para

predição de candidatos a genes efetores no genoma dos patógenos e o uso potencial

dos efetores na proteção das plantas de interesse econômico e ecossistemas naturais.

SUMMARY

Millions of years coexisting in the same environment lead to the development of a

complex interaction system between plants and pathogens. A number of strategies are

used by pathogens to break the plant defense barriers in order to invade and colonize

plant tissues. At the same time, a profusion of other strategies are used by plants to

avoid or minimize the pathogen invasion and development. Because of this battle

there is a constant selection pressure for the organisms involved, resulting in a

strategy game which will never have a final winner. Here, we review the main

components involved in plant-pathogen interactions from the Pathogen-Associated

Molecular Pattern (PAMP) and their recognition by PAMP receptors activating

2

defense, the role of effectors and R proteins and their importance to help pathogens

and plants, respectively, in this endless war for survival, the bioinformatic tools to

predict putative effectors and their potential use to protect crops and natural

ecosystems.

INTRODUÇÃO

Milhões de anos de convívio no mesmo ambiente favoreceu o

desenvolvimento de complexo sistema de comunicação entre plantas e

microrganismos. Para toda interação planta-microrganismo, a troca de sinais

representa a primeira e fundamental etapa. Assim, a habilidade de perceber e

responder a sinais do ambiente é fundamental para a sobrevivência (Tyler et al., 2006).

Patógenos apresentam a habilidade de reconhecer sinais das plantas para

iniciar a infecção (Dalio et al., 2014). Por sua vez, as plantas estão expostas

constantemente a mudanças no ambiente, ataque de pragas e patógenos.

Diferentemente dos animais, plantas não apresentam um sistema imune adaptativo e

nem células de defesa móveis, como os macrófagos (Chisholm et al., 2006). No

entanto, desenvolveram um sistema imune simples, porém eficiente, que é ativado

após o reconhecimento de sinais da presença do microrganismo (Dalio, 2013;

Gassmann & Bhattacharjee, 2012).

Os processos de reconhecimento pelo sistema imune das plantas podem ser

dividido em duas frentes: (i) aqueles associados à imunidade desencadeada por

PAMPs ou MAMPs (pathogen or microbe associated molecular patterns); (ii)

aqueles associados à imunidade desencadeada por efetores. O primeiro é usualmente

denominado PTI (PAMP-triggered immunity) e o segundo ETI (effector-triggered

immunity) (Jones & Dangl, 2006). Os PAMPs ou MAMPs são reconhecidos por

receptores PRRs (PAMP-recognition receptor) localizados na superfície da

membrana celular ou interior da célula, que desencadeiam uma cascata de transdução

de sinais ativando a resposta de defesa (Hogenhout et al., 2009). Este tipo de sistema

de defesa permite que as plantas respondam rápida e eficientemente a uma ampla

gama de patógenos (Roux et al., 2014).

Patógenos adaptados são capazes de secretar um arsenal de proteínas que

podem suprimir PTI, resultando em suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS,

3

effector-triggered susceptibility) (Birch et al., 2008). Os processos na resposta ETI

envolvem a secreção de efetores para suprimir essa resposta. No entanto, plantas

podem apresentar proteínas de resistência (R) que reconhecem estes efetores

resultando em defesa (Howden & Huitema, 2012). O reconhecimento de efetores por

proteínas R pode ser direto (modelo gene-a-gene) (Oßwald et al., 2014) ou indireto

(modelo guarda) (Jones & Dangl, 2006). Enquanto patógenos desenvolvem novos

efetores para manipular os processos de defesa das plantas, estas desenvolvem novas

proteínas R, o que sugere uma constante e indefinida “corrida armamentista” na

interação planta-patógeno (Figura 1) (Coll et al., 2011).

4

Figura 1. Representação esquemática da co-evolução entre plantas e patógenos.

Sob ataque de patógenos, PAMPs ativam PRRs nos hospedeiros, resultando em

cascata de sinais, usualmente através de fatores de transcrição como os WRKY, que

leva a defesa. Este processo é denominado PTI. Patógenos virulentos podem secretar

efetores que suprimem o reconhecimento de PAMPs e PTI, o que resulta em

suscetibilidade. Este processo é denominado ETS. Por outro lado, plantas podem

apresentar genes que codificam proteínas de resistência (R), que reconhecem os

efetores e desencadeiam defesa. Este processo é denominado ETI. Sob pressão de

seleção, os patógenos alteram ou desenvolvem novos efetores para escapar do

reconhecimento por proteínas R, o que resulta em uma nova fase ETS. Desse modo, a

pressão de seleção passa para as plantas. Novos genes R podem emergir e

desencadear uma nova ETI, restaurando a imunidade. Estes processos podem se

repetir indefinidamente (Dalio, 2013).

Após o reconhecimento de um PAMP ou efetor, o sistema imune das plantas é

ativado através de vias de sinalização semelhantes, baseadas em mudanças nos níveis

de cálcio no citoplasma, rápida produção de espécies reativas de oxigênio e cascata de

sinalização via MAP-quinases (mitogen activated protein kinases). A amplificação

desses sinais ocorre por meio de hormônios reguladores como ácido salicílico (SA),

ácido jasmônico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativação de fatores de transcrição,

entre eles os da super-família WRKY, e de genes de defesa, proteínas-PR

(pathogenesis-related proteins), fitoalexinas, lignificação de tecidos, deposição de

calose e outros reforços da parede celular (Grant & Lamb, 2006).

É evidente que o reconhecimento do patógeno é fundamental para qualquer

interação de suscetibilidade ou de resistência. Poucas proteínas efetoras já foram

5

descritas, no entanto, vários PAMPs/MAMPs são comprovadamente envolvidos nas

relações de reconhecimentos entre plantas e microrganismos (Newman et al., 2013).

Sabe-se que os patógenos apresentam diversas estratégias de ataque ao

hospedeiro e que inúmeros efetores tem potencial para manipular a defesa das plantas.

No entanto, isso contrasta com o que se vê na natureza, onde resistência é a regra e a

suscetibilidade a exceção. Em outras palavras, uma dada espécie de planta pode ser

resistente para a maioria dos patógenos e suscetível a apenas alguns. Isto se dá em

função de relações incompatíveis, sendo chamada de resistência de não-hospedeiro

(non-host resistance). Esta revisão, no entanto, está focada em relações compatíveis

patógeno-hospedeiro, abordando os efetores e seu papel na ativação ou bloqueio de

respostas de defesa das plantas.

O entendimento e a manipulação de componentes chave envolvidos em

mecanismos de defesa das plantas, como PAMPs, PRRs, efetores e genes de

resistência, podem levar ao desenvolvimento de novas estratégias para o controle de

doenças nos vegetais (Raffaele & Kamoun, 2012).

IMUNIDADE DESENCADEADA POR PAMPS (PTI)

Inicialmente, as plantas percebem a presença de microrganismos a partir de

receptores de reconhecimento de padrões moleculares PRRs (pattern recognition

receptors). Esses receptores são proteínas transmembranas pertencentes à classe das

proteínas receptor-like (RLPs) ou quinases receptor-like (RLKs) e apresentam

geralmente repetições ricas em leucina (LRRs) ou motivo de lisina (Lysm) no

domínio extracelular, o qual está envolvido com o reconhecimento dos sinais (Beck et

al., 2012).

Os PRRs estão presentes na superfície das células e são capazes de reconhecer

PAMPs e ativar a resposta de defesa contra os patógenos em potencial. Os PAMPS

foram inicialmente definidos como moléculas provenientes dos microrganismos

altamente conservadas e que apresentam função essencial em sua sobrevivência

(Medzhitov & Janeway, 1997). Muitas vezes, essas moléculas são provenientes de

microrganismos não patogênicos, portanto o termo (MAMP) também é utilizado.

