OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ENDOXILANASESlivros01.livrosgratis.com.br/cp007426.pdf · Os...
Transcript of OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ENDOXILANASESlivros01.livrosgratis.com.br/cp007426.pdf · Os...
Rodrigo Pires do Nascimento
OOTTIIMMIIZZAAÇÇÃÃOO DDAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO DDEE EENNDDOOXXIILLAANNAASSEESS
PPOORR SSttrreeppttoommyycceess mmaallaayyssiieennssiiss AAMMTT--33 UUTTIILLIIZZAANNDDOO
RREESSÍÍDDUUOOSS AAGGRROO--IINNDDUUSSTTRRIIAAIISS
Orientadores:
Profª. Rosalie Reed Rodrigues Coelho (Instituto de Microbiologia – CCS)
Profª. Elba Pinto da Silva Bon (Instituto de Química – CT)
Prof. Nei Pereira-Jr. (Escola de Química – CT)
Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro
2006
Tese apresentada ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, visando a obtenção do Grau de
Doutor em Ciências (Microbiologia).
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Nascimento, R.P.
ii
Ficha Catalográfica
ascimento, Rodrigo Pires
ndoxilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 Utilizando
utorado: Doutor em Ciências (Microbiologia)
da Produção
eral do Rio de Janeiro – Brasil
dustrial – Portugal
N
Estudo da Produção de E
Resíduos Agro-Industriais.
x, 164 fls.
Tese de Do
1. Streptomyces malaysiensis AMT-3
2. Xilanases
3. Otimização
4. Solo de Cerrado
I. Universidade Fed
II. Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia In
III. Título
Nascimento, R.P.
iii
Um especialista é aquele que comete um grande número de erros em uma área
Niels Böhr
muito específica do conhecimento.
Nascimento, R.P.
iv
Trabalho realizado no Laboratório de Biotecnologia de
Actinomicetos do Departamento de Microbiologia Geral do
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, sob a
orientação da Drª Rosalie Reed Rodrigues Coelho sob a co-
orientação dos Drs. Elba Pinto da Silva Bon e Nei Pereira Jr,
em colaboração com Unidade de Fisiologia Microbiana e
Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia do Instituto
Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial, sob a
coordenação dos Drs. Francisco Gírio e Alberto Reis.
Nascimento, R.P.
v
À Deus, presente em todas as horas durante a
minha vida, pois serviram para o meu
crescimento espiritual.
Nascimento, R.P.
vi
Dedico aos meus pais Luiz Paulo e Scheila Pires,
minha avó Maria Alice e a minha tia Regina Célia
por me darem o apoio necessário para seguir este
caminho tão pleno de oportunidades e alegrias.
Nascimento, R.P.
vii
AGRADECIMENTOS
Este trabalho se constitui parte de um ampl
potenci
as e instituições, às quais
gostaria
rigues Coelho, nossa orientadora, pelo constante incentivo,
paciênc
n e Dr. Nei Pereira Jr., nossos co-orientadores, pela
grande
r. Alberto Reis, pela grande oportunidade e pelo constante
apoio, i
ientífica e
pelo in
Marta Helena Branquinha, Alane Beatriz Vermelho,
Rosang
Microbiologia, Dilma, que sempre com seu carinho, sua
atenção
izade, paciência e apoio, sempre
demons
os meus colegas de laboratório: Adriana Linhares Sousa, Adriana Fróes, Andre
Grigorewski, Doralice Rodrigues Sacramento, Erick Aniszweski, Felipe Mendes, Júlio Cesar
o projeto, cujo objetivo principal é estudar o
al biotecnológico de actinomicetos isolados de ambientes naturais brasileiros.
Particularmente, no presente caso, pretende-se otimizar, estudar o escalonamento e caracterizar as
endoxilanases produzidas por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo de cerrado,
determinando as condições ótimas de produção e atividade enzimática.
Este trabalho só foi possível devido ao auxílio de diversas pesso
de agradecer em especial.
À profª. Rosalie Reed Rod
ia e sabedoria sempre demonstrados.
Aos Profs Dr. Elba Pinto da Silva Bo
oportunidade de participação no projeto Brasil–Portugal e pelo constante apoio, incentivo,
e sabedoria sempre demonstrados.
Aos Dr Francisco Gírio e D
ncentivo, e sabedoria durante a elaboração do trabalho no INETI, em Portugal.
Ao prof. Luiz Fernando de Toledo Luna Linhares pela valiosa colaboração c
centivo nos momentos de incerteza.
Às profªs. Eliana Barreto Bergter,
ela Araújo Soares e Celuta Sales Alviano pelo apoio, colaboração e pela constante
amizade demonstrados a todo tempo.
À bibliotecária do Instituto de
e presteza, emprestou-me mais do que simples livros.
À amiga Claudia Masini D’Avila-Levy pela grande am
trados.
À todos
Nascimento, R.P.
viii
Venânc
osé Carlos Júnior, Cláudia Jiovanetti,
Bruno
ento de Biotecnologia do Instituto Nacional de
Engenh
obiologia e
Imunol
pre demonstrados.
cados a nossa
disposi
-4), ao Conselho de Ensino e para Graduados e Pesquisas da UFRJ (CEPG), à
Coorde
io, Luzia Soares Semêdo, Luciana Insuellas de Azeredo, Marta de Sousa Ferreira, Nelson
Alves Júnior, Rodrigo Fonseca de Souza e Rosana Canuto Gomes pela constante colaboração,
paciência e pelo carinho e amizade sempre demonstrados.
Aos meus grandes amigos Lysianne Pinto, Rodrigo Souza, André Grigorewski, Gisele
Cunha, Eugênia Cunha, Sandra Cunha, Danilo Camargo, J
Lima Ribeiro, Vera Brilhante, Conceição Cândido, Tânia, pela amizade e confiança
sempre demonstradas em qualquer situação.
Aos amigos da Unidade de Fisiologia Microbiana e Bioprocessos e Unidade de
Bioengenharia e Bioprocessos do Departam
aria e Tecnologia Industrial (INETI), em Portugal: Susana Marques, Luis Alves, Luis
Duarte, Helena Alberguaria, Florbela Carvalheiro, Maria Amélia, Ana Mendes, Manoela Lageiro,
João Sousa, Cristina Máximo pela amizade, paciência e apoio sempre demonstrados.
À coordenadora do curso de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia Prof. Thais
Souto-Padrón pela competência em administrar o curso de pós-graduação em Micr
ogia dentro da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Aos colegas dos laboratórios situados no Departamento de Microbiologia Geral do
Instituto de Microbiologia pelo apoio, amizade e paciência sem
À todo corpo docente e discente do Instituto de Microbiologia da UFRJ na pessoa de seu
diretor, Prof.ª Ângela Hampshire Lopes, pelos recursos materiais e humanos colo
ção.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – Processo
201080/2004
nação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de
Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo auxílio financeiro dispensado durante a
realização deste trabalho.
Nascimento, R.P.
ix
RESUMO Os estreptomicetos são de grande potencial para a produção de enzimas, como as xilanases,
importantes para a indústria papeleira, têx ia. O objetivo do presente trabalho foi a
otimi
A melhor produção de CMCases (710 U/L) foi obtida em 2,5% (p/v)
drech
o, foi detectada utilizando SDS-PAGE contendo 0,1% (p/v) de
gelati
til e alimentíc
zação da produção de endoxilanase por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando
substratos de baixo custo. A otimização do meio de cultivo foi conduzida em frascos agitados,
utilizando um planejamento fatorial (23), em que dreche cervejeiro e farelo de trigo foram
testados como fontes de carbono, nas concentrações de 0,5 e 2,5% (p/v), e milhocina e extrato de
levedura como fonte de nitrogênio, nas concentrações de 0,1 e 1,2% (p/v). A fermentação foi
conduzida a 200 rpm, 28ºC, por 6 dias. A maior atividade enzimática (45,8 U/mL) foi obtida após
6 dias de fermentação a 28ºC, utilizando 2,5% (p/v) de farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina.
Utilizando a melhor composição de meio de cultivo, a produção de endoxilanases foi também
conduzida em biorreator de 2L. A taxa de aeração (0,5 e 1,5 vvm) e a velocidade (300 e 600 rpm)
foram otimizadas utilizando planejamento fatorial 22. O melhor resultado para a produção de
endoxilanases (média de 56,5 U/mL) foi observado quando 300 rpm e 0,5 vvm foram utilizados,
correspondendo a um aumento de 1,2 vezes, quando comparado com o observado em frasco
agitado. Os parâmetros cinéticos para a atividade endoxilanásica, utilizando uma xilana solúvel,
foram 1,56 mg/mL de xilana (Km) e 1,58 µmoles de xilose/mL.min (Vmax), mostrando uma alta
especificidade e uma velocidade baixa. A concentração de 1,5% (p/v) de xilana e o tempo de
reação de 6 min foram escolhidos como as melhores condições para o ensaio enzimático. A
melhor atividade enzimática foi observada em pH 6,0, a 60ºC. A enzima reteve 50% da atividade
após 6 horas à 50ºC.
A atividade de CMCase também foi estudada nos sobrenadantes obtidos da cultura de S.
malaysiensis AMT-3.
e cervejeiro e 1,2% (p/v) milhocina, após 4 dias de fermentação. As atividades enzimáticas
apresentaram um ótimo de temperatura a 50ºC e pH 4,0, e o extrato bruto reteve 50% da
atividade após 2 horas a 50ºC.
A atividade de protease, investigada em todos os sobrenadantes obtidos no desenho
experimental em frasco agitad
na. Todos os substratos testados foram capazes de induzir a produção de proteases, mas a
combinação farelo de trigo e extrato de levedura apresentou o melhor resultado, sendo as
melhores condições, da atividade enzimática, observadas a 37ºC, pH 7,0. Ao todo, 10 enzimas
Nascimento, R.P.
x
proteolíticas (6 serina- e 4 metalo-proteases) foram observadas nos filtrados da cultura de S.
malaysiensis AMT-3, correspondendo a proteínas com massa molecular aparente variando de 30
a 200 kDa, detectadas em SDS-PAGE corado com Comassie Blue.
Os resultados obtidos sugerem que a produção de endoxilanases pode ser conduzida por S.
malaysiensis AMT-3 utilizando resíduos agro-industriais, minimizando o impacto no custo da
produção e consequentemente contribuindo para o uso de tecnologias mais limpas.
Nascimento, R.P.
xi
SUMMARY
The streptomycetes are of great p me production, as xylanases, important
for pap
is AMT-
3. The
protease activity, assayed in all supernatants obtained in the experimental design, was
detected on Comassie Blue-stained SDS-PAGE.
otential for enzy
er, textile and food industries. The aim of the present work was the optimization of the
production of endoxylanase by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using cheap hemicellulosic
substrates. The optimization of the medium was performed in shake flasks, using a 23 factorial
design, brewer’s spent grain and wheat bran were tested as carbon sources, at 0.5% (w/v) and
2.5% (w/v) concentration, and corn steep liquor and yeast extract as nitrogen sources, at 0.1%
(w/v) and 1.2% (w/v). The fermentation systems were carried out at 200 rpm, 28ºC for 6 days.
The highest enzyme activity (45.8 U/mL) was obtained after 6 days–fermentation at 28°C using
2.5% (w/v) wheat bran and 1.2% (w/v) corn steep liquor. Using the best medium composition,
the endoxylanase production was also assayed in a 2L bioreactor. The aeration rate (0.5 and 1.5
vvm) and speed (300 and 600 rpm) were tested using a 22 factorial design. The best result for
endoxylanase production (56.5 U/mL) was observed when 300 rpm and 0.5 vvm were used,
corresponding to 1.2 fold those obtained in shake flasks. Best enzyme activity was observed at
60oC and pH 6.0. The kinetic parameters for endoxylanase activity, using a soluble xylan, were
1.56 mg/mL xylan (Km) and 1.58 µmol xylose/mL.min (Vmax), showing a high specificity and
low speed rate. One point five (w/v) oat spelts xylan and 6 min. were chosen as best conditions
for the enzymatic assay. The enzyme retained 50% of its activity after 6 hours at 50°C.
CMCase activity was also assayed in the supernatants obtained by S. malaysiens
best cellulase production (710 U/L) was obtained in brewer’s spent grain [2.5% (w/v)] and
corn steep liquor [1.2% (w/v)] after 4-days fermentation. The best enzyme activities were
observed at 50°C and pH 4.0, and the crude extract retained 50% of its activity after 2 hours at
50°C.
The
detected using SDS-PAGE containing gelatine 0.1% (w/v). All substrates tested were capable of
inducing proteases production, but the combination of wheat bran and yeast extract gave the best
results, being 37°C and pH 7.0 the best conditions for enzyme activity. Ten proteolytic enzymes
(6 serina-proteinases and 4 metalo-proteinases) were observed on of S. malaysiensis AMT-3
filtrates, corresponding to proteins of apparent molecular masses ranging from 30 to 200 kDa,
Nascimento, R.P.
xii
The results obtained suggest that endoxylanases production can be carried out by
Streptomyces malaysiensis using agro-industrial by-products, minimizing the impact of the
production, and consequently contributing for the use of cleaner technologies.
Nascimento, R.P.
xiii
ÍNDICE Agradecimentos vii
Resumo ix
o o icetos e sua Importância Biotecnológica
. Materiais e Métodos 38
Summary xi
1. Introduçã 1 1.1. Os Actin m 1
1.2. Biomassa Vegetal 3
1.2.1. Celulose 6
1.2.2. Hemiceluloses 7
1.2.3. Lignina 10
1.3. Enzimas Lignocelulolíticas 11
1.3.1. Complexo Xilanases 12
1.3.2. Complexo Celulases 16
1.4. Proteases 17
1.5. Aplicações Biotecnológicas das Xilanases, Celulases e Proteases 19
1.5.1. Xilanases 21
1.5.2. Celulases 22
1.5.3. Proteases 23
1.6. Otimização e Desenho Experimental 24
1.7. Biotecnologia e Processos Fermentativos 28
1.8. Processo de Escalonamento 34
2. Relevância e Objetivos do Trabalho 36
3
3.1. Manutenção da Estirpe 38
3.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados 38
3.3. Otimização do Processo Fermentativo em Frascos Agitados 38
3.4. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 2L 39
3.5. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 16 L 41
3.6. Cinética Enzimática 42
Nascimento, R.P.
xiv
3.7. Ensaios Analíticos 42
3.7.1. Dosagem da Proteína Total Solúvel 43
3.7.2. Determinação do pH 43
3.7.3. Atividade de Endoxilanases 43
3.7.4. Atividade de Carboximetilcelulases (CMCase) 43
3.8. Caracterização da Atividade Endoxilanásica 44
3.8.1. Determinação do Perfil de Temperatura 44
3.8.2. Determinação do Perfil de pH 44
3.8.3. Estabilidade a Temperatura 44
3.8.4. Influência de Íons Metálicos e Outros Aditivos 45
3.9. Caracterização da Atividade de CMCase 45
3.9.1. Determinação do Perfil de Temperatura 45
3.9.2. Determinação do Perfil de pH 45
3.9.3. Estabilidade a Temperatura 46
3.10. Eletroforese (Zimograma) 46
3.10.1. Endoxilanases 46
3.10.2. CMCases 47
3.10.3. Peptidases 47
Resultados 49
Discussão 90
Conclusões 113
Referências Bibliográficas 115
Produção Científica 132
Anexos 135
Nascimento, R.P. Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Os Actinomicetos e sua Importância Biotecnológica
Os actinomicetos são bactérias Gram positivas que apresentam um DNA rico em guanina
e citosina (G+C > 72%, no gênero Streptomyces e G+C de 64 a 72% no gênero Nocardia)
possuindo a capacidade de formar filamentos em algum estágio de seu desenvolvimento (Leblond
& Decaris, 1994). As colônias de actinomicetos são formadas por uma massa de hifas,
constituindo o micélio. Essa massa é formada a partir do desenvolvimento inicial de esporos,
esporângios ou fragmentos de hifas em meio sólido, constituindo primeiramente o micélio
vegetativo, de caráter hidrofílico. Crescendo verticalmente, algumas estirpes de actinomicetos
diferenciam seu micélio vegetativo em micélio aéreo, de caráter hidrofóbico, o que provoca uma
alteração nas características morfogenéticas, fisiológicas e ultraestruturais (Vobis, 1997).
Estes microrganismos se encontram distribuídos no solo, águas e outros ambientes, porém
o solo é o seu habitat mais comum (Goodfellow & Cross, 1984). Eles têm sido descritos como os
principais produtores de antibióticos no solo, e também como um dos principais grupos
microbianos produtores de enzimas de interesse comercial. Além disso, exercem um papel
importante na ciclagem de compostos orgânicos nos ambientes naturais e desempenham um
papel promissor na agricultura, visto que alguns gêneros como Frankia são capazes de fixar o
nitrogênio atmosférico em plantas não-leguminosas (Goodfellow et al.,1988).
A instabilidade genética é uma característica bastante encontrada nos actinomicetos,
podendo a freqüência de mutação chegar a pelo menos 1 em cada 103 células no gênero
Streptomyces. Assim sendo, a maioria das características fenotípicas relacionadas à diferenciação
e metabolismo secundário são geneticamente instáveis, tais como: formação de micélio aéreo,
pigmentação, esporulação, resistência a agentes genotóxicos e resistência e/ou produção de
antibióticos e enzimas (Leblond & Decaris, 1994).
Por muitos anos, os actinomicetos, principalmente os do gênero Streptomyces, foram
conhecidos como sendo os principais microrganismos produtores de antibióticos (Goodfellow et
al., 1988, Sanglier et al., 1993, Kim et al., 2000). A heterogeneidade bioquímica dos
actinomicetos, sua diversidade ecológica e sua capacidade para a produção de metabólitos
secundários os fazem um bom alvo para a produção de enzimas, desempenhando novas
Nascimento, R.P. Introdução
2
atividades e/ou especificidades (Goodfellow et al., 1988). As enzimas produzidas pelos
actinomicetos são capazes de degradar compostos nitrogenados orgânicos, carboidratos, vários
esteróides como colesterol, uma variedade de compostos aromáticos, acetileno e muitos outros.
Estudos recentes vêm apontando os actinomicetos como fontes emergentes promissoras de uma
ampla faixa de importantes enzimas de interesse industrial e ambiental, como àquelas envolvidas
na degradação de materiais lignocelulósicos (Goodfellow et al., 1988; Flores et al., 1997). A
decomposição dos resíduos lignocelulósicos pelos actinomicetos os fazem potenciais fontes para
a bioconversão de resíduos em substâncias químicas de interesse industrial (Piret & Demain,
1988).
Os actinomicetos estão adaptados a se desenvolverem em substratos sólidos. Suas fontes
primárias de carbono no solo são de baixa solubilidade e poliméricos, necessitando da secreção
de uma série de enzimas extracelulares, quando ocorre a colonização do substrato pelas hifas
(Piret & Demain, 1988). As celulases, por exemplo, são capazes de degradar a celulose, podendo
ser úteis nas indústrias têxteis e de detergentes, mas também possuem aplicações na área
ambiental, auxiliando no tratamento de efluentes da indústria de papel e celulose. Podemos citar
ainda as xilanases que são responsáveis pela degradação das xilanas, utilizadas em indústrias de
alimento e papeleira, para a fabricação de produtos dietéticos e clareamento de polpas de papel,
respectivamente (Stutzenberger & Bodine, 1992; Breccia et al., 1995). Além disso, estas
desempenham um papel importante na decomposição de hemicelulose em solos e na recuperação
de açúcares fermentáveis a partir de hemiceluloses (Belfaquih & Penninckx, 2000; Stutzenberger
& Bodine, 1998; Garg et al., 1996). Temos ainda as quitinases, que são responsáveis pela
degradação da quitina, o polímero aminado mais abundante na natureza, e encontrado em
crustáceos, fungos e insetos. Estas enzimas vem sendo utilizadas como controle biológico no
combate a fungos fitopatogênicos (Gupta et al., 1995). Já as proteases, que apresentam variadas
classes, em especial, metalo e serina proteinases, agem sobre uma gama de substratos protéicos,
sendo aplicadas na indústria do couro, tratamento de efluentes e vários processos de
biorremediação (Böckle et al., 1995; Mohamedin, 1999).
Nascimento, R.P. Introdução
3
1.2. Biomassa Vegetal
Anualmente, o uso da biomassa (alimentos, combustíveis, fibras, materiais de construção
e muitos outros produtos) gera grandes quantidades de resíduos orgânicos, tais como resíduos
agrícolas, resíduos de madeira florestal, obtidos após processamento em indústrias madereiras,
resíduos da indústria papeleira, restos e resíduos do processamento alimentar e resíduos urbanos
sólidos (Klass, 1983; Ingram & Doran, 1995). Uma variedade de problemas ambientais e sociais
e a compreensão de que fontes fósseis são limitadas, tem estimulado investigações adicionais de
novas tecnologias para converter materiais lignocelulósicos renováveis em etanol combustível
e/ou outros substituintes do petróleo, levando em consideração ser essa uma fonte alternativa de
energia barata (Ingram & Doran, 1995; Aristidou & Penttilä, 2000).
A parede celular vegetal é o maior reservatório de fonte de carbono renovável fixado na
natureza, e contém três importantes constituintes poliméricos: a celulose (fibras insolúveis de β-
1,4-glucanas, correspondendo a cerca de 30-45% do peso total), as hemiceluloses
(polissacarídeos não-celulósicos, incluindo glucanas, mananas, arabinanas, galactanas e xilanas,
correspondendo a cerca de 25-45% do peso total) e a lignina (estrutura polifenólica complexa,
correspondendo a cerca de 15 a 30% do peso total). Sendo o principal componente do suporte
estrutural, a parede celular vegetal é construída para resistir a degradação microbiana (Klass,
1983; Aristidou & Penttilä, 2000). A distribuição relativa dos componentes lignocelulósicos na
parede celular do vegetal depende da espécie do vegetal e do estágio de crescimento e
desenvolvimento do mesmo (Prade, 1995). A composição monomérica do material
lignocelulósico pode variar amplamente, dependendo da fonte da biomassa (Tabela 1). Estes
elementos não tendem a se acumular na natureza, pois sofrem degradação microbiana, como
parte integrante do ciclo do carbono (Klass, 1983; Puls & Schuseil, 1993; Aristidou & Penttilä,
2000). Em geral, a fração de carboidratos contém primariamente açúcares tipo hexose, como a
glucose e em menor quantidade manose e galactose; entretanto, a fração de pentoses é mais
significante: xilose (5– 20%) e arabinose (1– 5%). A xilose é o segundo açúcar mais abundante
na natureza após a glucose e é ainda o mais comum em resíduos hemicelulósicos de hardwood
(Aristidou & Penttilä, 2000).
Nascimento, R.P. Introdução
4
Tabela 1: Composição de diferentes biomassas vegetais com relação a presença (%) de carboidratos (pentoses C5 ou hexoses C6) e outros componentes.
Sabugo de milho
Farelo de trigo
Farelo de arroz
Casca de arroz
Fibra de bagaço-cana
Papel de imprensão
Carboidrato Glucose (C6) 39,0 36,6 41,0 36,1 38,1 64,4 Manose (C6) 0,3 0,8 1,8 3,0 - 16,6 Galactose (C6) 0,8 2,4 0,4 0,1 1,1 - Xilose (C5) 14,8 19,2 14,8 14,0 23,3 4,6 Arabinose (C5) 3,2 2,4 4,5 2,6 2,5 0,5 Total C6 40,1 39,8 43,2 39,2 39,2 81,0 Total C5 18,0 21,6 19,3 16,6 25,8 5,1 Não-carboidrato Lignina 15,1 14,5 9,9 19,4 18,4 21,0 Cinzas 4,3 9,6 12,4 20,1 2,8 0,4 Proteína 4,0 3,0 - - 3,0 - Fonte: Aristidou & Penttilä, 2000.
A degradação da parede celular vegetal por microrganismos é geralmente vista como um
processo enzimático, sendo um fenômeno complexo ainda não compreendido totalmente. Sabe-se
que certos microrganismos têm desenvolvido estratégias efetivas para invadir plantas e hidrolisar
polissacarídeos (Lequart et al, 2000). Em tecidos lignificados, a abertura da estrutura da parede
celular pode ser muito dificultada em parte pela presença de polímeros de lignina inseridos, o que
faz com que polissacarídeos se tornem menos acessíveis as celulases e hemicelulases microbianas
(Blanchette, 1995). A barreira de lignina na ligninocelulose pode ser removida pela utilização de
lignina peroxidases, deixando a estrutura mais susceptível ao ataque das celuloses e
hemiceluloses (Wong et al., 1988; Tuncer et al., 1999). Uma esquematização do arranjo
molecular da parede celular secundária do vegetal esta representada na Figura 1 (Bidlack et al.,
1992).
Nascimento, R.P. Introdução
5
Figura 1: Esquema da estrutura da parede celular secundária vegetal. Os componentes são arranjados de forma que as cadeias de celulose e hemicelulose fiquem embebidas pela lignina. pCA – ácido p-coumárico FA – ácido ferúlico BA – ácido p-hidroxibenzóico AS – ácido sinápico CA - ácido cinâmico
Fonte: Bidlack et al., 1992
Nascimento, R.P. Introdução
6
1.2.1. Celulose
A celulose, o maior carboidrato sintetizado pelos vegetais, é um polissacarídeo formado
por unidades residuais de β-D-glucose, que interagem entre si por ligações β-1,4 mantendo uma
estrutura linear e plana, sendo a celobiose, o dissacarídeo 4-O-β-D-glucopiranosil-D-
glucopiranose, a unidade repetitiva do polímero (Bayer & Lamed, 1992). A celulose é muito
rígida, e podem ser encontrados em sua estrutura cerca de 4000–8000 moléculas de glucose
conectadas por ligações β-1,4 (Aristidou & Penttilä, 2000).
Nas celuloses naturais, as cadeias se alinham de modo a formar fibrilas complexamente
organizadas, em estruturas ora cristalinas (regiões de alta ordem) ora amorfas (regiões de baixa
ordem). Estas fibrilas são estabilizadas entre si por ligações de hidrogênio inter-cadeias, que
individualmente são fracas, mas coletivamente resultam em uma força associativa considerável,
conferindo uma certa resistência à fibra celulósica (Bayer & Lamed, 1992). Outras ligações de
hidrogênio entre as cadeias adjacentes induzem-nas a interagirem fortemente umas com as outras
(Fig. 2). Desse modo, as microfibrilas se organizam em fibrilas maiores, que por sua vez são
organizadas em lamelas (finas camadas), formando uma rede de várias camadas da parede celular
do vegetal (Coughlan, 1990).
A estrutura da celulose pode ser avaliada por níveis ultraestruturais ou mesmo globais. A
nível global, a maioria das informações vem sendo obtida a partir de espectroscopia e
cristalografia. A nível ultraestrutural, a microscopia eletrônica de transmissão revela detalhes das
microfibrilas de celulose, refletindo os avanços tecnológicos nesta áera (Bayer et al, 1998).
Nos ambientes naturais, a celulose constitui cerca de 1/3 da matéria orgânica vegetal,
sendo o principal componente da parede celular em vegetais (Norkrans, 1967). Em contraste com
o amido, polímero de glucose de reserva, o papel da celulose é exclusivamente estrutural. A alta
força de tensão da celulose permite às células vegetais suportar a pressão osmótica e é
responsável pela resistência da planta ao estresse mecânico (Béguin & Aubert, 1994).
A decomposição da celulose parece depender da habilidade das enzimas responsáveis em
penetrar entre as cadeias adjacentes da fibra. O ataque às fibras de celulose é realizado pelos
microrganismos celulolíticos por intermédio das celulases, que agem em sítios onde a estrutura
do substrato é mais acessível, ou seja, onde a fibra perdeu seu aspecto reticulado (cristalino), em
proveito de um aspecto mais frouxo e amorfo (Bayer & Lamed, 1992; Béguin & Aubert, 1994).
Nascimento, R.P. Introdução
7
a
b
Região Cristalina Região Cristalina Região Amorfa
Figura 2: Esquematização da estrutura da fibra de celulose. (a) Ligações de Hidrogênio entre as microfibrilas de celulose; (b) Disposição das microfibrilas, formando as regiões cristalinas e regiões amorfas da fibra celulósica. Fonte: Bhat, 2000.
1.2.2. Hemiceluloses
As hemiceluloses são polissacarídeos não-celulósicos que são encontrados em tecidos
vegetais, compostos de polímeros complexos de carboidrato, onde as xilanas e as glucomananas
são os principais componentes. Em paredes celulares de plantas terrestres, a xilana é o
polissacarídeo hemicelulósico mais comum, representando de 20–40% do peso seco do vegetal,
sendo depois da celulose, o polissacarídeo renovável mais abundante na natureza com um alto
potencial para a degradação em produto final utilizável (Béguin & Aubert, 1994; Sunna &
Antranikian, 1997; Thomson, 1993).
Nascimento, R.P. Introdução
8
Os polímeros constituintes das hemiceluloses são de alto peso molecular, alguns
insolúveis ou mesmo associados a celulose e lignina. As hemiceluloses são também altamente
variáveis em suas estruturas, e, embora o número de ligações químicas diferentes seja limitado,
elas podem apresentar uma grande variabilidade em arranjos moleculares, podendo ser
classificadas como xilanas, arabinoxilanas, arabinanas, galactomananas, mananas,
arabinogalactana, entre outras (Fig. 3). A degradação eficiente do polímero requer uma ação
concernida de muitas enzimas que têm que trabalhar sinergisticamente (Shallom & Shoham,
2003). Como a hidrólise do polímero ocorre fora da célula, os microrganismos precisam
assegurar que pelo menos parte dos açúcares solúveis resultantes da hidrólise estarão disponíveis
para eles. Finalmente, as células necessitam de um mecanismo para sinalizar a presença do
polímero e induzir a produção das enzimas correspondentes. Juntando todos estes fatores, não
seria surpresa a natureza nos proporcionar uma espetacular variedade de estruturas modulares e
diferentes estratégias fisiológicas para degradar a parede celular vegetal (Shallom & Shoham,
2003).
De acordo com a literatura, existe uma ligação covalente entre a lignina e a hemicelulose,
provavelmente através da xilana, bem como evidências para a existência de uma outra ligação
entre arabinose e lignina, e uma ligação tipo éster entre a lignina e os ácidos glucurônicos
(Kulkarni et al., 1999). A presença de compostos fenólicos nas ligações cruzadas entre xilanas, e
entre xilanas e outros polissacarídeos também tem sido sugerida. Associações não-covalentes
entre as xilanas e outros carboidratos também podem ocorrer. As xilanas tendem a se adsorver a
celulose e a agregados por meio de ligações de hidrogênio, bem como também a outros
componentes hemicelulósicos (Thomson, 1993). As cadeias laterais determinam a solubilidade, a
conformação física e a reatividade da xilana com outros componentes hemicelulósicos e por isso
podem influenciar enormemente o modo e a extensão da clivagem enzimática, além de não
interferirem na geometria das ligações glicosídicas (Kulkarni et al., 1999).
Nascimento, R.P. Introdução
9
Xilana
Xilobiose
Galacto-glucomanana
Manobiose
Α-1,6-L-Arabinana Arabinogalactana
Figura 3: Estrutura básica dos componentes encontrados na hemicelulose. A maioria das hemiceluloses prevalentes é do grupo das xilanas, compostas por unidades de D-xilopiranosil ligados por ligações glicosídicas do tipo β-1,4. β-Mananas também são grandes polímeros dentro das hemiceluloses, onde seu esqueleto principal é composto por ligações β-1,4 entre resíduos de manose–manose ou manose–glicose, ligados randomicamente. Fonte: Shallom & Shoham, 2003
A xilana é um polissacarídeo formado por unidades residuais de β-D-xilopiranosil
interagidos entre si por ligações β-1,4, sendo o principal componente hemicelulósico depositado
durante a fase de diferenciação do xilema (Flores et al., 1997; Gregory et al. , 1998; Nascimento
et al., 2002). Os constituintes mais comuns encontrados na cadeia principal da xilana são resíduos
de acetil, arabinofuranosil e/ou glucuronil (Sunna & Antranikian, 1997). Baseado nos
substituintes comuns encontrados na cadeia principal, as xilanas são categorizadas como
Nascimento, R.P. Introdução
10
homoxilana linear, arabinoxilana, glucuroxilana e glucuroarabinoxilana. Entretanto, em cada
categoria delas existe uma heterogeneidade com respeito ao grau e natureza da ramificação. A
cadeia principal da xilana está demonstrada na Fig. 3. (Kulkarni et al., 1999).
A maioria das xilanas ocorre como heteropolissacarídeos, contendo diferentes grupos
substitutos na cadeia do esqueleto principal e em cadeias ramificadas. As homoxilanas, por outro
lado, consistem-se exclusivamente de resíduos de xilosil. Este tipo de xilana não é muito comum
em ambientes naturais e tem sido isolada de alguns tipos de grama, em caule de tabaco e em
casca da semente guar (Thomson, 1993; Sunna & Antranikian, 1997).
As xilanas de madeira existem como O-acetil-4-O-metilglucuroxilana em hardwood ou
como arabino-4-O-metilglucuroxilana em softwood (Kulkarni et al., 1999). Existem vários tipos
de hemiceluloses disponíveis no mercado, como por exemplo, xilana de madeira dura
(hardwood), xilana de madeira macia (softwood), xilana de bétula (birchwood), xilana de farelo
de aveia (oat spelts), xilana de lariço (larchwood) e xilana de gramíneas (grass), entre outras,
sendo todas extraídas de diferentes vegetais. As ligações glicosídicas encontradas em
hemiceluloses são facilmente hidrolisadas por ácidos diluídos a elevadas temperaturas, rendendo
um xarope contendo xilose e arabinose no caso de resíduos agrícolas e madeira dura ou manose,
xilose e glucose no caso de madeiras macias (Ingram & Doran, 1995).
1.2.3. Lignina
A lignina, a macromolécula aromática mais abundante da Terra, é construída a partir de
unidades de fenilpropano. Estes compostos fenólicos podem também estar envolvidos nas
ligações cruzadas entre moléculas de xilana e na ligação da xilana a outros polissacarídeos
(Tuncer et al., 1999). A lignina é encontrada na parede celular de vegetais, predominantemente
nos tecidos vasculares especializados para o transporte de líquidos em vegetais superiores, como
as gimnospermas e as angiospermas, e também em samambaias. Os precursores diretos da lignina
são os lignóis, representados pelas moléculas de coniferil, sinapil e p-coumaril (Higuchi, 1990;
Schoemaker, 1990).
Apesar de ser um composto macromolecular aromático, a lignina difere dos outros
componentes presentes na biomassa do vegetal, na medida que sua estrutura tridimensional não
possui ligações repetitivas entre os resíduos monoméricos constituintes da macromolécula.
Nascimento, R.P. Introdução
11
Pela sua complexidade estrutural, a lignina confere rigidez à parede celular, e, nas porções
encontradas na madeira, age como um agente permanente de ligação entre as células, gerando
uma estrutura resistente ao impacto, compressão e dobra (D’Almeida, 1988).
