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Enzimas na Nutrição de Ruminantes

Enzymes on Ruminant Nutrition

Ricardo Andrade Reis1,2*

, Erika Christina Lara1, Carlos Henrique Silveira Rabelo

1

RESUMO: O objetivo deste texto é discutir sobre as possibilidades de utilização de enzimas

exógenas, seja no processo de ensilagem ou como suplemento alimentar, e seus efeitos sobre a

nutrição e desempenho de ruminantes. Normalmente, enzimas fibrolíticas são mais pesquisadas pela comunidade científica com o intuito de reduzir a fração fibrosa do alimento e/ou aumentar a

digestibilidade desta fração no ambiente ruminal, sendo particularmente interessante na ensilagem de

capins tropicais. Porém, enzimas amilolíticas e proteolíticas também têm sido investigadas como estratégia para aumentar a degradabilidade do amido no rúmen. Adicionalmente, o uso de inoculantes

bacteriano-enzimáticos tem se tornado importante por promover melhoras no processo de conservação

dos alimentos e desempenho animal. No entanto, os resultados são amplamente variáveis, seja pelos

fatores intrínsecos aos produtos enzimáticos, ou também em relação ao uso exclusivo de enzimas exógenas ou associadas aos inoculantes bacterianos, em que na maioria dos casos, não há efeito

positivo destes aditivos sobre o valor nutritivo das silagens produzidas, bem como sobre o

desempenho animal.

Palavras-chave: amilase, consumo, enzimas fibrolíticas, inoculante bacteriano-enzimático, proteases

ABSTRACT: Our objective is highlighting the possibility in using exogenous enzymes, either in the

ensiling process or as supplement and their effects on the nutrition and ruminant performance.

Fibrolytic enzymes are widely investigated by scientific community by reducing of fiber and increasing the ruminal fiber digestibility, or both, being particularly interesting for ensiling of tropical

grasses. However amylolytic and proteolytic enzymes also have been used as a strategy to enhance the

starch rumen degradability. Moreover, use of bacterial-enzymes inoculants has become important to promote improvements at the fermentation process and animal performance. However, the results

show a great variation on the nutritive value of silages due to use of exogenous enzymes as an

exclusive additive or combined with silage inoculants. As a consequence, the majority of studies no

display positive effect of these additives on animal performance.

Key words: amylase, bacteria-enzymatic inoculant, fibrolytic enzymes, intake, proteases

1Departamento de Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, São Paulo, Brasil.

2INCT/CA, UFV, Departamento de Zootecnia, Av. Peter Henry Rolfs, s/n Campus Universitário,

Viçosa, Minas Gerais 36570-000, Brasil. *Autor correspondente. E-mail: [email protected]

Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras.

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1. Introdução

Ao longo dos anos, a ação conjunta de vários programas de melhoramento genético de plantas

forrageiras, estratégias de manejo e avanços agronômicos tem contribuído para melhorar a

digestibilidade da fibra dos alimentos fornecidos aos animais. No entanto, mesmo diante do avanço

nestas áreas, a digestibilidade da fibra ainda limita o consumo de energia disponível nas forragens

pelos ruminantes, contribuindo para a excessiva excreção de nutrientes no ambiente (Beauchemin et

al., 2003). Neste sentido, o uso de enzimas fibrolíticas exógenas tem por intuito aumentar a

digestibilidade da fração fibrosa melhorando sua utilização e a eficiência na produção de ruminantes

(Beauchemin et al., 1995). No Brasil, a utilização de enzimas fibrolíticas foi avaliada no processo de

ensilagem de gramíneas tropicais (Coan et al., 2005), uma vez que estas apresentam menor valor

nutritivo em relação àquelas cultivadas em áreas de clima temperado (Bernardes e Adesogan, 2012), e

silagens de capins constituem uma das principais fontes de fibra e energia na alimentação de animais

destinados a produção de leite e de carne em confinamento (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al.,

2009). Como se sabe, o uso das enzimas fibrolíticas tem por intuito disponibilizar carboidratos

solúveis provenientes da hidrolise da parede celular os quais podem ser utilizados no processo de

fermentação, melhorando a conservação da forragem (Lynch et al., 2015).

Embora as enzimas fibrolíticas sejam as mais pesquisadas pela comunidade científica, enzimas

amilolíticas e proteolíticas têm sido estudadas com particular interesse em melhorar a degradabilidade

do amido no rúmen, uma vez que a primeira atua quebrando a estrutura do amido em partículas

menores (Rojo et al., 2005; Van Soest et al., 1991) e a segunda reduz a proteção da matriz proteica

presente nos grânulos de amido sobre a ação dos microrganismos ruminais (DePeters et al., 2007;

Wang et al., 2009). Ambas as enzimas, amilases e proteases, devem ser utilizadas para melhorar o

valor nutritivo de silagens de cereais (Young et al., 2012), uma vez que estas estão entre os principais

alimentos utilizados na nutrição de ruminantes no Brasil (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al., 2009).

Adicionalmente, complexos enzimáticos (enzimas fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas) têm

sido utilizados em conjunto com inoculantes bacterianos no processo de ensilagem, os quais são

conhecidos como inoculantes bacteriano-enzimáticos. No Brasil, a utilização de inoculantes contendo

complexos-enzimáticos varia de 2,5 a 62,5% dependendo da cultura a ser ensilada (Reis et al., 2015).