Tanto PAMPs ou MAMPs são capazes de atuar como moléculas eliciadoras e

desencadear respostas de defesa basal. Da mesma forma, os PRRs podem também

6

reconhecer perfis moleculares associados a insetos herbívoros (HAMPs) (Mithöfer &

Boland, 2008) ou mesmo danos resultantes (DAMPs, damage-associated molecular

patterns) que são moléculas liberadas pelas próprias células do hospedeiro quando

expostas ao ataque por pragas ou microrganismos (Ma et al., 2012).

Moléculas de diferentes classes e pertencentes a diferentes microrganismos

foram identificadas como PAMPs/MAMPs, incluindo os peptídeos bacterianos

flagelina e fator Tu de elongamento (EF-Tu), xilanase de fungo induzida por etileno

(EIX) e oligossacarídeos de fungos, como as glucanas ou fragmentos de quitina da

parede celular. Também foram identificados como PAMPs/MAMPs epítopos mais

complexos, como glicoproteínas de oomicetos ou lipopolissacarideos e

peptideoglicanas de bactérias (Shan et al., 2007). Com a detecção dos

PAMPS/MAMPS, as proteínas PRRs ativam na planta a resposta de imunidade

desencadeada por PAMPs (PTI) e esta representa a primeira linha do sistema de

imunidade das plantas (Tabela 1).

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Tabela 1. PAMPs, MAMPs, DAMPs e HAMPs já descritos e seus respectivos

receptores PRRs envolvidos em respostas de defesa tipo PTI.

MAMP/DAMP/HAMP Planta responsiva Receptor Referência

Bactérias

Peptideoglicana Arroz Lyp4/Lyp6 (Liu et al., 2012)

Arabidopsis Lym1/Lym3 (Willmann et al., 2011)

Lipopolissacarídeo (LPS) Arabidopsis, fumo,

pimenta Desconhecido (Zeidler et al., 2004)

Flagelina Arabidopsis, tomate,

arroz, fumo FLS2

(Gómez-Gómez & Boller,

2000)

Fator Tu de elongação (EF-

Tu) Brassicaceae EFR (Kunze et al., 2004)

Oomicetos

Transglutaminase Batata, salsa Desconhecido (Brunner et al., 2002)

β-glucanas Soja GBP (Fliegmann et al., 2004)

Fungos

Xilanase Fumo, tomate Eix1/Eix2 (Ron & Avni, 2004)

Invertase Tomate Desconhecido (Basse et al., 1992)

β-glucanas Arroz Desconhecido (Yamaguchi et al., 2000)

Quitina

Arroz CEBiP/CERK1 (Shinya et al., 2012)

Arabidopsis CERK1 (Miya et al., 2007)

Arabidopsis LYK4 (Wan et al., 2012)

Sinais da própria planta

PEPR1/2 Arabidopsis AtPep (Krol et al., 2010)

ATP extracelular Tomate LecRK-1.9 (Choi et al., 2014)

Herbívoros

Conjugado de ácidos graxos e

aminoácidos (FAC) Fumo Desconhecido (Halitschke et al., 2001)

Insetinas Feijão de corda Desconhecido (Schmelz et al., 2007)

A proteína PRR mais estudada é a FLS2 (flagelin sensing 2) que foi

inicialmente identificada em Arabidopsis e que possui a capacidade de reconhecer um

epítopo de 22 aminoácidos (flg22) na porção conservada N-terminal da proteína

flagelina que compõe o flagelo, estrutura envolvida com a locomoção em bactérias. A

8

flagelina representa um exemplo consistente com a definição de PAMP, ou seja, é

essencial para a motilidade bacteriana, apresenta-se conservada em um grande grupo

(bactérias que se locomovem por flagelo) e representa um fator de virulência

comprovado e necessário para a patogenicidade bacteriana (Ramos et al., 2004). O

epítopo flg22 é reconhecido pela maioria das espécies de plantas e o receptor FLS2

foi identificado em plantas como arroz, tomate e Nicotiana benthamiana, além de

Arabidopsis (Boller & Felix, 2009). Outros exemplos bem caracterizados de PRRs

incluem o EFR que reconhece o epítopo elf18 de EF-Tu em bactérias, o receptor

CERK1 que reconhece peptideoglicanas bacterianas, Xa21 que reconhece proteína

sulfatada AX21 em Xanthomonas, além do receptor CEBip que reconhece regiões de

quitina em fungos ou LEIX1/2 que reconhece xilanases em fungos (Dardick et al.,

2012).

A resposta de imunidade do tipo PTI se dá por ligação física entre o domínio

extracelular do receptor (PRR) com o epítopo do ligante (PAMP/MAMP), o que

ocasiona uma mudança na estrutura do receptor e concomitante ativação da cascata de

sinalização citoplasmática pelo domínio intracelular do receptor. A percepção

microbiana rapidamente ativa o influxo de íons de cálcio (Ca2+

) para o interior das

células, o que modifica o pH local e regula a sinalização inicial de eventos que

ocorrem dentro de segundos a minutos, como o efluxo de ânions, a produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS) e a expressão de genes envolvidos com a

biossíntese de peptídeos e compostos antimicrobianos. Estas respostas são

principalmente mediadas por proteínas quinases dependentes de cálcio (CDPKs) e co-

reguladas pela cascata de sinalização por proteínas quinases ativadas por mitógenos

(MAPKs), as quais podem ser posteriormente moduladas por calmodulina (CAM). O

aumento de Ca2+

também regula respostas tardias que podem ocorrer horas ou dias

após o contato com o patógeno, o que inclui a produção de ácido salicílico,

fitoalexinas e outros compostos de defesa pela regulação genica. A ativação de genes

de defesa também pode sofrer regulação por fatores de transcrição, como por exemplo,

aqueles pertencentes à família WRKY (Monaghan & Zipfel, 2012). O complexo de

sinalização descrito, principalmente regulado por Ca2+

, apresenta uma visão geral de

resposta PTI que contribui para a defesa das plantas contra bactérias, fungos e

oomicetos. Entretanto, outras respostas podem estar associadas, incluindo a produção

de etileno, o fechamento de estômatos ou a deposição de calose ou lignina na parede

celular e, além disso, em vários desses processos há a formação de moléculas que

9

potencialmente podem atuar como mensageiros secundários (SA, ROS, etileno, cálcio,

etc.) em outras vias metabólicas, o que torna a resposta ainda mais complexa (Zipfel

& Robatzek, 2010).

SUSCETIBILIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETS)

Até recentemente, muito pouco se sabia sobre a biologia dos efetores e

principalmente sobre as bases moleculares da interação planta-patógeno. O

conhecimento era limitado a estruturas de infecção especializadas, sintomatologia,

secreção de enzimas hidrolíticas e toxinas. Com o avanço de técnicas moleculares e

sequenciamento, muita informação tem sido gerada e a fitopatologia está avançando

no entendimento das estratégias de infecção dos patógenos e mecanismos de defesa

das plantas. Inicialmente, foram elucidadas as funções bioquímicas de algumas

moléculas efetoras de bactérias. Depois, o conceito de efetores foi extrapolado de

bactérias patogênicas para fungos, oomicetos e nematoides, que também tiveram a

função bioquímica de alguns de seus efetores elucidada e finalmente, com métodos

computacionais e bioinformática baseados em sequenciamento de genomas, tem sido

possível predizer candidatos a efetores em uma imensa gama de microrganismos.

Estas informações em conjunto levaram a comunidade científica a aceitar os efetores

como fatores essenciais para a compreensão dos processos em qualquer interação

planta-patógeno.

