Elizabeth dos Reis Mazoni Andrade

Orientadora: Dra. Mônica Bucciarelli Rodriguez

Belo HorizonteDepartamento de Biologia GeralInstituto de Ciências Biológicas

2002

PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA PARA TRIAGEM DE PROMOTORES UTILIZANDO GENES REPÓRTERES

DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EM Saccharomyces cerevisiae

LEVEDURAS

Sequenciamento completo - 1996

Investigação da Expressão Gênica

Métodos para Análise da Expressão Gênica

Microarranjos de DNA Exposição diferenciada

Análise Seriada da Expressão Gênica

Genes Repórteres

Promotores transcritos por RNA polimerase II:

Estrutura de promotores

• Elementos básicos: PIC (TATA box), Inr, DPE

• Elementos regulatórios: UAS, URS, poly(dA-dT)

HSFHSFHSFHSF POL II

HSP82

TATAAAHSE1HSE2HSE3

TFIIF TBP

TFIIATFIIB

TFIIE

TAFs

PROMOTORES

Fusão transcricional

Gene RepórterPromotor

FUSÃO GÊNICA

Fusão traducional

Gene RepórterPromotor

Met

GENES REPÓRTERESBeta-galactosidase

LacZ

Escherichia coli

Aequorea victoria

GFP

EGFP

Ser-65 THr

Phe-64 Leu

yEGFPOtimização de códons

Discosoma sp.

DsRed

tTAtransativator

7 Tet0 box

lacZ

TRP1

Apr

pCM17310683 bp

tet07 CYC TATA lacZ

tetR VP16ad

SISTEMA REGULADO POR TETRACICLINA

Promotor tetO-CYC1/tetR-VP16/lacZ

tetR VP16ad

tet07 CYC TATA lacZ

tetRVP16ad

SISTEMA SEM TETRACICLINA

tetR VP16ad

tet07 CYC TATA lacZ

Tetraciclina

SISTEMA COM TETRACICLINA

Sistema de triagem de promotores em Saccharomyces cerevisiae

Vetor para a biblioteca

Avaliação da meia vida de genes repórteres

Sistema regulado por tetraciclina

Caracterização dos Genes Repórteres

Determinação da meia vida da expressão de lacZ

0

40

80

120

160

200

240

280

320

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Tempo (horas)

Uni

dade

s de

bet

a-ga

lact

osid

ase

sem tetrac.10 ug/ml100 ug/ml

Fase exponencial de crescimento

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tempo (horas)

Uni

dade

s de

bet

a-ga

lact

osid

ase sem tetrac.

10 ug/ml

100 ug/ml Fase estacionária de crescimento

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3 4 5

Tempo (horas)

Unid

ad

es d

e B

eta

-ga

lacto

sid

ase

sem tratamento

adição de cicloheximida

adição de tetraciclina

adição de cicl. + tet.

Fase exponencial de crescimento

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10

Tempo (horas)

Unid

ad

es d

e B

eta

-ga

lacto

sid

ase

sem tratamento

adição de cicloheximida

adição de tetraciclina

adição de cicl. + tet.

Fase estacionária de crescimento

Avaliação do efeito do bloqueio da tradução sobre

a atividade proteolítica

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4

Tempo (horas)

Ativ

idad

e pr

oteo

lític

a (%

)

sem tratamento

adição de tetraciclina

adição de cicloheximida

Adição de ciclo. + tet.

Fase exponencial de crescimento

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tempo (horas)

Ativ

idad

e pr

oteo

lític

a (%

)

sem tratamento

adição de tetraciclina

adição de cicloheximida

Adição de ciclo. + tet.Fase estacionária de crescimento

Avaliação da meia vida da expressão de proteínas

fluorescentes

Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes

DsRed

pCM173-DsRed

EGFP

pCM173-EGFP

yEGFP

pCM173-yEGFP

y

DsRed

EGFP

yEGFP

0%

2%4%

6%8%

10%12%

% d

e c

élu

las

fluo

resc

ent

es

0 2 4 6,5 12 24 48

Tempo (horas)

IH/pCM173

IH/pCM173-EGFP

IH/pCM173-yEGFP

IH/pCM173-DsRed

Número de células fluorescentes de acordo com a fase de crescimento da levedura

Avaliação da expressão de lacZ utilizando MUG como

substrato

0%5%

10%15%20%25%

% d

e cé

lula

s flu

ores

cent

es

1Fase de crescimento da

levedura

fase logatítmica

fase estacionária

Fase estacionária Fase exponencial

Aspectos da utilização de genes de proteínas fluorescentes como repórteres para a triagem

de promotores

ESTABILIDADE

MATURAÇÃO

Visualização da produção de beta-galactosidase de

acordo com o tempo

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

0 12 24 36 48 60 72

Tempo (horas)C

elul

as/m

l - U

FC/m

l

IH/pCM173 number of cells

IH/pCM173 number of viable cells

0

20

40

60

80

100

0

Uni

dade

s de

bet

a-ga

lact

osid

ase

IH/pCM173 b-gal units

Número de células

Número de células viáveis

Unidades de beta-gal

Experimentos utilizando meio SD

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

0 12 24 36 48 60 72 84

Tempo (horas)

Nú

me

ro d

e c

élu

las

/ml

IH/pCM173 cresc.

IH/pCM173 viab.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 12 24 36 48 60 72 84

Tempo (horas)

Un

idad

es

de

be

ta-g

alac

tos

idas

e/m

l

IH/pCM173 U bgal

Experimentos utilizando meio SD

drop-out

CONCLUSÕES

O uso do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter lacZ para visualização da meia vida da expressão de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae se mostrou viável para beta-galactosidase e pode ser utilizado para basicamente qualquer proteína em levedura.

A utilização do sistema de bloqueio geral da tradução para visualização da meia vida de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae fornece um resultado mais longo que o real, devido ao bloqueio da tradução de proteínas proteolíticas.

O uso de repórteres para triagem de promotores em diferentes fases de crescimento da levedura deve levar em conta que a meia vida do fenótipo é diferente.

Existe uma regulação, durante as fases de crescimento da levedura, do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter

A presença de atividade detectável do gene repórter em apenas uma parcela das células albergando o sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter, é uma característica própria deste sistema

AGRADECIMENTOS