Geralmente, os resultados apontam que não há melhora no valor nutritivo destas silagens (Reis et al.,

2015), embora o potencial de ação dos inoculantes bacteriano-enzimáticos seja intimamente

dependente da forragem ensilada, taxa de aplicação e tempo de ensilagem, assim como observado no

uso exclusivo de enzimas exógenas.

Diante deste contexto, o objetivo desta revisão é elucidar o potencial e as limitações da

utilização de enzimas exógenas associadas ou não à inoculantes bacterianos sobre o valor nutritivo das

silagens e seu efeito na nutrição e desempenho de ruminantes.


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2. Enzimas

Uma vez que há inúmeras enzimas com grande potencial de utilização na nutrição de

ruminantes, serão abordados aspectos inerentes à produção destas, bem como descrever o sítio de ação

das principais enzimas pesquisadas nesta área e, posteriormente, discorrer sobre seus efeitos na

conservação de forragens e na nutrição e desempenho de ruminantes.

2.1 Produção de enzimas

Enzimas utilizadas na alimentação de ruminantes são produzidas por microrganismos

específicos através da metabolização de nutrientes presentes no meio de cultivo, seguida pela síntese e

secreção enzimática. Uma vez que o processo se completa, o extrato enzimático é separado do resíduo

e dos organismos que lhe deram origem. Ainda que a fonte de organismo entre os produtos

enzimáticos seja geralmente semelhante, o tipo e a atividade de enzimas produzidas podem variar

amplamente, a depender da linhagem selecionada, do substrato de crescimento e do meio de cultura

utilizado (Considine e Coughlan, 1989; Gashe, 1992; Lee et al., 1998).

Os aditivos enzimáticos são normalmente classificados com base nos compostos que degradam,

como as celulases, xilanases e ligninases, que atuam sobre celulose, xilana e lignina, respectivamente

(McAllister et al., 2001). Além disso, os produtos enzimáticos destinados à alimentação animal,

geralmente são compostos por diferentes combinações enzimáticas e, mesmo produtos compostos

somente por celulases e hemicelulases, podem apresentar atividades secundárias como amilases,

proteases e/ou pectinases, as quais podem se associar às celulases e hemicelulases, consideradas

primárias ou essenciais às dietas de bovinos (McAllister et al., 2001).

As enzimas de origem microbiana são preferencialmente utilizadas pela indústria e são

provenientes, principalmente, de quatro espécies de bactérias (Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophilus, L. plantarum e Streptococcus faecium, spp.) e três espécies de fungos (Aspergillus

oryzae, Trichoderma reesei e Saccharomyces cerevisiae) (Muirhead, 1996). O interesse em produzir e

utilizar estas enzimas é relativamente maior no setor de nutrição animal comparado a outros setores

(Polizeli, 2008). Dentre as vantagens da utilização de microrganismos na produção de enzimas estão o

rápido crescimento celular, curto tempo de produção de metabólitos, cepas com alto potencial de

produção, meio de crescimento barato e fácil extração do produto.


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2.1 Principais enzimas e sítios de ação

2.1.1 Celulases

O sistema enzimático das celulases é constituído de um conjunto de hidrolases glicosídicas, que

envolvem três tipos de enzimas: endo-β-1,4-glucanases ou endoglucanases, exo-β-1,4-glucanases ou

celobiohidrolases, ou apenas exoglucanases e β-1,4-glucosidases. Esses três componentes atuam de

forma sinérgica na hidrólise de celulose (Dillon, 2004; Zhang et al., 2007), porém, em locais

diferentes. As endoglucanases agem nas regiões de menor organização das microfibrilas da celulose

reduzindo a polimerização das microfibrilas e disponibilizando mais substratos para ação das

exoglucanases (McAllister et al., 2001). Em outras palavras, endoglucanases hidrolisam

aleatoriamente as cadeias de celulose produzindo oligômeros de celulose de vários graus de

polimerização. Por sua vez, exoglucanases hidrolisam a cadeia de celulose a partir da extremidade não

redutora para produzir celobiose, enquanto β-glucosidases liberam glicose a partir da celobiose e

hidrolisam cadeias curtas de celoligossacarídeos a partir de extremidades redutoras ou não (Bhat e

Hazlewood, 2000). Por outro lado, as celulases são inibidas pela presença de altas concentrações de

seus produtos de hidrólise (Bhat e Hazlewood, 2000), enquanto endo e exoglucanases são geralmente

inibidas pela celobiose e β-glucosidases são inibidas pela alta concentração de glicose.

2.1.2 Hemicelulases

A utilização de hemicelulases para promover modificação na composição química da fibra está

essencialmente associada à aplicação de xilanases, que catalisam a hidrólise das xilanas. As xilanases

participam da desagregação da parede celular de plantas e, em conjunto com outras enzimas,

hidrolisam polissacarídeos (Polizeli et al., 2005).

A heterogeneidade das hemiceluloses, notadamente das xilanas, exige tal como a celulose, um

sistema enzimático (cooperativo) complexo para que a sua solubilização completa ocorra (Sunna e

Antranikian, 1997). As endo-β-1,4-xilanases são as principais enzimas no processo de

despolimerização da xilana, as quais hidrolisam a cadeia principal mais fácil e rapidamente em regiões

sem substituições gerando oligossacarídeos não substituídos e ramificados ou esterificados (Biely,

1985; 2003). Estas enzimas diferem na sua especificidade por substratos, em que algumas delas

quebram aleatoriamente resíduos de xilose não substituídos, enquanto outras dependem fortemente dos

substituintes próximos aos resíduos de xilose hidrolisados (De Vries e Visser, 2001).