EFETORES

Estudos envolvendo bactérias Gram-negativas, com sistema de secreção tipo

III (T3SS), revelaram que estas bactérias secretam proteínas no interior das células

que desencadeiam reações de hipersensibilidade. Essas moléculas foram chamadas de

fatores de avirulência. No entanto, as mesmas proteínas cunhadas como fatores de

avirulência foram encontradas contribuindo para a virulência em relações de

suscetibilidade. Deste modo, havia um impasse no uso do termo avirulência, visto que

ele não era correto em todos os casos, demonstrando a necessidade de um termo

10

neutro. Nesse sentido, surgiu o termo efetor para resolver o impasse, o qual vem

sendo aceito e utilizado na fitopatologia.

Alguns autores ainda insistem em definir efetores como moléculas que

suprimem a defesa das plantas. Como já mencionado acima, essa definição não é

correta porque alguns efetores apresentam dualidade em sua função dependendo do

hospedeiro, ou seja, podem ser relacionados tanto com a patogenicidade quanto com a

ativação de resistência. Por muito tempo a definição mais aceita, proposta por

Kamoun (2009), compreendia: “Efetores são moléculas secretadas por um

microrganismo que alteram a estrutura/função do hospedeiro”. Esta definição perdeu

um pouco de espaço, visto que nem todos os efetores são secretados e nem sempre o

organismo alvo é um hospedeiro. Nesse sentido, a definição de efetores mais correta

é: “Efetores são moléculas liberadas ou associadas a um organismo que modificam a

fisiologia de outro organismo”.

Os efetores são divididos em apoplásticos e citoplasmáticos em função do

local de atuação. Os efetores secretados pelos patógenos durante a infecção podem se

acumular na superfície exposta da célula ou nos espaços intercelulares, sendo

classificados como efetores apoplásticos (Figura 2). Por sua vez, os efetores

intracelulares ou citoplasmáticos são os que podem se translocar através da membrana

celular e ter contato direto com compartimentos subcelulares ou organelas (Block et

al., 2008). A estrutura típica de um efetor citoplasmático está representada na Figura

3.

Os processos utilizados por bactérias fitopatogênicas para inserir seus efetores

no interior das células dos hospedeiros são mais conhecidos quando comparados aos

de oomicetos e fungos. Os tipos de secreção de proteínas em bactérias têm sido

bastante estudados ao longo do tempo. No entanto, pouco ainda se sabe sobre o

trafego de efetores para fungos e oomicetos. Sabe-se que alguns efetores apresentam

motivos especiais em sua cadeia que utilizam a própria maquinaria da planta para

adentrarem no interior da célula, porém estes processos ainda não estão totalmente

esclarecidos, sendo necessários novos métodos que permitam a detecção e a

visualização do tráfego destes efetores até a célula hospedeira (Petre & Kamoun,

2014).

Uma vez translocados no citoplasma da planta, os efetores podem trafegar

para diferentes compartimentos subcelulares, incluindo organelas e vários sub-

compartimentos da célula. Um grande número de efetores se acumula no núcleo da

11

planta, como os TAL de Xanthomonas, SAP11 de fitoplasma, e CRNs e Crinklers de

Phytophthora, que utilizam a importina para mediar a entrada no núcleo da célula

vegetal (Bai et al., 2009; Schornack et al., 2010; Vandenackerveken, 1996). O efetor

TAL de Xanthomonas atua diretamente no núcleo e ativa genes no hospedeiro

envolvidos em processos diversos, como os que definem o tamanho das células,

transporte de açúcares e processos epigenéticos (Chen et al., 2010; Souza et al., 2012).

Em Phytophthora, os efetores apoplásticos estão, geralmente, associados à

inibição enzimática (ex. hidrolases) (Damasceno et al., 2008; Tian et al., 2004, 2005,

2007), enquanto que o modo de ação dos efetores citoplasmáticos em diferentes

compartimentos sub-celulares ainda é obscura. Os efetores citoplasmáticos são

proteínas modulares que carregam peptídeos N-terminais seguidos por motivos

conservados como os RxLR (R: arginina; x: qualquer aminoácido; L: leucina; R:

arginina) (Birch et al. 2006, 2008; Kamoun, 2006, 2007, 2009; Morgan & Kamoun,

2007; Tyler et al., 2006; Win et al., 2007) (Figura 3).

O motivo RxLR viabiliza a entrada de proteínas que contem esse motivo no

interior da célula (Bhattacharjee et al., 2006; Dou et al., 2008; Grouffaud et al., 2008;

Whisson et al. 2007). Um dos efetores RxLR mais estudados é o AVR3a

de Phytophthora infestans. O AVR3a suprime a morte celular induzida pela elicitina

INF-1, também secretada por P. infestans. Em suma, INF-1 teria características de

um padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) que induziria a morte celular.

Em contrapartida, o AVR3a suprime a ação deste PAMP, contribuindo para a

virulência do patógeno (Bos et al., 2009).

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Figura 2. Esquema ilustrativo da suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS). Os

patógenos de plantas como fungos, bactérias, oomicetos, vírus e nematóides colocam

efetores no exterior da célula vegetal, os efetores apoplásticos (EA). Enquanto que os

efetores citoplasmáticos (EC) são liberados diretamente no interior da célula, se

ligando a diferentes proteínas dos hospedeiros (alvos dos efetores citoplasmáticos

(AEC). (Adaptado de Win et al., 2012b). Tanto os efetores apoplásticos quanto os

citoplasmáticos tem o potencial de suprimir respostas de defesa das plantas.

Figura 3. Estrutura típica de um efetor citoplasmático. Todos os efetores,

citoplasmáticos ou apoplásticos apresentam um peptídeo sinal na posição N-terminal

da molécula, condição obrigatória para todas as moléculas secretadas. Os efetores

citoplasmáticos apresentam ainda um motivo especial também na posição N-terminal.

Motivos comuns são os RxLR e CRN que estão relacionados a translocação destes

efetores para o interior da célula (estes motivos estão ausentes em efetores

apoplásticos). Na região C-terminal encontra-se o domínio do efetor que está

relacionado a sua atividade/função.

13

ALVOS DOS EFETORES

Algumas atividades típicas dos efetores na inibição da defesa ou inibição do

reconhecimento da infecção pela planta incluem (Göhre & Robatzek, 2008):

Inibição de enzimas (hidrolases) no apoplasto,

Inibição de ativação de PRRs,

Inibição de cascatas de sinalização mediadas por MAP-quinases,

Modificação do transcriptoma relacionado a respostas de defesa,

Reprogramação transcricional,

Degradação de componentes/proteínas relacionadas à defesa,

Interferência na secreção de proteínas e tráfego vesicular.

Secreção orquestrada de efetores

Os efetores precisam estar no local e no tempo certo para uma colonização de

sucesso por parte do microrganismo. Por exemplo, os fungos fitopatogênicos

Colletotrichum higginsianum e C. graminicola, infectando Arabidopsis thaliana e

milho, respectivamente, usam reguladores de transcrição para a síntese e secreção de

diferentes conjuntos de efetores e enzimas para as diferentes fases de infecção. A fase

biotrófica é aumentada por efetores e enzimas do metabolismo secundário,

considerando que na fase necrotrófica há a liberação de hidrolases e transportadores

(O’Connell et al., 2012). Em C. higginsianum, a regulação é ainda mais refinada,

sendo que no período anterior à entrada do patógeno são liberados efetores ChCEs,

visando preparar a entrada na célula hospedeira (Kleemann et al., 2012). No oomiceto

Phytophthora, vários efetores RxLR são induzidos no estádio de germinação do

esporo ou na fase inicial da infecção, e várias proteínas Nep1- indutoras de necrose

(NLPs), são expressas em estágios posteriores a infecção, sugerindo que as mesmas

contribuem para a fase necrotrófica (Qutob et al., 2002; Haas et al., 2009). Em P.

infestans, um efetor conhecido como SNE1 é expresso durante a fase biotrófica, para

suprimir a morte celular que se expressa durante a fase necrotrófica da infecção

(Kelley et al., 2010). Chegando ao local certo nas células hospedeiras, no momento

certo, os efetores podem interagir com proteínas do hospedeiro para exercerem as

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suas funções, fazendo com que a invasão e a colonização sejam bem sucedidas (Win

et al., 2012a).

IMUNIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETI)

A ETI é ativada após o reconhecimento por parte do hospedeiro de efetores

dos patógenos, sendo essas proteínas reconhecidas pelas proteínas intracelulares R

dos hospedeiros, as quais possuem domínios NB-LRR (nucleotide binding‑leucin rich

repeat) (Figura 4) (Win et al., 2012a). Esse reconhecimento pode ser através da

interação direta e altamente específica, entre as proteínas hospedeiro/patógeno de

acordo com a teoria gene a gene (Boller & Felix, 2009; Flor, 1971 ). Contudo, os

efetores podem ser reconhecidos de forma indireta, conhecida como teoria guarda

(Flor, 1971; Jones & Takemoto, 2004). Nesse reconhecimento indireto, as proteínas R

reconhecem efetores ligados a proteínas da planta chamadas “alvos de efetores de

patógenos”, representados na Figura 4 como alvo dos efetores citoplasmáticos (AEC).

A maior evidência da teoria guarda foi encontrada no sistema R/Avr entre

Arabidopsis thaliana e Pseudomonas syringae pv. tomato, onde RIN4 é modificada

pela Avr da bactéria e essa modificação ativa a proteína R (RPM1) resultando na

resistência da planta (Mackey et al., 2002).

15

Figura 4. Resposta da planta ao ataque de patógenos (bactérias, fungos e oomicetos)

mostrando a imunidade desencadeada por efetores (ETI). Os patógenos secretam os

efetores para dentro da planta hospedeira (efetores citoplasmáticos, EC) através do

sistema de secreção do tipo III (no caso das bactérias) ou por estruturas de infecção

especializadas chamadas de haustórios (no caso de fungos e oomicetos). Os efetores

trafegam por vários compartimentos, ligando-se, e manipulando diferentes proteínas

dos hospedeiros chamadas de alvo. Este quando está localizado no citoplasma do

hospedeiro é designado como alvo dos efetores citoplasmáticos (AEC). Em interações

incompatíveis, os receptores intracelulares (NB-LRR) induzem a ETI, após o

reconhecimento dos EC e/ou as interações com AEC, evitando assim a doença

(Adaptado de Win et al., 2012b).

A maioria dos genes R codifica para uma proteína que apresenta um domínio

central de ligação a nucleotídeos (NB), outro com regiões repetidas ricas em leucina

(LRR), mediando o reconhecimento de diversos efetores de todas as classes de

patógenos de plantas, e um terceiro domínio variável no N-terminal que pode ser TIR

(Toll/Interleucina-1) ou CC (Coiled-coil) (Elmore et al., 2011; Gururani et al., 2012)

(Figura 5).

Além das classes TIR e CC das proteínas R, existem mais seis que se

destacam. Dentre elas temos a eLRR que possui um domínio LRR extracelular ligado

a um domínio transmembrana (TrD) (Gururani et al., 2012) (Figura 5). A quarta

classe é a LRR quinase, a qual apresenta um domínio intracelular de quinases

serina/treonina citoplasmáticos, um domínio extracelular LRR e um domínio

transmembrana (TrD) (Afzal et al., 2008; Gururani et al., 2012) (Figura 5).

A quinta classe é representada pelas proteínas R que possuem um domínio

TrD, o qual está ligado à um domínio CC (Win et al., 2012b) (Figura 5). Genes R

contendo os domínios LRR, seguido pelo domínio TrD ligado ao domínio PEST

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(prolina-glicina-serina-treonina) para degradação proteica, além de pequenos motivos

de ECS (domínio de sinalização celular de endocitose) representam a sexta classe

(Gururani et al., 2012).

A sétima classe é representada pelas proteínas R que contém os domínios TIR-

NBS-LRR, além de ter na extensão C-terminal um domínio putativo de sinal de

localização nuclear (NLS) e um domínio WRKY, o qual possui uma região de 60

aminoácidos que é definida pela sequência conservada WRKYGQK na região N-

terminal, associada à um motivo zinc-finger (Thomma et al., 2011) (Figura 5).

E a última classe é representada pelos genes R enzimáticos, os quais não

possuem nenhum dos domínios LRR e NBS, como por exemplo, o gene Hm1 de

milho que fornece proteção contra o fungo patogênico Cochliobolus carbonum (Johal

& Briggs, 1992) (Figura 5).

Figura 5. Principais classes dos genes de resistência de plantas baseadas nos

domínios funcionais. NBS - sítio de ligação a nucleotídeos; LRR - regiões repetidas

ricas em leucina; TIR - Toll/Interleucina-1; CC - Coiled-coil; TrD - domínio

transmembrana; PEST - domínio de degradação proteica (prolina-glicina-serina-

treonina); ECS - domínio de sinalização celular de endocitose; NLS - sinal de

localização nuclear; WRKY e HM1 - uma redutase que inativa uma toxina (Adaptado

de Win et al., 2012b).

Diferentes patógenos, como bactérias, fungos, oomicetos e vírus, produzem

efetores para atacar diferentes plantas, que por sua vez, usam seus genes de resistência

para evitar o desenvolvimento da doença (Tabela 2).

17

Tabela 2. Interação dos efetores de diferentes patógenos com os genes R de diversos

hospedeiros (Adaptado de Win et al., 2012b).

Patógenos Hospedeiros Efetores gene R

BACTÉRIAS

Xanthomonas oryzae Oryza sativa Avr-Xa1 Xa1

Xanthomonas oryzae Oryza sativa Avr-Xa21 Xa21

P. syringae Arabidopsis thaliana AvrRpm1 RPM1

P. syringae A. thaliana AvrRpt2 RPS2

P. syringae A. thaliana AvrPphB RPS5

FUNGOS

Blumeria graminis Hordeum vulgare AvrMla Mla

Fusarium oxysporium

Lycopersicum

esculentum Avr1 I2

Melamspora lini Linum usitatissimum AyrL L

Magnoporthe grisea Oryza sativa Avr-Pita Pi-ta

Puccinia graminis f.sp.

tritici H. vulgare Avr-Rpg1 Rpg1

OOMICETOS

Bremia lactucae Lactuca sativa Avr3 Dm3

Perenospora parasitica A. thaliana

AvrB,

AvrRPP1A RPP1

Phytophthora infestans Solanum tuberosum Avr1 R1

P. infestans Solanum demissum Avr3a R3a

Phytophthora sojae Glycine max

Avr1a, Avr3a

and Avr3c,

Rps1a, Rps3a,

Rps3c

VÍRUS

Bean dwarf mosaic

virus Phaseolus vulgaris Bdm BV1 protein

Cucumber mosaic

virus A. thaliana

Vpg (viral

genomeelinked

protein)

At-eIF4E1

(cum1)

Potato virus X S. tuberosum Coat protein Rx1, Rx2

Soybean mosaic virus Glycine max

Hc-Pro and

P3 cistron Rsv1

Turnip mosaic virus A. thaliana VPg At-eIF(iso)4E

Quando a ETI é ativada, a planta desencadeia uma rápida morte celular no

sítio de infecção, conhecida como reação de hipersensibilidade (HR, hypersensitive

response) (Win et al., 2012a). Associada a HR, outras respostas de defesa são

18

ativadas, como alterações nos níveis de cálcio no citoplasma, produção de espécies

reativas de oxigênio e cascata de sinalização via quinases. A amplificação desses

sinais se dá de modo similar a PTI, por mensageiros secundários como o ácido

salicílico, ácido jasmônico e o etileno resultando na ativação de fatores de transcrição

de genes de defesa e, subsequentemente, na resistência sistêmica adquirida ou

resistência sistêmica induzida (Tsuda & Katagiri, 2010).