1.3. Enzimas Lignocelulolíticas
Nos últimos 10 anos, têm-se observado um crescente interesse em sistemas enzimáticos
microbianos que degradem o principal componente hemicelulósico em vegetais, a xilana. Os
organismos procariotos hemicelulolíticos têm um papel fundamental na decomposição de
materiais de origem vegetal, em especial as bactérias do gênero Bacillus, que têm sido
frequentemente isoladas de solos, feno e adubos, dentre outros (Dahlberg, Holst & Kristjansson,
1993). Além disso, tanto bactérias aeróbicas quanto anaeróbicas podem degradar hemiceluloses
presentes em efluentes de indústrias de papel e de celulose (Sunna, Puls & Antranikian, 1996;
Chen, Chen & Lin, 1997). As arqueas e linhagens de bactérias termofílicas têm sido descritas
como sendo capazes de hidrolisar polissacarídeos complexos, incluindo a xilana. Os fungos e
actinomicetos produzem, em sua grande parte, xilanases extracelulares, o que diminui o custo
com sua recuperação em processamentos utilizando fermentadores para aplicação industrial ou
mesmo em processos de purificação. Este é o caso do Streptomyces cyaneus (Wang, Mason &
Broda, 1993) e Streptomyces malaysiensis (Nascimento et al., 2003), dos actinomicetos
termofílicos Thermomonospora sp. e Saccharomonospora sp. (Curotto et al., 1994) e dos fungos
termofílicos Penicillium janthinelum, Humicola grisea var. thermoidea e Thermomyces
lanuginosus (Monti, Terezin & Jorge, 1991; Hoq et al., 1995; Damaso, 2000). No entanto, a
maior parte das informações sobre enzimas xilanolíticas tem sido encontrada em publicações
sobre a aplicação de xilanases de estreptomicetos mesofílicos, no tratamento de polpas na
indústria do papel (Garg et al., 1996; Stutzenberger & Bodine, 1998). As xilanases e celulases de
actinomicetos são enzimas extracelulares induzidas, que são freqüentemente produzidas
simultaneamente (Ball & McCarthy, 1988, Nascimento et al., 2002).
Nascimento, R.P. Introdução
12
1.3.1. Complexo Xilanases
A heterogeneidade e complexidade estrutural das xilanas resultam numa abundância de
enzimas xilanolíticas com variações na especificidade, nas sequências primárias e tamanho, além
das limitações destas enzimas pela especificidade ao substrato (Collins et al., 2005). Dentre as
enzimas do complexo enzimático destacamos as β-1,4-endoxilanases (β-1,4-D-xylan
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), que despolimerizam a xilana pela hidrólise randômica do esqueleto
principal e as β-xilosidases (β-1,4-D-xyloside xylohydrolase; EC 3.2.1.37), que quebram
pequenos oligossacarídeos. Os grupamentos laterais presentes na xilana são liberados pela ação
das α-L-arabinofuranosidases, α-glucuronidases e acetilxilana esterases. Todas estas enzimas
agem cooperativamente, de modo a converter a xilana em seus açúcares constituintes (Fig. 4). A
presença de tais sistemas xilanolíticos multifuncionais é comum em bactérias e fungos (Sunna &
Antranikian, 1997; Birsan et al., 1998; Belfaquih & Penninckx, 2000; Subramaniyan & Prema,
2002).
As β-1,4-endoxilanases podem ser encontradas tanto em vegetais como em
microrganismos, incluindo as arqueas, as bactérias, os actinomicetos e os fungos (Coughlan &
Hazlewood, 1993; Nakamura, 1994, Nascimento et al., 2003). A hidrólise enzimática de
heteroxilanas vegetais envolve a ação de uma série de enzimas, na qual a β-1,4- endoxilanase é a
enzima crucial para a despolimerização completa da xilana (Biely et al., 1992, Biely, 1985).
Nascimento, R.P. Introdução
13
2 |1αMeGlA
O
HH
H
OOH
H OH
H
CH3
OOH
O
HOH
H
H
OHH
OH
O
O
OHO
HH
H
H
HOHO
HO
OH
HH
H
H
O
HO
OH
HH
H
H
O
HO
OH
HH
H
H
OOH
HO
HH
H
H
OHO
H
CH3CH3
O
O
O
-4 lβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-Xi2 |1αMeGlA
α1 |3
2 |
Arab
Ac
Ac|3
Xilβ1-4Xilβ1-
endo -1,4-β−xilanase (E.C. 3.2.1.8)
β−xilosidase (E.C. 3.2.1.37)
α−glucuronidase (E.C. 3.2.1)
α−L- arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55)
acetilesterase (E.C. 3.1.1.6)
Figura 4: Estrutura da xilana e os sítios de ataque das enzimas do complexo xilanolítico. O esqueleto principal é composto por resíduos de xilose ligados por ligações β-1,4. Ac.: grupo acetil α-araf.: α-arabinofuranose α-4-O-Me-GlcUA.: ácido α-4-O-metilglucurônico pcou.: ácido p-coumárico fer.: ácido ferúlico Fonte: Milagres et al., 2005
A maioria das β-1,4-endoxilanases hidrolisam as ligações glicosídicas internas ao longo
do esqueleto principal da heteroxilana, resultando num decréscimo no grau de polimerização
(DP) do substrato. O ataque ao substrato não é aleatório, e as ligações, para serem hidrolisadas,
dependem da natureza do mesmo. Durante a hidrólise inicial da xilana os principais produtos
formados são xilooligossacarídeos, os quais com a continuidade da hidrólise serão hidrolisados a
xilotriose, xilobiose e xilose (Sunna & Antranikian, 1997; Silveira et al., 1999).
As β-D-xilosidases são exoglicosidases que hidrolisam pequenos xilo-oligossacarídeos e
xilobiose de terminais não-redutores, liberando xilose (Sunna & Antranikian, 1997). São
Nascimento, R.P. Introdução
14
produzidas por uma variedade de fungos e bactérias, podendo ser intra ou extracelulares, ou ainda
ligadas à membrana, dependendo do microrganismo produtor e do tempo de cultivo. Estas
enzimas podem ser proteínas mono ou diméricas, com valores de massa molecular na faixa de 60
a 360 kDa. A maioria das β-xilosidases, segundo estudos aprofundados, são completamente
inibidas pelo seu próprio produto de hidrólise, a xilose (Coughlan & Hazlewood, 1993; Sunna &
Antranikian, 1997).
Apesar da importância desempenhada pelas arabinosidases na hidrólise da xilana,
somente algumas enzimas têm sido isoladas e caracterizadas. As α-L-arabinofuranosidases têm
sido isoladas de várias fontes, incluindo plantas, bactérias e fungos. Existem dois tipos de
arabinosidases, aquelas de ação exo, como é o caso da α-L-arabinofuranosidase, que é ativa
contra p-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo e arabinanas ramificadas, e aquelas de ação endo,
como o da 1,5-α-L-arabinase, que é ativa somente em arabinanas lineares (Coughlan &
Hazlewood, 1993; Sunna & Antranikian, 1997).
As α-D-glucuronidases hidrolisam as ligações α-1,2 entre o ácido glucurônico e resíduos
de xilose em glucuroxilanas. Apesar do papel desempenhado pela α-glucuronidases na
biodegradação da xilana, poucas enzimas têm sido detalhadamente descritas (Sunna &
Antranikian, 1997). A bactéria Fibrobacter succinogenes, isolada de rúmen, produz uma α-
glucuronidase que é incapaz de liberar ácido 4-O-metilglucurônico da xilana intacta. Esta enzima
é ativa contra fragmentos de glucuroxilanas de baixo peso molecular resultantes da hidrólise da
xilana por endoxilanase (Sunna & Antranikian, 1997).
A acetil-xilana esterase, libera substituintes de ácido acético diretamente da xilana
polimérica, removendo o grupamento O-acetil das posições C-2 e C-3 dos resíduos de xilose na
acetil-xilana. A troca da solubilidade dos polissacarídeos hemicelulósicos efetuada pela redução
da interação nas cadeias laterais também pode ser iniciada pela ação de enzimas que clivam as
cadeias laterais, tal como a acetil-xilana esterase (Puls & Schuseil, 1993). Outras esterases, como
por exemplo, a ácido fenólico esterase, fazem parte do sistema xilanolítico produzido por alguns
microrganismos, removendo o ferulato da cadeia principal da xilana (Coughlan & Hazlewood,
1993).
Muitas estruturas de xilanases estão descritas na literatura, e o mecanismo de ação de
várias β-1,4-endoxilanases tem sido estudado utilizando tanto a cinética como, técnicas de análise
dos produtos finais de hidrólise (Li et al., 2000). As enzimas xilanolíticas possuem diferentes
Nascimento, R.P. Introdução
15
propriedades e especificidades, mesmo quando são da mesma fonte. Vários microrganismos são
capazes de produzir múltiplas xilanases, adicionalmente as outras enzimas do complexo
xilanolítico (Biely et al., 1997; Sunna & Antranikian, 1997; Collins et al., 2005). Estas, por sua
vez, apresentam diversas propriedades fisico-quimicas, estruturais, atividades específicas, bem
como a sobreposição de especificidades e desse modo aumentando a eficiência e extensão da
hidrólise, como também a diversidade e complexidade das enzimas. Alguns exemplos clássicos
de microrganismos que produzem isoenzimas xilanolíticas são Aspergillus niger, que produz 15
xilanases extracelulares, e o Trichoderma viridae, que secreta 13 xilanases (Collins et al., 2005).
Entretanto, a habilidade de sintetizar várias xilanases com especificidades sobrepostas, parece
trazer para o organismo a vantagem de garantir reservas de carbono e energia a partir da xilana e
também dos diferentes tipos de associações com outros polímeros (Bastawde, 1992; Coughlan,
1992). Contudo, as bactérias além da capacidade de secretar multiplas xilanases, também podem
produzir uma estrutura análoga ao celulossoma, o xilanossoma. Os xilanossomas são discretos,
multifuncionais, representando um papel chave na degradação de hemiceluloses. O complexo
xilanossomo extracelular B de Butyvibrio fibrisolvens H17c existe como uma proteína
multifuncional agregada com uma massa molecular aparente superior a 669 kDa (Jiang et al.,
2005; Pohlschröder & Leschine, 1994). Entretanto, existem poucos dados na literatura sobre as
propriedades fisico-químicas destes complexos xilanolíticos.
Baseados na similaridade das seqüências de ácidos aminados, as xilanases podem ser
divididas em 2 grandes famílias de glicosil hidrolases, a família 10 (F) e a 11 (G). A relação das
enzimas destas famílias pode ser demonstrada pelo alinhamento pareado da seqüência da proteína
ou pela utilização do programa BLAST, para discernir a similaridade entre as seqüências. Nas
pesquisas BLAST utilizando seqüências de xilanase, as Famílias 10 (F) ou 11 (G) identificam
conjuntos de enzimas que sejam mutualmente exclusivas (Jeffries, 1996). Pesquisas BLAST com
seqüências da Família 10 (F) têm grandes similaridades a β-1,3 e β-1,4-glucanase (Jeffries, 1996;
Ali et al., 2001). A Família 10 (F) das xilanases consiste de um domínio ligante de celulose e um
domínio catalítico conectado por uma região ligante flexível. A Família 11 (G) é composta de
endoxilanases de baixo peso molecular altamente específicas, encontradas em procariotos e
eucariotos, onde a identidade das seqüências varia de 40-90% (Törronen & Rouvinen, 1997).
Um dos sistemas xilanolíticos melhor caracterizado em termos de isoformas de β–1,4–
endoxilanases é o de Streptomyces lividans. Este microrganismo produz um sistema que é
Nascimento, R.P. Introdução
16
composto de 3 β–1,4–endoxilanases codificadas por 3 diferentes genes xln, designados xlnA, xlnB
e xlnC. XlnA faz parte da família F das glucanases, que mostra atividade de exoxilanase e
endoglucanase. Por outro lado, XlnB e XlnC são membros da família G (Biely et al., 1993;
Sunna & Antranikian, 1997). Vários fatores podem ser responsáveis pela multiplicidade das
xilanases. Isto inclui processamento diferencial do RNAm, modificação pós-secrecional por
digestão proteolítica e modificação pós-traducional como glicosilação e autoagregação. As
múltiplas xilanases podem ser um produto de diferentes alelos do mesmo gene. Entretanto,
algumas das xilanases múltiplas são resultados de genes independentes, ou seja, de genes que não
estão relacionados entre si (Biely, 1985).
1.3.2. Complexo Celulases
A estrutura da celulose pode ser clivada por intermédio de enzimas que reconhecem
ligações β-1,4 entre moléculas de glucose, denominadas celulases (Aristidou & Penttilä, 2000).
As celulases são membros da família de glicosil hidrolases, que hidrolizam oligossacarídeos e/ou
polissacarídeos (Bayer et al., 1998). As etapas envolvidas na degradação microbiana da celulose
ainda não estão totalmente esclarecidas. Sendo a célula microbiana impermeável à molécula
polissacarídica, esta deve ser clivada pela ação das celulases, sintetizadas intracelularmente e
liberadas para o meio extracelular (Ghosh & Ghosh, 1993). As celulases são produzidas como um
sistema multienzimático, compreendendo basicamente 3 enzimas que agem sinergisticamente na
hidrólise da celulose: endoglucanases (E.C. 3.2.1.4), que clivam randomicamente o polímero de
celulose, alterando rapidamente o grau de polimerização da celulose, as celobiohidrolases (E.C.
3.2.1.91), que hidrolizam o polímero nos terminais não-redutores, liberando celobiose e as
celobiases (β-glucosidase, E.C. 3.2.1.21) que são responsáveis pela clivagem de pequenas cadeias
de celooligossacarídeos e celobiose a glucose, utilizada nas vias metabólicas do microrganismo
(Wood & Garcia-Campayo, 1990; Pérez Pons et al., 1995; Aristidou & Penttilä, 2000; Cao &
Tan, 2002).
As celulases são enzimas modulares que são compostas independentemente do formato
(α/β), unidades estruturais e funcionalmente discretas, referidas tanto como domínios como
módulos (Bayer et al., 1998). A hidrólise da celulose é acompanhada tanto pela inversão quanto
pela retenção da configuração do carbono anomérico, onde em ambos os casos, é catalisada
Nascimento, R.P. Introdução
17
primariamente por 2 grupos carboxilas localizados no sítio ativo da enzima. As celulases
bacterianas e fúngicas usualmente compreendem 2 ou mais domínios estruturais e funcionais, tal
como um domínio catalítico associado ao domínio celulose-ligante (CBD) comumente
organizados em enzimas de sistemas não complexados de organismos aeróbios, e um domínio
catalítico associado a um domínio dockerin, responsável pelo complexo celulosomo, comumente
organizado em enzimas com sistemas complexados de alguns organismos anaeróbios (Ohmiya et
al., 1997, Bayer et al., 1998). Em adição, muitas celulases incluem um domínio homólogo a
camada S (SLH), domínio fibronectina III, domínio NodB-like e varias regiões com funções
desconhecidas. Estes domínios são frequentemente conectados por sequências ligantes
enriquecidas em ácidos pro e hidroxiaminos (Treonina e Serina). Dentre os vários domínios, os
domínios catalítico e celulose-ligante são geralmente reconhecidos por serem importantes para a
hidrólise da celulose (Tomme et al., 1995, Ohmiya et al., 1997).
1.4. Proteases
As proteases (peptidases) são uma classe única de enzimas que catalisam a hidrólise das
proteínas através da clivagem de ligações peptídicas. De acordo com a nomenclatura enzimática,
as proteases são classificadas no subgrupo 4 do grupo 3 das hidrolases (International Union of
Biochemistry, 1992). Entretanto, devido a imensa diversidade de ação e estrutura, as peptidases
não obedecem facilmente ao sistema de classificação e nomenclatura criado para as enzimas em
geral. Tal fato tem gerado esforços para o desenvolvimento de outras formas de classificação para
este grupo em particular. Três critérios estão atualmente em uso para a classificação das
peptidases: a reação catalisada, a natureza química do sítio catalítico e a relação evolucionária
revelada pela sua estrutura. De acordo com a nomenclatura sugerida pelo sistema MEROPS, as
peptidases estão subdivididas em dois grupos principais dependendo do seu sítio de ação: as
exopeptidases e as endopeptidases (Rawlings et al., 2006).
As exopeptidases clivam a ligação peptídica próxima ao terminal amino ou carboxi das
cadeias polipeptídicas presentes no substrato. Baseado no seu sítio ativo de ação, no terminal C
ou N, elas são classificadas como carboxi ou aminopeptidases, respectivamente. As
aminopeptidases atuam no terminal N livre da cadeia polipeptídica e liberam um resíduo único de
aminoácido, ou dipeptídeo, ou um tripeptídeo. Elas ocorrem numa ampla variedade de espécies
Nascimento, R.P. Introdução
18
microbianas incluindo bactérias e fungos, em geral intracelularmente (Morihara & Tsuzuki,
1971). As carboxipeptidases atuam no C terminal de uma cadeia polipeptídica e liberam um
aminoácido simples ou um dipeptídeo, e podem ser divididas em 3 grupos maiores: serina-
carboxipeptidases, metalo-carboxipeptidases e cisteína-carboxipeptidases (Rao et al., 1998).
As endopeptidases clivam as ligações peptídicas nas regiões interiores da cadeia
polipeptídica distante do terminal amino ou carboxi. A clivagem proteolítica de ligações
peptídicas é uma das modificações mais freqüentes que ocorre nas proteínas. A presença de um
aminoácido livre e de um grupo carboxi tem uma influência negativa na atividade enzimática
(Priest, 1977; Rawling et al., 2006). Baseado no grupo funcional presente no sítio ativo, as
endopeptidases são classificadas em 6 grupos com base na seqüência de aminoácidos
provenientes como: glutâmico-peptidase, serina-peptidases, cisteína-peptidases, aspártico-
peptidases e metalo-peptidases.
As serina-peptidases são caracterizadas pela presença de um aminoácido serina no seu
sítio ativo. Elas são numerosas e amplamente distribuídas entre os vírus, bactérias e eucariotos,
sugerindo que elas são vitais aos organismos. Elas podem ser classificadas em 3 grupos, baseados
principalmente na sua preferência primária ao substrato: o tipo tripsina que cliva após resíduos
positivamente carregados, o tipo quimiotripsina que cliva após grandes resíduos hidrofóbicos e o
tipo elastase, que cliva após pequenos resíduos hidrofóbicos (Rao et al., 1998). Ja as metalo-
peptidases são as proteases mais diversas em relação ao sítio catalítico e ao mecanismo de ação,
diferindo sutilmente das demais peptidases. Elas dependem da presença de ligações de cátions
divalentes e podem ser inativadas por diálise ou pela adição de agentes quelantes. Elas incluem
enzimas de uma variedade de origens tais como as colagenases de organismos superiores, toxinas
hemorrágicas de venenos de cobras e termolisina de bactérias (Rao et al., 1998).
Devido a sua ocorrência em todas as formas de vida, as peptidases são importantes na
condução de funções metabólicas e regulatórias, e apresentam um papel crítico em muitos
processos fisiopatológicos tendo inclusive sido cogitadas como fatores de virulência numa
variedade de doenças causadas por microrganismos patogênicos (Brown, 1994). Os
microrganismos representam uma excelente fonte de enzimas por possuírem várias características
como ampla distribuição na natureza, crescimento rápido, espaço limitado para o cultivo, ampla
diversidade bioquímica e susceptibilidade a manipulação genética, propiciando toda uma geração
de novas enzimas com propriedades alteradas. O crescente interesse por enzimas microbianas
Nascimento, R.P. Introdução
19
deve-se a falta de habilidade das peptidases de origem vegetal e animal em atender a demanda do
mercado mundial. Além deste fato, as peptidases microbianas possuem quase todas as
características desejadas para aplicações biotecnológicas (Rao et al, 1998).
As enzimas proteolíticas sintetizadas por microrganismos têm se tornado um atrativo para
pesquisas devido a sua ampla aplicação nas diferentes áreas da indústria e medicina, bem como
pela sua participação no metabolismo microbiano. Elas têm sido utilizadas nas indústrias do
couro, farmacêutica e de alimentos, na hidrólise de substratos utilizados na preparação de meios
microbiológicos e na alimentação parenteral, preparação de detergentes e em cosméticos. Na
medicina, preparações enzimáticas são particularmente importantes para a limpeza de
queimaduras, na remoção de tecidos necrosados e para lise de coágulos sanguíneos (Landau &
Egorov, 1996).
Os estreptomicetos produzem uma variedade de peptidases extracelulares, incluindo
serina, metalo, endopeptidases, amino e carboxipeptidases com especificidade por vários
substratos, alem de produzirem também vários inibidores de peptidases (Chandrasekaran & Dhar,
1987). As várias peptidases obtidas de estreptomicetos, como as serina-peptidases de S.
exfoliatus, serina e metalo-peptidases de S. lactamdurans e serina-peptidase de S. pactum, estão
envolvidas na assimilação de fontes protéicas de nitrogênio, na degradação de micélio aéreo, em
processos de esporulação e na produção de antibióticos (Ginther, 1979; Kim & Lee, 1996). Como
na maioria das peptidases microbianas, a secreção dessas enzimas proteolíticas extracelulares em
actinomicetos, particularmente Streptomyces, ocorre no fim da fase logarítmica de crescimento,
geralmente coincidindo temporariamente com a produção de metabólitos ou diferenciação celular
na fase estacionária (Kim & Lee, 1996, Nascimento et al., 2005).
1.5. Aplicações Biotecnológicas das Xilanases, Celulases e Peptidases
Uma crescente necessidade de preparações enzimáticas, a partir de fontes diferentes das
clássicas, vem estimulando a busca no universo microbiano (Peczynsha-czoch & Mordarski,
1988). Atualmente, as enzimas são comumente utilizadas em muitas aplicações industriais, e a
demanda por enzimas mais estáveis, altamente ativas e específicas está crescendo rapidamente.
Estimou-se em 1995, que a venda mundial de enzimas industriais superou a quantia de 1 bilhão
de dólares, enquanto que o mercado mundial para enzimas industriais é esperado ser em torno de
Nascimento, R.P. Introdução
20
1,7 a 2,0 bilhões de dólares para o ano de 2006, podendo ser cada vez maiores. De acordo com
dados da literatura, as enzimas industriais têm realmente atingido um mercado de 1,6 bilhões de
dólares. Interessantemente, 60% da fonte do mercado mundial das enzimas industriais se
encontra na Europa e os 40% restantes nos EUA e Japão. Aproximadamente 75% das enzimas
industriais são hidrolases, onde as carbohidrolases são o segundo maior grupo das hidrolases
industriais (Demain, 2000, Bhat 2000).
O estudo na área de biotecnologia das celulases e hemicelulases teve início nos anos 80,
primeiramente em rações animais, e depois aplicações nas indústrias alimentícias.
Subsequentemente, estas enzimas foram utilizadas nas industrias têxtil, lavanderia, bem como nas
indústrias de papel e celulose. Durante as últimas duas décadas, o uso de celulases e
hemicelulases tem aumentado consideravelmente, especialmente nas indústrias têxtil, alimentícia,
panificação, vinho, bem como nas indústrias de papel e celulose (Godfrey & West, 1996; Uhlig
1998, Bhat 2000). Hoje em dia, estas enzimas contabilizam uma fatia aproximada de 20% do
mercado mundial de enzimas, sendo a maioria produzida por Aspergillus e Trichoderma (Bhat
2000). As celulases, hemicelulases e peptidases tem um amplo potencial de aplicações nas
diversas áreas industriais.
Nascimento, R.P. Introdução
21
1.5.1. Xilanases
INDÚSTRIA APLICAÇÃO FUNÇÃO REF.
Processamento de frutas e vegetais, produção de
vinho, cervejaria
Sucos de frutas e vegetais, néctares e purês, óleos (azeite de oliva, óleo de milho) e vinhos.
Melhorar a maceração e clarificação dos sucos, redução da viscosidade. Melhorar o rendimento da extração e filtração, desempenho do processo e qualidade do produto
Collins et al. 2005, Bhat 2000, Galante et al. 1998b, Wong & Saddler 1993.
Panificação Produtos derivados do pão Melhorar a elasticidade e a força da massa do pão, permitindo desse modo, facilitar a manipulação, aumentar o volume do pão e textura do pão melhorada.
Dutron et al. 2004, Bhat 2000, Maat et al., 1992
Ração Animal Ração monogástrica (aves domésticas e suínos) e ruminante
Diminuição do teor de polissacarídeos não amiláceos, reduzindo desse modo a viscosidade intestinal e melhorando a utilização de proteínas e amido. Melhorar o desempenho animal, aumentando a digestabilidade e o valor nutritivo de alimentos de dificil digestão (cevada e trigo).
Bhat 2000, Mathlouthi et al. 2002
Polpa e Papel Biobranqueamento de polpas Kraft, Polpagem biomecânica, Biomodificação das fibras, Biodescoloração
Redução do consumo de cloro e descargas tóxicas, Facilitação do processo de polpagem e redução do uso de métodos mecânicos de polpagem, reduzindo o consumo de energia, Melhoramento da fibrilação e das propriedades de drenagem da polpa, melhorando a eficiência do processo e a força do papel, Facilita o processo de descoloração e redução do uso de álcalis.
Collins et al. 2005, Beg et al. 2001, Viikari 1994, Bhat 2000, Pala et al. 2004
Amido Separação do glúten Redução da viscosidade, melhora a aglomeração do glúten e a eficiência do processo.
Frederix et al. 2003
Têxtil Maceração do linho, rami, cânhamo
Maceração enzimática, redução e substituição dos métodos químicos de maceração
Beg et al., 2001, Sharma 1987.
Biorremediação / Bioconversão
Tratamento de efluentesagrícolas, municipais e da indústria de alimentos
Tratamento e Reciclagem de efluentes. Produção de produtos fermentáveis, combustível renovável (bioetanol) e química fina.
Mielenz 2001, Saha 2003.
Nascimento, R.P. Introdução
22
1.5.2. Celulases
INDÚSTRIA APLICAÇÃO FUNÇÃO REF.
Alimentos
Melhoramento na prensagem e extração de suco de frutas e óleos de olivas, liberando o sabor, enzimas, proteinas, polissacarídeos, amido e agar
Melhoramento na eficiência de molhagem, absorção homogênea da água pelo cereal, qualidade nutritiva de alimentos fermentados, produção de oligossacarídeos como alimentos funcionais e conversão de biomassa, rehidratação de vegetais secos e sopas;
Controlador de doenças do sistema cardíaco, como coronárias e arteriosclerose, redução do desperdício de comida
Hidrólise da celulose, diminuição da viscosidade mantendo a textura de sucos de frutas
Hidrólise parcial ou completa de celulose substituída
Liberação de antioxidantes de frutas e cascas de vegetais
Bhat 2000
Heldt-Hansen 1997
Ração Animal
Melhoramento na qualidade nutricional da ração animal e consequentemente o desempenho dos ruminantes e monogástricos
Hidrólise parcial de materiais lignocelulósicos, descascagem de grãos de cereais, hidrólise de β-glucanas, diminuição da viscosidade intestinal, melhor emulsificação e flexibilidade de materiais alimentícios
Bhat 2000
Galante et al. 1998b
Têxtil e Lavanderia
Bioestonagem do tecido denim; produção de sabão em pó de alta qualidade e não-poluente
Biopolimento de algodão e tecidos não-denim
Remoção do excesso de corantes do tecido denim; amaciar a tela de algodão sem danificar a fibra
Remoção do excesso de microfibrilas da superfície do algodão e tecidos não-denim
Bhat 2000
Galante et al. 1998a
Papel e Celulose Polpagem biomecanica; modificação das propriedades das fibras; descoloramento de fibras recicladas
Modificação mecânica da polpa grossa e das propriedades da força da folha de mão; hidrólise parcial de carboidratos e liberação do corante da superficie da fibra
Bhat 2000
Nascimento, R.P. Introdução
23
1.5.3. Peptidases
INDÚSTRIA APLICAÇÃO FUNÇÃO REF.
Detergentes / Lavanderia
Remoção de resíduos protéicos em lentes de contato, dentadura, tecidos e pratos
Combinada com lipases, celulases e amilases, atuam de forma mais eficiente na hidrólise de manchas proteináceas em tecidos e pratos (serina peptidase)
Rao et al. 1998
Curtume Remoção de couro animal e pele assistida por proteases alcalinas
Hidrólise seletiva de constituintes não-colágenos da pele e remoção de proteínas não-fibrilares, como albumina e globulinas (elastina e querastina)
Rao et al. 1998
Biorremediação Remoção de residuos protéicos (penas, chifres, pelos)
Conversão de resíduos em biomassa aproveitável, proteina animal concentrada ou aminoácidos obtidos de hidrólise parcial (endopeptidases)
Rao et al. 1998
Alimentícia Fabricação de queijos
Remoção do glúten do trigo, melhoramento da extensibilidade e força da massa do pão
Hidrólise de ligações peptídicas específicas (Phe105-Met106) para gerar para-k-caseína e macropeptídeos, preferencialmente realizada pela quimosina (aspártico peptidase)
Hidrólise limitada do glúten do trigo, melhorando a expansão e resistência da massa, além de reduzir o tempo de mistura, resultando em pães mais volumosos (endo e exopeptidases)
Rao et al. 1998
Luecke et al. 1996
Anwar & Saleemuddin 1998
Farmacêutica Tratamento de queimaduras e feridas
Auxiliar digestivo
Tratamento de leucemia
Hidrólise parcial da fibra colágena, diminuindo o tempo e melhorando as condições de recuperação (colagenase)
Correção, via oral, em indivíduos com distúrbios nas enzimas líticas do trato digestivo (tripsina e quimotripsina)
Remoção de resíduos de asparagina nos diferentes linfócitos (asparaginase)
Rao et al. 1998
Chiplonkar et al. 1985
1.6. Otimização e Desenho Experimental
O método de desenho experimental pode ser amplamente encontrado em diversas
áreas, sendo uma ferramenta criticamente importante na engenharia para aumentar o
desempenho de processos de produção (Montgomery, 1997). A pronta aplicação de técnicas
de desenho experimental pode resultar em: (i) rendimento do processo aumentado; (ii) tempo
de desenvolvimento reduzido; (iii) custos totais reduzidos; (iv) variabilidade reduzida e
conformidade mais próxima do requerimento alvo (Montgomery, 1997).
Em um experimento de caracterização, usualmente determina-se as variáveis do
processo que afetam a resposta. A etapa mais lógica a seguir será a otimização, para a qual é
necessário determinar a região de importância em que os fatores podem dar uma melhor
resposta (Montgomery, 1997). A otimização pode ser dividida em estágios que caracterizam-
se por: (i) definição da função objetivo (resposta), podendo ser observado um ou mais
critérios; (ii) determinação dos fatores (variáveis) que apresentam influências significativas
sobre a resposta que deseja-se otimizar; (iii) otimização propriamente dita, isto é, procurar a
combinação dos valores dos fatores selecionados que resultem na melhor resposta
(maximização ou minimização).
Um procedimento criterioso para a otimização deve envolver as seguintes etapas de:
(i) Realização de experimentos de varredura para caracterizar as variáveis do sistema, usando
um planejamento fatorial; (ii) Localização da região ótima ou ideal usando o método simplex;
(iii) Certificação e/ou ajuste fino da região ótima, usando planejamento fatorial e/ou superfície
de respostas, dependendo de quão apurados se desejam os resultados (Eiras et al., 1994;
Fisher, 1935).
Muitos experimentos envolvem o estudo de efeitos de 2 ou mais fatores. Geralmente,
os desenhos fatoriais são mais eficientes para este tipo de experimento. O planejamento
fatorial tem sido muito aplicado em pesquisas básicas e tecnológicas e é classificado como um
método do tipo simultâneo, no qual as variáveis de interesse que realmente apresentam
influências significativas na resposta são avaliadas ao mesmo tempo (Routh et al., 1977). Para
realizar um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem estudadas e efetuam-se
experimentos em diferentes valores destes fatores. A seguir, um exemplo demonstrará
experimentos realizados para todas as combinações possíveis dentro dos níveis selecionados
(Barros Neto et al., 1995; Brereton 1987; Montgomery, 1997).
De um modo geral, o planejamento fatorial pode ser representado por ba, no qual "a" é
o número de fatores e o "b" é o número de níveis escolhidos. Em função do número de fatores
e de níveis, o planejamento fatorial pode ser indicado como sendo 2³, quando são estudados 3
variáveis, sugerindo que o número de experimentos diferentes sejam 8.
Em geral, os planejamentos fatoriais do tipo 2ª são os mais comuns. Um dos aspectos
favoráveis deste tipo de planejamento é a realização de poucos experimentos. Entretanto, a
utilização de um número reduzido de níveis não permite explorar de maneira completa uma
grande região no espaço das variáveis. Entretanto podemos observar tendências importantes
para a realização de investigações posteriores. Contudo, alguns cuidados devem ser
observados para que se possa obter o máximo de informação na realização do planejamento
fatorial. As replicatas devem ser repetições autênticas, devendo representar adequadamente o
espaço experimental no qual o planejamento fatorial foi desenvolvido. Outro cuidado a ser
observado refere-se à realização dos experimentos. É importante que todos os ensaios e
replicatas previstos no desenvolvimento do fatorial sejam realizados de forma aleatória. Estes
cuidados visam evitar distorções estatísticas que possam comprometer a qualidade dos
resultados obtidos e dos efeitos calculados para as variáveis estudadas.
Nos planejamentos experimentais em que as variáveis são exploradas em 2 níveis é
comum codificá-los usando os sinais (+) e (-). A atribuição destes sinais aos níveis superiores
ou inferiores é feita de forma arbitrária e não interfere na realização dos experimentos ou
interpretação dos resultados, além de permitir esquematizar o planejamento na forma de
matrizes. Os efeitos são definidos como "a mudança ocorrida na resposta quando se move do
nível baixo (-) para o nível alto (+)" e podem ser classificadas em duas categorias: efeitos
principais e efeitos de interação. Para o cálculo dos efeitos, além da codificação das variáveis
utilizando os sinais (+) e (-), é necessário incluir mais colunas na matriz de planejamento. O
conteúdo das novas colunas representa o efeito de interação entre as variáveis e é obtido
levando-se em consideração os sinais já atribuídos às variáveis envolvidas, como se fosse uma
operação matemática de multiplicação. A resposta seria, por exemplo, o rendimento de uma
planta piloto industrial.
O efeito principal é calculado como a média dos efeitos individuais e permite definir
qual o efeito médio da variável examinada sobre as condições das demais variáveis, usando a
Tabela de Coeficientes em Contrastes [sinais (+) e (-)]. Matematicamente o efeito principal
pode ser representado por:
Efeito Principal = 2 (Σy+ - Σy-) / (ba)
Onde: y corresponde a média dos efeitos individuais da medida, (+) e (-) corresponde ao nível
alto e nível baixo e ba corresponde ao número total de experimentos do planejamento.
Pode-se demonstrar que, para um fatorial do tipo 2ª, a estimativa da variância dos
efeitos pode ser dada por:
Onde: n corresponde ao número de replicatas de cada conjunto, a é o número de fatores e S² é
a estimativa amostral da variância da população.