As β-xilosidases são exoglucosidases que hidrolisam xilooligossacarídeos pequenos e xilobiose,

liberando xilose. A especificidade dessas enzimas por pequenos oligossacarídeos de xilose é alta

(Reilly, 1981; Sunna e Antranikian, 1997), e elas são capazes de liberar xilose de terminais não


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redutores de oligossacarídeos ramificados somente quando dois resíduos de xilose contínuos estão

adjacentes à resíduos de xilose simples ou duplamente substituídos (De Vries e Visser, 2001).

Outras enzimas responsáveis por eliminar resíduos substituintes específicos são conhecidas

como enzimas auxiliares ou desramificadoras e atuam em sinergia com as xilanases e β-xilosidases no

processo de despolimerização da xilana. Dentro desse grupo são conhecidas as acetil xilana esterases,

α-glucuronidases, α-L-aferanosidase, feroluil esterase e coumaroil esterase (Aro et al., 2005; Kulkarni

et al., 1999; Prade, 1995). Algumas atuam nas ligações entre um resíduo da cadeia principal e o grupo

substituinte, enquanto outras quebram ligações internas ou terminais das cadeias laterais (De Vries e

Visser, 2001).

2.1.3 Amilases

Amilases são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas α-1,4 da molécula de amido e, de

acordo com seu modo de ação, podem ser divididas em duas categorias: endoamilases e exoamilases.

A α-amilase trata-se de uma endoamilase que promove a hidrólise de ligações α-1,4 no interior da

cadeia de amilose e de amilopectina, liberando várias cadeias de oligossacarídeos de diversos

tamanhos que apresentam conformação α no carbono 1 (Reddy et al., 2003). A glucoamilase ou

amiloglicosidase trata-se de uma exoamilase capaz de hidrolisar ligações glicosídicas do tipo α-1,4 por

meio da remoção de sucessivas unidades de glicose a partir da extremidade não redutora da cadeia,

liberando moléculas de D-glicose na conformação β. Essas enzimas também hidrolisam as ligações α-

1,6 e algumas ligações do tipo α-1,3, porém, em uma velocidade menor (Kumar e Satyanarayana,

2009; Michelin et al., 2008).

2.1.4 Proteases

As proteases podem ser classificadas de acordo com o tipo de reação catalisada, a natureza

química da porção catalítica de sua cadeia química, entre outras, sendo divididas em exopeptidases e

endopeptidases. As exopeptidases atuam na quebra das ligações peptídicas próximas aos grupos amino

ou carboxílico terminal da proteína, enquanto as endopeptidases promovem a lise de ligações distantes

dos grupos amino ou carboxílicos terminais (Rao et al., 1998).

Estas enzimas proteolíticas têm sido associadas na melhora da digestibilidade do amido

(DePeters et al., 2007; Young et al., 2012), uma vez que agem sobre a matriz proteica dos grânulos de

amido hidrolisando cadeias complexas de polipeptídeos e liberando compostos de menor peso

molecular, o que resulta em mais sítios de ação para atuação dos microrganismos do rúmen (Simpson,

2001). Desta maneira, o impedimento físico-químico na digestão do amido em ruminantes promovido

pela matriz proteica (Owens et al., 1986) pode ser reduzido.


60

2.1.5 Feruloil esterase (FAE)

O uso da FAE na nutrição de ruminantes tem se tornado importante por quebrar ligações

cruzadas entre lignina e os polissacarídeos da parede celular. Essa enzima é uma hidrolase que atua em

ésteres carboxílicos liberando ácido ferúlico e outros ácidos cinâmicos presentes nos polissacarídeos

da parede celular vegetal, envolvidos na interligação entre a hemicelulose e a lignina (Faulds et al.,

2002). Por isso, as FAEs são conhecidas como enzimas acessórias, pois ajudam a ação das xilanases e

celulases na hidrólise da biomassa lignocelulósica (Gottschalk et al., 2010).

3. Aplicação de enzimas na nutrição de ruminantes

A forragem é a maior fonte de energia para os ruminantes, sendo constituída, principalmente,

por celulose e hemicelulose (Van Soest, 1994). Esses dois compostos são formados por moléculas

simples interligadas por ligações rígidas e altamente resistentes. Com isso, a degradação do alimento

pelos microrganismos do rúmen pode ser comprometida diminuindo a liberação de energia e proteína

para os ruminantes, além do desempenho animal (Church et al., 1993). Portanto, o maior volume de

pesquisas envolvendo enzimas fibrolíticas no intuito de melhorar a nutrição e maximizar o

desempenho animal é justificado.

Enzimas fibrolíticas foram inicialmente testadas como aditivos na ensilagem de forrageiras, pois

se acreditava que estas poderiam melhorar o processo fermentativo pela disponibilização de maiores

quantidades de carboidratos solúveis para as bactérias ácido-láticas (BAL), as quais rapidamente

produzem ácido lático e reduzem o pH da forragem ensilada (Colombatto et al., 2004; McDonald et

al., 1991). Além disso, essas enzimas podem atuar na degradação da parede celular da forragem,

diminuindo o conteúdo de fibra e/ou aumentando a digestibilidade desta fração, o que potencialmente

pode melhorar o desempenho animal (Beauchemin et al., 2003).