Quando a ETI ocorre, a resposta imune das plantas é mais prolongada e possui

uma sinalização dominante em relação à PTI. Tsuda & Katagiri (2010) propuseram

que a ETI possui uma rede de “setores interligados”, ou seja, quando o setor primário,

por exemplo, o da via do SA é comprometido por efetores de patógenos, algum outro

setor, como o da via do JA, é ativado garantindo assim a resistência da planta ao

ataque. Contudo, esse tipo de resistência pode ser rapidamente superado pelo

patógeno através da aquisição de novos efetores ou pela perda / diversificação do sítio

de reconhecimento do gene R para evitar a ETI (Jones & Dangl, 2006). Entretanto, a

seleção natural resulta em novos alelos dos NB-LRR, que por sua vez, podem

reconhecer um desse novos efetores resultando novamente em ETI (Jones & Dangl,

2006).

COMO PROCURAR EFETORES NO GENOMA DO PATÓGENO?

Secretadas na interface intercelular entre o patógeno e a planta ou translocadas

para o citoplasma das células hospedeiras, as moléculas efetoras fazem parte de um

complexo arsenal molecular que o patógeno utiliza para colonizar os tecidos da planta

hospedeira (Stergiopoulos & Wit, 2009). O fato dessas proteínas serem

obrigatoriamente secretadas do patógeno para o hospedeiro tornou-se a principal

característica na sua busca, primeiramente in vivo, analisando-se o secretoma destes

microrganismos, e mais tarde in silico, na mineração de dados em busca destas

sequencias nos genomas dos patógenos.

Os primeiros experimentos realizados pelos fitopatologistas tinham como

objetivo conhecer um pouco mais sobre o secretoma dos patógenos e a natureza

potencial das proteínas efetoras. Para tanto, a primeira estratégia utilizada foi a

clonagem molecular. O primeiro gene Avr clonado foi da bactéria P. syringae pv.

glycinea em 1984 (Staskawicz et al., 1984); mais tarde, em 1991, foi a vez do

19

primeiro gene Avr de fungo, Cladosporium fulvum (Kan et al., 1991), e em 2004 o

gene Avr do oomiceto P. infestans (Tian et al., 2004). Porém, a necessidade de se

conhecer melhor o sistema de secreção destas proteínas fez com que técnicas de

imunolocalização e utilização de transformantes fossem empregadas nestes estudos,

permitindo visualizar a complexidade dos secretomas de fitopatógenos e seus

hospedeiros, catalogar estes secretomas e fornecer novos dados para se elucidar os

processos apoplásticos e a natureza do conjunto de efetores secretados.

Simultaneamente, com a evolução das tecnologias visando obter maior

número de dados, algumas abordagens para a caracterização de efetores em larga

escala foram iniciadas. Uma dessas abordagens é o sistema de armadilha de sinal de

secreção em levedura (YST secretion trap library), onde é feita uma biblioteca

contendo a seqüência codante completa do gene para expressão e outra onde as

sequencias que codificam o primeiro e o segundo aminoácido da proteína são

retiradas via oligonucleotídeos iniciadores (primers), por reação em cadeia da

polimerase (polymerase chain reaction - PCR), tornando esta proteína inativa quando

subclonada em vetor de expressão de proteínas e expressa em leveduras. Para o

oomiceto P. infestans foram identificados 23 genes que codificam proteínas

secretadas, e todas estas proteínas estavam localizadas nas folhas do hospedeiro e não

no micélio cultivado in vitro (Lee et al., 2006). Para o fungo Uromyces fabae foram

encontrados 62 genes que codificam proteínas secretadas pelo haustório e 42 genes

que codificam proteínas secretadas em esporos germinados, das quais 28

apresentaram similaridade com proteínas encontradas somente na ordem Uredinales,

indicando um possível papel na virulência e especificidade de hospedeiro (Link &

Voegele, 2008).

Associando esta técnica ao sequenciamento, foi atribuída à caracterização de

efetores em larga escala uma nova abordagem, denominada de clonagem de

fragmentos genômicos diretamente do sistema de secreção, onde o DNA genômico do

patógeno é fragmentado aleatoriamente em fragmentos de tamanho desejado,

clonados em vetor e sequenciados a fim de se identificar clones de DNA genômico

únicos. Para a estirpe haploide selvagem Um521 de U. maydis, fragmentos do

genoma com ~300pb foram sequenciados e foi possível identificar 52 clones únicos.

A fim de se testar o papel destes genes na infecção, foi utilizada a técnica de mutantes

nulos (knock-outs) para diferentes genes. O knock-out duplo para genes envolvidos na

patogenicidade não afetaram o crescimento, o acasalamento, a formação de hifas

20

aéreas e a hidrofobicidade de superfície, no entanto, o desenvolvimento em plantas

logo após a penetração foi afetado, levando a perda da patogenicidade (Klein et al.,

1996).

Com o surgimento da técnica de microarranjo (microarray), a avaliação da

expressão global de genes diferencialmente expressos em plantas infectadas com o

patógeno, permitiu a identificação de genes que codificam proteínas secretadas

durante o crescimento e infecção pelo patógeno (Mosquera et al., 2009) e a

descoberta de novos locus associados a efetores. Em P. infestans foi possível

descrever um novo locus de avirulência utilizando esta técnica (Qutob et al., 2006), e

em Pectobacterium atrosepticum foram caracterizadas proteínas associadas ao

sistema de secreção tipo IV (Mattinen et al., 2008) e proteínas do quorum sensing,

sistema que controla a produção de enzimas de degradação de parede celular e outros

fatores de virulência deste patógeno, principalmente aos fatores ligados à sua

dispersão (Liu et al., 2008). Esta abordagem permite avaliar proteínas efetoras

envolvidas na penetração do patógeno na célula hospedeira (Doehlemann et al., 2008),

na inibição da resposta imune inata do hospedeiro (Fontana et al., 2011), predição de

novos efetores cuja anotação dos domínios não está associada à patogenicidade

(Saunders et al., 2012) e a identificação de proteínas efetoras associadas ao

desenvolvimento simbiôntico com o hospedeiro (Plett et al., 2014). Apesar da técnica

de microarray ser considerada obsoleta em algumas áreas da biologia molecular, para

a descoberta de novos efetores e elucidação da forma de atuação na célula hospedeira,

esta técnica se mostra eficiente, sendo ainda bastante utilizada.