Assumindo-se que existem n replicatas para cada um dos 2ª experimentos do
planejamento, e se yi1, yi2, yi3, ..., yin são observações do i-ésimo experimento, pode-se então
dizer que:
é uma estimativa da variância para o i-ésimo experimento, em que i=1,2,3,..., 2a e a
respectiva média. Combinando-se as estimativas dos 2ª experimentos, tem-se a estimativa da
variância total:
Considerando-se então que S² é uma boa estimativa da variância populacional σ2,
pode-se escrever que:
A interpretação do resultado pode ser facilitada com o auxílio da Figura 5, na qual
estão representadas graficamente as respostas obtidas para os experimentos realizados como
função das variáveis estudadas. Este tipo de representação é bastante utilizada e tem como
objetivo fornecer uma visão global de como as variáveis otimizadas atuam sobre a resposta do
sistema exemplificado.
Figura 5: Representação de um exemplo de fatorial 2³
O planejamento fatorial não determina valores ótimos em uma única etapa, porém este
procedimento indica satisfatoriamente o caminho a ser tomado para que se possa atingir o
objetivo proposto.
1.7. Biotecnologia e Processos Fermentativos
A fermentação é uma das tecnologias mais antigas conhecidas pelo Homem. As
capacidades fermentativas dos microrganismos ja têm sido utilizadas há milhares de anos.
Usualmente, os microrganismos degradam fontes de carbono e energia de alta massa
molecular em pequenas moléculas, convertendo-as em aminoácidos, nucleotídeos, vitaminas,
carboidratos, ácidos graxos e finalmente utilizam estes materiais básicos na construção de
proteínas, co-enzimas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos, utilizados para o seu
próprio crescimento e manuntenção (Sanchez & Demains, 2002).
Na prática, o termo fermentação pode apresentar diferentes significados. O clássico
significado bioquímico relaciona a geração de energia ao catabolismo de compostos
orgânicos, enquanto que o significado na microbiologia industrial tende a ser muito mais
amplo. Na indústria, a fermentação não é muito utilizada no seu significado clássico, mas tem
sido extendido a descrever qualquer processo químico catalisado por sistemas enzimáticos
microbianos, que por sua vez são produzidos durante a fase de crescimento do microrganismo
(Scragg, 1991; El-Mansy & Bryce, 1999). A fermentação é utilizada para produzir materiais
por uma via que poderia ser complicada ou ser muito despendiosa se métodos químicos
específicos fossem escolhidos para a síntese e, por vezes, é o único caminho a ser adotado.
Adicionalmente, centenas de enzimas têm que ser sintetizadas e agirem de uma maneira
integrada. O metabolismo tem que ser coordenado para garantir que, em qualquer momento
particular, somente as enzimas necessárias e a quantidade de cada uma delas, seja sintetizada
(Sanchez & Demain, 2002). Uma vez que, em particular, quantidade suficiente de um
determinado material é produzida, as enzimas envolvidas na etapa de formação não tardam a
serem sintetizadas e o desempenho da atividade das enzimas controlado por um número de
mecanismos regulatórios específicos. Desta forma, normalmente as células não produzem
metabólitos em excesso, mesmo em seu ambiente, permitindo uma espécie competir
eficientemente com outras formas de vida e sobreviver na natureza. Alguns dos importantes
mecanismos de controle responsáveis por estas funções são: a indução pelo substrato, a
regulação por feedback e a regulação nutricional. A modificação de tais mecanismos em
certos microrganismos tipo-selvagem, isolados da natureza e/ou a modificação feita
intencionalmente em laboratórios rendem superprodução de certos metabólitos primários e
secundários (enzimas, antibióticos). Esta é a essência da fermentação e dos bioprocessos
industriais (Sanchez & Demain, 2002).
Os bioprocessos compreendem um conjunto de operações que incluem o tratamento da
matéria-prima, o preparo de meios de propagação e produção, a esterilização, fermentação,
separação e a transformação do substrato em produto(s) por rota bioquímica. A distinção entre
bioprocessos e processos químicos esta baseado na natureza dos catalisadores utilizados em
suas reações. Os bioprocessos são conduzidos mediante ação de microrganismos, células
animais ou vegetais, ou ainda de enzimas por elas produzidas, sendo, entretanto todas as
transformações dos bioprocessos catalisadas enzimaticamente (Bon & Pereira Jr., 1999).
Algumas transformações microbianas, analogamente as reações químicas, atingem
rendimentos próximos ao máximo estequiométrico (produtos do metabolismo primário),
embora apresentando taxas globais de produção reduzidas. Outras transformações, como as
resultantes do metabolismo secundário resultam em baixos valores de rendimento e
produtividade, havendo enorme campo para avanços em ambos os casos. Os progressos serão
alcançados através da maior compreensão da fisiologia microbiana e da interação do
microrganismo com o ambiente químico e fisico no biorreator (McNeil & Harvey, 1990; Bon
& Pereira Jr., 1999).
A mistura reacional constituída de meio de cultivo (fermentação) e microrganismo é
processada em biorreatores, mantidos sob condições ideais para o microrganismo expressar o
máximo de sua atividade metabólica. No biorreator, vários fenômenos químicos, fisicos e
biológicos ocorrem concomitantemente. Assim sendo, o desenvolvimento de bioprocessos
constitui em uma das mais complexas e fascinantes áreas de atuação da Engenharia
Bioquímica. No projeto de um biorreator, devem ser levados em consideração os seguintes
aspectos: (i) a cinética microbiana (ou enzimática), (ii) o cálculo das tubulações e
equipamentos necessários para manutenção da esterilidade, (iii) as características
hidrodinâmicas do meio de fermentação, (iv) a transferência de massa de nutrientes na célula,
(v) a transferência de massa de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida e para as células,
(vi) a transferência de massa de produtos e subprodutos das vizinhanças das células para o
meio de fermentação, (vii) a transferência de calor metabólico e (viii) o controle da fisiologia
microbiana (Demain & Solomon 1986; Bon & Pereira Jr., 1999).
Atualmente, podemos observar uma grande variedade de configurações de
biorreatores, sendo os biorreatores agitados mecanicamente (STR – stirred tank reactor) os
mais estudados e mais utilizados pelas indústrias. Apesar da sua flexibilidade, os biorreatores
do tipo STR apresentam certas desvantagens, como: (i) demanda de grande aporte energético
para agitação mecânica, (ii) tendência a afetar a morfologia microbiana, e (iii) dificuldade em
fazer escalonamento. A Fig. 6 ilustra algumas das configurações possíveis que um biorreator
do tipo STR pode apresentar (Ansejo & Merchuck, 1995, Bon & Pereira Jr., 1999).
Figura 6: Configurações de biorreatores do tipo STR.
As principais subdivisões de um biorreator de bancada são: (i) componentes-base
incluem um motor de agitação e desmultiplicador, calefação e sistema de resfriamento,
bombas, controle de gás, etc; (ii) coluna de líquido e acessórios; (iii) equipamentos periféricos
(incluindo recipientes para preparação de meios de cultura); (iv) instrumentação, sensores e
controle.
Estes componentes, por sua vez, combinam para melhorar as seguintes funções: (i)
fornecer uma operação livre de contaminantes; (ii) manter uma temperatura específica; (iii)
controlar o pH da cultura; (iv) permitir o monitoramento e/ou controle do oxigênio dissolvido;
(v) permitir a alimentação de solução de nutrientes e reagentes; (vi) fornecer pontos de acesso
para inoculação e amostragem; (vii) usar encaixes e geometria relevante para escalonamento;
(viii) minimizar a perda de líquido da coluna; (ix) facilitar o crescimento de uma ampla faixa
de organismos (El Mansi & Bryce, 1999).
A forma mais utilizada de condução de um bioprocesso é a Batelada Simples. O
principal problema deste modo de operação é decorrente de fenômenos de inibição pelo
substrato, produto, ou outros metabólitos. Algumas razões podem explicar a inibição do
agente biológico por altas concentrações de substrato, como a repressão na síntese de enzimas
e a desidratação dos sistemas enzimáticos, devido à perda de água da célula ou à inibição do
transporte de nutrientes para o seu interior. Entretanto, uma maneira de contornar este
problema é através da operação denominada Batelada Alimentada, que possibilita a
manutenção da concentração desses inibidores/repressores em níveis sub-inibitórios/sub-
repressores, com implicações diretas no desempenho do biocatalisador. A batelada alimentada
é definida como um modo de operação em que um ou mais nutrientes necessários ao
crescimento celular são adicionados ao biorreator intermitentemente ou continuamente, sem
que ocorra a retirada de material durante a operação. Bateladas alimentadas podem ser
operadas sob diversas formas, através do ajuste da taxa de alimentação, utilizando-se
controles feedforward ou feedback (Bon & Pereira Jr., 1999). Uma das vantagens de se
utilizar a batelada alimentada é que uma maior variedade de meios de cultivo pode ser
utilizada sem que ocorra repressão na formação de produtos, como mencionado
anteriormente.
Uma das características da produção de enzimas extracelulares, assim como de outros
produtos decorrentes do metabolismo secundário, é que estas biomoléculas não são, em geral,
produzidas durante a fase exponencial em um biorreator operado sob batelada. Na produção
de enzimas, é comum a utilização de meios de cultivo quimicamente complexos e de baixa
solubilidade, que são metabolizados lentamente pelo microrganismo. Por sua vez, a produção
pode ser por fermentação submersa ou semi-sólida. Os processos submersos apresentam
grandes vantagens sobre os processos conduzidos em superficie sólida, como fácil
manipulação, maior volume de meio, submersão total da massa microbiana no meio de cultivo
de maneira uniforme, podendo ser ajustado para fornecer as condições ideais de crescimento e
produção. A absorção de nutrientes e excreção de metabólitos ocorre de maneira eficiente,
levando a um tempo mais reduzido de fermentação, e consequentemente, maior produtividade
(Bon & Pereira Jr., 1999).
No que diz respeito a processos biotecnológicos dentro dos casos de transferência de
massa entre fases, é particularmente importante, o fornecimento de oxigênio às células. Em
bioprocessos aerados, o oxigênio é forçado a entrar no sistema, sendo esterilizado por
filtração. O oxigênio gasoso é borbulhado, geralmente, no meio de cultivo a 1 atm, e as bolhas
de ar contêm 0,22 atm de oxigênio. Contudo, as células apenas conseguem utilizar o oxigênio
dissolvido. Porém, sua solubilidade é muito baixa, tornando a fermentação um processo
frequentemente limitado pela taxa de transferência do oxigênio da bolha de ar para o líquido
(Bon & Pereira Jr., 1999; Roseiro, 2003). A limitada solubilidade e o ávido consumo de
oxigênio pelos microrganismos durante a fermentação torna necessário o seu fornecimento
sempre constante, de forma a não se tornar limitante. Presença de oxigênio nas culturas de
microrganismos é uma constante em fermentação, sendo utilizado nas funções de
manutenção, respiração, crescimento e oxidação dos substratos. O oxigênio é transferido das
bolhas de ar para o meio líquido onde só então é transferido para a biomassa. Entretanto, o
oxigênio passa por resistências, constituídas por filmes estagnantes ao redor da interface
líquido-gás e outras interfaces. Estes filmes, camadas de moléculas fixadas por forças
eletroestáticas que sofrem alterações dinâmicas e se situam nas regiões fronteiriças dos
elementos de fermentação, constituem resistência à passagem das moléculas através deles.
Existem diversas classes de resistência, tais como (i) resistência difusional do gás para o
líquido; (ii) resistência por difusão e convecção e (iii) resistência difusional do líquido para a
biomassa (Roseiro, 2003).
Os filmes estagnantes envolvem a bolha de ar nas duas faces, envolvendo também os
filamentos agregados e bactérias unicelulares. A taxa que o oxigênio fica disponível para as
células é controlada pela passagem através dos vários filmes e a resistência à transferência
diminui com a agitação do meio. Se esta agitação for suficientemente elevada o fator limitante
do processo de transferência passa a ser o movimento das moléculas de oxigênio através da
interface gás-líquido, sendo o verdadeiro controle do fenômeno de transferência (Roseiro,
2003).
A taxa de transferência de oxigênio (KLa) é substancialmente melhorada com o
aumento da área interfacial. Durante o borbulhamento de um reator, quanto menor o tamanho
da bolha, maior a área interfacial. Para se determinar a taxa ótima de transferência de massa
de oxigênio da fase gasosa para a líquida, é importante considerar 2 aspectos: o suprimento e
a demanda de oxigênio. O suprimento está relacionado com as variáveis de ordem fisica
(vazão de ar, velocidade de agitação, grau de mistura, temperatura, geometria do biorreator,
etc.). Já a demanda está associada a fisiologia celular, no que diz respeito a quantidade de
oxigênio dissolvido necessária ao cultivo, sendo, portanto, proporcional a biomassa celular e é
definida como a quantidade de oxigênio necessária por unidade de tempo e por unidade de
volume de meio de cultivo ou em fermentação, sendo expresso matematicamente pela
seguinte expressão:
( ) XqCCaKdt
dCOLSL
L2
−−=
Onde:
dCL/dt = taxa de transferência de O2 ou taxa de absorção de O2, moles de O2/m3.h
KL = coeficiente global de transferencia de massa de O2 na fase líquida, m/h
a = área específica da superficie de interface, m-1
CS = concentração de saturação de O2 dissolvido, moles/m3
CL = concentração de O2 dissolvido no seio do meio em fermentação, moles/m3
qO2 = demanda específica de oxigênio, moles de O2/g células. h
X = concentração de células no meio em fermentação, g/m3.
De maneira prática, o ideal e o modo mais econômico seria que o suprimento fosse
igual a demanda. Entretanto, esta situação é dificil de se obter, devido a baixa solubilidade do
oxigênio em meios líquidos. As temperaturas para a produção de biomoléculas, através de
processos fermentativos, situam-se em 30ºC, na qual a solubilidade do oxigênio em água pura
é apenas 7 ppm, diminuindo notoriamente com o aumento da temperatura. Em um meio de
cultivo, a solubilidade do oxigênio diminui, em função da presença de solutos (células e
substrato). Desta forma, o potencial de transferência de oxigênio encontra-se limitado pelo
valor de CS. Adicionalmente, a alta resistência a dissolução do oxigênio resulta em um baixo
valor para a capacidade de oxigenação do biorreator (KLa). A taxa de reação em biorreatores é
diretamente proporcional à concentração da massa celular (Bon & Pereira Jr., 1999). De uma
maneira geral, a determinação do KLa em biorreatores é essencial para estabelecer a eficiência
de aeração e para quantificar os efeitos das variáveis operantes na provisão do oxigênio.
1.8. Processo de Escalonamento
A extrapolação de escala é um problema comum dentro da engenharia. O
escalonamento (scale-up) é um procedimento para o desenho e a construção de um sistema
em larga escala, baseado nos resultados experimentais de equipamentos em escala reduzida. O
escalonamento de um bioprocesso deve seguir 3 estágios: (i) escala laboratorial, na qual
estudos elementares são desenvolvidos; (ii) escala piloto, na qual as otimizações dos
processos são determinadas; (iii) produção em larga escala, na qual o processo é realizado
para fins econômicos (Ju & Chase, 1992). No processo de scale-up, são utilizados dados
obtidos de processos de otimização em escala piloto ou laboratorial, estabelecendo as
variáveis de operação em uma escala industrial. O principal objetivo é manter as condições
ambientais ótimas. Existem vários critérios para o scale-up, e a aplicação de cada um deles ou
sua combinação com outros depende de uma série de fatores, característicos de cada processo
(Mavituna, 1996). Existem alguns critérios de similaridade que são utilizados no processo de
scale-up, como:
1) similaridade geométrica: relação constante entre as dimensões lineares correspondentes nas
duas escalas;
2) similaridade cinemática: manutenção da velocidade de fluído em pontos equivalentes nas
duas escalas;
3) similaridade dinâmica: manutenção das forças aplicadas nas duas escalas;
4) similaridade térmica: manutenção da temperatura em pontos equivalentes nas duas escalas;
5) similaridade química: manutenção da composição química do meio em pontos equivalentes
nas duas escalas.
Os efeitos de natureza física das condições a serem estudadas dependem das
dimensões do biorreator. Caso a escala ampliada seja diferente da escala em que o processo
foi otimizado, as variações de resposta podem ser grandes. Por outro lado, ao se aplicar a
similaridade geométrica plena, verifica-se que a relação entre a área superficial e o volume de
um biorreator decresce acentuadamente, implicando diretamente na transferência de calor
para a esterilização do meio e do equipamento, bem como para o controle de temperatura do
processo de fermentação. Um outro exemplo que impede que a similaridade geométrica plena
seja adotada em biorreatores de mistura completa, está associado à velocidade periférica,
definida matematicamente como Vp = πDN (em que D = diâmetro do impelidor e N =
velocidade de agitação). Ao se ampliar a escala, mantendo-se a velocidade de agitação
contante, os valores deste parâmetro serão diferentes, refletindo diretamente na reologia do
sistema. Adicionalmente, cultivo com microrganismos filamentosos (fungos e actinomicetos)
ou suscetíveis a forças cisalhantes podem ter sua morfologia alterada, resultando em
diferentes respostas metabólicas ou mesmo a perda da viabilidade. Em fermentações aeróbias,
o critério mais indicado seria a manutenção do KLa. Desta forma, o sistema é projetado,
mantendo este critério de ampliação de escala, enquanto que os outros parâmetros podem
sofrer variações (Pereira Jr., 2003).
Dos quatro métodos principais para a aproximação do scale-up, um dos mais
comumente utilizados é o do rules of thumb (Kossen & Oosterhuis, 1985), nos quais os
critérios mais utilizados são: (i) entrada de energia específica constante (P/V); (ii) KLa
constante; (iii) velocidade linear constante da extremidade do impelidor; (iv) concentração de
oxigênio dissolvido constante (Mavituna, 1996). A Tabela 4 mostra a percentagem de cada
critério utilizado numa fermentação industrial. Os diferentes critérios de scale-up
normalmente resultam em condições de processo inteiramente diferentes na produção em
ampla escala. Assim é impossível manter todos os parâmetros na mesma proporção que no
outro. As consequências de tais cálculos para 2 sistemas tanque agitados similares
geometricamente com o sistema de modelo volumétrico, Vm = 10L e o sistema de produção
volumétrico, Vp = 10 m3 (escalonamento linear de fator 10), estão demonstrados na Tabela 5.
Tabela 4: Critérios de scale-up em fermentações industriais
Critérios utilizados para o Scale-up Percentagem aproximada das industrias utilizando os critérios
P/V constante 30
KLa constante 30
Vtip constante 20
pO2 constante 20 Fonte: Mavituna, 1996.
Tabela 5: Diferentes critérios de scale-up e suas consequências
Valores na escala 10 m3 (V= 10L) Critérios scale-up
P P/V N ND Re N/D
P/V igual 103 1 0.22 2.15 21.5 0.022
N igual 105 102 1 10 102 0.1
Velocidade da ponta igual
102 0.1 0.1 1 10 10-2
Número de Re igual 0.1 10-4 10-2 0.1 1 10-3
Razão entre tensão de corte e fluxo igual
108 105 10 102 103 1
Fonte: Kossen & Oosterhuis, 1985. P (potência); V (velocidade); Re (nº Reynolds); D (diâmetro)
Na prática, todos os 4 métodos são utilizados em combinação um com o outro e as
vezes o método tentativa-erro tem que ser incluido também. Para o scale-up de uma
fermentação aeróbia, o efeito do transporte de massa gás-liquido é o fator mais significativo
(Hubbard et al., 1994). O scale-up de uma fermentação aeróbia é frequentemente realizado
baseado em valores de KLa constante. O sucesso dos processos de scale-up são usualmente
confirmados por resultados experimentais que mostrem que não houve diferença entre a
fermentação conduzida em escala reduzida e em escala ampliada, sob a mesma taxa de
transferência de oxigênio.
2. RELEVÂNCIA E OBJETIVOS DO TRABALHO
A produção de xilanases a baixo custo é de extrema importância para processos
que requeiram sua utilização em larga escala. Estudos vêm sendo realizados com
substratos indutores de baixo custo, visando minimizar o impacto dos custos da matéria-
prima e do processamento na produção de xilanases, tanto em escala de bancada como
em escala piloto, utilizando biorreatores de diversas escalas.
O processo de escalonamento é importante quando se pensa em produção a nível
industrial e a comercialização do produto em questão. No que diz respeito às enzimas, a
produção em larga escala depende de vários fatores que podem onerar os custos de
produção, como a matéria-prima, a quantidade de energia aplicada ao sistema e os
custos com a recuperação do produto. O mercado mundial de enzimas cresceu cerca de
1 bilhão de euros em 1995 para quase 2 bilhões de euros em 2001 e continua
aumentando com novas enzimas e aplicações sendo descobertas. Somente para o setor
de processamento enzimático de grãos (que atualmente conta com aproximadamente 25-
28% da venda total de enzimas), é previsto um aumento de volume nos valores de
mercado de 510 milhões de euros em 2001 para 760 milhões em 2010 (Godfrey &
West, 1996; Godfrey, 2003). Atualmente, as indústrias técnicas, dominadas pelas
indústrias de detergente, amido, têxtil e álcool combustível, contabilizam a maioridade
do total do mercado de enzimas, juntamente com as enzimas da indústria de rações e
alimentos, totalizando somente cerca de 35% do mercado. Entretanto, recentemente, a
venda em algumas das principais indústrias técnicas se encontra estagnada (queda de
3% em 2001), enquanto as vendas nas indústrias de alimentos e rações estão
aumentando com uma taxa de crescimento anual prevista para aproximadamente 4-5%
(Godfrey, 2003). As hidrolases constituem 75% do mercado de enzimas industriais,
como as glucosidases (celulases, amilases e hemicelulases), constituindo o segundo
maior grupo depois das peptidases (Bhat, 2000). As xilanases constituem a maior
proporção comercial das hemicelulases, mas representa somente uma pequena
percentagem do total de venda de enzimas. Entretanto, espera-se um aumento das
vendas, visto que estas enzimas têm atraído uma crescente atenção devido ao seu
potencial para o uso em diversas aplicações. De fato, “The United States Patent” e
“Trademark Office” (www.uspto.gov) lista 468 patentes introduzidas desde 2001, com
referência a xilanases (pesquisa realizada em todos os campos). Desta forma, estudar a
produção de xilanases, objetivando a minimização dos custos de processo e visando sua
comercialização é de grande valia para o mercado mundial de enzimas.
Vários trabalhos vêm sendo realizados com xilanases no âmbito industrial, em
especial na indústria de papel e celulose. Alguns trabalhos (Nascimento et al., 2002,
Nascimento et al., 2003) sobre produção de xilanases em diferentes substratos indutores
já foram realizados com a estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3,
isolada de solo de cerrado. Estes estudos serviram de base para a presente tese, no qual
o estudo otimizado da produção de xilanases foi o objetivo geral. Sendo assim, os
objetivos específicos foram:
1. Através do sistema de análise do desenho experimental (23), investigar
diferentes substratos de baixo custo, em diferentes concentrações, para a
produção de endoxilanases por S. malaysiensis em frascos agitados.
2. Determinar as melhores condições de pH e temperatura para a atividade
xilanolítica no extrato bruto, bem como sua termoestabilidade e reação frente a
íons metálicos.
3. A partir dos resultados obtidos no item 1, melhorar as condições de produção de
endoxilanases por S. malaysiensis em biorreatores do tipo STR de capacidade
volumétrica de 2L, avaliando as condições de tempo de cultivo, aeração e
agitação, empregando Planejamento Fatorial Simples (22).
4. Estudar o processo de produção de endoxilanases em escala ampliada, utilizando
um biorreator do tipo STR de capacidade volumétrica de 16L, nas condições
pré-determinadas em biorreator de 2L.
5. Paralelamente, estudar o perfil de produção de CMCases e peptidases nos
extratos obtidos, através de ensaios enzimáticos e técnicas eletroforéticas
(zimograma).
A realização do presente trabalho só foi possível através da colaboração bilateral
Brasil-Portugal, sendo o trabalho relacionado com a parte microbiológica e fermentativa
realizado nos laboratórios de Biotecnologia de Actinomicetos, no Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, na UFRJ e a parte relacionada ao estudo em
biorreatores foi realizada na Unidade de Bioengenharia e Bioprocessos do Dep.
Biotecnologia do INETI, em Portugal.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Manutenção da Estirpe
A estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolada de solo de cerrado
(Nascimento et al., 2003), foi mantida em glicerol 20% a –20°C na forma de suspensão de
esporos padronizada (4x1010 UFC / mL), de acordo com Hopkins et al. (1985).
3.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados
Para a produção de endoxilanases em fermentação submersa, as células foram
cultivadas em meio de sais mineirais (Breccia et al., 1995) modificado contendo (g/L): 9,0
KH2PO4; 1,5 K2HPO4; 0,2 MgSO4.7H2O; 0,05 CaCl2; 0,01 MnSO4.7H2O; 0,001
ZnSO4.7H2O, suplementado com diferentes concentrações de fonte de carbono (farelo de trigo
e dreche cervejeiro) e fontes de nitrogênio orgânica (milhocina e extrato de levedura), como
descrito na Tabela 6. A descrição e composição das fontes que foram utilizadas como matéria-
prima se encontram no ANEXO I. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi cultivada em frascos
Erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL de meio descrito previamente (pH 6,8), sendo
inoculada com 50 µL de suspensão de esporos padronizada (4×109 UFC/mL), de modo que a
concentração final no meio fosse de aproximadamente 106 UFC/mL. Os frascos foram
agitados em agitador orbital, a 200 rpm durante 144 horas (6 dias), sendo retirados 2 frascos
em intervalos de 24 horas para amostragem e o volume total centrifugado (4.000 rpm/4ºC) e
filtrado. Os sobrenadantes brutos foram congelados (-20°C) para análises posteriores.
3.3. Otimização do Processo Fermentativo em Frascos Agitados
Na tentativa de otimizar as condições de produção de endoxilanase, foi adotada a
metodologia do planejamento fatorial 23. A variável dependente selecionada para este estudo
foi a atividade xilanolítica, expressa em U/mL, enquanto que as variáveis independentes
foram a concentração das fontes de carbono e de nitrogênio, e o tempo. Como fontes de
carbono, foram utilizados farelo de trigo e dreche cervejeiro, enquanto que como fontes de
nitrogênio, foram empregados a milhocina e o extrato de levedura. O planejamento fatorial
gerou um conjunto de 8 experimentos, representado na Tabela 6, sendo o programa
STATISTICA (versão 6.0) utilizado para as análises de regressão e elaboração dos gráficos de
superfície de resposta. O sistema foi conduzido em frascos de Erlenmeyers (250 mL), por
fermentação submersa, em duplicata. A melhor combinação fonte de carbono e fonte de
nitrogênio foi selecionada para estudos estatísticos (farelo de trigo e milhocina), avaliando a
superfície de resposta e a curva de pareto como ferramentas estatísticas.
Tabela 6: Esquematização do planejamento fatorial 23 com os níveis e as concentrações estudadas.
Concentração das fontes e níveis do planejamento Ensaio Fonte de Carbono
(% p/v) Fonte de Nitrogênio
(% p/v) Tempo (dias)
1 0,5 (-1) 0,1 (-1) 2 (-1)
2 2,5 (+1) 0,1 (-1) 2 (-1)
3 0,5 (-1) 1,2 (+1) 2 (-1)
4 2,5 (+1) 1,2 (+1) 2 (-1)
5 0,5 (-1) 0,1 (-1) 6 (+1)
6 2,5 (+1) 0,1 (-1) 6 (+1)
7 0,5 (-1) 1,2 (+1) 6 (+1)
8 2,5 (+1) 1,2 (+1) 6 (+1)
3.4. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 2 L
Para a produção de endoxilanases em biorreator do tipo STR de 2L (Setric Genie
Industriel – França, Fig. 7), as células foram cultivadas em meio de sais minerais modificado,
previamente descrito no item 3.3., utilizando a melhor condição prevista no planejamento
fatorial [2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) milhocina]. A estirpe S. malaysiensis AMT-3
foi cultivada em 1000 mL de meio de cultivo (pH 6,8), sendo inoculado com 1 mL de
suspensão de esporos padronizada (4×109 UFC/mL). O efeito das variáveis velocidade de
agitação e taxa de aeração na produção de endoxilanases foi estudado, utilizando
planejamento fatorial 22 (Tabela 7). A fermentação foi conduzida por 144 horas (6 dias), e a
cada 24 horas, uma alíquota de 15 mL era retirada e o volume total centrifugado (4.000
rpm/4ºC) e filtrado, sendo os sobrenadantes brutos congelados (-20°C) para análises
posteriores. Os parâmetros pH e oxigênio dissolvido foram monitorados ao longo do processo
fermentativo e os experimentos conduzidos em duplicata. O esquema do biorreator se
encontra no ANEXO 2A.
Tabela 7: Esquematização do planejamento fatorial 22 com os níveis estudados.
Ensaio Agitação (rpm) Aeração (vvm) 1 300 (-1) 0,5 (-1) 2 600 (+1) 0,5 (-1) 3 300 (-1) 1,5 (+1) 4 600 (+1) 1,5 (+1)
Figura 7: Fermentação submersa com S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%) em biorreator do tipo STR 2L (Setric Genie Industriel).
3.5. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 16 L
Para o estudo da produção de endoxilanases em sistema de maior volume, foi utilizado
um biorreator do tipo STR de 16L (Bioengineering – Fig. 8), o que promoveu um aumento de
escala de 1:8. As células foram cultivadas no meio de sais mineirais modificado, previamente
descrito no item 3.3., utilizando a melhor condição prevista no planejamento fatorial [2,5%
(p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) milhocina]. O esquema do biorreator encontra-se no
ANEXO 2B.
A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi cultivada em 10.000 mL de meio de cultivo (pH
6,8), sendo inoculado com 1 mL de suspensão de esporos padronizada (4×1010 UFC/mL).
Como parâmetros de escalonamento, foram utilizados KLa constante (fator de transferência de
massa) e velocidade linear constante da extremidade do agitador (fator geométrico). A
determinação destes parâmetros em estudos de aumento de escala foi obtida através dos
cálculos apresentados no ANEXO 2. O KLa foi determinado de acordo com o método de
desgaseificação, utilizando nitrogênio para previamente desaerar o sistema (Roseiro, 2003).
Por ser um gás inerte, o nitrogênio expulsa o oxigênio do biorreator, permitindo um aumento
da faixa de estudo do oxigênio dissolvido.
Parâmetro Geométrio (P/V)
Velocidade constante da ponta do impelidor (tip speed)
vp= π.D N
(vp)1 = (vp)2
D1 N1 = D2 N2
Parâmetro de Transferência de Massa (KLa constante)
KLa constante, mantendo a agitação (300 rpm), alterando a aeração (0,65 vvm), para o
biorreator do tipo STR de 16 litros.
Figura 8: Fermentação submersa com S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%) em biorreator do tipo STR de capacidade nominal de 16 L.
3.6. Cinética Enzimática
A caracterização da cinética enzimática da endoxilanase no extrato bruto obtido em
fermentação nos frascos agitados foi realizada analisando-se os parâmetros Km e Vmax,
necessários para se otimizar a quantificação da enzima estudada, trabalhando desta forma em
velocidade inicial e velocidade máxima. Para tanto, foram construídas curvas de progresso
que consistem da quantificação de produto formado (xilose) em diferentes concentrações do
substrato (xilana birchwood) após diferentes tempos de incubação. A partir dos dados obtidos,
foi possível determinar as curvas de tempo de incubação versus µmoles de xilose liberados
durante a reação enzimática. Os parâmetros foram determinados graficamente pelo método de
Lineweaver-Burk. Também foi estudado o efeito da diluição do extrato na atividade
enzimática, utilizando-se as diluições 1:20 e 1:50, em um intervalo de tempo de 1 a 12
minutos.
3.7. Ensaios Analíticos
Os experimentos realizados em frascos agitados foram acompanhados pelas atividades
de endoxilanase e celulase, acúmulo de proteínas totais solúveis e alteração de pH no extrato.
Além disso, foram determinados os parâmetros cinéticos para a atividade de xilanase. Nos
experimentos conduzidos em biorreator foram determinados a atividade de endoxilanase e a
alteração do pH ao longo do processo, além da dosagem de oxigênio dissovildo.
3.7.1. Dosagem da Proteína Total Solúvel
A proteína total solúvel, presente nos filtrados obtidos após crescimento em diferentes
substratos, em frascos agitados, foi estimada espectrofotometricamente pelo método de
Bradford (1976), utilizando-se a albumina sérica bovino (BSA) como padrão.
3.7.2. Determinação do pH
Os valores de pH dos diferentes extratos foram determinados com auxílio de um
potenciômetro, previamente calibrado com tampões 4,0 e 7,0.
3.7.3. Atividade de Endoxilanases
A atividade xilanolítica (ensaio otimizado) foi determinada através da medida dos
açúcares redutores produzidos durante a incubação de 0,5 mL do sobrenadante da cultura com
1,5 mL de xilana oat spelts 1,5% (p/v) em tampão citrato de sódio 50mM pH 5,3, a 50ºC
durante 6 minutos. Esta medida foi realizada espectrofotometricamente, pelo método do DNS,
onde o produto da reação foi medido a 540nm (Miller, 1959), após interrupção da reação
enzimática por imersão em gelo. Para o branco da reação, foram adotadas as mesmas condições
(Bailey et al., 1992). Uma unidade de atividade endoxilanase (U) corresponde a liberação de 1
µmol de xilose equivalente por minuto nas condições do ensaio.
3.7.4. Atividade de Carboximetilcelulases (CMCase)
A atividade celulolítica (CMCase) foi determinada através da medida dos açúcares
redutores produzidos durante a incubação de 1 mL do sobrenadante da cultura com 1 mL de
carboximetilcelulose (na forma de sal sódico) 2% (p/v) em tampão citrato de sódio 50mM pH
4,0, a 50ºC durante 30 minutos. Esta medida foi realizada espectrofotometricamente, pelo
método do DNS, onde o produto da reação foi medido a 540nm (Miller, 1959), após
interrupção da reação enzimática por imersão em gelo. Para o branco da reação, foram adotadas
as mesmas condições (Ghose, 1987). Uma unidade de atividade CMCase (U) corresponde a
liberação de 1 µmol de glucose equivalente por minuto nas condições do ensaio.
3.8. Caracterização da Atividade Endoxilanásica
A caracterização parcial da atividade xilanolítica foi realizada com o sobrenadante
obtido na melhor condição observada para a produção em frascos agitados.
3.8.1. Determinação do Perfil de Temperatura
Para o estudo do efeito da temperatura, a atividade endoxilanásica foi determinada sob
as mesmas condições descritas no item 3.6.4., analisando-se o parâmetro de temperatura de
incubação na faixa entre 20–90oC (Bailey et al., 1992). A mistura reacional foi incubada em
banho-maria, nas respectivas temperaturas, a pH 5,3, e após o tempo de reação (6 min.), a
atividade foi interrompida em banho de gelo. O teor de açúcares redutores produzidos após
atividade enzimática foi determinado pelo método DNS (Miller, 1959).
3.8.2. Determinação do Perfil de pH
Para o estudo do efeito de pH, a atividade endoxilanásica foi determinada no ótimo de
temperatura, a diferentes valores de pH, segundo o item 3.6.4., utilizando-se como tampões:
glicina-HCl 50mM (pH 2,0–3,0), citrato de sódio 50mM (pH 3,0–6,0), fosfato de sódio
50mM (pH 6,0–8,0), tris-HCl 50mM (pH 8,0–9,0) e glicina-NaOH (pH 9,0–10,0). Os
tampões foram preparados de acordo com os procedimentos descritos por Colowick & Kaplan
(1955). A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas respectivas faixas de pH, e
após o tempo de reação a atividade foi interrompida em banho de gelo. A dosagem dos
açúcares redutores produzidos após atividade enzimática foi determinada pelo método DNS
(Miller, 1959).