Contudo, devido à variedade de produtos enzimáticos e condições experimentais, as respostas

observadas na utilização de enzimas para ruminantes são muitas vezes inconsistentes, e variam desde a

maior liberação de carboidratos solúveis e melhora na digestibilidade do alimento, até respostas nulas

ou negativas da aplicação desses aditivos (Tabela 1). Tais respostas podem ser atribuídas às condições

nas quais a energia não é limitante, pela diferença de atividade enzimática e características das

enzimas suplementadas, assim como, por uma super ou sub-dosagem da atividade enzimática e pelo

método inapropriado de fornecimento da enzima para o animal (Beauchemin et al., 2003).

Além do efeito sobre a concentração da FDN e FDA ser variável, o uso de enzimas fibrolíticas

como estratégia para melhorar o processo de conservação de forragens não apresenta grandes impactos

sobre o valor nutritivo das silagens. Como exemplo, Lynch et al. (2014a; 2015a) não encontraram

efeitos positivos no uso das de enzimas fibrolíticas exógenas sobre o valor nutritivo e digestibilidade

da FDN de silagem e feno de alfafa. Além disso, os autores observaram que o uso das enzimas


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favoreceram a fermentação heterolática da silagem de alfafa e proporcionou maiores perdas de matéria

seca (MS) da forragem. Adicionalmente, em alguns casos, o uso das enzimas fibrolíticas tem

promovido resultados negativos. Por exemplo, Colombatto et al. (2004) avaliaram silagens tratadas

com enzimas comerciais e observaram menor produção de gases e degradação mais lenta nas tratadas

quando comparadas com a controle, o que implicou em substrato menos fermentável e disponível para

os microrganismos do rúmen.

Tabela 1. Efeito da aplicação de enzimas na ensilagem de diferentes forrageiras sobre as

concentrações de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA)

(valores expressos em g/kg de MS)

Fonte FDN FDA

Silagem de capim

Beuvink e Spoelstra (1994) -35,6 -

Jacobs e McAllan (1991) -4,9 -10,2

Choung e Chamberlain (1992) -12,3 -11,7

Rodrigues et al. (1993) -29,6 -19,2

Selmer-Olsen et al. (1993) -26,9 -30,7

Stokes et al. (1996) -5,3 -8,2

Weinberg et al. (1993) 0 -8,8

Silagem de leguminosas e capim-leguminosas

Kung et al. (1991) +1,1 +2,6

Fredeen e Mc Queen (1993) -1,3; -7,8 -1,4; -6,5

Hoffman et al. (1995) -6,7 -2,0

Sheperd et al. (1995) -9,5; -7,8 -9,2; -4,2

Nadeau e Buxton (1997) -3,7 0

Silagem de planta inteira de milho

Kung et al. (1990) -4,2 -2,8

Weinberg et al. (1993) -7,3 -7,2

Adogla-Bessa et al. (1999) -8,5 -12,8

Adogla-Bessa et al. (1999) (+ ureia) +0,3 -1,1

Nia e Wittenberg (1999) -0,4 -0,6

Fonte: Adesogan (2005).

Embora a fração fibrosa possa ser reduzida em alguns casos devido ao uso de enzimas

fibrolíticas (Tabela 1), os resultados negativos de várias pesquisas conduzidas em condições tropicais

parecem estar mais vinculados a um provável aumento proporcional na fração fibra em detergente

neutro indigestível (FDNi) das silagens tratadas em detrimento da redução na fração potencialmente


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digestível da FDN (FDNpd), uma vez que a ação das enzimas fibrolíticas deve resultar em maior

quantidade de substratos fermentáveis pelas BAL, as quais produzem ácido lático e ácidos de cadeia

curta (McDonald et al., 1991; Nadeau et al., 2000). Como exemplo, Cysneiros et al. (2006)

observaram redução no teor de FDN em silagens de milho tratadas com enzimas fibrolíticas, porém,

sem qualquer efeito sobre a degradação ruminal da FDN.

Portanto, estudos passaram a avaliar enzimas fibrolíticas como aditivos em ração para

ruminantes, ou seja, fornecida imediatamente antes da alimentação, no intuito de aumentar a

digestibilidade, melhorar a eficiência de utilização dos alimentos e, consequentemente, melhorar o

desempenho animal. Quando fornecidas dessa maneira, as enzimas formam ligações com os

substratos, que as protegem da degradação ruminal e podem aumentar a digestibilidade através de

diferentes mecanismos, como: hidrólise direta, melhoria da aceitabilidade, alterações na viscosidade

intestinal e mudanças do local de digestão (Beauchemin et al., 2003; Loures, 2004; Martins, 2003).

O fato de aplicar as enzimas diretamente no cocho parece conferir maior estabilidade enzimática

graças à formação do complexo enzima-substrato, dificultando a ação de proteases microbianas e

aumentando seu tempo de permanência no rúmen por não estar dissolvida no fluído ruminal (Morgavi

et al., 2000). Entretanto, na falta do complexo enzima-substrato estável, as enzimas se solubilizam no

líquido ruminal e fluem rapidamente para o intestino (Beauchemin et al., 2003).