Entretanto, o uso do sequenciamento na obtenção do genoma completo dos

patógenos, primeiro pela metodologia de Sanger e depois pelo sequenciamento de

nova geração (next generation sequence), permitiram o aumento exponencial da

quantidade de dados gerados e a possibilidade de se minerar novos genes candidatos a

efetores em diversas espécies de patógenos. As plataformas de sequenciamento mais

usadas atualmente para estes estudos são: 454 pirosequenciamento (454 Life Science

– Roche Diagnostic) baseado na detecção do pirofosfato liberado na incorporação do

nucleotídeo na cadeia de DNA sintetizada; o sequenciamento Illumina (Illumina

sequencing – Solexa) baseado na detecção dos nucleotídeos previamente marcados

com um fluorófo, durante a síntese da cadeia. Ambos geram sequencias curtas,

entretanto, os fragmentos gerados pelo pirosequenciamento são um pouco maiores do

que os gerados pelo sequenciamento Illumina, sendo 700 pb contra 50 a 300 pb,

21

conferindo uma maior acurácia dos dados (99,9% contra 98% obtidos no

sequenciamento Illumina). O pirosequenciamento gera um menor número de dados,

cerca de um milhão de fragmentos, enquanto o Illumina gera mais de 3 milhões de

fragmentos. Isto torna o sequenciamento Illumina mais demorado, de um a 10 dias,

dependendo do tamanho do fragmento gerado, sendo que em contrapartida, o

pirosequenciamento pode ser realizado em 24 horas. Em termos de custo, o

sequenciamento Illumina é mais vantajoso: US$ 0,05 a 0,15 por milhão de bases,

enquanto que, no pirosequenciamento, o custo é de US$ 10 (Liu et al., 2008; Quail et

al., 2012). Outro aspecto vantajoso de ambas as plataformas é a aplicação não só no

sequenciamento de genomas, mas também no sequenciamento de transcriptoma do

organismo, metodologia esta denominada RNAseq.

O emprego desta técnica, tanto na genômica como na transcriptômica, tem

gerado muitos trabalhos com fitopatógenos e a sua interação com o hospedeiro,

visando principalmente, a busca por moléculas efetoras e a resposta adaptativa da

planta a estas moléculas, evidenciando a coevolução do sistema. Como exemplos

desta abordagem, podemos citar: a descoberta de um gene de virulência em

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi para a indução de tumor em plantas lenhosas

(Rodríguez-Palenzuela et al., 2010); a microevolução e relação filogenética de

efetores de P. syringae na adaptação ao hospedeiro (Cai et al., 2011); análise de

polimorfismo das proteínas candidatas a efetoras secretadas pelo haustório de

Puccinia striiformis f. sp. tritici (Cantu et al., 2013); a identificação de genes

candidatos a efetores no transcriptoma do nematoide da galha (Meloidogyne

graminicola) em arroz (Haegeman et al., 2013); a busca por genes efetores expressos

na interação com o hospedeiro, no transcriptoma de Melampsora lini (Nemri et al.,

2014); a comparação entre genomas da mesma espécie a qual pertence o patógeno,

avaliando a conservação das proteínas efetoras ao longo do tempo evolutivo (Qi et al.,

2011); a identificação de efetores de domínio caracterizado, como os RXLR, no

genoma de patógenos de grande importância na agricultura (Thakur et al., 2013).

Para que estas diversas abordagens tivessem sucesso, simultaneamente ao

aparecimento do sequenciamento de nova geração, diversas ferramentas de

bioinformática foram desenvolvidas, visando analisar o secretoma dos patógenos

permitindo a predição de proteínas efetoras e a mineração destas a partir de domínios

caracterizados, como os RXLR. As ferramentas desenvolvidas para a predição de

proteínas efetoras são baseadas nas características do peptídeo sinal (secretion signal

22

target) das proteínas pertencentes aos cinco tipos de sistema de secreção descritos

para patógenos (Preston et al., 2005). O peptídeo sinal é uma pequena sequência de

aminoácidos (entre 15 e 60), localizada na porção N-terminal da proteína, com a

função de marcar as proteínas que serão exportadas pelo aparato de secreção, seja

através da interação direta com os componentes citoplasmáticos ou periplasmáticos da

maquinaria de secreção, ou através de um intermediário, como as chaperonas.

O peptídeo sinal Sec/SRP se caracteriza por compartilhar pequenas sequencias

que apresentam características em comum, como uma sequência de carga positiva na

porção N-terminal, uma sequência de aminoácidos hidrofóbicos de 7 a 15

aminoácidos e uma sequência polar que contém o sítio de clivagem “AXA”. Similares

a este, os peptídeos sinais TAT-específicos são um pouco mais longos, apresentando

de 26 a 52 aminoácidos, devido a presença de uma região N-terminal a mais. Estes

peptídeos apresentam o motivo S(T)-RRxhhh, onde h é um resíduo hidrofóbico, e são

menos hidrofóbicos do que seus homólogos Sec, apresentando uma alta carga

negativa na porção N-terminal e positiva na porção C-terminal. A dificuldade de se

caracterizar peptídeos sinais vinculados ao sistema de secreção tipo III é superada

pela estrutura conservada destas proteínas efetoras em múltiplos gêneros de

microrganismos patógenos de plantas. Estudos envolvendo mutação por deleção

mostraram que a informação essencial para a secreção destas proteínas está localizada

no 10° e 15° primeiros aminoácidos (Preston et al., 2005). Muitas das proteínas de

secreção do tipo III requerem uma chaperona para sua secreção, que, a exemplo da

proteína HopPtoV necessita da ligação da chaperona ShcV na porção N-terminal de

sua sequencia, entre os aminoácidos 76 e 125 (Wehling et al., 2004). A fim de se

identificar padrões associados com estas proteínas, observou-se um viés nos primeiros

50 resíduos de aminoácidos, com uma frequência maior de serina e prolina nas

primeiras cinco posições, além de um aminoácido hidrofóbico na posição 3 ou 4 e a

falta nas primeiras 12 posições (Alfano & Collmer, 2004; Guttman et al., 2002;

Petnicki-Ocwieja et al., 2002), o que possibilitou estabelecer parâmetros para o

treinamento de máquina (learning machine) para a seleção destas proteínas, a partir

de um banco de dados.

Para os sistemas de secreção tipo I, II e V, as tentativas de se criar uma

ferramenta de bioinformática para predição destas proteínas não têm sido bem

sucedidas, pois, a exemplo do sistema de secreção tipo II, o sinal para que a proteína

seja secretada depende da estrutura secundária ou terciária da mesma. Alguns estudos

23

indicam que cada proteína se dobrou e apresentou o motivo de secreção à sua maneira,

o que resultou em um alto grau de especificidade com a exoenzima que irá atuar neste

motivo, sendo que até comparações estruturais tridimensionais de proteínas secretadas

pelo mesmo sistema não revelam um padrão de secreção unificado (Bouley et al.,

2001; Chapon et al., 2001). Além disto, existem outros fatores a serem considerados,

como a proximidade dos genes que codificam para a maquinaria de transporte,

homologia com proteínas ou domínios identificados previamente, e a presença de

sequência promotora a montante do gene (do inglês, upstream).

Pouco tempo atrás, o sistema de secreção tipo IV também se enquadrava neste

panorama. Entretanto, atualmente, foram desenvolvidas algumas ferramentas capazes

de predizer proteínas do sistema de secreção tipo IV, um sistema homólogo aos

sistemas de conjugação e ao sistema VirB de A. tumefaciens, facilitando a

translocação de DNA, e secretando tanto ácidos nucleicos quanto proteínas. A

disponibilidade destas ferramentas só é possível graças ao sequenciamento de

diversos genomas de patógenos, pois são baseadas nas triagens feita nestes genomas

associados a natureza bioquímica destas moléculas. Basicamente, o learning machine

é feito baseado nas seguintes características: busca pelo motivo RRRSNTTTTY em

300 pb, denominado de novo motif search; homologia com moléculas efetoras

conhecidas; presença de domínios eucarióticos (no total de 58 domínios); proteínas

com domínio de função desconhecida (DUF); busca por peptídeo sinal de localização

nuclear (NLS, do inglês, nuclear localization signal); probabilidade com P>0,095 da

proteína possuir um sinal de localização mitocondrial; presença de um resíduo de

cisteína seguido de dois resíduos alifáticos e um quarto aminoácido (CaaX);

probabilidade de formação de estrutura em espiral nos 28 resíduos da proteína;

basicidade C-terminal; hidrofobicidade da porção C-terminal e global; presença do

bloco EEXXE nos 30 aminoácidos da porção C-terminal (Meyer et al., 2013).