3.8.3. Estabilidade a Temperatura
As preparações enzimáticas foram pré-incubadas em diferentes faixas de temperatura,
em intervalos de tempo de 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22 e 24 horas, sendo a atividade
residual de endoxilanase determinada ao longo dos tempos pré-definidos. Também foi
verificada a capacidade de resistência da enzima ao processo de congelamento e
descongelamento, por um período de 6 meses.
3.8.4. Influência de Íons Metálicos e Outros Aditivos
O efeito de diferentes íons metálicos na atividade endoxilanásica foi estudado a partir
da determinação da atividade enzimática na presença da solução do respectivo sal na
concentração de 10mM na mistura reacional. O ensaio enzimático foi realizado na presença
de sais de cloreto de: magnésio (MgCl2), zinco (ZnCl2), sódio (NaCl), cálcio (CaCl2),
manganês (MnCl2), potássio (KCl), ferro III (FeCl3), bário (BaCl2) e cobre (CuCl2). Também
foi estudado o efeito do EDTA na atividade endoxilanásica. A quantidade de açúcares
redutores produzidos durante a incubação de 0,25 mL de amostra, 0,25 mL de solução de íons
(80mM) com 1,5 mL de xilana oat spelts 1,5% (p/v) nas condições ótimas de temperatura e
pH, durante 6 minutos, foi medida pelo método do DNS a 540nm (Miller, 1959), após
interrupção da reação enzimática por imersão em gelo (Marques et al., 1998).
3.9. Caracterização da Atividade de CMCase
A caracterização parcial da atividade celulolítica foi realizada com o sobrenadante
obtido na melhor condição de produção em frasco agitado.
3.9.1. Determinação do Perfil de Temperatura
Para o estudo do efeito da temperatura, a atividade de CMCase foi determinada sob as
mesmas condições descritas no item 3.6.5., analisando-se o parâmetro de temperatura de
incubação na faixa entre 20–100ºC. A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas
respectivas temperaturas, a pH 5,0, e após o tempo de reação (30 min.), a atividade foi
interrompida em banho de gelo. O teor de açúcares redutores produzidos após atividade
enzimática foi determinado pelo método DNS (Miller, 1959).
3.9.2. Determinação do Perfil de pH
Para o estudo do efeito de pH, a atividade de CMCase foi determinada no ótimo de
temperatura, a diferentes valores de pH, segundo o item 3.6.5., utilizando-se como tampões:
glicina-HCl 50mM (pH 2,0–3,0), citrato de sódio 50mM (pH 3,0–6,0), fosfato de sódio
50mM (pH 6,0–8,0), tris-HCl 50mM (pH 8,0–9,0) e glicina-NaOH (pH 9,0–10,0). Os
tampões foram preparados de acordo com os procedimentos descritos por Colowick & Kaplan
(1955). A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas respectivas faixas de pH e após
o tempo de reação, a atividade foi interrompida em banho de gelo. A dosagem dos açúcares
redutores produzidos após atividade enzimática foi determinada pelo método DNS (Miller,
1959).
3.9.3. Estabilidade a Temperatura
As preparações enzimáticas foram pré-incubadas em diferentes temperaturas (40º, 50º
e 60ºC), em intervalos de tempo de 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22 e 24 horas, sendo a
atividade residual de CMCase determinada ao longo dos tempos pré-definidos.
3.10. Eletroforese (Zimograma)
Para análise das características moleculares das enzimas presentes nos sobrenadantes
obtidos em fermentação em frascos agitados, as amostras foram aplicadas em gel sob
condições desnaturantes contendo SDS 10% (CMCases e peptidases) e sob condições não-
desnaturantes (endoxilanases). O preparo das soluções e dos géis se encontram no ANEXO 3.
3.10.1. Endoxilanases
Para a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), foi preparado um gel de
gradiente de poliacrilamida (7–20% para o gel de concentração e 5% para o gel de resolução),
contendo 0,12% de xilana oat spelts. O volume de cada amostra corrida no gel continha uma
atividade enzimática de endoxilanase de 150 mU. Paralelamente, foram injetados marcadores
de massa molecular entre 67 e 690 kDa (HMW electrophoresis calibration kit – Pharmacia
Biotech), de forma a permitir determinar a massa molecular aparente de cada enzima
detectada. A corrida foi processada a 85 mV, durante 23 horas a 4º C (Laemmli, 1970; Morag
et al., 1990; César & Mrsa, 1996).
Ao fim da corrida, o gel foi revelado para a detecção de atividade enzimática de
endoxilanase, através do zimograma. Para tal, o gel foi incubado sob as condições ótimas da
enzima, durante 6 minutos, e em seguida o gel foi mergulhado em solução de Vermelho do
Congo (0,1% p/v) durante overnight, sendo o excesso de corante removido por lavagens
sucessivas em 1M de NaCl (César & Mrsa, 1996; Morag et al., 1990). Ao final, com auxílio
de um transluminador, foram observadas zonas de hidrólise no gel indicando, assim, as
enzimas com suas respectivas massas moleculares aparentes.
3.10.2. CMCases
Para a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS–PAGE), foi preparado
um gel de poliacrilamida (10% para o gel de concentração e 3% para o gel de resolução),
contendo 0,2% de carboximetilcelulose (na forma de sal sódico) (SIGMA). O volume de cada
amostra corrida no gel continha uma atividade enzimática de CMCase de 500 mU.
Paralelamente, foram injetados marcadores de massa molecular entre 37,4 e 176,5 kDa
(Pharmacia), de forma a permitir determinar a massa molecular aparente de cada enzima
detectada. A corrida foi realizada a 150 mV, durante 2 horas a 4ºC (Laemmli, 1970; Morag et
al., 1990; César & Mrsa, 1996).
Ao fim da corrida, o gel foi revelado para a detecção de atividade enzimática de
CMCase, através do zimograma. Para tal, o gel foi incubado sob as condições ótimas da
enzima, durante 30 minutos e em seguida, o gel foi mergulhado em solução de Vermelho do
Congo (0.1% p/v) durante 10 minutos, sendo o excesso de corante removido por lavagens
sucessivas em 1M de NaCl (César & Mrsa, 1996; Morag et al., 1990). Ao final, com auxílio
de um transluminador, foram observadas zonas de hidrólise no gel, indicando assim, as
enzimas com suas respectivas massas moleculares aparentes.
3.10.3. Peptidases
Para a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS–PAGE), os
sobrenadantes estudados foram passados por filtração (0,45 µm) e então misturados com
tampão de amostra [125 mM Tris, pH 6,8, 4% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS), 20% (p/v)
glicerol e 2% (p/v) azul de bromofenol] e adicionados ao gel de poliacrilamida (Heussen &
Dowdle, 1980), numa proporção 7:3 (extrato enzimático : tampão de amostra – v/v).
Alternativamente, 10 mM 1,10-phenanthroline ou 1 mM PMSF também foram adicionados no
tampão de amostra simultaneamente à mistura com os extratos. As peptidases foram
caracterizadas parcialmente, quanto ao perfil de temperatura, termoestabilidade, perfil de pH e
classificação enzimática, onde o melhor extrato enzimático foi selecionado (farelo de trigo e
milhocina) para estes estudos.
A habilidade das peptidases em degradar diferentes fontes proteináceas também foi
estudada, em sistema SDS-PAGE (10%) contendo 0,1% de gelatina, caseina, hemoglobina ou
BSA. Após corrida eletroforética, a uma voltagem constante de 200 mV, durante 4 horas a
4ºC, as tiras do gel foram mergulhadas por 30 minutos em solução Triton-X 100 [2,5% (v/v)],
em banho de gelo, e em seguida incubadas em tampão fosfato 50 mM, pH 7,0, por 4 horas a
37ºC. Os géis foram corados por 1 hora com solução de 0.1% Comassie Blue R-250 em
metanol–ácido acético–água (30:10:60) e descoradas com o mesmo sistema solvente
(Laemmli, 1970). A massa molecular das peptidases foi calculada através da comparação com
a mobilidade de padrões de massa molecular entre 14,4 e 212 kDa (Pharmacia).
O efeito de temperatura, pH e inibidores de peptidases na atividade proteolítica
extracelular foi realizado sob as mesmas condições descritas acima, utilizando 0.1% de
gelatina como substrato (Heussen & Dowdle, 1980). O efeito da temperatura foi determinado
pela incubação das tiras dos géis por 4 horas em tampão fosfato 50 mM, pH 7.0, a 28º, 37º,
50º, 60º e 70ºC. O efeito do pH foi realizado na melhor temperatura (37ºC), por 4 horas,
variando os valores de pH utilizando os seguintes tampões (50 mM): citrato de sódio (3,0–
5,0), citrato fosfato (6.0), fosfato (7,0 e 8,0) e glicina-NaOH (9,0 e 10,0). Em adição, as
classes das peptidases extracelulares produzidas pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 foram
estudadas pela incubação dos géis por 30 minutos em solução Triton X-100 (2.5%) em banho
de gelo, na presença ou ausência de inibidor proteolítico, seguido de incubação por 4 horas a
37ºC em tampão fosfato pH 7,0, contendo ou não: 2 mM ditiothreitol (DTT) (Sigma), 10 µm
trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino) butane (E-64) (Sigma), 10 mM 1,10-
phenanthroline (Sigma), 1 mM phenyl-methyl sulfonyl-fluoride PMSF (Sigma), 0,5 mM
benzamidine (Sigma), e 1 µm Pepstain A (Sigma).
Para estudar a termoestabilidade das peptidases extracelulares, o sobrenadante bruto
foi pré-incubado a 28°, 37°, 50°, 60° e 70° C por 30, 120 e 480 minutos em tampão fosfato 50
mM, pH 7,0. Após esta pré-incubação, os sobrenadantes foram adicionados ao tampão de
amostra contendo SDS, na proporção descrita acima, e em seguida aplicados ao gel, seguindo
uma corrida eletroforética previamente descrita. Após a corrida, os géis foram mergulhados
em solução Triton X-100 [2,5% (v/v)] por 30 minutos em banho de gelo e depois incubados
em tampão fosfato 50mM pH 7,0, por 4 horas a 37ºC.
Nascimento, R.P. Resultados
49
4. RESULTADOS 4.1. Determinação dos Parâmetros Cinéticos para Endoxilanase (Km e Vmax)
A determinação dos parâmetros cinéticos de atividade enzimática são de extrema
importância para um melhor conhecimento bioquímico da enzima a ser estudada. A partir
do sobrenadante obtido em fermentação submersa de estudos preliminares, os parâmetros
cinéticos enzimáticos foram determinados. Para a construção das primeiras curvas de
progresso foram utilizadas as concentrações de xilana de 0,3%, 0,9%, 1,5%, 2,1%, 2,7% e
3,0% (p/v) e testadas 2 diluições (1:20 e 1:50) (Fig. 9). De acordo com os resultados
obtidos a diluição 1:20 foi utilizada para os ensaios posteriores.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
0 3 6 9 12 15 18
Tempo (min.)
Prod
uto
[um
ol/m
E.B. (1:50)E.B. (1:20)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
0 3 6 9 12 15 18
Tempo (min.)
Prod
uto
[um
ol/m
E.B. (1:50)E.B. (1:20)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
0 3 6 9 12 15 18Tempo (min.)
Prod
uto
[um
ol/m
E.B. (1:50)E.B. (1:20)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
0 3 6 9 12 15 18
Tempo (min.)
Prod
uto
[um
ol/m
E.B. (1:50)E.B. (1:20)
Xilana = [0,3% (p/v)] Xilana = [0,9% (p/v)]Pr
odut
o [µ
mol
/mL
] Pr
odut
o [µ
mol
/mL
]
Prod
uto
[µm
ol/m
L]
Prod
uto
[µm
ol/m
L]
Xilana = [1,5% (p/v)] Xilana = [2,1% (p/v)]
Figura 9: Efeito da diluição do Extrato Enzimátivo Bruto nas Curvas de Progresso de Atividade Endoxilanásica de S. malaysiensis AMT-3, utilizando Xilana birchwood como substrato. E.B. = Extrato Bruto
Nascimento, R.P. Resultados
50
A partir dos valores obtidos de produto (xilose) formado ao longo do tempo, pode-
se determinar a velocidade inicial atingida para cada concentração de xilana estudada (Fig.
10). Os valores resultantes do cálculo das velocidades iniciais estão apresentados na Tabela
8, e neste caso pode-se verificar que a concentração de 1,5% (p/v) foi a que forneceu os
maiores valores de produto formado, sendo o tempo intermediário de 6 minutos escolhido
como mais adequado para trabalhar em velocidade inicial de reação.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tempo (min)
Prod
uto
(mic
rom
ol x
ilose
0,3%
0,9%
1,5%
2,1%
2,7%
3,0%
Figura 10: Curvas de Progresso obtidas com o Extrato Enzimático Bruto (diluição 1:20) de S. malaysiensis AMT-3 produzido por fermentação submersa.
Tabela 8: Valores Estimados para as Velocidades Iniciais de Atividade Endoxilanásica.
Concentração de Xilana (%)
Velocidade Inicial (µmoles xilose/min)
0,3 8,97 0,9 11,49 1,5 13,10 2,1 11,03 2,7 10,54 3,0 9,75
Pro
du
to [
µm
ol x
ilos
e/m
L]
Nascimento, R.P. Resultados
51
y = 0,9887x + 0,6342R2 = 0,9554
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000
1/S [L/g]
1/V
[mL.
min
/ um
ol x
ilos
1/V
[m
L.m
in/µ
mol
xil
ose]
Figura 11: Curva de Lineweaver-Burk levantada a partir dos Valores de Concentração de Xilana [S] e de Velocidade Inicial [V].
A partir dos resultados apresentados na Tabela 8, foi possível traçar a curva de
Lineweaver-Burk (Fig. 11). Os valores referentes as concentrações 2,1; 2,7 e 3,0% não
foram utilizados para a linearização. No método de Lineweaver-Burk, o coeficiente angular
da reta corresponde a Km/Vmax, enquanto que o coeficiente linear corresponde a 1/Vmax.
Assim sendo, os valores de Km e Vmax (regressão linear) descritos na Tabela 9, revelaram
que a atividade endoxilanásica segue os padrões cinéticos de Michaelis-Menten. O erro
observado na regressão linear (< 3%) é considerado como baixo, tendo em vista a
determinação experimental dos pontos selecionados. Adicionalmente, os resultados obtidos
pelo método de Lineweaver-Burk mostraram uma inibição da atividade enzimática em altas
concentrações de substrato (2,1; 2,7 e 3,0%). A média dos valores do Km aparente estimado
para endoxilanase foi de 1,56 mg xilana/mL, denotando alta afinidade pelo substrato.
Nascimento, R.P. Resultados
52
Tabela 9: Valores Aparentes Estimados dos Pâmetros Cinéticos
Parâmetros Lineweaver-Burk Erro Relativo
Km (mg xylan . mL-1) 1,56 2,85%
Vmax (µmol xilose/mL.min) 1,58 2,85%
A influência do substrato na atividade enzimática também foi investigada. Foram
utilizados dois substratos comerciais (xilana oat spelts e xilana birchwood) para investigar
o grau de afinidade do extrato enzimático em relação ao substrato. Em virtude da baixa
solubilidade observada para o substrato xilana oat spelts, a investigação dos parâmetros de
Km e Vmax foi realizada utilizando-se uma xilana de fácil solubilidade (birchwood). Tendo
em vista os melhores resultados obtidos com xilana oat spelts (Fig. 12) e os valores
observados serem semelhantes àqueles obtidos com xilana birchwood, os ensaios
posteriores foram realizados com este substrato.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
XBW XOS
Substrato [1,5% (p/v)]
Prod
uto
[um
ol/m
Prod
uto
[µm
ol x
ilose
/mL
]
Figura 12: Efeito do substrato na atividade enzimática, utilizando uma concentração de 1,5% (p/v) de xilana comercial (XOS = xilana oat spelts / XBW = xilana birchwood), e um tempo de reação de 6 min.
Nascimento, R.P. Resultados
53
4.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados
O perfil cinético da produção enzimática em meio líquido de sais minerais,
contendo a combinação de 2 fontes de carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e
nitrogênio (milhocina e extrato de levedura), em diferentes concentrações cada uma, foi
obtido após 6 dias de cultivo sob agitação (200 rpm), a 28ºC (Fig. 13 e 14). A maior
atividade endoxilanásica (média de 45,8 U/mL) ocorreu no 6º dia de fermentação, quando o
farelo de trigo [2,5% (p/v)] foi utilizado como fonte de carbono e a milhocina 1,2% (p/v)]
como fonte de nitrogênio, de acordo com o ensaio 4 (Fig. 13B). Entretanto, quando o
extrato de levedura foi utilizado como fonte de nitrogênio, na concentração mínima [0,1%
(p/v)], a atividade máxima de endoxilanase (31,3 U/mL) foi obtida ao fim de 5 dias de
fermentação (Fig. 13A). Quando da utilização da combinação milhocina [0,1% (p/v) e
farelo de trigo [2,5% (p/v)], a atividade endoxilanásica foi considerável já ao fim de 3 dias
(15,2 U/mL), mas muito baixa após 6 dias (2,75 U/mL). Por outro lado, a utilização de
dreche cervejeiro como fonte de carbono e milhocina como fonte de nitrogênio, nas
concentrações máximas, forneceu uma produção máxima de endoxilanases (21,2 U/mL) ao
término de 6 dias (Fig. 14A), enquanto que a combinação de dreche cervejeiro e extrato de
levedura, no ensaio 2, mostrou uma boa produção de endoxilanases (19,0 U/mL) no 5º dia
de fermentação (Fig 14B).
Nascimento, R.P. Resultados
54
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,045,050,0
0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)
A
(U.
Ativ
idad
e X
ilano
lític
aA
tivid
ade
Xila
nolít
ica
(U/m
L)
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,045,050,0
0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)
Ativ
idad
e X
ilano
lític
a (U
Ativ
idad
e X
ilano
lític
a (U
/mL
) B
Figura 13: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) farelo de trigo e extrato de levedura; (B) farelo de trigo e milhocina, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de 3,1).
Nascimento, R.P. Resultados
55
A
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,045,050,0
0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)
(U
Ativ
idad
e X
ilano
lític
aA
tivid
ade
Xila
nolít
ica
(U/m
L)
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,045,050,0
0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)
Ativ
idad
e X
ilano
lític
a (U
Ativ
idad
e X
ilano
lític
a (U
/mL
) B
Figura 14: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) dreche cervejeiro e milhocina; (B) dreche cervejeiro e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de 2,6).
Nascimento, R.P. Resultados
56
Com relação aos valores de pH, quando se utilizou milhocina como fonte de
nitrogênio, tanto com farelo de trigo, como com dreche cervejeiro, não houve muita
alteração, mantendo-se entre 7,0 e 7,5. Por outro lado, quando se utilizou extrato de
levedura como fonte de nitrogênio, em concentração de 1,2% (p/v), houve um aumento
significativo do valor de pH, atingindo valores superiores a 8,5. Contudo, ao se utilizar o
extrato de levedura na concentração mínima (0,1% p/v), os valores do pH se mantiveram
entre 7,0 e 7,4.
Baseado em estudos preliminares, as concentrações das fontes de carbono e
nitrogênio foram identificadas como os principais fatores que afetam a produção de
endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3. Assim sendo, estas variáveis, carbono e
nitrogênio, além da variável tempo, foram estatisticamente otimizadas, com o auxílio do
planejamento fatorial, utilizando 2 níveis e 3 variáveis (23). O melhor sistema apontado
pelo planejamento fatorial está descrito na Tabela 10. A melhor produção de endoxilanase
(45,8 U/mL) foi observada no ensaio 8, quando os níveis máximos de concentração de
farelo de trigo [2,5% (p/v)], de concentração de milhocina [1,2% (p/v)] e tempo (6 dias)
foram utilizadas. O valor máximo de atividade foi confirmado com a réplica deste ensaio.
Com um nível de 5% de probabilidade (95% de confiabilidade estatística), o coeficiente
linear de X1 (concentração de farelo de trigo), X2 (concentração de milhocina), X3 (tempo)
e os coeficientes de interação X1X2, X2X3 foram significativos. O modelo matemático que
representa a atividade endoxilanásica (Z) na região experimental estudada, considerando o
tempo de 6 dias, pode ser expressa pela equação abaixo:
Z = 10,3932 – 22,5568X2 – 0,7901X1 + 6,30682X1*X2 – 16,3182
O modelo forneceu um coeficiente de regressão, R2, de 0,941. A superfície de
resposta descrita no modelo da equação Z, para estimar a atividade endoxilanásica sobre as
variáveis independentes: tempo (X3), concentração de farelo de trigo (X1) e milhocina (X2),
pode ser observada na Fig. 15. A produção de endoxilanases atingiu os máximos valores na
Nascimento, R.P. Resultados
57
região dos níveis ‘+1’ tanto para o parâmetro concentração de fonte de carbono e fonte de
nitrogênio, como também para o parâmetro tempo.
Tabela 10: Planejamento fatorial (23) e resultados obtidos no melhor sistema (farelo de trigo e milhocina).
Níveis Atividade Endoxilanases
(U/mL) Ensaio
X1 X2 X3 Observado Predito
1 –1 –1 –1 2,0 5,81
2 +1 –1 –1 1,7 - 2,21
3 –1 +1 –1 1,9 -1,26
4 +1 +1 –1 2,2 6,16
5 –1 –1 +1 9,9 6,98
6 +1 –1 +1 2,0 6,21
7 –1 +1 +1 25,4 27,66
8 +1 +1 +1 46,1 42,33
9* –1 –1 –1 2,7 5,81
10* +1 –1 –1 0,8 - 2,21
11* –1 +1 –1 2,5 -1,26
12* +1 +1 –1 3,2 6,16
13* –1 –1 +1 11,0 6,98
14* +1 –1 +1 3,5 6,21
15* –1 +1 +1 23,0 27,66
16* +1 +1 +1 45,5 42,33 * replicata do sistema
Nascimento, R.P. Resultados
58
Figura 15: Superfície de Resposta para a Otimização da Produção de Endoxilanases em diferentes concentrações de farelo de trigo e de milhocina. O modelo do desenho padrão (23) utilizado para a metodologia de superficie de resposta prevê a tendência do melhor ponto para a produção de endoxilanases.
Baseado no modelo obtido, observou-se uma tendência de melhoramento da
produção de endoxilanase e as condições de trabalho foram definidas com o intuito de
atingir a máxima produção de endoxilanases, através da maximização das concentrações de
farelo de trigo e milhocina. Assim sendo, o ponto assinalado como ótimo corresponde a
2,5% (p/v) de farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina. Nestas condições, o modelo prevê
uma produção de endoxilanase de 44,0 U/mL, sendo possível atingir valores máximos de
48,7 U/mL.
O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das
variáveis possui sobre a atividade endoxilanásica (Fig. 16), estabelecendo quais destes
efeitos encontram-se dentro do grau de confiança estabelecido para a análise estatística
(95%). Cabe destacar que os fatores correspondentes ao efeito linear das variáveis tempo
[(3) T] e concentração da fonte de nitrogênio [(2) N], mostraram significância estatística,
Nascimento, R.P. Resultados
59
do mesmo modo que as interações lineares entre as variáveis tempo e concentração de fonte
de nitrogênio (2 by 3) e concentração de fonte de carbono e concentração de fonte de
nitrogênio (1 by 2). A variável concentração de fonte de carbono [(1) C], bem como sua
interação com a variável tempo (1 by 3) não apresentaram significância estatística.
Efeito Estimado (valores absolutos)
Figura 16: Diagrama de Pareto para o efeito estimado de cada variável. Planejamento Fatorial Simples (23)
Erro Puro = 0,765
Variáveis Dependentes = tempo (T) e concentrações de fontes de carbono (C) e nitrogênio (N)
4.3. Produção de Endoxilanases em Bioreatores de 2L
O perfil cinético da produção enzimática em meio líquido contendo sais minerais
em biorreator de 2L, nas melhores condições obtidas em frascos agitados [2,5% (p/v) farelo
de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina], foi obtido durante 6 dias de cultivo em diferentes
condições de agitação e aeração, a 30ºC. A maior atividade endoxilanásica (média de 56,5
U/mL) foi obtida após 5 dias de fermentação, empregando 300 rpm de agitação e 0,5 vvm
de aeração, de acordo com o ensaio 1, exibido na Fig. 17. Nesta mesma figura, observa-se
Nascimento, R.P. Resultados
60
que quando a agitação e a aeração foram utilizadas em níveis máximos (600 rpm e 1,5
vvm), a atividade endoxilanásica foi muito baixa (5,9 U/mL). O aumento da velocidade de
agitação para 600 rpm, porém com uma taxa de aeração baixa (0,5 vvm), a atividade
endoxilanásica também foi bastante alta ao término de 6 dias de cultivo (46,4 U/mL). Por
outro lado, a utilização de uma velocidade de agitação de 300 rpm e uma taxa de aeração
maior (1,5 vvm) resultou numa produção máxima de endoxilanase de apenas 12,2 U/mL.
Com relação aos valores de pH, não foi detectada grandes alterações em quaisquer
situações estudadas. Os valores de pH ficaram entre os 7,0 e 7,6.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
0 1 2 3 4 5 6 70,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Ativ
idad
e X
ilana
se (U
/mA
tivid
ade
Xila
nolít
ica
(U/m
L)
% O
.D.
% O
.D.
Tempo (dias)Tempo (dias)
Figura 17: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 30ºC, em biorreator de 2L contendo meio de sais minerais suplementado com 2.5% (p/v) farelo de trigo e 1.2% (p/v) milhocina nas seguintes condições: Atividade enzimática: (-▲-) ensaio 1 [300 rpm e 0,5 vvm]; (-■-) ensaio 2 [600 rpm e 0,5 vvm]; (-♦-) ensaio 3 [300 rpm e 1,5 vvm]; (- -) ensaio 4 [600 rpm e 1,5 vvm]. % Oxigênio Dissolvido (O.D.): (-∆-) ensaio 1 [300 rpm e 0,5 vvm]; (- -) ensaio 2 [600 rpm e 0,5 vvm]; (- -) ensaio 3 [300 rpm e 1,5 vvm]; (- -) ensaio 4 [600 rpm e 1,5 vvm]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de12,48).
Nascimento, R.P. Resultados
61
No presente trabalho, as variáveis aeração e agitação foram estatisticamente
melhoradas, com o auxílio do planejamento fatorial, utilizando 2 níveis e 2 variáveis (22). O
melhor sistema apontado pelo planejamento fatorial está descrito na Tabela 13. A melhor
produção de endoxilanase (56,5 U/mL) foi observada no ensaio 1, quando os níveis
mínimos de agitação [300 rpm] e aeração [0,5 vvm] foram utilizados, ao término de 5 dias.
Com um nível de 5% de probabilidade (95% de confiabilidade estatística), o
coeficiente linear de X1 (agitação), X2 (aeração) e o coeficiente de interação X1X2, foram
significativos. O modelo matemático que representa a atividade endoxilanásica (Z) na
região experimental estudada pode ser expressa pela equação abaixo:
A resposta de superfície descrita no modelo da equação Z para estimar a atividade
endoxilanásica sobre as variáveis independentes agitação (X1) e aeração (X2) pode ser
observada na Fig. 18. A produção de endoxilanases atingiu os máximos valores na região
dos níveis ‘-1’ tanto para o parâmetro agitação (300 rpm) como também para o parâmetro
aeração (0,5 vvm).
Tabela 13: Planejamento fatorial (22) e resultados obtidos.
Níveis Atividade Endoxilanase
(U/mL) Ensaio
X1 X2 Observado Predito
1 –1 –1 65,2 56,5
2 +1 –1 7,5 9,7
3 –1 +1 5,5 5,1
4 +1 +1 5,0 4,1
5* –1 –1 47,8 56,5
6* +1 –1 11,9 9,7
7* –1 +1 4,7 5,1
8* +1 +1 3,2 4,1
Z = 151,9 – 0,2323*X1 – 97,2*X2 + 0,1527*X1*X2
Nascimento, R.P. Resultados
62
Figura 18: Superfície de Resposta para a Otimização da Produção de Endoxilanases em diferentes valores de velocidade agitação e taxa de aeração investigados. O modelo do desenho padrão (22) utilizado para a metodologia de superficie de resposta prevê o melhor ponto para a produção de endoxilanases.
Baseado no modelo obtido, as condições melhoradas de trabalho foram definidas
com o intuito de atingir a máxima produção de endoxilanases, através da minimização da
velocidade de agitação e da taxa de aeração. Assim sendo, o ponto assinalado como ótimo
corresponde a uma velocidade de agitação de 300 rpm e uma taxa de aeração de 0,5 vvm.
Nestas condições, o modelo prevê uma produção de endoxilanase de 57,0 U/mL, sendo
possível atingir valores máximos de 63,7 U/mL.
O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das
variáveis possui sobre a atividade endoxilanásica (Fig. 19), estabelecendo quais destes
efeitos encontram-se dentro do grau de confiança estabelecido para a análise estatística
(95%). Cabe destacar que os fatores correspondentes ao efeito linear das variáveis
Nascimento, R.P. Resultados
63
velocidade de agitação [(1) rpm] e taxa de aeração [(2) vvm], mostraram significância
estatística, de ordem inversa, ao contrário do observado para a interação linear entre estas
variáveis (1 by 2).
Efeito Estimado (valor absoluto)
Figura 19: Diagrama de Pareto para o efeito estimado de cada variável. Planejamento Fatorial Simples (22)
Erro Puro = 27,75
Variáveis Dependentes = velocidade de agitação (rpm) e taxa de aeração (vvm)
4.4. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 16 L
Com o intuito de se avaliar o desempenho do estreptomiceto produtor de
endoxilanase, procedeu-se ao estudo em escala ampliada (aumento de 8 vezes), utilizando
um biorreator do tipo STR de capacidade nominal 16L, fabricado pela Bioengeneering.
Empregou-se a melhor condição obtida em biorreator de 2L e como critérios de ampliação
de escala foram utilizados o geométrico, baseando na manutenção da velocidade periférica
Nascimento, R.P. Resultados
64
do impelidor e o de transferência de massa, baseado na manutenção do valor de KLa. Para a
utilização do critério da aeração é necessário determinar os valores de KLa para cada
biorreator, a fim de, através da fixação deste parâmetro, fazer a ampliação de escala. Os
valores de KLa medidos para os biorreatores de 2 e 16L estão apresentados na Fig. 20.
Comparando os dois critérios, o critério geométrico apresentou maior influência na
produção de endoxilanases, embora o valor da atividade enzimática (3,2 U/mL) tenha caído
mais de 94%. O criterio de KLa apresentou valores muito inferiores aqueles obtidos em 2L
e também em 16L, pelo critério geométrico, chegando a atividade máxima de 0,9 U/mL, ao
fim de 4 dias.
Nascimento, R.P. Resultados
65
0
15
30
45
60
75
90
105
120
KL
a (h
-
135
150
0,17 0,25 0,33 0,42
Q/V (vvm)
A
1K
La
(h-1
)
B
0,0
15,0
30,0
45,0
60,0
75,0
90,0
105,0
120,0
135,0
150,0
0,25 0,50 0,75 1,00
Q/V (vvm)
KL
a (h
-1 K
La
(h-1
)
0,0
15,0
30,0
45,0
60,0
75,0
90,0
105,0
120,0
135,0
150,0
150 200 250 300
V (rpm)
C
KL
a (h
-1K
La
(h-1
)
Figura 20: Determinação do KLa pelo método de desgaseificação no biorreator de 2L (A), e no biorreator de 16L, fixando a agitação em 300 rpm (B) e a aeração em 0,5 vvm (C).
Nascimento, R.P. Resultados
66
4.6. Caracterização Parcial das Endoxilanases
Utilizando-se o extrato do sobrenadante obtido em 2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2%
(p/v) milhocina, foi possível determinar o perfil de temperatura e pH da atividade
endoxilanásica produzida (Fig. 21). A temperatura ótima de atividade enzimática foi a
60oC, enquanto que entre 40o e 70o C observou-se uma atividade enzimática relativa
superior a 60%. Além disso, 90ºC ainda pode-se observar uma atividade relativa de 20% da
original. Quanto ao pH, a endoxilanase apresentou um ótimo em pH 6,0 (Fig. 22),
mantendo mais de 60% do máximo da atividade na faixa de pH 5,0–9,0, podendo estas
serem importantes características quando se pensa em aplicações industriais.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temp (°C)
Ativ
idad
e R
elat
iva
Ativ
idad
e R
elat
iva
(%)
Temp (ºC)
Figura 21: Efeito da temperatura na atividade endoxilanásica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4. A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 51,9 U/mL).
Nascimento, R.P. Resultados
67
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
pH
Ativ
idad
e R
elat
iva
Ativ
idad
e R
elat
iva
(%)
pH
Figura 22: Efeito do pH na atividade endoxilanásica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4. A força iônica dos tampões foi de 50 mM: glicina-HCl ( ), citrato de sódio ( ), fosfato ( ), Tris-HCl ( ), glicina-NaOH (-x-). A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 58,1 U/mL).
O estudo de termoestabilidade da preparação enzimática demonstrou que a atividade
endoxilanásica se manteve bastante estável a 50ºC, retendo 50% e 18% da atividade
original após, respectivamente, 6 e 20 horas de pré-incubação a pH 6,0. Tal aspecto não foi
observado para a temperatura de 60ºC, em que se verificou uma total inativação após 2
horas de pré-incubação (Fig. 23).
Nascimento, R.P. Resultados
68
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (horas
Ativ
idad
e R
elat
iva
Ativ
idad
e R
elat
iva
(%)
)Tempo (h)
Figura 23: Estudo da termoestabilidade na atividade endoxilanásica, produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4, utilizando temperaturas de 60ºC ( ) e de 50ºC ( ).
A estabilidade a estocagem também foi estudada. O extrato enzimático obtido foi
estocado a -20ºC e a cada 60 dias uma amostra foi retirada e a atividade xilanolítica
determinada. Os resultados demonstraram uma alta estabilidade mesmo após 240 dias,
perdendo aproximadamente 10% da atividade enzimática original.
No que diz respeito aos íons metálicos, a atividade de endoxilanase não sofreu
nenhum efeito de ativação. Entretanto, na presença de íons, como Cu2+ (13,2%), Zn2+
(14,6%) Fe2+ (29,8%) e Mn2+ (9,5%) provocaram uma forte inibição (superior a 70%) da
atividade, enquanto que os íons Na2+ (56,3%), K+ (65,1%) e Mg2+ (54,4%), provocaram um
fraco efeito inibitório (inferior a 46,0%) (Tabela 14).
Nascimento, R.P. Resultados
69
Tabela 14: Efeito dos diferentes íons metálicos na atividade xilanolítica produzida extracelularmente pela S. malaysiensis AMT-3, cultivada a 28ºC durante 6 dias em farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%). O valor correspondente a 100% de atividade de endoxilanase foi de 58,1 U/mL).