Frente ao contexto de que enzimas fibrolíticas devem ser mais efetivas na degradação ruminal

da FDN quando aplicadas sobre o alimento, imediatamente antes do fornecimento aos animais, Lara et

al. (2012) verificaram maior degradação da parede celular primária de silagens de milho tratadas com

xilanases e celulases após 6 horas de contato entre enzimas e substrato (Figura 1). Neste mesmo

estudo, os autores verificaram ainda maior colonização e exposição dos grânulos de amido da matriz

proteica das silagens de milho quando tratadas com as enzimas fibrolíticas e a bactéria Lactobacillus

buchneri. Tal fato comprovou que aumentos na taxa de degradação do alimento no rúmen estão

relacionados com a melhora na colonização dos alimentos pelos microrganismos ruminais em função

do tratamento enzimático (Colombatto et al., 2003).

No rúmen, as enzimas podem agir diretamente nos alimentos ou estimular indiretamente a

digestão por potencializar as atividades das enzimas microbianas (McAllister et al., 2001),

demonstrando a possibilidade de haver sinergismo entre enzimas exógenas e microbianas (Morgavi et

al., 2000). Neste sentido, produtos enzimáticos contendo xilanases, esterases e proteases mostraram-se

efetivos em estimular a degradação in vitro do feno de alfafa (Colombatto et al., 2003; Nsereko et al.,

2000). Melhorias na digestibilidade in vitro da FDN e fibra em detergente ácido (FDA) da palha de

arroz também foram observadas com a aplicação de xilanase e celulase (Eun et al., 2006).

Os resultados positivos reportados em condições in vitro devido à aplicação das enzimas

poderiam sugerir que as mesmas respostas fossem obtidas em condições in vivo. Entretanto, a

aplicação de enzimas em dietas contendo tortas de azeitona e gramíneas no momento da alimentação

de cordeiros não surtiu qualquer efeito sobre o consumo e digestibilidade (Awawdeh e Obeidat, 2011;


63

Miller et al., 2008). Além disso, outros estudos envolvendo carneiros (McAllister et al., 1999; Rojo et

al., 2005) e bovinos (Krueger et al., 2008; ZoBell et al., 2000) não reportaram efeitos positivos no

ganho de peso dos animais tratados com enzimas aplicadas no momento da alimentação.

Figura 1. Elétron-micrografia de varredura de silagem de milho não tratada (A), silagem de milho

tratada com L. buchneri (B), silagem de milho tratada com enzimas fibrolíticas (C) e

silagem de milho tratada com L. buchneri e enzimas fibrolíticas (D) por 0,5; 1,0; 3,0; 6,0 e

12 horas, de cima para baixo, respectivamente.

Fonte: Lara et al. (2012).

Em condições brasileiras, a adição de enzimas como suplemento para bovinos não proporcionou

mudanças no consumo de matéria seca e de fibra em detergente neutro, como também na

digestibilidade da matéria seca, conforme apresentado na Figura 2 (Martins et al., 2006; Loures et al.,

2005). Porém, foi verificado melhora na digestibilidade da fibra em detergente neutro dos alimentos

suplementados com enzimas (Figura 3). Respostas negativas ou nulas podem estar relacionadas ao


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tempo no qual o produto enzimático ficou em contato com o alimento antes de ser consumido, e

também ao nível de atividade enzimática presente e ativa no substrato.

Figura 2. Ingestão de matéria seca (MS) e fibra em detergente neutro (FDN) em bovinos

suplementados ou não com enzimas fibrolíticas exógenas em condições brasileiras.

Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005).

Figura 3. Coeficientes de digestibilidade aparente total (%) da matéria seca (MS) e fibra em

detergente neutro (FDN) de bovinos suplementados ou não com enzimas fibrolíticas

exógenas em condições brasileiras.

Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005).

Como mencionado acima, para que as enzimas sejam eficazes como modificadoras da

fermentação ruminal, elas devem resistir à proteólise decorrente da ação de microrganismos do rúmen

e à flutuação do pH e temperatura do rúmen durante um período de tempo suficientemente longo. Em

pesquisa para verificar a estabilidade de enzimas no líquido ruminal, Morgavi et al. (2000) concluíram

0

2

4

6

8

10

12

Silagem de milho

Silagem de capim

Feno de Tifton 85

Silagem de milho

Silagem de capim

Feno de Tifton 85

MS FDN

Ing

estã

o,

kg

/dia

Sem enzimas Com enzimas

0

10

20

30

40

50

60

70

Silagem de milho

Silagem de capim

Feno de Tifton 85

Silagem de milho

Silagem de capim

Feno de Tifton 85

MS FDN

Dig

esti

bil

idad

e, %

Sem enzimas Com enzimas


65

que, na maioria das enzimas, isso não constitui um fator limitante para sua utilização em dietas para

ruminantes. Todavia, existem evidências de que a aplicação de enzimas sobre os alimentos,

principalmente na forma líquida, aumenta sua adsorção, com consequente aumento da resistência das

enzimas à proteólise prolongando sua viabilidade no ambiente ruminal (Beauchemin et al., 1999).

Além disso, o modo de ação das enzimas exógenas é extremamente complexo, acarretando respostas

variáveis quando da sua utilização em dietas de ruminantes (McAllister et al., 2001).