Na Tabela 3 estão sumarizadas algumas destas ferramentas disponíveis, tanto

para análises via internet, quanto para a instalação na máquina. É possível observar o

tipo de algoritmo utilizado para o desenvolvimento destas ferramentas: para o sistema

de secreção tipo III, com características mais bem definidas, são utilizados

principalmente o Modelo oculto de Markov (Hidden Markov Model – HMM),

Máquina de vetores de suporte (Support Vector Machine) e Redes neurais (do inglês,

Neural Networks); para o sistema de secreção tipo IV, mais complexo, utiliza-se uma

forma modular escrita em Perl (linguagem de programação estável e multiplataforma).

24

Para facilitar ainda mais o uso de ferramentas de bioinformática e possibilitar

ao usuário agrupar vários softwares em uma única interface, surgiu o software Galaxy,

que é executado na plataforma Linux/Unix e fornece ao usuário uma interface

baseada em navegador (Cock et al., 2013). Para a predição de sistemas de secreção

em proteínas há um repositório (Whisson et al., 2007), que contém as ferramentas:

SignalP para a predição de peptídeo sinal (Petersen et al., 2011); TMHMM para a

predição de domínios transmembrana (Krogh et al., 2001); PSORTb para proteínas de

arqueobactérias (Yu et al., 2010); WoLF PSORT para proteínas fúngicas, animais e

vegetais (Horton et al., 2007); Promoter para promotores eucarióticos para polimerase

II; Oomycete RXLR motifs para predição de motivos RXLR (WHISSON et al., 2007;

WIN et al., 2007). O usuário entra com o arquivo fasta na página do Galaxy e o

resultado é mostrado na mesma interface, com possibilidade de download dos dados.

25

Tabela 3. Ferramentas de bioinformática desenvolvidas para predição de peptídeos

sinais (secreção) na porção N-terminal das proteínas (adaptado de Preston et al.,

2005)

Ferramenta Referência Tipo de Algoritmo Sistema de

Secreção

Caminho

CELLO v.2.5 (Yu & Lin,

2004)

Máquina de vetores de

suporte

Tipo III http://cello.life.nctu.edu.tw/

Phobius (Käll et al.,

2007)

Modelo oculto de

Markov

Tipo III http://phobius.binf.ku.dk/

PSORT-b

v.3.0

(Yu et al.,

2010)

Modelo oculto de

Markov e

Máquina de vetores de

suporte

Tipo III http://psort.org/psortb/inde

x.html

SigCleave (Heijne,

1986)

Matriz de contagem

(Scoring matrix)

Tipo III http://emboss.sourceforge.n

et/

Parte do pacote de

programas EMBOSS

SignalP4.1 (Petersen et

al., 2011)

Redes neurais e

Modelo oculto de

Markov

Tipo III http://www.cbs.dtu.dk/servi

ces/SignalP/

SPEPlip (Fariselli et

al., 2003)

Redes neurais Tipo III http://gpcr.biocomp.unibo.i

t/predictors/

requer autenticação para o

uso

SubLoc 1.0 (Guo et al.,

2004)

Máquina de vetores de

suporte

Tipo III http://www.bioinfo.tsinghu

a.edu.cn/~guotao/predict.ht

ml

Effective (Jehl et al.,

2011)

Banco de dados. Une

anotação motivos de

diversos genomas pelo

Pfam e SignalP para

predição de sinal de

secreção

Tipo III http://effectors.org/

Galaxy (Cock et al.,

2013)

Interface baseada em

navegador. Usa

repositórios com

algumas ferramentas de

predição de proteínas

secretadas

Tipo III e

IV

https://usegalaxy.org/

S4TE (Meyer et

al., 2013)

Perl Tipo IV http://sate.cirad.fr/

T4SE (Wang et al.,

2014)

Máquina de vetores de

suporte

Matriz de contagem

(Scoring matrix)

Tipo IV http://biocomputer.bio.cuhk

.edu.hk/softwares/T4SEpre/

T4EffPred (Zou et al.,

2013)

Máquina de vetores de

suporte

Matriz de contagem

(Scoring matrix)

Tipo IV http://bioinfo.tmmu.edu.cn/

T4EffPred/prediction.html

26

OS EFETORES NA AGRICULTURA

Desde os primórdios da agricultura, patógenos tem causado devastadoras

epidemias envolvendo plantas, as quais tem afetado a humanidade (Agrios, 2004). A

seleção de plantas resistentes a doenças tem sido prática comum no melhoramento

vegetal. Para isso, por um longo período, o que foi feito em quase todas as culturas foi

a introdução de genes de resistência a doenças (R) em novas variedades. Hoje, sabe-se

que os genes R estão presentes em clusters multigênicos e podem ocorrer

naturalmente como verdadeiros alelos através de variantes da genética original (Dangl

et al., 2013). A ativação da função de cada uma das proteínas R é feita pelo produto

dos genes efetores de virulência de um patógeno específico (Flor, 1971). Como

mencionado anteriormente, vários efetores podem ser expressos por um único

patógeno e a diversidade de efetores em uma população de qualquer espécie

patogênica pode ser muito grande (Baltrus et al., 2011; Raffaele et al., 2010).

No campo, a utilização da maioria dos alelos do gene R pode ser de curta

duração, isto porque a sua implantação em monocultura foi selecionada para variantes

do patógeno, em que o alelo correspondente do efetor, sofreu mutação ou se perdeu.

Efetores são fatores de virulência, mas cada um contribuindo parcialmente para a

virulência final. Efetores independentes podem atuar de forma redundante, podendo

alterar uma mesma via de sinalização do hospedeiro. Portanto, os genes efetores

podem ser perdidos sem causar impacto significativo na virulência do patógeno.

Exceções a este princípio são os “efetores fundamentais”, definidos operacionalmente

por sua ampla distribuição na população de um determinado patógeno e sua

contribuição para a virulência do mesmo (Dangl et al., 2013). As bases genômicas são

utilizadas para se identificar efetores fundamentais e defini-los funcionalmente como

novos alelos R e suas atividades são usadas como estratégias promissoras para a

pesquisa e a obtenção de plantas resistentes a doenças.

Em 1986 demonstrou-se o sucesso da construção de uma planta transgênica

resistente à doença, a qual apresentava expressão constitutiva de uma sequência

gênica da proteína da capa viral que conferiu resistência ao vírus através de pequenos

RNAs. Hoje, este mecanismo é conhecido e amplamente aplicável para a inibição da

27

replicação viral (Lindbo & Dougherty, 1992). A Tabela 4 mostra um exemplo de

híbridos de abóbora que adquiriram resistência multiviral através da combinação de

genes da capa proteica de três tipos diferentes de vírus. Em 1994, uma estratégia

semelhante foi implantada para se controlar o vírus da mancha anelar do mamoeiro,

que em testes de campo demonstrou excelente eficácia e frutos de alta qualidade

(Tabela 4), sendo os frutos aprovados para venda no Havaí, Canadá e Japão. Desde a

aprovação e comercialização dessas duas culturas, nenhuma nova cultura modificada

para resistência a doença chegou ao mercado. A Tabela 4 ainda mostra algumas

pesquisas em outras culturas que apresentaram sucesso e com potencial para redução

de perdas de produção e uso de insumos químicos associados à doença.