Íon Metálico
(10mM) Atividade Relativa (%)
Controle (sem adição)
100,0
Mg2+ 54,4 Zn2+ 14,6 Cu2+ 13,2 Na2+ 56,3 Ba2+ 94,5 Mn2+ 9,5 Fe2+ 29,8 Ca2+ 99,0 K+ 65,1
EDTA 58,0
Observou-se no zimograma (Fig 24) a produção de endoxilanases em todas as
condições testadas. Em todos os extratos obtidos, foram detectadas 3 bandas distintas,
provenientes das diversas condições investigadas dentro do planejamento fatorial, uma na
região de 690 kDa, uma em 180 kDa e outra em 142 kDa, indicando portanto 2 enzimas
diferentes e a presença de 1 complexo xilanossomo, diferenciando apenas na intensidade
delas. Com relação aos extratos obtidos em farelo de trigo e milhocina, as bandas
apresentaram maior intensidade.
Nascimento, R.P. Resultados
70
1 2 3 4 5 6 7 8
690 180
142
Figura 24: Análise de zimograma da atividade xilanolítica no sobrenadante da estirpe S.
malaysiensis AMT-3, crescida em:
linha 1 (farelo de trigo e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia) ; linha 2 (farelo de trigo e extrato de
levedura, ensaio 2, 5º dia); linha 3 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 2, 5º dia); linha
4 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia); linha 5 (farelo de trigo e milhocina,
ensaio 4, 6º dia); linha 6 (farelo de trigo e milhocina, ensaio 3, 5º dia); linha 7 (dreche cervejeiro e
milhocina, ensaio 2, 6º dia); linha 8 (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 4, 6º dia).
Foram aplicados no gel 150 mU de atividade xilanásica. O gel contendo os marcadores de massa
molecular foi corado através do Comassie Blue, e a massa molecular calculada (kDa) se encontra do
lado esquerdo da figura.
4.7 Estudo da Produção de CMCases e Caracterização Parcial
Para acompanhar a produção concomitante de celulases ao longo do processo
fermentativo, dentro do estudo de planejamento fatorial, também foram analisadas as
melhores condições para obter maiores valores de atividade enzimática celulolítica. O perfil
cinético da produção enzimática em meio líquido de sais minerais, contendo a combinação
alternada de 2 fontes de carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e nitrogênio
Nascimento, R.P. Resultados
71
(milhocina e extrato de levedura), em diferentes concentrações cada uma, foi obtido após 6
dias de cultivo sob agitação (200 rpm), a 28ºC (Fig. 25). A maior atividade de CMCase
(720 U/L) foi obtida após 4 dias de fermentação, utilizando dreche cervejeiro [0,5% (p/v)]
como fonte de carbono e milhocina 1,2% (p/v)] como fonte de nitrogênio, de acordo com o
ensaio 3 (Fig. 25A). Por outro lado, quando utilizou-se o extrato de levedura como fonte de
nitrogênio, no nível mínimo (0,1%), observou-se uma produção máxima de CMCase (580
U/L) ao fim de 4 dias, e mesmo com 3 dias, observou-se valores promissores (440 U/L)
quando comparada com a fonte milhocina (Fig. 25B). A utilização da combinação das
fontes farelo de trigo (0,5%) e extrato de levedura (0,1%) não foi favorável a produção de
CMCases, com valores máximos de atividade enzimática (340 U/L), obtidos ao fim de 5
dias (Fig. 26B). Por outro lado, com a utilização de milhocina como fonte de nitrogênio,
nas concentrações máximas, obteve-se uma produção máxima de CMCases (510 U/L) ao
fim de 6 dias (Fig. 26A).
Nascimento, R.P. Resultados
72
A
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (dias)
Ativ
idad
e C
MC
ase
(UA
tivid
ade
Cel
ulol
ítica
(U/L
)
7
B
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (dias)
Ativ
idad
e CM
Case
(U
Ativ
idad
e C
elul
olíti
ca (U
/L)
Figura 25: Produção de CMCases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) dreche cervejeiro e milhocina; (B) dreche cervejeiro e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo < 10%)
Nascimento, R.P. Resultados
73
A
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)
Ativ
idad
e C
MC
ase
(UA
tivid
ade
Cel
ulol
ítica
(U/L
)
B
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (dias)
Ativ
idad
e C
MC
ase
(UA
tivid
ade
Cel
ulol
ítica
(U/L
)
Figura 26: Produção de CMCases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) farelo de trigo e milhocina; (B) farelo de trigo e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo < 10%).
Nascimento, R.P. Resultados
74
Desta forma, utilizou-se o extrato obtido em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio
3, para determinar o perfil de temperatura e pH da atividade celulásica produzida. A
temperatura ótima de atividade enzimática foi a 50oC, ainda retendo entre 40º e 60ºC
valores próximos a 100% (Fig. 27), enquanto que entre 20o e 70oC observou-se uma
atividade enzimática relativa superior a 50%. Além disso, a 90ºC, ainda pode-se observar
uma atividade relativa superior a 20%. Quanto ao pH, a CMCase apresentou uma atividade
máxima em pH 4,0 (Fig. 28), mantendo mais de 60% do máximo da atividade na faixa de
pH 2,0–9,0, podendo estas serem importantes características quando se pensa em aplicações
industriais.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Temp(oC)
R
esid
ual A
ctiv
ityA
tivid
ade
Rel
ativ
a (%
)
Temp (ºC)
Figura 27: Efeito da temperatura na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3. A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 700 U/L).
Nascimento, R.P. Resultados
75
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH
Rel
ativ
e A
ctiv
ity
Ativ
idad
e R
elat
iva
(%)
pH
Figura 28: Efeito do pH na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3. A força iônica dos tampões foi de 50 mM: glicina-HCl ( ), citrato de sódio ( ), fosfato ( ), Tris-HCl (-x-), glicina-NaOH ( ). A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 620 U/L).
O estudo de termoestabilidade da preparação enzimática demonstrou que a atividade
de celulase se manteve bastante estável a 40ºC, retendo 80% e 50% da atividade original
após, respectivamente, 6 e 24 horas de pré-incubação a pH 4,8. Tal aspecto não foi
observado para as temperaturas de 50º e 60ºC, em que se verificou uma forte perda de
atividade após 4 horas de pré-incubação, rentendo apenas 12% de atividade (50ºC) e uma
total inativação após 1 hora de pré-incubação a 60ºC (Fig. 29).
Nascimento, R.P. Resultados
76
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (h)
Ativ
idad
e R
elat
iva
Ativ
idad
e R
elat
iva
(%)
Tempo (h)
Figura 29: Estudo da termoestabilidade na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3, utilizando temperaturas de 60ºC ( ), 50º ( ) e 40ºC ( ).
Observou-se no zimograma (Fig 30) a produção de CMCases em algumas das
condições testadas. Ao todo foram detectadas duas bandas distintas, provenientes das
melhores condições estudadas dentro do planejamento fatorial, uma em 178 kDa e outra em
51 kDa, indicando portanto duas enzimas diferentes.
Nos extratos obtidos com 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) milhocina, 0,5%
(p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) milhocina, 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v)
extrato de levedura, observaram-se apenas duas bandas, sendo que a melhor condição para
a produção de celulase (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3), apresentou maior
intensidade na banda de 178 kDa (Fig. 30). Não se observou muita alteração de intensidade
na banda de 51 kDa para os três extratos testados.
Nascimento, R.P. Resultados
77
1 2 3
178 51
Figura 30: Análise de zimograma da atividade celulolítica no sobrenadante da estirpe S. malaysiensis AMT-3, crescida em: linha 1 (farelo de trigo e milhocina, ensaio 2, 4º dia) ; linha 2 (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3, 5º dia); linha 3 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia); Foram aplicados no gel 500 mU de atividade celulásica. O gel contendo os marcadores de massa molecular foi corado através do Comassie Blue, e a massa molecular calculada (kDa) se encontra do lado esquerdo da figura.
4.8. Estudo da Produção de Peptidases e Caracterização Parcial
Paralelamente ao estudo da produção de xilanases, foi realizado um estudo para
avaliar a capacidade da estirpe S. malaysiensis AMT-3 em produzir peptidases, utilizando a
técnica de SDS-PAGE. A habilidade das peptidases produzidas extracelularmente em
degradar diferentes substratos protéicos foi ensaiada utilizando 4 diferentes substratos
(gelatina, BSA, caseína e hemoglobina) incorporados ao gel. O sobrenadante utilizado
inicialmente foi aquele obtido com o crescimento da estirpe em farelo de trigo [2,5% (p/v)]
e extrato de levedura [0,1% (p/v)]. Somente a peptidase contendo uma massa molecular
aparente de 116 kDa teve a habilidade em hidrolisar os 4 substratos testados, enquanto que
a peptidase que migrou a 212 kDa degradou o substrato gelatina, BSA e hemoglobina (Fig.
31). Entretanto, após ferver o extrato bruto na presença de DTT, verificou-se que as
Nascimento, R.P. Resultados
78
proteínas com massa molecular aparente de 212 e 116 kDa provavelmente correspondiam a
agregados de diferentes proteínas, tendo em vista o desaparecimento destas bandas no gel e
o surgimento de novas bandas com menor massa molecular. A análise em SDS-PAGE
desta amostra foi realizada e indicou que as enzimas foram irreversivelmente destruídas
com este tratamento. As peptidases remanescentes (20, 35, 43, 50, 70, and 100 kDa)
detectadas neste estudo foram capazes de degradar somente a gelatina, sendo este substrato
adotado para estudos posteriores em sistema SDS-PAGE (Fig. 31).
Figura 31: Efeito de diferentes substratos proteícos incorporados a 10% SDS-PAGE na detecção de peptidases extracelulares produzidas por S. malaysiensis AMT-3: (G) gelatina, (C) caseína, (H) hemoglobina, (B) albumina sérica bovino. A massa molecular aparente, calculada de acordo com a migração dos marcadores, em kDa, está indicado no lado esquerdo da figura.
A produção de peptidases foi examinada na presença de farelo de trigo e extrato de
levedura em diferentes concentrações, de acordo com os ensaios 1 a 4 descritos
anteriormente. Verificou-se inicialmente que a melhor produção, examinada no 5º dia, foi
obtida na menor concentração de extrato de levedura [0,1% (p/v)] combinada com a maior
concentração de farelo de trigo [2,5% (p/v)] (ensaio 2) (Fig. 32A). Quando o farelo de
trigo foi utilizado na menor concentração [0,5% (p/v)] (ensaios 1 e 3), a enzima proteolítica
Nascimento, R.P. Resultados
79
que migrou a 100 kDa não apresentou uma banda de grande intensidade, enquanto que a de
20 kDa não foi detectada. Por outro lado, quando a máxima concentração de extrato de
levedura [1,2% (p/v)] foi utilizada, para ambas as concentrações de farelo de trigo (ensaios
3 e 4), as peptidases que migraram em 43 e 70 kDa não foram detectadas, enquanto que
outras, como as de 20, 35 e 50 kDa não apresentaram bandas com grande intensidade (Fig.
32A).
A cinética de produção de peptidases em farelo de trigo [2,5% (p/v)] e extrato de
levedura [0,1% (p/v)] (ensaio 2) está apresentada na Fig. 32B. Podemos observar que a
partir do 3ºdia de fermentação, as primeiras bandas proteolíticas, em 43 e 50 kDa começam
a ser produzidas, sendo a máxima produção de peptidases detectada ao término de 5 dias de
fermentação. Entre as massas moleculares aparentes de 35 e 43 kDa, podemos observar
uma fraca banda proteolítica.
Nascimento, R.P. Resultados
80
A B
Figura 32: Estudo da produção de peptidases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo e extrato de levedura como substratos. (A) SDS-PAGE dos sobrenadantes obtidos em diferentes concentrações de C e N após 5 dias de incubação: linha 1 (ensaio 1), linha 2 (ensaio 2), linha 3 (ensaio 3) e linha 4 (ensaio 4). (B) Cinética da produção de peptidases observada através do SDS-PAGE, a partir dos sobrenadantes obtido em 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 2): linhas de 1 a 6, 1º ao 6º dia, respectivamente. A massa molecular aparente, calculada de acordo com a migração dos marcadores, em kDa, está indicado no lado esquerdo da figura. Os ensaios de 1 a 4 estão descritos nos Materiais e Métodos.
Nascimento, R.P. Resultados
81
Quando foram utilizadas as fontes dreche cervejeiro e milhocina, não se observou o
mesmo perfil de produção de peptidases como observado para farelo de trigo e extrato de
levedura. Nas menores concentrações estudadas, observou-se uma maior produção de
peptidases ao fim de 5 dias de fermentação, apresentando bandas entre 212 e 35 kDa (Fig.
33A), sendo as bandas de 116 kDa as com maior intensidade. Ao aumentar a concentração
de dreche cervejeiro para 2,5% (p/v), mantendo-se a concentração de 0,1% (p/v) de
milhocina, a banda com 212 kDa não foi detectada (Fig. 33B). Contudo, quando se utilizou
0,5% (p/v) de dreche cervejeiro com 1,2% (p/v), houve uma boa produção de peptidases já
a partir do 3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo de todo o processo
fermentativo (Fig. 33C), e observando-se diversas bandas proteolíticas (212, 116, 50, 35 e
29 kDa). Já ao se utilizar as concentrações máximas de dreche cervejeiro [2,5% (p/v)] e
milhocina [1,2% (p/v)], praticamente não houve produção de peptidases, sendo apenas
detectadas algumas bandas ao término de 6 dias de fermentação (Fig. 33D).
Nascimento, R.P. Resultados
82
A B
1 2 3 4 1 2 3 4
176.5 113.7
80.9 63.8
49.5 37.4 26.0
176.5 113.7
80.9 63.8
49.5 37.4 26.0
D C
176.5 113.7
80.9 63.8 49.5 37.4
176.5 113.7
80.9 63.8 49.5 37.4
1 2 3 4 1 2 3 4
Figura 33: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando dreche cervejeiro e milhocina como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 2): linha 1 (5º dia), linha 2 (3º dia), linha 3 (4º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0.5% (p/v) dreche cervejeiro e 1.2% (p/v) de milhocina (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel
Nascimento, R.P. Resultados
83
Já quando as fontes dreche cervejeiro e extrato de levedura foram utilizadas um
novo perfil de produção de peptidases se apresentou, diferente daqueles observados para
farelo de trigo e extrato de levedura ou mesmo para dreche cervejeiro e milhocina. Ao
utilizar dreche cervejeiro e extrato de levedura nas menores concentrações estudadas,
observou-se uma maior produção de peptidases ao término de 4 dias de fermentação,
apresentando bandas proteolíticas entre 145 e 29 kDa (Fig. 34A). Ao aumentar a
concentração de dreche cervejeiro para 2,5% (p/v), mantendo a concentração de 0,1% (p/v)
de extrato de levedura, as bandas apresentaram uma grande intensidade, embora sendo
detectadas apenas 3 peptidases, com 145 kDa, 64 kDa e 35 kDa (Fig. 34B), com início
apenas a partir do 4º dia. Contudo, quando se utilizou 0,5% (p/v) de dreche cervejeiro com
1,2% (p/v) de extrato de levedura, houve uma pequena produção de peptidases já a partir do
3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo do processo fermentativo (Fig. 34C).
Porém, quando se utilizou as concentrações máximas de dreche cervejeiro [2,5% (p/v)] e
extrato de levedura [1,2% (p/v)], praticamente não houve produção de peptidases com 3 e 4
dias, sendo apenas detectadas algumas bandas ao fim de 5 dias de fermentação, mas com
bandas com grande intensidade ao fim de 6 dias (Fig. 34D).
A utilização de farelo de trigo e milhocina, melhor condição para a produção de
xilanases, não foi favorável para a produção de peptidases, como foi observado com a
condição farelo de trigo e extrato de levedura. Ao utilizar farelo de trigo e milhocina nas
menores concentrações estudadas, houve uma pequena produção de peptidases já a partir
do 3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo do processo fermentativo (Fig. 35A),
sendo detectado bandas proteolíticas com 116, 50, 35 e 29 kDa. Ao aumentar a
concentração de farelo de trigo [2,5% (p/v)] observou-se uma maior produção de peptidases
ao término de 4 dias de fermentação, apresentando um perfil similar àquele obtido com a
utilização de farelo de trigo em menor concentração (Fig. 35B). Quando se utilizou a
milhocina na concentração de 1,2% (p/v), a produção de peptidase teve início a partir do 4º
dia, apresentando poucas bandas, atingindo um nível máximo após 5 dias de fermentação,
na concentração mínima de farelo de trigo (Fig. 35C) e após 6 dias na concentração
máxima de farelo de trigo (Fig. 35D).
Nascimento, R.P. Resultados
84
A B
176.5 113.7
80.9
63.8
49.5 37.4
26.0 1 2 3 4 1 2 3 4
176.5 113.7
80.9
63.8
49.5 37.4
26.0
176.5 113.7 80.9 63.8
49.5 37.4
C D
176.5 113.7 80.9 63.8
49.5 37.4
1 2 3 4 1 2 3 4
Figura 34: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando dreche cervejeiro e extrato de levedura como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 2): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel.
Nascimento, R.P. Resultados
85
A B
176.5 113.7 80.9 63.8 49.5
37.4 26.0
1 2 3 4 1 2 3 4
C
176.5 113.7 80.9 63.8 49.5
37.4 26.0
D
176.5
113.7 80.9
63.8
49.5
37.4 26.0
1 2 3 4 1 2 3 4
176.5
113.7 80.9
63.8
49.5
37.4 26.0
Figura 35: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo e milhocina como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 2): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel.
Nascimento, R.P. Resultados
86
As peptidases foram caracterizadas parcialmente em sistema SDS-PAGE, utilizando
a melhor condição observada (farelo de trigo e extrato de levedura, ensaio 2). O perfil de
temperatura das peptidases estudadas apresentou um ótimo a 37ºC. Contudo também foi
verificada uma boa atividade proteolítica a altas temperaturas, como 60º e 70ºC (Fig. 36).
Para as peptidases com massa molecular acima de 116 kDa, o ótimo de pH foi
observado em 7,0, mas níveis significativos de atividade foram detectados numa faixa de
pH entre o 6,0 e o 8,0 (Fig. 37).
Figura 36: Efeito da temperatura da atividade proteolítica de S. malaysiensis AMT-3, analisada em SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, em diferentes temperaturas (28°, 37°, 50°, 60° e 70°C) em tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A linha C é uma tira de gel corada imediatamente após tratamento com Triton X-100. A massa molecular calculada (kDa) se encontra no lado esquerdo da figura.
Nascimento, R.P. Resultados
87
pH
Figura 37: Efeito do pH da atividade proteolítica de S. malaysiensis AMT-3, analisada em SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, em diferentes tampões com força iônica de 50 mM, variando o pH de 3 – 10,0, a 37ºC. A linha C é uma tira de gel corada imediatamente após tratamento com Triton X-100. A massa molecular calculada (kDa) encontra-se no lado esquerdo da figura.
Os perfis obtidos para a termoestabilidade das atividades proteolíticas produzidas
por S. malaysiensis AMT-3, em pH 7,0 estão representados na Fig. 38. Quando o
sobrenadante bruto foi pré-incubado a 60ºC, pelo menos parte da atividade proteolítica,
especialmente a banda de 35 kDa, foi retida, mesmo após 480 minutos de exposição a esta
temperatura. A banda proteolítica de 35 kDa foi totalmente inativada apos 120 min. de pré-
incubação a 70ºC.
As bandas proteolíticas de 212, 116, 100 e 35 kDa foram classificadas como sendo
pertencentes a classe de serina-peptidase, uma vez que elas foram inibidas por PMSF (Fig.
39, linha B e benzamidina (dado não mostrado).Todas as outras enzimas detectadas foram
classificadas como sendo metalo-peptidases, baseado na inibição por 1,10-fenantrolina
(Fig. 39, linha C). É importante ressaltar que cada inibidor foi adicionado ao tampão de
amostra SDS-PAGE, com o intuito de prevenir a atividade proteolítica de bandas com alto
peso molecular ao longo da corrida eletroforética. Outros inibidores foram utilizados, como
o agente DTT, o inibidor especifico de cisteina peptidase (E-64) e o inibidor de aspártico
Nascimento, R.P. Resultados
88
peptidase (pepstatina A), mas não apresentaram qualquer efeito nas bandas proteolíticas
detectadas.
Figura 38: Termoestabilidade das atividades proteolíticas da estirpe S. malaysiensis AMT-3. O sobrenadante da cultura foi pré-incubado em diferentes temperaturas (28°, 37°, 50°, 60° e 70°C) por 30, 120 e 480 minutos e a atividade enzimática residual foi determinada através da gelatina-SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas a 37ºC, em tampão fosfato 50 mM, pH 7,0.
Nascimento, R.P. Resultados
89
Figura 39: Perfil de inibição da atividade proteolítica produzida pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 em gelatina-SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, a 37ºC em tampão fosfato 50 mM pH 7,0: (A) sem inibidor, (B) 1µM PMSF, (C) 10 mM 1,10-fenanthrolina. As letras s e m referem a classe proteolítica, serina e metalo peptidase, respectivamente.
Nascimento, R.P. Discussão
90
5. DISCUSSÃO
Dentre os vários microrganismos degradadores de materiais lignocelulósicos, os
actinomicetos, um grupo de bactérias filamentosas Gram positivas, são considerados
grandes produtores de enzimas lignocelulolíticas (Wang et al., 1993, Lima et al., 2005),
sendo a atividade xilanolítica uma das mais abundantes (Nascimento et al., 2003). A
grande maioria dos representantes dos actinomicetos cresce em forma miceliar,
invasiva, semelhantemente aos fungos filamentosos. Esta característica torna-se
vantajosa para o microrganismo, pois aumenta a área de contato com o substrato e
consequentemente aumenta sua capacidade de degradação. Por habitarem o solo, os
actinomicetos já estão adaptados a colonizar resíduos sólidos, como restos vegetais e
animais, participando ativamente da ciclagem da matéria orgânica. No presente
trabalho, a estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolada de solo sob
vegetação de cerrado, foi utilizada em estudos de otimização e escalonamento da
produção de xilanases utilizando resíduos de baixo custo. Outros estudos, visando a
caracterização da atividade xilanolítica também foram realizados.
O estudo cinético para análise de qualquer reação química é uma ferramenta de
extrema importância, implicando na determinação das taxas de transformação dos
reagentes em produtos assim como na determinação da influência do meio reacional
sobre as taxas das transformações químicas. O valor de Km (1,56 mg/mL) obtido para a
endoxilanase produzida pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 sugere que a enzima possui
alta afinidade pelo substrato. Uma reação do tipo uni-uni, que apresente um baixo valor
de Km implica em uma elevada estabilidade do complexo ES, com pouca tendência de
dissociação (Fonseca, 1998). Sendo assim, a presença de um sítio ativo da enzima com
grupos químicos capazes de interagir de forma eficiente com o substrato pode ser
sugerida.
Damaso e colaboradores (2000) observaram valores de Km (1,78 mg/mL) da
mesma magnitude para endoxilanase produzida por uma estirpe de Thermomyces
lanuginosus. Entretanto, Cesar e Mrsa (1996) observaram valores mais elevados de Km
(7,3 mg/mL) para uma outra linhagem do mesmo microrganismo. Belfaquih e
colaboradores (2002) obtiveram valores de 5,0; 6,1 e 3,3 mg/mL para três enzimas
xilanolíticas produzidas por Streptomyces sp., utilizando xilana beechwood como
substrato. Comparando os valores de Km obtidos pela estirpe S. malaysiensis AMT-3
Nascimento, R.P. Discussão
91
com os descritos na literatura para outros actinomicetos e fungos, confirma-se alta
afinidade que a endoxilanase produzida pelo estreptomiceto apresenta pelo substrato.
A comparação de valores de Vmax também podem ser validados quando
expressos em atividade específica, pois a velocidade máxima é diretamente dependente
da concentração de enzima que se encontra ativa (Fonseca, 1998). O valor de Vmax para
S. malaysiensis foi 1,58 µmoles xilose/mL.min. Diferentes valores de Vmax aparente
(2198, 2269 e 302 µmoles xilose/mL.h) foram obtidos por Belfaquih e colaboradores
(2002) utilizando xilana beechwood como substrato. As diferenças encontradas entre os
valores de Vmax para diversos microrganismos, sejam fungos ou actinomicetos, pode ser
devido a diferentes especificidade das xilanases produzidas, à heterogeneidade da
xilana, como também ao uso de diferentes temperaturas e métodos de quantificação dos
açúcares redutores durante a determinação da atividade enzimática.
Para que a enzima seja saturada pelo substrato, é necessário que uma
concentração superior ao valor de Km deva ser utilizada. Bailey e colaboradores (1992)
observaram que a concentração máxima para substratos poliméricos, como a xilana, não
deve ultrapassar 1%, devido a baixa solubilidade. Contudo, este valor não garante uma
condição de saturação, devendo esta ser determinada através de uma curva que
relacione a velocidade da reação com a concentração de substrato. Valores superiores a
1,5% de xilana [2,1; 2,7 e 3,0% (p/v)] foram responsáveis por um efeito inibitório na
atividade enzimática produzida por S. malaysiensis. Belfaquih e colaboradores (2002)
não observaram inibição da atividade xilanásica quando na presença de xilose em
diferentes concentrações (5–50 mM), indicando que nesta faixa de concentração a
enzima não sofre inibição pelo produto de sua ação catalítica. Através da curva de
progresso utilizando xilana birchwood na concentração 1,5% (p/v), pôde-se selecionar o
tempo de reação enzimática, que foi de 6 minutos. Desta forma, foi possível otimizar a
metodologia utilizada para a dosagem da atividade endoxilanásica. Porém, os estudos
posteriores foram conduzidos com xilana oat spelts, em virtude dos melhores valores de
atividade enzimática observados quando este substrato foi utilizado, indicando uma
maior afinidade da enzima por este tipo de xilana.
A maioria das pesquisas referentes à produção de enzimas de interesse industrial
vem utilizando cultura submersa, a qual permite um controle do grau de aeração, pH e
temperatura do meio, bem como o controle de outros fatores ambientais requeridos para
o crescimento ótimo do microrganismo (Souza, Souza & Peralta, 2001). Neste tipo de
Nascimento, R.P. Discussão
92
cultivo, o acúmulo de açúcares redutores tem sido relatado como um efeito negativo na
produção de xilanases (Biswas et al., 1988; Gosh & Nanda, 1994), já que a presença de
açúcares inibe a produção da enzima pela estirpe produtora.
As fontes de carbono e nitrogênio utilizadas no meio de produção são os
principais fatores que afetam a produção de enzimas e seus níveis. Por outro lado,
parece óbvio que os custos de produção são diretamente proporcionais ao tempo de
produção, de modo que para minimizar os custos de produção a enzima deveria ser
produzida no menor tempo possível. Como a xilana no meio de produção é uma
macromolécula complexa, a produção enzimática requerida para hidrolisar tal estrutura
macromolecular pode atingir seu máximo somente após a biomassa bacteriana ter
atingido certo nível (Seyis & Aksoz, 2003; Seyis & Aksoz, 2005). Processos baseados
em microrganismos têm custos de produção específicos. Aproximadamente 30–40% do
custo de produção de muitas enzimas é atribuido ao custo do substrato de crescimento
(Hinnman, 1994, Techapun et al., 2003a). Consequentemente espera-se reduzir os
custos de produção de maneira significante com o uso de substratos de baixo custo para
a produção de enzimas industriais. Os altos custos do extrato de levedura como fonte de
nitrogênio (US$ 1800.00/ton) impossibilita seu uso na produção de enzimas industriais.
Certamente, os custos de produção de xilanases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3
podem sofrer grandes reduções utilizando-se farelo de trigo (US$ 175.00/ton) e
milhocina (US$ 80.00/ton) como matérias-prima, se comparado com alguns dos meios
de fermentação contendo substrato comercial, como a xilana, ou como suplemento de
nitrogênio, utilizar extrato de levedura. O uso de xilana purificada como um substrato
para a produção de xilanases torna-se economicamente inviável, já que tais enzimas
serão utilizadas em grandes quantidades e, consequentemente, o uso de resíduos
agrícolas de baixo custo, ricos em xilana, para produção de xilanases é de fundamental
importância. Assim sendo, resíduos agro-industriais como farelo de trigo, dreche
cervejeiro, em diferentes concentrações foram suplementados como fontes de carbono,
bem como extrato de levedura (fonte de custo elevado) e milhocina como fonte de
nitrogênio para a produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3.
A produção máxima de endoxilanase em resíduos agro-industriais pela estirpe S.
malaysiensis AMT-3, especialmente em farelo de trigo e milhocina, ao término de 6
dias de fermentação (45,8 U/mL) foi consideravelmente superior aquela obtida em
dreche cervejeiro (21,2 U/mL). Utilizando uma fonte orgânica e complexa de nitrogênio
(milhocina) na concentração de 1,2% (p/v) e uma fonte de carbono complexa (farelo de
Nascimento, R.P. Discussão
93
trigo), na concentração de 2,5% (p/v), obteve-se o melhor resultado. Entretanto, quando
se utilizou 0,1% (p/v) extrato de levedura, a atividade xilanolítica foi de 31,2 U/mL.
Fontes de nitrogênio inorgânica foram testadas em estudos anteriores e somente o
nitrato de potássio a 0,12% teve algum efeito na produção de xilanases, quando xilana
larchwood foi utilizada como fonte de carbono (Nascimento et al., 2002). Quando
houve a utilização de extrato de levedura (0,5%) combinado com triptona (0,3%), na
presença de xilana larchwood, a atividade máxima de xilanase (116,0 U/mL) foi obtida
ao cabo de 6 dias (Nascimento et al., 2003). Isto pode indicar que o melhoramento da
produção de xilanases com meio de cultura contendo fontes de nitrogênio orgânico é
devido presumivelmente a complementação dos componentes moleculares destas
fontes. Fontes de nitrogênio como extrato de levedura podem conter 6–17% de
carboidratos, aminoácidos e ácidos nucléicos em adição às proteínas (Subramayian et
al., 2001). A produção de endoxilanase pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3,
utilizando farelo de trigo e milhocina, como matérias-prima, apresentou valores
relativamente elevados (45,8 U/mL) de atividade enzimática quando comparado aos
descritos na literatura para outras espécies de Streptomyces (Sunna & Antranikian,
1997; Beg et al., 2000).
Embora vários relatos estejam disponíveis a respeito do rendimento da produção
de endoxilanases, é difícil comparar os resultados obtidos, uma vez que os
microrganismos produtores das enzimas-alvo, as condições de cultivo e produção, o
substrato testado, as condições dos ensaios enzimáticos e a forma de definir as unidades
são bastante variáveis. Entretanto, outros autores têm descrito valores de 14,3 U/mL
(Liu et al., 1998), 17,0 U/mL (Damaso et al, 2000), 30,0 U/mL (Lemos et al., 2000),
22,5 U/mL (Bocchini et al., 2002) e 10,3 U/mL (Wang et al., 2003), utilizando
diferentes microrganismos sob diferentes condições de crescimento e de produção
enzimática. Porém, de um modo geral, aparentemente a estirpe S. mayalsiensis AMT-3
é uma excelente produtora de endoxilanase, fornecendo valores de atividade enzimática
bem superiores ou comparáveis a literatura, quando utilizado resíduos agro-industriais.
Subramaniyan e colaboradores (2001) verificaram que a maior produção de
xilanase (380 U/mL) com uma estirpe de Bacillus sp. foi obtida, após 96 horas de
cultivo, no meio contendo extrato de levedura e peptona [0,25% (p/v)] como fontes de
nitrogênio e xilana oat spels como fonte de carbono [1% (p/v)]. Entretanto, quando o
extrato de levedura (1%) e a peptona (1%) foram adicionadas separadamente, as
máximas de atividade xilanolítica obtidas foram de 150 e 218 U/mL, respectivamente.
Nascimento, R.P. Discussão
94
Também verificaram que outras fontes de nitrogênio, orgânicas ou inorgânicas não
tiveram um efeito significativo na produção de xilanases. Altas concentrações de fontes
complexas de nitrogênio para bactérias produtoras de hidrolases podem melhorar o
crescimento em relação a produção da enzima, devido a presença de açúcares simples.
Também, fontes complexas como extrato de levedura, triptona e peptona podem liberar
amônia, o que poderia estimular o crescimento e ao mesmo tempo aumentar o
rendimento da produção da enzima por causa de uma possível inibição natural de
peptidases que poderiam estar presentes no sobrenadante (Subramaniyan et al., 2001).
George e colaboradores (2001) verificaram que na presença de extrato de levedura, o
nível de produção das xilanases por Thermomonospora sp. foi melhor (115,0 U/mL),
sendo considerado uma ótima fonte de nitrogênio orgânico. Outros resultados
comparativos foram obtidos quando foram utilizados peptona (105,0 U/mL), triptona
(98,0 U/mL) e farelo de soja (103,0 U/mL), verificando-se também uma boa indução da
produção de xilanases, porém não superiores aos obtidos com extrato de levedura.
Entretanto, quando se utilizou fonte de nitrogênio inorgânico, como o sulfato de
amônio, o nível máximo de produção de xilanase foi de 86,0 U/mL. Deng e
colaboradores (2005) verificaram que a produção de xilanases por Streptomyces
olivaceoviridis variou de acordo com a fonte de nitrogênio. Entre as várias fontes
inorgânicas e orgânicas de nitrogênio testadas, a triptona foi a melhor na estimulação da
produção de xilanases (1568 U/mL).Uma Maheswari e Chandra (2000) observaram uma
boa produção de xilanases (24,0 U/mL) em xilana birchwood, 1% (p/v), após 5 dias de
fermentação, utilizando Streptomyces cuspidosporus. Entretanto, quando utilizou-se
farelo de trigo como fonte de carbono na concentração de 10 %, observou uma grande
produção de xilanase (105 U/mL). Por outro lado, o farelo de trigo induziu a produção
de um coquitel de enzimas extracelulares, quando comparado com a xilana birchwood.
Uma variedade de substratos, principalmente resíduos agrícolas, podem ser
avaliados para a produção de xilanases. George e colaboradores (2001) observaram que
o substrato Celulose Paper Powder (CPP) a 4% induziu uma maior produção de
xilanase (115 U/mL) pelo Thermomonospora sp quando comparados com outros
substratos, como sabugo de milho (105 U/mL), farelo de trigo (30 U/mL), xilana (22
U/mL) e palha de arroz (18 U/mL). Também observou que combinando a melhor fonte
de carbono com diferentes fontes de nitrogênio, a atividade máxima de endoxilanase foi
obtida com extrato de levedura (115 U/mL) sendo a fonte sulfato de amônia (86 U/mL)
a melhor fonte de nitrogênio inorgânico.
Nascimento, R.P. Discussão
95
Nas últimas décadas, mesmo que vários artigos abordando a otimização da
produção de xilanases tenham sido publicados, pouca informação sobre a otimização
desta enzima por processo de fermentação submersa, utilizando espécies de
Streptomyces, está disponível na literatura científica (Techapun et al, 2002). Alguns
destes estudos com outras bactérias relatam a utilização de métodos estatísticos no
processo de otimização (Bocchini et al., 2002, Heck et al., 2005). A otimização do meio
de crescimento e as condições de cultivo tem sido aplicadas com sucesso para aumentar
os rendimentos tanto de produtos primários como de produtos secundários de uma
ampla variedade de microrganismos. Estudos de otimização do meio de cultivo
descritos na literatura têm sido conduzidos seja por aproximação de “uma variável a
cada vez” seja por resposta de superfície, sendo esta mais completa em relação a outra,
pois revela possibilidades de interações entre as variáveis. Entretanto, a aproximação de
“uma variável a cada vez” pode ser útil para estimar intervalos operacionais apropriados
para importantes variáveis de efeito estimulatório/inibitório, na condução de estudos em
resposta de superfície (Wejse et al., 2003).