Outra provável explicação para a falta de resultados positivos em muitos estudos está

relacionada às condições de atuação das enzimas. Em geral, as enzimas usadas na alimentação animal

são misturas de diferentes polissacaridases, glucosidases, ligninases e proteases, que geralmente

necessitam de condições diferentes para mostrarem máximo efeito (Vahjen e Simon, 1999). Por

exemplo, temperatura de 50ºC e pH entre 4,8 a 5,3 são recomendados para celulases provenientes do

Trichoderma spp. (Ghose, 1987; Wood e Bhat, 1988). No entanto, essas condições não refletem a

situação in vivo (Sabatier e Fish, 1996), como temperatura do rúmen de 39ºC e pH entre 5,8 e 6,8. Para

aplicações em ração animal, parece lógico que o pH e a temperatura utilizada nos ensaios de avaliação

devem assemelhar-se às condições encontradas no alimento ou no animal, dependendo do local onde

as enzimas irão atuar.

Outro fator que também exerce grande influência sobre os resultados é o nível de aplicação

enzimática, ou seja, quantas unidades de atividade enzimática devem ser adicionadas por quilo de MS

a ser ingerida. O uso de níveis moderados de enzimas na alimentação de ruminantes pode causar

rupturas benéficas na estrutura da superfície dos alimentos, antes ou após a ingestão (Nsereko et al.,

2002). No entanto, níveis elevados de enzimas podem ser menos eficazes do que níveis mais baixos

por diminuir a adesão microbiana e limitar a digestão do alimento, enquanto o nível ótimo é

dependente da dieta (Beauchemin et al., 2003). Neste sentido, as quantidades de enzimas normalmente

utilizados como aditivos na alimentação de ruminantes variam de 0,5 a 2,0 mg/g (ou g/kg) da dieta

total, com base na MS (Beauchemin et al., 2003). Porém, estas quantidades são dependentes das

características específicas de cada produto, como tipo de atividade das enzimas presentes.

4. Inoculantes bacteriano-enzimáticos

4.1 Efeito sobre o valor nutritivo das silagens

A ensilagem de culturas que apresentam baixo teor de MS, baixa concentração de carboidratos

solúveis e alta capacidade tampão, ou a escolha errada do ponto de colheita, invariavelmente resultam

em silagens inadequadamente fermentadas e de baixa qualidade nutricional (McDonald et al., 1991).

Este quadro é mais grave particularmente em regiões de clima tropical, onde geralmente plantas

forrageiras apresentam menor valor nutritivo comparado àquelas de clima temperado (Bernardes e

Adesogan, 2012). Portanto, a obtenção de silagens com boa qualidade requer adequado manejo da


66

cultura e do processo de ensilagem e, a população epífita de BAL deve estar presente em quantidade

suficiente (105 - 10

6 unidades formadoras de colônia/g de forragem) para dominar o processo de

fermentação e garantir a fermentação lática (McDonald et al., 1991). No entanto, os produtos

utilizados pelas BAL no processo fermentativo estão restritos basicamente aos carboidratos solúveis

(mono e dissacarídeos), uma vez que a maioria destas bactérias não possui complexo enzimático para

metabolizar carboidratos complexos (Rooke e Hatfield, 2003).

Estratégias como a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido avaliadas para

melhorar o padrão de fermentação e valor nutritivo das silagens. Geralmente podem-se considerar dois

tipos distintos de inoculantes bacteriano-enzimáticos: o primeiro e mais comum refere-se à utilização

de BAL homo e/ou heterofermentativas associadas a um complexo enzimático exógeno (enzimas

fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas); o segundo trata-se de cepas específicas de BAL ou outros

microrganismos que são capazes de produzir enzimas. Por exemplo, algumas cepas de Lactobacillus

buchneri, L. plantarum e Bacillus subtilis demonstraram ser hábeis em produzir algum tipo de enzima,

normalmente fibrolíticas (Cavin et al., 1997; Donaghy et al., 1998; Kang et al., 2009). A aplicação de

enzimas fibrolíticas seja isoladamente ou associada à BAL antes da ensilagem de qualquer forragem

deve facilitar a ação das mesmas, uma vez que o tempo de contato entre forragem e enzimas aumenta,

permitindo obter um grande impacto sobre o valor nutritivo da silagem (Lynch et al., 2015b). Neste

sentido, a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos é benéfica, uma vez que as BAL presentes

no inoculante agem promovendo maior e mais rápida produção de ácido lático, enquanto o complexo

enzimático contido no inoculante age na parede celular e na matriz proteica dos grânulos de amido

liberando açúcares solúveis prontamente disponíveis para fermentação (Fugita et al., 2012).

Especificamente no caso de enzimas fibrolíticas, estas agem na parede celular das plantas removendo

ácido-ferúlico, o que teoricamente implicaria no aumento da digestibilidade das silagens, pois a fração

fibrosa torna-se mais susceptível à ação de bactérias fibrolíticas presentes no rúmen dos animais (Kang

et al., 2009). Como se sabe, o ácido ferúlico é o mais abundante e mais inibitório ácido fenólico que

limita a digestão ruminal da fibra (Yu et al., 2005). Portanto, reduções no teor de FDN em silagens de

milho tratadas com inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido reportadas em silos laboratoriais nos

países de clima temperado (Stokes e Chen, 1994).