Outra estratégia para a obtenção de plantas com resistência durável é o uso de

efetores alvos. Para isso, mesmo nos genomas de plantas mais complexas, o uso da

genética e da genômica é uma realidade, a qual facilita o isolamento de gene R

(Periyannan et al., 2013; Saintenac et al., 2013). Com as tecnologias rápidas e de

baixo custo de sequenciamento de DNA, um novo patógeno pode ser isolado e seu

genoma gerar informações com impactos sobre as estratégias de melhoramento para

um controle durável de doenças em plantas (Vleeshouwers et al., 2011). Agora, é

possível definir os genomas de patógenos isolados de plantas infectadas e também de

maneira rápida e eficiente definir o complemento do efetor. Usando ensaios de co-

expressão transiente seguido por melhoramento de marcador assistido ou

desenvolvimento de transgênico, é possível definir os efetores fundamentais que

facilitam a identificação de genes R ativados pelos seus efetores correspondentes de

germoplasma selvagem. Esses novos genes R podem ser validados pelo método de

edição de genoma que usa efetor ativador de transcrição de nucleases (TALEN)

(Schornack et al., 2013) e pela tecnologia de repetições de agrupados de palíndromo

curto intervalados regularmente (CRISPR) (Gaj et al., 2014; Jinek et al., 2013).

É de grande importância se observar que a função de qualquer gene R apenas

será durável se o efetor que o ativa estiver presente na estirpe patogênica cuja

virulência está se tentando controlar. Como por exemplo, temos o controle da

requeima da batata, onde o conhecimento do conteúdo de efetores em locais do

patógeno isolado pode auxiliar na implantação do gene R ou tratamento químico para

o controle desta doença (Vleeshouwers et al., 2011).

O emprego de receptores de sistema imune também é uma estratégia usada na

agricultura, existindo duas classes desses receptores, podendo-se seguir duas

28

estratégias principais. A primeira é transferir PRRs que detectem produtos

microbianos comuns em espécies que não as tenham. Isto é, efetuar a identificação

funcional das PRRs e promover a transferência para uma espécie receptora que não

tenha um receptor ortólogo e que poderia fornecer um caminho geral para exemplos

adicionais de repertórios ampliados de PRRs (Dangl et al., 2013). Por exemplo, o

receptor PRR EF-Tu (EFR) reconhece o fator de tradução de alongamento EF-tu

bacteriano, sendo que a implantação do EFR em Nicotiana benthamiana ou Solanum

lycopersicum (tomate), que não pode reconhecer o EF-Tu, conferiu resistência a uma

ampla gama de patógenos bacterianos (Lacombe et al., 2010). A segunda estratégia é

conhecida como estratégia de empilhamento, a qual explora respostas imunes em

contextos em que vários genes NLR são implantados simultaneamente. As cultivares

geradas por qualquer tipo de melhoramento molecular de DNA assistido ou por

transferência gênica devem exibir resistência mais durável a doenças, visto que a

evasão do patógeno exigirá mutações em múltiplos genes efetores. O acesso a uma

enorme diversidade genética é permitido devido aos avanços em sequenciamento de

DNA das principais culturas e seus parentais para uma grande quantidade de genes

NLR funcionalmente dirigidos contra diferentes efetores fundamentais (Dangl et al.,

2013). A descoberta do gene efetor avrBs2 da bactéria Xanthomonas perforans,

agente causal da doença da pinta bacteriana do pimentão e do tomate, possibilitou a

procura de um gene R potencialmente durável. Este gene é encontrado na maioria das

espécies de Xanthomonas que causam doença e é necessário para o patógeno

(Kearney & Staskawicz, 1990). Plantas de tomate foram transformadas com o gene

Bs2, que é um gene NLR isolado de uma pimenta selvagem (Capsicuum chacoense)

e este inibiu o crescimento de estirpes do patógeno que foram transformadas com o

gene avrBs2. Ensaios de campo foram realizados com essas plantas transgênicas que

expressam Bs2 de tomate, sendo que essas plantas demonstraram alta resistência para

X. perforans (Horvath et al., 2012), sem o uso de produtos químicos bactericidas.

Outra classe de genes relacionados à resistência de plantas a doença e que tem

evoluído para agregar funções de virulência, criando armadilha para impedir a

proliferação do patógeno, é chamada de executores e estes são contrastantes aos PRRs

e NLRs. Como por exemplo, em Xanthomonas e Ralstonia foram identificados

efetores de ativação de transcrição (TAL), os quais são proteínas secretadas no

interior das células da planta que se ligam no DNA e ativam a expressão de genes de

acolhimento para melhorar a virulência do patógeno (Schornack et al., 2013). A

29

expressão de um gene executor só ocorre pela indução de um efetor TAL específico e

eles não são expressos na ausência de infecção. Transformações utilizando-se genes

executores foram demonstradas com sucesso em plantas de pimenta (Römer et al.,

2009) e arroz (Hummel et al., 2012).

Finalmente, esses foram alguns exemplos de aplicação dos efetores como

ferramenta para desenvolver novas variedades de plantas resistentes a patógenos.

Muitos são os desafios e a área a ser explorada ainda é grande, porém as perspectivas

de melhora dessas estratégias avançam significativamente em função dos estudos

moleculares minuciosos e continuo do sistema imune das plantas cada vez mais

rápidos e com tecnologias de sequenciamento de genomas cada vez mais baratas.

30

Tabela 4. Exemplos de publicações relacionadas a culturas transformadas para resistência à doenças e situação atual das plantas.

Ano de publicação Cultura Resistência a Doença Mecanismos Estado de desenvolvimento

2012 Tomate Pinta bacteriana Gene R da pimenta 8 anos de ensaios em campo

2012 Arroz Crestamento bacteriano e risca

bacteriana

Transformada com gene E Laboratório

2012 Trigo Oídio Gene R do trigo superexpresso 2 anos de ensaio em campo até

o momento da publicação

2011 Batata Vírus Y da Batata Resistência derivada de

patógeno

1 ano de ensaio em campo até o

momento da publicação

2010 Tomate Resistência multibacteriana PRR de Arabidopsis Escala de Laboratório

2010 Banana Murcha por Xanthomonas Gene raro de pimenta 2 anos em ensaio de campo

2010 Laranja doce Resistência / tolerância à

Xanthomonas axonopodis pv. citri

Xa21 Casa-de-vegetação

2009 Batata Requeima Genes R de parentais selvagens 3 anos em ensaio de campo

2009 Batata Requeima Genes R de parental selvagem 2 anos de ensaio em campo até

o momento da publicação

2008 Batata Requeima Genes R de parental selvagem 2 anos de ensaio em campo até

o momento da publicação

2008 Ameixa Varíola da ameixa Resistência derivada de

patógeno

Regulamentação aprovada, sem

vendas comerciais

2005 Arroz Risca bacteriana Gene R do milho Laboratório

2002 Cevada Ferrugem da haste Gene RLK da cultivar de

cevada resistente

Laboratório

2001 Laranja doce Resistência / tolerância a

Phytophthora citrophthora

PR-5 Casa-de-vegetação

1997 Mamão Vírus da mancha anelar Resistência derivada de

patógeno

Aprovada e vendida

comercialmente desde 1998;

vendido no Japão desde 2012

1995 Abóbora Mosaico devido a três vírus Resistência derivada de

patógeno

Aprovada e comercialmente

vendida desde 1994.

1993 Batata Vírus X da batata Enzima induzida por interferon

de Mammalian

3 anos de ensaio em campo até

o momento da publicação

Fonte: Dangl et al. (2013); Fagoaga et al. (2001); Mendes et al. (2010).

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