Geralmente, um conhecimento prévio de procedimentos matemáticos é
necessário para que se desenvolva um modelo estatístico. As três etapas de um desenho
experimental incluem fazer experimentos estatisticamente desenhados, estimar os
coeficientes em modelos matemáticos predizendo a resposta, e checar a aplicabilidade
do modelo (Techapun et al., 2002). Para a otimização das condições do meio de cultivo,
foram utilizadas quatro fontes diferentes, sendo duas de carbono (farelo de trigo e
dreche cervejeiro) e duas de nitrogênio (milhocina e extrato de levedura), bem como o
tempo de cultivo. De acordo com a teoria da Superfície de Resposta, a atividade de
endoxilanase das amostras estudadas pode ser descrita como uma função das variáveis
selecionadas. A função exata é desconhecida, mas este tipo de resposta pode usualmente
ser aproximado por um polinomial de 2ª ordem com a seguinte equação:
Z = β0 + Σ βiXi + Σ βiiXi2 + Σ βijXiXj
Onde:
Z = variável de resposta; β0 = constante; βi = coeficiente do efeito linear; βii =
coeficiente para o efeito quadrático; βij = coeficiente do efeito de interação; Xi e Xj =
níveis das variáveis.
Nascimento, R.P. Discussão
96
Baseado em estudos anteriores, a concentração de fontes de carbono e nitrogênio
de baixo custo e o tempo de cultivo foram identificados como os principais fatores que
afetavam a produção de xilanases por S. malaysiensis AMT-3. No presente trabalho,
estas variáveis foram estatisticamente otimizadas com a ajuda do desenho fatorial 23
utilizando o método de superfície de resposta. A maior atividade xilanolítica (46,1
U/mL) foi obtida no ensaio 8, na qual os fatores concentração de fonte de carbono
(farelo de trigo), concentração de fonte de nitrogênio (milhocina) e o tempo de cultivo
foram utilizados nos seus níveis máximos (25,0 g/L, 12,0 g/L, 6 dias), respectivamente.
O valor observado no presente trabalho, após planejamento fatorial, foi 1,6 vezes maior
que o originalmente obtido em estudos anteriores, quando se utilizou 1% (p/v) de farelo
de trigo como única fonte de carbono, após 10 dias de fermentação (Nascimento et al.,
2002). A maior atividade (46,1 U/mL) obtida no presente trabalho foi, por sua vez, 2,2
vezes maior do que a observada para a combinação das fontes dreche cervejeiro e
milhocina, nas mesmas condições. Também foi observado um bom valor de atividade
xilanolítica (25,4 U/mL) no ensaio 7, utilizando as mesmas fontes de carbono e
nitrogênio, ao fim de 6 dias de fermentação. Techapun e colaboradores (2002),
utilizando a estirpe Streptomyces sp. Ab106, observaram as máximas produções de
endoxilanase quando utilizou meio de cultura contendo extrato de levedura e peptona
como fontes de nitrogênio combinadas (0,075 g/L cada) e bagaço de cana como fonte de
carbono (10 g/L), variando os valores de temperatura (28–71ºC) e pH (3,6–9,6). Quando
combinou-se as variáveis temperatura (50ºC) e pH (6,5), a atividade máxima observada
foi 14,8 U/mL. Com relação ao teste T-Student e os valores de p-level (significância de
cada coeficiente), Techapun e colaboradores (2002) verificaram que os baixos valores
de p-level (inferiores a 0,05) indicam uma correlação mais significante dos coeficientes.
Também verificou que as variáveis independentes (temperatura e pH) tinham um efeito
significante na produção de xilanases e a interação destas variáveis de baixa
significância, devido ao valor de p-level ser superior a 0,05.
Bocchini e colaboradores (2002) observaram que em 5% de nível de
probabilidade, o coeficiente linear do fator tempo de cultivo e os coeficientes de
interação entre os fatores tempo de cultivo e concentração de xilana foram
significativos. A significância estatística do modelo de equação proposto por Bocchini e
colaboradores (2002) mostrou que esta regressão é estatisticamente significante a 99%
de nível de confiança. Desta forma, conclui-se que a estirpe S. malaysiensis AMT-3 é
Nascimento, R.P. Discussão
97
uma boa produtora de endoxilanase. A partir do experimento fatorial 23, uma curva de
superfície de resposta foi gerada e indicou que a produção de endoxilanases pode ser
extrapolada acima do valor máximo, dentro do intervalo de variáveis dependentes
estudadas. A maior atividade xilanolítica (46,1 U/mL) obtida com o desenho fatorial 23
foi 38,4% maior que àquela obtida no meio inicial (Nascimento et al., 2002). Diferentes
desenhos experimentais foram conferidos por Pham e colaboradores (1998) com o
objetivo de otimizar um meio de cultivo para a produção de xilanases por Bacillus sp. 1-
1018. A xilana, hidrolisado de caseína e concentração de NaCl foram otimizadas pela
superfície de resposta. A composição ótima do meio nutriente foi determinada sendo
3,16 g/L de xilana, 1,94 g/L de caseína hidrolisada e 0,8 g/L de NaCl. A maior produção
de xilanases observada foi 151 U/mL. O cultivo de Bacillus sp. 1-1018 no meio
otimizado resultou no aumento de 135% da produção de xilanases, comparado com o
meio inicial. Métodos de superfície de resposta foram também utilizados para otimizar o
meio de cultura no que diz respeito a produção de xilanases por Schizophyllum
commune (Haltrich et al., 1993). No presente trabalho, o aumento da produção de
xilanases é comparável com aqueles observados por Haltrich e colaboradores (1993) e
maior que os observados por Pham e colaboradores (1998).
No presente trabalho, os fatores tempo e concentração de nitrogênio foram
estatisticamente significantes, apresentando um valor de p-level inferior a 0,01 (99% de
confiabilidade estatística), o que indica que eles podem agir como fatores limitantes.
Mesmo pequenas variações nos seus valores poderão alterar a atividade endoxilanásica
a uma extensão considerável, observando um efeito significante entre as interações dos
fatores concentração de fonte de carbono e fonte de nitrogênio (X1X2) e entre a
concentração da fonte de nitrogênio e o tempo (X2X3). Contudo, a interação entre o
fator concentração de fonte de carbono e tempo (X2X3) teve um efeito insignificante na
atividade endoxilanásica. Heck e colaboradores (2005) observaram valores de p-level
inferiores a 0,02 para o fator tempo e 0,008 para o fator pH.
Muitas das xilanases utilizadas na indústria hoje em dia parecem ser de origem
mesofílica e/ou neutrofílica, ainda que enzimas de fontes extremofílicas podem ser de
grande utilidade em muitos processos biotecnológicos. Em particular, enzimas que
combinam um número de características extremofílicas poderiam ser utilizadas em
muitos processos tecnológicos (Collins et al, 2005). A maior aplicação das xilanases
hoje em dia é na indústria de polpa e papel, onde altas temperaturas (55–70ºC) e pH
Nascimento, R.P. Discussão
98
alcalino do substrato da polpa requerem a utilização de enzimas termo-alcalofílicas para
um biobranqueamento eficiente (Beg et al., 2001; Collins et al., 2005). Xilanases termo-
alcalofílicas ou mesmo termo-acidofílicas podem ser utilizadas em processos de
bioconversão, onde uma variedade de tratamentos, incluindo água quente e explosão a
vapor, alcalino, pré-tratamento com solventes ou ácidos podem ser utilizados
previamente no tratamento enzimático (Saha, 2003; Collins et al., 2005). Xilanases
adaptadas ao frio, que podem ser ativas em temperaturas baixas ou intermediárias,
podem oferecer vantagens sobre as xilanases utilizadas atualmente em muitos dos
processos com temperatura moderada, em particular na indústria de alimentos. Por
exemplo, as xilanases poderiam ser as mais aptas para o uso na indústria de panificação,
como no preparo da massa de pão, sendo geralmente conduzida à temperaturas abaixo
de 35ºC (Collins et al., 2005).
Xilanases estáveis e ativas a altas temperaturas e condições alcalinas são mais
susceptíveis a aplicações biotecnológicas. Uma das alternativas para identificar as
enzimas, que são termoestáveis e ativas a pH alcalinos, é explorar fontes naturais que se
encontram organismos alcalotermofílicos. Eles são conhecidos por produzirem enzimas
com maior termoestabilidade que aqueles derivados das suas contrapartes mesofílicas.
A estabilidade da enzima também pode ser aumentada através de modificação química,
ligações cruzadas, imobilização, tratamento com aditivos e engenharia de proteína. A
adição de pequenos compostos na solução de proteínas e modificação de
microambientes provém uma simples medida prática para aumentar a estabilidade da
enzima (George et al. 2001).
O efeito da temperatura na atividade de endoxilanases, observada no
sobrenadante dialisado da cultura testada, demonstrou um perfil ótimo com um máximo
de 60ºC. Estes resultados indicam que a estirpe S. malaysiensis AMT-3, sendo uma
estirpe mesofílica, é capaz de produzir enzimas que podem ser consideradas
termotolerantes a 30ºC. Contudo, foi observada uma boa atividade à 70oC, na qual foi
retida mais de 70% da atividade enzimática original máxima. Lemos e colaboradores
(2000) relataram uma faixa ótima de temperatura para atividade de endoxilanase em
Aspergillus awamori entre 50o e 70oC, com um ótimo de 60oC. Beg e colaboradores
(2000) demonstraram valores ótimos de temperatura em uma faixa de 50o a 65oC,
mesmo retendo uma atividade residual superior a 80% em 75oC para a estirpe
Streptomyces QG-11-3. Flores e colaboradores (1997) relataram um ótimo a 60oC para a
estirpe Streptomyces CH-M-1035, embora também tenha detectado uma atividade
Nascimento, R.P. Discussão
99
enzimática residual superior a 70% na faixa de 55o a 65oC. Marques e colaboradores
(1998) também demonstraram um ótimo à 60oC, em Bacillus sp., e mesmo ainda uma
atividade residual acima de 70% detectada a 50oC. Os resultados aqui apresentados
sugerem que a atividade enzimática da nossa estirpe apresenta um perfil amplo em
termos de temperatura, importante ferramenta quando se sugere uma utilização para
processos biotecnológicos, principalmente na área de papel e celulose ou mesmo na área
alimentícia, em processos como extração de sucos e clarificação de vinhos.
Para o uso em processos de biobranqueamento, as xilanases poderiam não
somente ser livres de celulases, como tambem ativas em altas temperaturas,
termoestáveis e alcalofílicas. Devido a altas temperaturas do processo de
biobranqueamento da polpa celulósica, é desejável que a enzima seja hábil em
condições alcalinas (pH 8,0–10,0) e altas temperaturas (60–90ºC), com períodos de
incubação entre 3 e 5 horas. O uso de xilanases para a deslignificação na indústria
papeleira tem sido desmotivado pela falta de disponibilidade de enzimas ativas em pH
acima de 8,0 e temperatura em torno de 60ºC, que são condições prevalentes em muitos
processos de branqueamento (Beg et al., 2000, Techapun et al., 2003a). Muitas
xilanases livres de celulases produzidas por microrganismos mesofilicos não são
termoestáveis, como observado em Streptomyces albus, S. lividans e S. cuspidosporus
que produzem xilanases estáveis a temperaturas inferiores a 70ºC (Techapun et al.,
2003a).
A avaliação da capacidade da enzima em manter sua atividade intacta ao longo
do tempo, uma etapa importante para a viabilização comercial da enzima, consiste na
estabilidade a estocagem. Este fator torna-se importante quando se pensa em escala
industrial, onde o tempo de durabilidade da atividade enzimática pode viabilizar ou não
sua comercialização. A estabilidade da enzima pode ser aumentada por modificação
química, ligações cruzadas, imobilização, tratamento com aditivos e engenharia de
proteínas (Gupta, 1991; George et al., 2001).
Em processos industriais, o tempo é fundamental. O estudo de termoestabilidade
enzimática em diferentes tempos de incubação é importante para determinar o quanto e
por quanto tempo a preparação enzimática pode suportar as condições aplicadas à
indústria de interesse. A maioria das xilanases termoestáveis conhecidas é produzida por
estirpes de Thermatoga, tendo uma meia vida de 90 minutos a 95°C (Sunna &
Antranikian, 1997), porém termoestabilidades de grande significância tem sido relatadas
para xilanases de muitas estirpes de Streptomyces, incluindo Streptomyces T7, com uma
Nascimento, R.P. Discussão
100
estabilidade a 50oC em pH 6,0 durante 6 dias (Keskar, 1992). No presente trabalho, a
preparação enzimática produzida por S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de reter 70% e
49,5% da atividade total por 18 e 24 horas, respectivamente, a 55°C, sugerindo que a
enzima pode ser uma importante ferramenta em aplicações que requeiram temperaturas
entre 50 e 70ºC.
O perfil de pH do melhor sobrenadante produzido por S. malaysiensis,
apresentou os melhores resultados na faixa entre 5,0 e 9,0, com um ótimo em 6,0. Estes
valores são similares àqueles obtidos para outras endoxilanases de várias estirpes de
Streptomyces (Kluepfel et al., 1992; Patel & Ray, 1994; Flores et al., 1997; Georis et
al., 2000). De acordo com Viikari e colaboradores (1994), algumas xilanases comerciais
testadas para auxiliar o branqueamento de polpas deram bons resultados com pH entre
5,0 e 7,0, a 35–55oC. Beg e colaboradores (2000) observaram que o ótimo de pH para
atividade de endoxilanase produzida por Streptomyces sp. QG-11-3, crescido em meio
de sais contendo xilana e sulfato de amónia, foi 8,6 a 60ºC, rentendo uma atividade
relativa superior a 75% na faixa entre 5,0 e 9,2. A atividade endoxilanásica também
demonstrou uma estabilidade de mais de 85% após 1 hora de pré incubação numa faixa
de pH entre 5,4 e 9,4, a 50ºC. O pH otimo de xilanases de actinomicetos, leveduras e
fungos é geralmente encontrado na faixa do ácido ao neutro. O pH ótimo para xilanases
de S. viridosporus T7A (Magnuson & Crawford, 1997) foi relatado entre 7,0 e 8,0. Por
outro lado, o ótimo de xilanases produzidas por Aspergillus fischeri Fxnl (Raj &
Chandra, 1996), A. oryzae NRRL 1808 (Cristov et al., 1999) e Gliocladium viride CBS
5870 (Cristov et al., 1999) foi 6,0 e sua estabilidade ao pH foram de 5,5 a 6,5; 5,0 a 6,0
e 5,0, respectivamente, retendo cerca de 80% da sua atividade original. Belfaquih e
colaboradores (2002) observaram que as xilanases das estirpes S2 e S3 (Streptomyces
sp.) mostraram um perfil similar para o ótimo de pH e estabilidade com uma importante
atividade xilanásica em condições alcalinas e praticamente zero na faixa compreendida
entre 4,0 e 6,0. Em contraste, a xilanase de S1 mostrou um perfil diferente com
atividade máxima em pH 6,5 (Belfaquih et al., 2002). No que diz respeito a
temperatura, a hidrólise máxima ocorreu entre 60 e 65ºC, após 10 minutos, observados
para as 3 estirpes de Streptomyces sp. Embora a maioria dos actinomicetos expressem
uma atividade máxima de endoxilanase em pH sensivelmente ácido a neutro, uma
ampla faixa de pH ótimo tem sido demonstrado para algumas estirpes de
Thermomonospora fusca (McCarthy et al, 1985) e Streptomyces (Belfaquih et al.,
2002). Este foi o caso da estirpe S. malaysiensis que apresentou um ótimo de pH em 6,0,
Nascimento, R.P. Discussão
101
mas com atividade superior a 60% na faixa do pH 5,0 a 8,0. Em estudos anteriores,
utilizando xilana oat spelts como fonte de carbono no meio de cultivo, a estirpe S.
malaysiensis apresentou um ótimo em pH 6,0, mas quase foi totalmente inativada em
pH 9,0, demonstrando alteração das propriedades bioquímicas das endoxilanases
produzidas (Nascimento et al., 2002).
Os dados referentes à inibição ou estímulo de íons metálicos na atividade
enzimática de enzimas de interesse industrial são de fundamental importância, pois
permite selecionarmos previamente certas condições do processo, impedindo prejuízos
futuros quando se passa da escala laboratorial para a escala industrial. Assim sendo, os
resultados obtidos no estudo do efeito dos íons metálicos demonstraram que na presença
de alguns dos íons testados (Ba2+ e Ca2+), a atividade enzimática total quase não sofreu
alteração, seja de forma positiva, seja de forma negativa. Alguns íons estudados foram
capazes de provocar uma leve inibição da atividade enzimática total. Outros autores
descrevem o estímulo da atividade de endoxilanase na presença de íons metálicos, como
Co2+, Mn2+ e Fe2+ (Cesar & Mrsa, 1997, Heck et al., 2005), e inibição na presença de
EDTA, Ca2+, Zn2+ e Co2+ (Liu et al., 1998, Heck et al., 2005). Interessantemente, dados
disponíveis na literatura indicam que na presença de Co2+, Mn2+ e Fe2+ pode haver um
estímulo da atividade de endoxilanase. Estes resultados não foram observados nas
preparações enzimáticas do presente trabalho, onde os íons Fe3+ (29,8%) e Mn2+ (9,5%)
provocaram um forte efeito inibitório na atividade xilanolítica. Beg e colaboradores
(2000) observaram que as endoxilanases de Streptomyces sp. QG-11-3 foram
marginalmente estimuladas em 1mM de Ca2+. Por outro lado, Cd2+, Co2+, Cr3+, ácido
iodoacético e iodoacetamida inibiram a atividade endoxilanásica até 35% a 1mM,
enquanto que Hg2+ inibiu completamente a enzima. A inibição de xilanases por Zn2+,
SDS, Co2+ e o estímulo da atividade enzimática na presença de Mn2+, Fe2+ e beta-
mercaptoetanol também já foram observadas (Beg et al., 2000). Heck e colaboradores
(2005) verificaram que os íons Mn2+ (124,2%) e Co2+ (159,3%) promoveram um
aumento na atividade enzimática, enquanto que na presença de Ca2+ (9,9%), Zn2+
(36,9%), Ba2+ (54,9%), Mg2+ (44,1%) e EDTA (43,2%) promoveram um decréscimo. Já
os íons Fe3+ (83,7%) e o Cu2+ (74,7%) produziram inibições discretas.
Quando cada fração do sobrenadante derivado das diferentes condições foi
introduzida no gel de poliacrilamida (PAGE), padrões semelhantes foram observados
em todas as condições, variando apenas a intensidade das bandas, consoante a
concentração das fontes de carbono e nitrogênio. Deng e colaboradores (2005)
Nascimento, R.P. Discussão
102
observaram que os xilanossomos (complexos ou agregados enzimáticos de alto peso
molecular) derivados de culturas com triptona, peptona de carne, nitrato de sódio e
fosfato monoácido de amônia apresentavam diferenças significantes quanto a atividade
específica da xilanase quando S. olivaceoviridis foi crescido em meio contendo estas
fontes de nitrogênio. Fontes de nitrogênio orgânico são geralmente melhores que as
fontes inorgânicas para a maioria dos microrganismos. A variação na composição de
muitos complexos xilanolíticos de alto peso molecular (xilanossomos), produzidos
extracelularmente por S. olivaceoviridis E-86 com várias fontes de nitrogênio, pode ser
devido a própria fonte de nitrogênio induzir várias atividades proteolíticas. Contudo, a
alteração da concentração dos sais fosfato no meio, das concentrações das fontes de
carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e das fontes de nitrogênio (extrato de
levedura e milhocina), foi suficiente para causar uma alteração da massa molecular
aparente das enzimas estudadas, quando comparado com estudos anteriores com a
mesma estirpe (Nascimento et al., 2002). As enzimas que antes tinham uma massa
molecular aparente de 170 e 240 kDa, além da presença de 2 complexos xilanossomos,
após o processo de otimização das condições de produção da enzima, apresentaram
apenas um possível complexo xilanossomo e 2 bandas com 142 e 180 kDa, sugerindo
uma possível alteração na estrutura quaternária da enzima, devido as condições de
cultivo alteradas. Na análise do zimograma, as atividades endoxilanásicas detectadas
correspondiam a região de alto peso molecular do PAGE-NATIVO, sugerindo a
formação de xilanossomos a partir das endoxilanases presentes no sobrenadante.
Cada organismo ou estirpe tem o seu próprio requerimento de condições
especiais para uma máxima produção de enzimas. Stress ambiental, tal como a depleção
de nutrientes, composição do meio de cultivo, oxigênio dissolvido, íons H+, bem como a
fase da cultura do inóculo, podem ter profundos efeitos na produção de qualquer
enzima, inclusive as xilanases (Beg et al., 2003). A produção de compostos bioativos ou
mesmo biomassa por microrganismos em laboratórios de escala piloto é um grande
desafio. A manutenção das condições ideais de crescimento e produção destes
compostos, mantendo o sistema livre de contaminação, representa um outro desafio para
qualquer indústria. Para manter estas condições sob controle, a produção é conduzida
em sistemas fechados, altamente controlados, conhecidos por fermentadores ou
biorreatores (Roseiro, 2003).
Nascimento, R.P. Discussão
103
O estudo da produção de endoxilanases em biorreatores foi conduzido no
presente trabalho com o objetivo de avaliar a produção em uma escala maior, visando
melhorar a produtividade obtida em frascos agitados (250 mL). Muita informação pode
ser obtida utilizando desenho experimental baseado em princípios estatísticos,
determinando um número mínimo de experimentos (Barros Neto et al., 1995). No
presente trabalho, as variáveis velocidade de agitação e taxa de aeração foram
estatisticamente otimizadas com a ajuda do desenho fatorial 22 utilizando o método de
superfície de resposta, com o intuito de determinar a melhor agitação e a melhor aeração
em biorreator do tipo STR de 2L, com um volume útil de 1L. O valor máximo de
atividade endoxilanásica (56,5 U/mL) observado no presente trabalho, após
planejamento fatorial, foi 2,0 vezes maior que o originalmente obtido em estudos
anteriores (28,4 U/mL), quando se utilizou 1% (p/v) de farelo de trigo como única fonte
de carbono, após 10 dias de fermentação (Nascimento et al., 2002) e 1,2 vezes maior
que o obtido na melhor condição em frascos agitados (45,8 U/mL).
No presente trabalho, os fatores aeração e agitação foram significantes,
apresentando um valor de p-level inferior a 0,01 (99% de confiabilidade estatística), o
que indica que estas variáveis podem agir como fatores limitantes e mesmo pequenas
variações nos seus valores irão alterar a atividade endoxilanásica a uma extensão
considerável, observando um efeito significante entre as interações destes fatores
(X1X2). Entretanto, a influência da aeração se dá de forma inversa e muito significativa,
indicando que o sistema tem uma melhor resposta para a produção de xilanases quanto
menor for a vazão de oxigênio (≤ 0,5 vvm). Reddy e colaboradores (2002) verificaram
uma máxima produção de xilanases (404,2 U/mL) por Thermomyces lanuginosus SSBP
utilizando 0,75 vvm, a 500 rpm, após 48 horas de fermentação, em biorreator de 30L.
Quando houve um aumento da vazão de oxigênio para 1,25 vvm, foi observado um
decréscimo da atividade enzimática, atingindo um máximo de 149,7 U/mL ao fim de 72
horas. Resultados similares foram observados por Hoq e colaboradores (1994),
utilizando T. lanuginosus RT9, que relataram um aumento da atividade de xilanase com
o aumento da aeração, sendo o máximo atingido a uma vazão de 1,0 vvm. Entretanto,
quando a aeração passou para 1,5 vvm, a atividade xilanolítica caiu 1,5 vezes. O mesmo
foi observado para a estirpe S. malaysiensis AMT-3, tendo sido verificado que quanto
menor a taxa de aeração, maior a atividade enzimática. Entretanto, quando se utilizou
valores de aeração elevados (1,5 vvm), a produção de xilanases foi severamente afetada,
Nascimento, R.P. Discussão
104
indicando um possível efeito inibitório da produção em altas concentrações de oxigênio,
em virtude da toxicidade do oxigênio em altas concentrações.
Techapun e colaboradores (2003b) realizaram um estudo sobre o efeito da
agitação e da aeração na produção de xilanases por Streptomyces sp. Ab106, baseado no
desenho experimental com ponto central, em biorreator de 5L. Utilizando uma agitação
de 150 rpm e aumentando a aeração de 0 a 1,0 vvm, Techapun e colaboradores (2003b)
observaram um aumento na produção de xilanases, atingindo o nível máximo de
produção ao fim de 6 dias de fermentação. No entanto, quando o valor de aeração foi
superior a 1,0 vvm, houve um decréscimo da produção. Estudos em microscopia
revelaram que altas velocidade de agitação alteraram a morfologia do Streptomyces sp.
Ab106, o que resultou na redução da produtividade. Palma e colaboradores (1996) e
Cho e colaboradores (2002) também observaram uma alteração da morfologia dos
fungos Penicillium janthinellum e Paecilomyces sinclairii em alta velocidade de
agitação. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 também apresentou alteração de morfologia
quando se utilizou 600 rpm de agitação, o que pode ser um fator importante para
explicar a baixa atividade enzimática. Contudo, quando se utilizou uma vazão de
oxigênio de 0,5 vvm, a produção de xilanases, ao término de 6 dias, foi de 56,5 U/mL, o
que sugere a forte influência de ordem inversa da aeração na resposta do sistema.
Analisando os perfis obtidos em biorreator de 2L (Fig. 15), verificou-se que a
maior produção de xilanases aconteceu no sistema em que ocorreu o maior consumo de
oxigênio (300 rpm e 0,5 vvm). Porém, quando se analisou a 2ª condição na qual houve
maior consumo de oxigênio (300 rpm e 1,5 vvm), a produção de xilanase não foi a 2ª
maior, sugerindo que os fatores agitação e aeração não são os principais fatores que
interferem na produção de xilanases. A alteração da taxa de aeração de 0,5 vvm para 1,5
vvm foi o suficiente para interferir negativamente no sistema, diminuindo a produção de
xilanases. Todavia, fatores como a composição do meio, força iônica, turbilhonamento,
dentre outros, podem estar envolvidos na produção de xilanases. Até o presente
momento, não há dados na literatura que possam justificar esse efeito inverso observado
na estirpe S. malaysiensis AMT-3, relacionando a velocidade de agitação com a taxa de
aeração.
Após determinar as melhores condições de agitação e aeração em biorreator de
2L agitado mecanicamente, um estudo em biorreator, do mesmo tipo, de maior
capacidade (16L) foi realizado. O estudo de scale-up pode ser feito baseado em alguns
Nascimento, R.P. Discussão
105
critérios de extrema importância. Os critérios adotados no presente estudo foram o
critério geométrico, visando a manutenção da velocidade periférica (na ponta do
impelidor) constante, e o critério de transferência de massa, que visa a manutenção da
capacidade de oxigenação do sistema (KLa). Este último critério pode ainda ser
conseguido por duas estratégias; um mantendo a velocidade de agitação constante e
alterando a taxa de aeração e outro, mantendo a taxa de aeração e alterando a velocidade
de agitação. Algumas variáveis podem afetar o KLa do biorreator, como a altura da
coluna líquida, a vazão do oxigênio, o tipo de impelidor, viscosidade e a velocidade de
agitação. Uma maior velocidade de agitação implica num aumento do turbilhonamento
e, consequentemente, em um aumento na taxa de transferência de oxigênio, em virtude
da diminuição da espessura da película líquida ao redor da bolha gasosa (Kossen &
Oosterhuis, 1985; Bon & Pereira Jr., 1999, Roseiro, 2003). A determinação do KLa pode
ser feita por métodos indiretos, como a desgaseificação, que envolve a eliminação do
oxigênio no interior do biorreator, por borbulhamento de nitrogênio, a fim de levar a
zero a concentração inicial do oxigênio e, desta forma, aumentar a faixa para o estudo
dinâmico da absorção de oxigênio. Quando o oxigênio dissolvido atinge um valor
mínimo (próximo a zero), reverte-se o processo, suprimindo o borbulhamento do
nitrogênio e acionando a aeração. O processo é seguido por uma sonda de oxigênio
dissolvido que produz um registro gráfico idêntico ao apresentado nas Figuras A2-I e
A2-III (vide ANEXO 2).
O processo de aeração provoca um aumento da concentração do oxigênio
dissolvido, gerando a equação:
( )LSLL CCaK
dtdC
−=
Que após integração, resulta em:
( ) taKCCLn LLS ⋅∝−
Portanto, coloca-se diretamente os dados experimentais em gráfico, apresentado
nas Figuras A2-II e A2-IV (vide ANEXO 2), cuja inclinação da reta corresponde ao
coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio, o KLa (Roseiro, 2003).
Para um determinado tipo de reologia introduzido pelos componentes do meio e
pelas células microbianas, a agitação é o parâmetro que tem maior influência na
Nascimento, R.P. Discussão
106
transferência de oxigênio. A agitação aumenta a área de contato gás-líquido por
dispersar o ar sob a forma de pequenas bolhas, aumentando o tempo de permanência das
bolhas no seio da cultura e evitando a coalescência das bolhas de ar (Pereira Jr., 2003).
O grau de agitação utilizado provém da rotação de turbinas ligadas a um motor e pode
ser expresso em termos de potência absorvida no interior do vaso em condições de
processo. Assim, ampliar a escala de produção de um sistema de fermentação
corresponde a utilização de condições de reação que permitam manter o rendimento e
produtividade do processo, aumentando a quantidade final do produto. A escala de
bancada, em que a operação tem como objetivo estudar a fisiologia microbiana, as
culturas são desenvolvidas em condições de boa homogeneização, que é facilmente
conseguida utilizando um volume pequeno. Na escala piloto, estudam-se essencialmente
os problemas de transferência e problemas típicos da produção em escala elevada, como
a deficiência de aeração. Nesta escala, há uma incidência de estudos de engenharia os
quais permitem resolver problemas que ocorrem durante a fase de produção (Stanbury
& Whitaker, 1984; Thiry & Cingolani, 2002; Roseiro, 2003).
A otimização da produção de enzimas é um fator chave para o sucesso na
implementação de enzimas em uso sintético. Exemplos na literatura para biorreatores de
pequena escala reforçam a importância das condições do meio de cultura para obter uma
boa produção de uma dada enzima. A ampliação dessa escala implica no estudo de
fatores de ordem fisica que interferem diretamente no metabolismo do microrganismo
(Junker et al., 2001). Tentativas em produzir endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3
em uma escala ampliada (biorreator de 16L), não foi bem sucedida. Provavelmente, a
dissimilaridade geométrica dos biorreatores empregados (diferença das dimensões
geométricas, presença de dois impelidores, dentre outros) associado a uma instabilidade
fisiológica dos estreptomicetos, podem ter sido a causa para tão baixa produção.
Contudo, para comprovar se algum destes efeitos foi realmente o responsável pela baixa
produção, um estudo paralelo foi realizado em biorreator de 2L para testar a viabilidade
da estirpe. Foi constatado, que na melhor condição (300 rpm e 0,5 vvm) houve um
decréscimo de 74% da atividade enzimática, sugerindo que a estirpe não estava em
condições adequadas. Outro fator impotante foi a utilização de uma segunda suspensão
de esporos, em virtude do término do primeiro estoque, diferente daquela obtida
inicialmente, a qual gerou todo o trabalho em frascos agitados e biorreatores de 2L.
Considerando os resultados obtidos neste trabalho, podemos dizer que a estirpe
selecionada, o Streptomyces malaysiensis AMT-3, possui sob vários aspectos, um
Nascimento, R.P. Discussão
107
importante potencial para aplicações biotecnológicas, em especial indústria papeleira e
indústria alimentícia. O gênero Streptomyces por si só já representa um papel
importante, visto que pode ser considerado seguro para manuseio humano, e vários
procedimentos já têm sido relatados com xilanases de estreptomicetos mesofílicos não
só no tratamento da polpa de papel (Garg et al., 1996) como também em aplicações na
indústria alimentícia. Por outro lado, a aplicação das xilanases, em conjunto com
celulases, na conversão de biomassa renovável em combustível líquido, ainda não é
economicamente viável. Entretanto, as severas regulações ambientais e a necessidade de
reduzir a emissão de gases que provocam o efeito estufa, tem impulsionado o
desenvolvimento de futuras pesquisas no estudo das xilanases (Kulkarni et al., 1999)
para esta finalidade.
Paralelamente ao estudo da produção de endoxilanases, foi realizado um estudo
para verificar a capacidade da estirpe S. malaysiensis AMT-3 em produzir celulases
(CMCases). A atividade simples de endoglucanase é frequentemente representada pela
atividade de carboximetilcelulase (CMCase). A atividade de CMCase pode ser utilizada
para refletir toda a atividade de celulase livre ou ligada durante a hidrólise enzimática da
celulose para certas reações do sistema celulose-celulase (Zhou et al., 2004).
Curiosamente, a melhor condição observada para a produção de CMCases pela estirpe
S. malaysiensis AMT-3 não foi a mesma observada para a produção de endoxilanases.
O perfil cinético da produção de CMCases em meio de sais minerais, contendo farelo de
trigo ou dreche cervejeiro como fontes de carbono, e milhocina ou extrato de levedura
como fontes de nitrogênio, em diferentes concentrações, indicou uma maior atividade
de CMCases (720 U/L) ao fim de 4 dias de fermentação, utilizando dreche cervejeiro
[0,5% (p/v)] como fonte de carbono e milhocina [1,2% (p/v)] como fonte de nitrogênio.
Este fato é importante ressaltar pois a melhor condição para produção de CMCases não
foi a mesma para a produção de xilanases, o que sugere uma possível aplicação deste
extrato enzimático em processos da indústria papeleira, embora valores superiores a 500
U/L tenham sido observados. Estes valores são relativamente baixos quando
comparados com dados na literatura para outros microrganismos. George e
colaboradores (2001) observaram uma máxima produção de CMCase em um
actinomiceto termoalcalofílico de 23 U/mL ao fim de 5 dias, utilizando cellulose paper
powder, a 4% (p/v). A utilização de farelo de trigo (8,5 U/mL) e sabugo de milho (12,5
U/mL) também induziram a níveis consideráveis de CMCase. Jang & Chen (2003)
Nascimento, R.P. Discussão
108
observaram uma produção máxima de CMCase (40,3 U/mL), com 1,5% (p/v) de
carboximetilcelulose (CMC), utilizando uma estirpe transformada de Streptomyces T3-
1. Lima e colaboradores (2005) observaram uma produção máxima de CMCase (595
U/L) em meio contendo 1,0% (p/v) de CMC e 0,3% (p/v) de extrato de levedura, ao fim
de 3 dias, utilizando a estirpe S. drozdowiczii M-7a. Surpreendentemente, o aumento da
concentração de extrato de levedura para 1% levou a uma ligeira queda na produção de
CMCase no 4º dia. Entretanto, o máximo de atividade celulolítica (300 U/L) foi
observado ao fim de 2 dias. Através da combinação de farelo de trigo [1,0% (p/v)] e
milhocina [0,3% (p/v)] foi possível obter uma produção máxima de CMCase (230 U/L)
ao fim de 4 dias. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de produzir valores
superiores a estirpe S. drozdowiczii M-7a, obtendo um valor de 510 U/L quando se
utilizou estas fontes, embora em concentrações diferentes.