Por outro lado, em uma ampla revisão da literatura brasileira, Reis et al. (2015) observaram que

inoculantes bacteriano-enzimáticos são mais utilizados em silagens de sorgo (62,5% dos tratamentos

avaliados), seguido por silagem de capim e milho (30 e 24%, respectivamente). De acordo com os

dados compilados pelos autores citados anteriormente, ao contrário do que se esperava, a aplicação de

inoculantes bacteriano-enzimáticos não reduziu os teores de FDN ou alterou os coeficientes de

digestibilidade comparado às silagens não tratadas (Figura 4). Uma das premissas em utilizar

inoculantes bacteriano-enzimáticos deve-se a preservação de maior quantidade de compostos solúveis

durante a fermentação (Ribeiro et al., 2008). Se esta premissa é atingida, poderia esperar-se uma

redução indireta na participação percentual da parede celular na silagem tratada. No entanto, a maioria


67

dos resultados obtidos experimentalmente no Brasil sugere que inoculantes bacteriano-enzimáticos

não são eficientes em preservar carboidratos solúveis e aumentar a produção de ácido lático nas

silagens (Reis et al., 2015). Além disso, a obtenção de resultados similares quanto aos coeficientes de

digestibilidade possivelmente está associada ao aumento da FDNi na silagem, uma vez que as enzimas

contidas nos inoculantes são capazes de agir somente na fração FDNpd (Rooke e Hatfield, 2003).

Figura 4. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de proteína bruta (PB), fibra em

detergente neutro (FDN) e coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS)

de silagens de milho, capim e sorgo.

Fonte: Adaptado de Reis et al. (2015).

Outros fatores como estádio de maturidade da forragem, tempo de fermentação, exposição ao

oxigênio e perdas de constituintes não fibrosos durante a fermentação também contribuem para as

discrepâncias sobre os efeitos de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de FDN das silagens

(Addah et al., 2014). De fato, o estádio de maturidade da forragem interfere marcadamente sobre a

ação de inoculantes bacteriano-enzimáticos. Como exemplo, a aplicação de um inoculante bacteriano-

enzimático foi mais eficiente em aumentar os coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria

orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas a partir de plantas colhidas mais tardiamente

(Figura 5), como reportado por Rabelo et al. (2014). De acordo com os próprios autores, os maiores

coeficientes de DIVMO encontrados em silagens produzidas nos estádios 2/3 de linha de leite e

camada negra se devem à presença de enzimas amilolíticas, assim como celulolíticas no inoculante,

que atuam sobre o amido e celulose, respectivamente, e auxiliam na degradação destas frações durante

o processo digestivo. Contudo, de maneira geral, os inoculantes bacteriano-enzimáticos não têm

contribuído de forma positiva em melhorar o valor nutritivo das silagens produzidas em condições

brasileiras, especialmente sobre a redução da FDN e aumento da digestibilidade (Reis et al., 2015), o

que está de acordo com dados reportados em países de clima temperado (Van Soest, 1994).

0

200

400

600

800

PB FDN DIVMS PB FDN DIVMS PB FDN DIVMS

Milho Capim Sorgo

g/k

g d

e M

S

Controle Inoculante bacteriano-enzimático


68

Figura 5. Efeito de um inoculante bacteriano-enzimático sobre os coeficientes de digestibilidade in

vitro da matéria orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas em diferentes

estádios de maturidade (SLL = sem linha de leite (25,9% de MS); 1/3 de linha de leite

(29,5% de MS); 1/2 de linha de leite (31,6% de MS); 2/3 de linha de leite (33,9% de MS);

CN = camada negra (38,4% de MS)).

Fonte: Adaptado de Rabelo et al. (2014).

Mesmo que não haja reduções na fração fibrosa, os inoculantes bacteriano-enzimáticos são

aplicados no intuito de promover benefícios sobre a degradação da FDN em condições ruminais (Kang

et al., 2009). Estudos de degradabilidade in situ têm demonstrado que a hidrólise completa ou parcial

das ligações entre ácido ferúlico e carboidratos da parede celular da forragem deve diretamente

melhorar a digestão ruminal ou aumentar a susceptibilidade da parede celular para digestão ruminal

(Nsereko et al., 2008; Kang et al., 2009). Todavia, dados sumarizados de estudos conduzidos nos

Estados Unidos e Canadá mostram que o efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a

degradabilidade da MS e FDN é muito pequeno (<2,5%) em silagens de milho, enquanto observa-se

um negativo efeito em silagens de alfafa pré-secada (Figura 6). O ligeiro aumento na degradabilidade

da MS e da FDN em silagem de milho pode indicar que carboidratos presentes na parede celular das

silagens tratadas são mais facilmente digestíveis devido à ação da enzima ferulato-esterase (Lynch et

al., 2015). Porém, de maneira geral, os efeitos observados sobre a digestibilidade de silagens tratadas

com inoculantes bacteriano-enzimáticos são inconsistentes e controversos (Chen et al., 1994; Sheperd

e Kung, 1996; Kung et al., 2000). Adicionalmente, silagens de milho apresentam maior digestibilidade

da fibra em condições in vitro quando tratadas imediatamente antes do ensaio de digestão somente

com enzimas fibrolíticas (Colombatto et al., 2004; Phakachoed et al., 2013).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

SLL 1/3 LL 1/2 LL 2/3 LL CN

DIV

MO

, %



69

Figura 6. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a degradabilidade da matéria seca (DMS) e fibra em detergente neutro (DFDN) de silagens de milho e alfafa pré-secada após

24 e 48 horas de incubação in vitro.

Fonte: Adaptado de Kang et al. (2009) e Lynch (2014a,b, 2015).