A aplicação de enzimas nas indústrias de papel, detergentes e couro demanda
identificação de enzimas altamente estáveis e ativas a valores de temperaturas e pH
extremos. Existe um número de artigos na literatura relatando a produção de celulases
por microrganismos termófilos. As celulases têm sido investigadas principalmente no
que diz respeito ao seu potencial uso industrial na bioconversão de biomassa agrícola
em produtos com valor comercial. Recentemente, as celulases têm sido aplicadas com
sucesso em aditivos nos detergentes de lavanderia. A proporção corrente da produção
total de enzimas para o mercado da indústria de lavanderia excede os 30%. Devido ao
aumento da pressão ambiental nas indústrias de papel e têxtil, as celulases são esperadas
para desempenharem um papel importante no desenvolvimento de tecnologias limpas
no processamento do denim e na descoloração do papel (George et al., 2001). Desta
forma, a maior aplicação das celulases hoje em dia é na indústria têxtil, onde altas
temperaturas (50–65ºC) e pH alcalino requer a utilização de enzimas termo-alcalofílicas
para um biopolimento e e bioestonagem eficientes (Bhat, 2000). Durante o processo de
bioestonagem, as celulases agem no algodão fabril e quebram os terminais das pequenas
fibras na superfície do fio, desse modo perdendo o indigo, que é facilmente removido
por abrasão mecânica nos ciclos de lavagens (Bhat, 2000). O biopolimento é usualmente
realizado durante a etapa têxtil do processo de secagem e inclui degomagem,
escorrimento, branqueamento, coloração e finalização. Durante este processo, as
celulases agem nos terminais das pequenas fibras que ressaltam da superfície fabril,
onde a ação mecânica remove estas fibras e poli o tecido fabril (Bhat, 2000).
Nascimento, R.P. Discussão
109
O efeito da temperatura na atividade de CMCases, observada no sobrenadante
dialisado da cultura testada, demonstrou um perfil ótimo com um máximo de 50ºC.
Contudo, foi observada uma boa atividade entre 30º e 70oC, onde foi retida mais de
50% da atividade enzimática original máxima. Lima e colaboradores (2005) observaram
um ótimo de temperatura a 50ºC, retendo mais de 80% de atividade residual a 60ºC para
a estirpe S. drozdowiczii M-7a. Jang & Chen (2003) observaram um ótimo de 50ºC,
retendo ainda uma atividade residual máxima acima dos 70% entre 40º e 75ºC, com a
estirpe transformada Streptomyces T3-1. Os resultados aqui apresentados sugerem que a
atividade enzimática da nossa estirpe apresenta um perfil amplo em termos de
temperatura, importante característica para aplicações biotecnológicas. O estudo de
termoestabilidade enzimática em diferentes tempos de incubação é importante para
determinar o quanto e por quanto tempo a preparação enzimática pode suportar as
condições aplicadas à indústria de interesse. Jang & Chen (2003), verificaram que a
CMCase produzida por Streptomyces T3-1 foi altamente estável a 40º e 50ºC, retendo
mais de 90% da atividade residual, mesmo após 180 horas. George e colaboradores
(2001) observaram uma alta estabilidade da CMCase produzida por um actinomiceto
alcalotermotolerante, retendo mais de 98% da atividade, ao fim de 20 horas, a 50ºC. No
presente trabalho, a preparação enzimática foi capaz de reter 50% da atividade total por
2 e 24 horas, respectivamente, a 50° e 40ºC, sugerindo alguma possibilidade de
aplicação biotecnológica.
O perfil de pH apresentou os melhores resultados na faixa entre 2,0 e 9,0, com
um ótimo em 4,0. Estes valores não são muito comuns àqueles obtidos para outras
CMCases de várias estirpes de Streptomyces (Jang & Chen, 2003, George et al., 2001).
George e colaboradores (2000), observaram um ótimo de pH a 5,0, retendo apenas 10%
da atividade residual em pH 8,0, utilizando uma estirpe de actinomiceto
alcalotermofílico. Jang & Chen (2003) observaram que o ótimo de pH para atividade de
CMCase produzida pela estirpe transformada Streptomyces T3-1, crescido em meio de
sais foi 7,0, rentendo uma atividade relativa superior a 50% na faixa entre 5,0 e 9,0. O
pH ótimo de CMCases de actinomicetos, leveduras e fungos é geralmente encontrado na
faixa do ácido ao neutro. Este foi o caso da estirpe S. malaysiensis que apresentou um
ótimo de pH em 4,0, mas com atividade superior a 60% na faixa do pH 2,0 a 9,0.
As frações dos sobrenadantes das melhores condições para a produção de
CMCases foram introduzidas no PAGE, e padrões semelhantes foram observados em
todas as condições, variando apenas a intensidade das bandas, consoante ao tipo e
Nascimento, R.P. Discussão
110
concentração das fontes de carbono e nitrogênio. Somente foram detectadas 2 bandas
celulolíticas no PAGE-nativa, sendo uma provável justificativa para o gráfico de pH
onde se observa um padrão duplo, indicando a presença de 2 isoformas. Atualmente
existem poucos dados na literatura sobre a caracterização de celulases, a nivel de
zimograma. Kaur e colaboradores (2005) observaram 2 endoglucanases de massa
molecular aparente de 40 e 50 kDa produzidas por Melanocarpus sp. MTCC 3922 em
meio de sais minerais suplementado de glucose e extrato de levedura.
O uso de celulose como um substrato para ser utilizado na produção de celulases
é economicamente viável, em que a utilização de outras fontes de baixo custo ricas em
celulose, visto que a maioria dos substratos disponíveis são de baixo custo, pode ser
uma outra alternativa de minimizar ainda mais os custos. Desta forma a utilização de
resíduos agrícolas torna-se atraente sob o ponto de vista da valorização e diminuição do
custo de produção. Assim sendo, a utilização da estirpe S. malaysiensis AMT-3 na
produção de CMCases pode apresentar um atrativo biotecnológico, embora os valores
de atividade sejam relativamente baixos.
As peptidases constituem um dos mais importantes grupos de enzimas
industriais, contabilizando pelo menos ¼ do mercado mundial de produção de enzimas
(Layman, 1986, Anwar & Saleemuddin, 1998). As peptidases são um grupo importante
de enzimas produzidas comercialmente, sendo utilizadas em detergentes, proteínas,
ração animal, material fotográfico, couro. Atualmente, a indústria de detergentes emerge
como o principal consumidor de várias enzimas hidrolíticas com ação em pH alcalino.
O principal uso de peptidases compatíveis com detergentes é na formulação de
detergentes para lavanderia (Anwar & Saleemuddin, 1998).
As peptidases utilizadas na indústria podem ser obtidas de microrganismos
selvagens ou geneticamente modificados. A produção de peptidases por microrganismos
e suas potenciais aplicações biotecnológicas ja vêm sendo estudada há muito tempo. Por
outro lado, a produção de peptidases por microrganismos pode apresentar um certo
desfavorecimento, quando se visa a produção de outras enzimas hidrolíticas, como as
degradadoras de materiais lignocelulósicos. Assim sendo, faz-se importante estudar a
produção e um possível efeito das peptidases no rendimento da atividade enzimática de
outras hidrolases. Sabe-se que a produção de peptidases extracelulares em actinomicetos
é influenciada por parâmetros como pH, temperatura, meio de cultivo, composição do
meio e tipo de metabolismo (Kumar and Takagi 1999; Moreira et al. 2003). Devido a
Nascimento, R.P. Discussão
111
estes fatores, uma grande heterogeneidade pode ser observada na produção de
peptidases, em resposta aos tipos e concentrações de substratos no meio de cultivo. Até
o presente momento, não há relatos na literatura que descrevam o efeito da combinação
de fontes como farelo de trigo, dreche cervejeiro, extrato de levedura e milhocina na
produção de peptidases.
O perfil de produção de peptidases, pela estirpe S. malaysiensis, em diferentes
fontes de carbono e nitrogênio mostrou-se bastante variado. Ao se alterar a
concentração das fontes estudadas, observou-se uma alteração do perfil das peptidases
produzidas, sugerindo que a concentração destas fontes, como por exemplo, dreche
cervejeiro e milhocina, pode influenciar diretamente o metabolismo do microrganismo e
consequentemente a expressão destas enzimas. Ao se utilizar a máxima concentração
estudada, a produção de peptidases, para esta combinação de fontes foi bastante
prejudicada, enquanto que na menor concentração, houve uma expressão mais
significativa. No que diz respeito a combinação farelo de trigo e extrato de levedura,
observamos que apenas alterando a concentração destas fontes, é possível alterar o
perfil de produção de peptidases, sugerindo a importância da concentração de fontes
protéicas na expressão de peptidases extracelulares (Nascimento et al., 2005), como o
observado para a estirpe S. malaysiensis AMT-3. De Azeredo e colaboradores (2003)
observaram que a produção de peptidases extracelulares por Streptomyces sp. 594 tinha
início a partir do 3º dia de fermentação, tal como observado para a estirpe S.
malaysiensis AMT-3, correspondendo, em ambos, ao início da fase estacionária. No
gênero Streptomyces, encontra-se descrito na literatura, que as peptidases da classe
serina- são expressas na fase estacionária, e regulam o processo de morfogênese
intimamente associado ao crescimento micelial (Kim & Lee 1995, Lopes et al. 1999).
Esta característica é similar àquelas descritas na literatura para outros actinomicetos
produtores de peptidases, como o Streptomyces sp. G157 (Sampath et al. 1997) e
Nocardiopsis spp. (Moreira et al. 2003). Certamente, peptidases e outras enzimas
utilizadas em formulações de detergentes podem ter alta atividade e estabilidade numa
ampla faixa de pH e temperatura (Kumar and Takagi 1999). Serina-peptidases de
estreptomicetos descritas na literatura usualmente apresentam massa molecular aparente
entre 22 e 30 kDa (Yeoman & Edwards 1994), exceto àquelas relatadas por De Azeredo
e colaboradores (2004), na qual uma serina peptidase de 113.7 kDa foi observada.
Serina e metalopeptidases têm sido descritas comumente no gênero Streptomyces, como
observado com as estirpes Streptomyces sp. 594, S. malaysiensis AMT-3 (De Azeredo
Nascimento, R.P. Discussão
112
et al. 2004; Nascimento et al, 2005). Entretanto, a natureza e características de cada
componente do complexo peptidase, derivado dos estreptomicetos, não foi ainda
extensivamente estudada. Traçando um perfil comparativo com a condição ótima
observada para a produção de endoxilanases, a condição ótima para a produção de
peptidases foi em farelo de trigo e extrato de levedura, embora o perfil cinético seja
muito semelhante com o observado para as endoxilanases.
A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de produzir peptidases com
diferentes massas moleculares, dentro de duas classes, serina e metalo peptidases. Com
características peculiares, especialmente no que diz respeito a resistência a altas
temperaturas, estas peptidases apontam para uma possível aplicação biotecnológica,
sendo necessários estudos mais aprofundados dentro desta área para determinar a
potencialidade desta estirpe e das peptidases produzidas por ela.
Nascimento, R.P. Conclusão
113
6. CONCLUSÕES
A atividade máxima de endoxilanases em frascos agitados (média de 45,8 U/mL) foi
observada quando as fontes farelo de trigo e milhocina foram utilizadas nas concentrações de
2,5% (p/v) e 1,2% (p/v), respectivamente, após 6 dias de fermentação.
A utilização de 1,2% (p/v) de extrato de levedura, independentemente da fonte de
carbono, influenciou negativamente a produção de xilanases, aumentando os valores de pH do
meio de cultivo e diminuindo os valores de endoxilanases produzidas. Com relação a
concentração de fonte de carbono, seja dreche cervejeiro ou farelo de trigo, a que melhor
influenciou positivamente a produção de endoxilanases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3
foi a de 2,5% (p/v).
Em termos estatísticos, no nível de 5% de grau de confiança (95% de confiabilidade
estatística), o coeficiente linear X1 (concentração de farelo de trigo), X2 (concentração de
milhocina) e o coeficiente de interação X1X2 foram significativas, devido aos baixos valores
de p-level (<0,05).
A estirpe aumentou a produção de endoxilanases em 1,2x em bioreator do tipo STR de 2L
(média de 56,5 U/mL), quando comparado com os valores de atividade obtidos na melhor
condição vista em frascos agitados (45,8 U/mL).
A taxa de aeração e a velocidade de agitação apresentaram efeito estatistico significante,
sendo a aeração o fator com maior efeito de ordem inversa na resposta (produção de xilanase),
em biorreator de 2L.
O estudo de produção de endoxilanases em escala ampliada (1:8), em biorreator de 16L
não foi bem sucedida, devido a interferência de fatores de ordem física e biológica,
necessitando novos estudos nesta área.
A atividade xilanolítica produzida pela estirpe de Streptomyces malaysiensis AMT-3 foi
considerada bastante vantajosa pois é estável a 50°C e mantém mais de 60% da atividade
máxima entre 40º e 70ºC. Além disso, possui um ótimo de pH em 6,0 e ainda consegue reter
Nascimento, R.P. Conclusão
114
60% da atividade entre pH 5,0 e 9,0. A estabilidade ao congelamento e descongelamento
mostram a resitência do extrato bruto a processos fisicos relacionados a temperatura,
mantendo atividade superior a 96%, mesmo após 6 meses de estocagem.
A atividade celulolítica detectada nos sobrenadantes foi baixa quando comparada com
outras estirpes na literatura, mas apresentou características peculiares, como uma boa atuação
numa ampla faixa de pH (2,0–9,0) e temperatura (40–60ºC). Os valores de CMCase
observados, a princípio não representam efeito de caráter negativo na produção das
endoxilanases.
As peptidases produzidas em frascos agitados apresentaram características que indicam
uma possível aplicação biotecnológica. Com estabilidade a 60ºC por 120 minutos e atividade
em pH variando de 6,0 a 9,0, as peptidases produzidas por S. malaysiensis, a princípio, não
exerceram efeito negativo sobre as xilanases.
O estudo da utilização de resíduos agro-industriais como fontes alternativas para a
produção de endoxilanases revelou farelo de trigo e milhocina como ótimos indutores. A
produção de xilanases nestes resíduos pode representar, em nível industrial, um processo
importante no aproveitamento de resíduos agro-industriais e na indústria alimentícia.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
115
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• AKHNAZAROVA, S. & KAFAROV, V. Experiment optimization in chemistry and
chemical engineering. Moscow: Mir. 1982.
• ALI, M. K., KIMURA, T., SAKKA, K. & OHMIYA, K. The multidomain xylanase
Xyn10B as a cellulose-binding protein in Clostridium stercorarium. FEMS.
Microbiol. Lett. v. 198, pp. 79-83, 2001.
• ALMAN, A.R. Fermentors: design, operation and applications. In: Fermentation
Microbiology and Biotechnology. EL-MANSI, M. & BRYCE, C. (eds). pp. 9-48.
Taylor & Francis, London, 1999.
• ANSEJO, J. A. & MERCHUCK, J. C. Bioreactor system design. Marcel Dekker,
Inc. New York. 1995.
• ANWAR, A. & SALEEMUDDIN, M. Alkaline proteases: A review. Biores.
Technol. v. 64, pp. 175–183, 1998.
• ARISTIDOU, A. & PENTTILÄ, M. Metabolic engineering applications to
renewable resource utilization. Curr. Opin. Biotechnol. v. 11, pp. 187-198, 2000.
• BAILEY, M. J., BIELY, P. & POUTANEN, K. Interlaboratory testing of methods
for assay of xylanase activity. J. Biotech. v. 23, pp. 257-270, 1992.
• BALL, A. S. & MCCARTHY, A. J. Saccharification of straw by actinomycete
enzymes. J. Gen. Microbiol. v. 134, pp. 2139-2147, 1988.
• BARRET, A.J. Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidases. Methods
Enzymol. v. 244, pp.1-15, 1994.
• BARROS NETO, B., SCARMÍNIO, I.S., BRUNS, R.E. "Planejamento e
Otimização de Experimentos". Editora da Unicamp, Campinas, Brasil. 1995.
• BASTAWDE, K. B. Xylan structure, microbial xylanases and their mode of action.
World J. Microbiol. Biotechnol. v. 8, pp. 353-368, 1992.
• BAYER, E. A & LAMED, R. The cellulose paradox: pollutant par excellence and/or
a reclaimable natural resource? Biodegradation v. 3, pp. 171-188, 1992.
• BAYER, E.A., CHANZY H., LAMED, R. & SHOHAM, Y. Cellulose, cellulases
and cellulosomes. Curr. Opi. Struc. Biol. v. 8, pp. 548-557, 1998.
• BEG, Q. K., BHUSHAN, B., KAPOOR, M. & HOONDAL, G.S. Production and
characterization of thermostable xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-
11-3. J. Ind. Microbiol. Biotech. v. 24, pp. 396-402, 2000.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
116
• BEG, Q.K., KAPOOR, M., MAHAJAN, L. & HOONDAL, G.S. Microbial
xylanases and their industrial applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.
56, pp. 326–338, 2001.
• BEG, Q.B., SAHAI, V. & GUPTA, R. Satistical model optimization and alkaline
protease production from Bacillus mojavensis in a bioreactor. Proc. Biochem. v. 39,
pp. 203-209, 2003.
• BÉGUIN, P. & AUBERT, J.P. The biological degradation of cellulose. FEMS
Microbiol. Rev. v. 13, pp. 25-58, 1994.
• BELFAQUIH, N. & PENNINCKX, M. J. A bifunctional β-xylosidase-xylose
isomerase from Streptomyces sp. EC 10. Enz. Microb. Tecnol. v. 27, pp. 114-121,
2000.
• BELFAQUIH, N., JASPERS, CH., KURZATKOWSKI, W. & PENNINCKX, M. J.
Properties of Streptomyces sp. endo-β-xylanases in relation to their applicability in
kraft pulp bleaching. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 18, pp. 699–705, 2002.
• BHAT, M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotech. Adv. v. 18,
pp. 355–383, 2000.
• BIDLACK, J., MALONE, M. & BENSON, R. Molecular structure and component
integration of secondary cell walls in plants. Proc. Okla. Acad. Sci. v. 72, pp. 51-56,
1992.
• BIELY, P. Microbial xylanolytic systems. Trends Biotechnol. v. 3 (11), pp. 286-
290, 1985.
• BIELY, P., VRSANSKÁ, M. & KUCÁR, S. Identification and mode of action of
endo-(1→4)-β-xylanases. In: Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology 7.
VISSER, J., BELDMAN, G., KUSTERS-VAN SOMEREN, M. A. & VORAGEN,
A. G. J. (eds.) Elsevier. 1992.
• BIELY, P., KLUEPFEL, D., MOROSOLI, R. & SHARECK, F. Mode of action of
three endo-β-1,4-xylanases of Streptomyces lividans. Biochim. Biophys. Acta v.
1162, pp. 246-254, 1993.
• BIELY, P., VRSANSKÁ, M., TENKANEN, M. & KUEPFEL, D. Endo-β-1,4-
xylanase families: differences in catalytic properties. J. Biotechnol. v. 57, pp. 151-
166, 1997.
• BIRSAN, C., JOHNSON, P., JOSHI, M., MCLEOD, A., MCINTOSH, L.,
MONEM, V., NITZ, M., ROSE, D. R., TULL, D., WAKARCHUCK, W. W.,
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
117
WANG, Q., WARREN, R. A. J., WHITE, A., WITHERS, S. G. Mechanisms of
cellulases and xylanases. Biochem. Soc. Trans. v. 26, pp. 156-160, 1998.
• BISWAS, S. R., MISHRA A. K., NANDA, G. Induction of xylanase in Aspergillus
ochraceus. Folia Microbiol. v. 33, 355-359, 1988.
• BLANCHETTE, R. A. Degradation of the ligocellulose complex in wood. Can. J.
Bot. v. 73, pp. S999 – S1010, 1995.
• BOCCHINI, D.A., ALVES-PRADO, H.F., BAIDA, L.C., ROBERTO, I.C.,
GOMES, E. & DA SILVA, R.. Optimization of xylanases production by Bacillus
circulans D1 in submerged fermentation using response surface methodology. Proc.
Biochem. v. 38, pp. 727-731, 2002.
• BÖCKLE, B., GALUNSKY, B. & MÜLLER R. Characterization of a keratinolytic
serine proteinase from Streptomyces pactum DMS 40530. Appl. Environm.
Microbiol. v. 61, pp. 3705-3710, 1995.
• BON, E. P. S. & PEREIRA JR., N. Bioprocessos Industriais, In: Tecnologia
Enzimática, pp. 24–46. Rio de Janeiro, RJ. 1999.
• BOX, G.E.P. & WILSON, K.B. On the experimental attainment of optimum
conditions. J.R. Statist. Soc. v. 13, pp. 1-45, 1951.
• BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.
Biochem. v. 72, pp. 248-254, 1976.
• BRECCIA, J. D.; CASTRO, G. R.; BAIGARI, M. D. & SIÑERIZ, F. Screening of
xylanolitic bacteria using a colour plate method. J. Appl. Bacteriol. v. 78, pp. 469-
472, 1995.
• BRERETON, R. G. "Chemometrics in Analytical Chemistry - A Review", Analyst
v. 112, pp.1635–1657, 1987.
• BROWN, P. D. Clinical trials of low molecular weight matrix metalloproteinase
inhibitors in cancer. Inhibition of matrix metalloproteinases. Therapeutic potential.
AN. NY Acad. Sci. v. 732, pp. 217-221, 1994.
• CAO, Y. & TAN, H. Effects of cellulase on the modification of cellulose.
Carbohyd. Res. v. 337, pp.1291-1296, 2002.
• CESAR, T., MRSA, V. Purification and properties of the xylanase produced by
Thermomyces lanuginosus. Enz. Microb. Technol. v. 19, pp. 289-296, 1996.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
118
• CHANDRASEKARAN, S. & DHAR, S.C. Multiple proteases from Streptomyces
moderatus. II. Physiochemical and enzymatic properties of the extracellular
proteases. Arch. Biochem. Biophys. v. 257, pp. 402-408, 1987.
• CHEN, C., CHEN, J. L. & LIN, T. Y. Purification and characterization of a
xylanase from Trichoderma longibrachiatum for xylooligosaccharide production.
Enz. Microb. Technol. v. 21, pp. 91-96, 1997.
• CHIPLONKAR, J. M., GANGODKAR, S. V., WAGH, U. V., GHADGE, G. D.,
RELE, M. V. & SRINIVASSAN, M. C. Applications of alkaline protease from
Conidiobolus in animal cell culture. Biotechnol. Lett. v. 7, pp. 665-668, 1985.
• CHO, Y.J., HWANG, H.J., KIM, S.W., SONG, C.H. & YUN, J.W. Effect of carbon
source and aeration rate on broth rheology and fungal morphology during red
pigment production by Paecilomyces sinclairii in a batch bioreactor. J. Biotechnol.
v. 95, pp. 13-23, 2002.
• COLLINS, T.; GERDAY, C. & FELLER, G. Xylanases, xylanase families and
extremophilic xylanases. FEMS Microbiology Rev. v. 29, pp. 3-23, 2005.
• COLOWICK, S. P. & KAPLAN, N. O. (eds.) Section I. General Preparative
Procedures. Methods in Enzymology. v. 1, pp. 138-146, 1955.
• COUGHLAN, M. P. Cellulose degradation by fungi. In: Microbial Enzymes and
Biotechnology, FOGARTY, W.M. AND KELLY, C.T. (eds.), 2nd ed., pp. 1-36.
Elsevier Applied Science. 1990.
• COUGHLAN, M. P. Towards an understanding of the mechanism of action of main
chain-hydrolysing xylanases. In: Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology
7. VISSER, J., BELDMAN, G., KUSTERS-VAN SOMEREN, M. A. &
VORAGEN, A. G. J. (eds.) Elsevier. 1992.
• COUGHLAN, M. P. & HAZLEWOOD, G. P. β-1,4-D-xylan-degrading enzyme
systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol. Appl.
Biochem. v. 17, pp. 259-289, 1993.
• CRISTOV, L.P., SAZACKS, G. & BALAKRISHNAN, H. Production, partial
characterization and use of fungal cellulase-free xylanases in pulp bleaching. Proc.
Biochem. v. 34, pp. 511 – 517, 1999.
• CUROTTO, E., CONCHA, M., CAMPOS, V., MILAGRES, A. M. F. & DÚRAN,
N. Production of extracellular xylanases by Penicillium janthinellum. Appl.
Biochem. Biotechnol. v. 48, pp. 107-116, 1994.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
119
• DAHLBERG, L., HOLST, O. & KRISTJANSSON, J. K. Thermostable xylanolytic
enzymes from Rhodothermus marinus grown on xylan. Appl. Biochem. Biotechnol.
v. 40, pp. 63-68, 1993.
• DAMASO, M. C. T., ANDRADE, C. M. M., JUNIOR, N. P. Use of corncob for
endoxylanase production by thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus IOC-
4145. Appl Biochem Biotechnol. v. 84-86, pp. 821-34, 2000.
• D’ALMEIDA, M. L. O. Celulose e Papel: Tecnologia de fabricação do papel. São
Paulo: Instituto de Pesquisas Tecnológicas – IPT. 2v 2a ed (ISBN: 85-09-00039-5 –
obra completa), 1988.
• DE AZEREDO, L.A.I., CASTILHO, L.R., LEITE, S.G.F., COELHO, R.R.R. &
FREIRE, D.M.G., Protease production by Streptomyces sp. isolated from Brazilian
cerrado soil. Optimization of culture medium employing satistical experimental
design. App. Biochem. Biotechnol. v. 105-108, pp. 749-755, 2003.
• DE AZEREDO, L.A.I., FREIRE, D.M.G., SOARES, R.M.A., LEITE, S.G.F. &
COELHO, R.R.R. Production and partial characterization of thermophilic proteases
from Streptomyces sp. isolated from Brazilian cerrado soil. Enz. Microbial Technol.
v. 34, pp. 354-358, 2004.
• DEMAIN, A. L. & SOLOMON, N. A. Manual of Industrial Microbiology and
Technology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1986.
• DEMAIN, A. L. Microbial biotechnology. Trends Biotechnol. v. 18, pp. 26-31,
2000.
• DENG W., JIANG, Z.Q., LI, L.T., WEI, Y., SHI, B. & KUSAKABE, I. Variation of
xylanossomal subunit composition of Streptomyces olivaceoviridis by nitrogen
sources. Biotechnol. Lett. v. 27, pp. 429 – 433, 2005.
• DUTRON, A., GEORIS, J., GENOT, B., DAUVRIN, T., COLLINS, T., HOYOUX,
A. & FELLER, G. Use of family 8 enzymes with xylanolytic activity in baking. In:
World Intellectual Property Organization, PCT, WO 2004/023879 A1. 2004.
• EIRAS, S.P., CUELBAS, C. J., DE ANDRADE, J.C. "Um Estudo Comparativo
sobre a Eficiência de Estratégias Quimiométricas de Otimização", Química Nova v.
16, pp. 216–219, 1994.
• EL-MANSI, M. & BRYCE, C. Fermentation Biotechnology: an historical
perspective. In: Fermentation Microbiology and Biotechnology. Taylor & Francis
Group, London. 1999.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
120
• FISHER, R. A. "The Design of Experiments". Oliver & Boyd, Edinburg, 1935.
• ROUTH, M.W., SWARTZ, P.A E DENTON, M. B. "Performance of the super
modified simplex" Anal. Chem. v. 49, pp. 1422–1428, 1977.
• FLORES, M. E., PÉREZ, R. & HUITRÓN, C. β-Xylosidase and xylanase
characterization and production by Streptomyces sp. CH-M-1035. Lett. Appl.
Microbiol. v. 24, pp. 410-416, 1997.
• FONSECA, M.C.C. Produção de xilanases por Aspergillus awamori em bagaço de
cana. Rio de Janeiro, Brasil. Escola de Quimica, UFRJ, p.147, Dissertação
(mestrado). 1998.
• FREDERIX, S.A., COURTIN, C.M. & DELCOUR, J.A. Impact of endoxylanases
with different substrate selectivity on gluten-starch separation. In: Recent Advances
in Enzymes in Grain Processing. COURTIN, C.M., VERAVERBEKE, W.S. &
DELCOUR, J.A. (eds), pp. 247–254. Kat. Univ. Leuven, Leuven. 2003.
• GALANTE, Y. M., DE CONTI, A. & MONTEVERDI, R. Application of
Trichoderma enzymes in textile industry. In: Trichoderma and Gliocladium –
Enzymes, Biological Control and Commercial Applications. HARMAN, G.E. &
KUBICEK, C.P. (eds), pp. 311–327. Taylor and Francis, London. 1998a.
• GALANTE, Y. M., DE CONTI, A. & MONTEVERDI, R. Application of
Trichoderma enzymes in food and feed industries. In: Trichoderma and Gliocladium
– Enzymes, Biological Control and Commercial Applications. HARMAN, G.E. &
KUBICEK, C.P. (eds), pp. 327–342. Taylor and Francis, London. 1998b.
• GARG, A. P., MCCARTHY, A. J. & ROBERTS, J. C. Biobleaching effect of
Streptomyces thermoviolaceus xylanase preparations on birchwood kraft pulp. Enz.
Microb. Technol. v. 18, pp. 261-267, 1996.
• GEORGE, S.P., AHMAD, A. & RAO, M.B. Studies on carboxymethyl cellulase
produced by an alkalothermophilic actinomycete. Biores. Technol. v. 77, 171-175,
2001.
• GEORIS, J., GIANNOTTA, F., BUYL, E. D., GRANIER, B. & FRÉRE, J.M.
Purification and properties of three endo-β-1,4-xylanases produced by Streptomyces
sp. Strain S38 which differ in their ability to enhance the bleaching of kraft pulps.
Enz. Microb. Technol. v. 26, pp. 178-86, 2000.
• GHOSE T.K. Measurement of cellulase activities. Pure Appl Chem v. 59, pp. 257-
268, 1987.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
121
• GINTHER, C. L. Sporulation and the production of serine protease and cephamycin
C by Streptomyces lactamdurans. Antimicrob. Agents Chemotherapy. v. 15, pp.
522-526, 1979.
• GHOSH, B. K. & GHOSH, A. Degradation of cellulose by fungal cellulase. In:
Microbial Degradation of Natural Products. pp 84-121. G. WINKELMAN (ed.)
VCH. 1993.
• GOSH, M. & NANDA, G. Physiological studies on xylose induction and glucose
repression of xylanolytic enzymes in Aspergillus syndowii MG 49. FEMS
Microbiol. Lett. v. 117, pp. 151-156, 1994.
• GODFREY, T. & WEST, S. Textiles. In: Industrial Enzymology, pp. 360-371. T.
GODFREY & S. WEST (eds) 2nd edition, Macmilliam Press, London. 1996.
• GODFREY, T. .The enzymes market for grain processing In: Recent Advances in
Enzymes in Grain Processing. COURTIN, C.M., VERAVERBEKE, W.S. AND
DELCOUR, J.A. (eds.), pp. 401–406. Kat. Univ. Leuven, Leuven. 2003.
• GOODFELLOW, M. & CROSS, T. Classification. In: The Biology of the
Actinomycetes, pp. 74-91. M. GOODFELLOW, M. MORDARSKI & S.T.
WILLIAMS (eds.) Academic Press, London. 1984.
• GOODFELLOW, M., WILLIAMS, S.T. & MORDARSKI, M. Actinomycetes in
Biotechnology. M. GOODFELLOW, S.T. WILLIAMS & M. MORDARSKI (eds.).
Academic Press, London. 1988.
• GREGORY, A. C. E., O’CONNEL, A. P. & BOLWELL, G. P. Xylans. Biotechnol.
Gen. Engin. Rev. v. 15, pp. 439-455, 1998.
• GUPTA, R.; SAXENA, R. K.; CHATURVEDI, P. & VIRDI, J.S. Chitinase
production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. J.
Appl. Bacteriol. v. 78, pp. 378-383, 1995.
• HALTRICH, D., PREISS, M. & STEINER, W. Optimization of a culture medium
for increased xylanase production by a wild strain of Schizophylum commune. Enz.
Microb. Technol. v. 15, pp. 854–860, 1993.
• HECK, J.X., FLORES, S.H., HERTZ, P.F. & AYUB, M.A.Z. Optimization of
cellulose-free xylanase activity produced by Bacillus coagulans BL69 in solid-state
fermentation. Proc. Biochem. v. 40, pp. 107– 112, 2005.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
122
• HELDT-HANSEN, H. P. Development of enzymes for food applications. In:
Biotechnology in the food chain – New tools and applications for future foods.
POUTANEN, K. (ed). Helsink, Finland: VTT symp. v. 177, pp. 45–55, 1997.
• HEUSSEN C. & DOWDLE E.B. Electrophoretic analysis of plasmintogen
activators in polyacrilamide gels containing sodium dodecyl sulphate and
copolymerized substrates. Anal. Biochem. v. 102, pp. 196-202, 1980.
• HIGUCHI, T. Lignin biochemistry: Biosynthesis and degradation. Wood Sci.
Technol. v. 24, pp. 23-63. 1990.
• HINNMAN, R.L. The changing face of the fermentation industry. Chem. Technol.
v. 24, pp. 45–48, 1994.
• HOPKINS, D. W., BIBB, M. J., CHATER, K. F., KIESER, C., BRUTON, C. J.,
KIEZER, H. M., LYDIATE D. J., SMITH, C. P., WARD, J. M. & SCHREMPF, H.
Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes
Institute, Norwich, United Kingdom. 1985.
• HOQ, M.M., HEMPEL, C. & DECWER, W.D. Cellulase-free xylanase by
Thermomyces lanuginosus RT9: effect of agitation, aeration and medium
components on production. J. Biotechnol. v. 37, pp. 49-58, 1994.
• HOQ, M. M., SOLOMON, B. O., HEMPEL, C., RINAS, U. & DECKWER, W.D.
The kinetics of cellulase-free xylanase excretion by Thermomyces lanuginosus RT9.
J. Chem. Technol. Biotechnol. v. 63, pp. 229-236, 1995.
• HUBBARD, D. W., LEDGER, S. E. & HOFFMAN, J. A. Scaling-up aerobic
fermentation which produce non-newtonian, viscoelastic broths. In: Advances in
Bioprocess Engineering. GALINDO, E. & RAMIREZ O. T. (eds) pp. 95-101,
Kluwer Academic Publishers, Netherlands. 1994.
• INGRAM, L. O. & DORAN, J.B. Conversion of cellulosic materials to ethanol.
FEMS Microbiol. Rev. v. 16, pp. 235-241, 1995.
• International Union of Biochemistry. Enzyme nomenclature. Academic Press, Inc.,
Orlando, Florida. 1992.
• JANG, H.D. & CHEN, K.S. Production and characterization of thermostable
cellulases from Streptomyces transformant T3-1. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 19,
263-268, 2003.
• JEFFRIES, T. W. Biochemistry and genetics of microbial xylanases. Cur. Opin.
Biotechnol. v. 7, pp. 337-342, 1996.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
123
• JIANG, Z. Q., DENG, W., LI, X. T., AI, Z. L., LI, L. T. & KUSAKABE, I.