4.2 Efeito no desempenho animal

Nos trabalhos onde inoculantes bacteriano-enzimáticos melhoram o valor nutritivo das silagens

tratadas é compreensível que algumas expectativas em maximizar o desempenho animal sejam

geradas. Como se sabe, o consumo de MS é direta e negativamente correlacionado com a

concentração de fibra no alimento (Allen, 1997). Portanto, qualquer ação que diminua a concentração

de fibra e/ou maximize a digestibilidade da fração fibrosa no rúmen deve implicar no aumento do

consumo e, consequentemente no ganho de peso dos animais (Van Soest, 1994). Todavia, como

descrito anteriormente, na maioria dos casos os inoculantes bacteriano-enzimáticos não tem

promovido melhorias significativas no valor nutritivo das silagens. Como resultado, dados

sumarizados de estudos conduzidos em países de clima temperado e tropical indicam desempenhos

similares entre os animais que consomem silagens tratadas e não tratadas (Figura 7 e Tabela 2).

Figura 7. Efeito de inoculantes contendo BAL produtoras de ferulato esterase sobre o desempenho de bovinos de corte alimentados com silagem de cevada e terminados em confinamento.

Fonte: Adaptado de Addah et al. (2012, 2014, 2015).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h

DMS DFDN DMS DFDN

Milho Alfafa pré-secada

%


0

2

4

6

8

10

Controle Inoculante

kg

/dia

Consumo de matéria seca Ganho de peso


70

Isto sugere que em muitos casos não há ação do complexo enzimático contido nos inoculantes

durante o processo fermentativo, nem mesmo dentro do rúmen, onde o mesmo poderia maximizar a

digestão da fibra e outros componentes. Como não há atuação das enzimas, provavelmente o potencial

de ação das BAL presentes no inoculante também não é alterado, embora estas possam interferir

marcadamente sobre o desempenho animal (Basso et al., 2014) por melhorar a qualidade da silagem

e/ou fornecer massa microbiana diretamente no rúmen, agindo como um probiótico (Weinberg et al.,

2007).

Os dados obtidos em condições brasileiras indicam que o consumo de MS (kg/dia) diminuiu

ligeiramente quando bovinos e ovinos foram alimentados com silagens de capim e milho tratadas com

inoculantes bacteriano-enzimáticos (Tabela 2). Além disso, bovinos consumindo silagem de milho

tratada apresentaram acentuada redução (14,2%) na digestibilidade da FDN em relação aos animais

alimentados com silagem não tratada. Como resultado, a digestibilidade da MS também foi

ligeiramente prejudicada pelo inoculante. Do mesmo modo, ovinos alimentados com silagem de milho

tratada com o inoculante bacteriano-enzimático apresentaram redução de 9,3% na digestibilidade da

MS. No entanto, estudos envolvendo inoculantes bacteriano-enzimáticos e seus efeitos sobre o

desempenho animal ainda são incipientes no Brasil (Reis et al., 2015) e, novos estudos são necessários

para atestar o potencial destes aditivos nas mais variadas condições.

Tabela 2. Dados sumarizados sobre consumo e digestibilidade em bovinos e ovinos alimentados com

silagens de capim, milho e sorgo tratadas ou não com inoculantes bacteriano-enzimáticos

em condições brasileiras

Item Bovinos

Ovinos Controle Inoculante Controle Inoculante

Consumo de matéria seca, kg/dia Capim 4.71 4.67

1.10 1.08

Milho 8.67 8.42

1.37 1.11 Sorgo 6.53 6.63

0.51 0.53

Consumo de matéria seca, % do peso vivo Capim 2.34 2.37

2.16 2.05

Milho 2.19 2.22

2.81 2.39 Sorgo 1.99 2.10

1.64 1.72

Digestibilidade in vivo da matéria seca, % Capim 65.74 66.35

64.00 63.32

Milho 65.25 64.21

60.40 54.80 Sorgo 60.10 61.07

52.24 54.05

Digestibilidade in vivo da fibra em detergente neutro, % Capim 62.78 61.39

53.55 50.97

Milho 56.92 48.85

35.17 37.21 Sorgo 50.43 52.30

46.49 48.84

Digestibilidade in vivo da proteína bruta, % Capim 66.28 66.71

65.04 66.40

Milho 65.33 60.01

60.50 59.20 Sorgo 60.21 60.17 36.21 36.92

Fonte: Adaptado de Bergamaschine et al. (2006), Bumbieris Junior et al. (2009), Fugita et al. (2012), Henrique e Bose (1992), Jayme et al. (2011), Rocha et al. (2006), Rodrigues et al. (2002), Silva et al.

(2006) e Zanette et al. (2011).


71

5. Implicações

De maneira geral, com base no conjunto de artigos consultados na construção desta revisão

notou-se que a aplicação de enzimas antes da ensilagem na forma exclusiva ou associada à inoculantes

bacterianos não altera positivamente o valor nutritivo da silagem. Além disso, resultados de

degradação da fibra e do alimento como um todo demonstra o baixo impacto das enzimas sobre estas

variáveis, o que explica a falta de resultados positivos no desempenho animal.

A aplicação das enzimas nas dietas no momento do fornecimento aos animais parece gerar

resultados mais promissores. Por outro lado, o volume de estudos no Brasil sobre o efeito de enzimas

exógenas sobre o desempenho animal ainda é incipiente. Portanto, novas pesquisas que contribuam

para o entendimento de mecanismos de ação das várias enzimas utilizadas na nutrição de ruminantes

visando maximizar o desempenho animal devem ser estimuladas.

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