Characterization of a novel, ultra-large xylanolytic complex (xylanosome) from
Streptomyces olivaceoviridis E-86. Enz. Microbial Technol. v. 36, pp. 923-929,
2005.
• JU, L. K. & CHASE, G. G. Improved scale-up strategies of bioreactors. Bioproc.
Eng. v. 8, pp. 49–55, 1992.
• JUNKER, B., MOORE, J., STURR, M., MCLOUGHLIN, K., LEPORATI, J.,
YAMASAKI, S., CHARTRAIN, M. & GREASHAM, R. Pilot-scale production of
intracellular and extracellular enzymes. Bioproc. Bios. Eng. v. 24, pp. 39-49, 2001.
• KAUR, J., CHADHA, B.S., KUMAR, B.A. & SAINI, H.S. Purification and
characterization of two endoglucanases from Melanocarpus sp. MTCC 3922.
Biores. Technol. In Press, 2005.
• KESKAR, S. S. High activity xylanase from thermotolerant Streptomyces T7
cultural conditions and enzyme properties. Biotechnol. Lett. v. 14, pp. 481-486,
1992.
• KIM, I. S. & LEE, K. J. Trypsin-like protease of Streptomyces exfoliates SMF13, a
potential agent in mycelial differentiation. Microbiol. v. 142, pp. 1797-1806, 1996.
• KIM, B., AL-TAI, A.M., KIM, S. B., SOMASUNDARAM, P. & GOODFELLOW,
M. Streptomyces thermocoprophilus sp. nov., a cellulase-free endo-xylanase-
producing streptomycete. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. v. 50, pp. 505-509, 2000.
• KLASS, D. L. Energy and synthetic fuels from biomass and wastes. In: Handbook
of Energy Technology and Economics, pp. 712-788. MEYERS, R. A. (ed.), Wiley,
1983.
• KLUEPFEL, D., DAIGNEAULT, N., MOROSOLI, R. & SHARECK, F.
Purification and characterization of a new xylanase (xylanase C) produced by
Streptomyces lividans 66. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 36, pp. 626-631, 1992.
• KOSSEN, N. W. F. & OOSTERHUIS, N. M. G. Modelling and Scaling-up of
Bioreactors. In: Biotechnology. REHM, H. J. & REED, G. (eds), 2nd edition, VGH-
Verlag, Weinheim, Germany, 1985.
• KULKARNI, N., SHENDYE, A. & RAO, M. Molecular and biotechnological
aspects of xylanases. FEMS Microbiol. Rev. v. 23, pp. 411-456, 1999.
• KUMAR, C.G. & TAKAGI, H. Microbial alkaline proteases: from bioindustrial
viewpoint. Biotechnol. Adv. v. 17, pp. 561-594, 1999.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
124
• LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature (London) v. 227, pp. 680-685, 1970.
• LANDAU, N. S. & EGOROV, N. S. Proteolytic enzymes of Nocardia minima:
accumulation in the medium and some properties. Microbiol. v. 65, pp. 36-40, 1996.
• LAYMAN, P.L. Industrail enzymes: battling to remain specialities. Chem. Eng.
News. v. 64, pp. 11-14, 1986.
• LEBLOND, P. & DECARIS, B. New insights into the genetic instability of
Streptomyces. FEMS Microbiol. Lett. v. 123, pp. 223-232, 1994.
• LEMOS, J. L. S., BON, E. P. S., SANTANA, M. F. E. & JUNIOR, N. P. Thermal
stability of xylanases produced by Aspergillus awamori. Braz. J. Microbiol. v. 31,
pp. 206-211, 2000.
• LEQUART, C., RUEL, K., LAPIERRE, C., POLLET, B. & KUREK, B. Abiotic
and enzymatic degradation of wheat stram cell wall: a biochemical and
ultraestructural investigation. J. Biotechnol. v. 80, pp. 249-259, 2000.
• LI, K., AZADI, P., COLLINS, R., TOLAN, J., KIM, J. S. & ERIKSSON, K. E. L.
Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enz. Microb.
Technol. v. 27, pp. 89-94, 2000.
• LIMA, A.L.G., NASCIMENTO, R.P., BON, E.P.S. & COELHO, R.R.R. Cellulase activity produced by Streptomyces drozdowiczii using low cost agri-industrial by-products and tests for biotechnological application. Enz. Microbial Technol. v. 37, pp. 272-277, 2005.
• LIU, W., ZHU, W., LU, Y., KONG, J. & MA, G. Production, partial purification and characterization of xylanase from Trichosporon cutaneum SL409. Proc. Biochem. v. 33, 331-336, 1998.
• LOPES, A., COELHO, R.R.R., MEIRELLES, M.N.L., BRANQUINHA, M.H. &
VERMELHO, A.B. Extracellular serine-proteinases isolated from Streptomyces
alboniger: partial characterization and effect of aprotinin on cellular structure. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz v. 94 (6), pp. 763-770, 1999.
• LUECKE, F., FRIEDIRCH, F. & CARL, L. Lactic acid bacteria involved in food
fermentations, their present and future uses in food industry: A review. NATO. Asi.
Ser. v. 98, pp. 81-99, 1996.
• MAAT, J., ROZA, M., VERBAKEL, J., STAM, H., DASILRA, M.J.S., EGMOND,
M.R., HAGEMANS, M.L.D., VAN GARCOM, R.F.M., HESSING, J.G.M., VAN
DERHONDEL, C. & VAN ROTTERDAM, C. Xylanases and their applications in
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
125
baking. In: Xylan and Xylanases. VISSER, J., BELDMAN, G., VAN SOMEREN,
M.A.K. & VORAGEN, A.G.J. (eds), pp. 349–360. Elsevier, London, 1992.
• MAGNUSON, T.S. & CRAWFORD, D.L. Purification and characterization of an
alkaline xylanase from Streptomyces viridosporous T7A. Enz. Microbial Technol. v.
21, pp. 160–164, 1997.
• MARQUES, S., ALVES, L., RIBEIRO, S., GÍRIO, F. M. & AMARAL-
COLLAÇO, M. T. Characterization of a thermotolerant and alkalotolerant xylanase
from a Bacillus sp. Appl. Biochem. Biotechnol. v. 73, pp. 159-172, 1998.
• MATHLOUTHI, N., LALLES, J.P., LEPERCQ, P., JUSTE, C. & LARBIER, M.
Xylanase and beta-glucanase supplementation improve conjugated bile acid fraction
in intestinal contents and increase villus size of small intestine wall in broiller
chickens fed a rye-based die. J. Anim. Sci. v. 80, pp. 2773–2779, 2002.
• MAVITUNA, F. Strategies for bioreactor scale-up. In: Computer and Information
Science Application in Bioprocess Engineering. MOREIRA, A. R. & WALLACE,
K. K. (eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands. 1996.
• McCARTHY, A.J., PEACE, E., & BRODA, P. Studies on the extracellular xylanase
activity of some thermophilic actinomycetes. App. Microbiol. Biotechnol. v. 21, pp.
238-244, 1985.
• MCNEIL, B. & HARVEY, L. M. Fermentation – A practical approach. Oxford
University Press, Oxford. 1990.
• MIELENZ, J.R. Ethanol production from biomass: technology and
commercialization status. Curr. Opin. Microbiol. v. 4, pp. 324–329, 2001.
• MILAGRES, A. Aplicação de enzimas na indústria de polpa e papel. XXIII
Congresso Brasileiro de Microbiologia, Santos. 2005.
• MILLER, L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal. Chem. v. 31, pp. 426-428, 1959.
• MOHAMEDIN, A.H. Isolation, identification and some cultural conditions of a
protease-producing thermophilic Streptomyces strain grown on chicken feather as a
substrate. Int. Biodeter. Biodegr. v.43, pp. 13-21, 1999.
• MONTGOMERY, D. C. Design and Analysis of Experiments. Chapter 1, 6, 7. 4th
edition. John Wiley & Sons, New York. 1997.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
126
• MONTI, R., TEREZIN, H. F. & JORGE, J. A. Purification and properties of an
extracellular xylanase from the thermophilic fungus Humicola grisea var.
thermoidea. Can. J. Microbiol. v. 37, pp. 675-681, 1991.
• MORAG, E., BAYER, E.A., LAMED, R. Relationship of cellulosomal and
noncellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum to cellulose-degrading
enzymes. J. Bacteriol. v. 172, pp. 6098-6105, 1990.
• MOREIRA, K.A., PORTO, T.S., TEIXEIRA, M.F.S., PORTO, A.L.F. & LIMA
FILHO, J.L. New alkaline protease from Nocardiopsis sp.: partial purification and
characterization. Proc. Biochem. v. 39, pp. 67-72, 2003.
• MORIHARA, K. & TSUZUKI, H. Comparative study of various neutral proteinases
from microorganisms: specificity with oligopeptides. Arch. Biochem. Biophys. v.
146, pp. 291-296, 1971.
• NAKAMURA, S. NAKAI, R., WAKABAYASHI, K., ISHIGURO, Y. AONO, R.
& HORIKOSHI, K. Thermophilic alkaline xylanase from newly isolated
alkalophilic and thermophilic Bacillus sp. strain TAR-1. Biosci. Biotechnol.
Biochem. v. 58 (1), pp. 78-81, 1994.
• NASCIMENTO, R.P., COELHO, R.R.R., MARQUES, S., ALVES, L., GÍRIO,
F.M., BON, E.P.S. & AMARAL-COLLAÇO, M.T. Production and partial
characterisation of xylanase from Streptomyces sp. Strain AMT-3 isolated from
Brazilian cerrado soil. Enz. Microbial Technol. v. 31, 549-555, 2002.
• NASCIMENTO, R.P., MARQUES, S., ALVES, L., GÍRIO, F.M., AMARAL-
COLLAÇO, M.T., SACRAMENTO, D.R., BON, E.P.S., & COELHO, R.R.R. A
novel strain of Streptomyces malaysiensis isolated from Brazilian soil produces high
endo-β-1,4-xylanase titres. W. J. Microb. Biotechnol. v. 19, pp. 879-881, 2003.
• NASCIMENTO R.P., D’AVILA-LEVY, C.M., SOUZA, R.F., BRANQUINHA,
M.H., BON, E.P.S., PEREIRA JR., N. & COELHO, R.R.R. Production and partial
characterization of extracellular proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3
isolated from a Brazilian cerrado soil. Arch. Microbiol. v. 184 (3), pp. 194-198,
2005.
• NORKRANS, B. Cellulose and cellulosys. Appl. Microbiol. v. 9, pp. 91-130, 1967.
• OHMIYA, K., SAKKA, K., KARITA, S. & KIMURA, T. Structure os cellulases
and their applications. Biotechnol. Gen. Eng. Rev. v. 14, pp. 365-414, 1997.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
127
• PALA, H., MOTA, M. & GAMA, F.M. Enzymatic versus chemical deinking of
non-impact ink printed paper. J. Biotechnol. v. 108, pp. 79–89, 2004.
• PALMA, M.B., MILAGRES, A.M.F., PRATA, A.M.R. & MANCILHA, I.M.
Influence of aeration and agitation rate on the xylanase activity from Penicillium
janthinellum. Proc. Biochem. v.31, pp. 141-145, 1996.
• PATEL B. & RAY R.M. Production and characterization of xylanase from
Streptomyces species grown on agricultural wastes. W. J. Microbio. Biotechnol. v.
10, pp. 599-604, 1994.
• PECZYNSKA-CZOCH, W. & MORDARSKI, M. Actinomycetes enzymes. In:
Actinomycetes in biotechnology. M. GOODFELLOW, S. T. WILLIAMS, M.
MORDARSKI (eds.). pp. 219-283.Academic Press. 1988.
• PEREIRA, JR. Notas de Aula. In: Engenharia Bioquímica. Curso de Pós Graduação
do Programa de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de
Química – CT., 2003.
• PÉREZ PONS, J. A., REBORDOSA, X. & QUEROL, E. Induction and preliminary
characterization of intracellular β-glucosidases from a cellulolytic Streptomyces
strain. FEMS Microbiol. Lett. v. 128, pp. 235-239, 1995.
• PHAM, P.L., TAILLANDIER, P., DELMAS, M. & STREHANIANO, P.
Optimization of a culture medium for xylanase production by Bacillus sp. using
statistical experimental designs. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 14, pp. 185–190,
1998.
• PIRET, J. M. & DEMAIN, A. L. Actinomycetes in Biotechnology: An overview. In:
Actinomycetes in Biotechnology. GOODFELLOW, M., WILLIAMS, S. T. &
MORDARSKI, M. (eds). Academic Press, London. 1988.
• POHLSCHRÖDER, M., LESCHINE, S.B. & CANALE-PAROLA, E.
Multicomplex cellulase-xylanase system of Clostridium papyrosolvens C7.
Bacteriol. v. 176, pp. 70-76, 1994.
• PRADE, R. A. Xylanases: from biology to biotechnology. Biotechnol. Gen.
Enginee. Rev. v. 13, pp. 101-131, 1995.
• PRIEST, F. G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol. Rev.
v. 41, pp. 711-753, 1977.
• PULS, J. & SCHUSEIL, J. Chemistry of hemicelluloses: relationship between
hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis. In: Hemicellulose and
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
128
Hemicellulases. COUGHLAN, M. P. & HAZLEWOOD, G. P. (eds.) pp. 1-28.
Portland Press, London. 1993.
• RAJ, K.C. & CHANDRA, T.S. Purification and characterization of xylanase from
alkali-tolerant Aspergillus fischeri Fxnl. FEMS Microbiol. Lett. v. 145, pp. 457 –
461. 1996.
• RAO, M. B., TANKSALE, A. M., GHATGE, M. S. & DESHPANDE, V. V.
Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol.
Biol. Rev. v. 62, pp. 597-635, 1998.
• RAWLINGS, N.D., MORTON, F.R. & BARRETT, A.J. MEROPS: the peptidase
database. Nucleic Acids Res v. 34, D270–D272, 2006.
• REDDY, V., REDDY, P., PILLAY, B. & SINGH, S. Effect of aeration on the
production of hemicellulases by T. lanuginosus SSBP in a 30 l bioreactor. Proc.
Biochem. v. 37, pp. 1221-1228, 2002.
• ROSEIRO, J.C.P. Tecnologia de Fermentações. Art.9º, linha A, Decreto-Lei 301/72.
Dep. Química, Universidade de Évora, Portugal, pp. 86-133, 2003.
• SAHA, B.C. Hemicellulose bioconversion. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. v. 30, pp.
279–291. 2003.
• SAMPATH, P., SUBRAMANIAN C. & CHANDRAKASAN, G. Extracellular
proteases from Streptomyces spp. G157: purification and characterization.
Biotechnol. Appl. Biochem. v. 26, pp. 85-90, 1997.
• SANCHEZ, S. & DEMAIN, A. L. Metabolic regulation of fermentation processes.
Enz. Microbial Technol. v. 31, pp. 895-906, 2002.
• SANGLIER, J. J., HAAG, H., HUCCK, T. A. & FEHR, T. Novel bioactive
compounds from actinomycetes (1988-1992). Res. Microbiol. v. 144, pp. 633-642,
1993.
• SCHOEMAKER, H. E. On the chemistry of lignin biodegradation. Recl. Trav.
Chim. Pays-Bas v. 109, pp. 255-272, 1990.
• SCRAGG, A. H. Aerobic batch culture of Saccharomyces cerevisae using 2% as a
carbon source. In: Bioreactors in Biotecnology: a practical approach. Ellis
Horwood Limited, England. 1991.
• SEYIS, I. & AKSOZ, N. Determination of some physiological factors affecting
xylanase production from Trichoderma harzianum 1073 D3. Microbiologica. v. 26,
pp. 75–81, 2003.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
129
• SEYIS, I. & AKSOZ, N. Effect of carbon and nitrogen sources on xylanase
production by Trichoderma harzianum 1073 D3. Int. Biodeter. Biodegr. v. 55 (2),
pp.115-119, 2005.
• SHALLOM, D. & SHOHAM, Y. Microbial hemicellulases. Curr. Opi. Microbiol. v.
6, pp. 219-228, 2003.
• SHARMA, H.S.S. Enzymatic degradation of residual non-cellulosic polysaccharides
present on dew-retted flax fibers. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 26, pp. 2714–
2723, 1987.
• SILVEIRA, F. P. Q., SOUSA, M. V., RICART, C. A. O., MILAGRES, A. M. F.,
MEDEIROS, C. L. & FILHO, E. X. F. A new xylanase from Trichoderma
harzianum strains. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.. v. 23, pp. 682-685, 1999.
• SOUZA, D. F., SOUZA, C. G. M. & PERALTA, R. M. Effect of easily
metabolizable sugars in the production of xylanase by Aspergillus tamarii in solid-
state fermentation. Proc. Biochem. v. 36, pp. 835-838, 2001.
• STANBURY, P.F. & WHITAKER, A. Microbial growth kinetics. In: Principles of
fermentation technology. pp. 11-25. Pergamon Press, United Kingdom, 1984.
• STUZENBERGER, F. J. & BODINE, A. B. Xylanase production by
Termomonospora curvata. J. Appl. Bacteriol. v. 72, pp. 504-511, 1992.
• STUZENBERGER, F. J. & BODINE, A. B. Thermostable β-xylosidase from
Termomonospora curvata. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. v. 20, pp. 55-60, 1998.
• SUNNA, A. PULS, J. & ANTRANIKIAN, G. Purification and characterization of
two thermostable endo-1,4-β-xylanases from Thermotoga thermarum. Biotechnol.
Appl. Biochem. v. 24, pp. 177-185, 1996.
• SUBRAMANIYAN, S., SANDHIA, G.S. & PREMA, P. Control of xylanase
production with out protease activity in Bacillus sp. by the selected nitrogen source.
Biotechnol Lett. v. 23, 369-372, 2001.
• SUBRAMANIYAN, S. & PREMA, P. Biotechnology of microbial xylanases:
enzymology, molecular biology, and application. Crit. Rev. Biotechnol. v. 22 (1),
pp. 33-64, 2002.
• SUNNA, A. & ANTRANIKIAN, G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria.
Crit. Rev. Biotechnol. v. 17 (1), pp. 39-67, 1997.
• TECHAPUN C., CHAROENRAT T., WATANABE M., SASAKI K. &
POOSARAN N. Optimization of thermostable and alkaline-thermotolerant
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
130
cellulase-free xylanase production from agricultural waste by thermotolerant
Streptomyces sp. Ab106, using the central composite experimental design. Biochem.
Eng. J. v. 12, pp. 99–105, 2002.
• TECHAPUN, C., POOSARAN, N., WATANABE, M. & SASAKI, K.
Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanases produced
from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching
bioprocesses: a review. Proc. Biochem. v. 38, 1327-1340, 2003a.
• TECHAPUN, C., POOSARAN, N., WATANABE, M. & SASAKI, K. Optimization
of aeration and agitation rates to improve cellulase-free xylanase production by
thermotolerant Streptomyces sp. Ab106 and repeated fed-batch cultivation using
agricultural waste. J. Biosc. Bioeng. v. 95, pp. 298-301, 2003b.
• THIRY, M. & CINGOLANI, D. OPTIMIZING SCALE-UP FERMENTATION
PROCESSES. TRENDS Biotechnol. v. 20 (3), pp. 103-105, 2002.
• THOMSON, J. A. Molecular biology of xylan degradation. FEMS Microbiol. Rev.
v. 104, pp. 65–82, 1993.
• TOMME, P., WARREN, R. A. J. & GILKES, N. R. Cellulose hydrolysis by
bacteria and fungi. Adv. Microb. Physiol. v. 37, pp. 1-81, 1995.
• TÖRRONEN, A. & ROUVINEN, J. Structural and functional properties of low
molecular weight endo-β-1,4-xylanases. J. Biotechnol. v. 57, pp. 137-149, 1997.
• TUNCER, M., BALL, A. S., ROB, A. & WILSON, M. T. Optimization of
extracelullar lignocellulolytic enzyme production by a thermophilic actinomycete
Thermomonospora fusca BD 25. Enz. Microb. Technol. v. 25, pp. 38-47, 1999.
• UHLIG, H. Industrial enzymes and their applications. John Wiley & Sons Inc., pp.
435, New York. 1998.
• UMA MAHESWARI, M. & CHANDRA, T.S. Production and potential
applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus. W. J.
Microbiol. Biotechnol. v. 16, pp. 257-263, 2000.
• VIIKARI, L., KANTELINEN, A., SUNDQUIST, J. & LINKO, M. Xylanases in
bleaching: from an idea to the industry. FEMS Microbiol. Rev. v. 13, pp. 335-50,
1994.
• VOBIS, G. Morphology of actinomycetes. In: Atlas of Actinomycetes. HAMADA,
M., HOTTA, K., KUDO, T., SEINO, A., VOBIS, G. & YOKOTO, A. (eds.) pp.
178–191. Asakura Publishing Co. ltda. Tokyo. 1997.
Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas
131
• WANG, P., MASON, C. & BRODA, P. Xylanases from Streptomyces cyaneus:
their production, purification and characterization. J. Gen. Microbiol. v. 139, pp.
1987-1993, 1993.
• WANG, S.L., YEN, Y.H., SHIH, I.L., CHANG, A.C., CHANG, W.T., WU, W.C. &
CHAI, Y.D. Production of xylanases from rice bran by Streptomyces actuosus A-
151. Enz. Microbial Technol. v. 33, pp. 917-925, 2003.
• WEJSE, P.L., INGVORSEN, K. & MORTENSEN, K.K. Xylanase production by a
novel halophilic bacterium increased 20-fold by response surface methodology. Enz.
Microbial Technol. v. 32, pp. 721-727, 2003.
• WONG, K. K. Y., TAN, L. U. L. & SADDLER, J. N. Multiplicity of β-1,4-xylanase
in microorganisms: functions and applications. Microbiol. Rev. v. 52 (3), pp. 305-
317, 1988.
• WONG, K.K.Y. & SADDLER, J.N. Applications of hemicellulases in the food, feed
and pulp and paper industries. In: Hemicelluloses and Hemicellulases.
COUGHLAN, M.P. & HAZLEWOOD, G.P. (eds), pp. 127–143. Portland Press,
London. 1993.
• WOOD, T. M. & GARCÍA-CAMPAYO, V. Enzymology of cellulose degradation.
Biodegradation. v. 1, pp. 147-161, 1990.
• YEOMAN, K.H. & EDWARDS, C. Protease production by Streptomyces
thermovulgaris grown on rapemeal-derived media. J. Appl. Bacteriol. v. 77, pp.
264-270, 1994.
• ZHOU, X., CHEN, F. & LI, Z. CMCase activity assay as a method for cellulase
adsorption analysis. Enz. Microbial Technol. v. 35, pp. 455-459, 2004.
Nascimento, R.P. Produção Científica
132
PRODUÇÃO CIENTÍFICA Publicações em anais de eventos científicos:
Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Coelho R.R.R.; Girio, F. & Reis, A. 2006.
Estudo da produção de xilanases em bioreator por Streptomyces malaysiensis utilizando
resíduos agro-industriais. III Workshop de Biocatálise e II Encuentro Regional de
Biocatálisis y Biotransformaciones (São Paulo, Brasil) – apresentação oral.
Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Junior, N.A. & Coelho R.R.R. 2005.
Xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using agro-industrial by-
product. Congresso Portugues de Microbiologia e Biotecnologia – MICROBIOTEC
(Póvoa de Varzim, Portugal) – apresentação oral.
Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Coelho R.R.R.; Gírio, F. & Reis, A. 2005.
Optimization of xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using
experimental design. Congresso Portugues de Microbiologia e Biotecnologia (Póvoa de
Varzim, Portugal) – apresentação poster.
Nascimento, R.P.; Bon, E.P.S.; Pereira-Jr., N.; Junior, N.A. & Coelho R.R.R. 2005. Produção de xilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando resíduos agro-
industriais. XIII Congresso Brasileiro de Microbiologia (Santos, SP) – apresentação
poster.
Nascimento, R.P.; Junior, N.A.; Venancio, J.C.C.; Tavares, L.F.D.; Pereira-Jr., N.; Bon,
E.P.S. & Coelho R.R.R. 2005. CMCase production by Streptomyces malaysiensis using
agro-industrial by-products. XV Simpósio Nacional de Bioprocessos – XVI SINAFERM
(Recife, PE) – apresentação poster.
Nascimento, R.P.; Pereira-Jr, N.; Bon, E.P.S. & Coelho, R.R.R. 2004. Otimização da
produção de xilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo de cerrado.
IX Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental (Curitiba, PR) – apresentação oral.
Nascimento, R.P.; d’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Bon, E.P.S.;
Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004. Production of proteases by Streptomyces
malaysiensis AMT-3 using wheat bran. 12th International Biotechnology Symposium and
Exhibition (Santiago, Chile) – apresentação poster.
Rondon, A.M.R.; Nascimento, R.P.; Bon, E.P.S.; Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004.
Produção de xilanases e celulases por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo
de cerrado, utilizando farelo de trigo. XIX Reunião Anual Federação de Sociedades de
Biologia Experimental – FESBE (Caxambu, MG) – apresentação poster.
Nascimento, R.P. Produção Científica
133
Nascimento, R.P.; D’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Pereira-Jr, N.;
Bon, E.P.S. & Coelho, R.R.R. 2004. Produção de proteases por Streptomyces malaysiensis
AMT-3, isolado de solo de cerrado, utilizando farelo de trigo. 6° Seminário Brasileiro de
Tecnologia Enzimática – ENZITEC (Rio de Janeiro, RJ) – apresentação oral.
Nascimento, R.P.; Rondon, A.M.R.; Bon, E.P.S.; Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004.
Produção de xilanases e celulases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando farelo
de trigo. 6º Seminário Nacional de Tecnologia Enzimática – ENZITEC (Rio de Janeiro,
RJ) – apresentação poster.
Nascimento, R. P.; Souza, R. F.; Tavares, L. F. D.; Bon, E. P. S.; Pereira Jr., N. &
Coelho, R. R. R. 2003. Produção de xilanases em farelo de trigo por Streptomyces
malaysiensis AMT-3. XXII Congresso Brasileiro de Microbiologia (Florianópolis, SC) –
apresentação poster.
Artigo Publicado:
• Nascimento R.P.; d’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Bon, E.P.S.;
Pereira Jr., N.; Coelho, R.R.R. (2005). Production and partial characterization of extracellular
proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3 isolated from a Brazilian cerrado soil.
Archives of Microbiology , vol 184 (3), pp. 194-198.
Artigos Submetidos:
• Nascimento, R.P.; Junior, N.A.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S. & Coelho R.R.R. 2006.
Cellulase production by Streptomyces malaysiensis in submerged fermentation using agro-
industrial by-products. Applied Biochemistry and Biotechnology.
• Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S. & Coelho R.R.R. 2006. Optimization of
xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using agro-industrial by-products.
Journal of Biotechnology.
Artigos em Manuscrito:
• Nascimento R. P., Bon E. P. S., Pereira-Jr. N., Coelho R. R. R., Girio F., Reis A. Effect
of aeration, agitation and scale-up on xylanase production by S. malaysiensis on 2L and 16 L
bioreactor.
Nascimento, R.P. Produção Científica
134
• Nascimento R. P., Bon E. P. S., Pereira-Jr. N., Coelho R. R. R., Girio F., Reis A.
Xylanase production by Streptomyces malaysiensis using a non-cost wheat residue by central
composite experimental design.
Nascimento, R.P. Anexos
135
ANEXOS
ANEXO 1 – Descrição e Composição das Fontes de Carbono e Nitrogênio Utilizadas
como Matéria-Prima
Milhocina (“Corn Steep Liquor”) – É um subproduto do processamento do milho contendo
aproximadamente 40% de sólidos totais e correspondendo a água de lavagem e embebição
dos grãos quando do fracionamento em amido e germe (óleo). A composição química é
complexa, tendo na sua grande maioria compostos orgânicos nitrogenados
Farelo de Trigo (“Wheat Bran”) – É um subproduto obtido na etapa de moagem do trigo
durante o processamento da farinha de trigo. É um produto comercializado, apresentando uma
composição variada, contendo proteínas (≅ 13%), hemicelulose (≅ 33%), celulose (≅ 10%),
lignina (≅ 3%), amido (≅ 12%), além de sais, gordura e outros componentes. Pode ser
considerada uma boa fonte de baixo custo para produção de hidrolases.
Nascimento, R.P. Anexos
136
Dreche Cervejeiro (“Brewer’s Spent Grain”) – É o principal produto residual da indústria
cervejeira, representando cerca de 85% do total de subprodutos gerados. É um componente
lignocelulósico contendo cerca de 17% de celulose, 28% de polissacarídeos não-celulósicos
(principalmente arabinoxilana) e 28% de lignina.
ANEXO 2 – Esquematização dos Biorreatores do tipo STR de 2 e 16L
Nascimento, R.P. Anexos
137
Impelidor
Eletrodo de pH
Difusor de ar
Coletor de amostras
Zona de inóculo
Motor
Zona de escape
Eletrodo de O2
A – esquema do biorreator STR de 2L da Setric Genie Industriel (SGI)
Nascimento, R.P. Anexos
138
Zona de escape
Eletrodo de pH Filtro de ar
Eletrodo de O2
Impelidor
Motor Difusor de ar
Coletor de Amostras
B – esquema do biorreator STR de 16L da Bioengineering
Nascimento, R.P. Anexos
139
ANEXO 3 – Cálculos de Determinação do KLa e método geométrico de escalonamento
A) Parâmetro Geométrio (P/V)
Velocidade constante da ponta do impelidor (tip speed)
[NiVi = Nii Vii]
N1 = 300 rpm
Diâmetro do Impelidor - Fermentador 2L = 4,8 cm (1)
Diâmetro do Impelidor - Fermentador 16L = 8,0 cm (2)
πD1N1 = πD2N2
4,8 x 300 = 8,0 x N2
N2 = 180 rpm
B) Parâmetro de Transferência de Massa (KLa constante)
KLa do Fermentador de 2L KLa do Fermentador de 16L
0,5 vvm e 250 rpm = 66,48 h-1 0,5 vvm e 300 rpm = 60.5 h-1
0,5 vvm e 500 rpm = 104,64 h-1 0,75 vvm e 300 rpm = 82,8 h-1
0,5 vvm e 300 rpm = 74,11 h-1 0,65 vvm e 300 rpm = 74,11 h-1KLa constante
* KLa constante, mantendo a agitação, alterando a aeração (0,25; 0,5; 0,75; 1,0 vvm)
Nascimento, R.P. Anexos
140
A
B
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Time (s)
% D
.O
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Time (s)
% D
.O
Figura A3-I – Determinação do declive e subida da taxa de oxigênio, em função da pressão
por nitrogênio em bioreator de 16L. O gráfico representa as triplicatas, fixando a agitação
(300 rpm), e alterando a aeração em 0,5 (A) e 0,75 vvm (B).
Nascimento, R.P. Anexos
141
0,5 vvm / 300 rpm 0,75 vvm / 300 rpm
Tempo (s) ln (100% O2) 40 4,2822063 50 4,11632347 60 3,97092065 70 3,79173684 80 3,61001661 90 3,47300111
100 3,29212629 110 3,12822146 120 2,95317266 130 2,76211742
Tempo (s) ln (100% O2) 50 3,994524227 60 3,772760938 70 3,553441483 80 3,33220451 90 3,098589659 100 2,879198457 110 2,614959778 120 2,3857 130 2,170956651
y = -0,0168x + 4,9635R2 = 0,9994
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
5
0 100 200 300 400Tempo (s)
ln (1
00%
O2
y = -0,023x + 5,157R2 = 0,9996
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 100 200 300 400
Tempo (s)
ln (1
00%
O2
KLa = - 0,0168/s KLa = - 0,0230/s
Figura A3-II – Determinação do valor de KLa baseado no cálculo da subida e inclinação do
oxigênio.
* KLa constante, mantendo a aeração, alterando a agitação (150, 200, 250, 300 rpm)
Nascimento, R.P. Anexos
142
A
B
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Time (s)
% D
.O
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Time (s)
% D
.O
igura A3-III – Determinação do declive e subida da taxa de oxigênio, em função da pressão F
por nitrogênio em bioreator de 16L. O gráfico representa as triplicatas, fixando a aeração (0,5
vvm), e alterando a agitação em 150 (A) e 200 rpm (B).
Nascimento, R.P. Anexos
143
150 rpm / 0.5 vvm 200 rpm / 0.5 vvm
Tempo (s) ln(100-%O2) 150 3,843030134 160 3,796986195 173 3,750288082 180 3,697178257 190 3,648925139 200 3,560098664 210 3,440418095 220 3,373026505 230 3,363841595 240 3,340503313 250 3,260657359 260 3,210843653 270 3,169685581 280 3,113515309 290 3,052427617 300 2,978925155
y = -0,0058x + 4,7185R2 = 0,9887
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 100 200 300 400
Tempo (s)
ln (1
00%
O2
y = -0,0074x + 4,6946R2 = 0,9979
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 100 200 300 400
Tempo (s)
ln (1
00%
O2
KLa = - 0,0058/s KLa = - 0,0074/s
igura A3-IV – Determinação do valor de KLa baseado no cálculo da subida e inclinação do
2) Tempo (s) ln(100-%O150 3,583518938 160 3,479186701 170 3,398972687 180 3,364994333 190 3,301990732 200 3,24128942 210 3,147021721 220 3,069602122 230 2,985681938 240 2,91416062 250 2,85263143 260 2,772588722 270 2,683302031 280 2,610069793 290 2,531047806 300 2,456735773
F
oxigênio.
Nascimento, R.P. Anexos
144
ANEXO 4 – Soluções Tampão e Eletroforese
0,8 mL
3-1. Tampão de amostra (2x concentrado)
Tris-HCl 1 M (pH 6,8)
Glicerol 0,5 mL
Azul de bromofenol 0,2% 0,1 mL
Água q.s.q. 1,1 mL
3-2. Tampão de corrida
0,025 M 15,14 g/ 1 L Tris base (pH 8,3)
Glicina 0,192 M 72,06 g/ 1 L
Água q.s.p. - 500 mL
3-3. Gel de resolução (10%)
10%
Tris 1,5 M pH 8,8 (mL) 2,25
Persulfato de amônia 10% (µL) 125,0
Acrilamida (30%) / Bis acrilamida (0,8%) (mL) 3,0
SDS 10 % (µL) 125,0
TEMED (µL) 12,5
Água destilada 2,3
-4. Gel de separação (gradiente em poliacrilamida)
20%
3
7,5%
Tris 1,5 M pH 8,8 (mL) 10 10,0
Persulfato de amônia 10% (µL) 85 55
Glicerol 100% (mL) - 2,0
Acrilamida (30%) / Bis (0,1%) 10 26,6
Bis acrilamida 1,5% (mL) 4 -
TEMED (µL) 8,5 5,5
Água destilada 16,0 1,4
Nascimento, R.P. Anexos
145
ANEXO 5 – Artigo Publicado
ASCIMENTO R.P., D’AVILA-LEVY, C.M., SOUZA, R.F., BRANQUINHA, M.H.,
N
BON, E.P.S., PEREIRA JR., N. & COELHO, R.R.R. Production and partial characterization
of extracellular proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3 isolated from a Brazilian
cerrado soil. Arch. Microbiol. v. 184 (3), pp. 194-198, 2005
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo