Erica Rodrigues de Souza - teses.usp.br · A definição de praguicida segundo a Organização para...

BIBLIOTECA acuidade de Ciências Farmacéutic;:,·

Un\llersidade r.e São Palllr ,/

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas

Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de

transformação em matriz ambiental - desenvolvimento e

comparação de técnicas analíticas

Erica Rodrigues de Souza

Dissertação para obtenção do grau de

MESTRE

Orientadora: Profa. Ora. Gisela Aragão Umbuzeiro

São Paulo 2009

BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Unil/ersidade de São Paulo

ERICA RODRIGUES DE SOUZA




Dissertação para obtenção do grau de

MESTRE

Orientadora : Profa . Ora. Gisela Aragão Umbuzeiro

São Paulo 2009 J3551

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DEDALUS - Acervo - CQ

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30100015282

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Souza, Erica Rodrigues de S729a Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de

transformação em matriz ambiental - desenvolvimento e comparação de técnicas analíticas / Erica Rodrigues de Souza

São Paulo, 2009. 120p .

Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas.

Orientador: Umbuzeiro , Gisela Aragão

1. Toxicologia ambiental 2. Análise toxicológica I. T. 11. Umbuzeiro, Gisela Aragão , orientador.

615 .9 CDD

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ERICA RODRIGUES DE SOUZA




Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Dra. Gisela Aragão Umbuzeiro

Orientadora/Presidente

~, ~, .~~ J~w'i ~ Prof. Dr.

1°. Examinador

-/~ Ou.-~~ c& ~ S?~~ Prof. Dr.

2°. Examinador

1Il

~~i O~AC~4,-2&0-)

IV

Agradecimentos

Agradeço a minha mãe Dilma e avó Joana pela paciência e apoio em todos os

momentos;

Aos amigos da CETESB, Gilson, Wálace, Daniela, Adauto, Carlos e Viana por toda

a colaboração e bom humor;

Aos amigos do LACE, Luiz, Rafael, Fernando e Gustavo, pelas dicas e valiosas

sugestões;

As professoras Doutoras Alice Chasin, Regina Lúcia e Marina Tavares; por

sempre apoiarem o trabalho e contribuírem efetivamente para que ele começasse

e/ou fosse concluído;

Agradeço a minha orientadora, pelos ensinamentos e pelo esforço para que o

nosso trabalho chegasse ao fim;

Agradeço especialmente ao Zé Luiz pelo companherismo, pelo apoio e também

pelas "broncas" nesses três anos de mestrado.

v

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............ .... ... ................ .. .... .. .... ....... .. ..... ....... ......... ....... ... .. ........ .. .... . 1

2. GENERALIDADES ...... ... .... ....... .. ........ ................................... .. .. ... .... .. .. ..... ... ... ..... . 3

2.1. Praguicidas Carbamatos ...... ...... .. .... ... .. .. ... ... .... .... .. ... .. ........... ..................... .. 4 2.2. Toxicocinética e toxicodinâmica .. ......... ........ ...... .. ................. .. ..................... 7 2.3. Toxicidade .. .......... .... .. ....... ..... .. ... ... ..... ... .... .. ......... .... .................. .. .... .. ... ..... .. 12 2.4. Contaminação ambiental por praguicidas ......... .... ...... .. .. .... ...... ...... .. .... ..... 22 2.5. Legislação ... ...... .... .. .. ......... .......... ... .............. .. .. .............. .. ......... .. .... ..... ..... ... 26 2.6. Teste de toxicidade aguda .... ...... ... .. .... ... ......... .. ........... ...... ...... .......... ..... .. .. 28 2.7. Técnicas analíticas e preparo de amostras .. ... .. .............. .. .... ....... ... ..... .... .. 31

2.7.1. Cromatografia gasosa .. .... ... .. ...... ..... .......... ... ............. .. .. .... .. ...... .. ....... .. 31 2.7.2. Cromatografia líquida de alta eficiência ... .. ....... .... ... .... ..... ...... .... ......... 32 2.7.3. Eletroforese capilar .. .... ......... ... ... .............. ...... .... .. .... ...... ....... .. ..... ... .. .. .. 36 2.7.4. Espectrometria de massas ... .. ..... ... ... .... .. ... ....... .. .. .. ........... ........ ........... 42 2.7.5. Preparo de amostras - extração em fase sólida ............. ...... ...... .. ...... .45

3. OBJETIVO .. ... ......... ......... ......... .. ... .. .. .... ....... .. ... ... ....... ......... .. ..... ....... ...... ... ......... 52

4. MATERIAL E MÉTODOS .. .... ... .. ....... ...... ........ ..... .... .. ... ......... .... .... ... ................... 53

4.1. Material ..... .... ..... ... ... ........ ..... ... ... ..... .. ......... .. .... .... ... ... ..... ........ ... .... ........... .... 53 4.1.1. Equipamentos ....... .............. ... ... .. .............................. .... ..... ... ...... ....... .... . 53 4.1.2. Reagentes e materiais .. ... .. .. .. .. ....... .. ....... ... .. ....... ........ .... .. .. .. ... ........... .. 54 4.1.3. Soluções-Padrão ... ...... ...... .... .. .......... ........ .... ........ .......... ........... ... ... .. .... 55 4.1.4. Amostras de Referência Negativa .. ... ....... ... ............... .... ...... ...... .. ........ 56

4.2 Métodos ...... ...... .... .. ... .. ....... .......... .... .. .... ....... ........ .. ......... ... .... .... .. ... .... ... .. ..... 57 4.2.1. Determinação de aldicarbe e aldicarbe sultona por HPLC-DAD ... ..... 57 4.2.2. Determinação de aldicarbe por CE-DAD ... ......... ... .......... ... ... ........ ....... 60 4.2.3. Determinação de aldicarbe e aldicarbe sulfona por LC-MS ... ............ 60 4.2.4. Bioensaio com bactéria luminescente Vibrio fischeri ..... ........ .. ......... 62

4.3. Validação analítica ... ...... ..... ... ......... .. .. ... .. .. ... ... .. ...... ..... ........ .. ............ .......... 63 4.4. Teste de toxicidade aguda ........ ... .. .......... ..... ..... ... ..... ...... ............................ 66

5. RESULTADOS ... .. ... ..... .. .. .. ....... ..... .... .... ..... .................. .. ....... .. ... ........ ....... ...... ..... 67

5.1. Resultados cromatografia líquida ............. ....... ... .. ...... .... ....... ... ....... .... ...... . 67 5.2. Otimização do procedimento de extração ..... ... ...... .. ..... .. ........ ........ .. ......... 70 5.3. Resultados - eletroforese capilar ...... .. ... ........ .......... ... ... .. ... .. ... .. ...... ..... ...... 77 5.4. Resultados cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas .............. .... .. .. .... .......... ...... ....... .... ....... ... ... .... .... .... ....... .. ...... ...... ....................... ..... 80 5.5. Teste de toxicidade aguda ....... .. ... .. .... ... .............. .......... ..... .... ... .............. .... 84

6. DiSCUSSÃO ..... ..... .... .. ... .. ........ .. ...... ..... .. ................ .... .... ... ............. ..... ... ..... ..... ... 86

7. CONCLUSÕES ........ ..... .... .. ... .... ..... .... ..... ... ..... .. ..... ... ..... ... .. ... ... ...... ... ........... .. ... .. 93

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFiCAS .. .. ..... .... .. ... .. ........ .. .... ................ ... ...... ... .. .... . 94

APÊNDiCE .... ........ ... ........ .. .. .. ... .......... .... .... ..... ........ .......... .. ........... ...... ... ..... ..... .. .... 109

VI

RESUMO

SOUZA, E. R. Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em

matriz ambiental - desenvolvimento e comparação de técnicas analíticas. São Paulo,

2008. 120p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas -

Universidade de São Paulo.

Os praguicidas carbamatos surgiram na década de 70. Este grupo de substâncias

possui atividade anticolinesterásica, com variado grau de toxicidade. São solúveis em água

e termicamente instáveis. O praguicida aldicarbe faz parte do grupo dos carbamatos, sendo

um metil carbamato de oxima. Contaminações de águas subterrâneas e superficiais pelo

aldicarbe já foram demonstradas, devido a alta solubilidade deste composto em água e sua

alta capacidade de lixiviação em solo. Este trabalho visa o desenvolvimento de métodos

analíticos para separação e quantificação de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe

sulfona, por cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massas e eletroforese capilar. O trabalho objetiva ainda avaliar a

toxicidade aguda das três substâncias utilizando a bactéria marinha luminescente Vibrio

fischeri. Amostras de água ultrapura, superficial e subterrânea foram submetidas a etapas

de extração em diferentes cartuchos de fase sólida para avaliação da recuperação dos

analitos e a realização da pré concentração dos mesmos. No método proposto por

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, obteve-se limite de

quantificação de 10 J.Jg.L-\ sendo que o alcançado no método proposto por cromatografia

líquida com detecção por arranjo de diodos foi de 2 J.Jg.L-1. Já o método desenvolvido por

eletroforese capilar com detecção por arranjo de diodos teve um limite de quantificação de

10 mg.L-1. Os resultados de CE50 obtida para o aldicarbe, aldicarbe sulfona e aldicarbe

sulfóxido, no teste de toxicidade com a bactéria luminescente Vibrio fischeri foram

respectivamente: 56,0 mg.L-\ 47,0 mg.L-1 e 7,8 mg.L-1. O método desenvolvido por

cromatografia líquida se mostrou com sensibilidade satisfatória para análise de aldicarbe e

seus produtos de transformação em água com níveis de quantificação dos compostos

abaixo do limite determinado pela OMS (10 J.J9L\ O método por eletroforese capilar não se

mostrou com sensibilidade ideal para detecção dos analitos em níveis de traços. No teste de

toxicidade aguda, observou-se que o aldicarbe sulfóxido é cerca de 7 vezes mais tóxico para

a bactéria que o próprio aldicarbe, o que já é descrito na literatura para outras espécies.

VII

ABSTRACT

SOUZA, E. R. Evaluation of aldicarb pesticide and its transformation products in

environmental matrix - development and comparison of analytical techniques. São

Paulo, 2008. 120p. Master Dissertation - Faculdade de Ciências Farmacêuticas -

Universidade de São Paulo.

Carbamates pesticides first appeared in the 1970s. This group of substances

possesses anticholinesterasic activity, with varied toxicity degree. They are soluble in water

and thermally unstable. The aldicarb pesticide belongs to the carbamates group, being an

oxime methyl carbamate. Contaminations of underground and superficial waters by aldicarb

have been demonstrated, due to the high solubility of this compound in water and its high

capacity of lixiviation in soil. This dissertation aims to develop analytical methods for

separation and quantification of aldicarb, aldicarb sulfoxide, and aldicarb sulfona, by high

efficiency liquid chromatography, liquid chromatography-tandem mass spectrometry and

capillary electrophoresis. The dissertation also focuses on evaluating the acute toxicity of the

three substances using the luminescent marine bacterium Vibrio fischeri. Samples of

ultrapure water, superficial and underground, were submiUed to extraction stages in different

cartridges of solid phase for evaluating the recovery of analytes and conducting their pre

concentration. In the method proposed by liquid chromatography-tandem mass

spectrometry, a quantification limit of 10 IJg.L-1 was obtained, in comparison with the 2 IJg.L-1

achieved in the method proposed by liquid chromatography with diode-array detection. The

method developed by capillary electrophoresis with diode-array detection had a

quantification limit of 10 mg L-1. The results of CE50 obtained for the aldicarb, aldicarb

sulfone and aldicarb sulfoxide, in the toxicity test with the luminescent bacterium Vibrio

fischeri were respectively: 56.0 mg.L-1, 47.0 mg.L-1 e 7.8 mg.L-1

. The method developed by

liquid chromatography showed satisfactory sensitivity for analysis of aldicarb and its

transformation products in water with quantification leveis of the compounds below the limit

determined by OMS (10 IJg.L-1) . The method by capillary electrophoresis did not show ideal

sensitivity for trace levei detection of analytes. In the acute toxicity test, it was observed that

the aldicarb sulfoxide is nearly 7 times more toxic for the bacterium than the aldicarb itself,

which is already described in the literature for other species.

1. INTRODUÇÃO

Antes da Segunda Guerra Mundial, a maioria dos produtos utilizados na

agricultura para o controle de pragas eram baseados em compostos inorgânicos

e/ou extratos vegetais. O marco inicial do surgimento de novas substâncias para

este fim ocorreu com a redescoberta da molécula do dicloro-difenil-tricloroetano

(OOT) em 1939 e sua aplicação com finalidade inseticida (Larini, 1999).

Os praguicidas carbamatos surgiram na década de 70, quando a busca por

compostos menos persistentes e mais eficazes aumentou , trazendo aos agricultores

novas opções de produtos. Este grupo de substâncias possui atividade

anticolinesterásica, com variado grau de toxicidade. Os principais representantes

desta classe são: carbaril, carbofurano, aldicarbe, propoxur e metomil. Estes

compostos possuem caráter polar, são solúveis em água e termicamente instáveis

(Moraes, 1999; Martínez et ai, 2005) .

Em contraposição aos resultados satisfatórios da utilização destas substâncias

como inseticidas, acaricidas e nematicidas, está o fato de que estão cada vez mais

envolvidas em situações de intoxicações humanas, animais e contaminações

ambientais. Os produtos de transformação gerados por reações de hidrólise e

oxidação também possuem elevado caráter tóxico (Molina et aI. , 2001; Anvisa,

2007) .

O praguicida aldicarbe faz parte do grupo dos carbamatos, sendo um metil

carbamato de oxima. É comercializado com o nome comercial de Temik®, possui

apresentação exclusivamente granular, sendo indicado para as culturas de batata ,

café, citros e cana-de-açúcar. A venda no Brasil é autorizada apenas nos Estados

da Bahia, Minas Gerais e São Paulo. Apesar da sua baixa persistência no ambiente

Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental- desenvolvimento e

comparação de técnicas analíticas - 2

e rápida biodegradação, possui uso bastante controlado, pois tem alta toxicidade

aguda para organismos alvo e não-alvo (Román et ai, 2004)

No Brasil, o aldicarbe é considerado um grande problema de saúde pública,

devido a sua venda ilegal para aplicação como raticida (Anvisa, 2006). O produto

não tem indicação de uso para esse tipo de praga, entretanto, devido a sua alta

toxicidade acaba sendo desviado para o controle de roedores nas grandes cidades

(Moraes, 1999).

Contaminações de águas subterrâneas e superficiais pelo aldicarbe já foram

demonstradas desde a década de 1980, isso devido a alta solubilidade deste

composto em água e sua alta capacidade de lixiviação em solo (Jones e Marquardt,

1987).

Este trabalho tem por objetivo otimizar métodos analíticos para detecção e

quantificação de aldicarbe e seus produtos de degradação em matrizes ambientais.



2. GENERALIDADES

A definição de praguicida segundo a Organização para Agricultura e

Alimentação das Nações Unidas (FAO) é de que são produtos químicos ou uma

mistura de substâncias destinadas à prevenção, a destruição ou controle de

qualquer praga, incluindo vetores de doenças humanas e animais , que causam

prejuízo, que interferem na produção, elaboração, armazenagem, transporte e

comercialização de alimentos, produtos agrícolas, de madeira e seus derivados, ou

que podem ser administrados aos animais para combater insetos, aracnídeos e

outras pragas dentro ou sobre seus corpos. Este termo também se aplica às

substâncias reguladoras do crescimento das plantas, desfolhantes, dessecantes,

agentes para reduzir densidade ou evitar a queda prematura dos frutos (FAO, 2007) .

A utilização do termo pesticida é inadequada por haver significado literal de

algo com poder de destruir peste, ou seja , qualquer doença epidêmica grave, por

vezes endêmica , de grande mobilidade e mortalidade. Outra terminologia , utilizada

de maneira pouco específica é agrotóxico, que inclui todos os compostos químicos

usados na agricultura , excluindo os de uso domissanitário, pecuário , utilizados no

combate de parasitas de animais domésticos, aqueles aplicados à limpeza e

manutenção das áreas com linha de transmissão elétrica, no controle de plantas

aquáticas e outros.

A classificação destes compostos é baseada nos padrões de uso e no tipo de

praga a ser controlada ou destruída. A natureza dos grupos funcionais também é

muito importante, pois a reatividade e a utilidade dos compostos orgânicos estão

diretamente ligadas a eles (Martínez et ai , 2005).



o uso intensivo de praguicidas na produção agrícola pode levar a

contaminação do meio ambiente , principalmente das águas (Mattos e Silva, 1999).

2.1. Praguicidas Carbamatos

Os carbamatos são compostos anticolinesterásicos com variado grau de

toxicidade para seres humanos. Estas substâncias são largamente utilizadas no

controle e no combate a pragas, principalmente como inseticidas (agrícola , saúde

pública, uso doméstico e veterinário), como acaricidas e nematicidas (Larini, 1999).

Os trabalhadores expostos são os manipuladores destas substâncias nas fábricas e

os que aplicam estes praguicidas na atividade agropecuária , principalmente quando

não fazem uso dos equipamentos de proteção individual. Outras possibilidades de

intoxicação se dão por falta de higiene, por contaminação direta de alimentos e por

ingestão proposital, como tentativa de suicídio.

O inseticida e nematicida aldicarbe, em formulação granulada (Temik 150®)

para aplicação no solo, tem sido muito utilizado no Brasil. Possui autorização apenas

para comercialização , não sendo produzido no país, e sua venda somente é

permitida nos estados da Bahia, Minas Gerais e São Paulo. O sucesso comercial

desse produto é decorrente, ao menos em parte, de sua eficiente ação praguicida. O

aldicarbe é utilizado em culturas de batata , café, cana-de-açúcar e citros (Anvisa,

2007) . O intervalo de segurança entre aplicação e colheita é em média de 50 dias.

Para batata , recomenda-se uma aplicação única , no momento da semeadura ou

plantio da cultura e quando necessário, uma aplicação de emergência nas plantas.

Para café e citros a aplicação indicada é na estação chuvosa no início da infestação

por pragas. Na cultura de cana a aplicação deve ser feita no momento do plantio e



após a colheita (Bayer, 2008). É obrigatório o emprego de equipamento adequado

para aplicação do produto, como também cobrir os grânulos imediatamente com

terra de modo a evitar contato com aplicadores e outras pessoas que penetrem

posteriormente na cultura (Anvisa, 2007).

o aldicarbe é o 2-metil-propionaldeído O-(metilcarbamoil) oxima. Sua fórmula

estrutural é C7H14N202S, e seu peso molecular é 190.25 daltons (Spectrum

Laboratories, 1999). Sua estrutura química está apresentada na Figura 1. Possui

alta solubilidade em água, é estável em meio levemente ácido e neutro, mas

degrada-se rapidamente em soluções alcalinas. Sua degradação no meio ambiente

é rápida, não sendo um composto persistente, entretanto, o aldicarbe e seus

produtos de transformação são altamente tóxicos para aves, peixes e mamíferos.

CH3 Q I 11 .IH

CH3-S-C-CH = N-Q-C-N I ' CH3 CH 3

Figura 1 - Estrutura molecular do aldicarbe.

o aldicarbe possui dois isômeros como apresentado na figura 2. O produto

comercial é composto por uma mistura desses dois isômeros e não há evidências de

maior atividade de um deles (Inchem, 1991).



CH 3 I

CH3 S - C - C

Cti 3

H

Anti

o 11

N / . OCNHCH 3

CH 3

I CH

3S - C __

I CH3

O

C - N 11 "'"'"'-OCNHCH 3

H

Syn

Figura 2 - Estrutura molecular dos isômeros geométricos de aldicarbe.

o Temik 150® é um produto granular de coloração cinza-chumbo, com

concentração de aldicarbe de 15%. Ele é conhecido popularmente como

"chumbinho" e utilizado, clandestinamente , como rodenticida . Sua comercialização

clandestina está ainda diretamente relacionada com inúmeros casos de suicídios,

homicídios e intoxicações acidentais por esse produto (Anvisa, 2006). Somente no

Estado do Rio de Janeiro são estimados 900 a 1500 casos de intoxicação anual por

"chumbinho" , com cerca de 100 mortes (Moraes, 1999; Anvisa, 2006).

Estudos in vitro demonstraram que o aldicarbe sulfóxido, principal produto de

transformação do aldicarbe por reações de oxidação, é um inibidor da

acetilcolinesterase 23 vezes mais potente que o aldicarbe e 60 vezes mais potente

que o aldicarbe sulfona (proveniente da oxidação do aldicarbe sulfóxido) (Mink et ai ,

1989; Martínez et ai, 2005) .

Os produtos resultantes da hidrólise do aldicarbe sob condições de pH

alcalino (pH 12.9 e 13.4) são o aldicarbe oxima, metilamina e carbonato (Lemley e

Zhong , 1983; Given e Dierberg ,·1985). A meia vida de hidrólise nesses dois pH são



de 4,0 e 1,3 min, respectivamente. Outra hidrólise determinada em pH 8.5 e 8.2,

indicaram meia-vida de 43 e 69 dias, respectivamente (Lemley e Zhong, 1983).

2.2. Toxicocinética e toxicodinâmica

Toda substância pode ser considerada um agente tóxico, dependendo das

condições de exposição, como dose administrada ou absorvida, tempo e freqüência

de exposição e vias pela qual é administrada. Desta forma é necessário o

conhecimento das condições de uso seguro de substâncias químicas para a saúde

humana e ambiental. Da mesma maneira que todas as substâncias podem ser

potencialmente tóxicas, elas também podem ser usadas de forma segura, desde que

as condições de exposição sejam mantidas abaixo dos níveis de tolerância

(concentração ou intensidade máxima e mínima, relacionada com a natureza e o

tempo de exposição ao agente, que não causará dano à saúde do indivíduo durante

toda sua vida). Quando não for possível definir um limite de tolerância, deve-se

então evitar a exposição (Barros e Davino, 2008).

Os carbamatos são derivados do ácido carbâmico ésteres que tem sua

estrutura comum e dois radicais, R e R' onde R é um álcool, oxima, ou fenol e R' um

hidrogênio ou um grupo metil (Baron, 1991). Os compostos deste grupo apresentam

as seguintes características:

1) alta atividade inseticida;

2) baixa ação residual, devido à instabilidade química das moléculas;



3) baixa toxicidade a longo prazo, quando comparada com derivados

fosforados (Mídio e Silva, 1995).

A absorção do aldicarbe pelo homem pode ocorrer pelas vias dérmica,

respiratória e oral, sendo essa última a mais importante. (Inchem, 1991; Melito,

2006; Alonzo e Corrêa, 2008).

A absorção por via oral ocorre nas intoxicações agudas acidentais, nas

tentativas de suicídio e intoxicações por contaminação alimentar e ocupacional,

tendo relevância também em trabalhadores que fumam durante o trabalho (Alves e

col , 1997). Após a absorção, o aldicarbe e seus produtos de biotransformação são

rapidamente distribuídos por todos os tecidos (Baron, 1991). A concentração tende a

ser maior nos órgãos e tecidos envolvidos no metabolismo do xenobiótico (Baron,

1991 ).

Na biotransformação do aldicarbe, as reações de maior importância são:

1 - Oxidação, levando a formação de aldicarbe sulfóxido, que mais lentamente se

oxida em aldicarbe sulfona.

2 - Hidrólise, com a formação do ácido N-metilcarbâmico e o fenol correspondente.

A biotransformação e a eliminação do aldicarbe são relativamente rápidos,

sem evidências de que ocorra bioacumulação (Baron, 1991). A biotransformação

ocorre no fígado através de enzimas microssomais (Oonnithan e Casida, 1967). A

eliminação ocorre principalmente pela urina e fezes . No caso da eliminação pela via

biliar, ocorre circulação entero-hepática, prolongando a sintomatologia (cerca de

30% é excretado conjugado pela. bile) (Larini, 1993).

Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental- desenvolvimento e comparação de técnicas analíticas - 9

No fígado, o aldicarbe é rapidamente oxidado a aldicarbe sulfóxido.

Posteriormente e mais lentamente, uma pequena porção do aldicarbe sulfóxido é

oxidado a aldicarbe sulfona. O aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona são

convertidos aos correspondentes oximas e nitrilas, as quais são lentamente

degradadas aos correspondentes aldeídos, ácidos e alcoóis (figura 3).

Knaak e colaboradores (1966), administraram doses orais de aldicarbe

marcado em ratos e observaram que a maior parte do aldicarbe e seus metabólitos

foram excretados nas primeiras 24 horas. Após quatro dias, mais de 95% das doses

administradas foram excretadas e não se detectou resíduos nos tecidos corporais.

Em outro estudo em ratos, realizado por Andrawes e colaboradores (1967), 80% da

dose de aldicarbe radioativamente marcado foi eliminado na urina e 4% nas fezes,

nas primeiras 24 horas após a exposição. Embora resíduos tenham sido

encontrados em níveis baixos em vários tecidos, nos primeiros dias após a

administração, não há indicações de que o aldicarbe acumule-se no organismo.

Marshall e Dorough (1979) verificaram que após administração de aldicarbe

marcado em fêmeas de ratos, foi detectado nos duetos biliares dos animais 26% da

dose na bile nas primeiras 24 horas, demonstrando que os metabólitos biliares são

amplamente reabsorvidos e excretados na urina (Andrawes et a!., 1967; Marshall e

Dorough, 1979).


comparação de técnicas analíticas - 1 O

Ois O CH3 CH3

CH3 • S • ? . Oi .. N • O • C • NH • CH 3 CH' 3 ' S • ? . (H ... NOH

0i3 c:::::> (H3

CHl · S • é - C ~ N I

c=:!> CH3

Aldicarbe

~ Aldicarbe oxima Aldicarbe nitrila

o 0i3 O O CH3

• • 11 IIL l

O CH3 .. I

CH - S - C - CH = N - O - C - NH - CH 3 CHI _ S _ C _ CH = NOH 3 • 3. ~

0i3 ~ CH3

---"...,

CH 3 -S C -C =f\l

CH3

Aldicarbe slIlfóxido Aldicarbe slIlfóxido oxima Aldicarbe slIlfóxido nitrila

~ o 0i3 o O CH3 o CH 3

11, t .. I

CH3 - S - ê -CH N - O - C - NH - CH_ . ~ CH - S-C-CH=N- OH

::~, 111 I CH3- ~ Ç - C =N

O CH 3 ~

O CH3 ~ O CH 3

Aldicarhe sulfona Aldicarbe sulfona oxima Aldicabe slIlfona nitrila

Figura 3 - Biotransformação de aldicarbe em ratos (Inchem, 1991).

A ação tóxica do aldicarbe ocorre através da inibição da enzima

acetilcolinesterase, que promove a hidrólise da acetilcolina. A acetilcolina é o

mediador químico que realiza a transmissão do impulso nervoso em todas as fibras

pré-ganglionares do sistema nervoso autônomo, em todas as fibras parassimpáticas

pós-ganglionares e em algumas fibras simpáticas pós-ganglionares. Além disso, a

acetilcolina é o transmissor neuro-humoral do nervo motor do músculo estriado

(placa mioneural) e de algumas sinapses interneuronais no sistema nervoso central.

A transmissão do impulso nervoso requer que a acetilcolina seja liberada no espaço

intersináptico ou entre a fibra nervosa e a célula efetora. Depois, a acetilcolina se

liga a um receptor colinérgico gerando desta forma um potencial pós-sináptico e a

propagação do impulso nervoso. A acetilcolina é imediatamente liberada e



hidrolisada pela acetilcolinesterase. Cambon e col. (1979) demonstraram que logo

após a administração de aldicarbe à ratos, houve uma diminuição significativa nos

níveis de acetilcolinesterase do cérebro e do fígado desses animais . Weil e

Carpenter (1975) determinaram a DL50 dos produtos de transformação de aldicarbe

em ratos, para o aldicarbe sulfóxido obtiveram 0,88 mg.Kg-1 de peso corpóreo, e

25,0 mg.Kg-1 de peso corpóreo para aldicarbe sulfona.

o aldicarbe e a acetilcolina possuem estruturas muito semelhantes como

demonstrado na Figura 4. Desta forma o praguicida se liga facilmente ao sítio da

enzima acetilcolinesterase impedindo a ligação desta com o neurotransmissor

acetilcolina.

o CH3 II I

CHá C-O-cHrCHrN"-CH3 I

Acetilcolina CH3

o CH3 11 I

CH -NH- C-O-N=CH-C-S-CH 3 2 I 3

Aldicarbe CH3

Figura 4 - Estrutura molecular do aldicarbe e do neurotransmissor acetilcolina

o quadro clínico da intoxicação é caracterizado essencialmente por

manifestações nicotínicas e muscarínicas que podem iniciar em até 12 horas após a

exposição. As manifestações iniciais de intoxicação incluem cefaléia, tonturas,

agitação, tremores , miose, lacrimejamento, visão turva, fotofobia e salivação



excessiva. Nos casos de intoxicação moderada e grave pode-se observar quadros

de bradicardia e hipotensão, seguida por taquicardia e arritmias (Larini, 1999; Alonzo

e Corrêa, 2008) .

2.3. Toxicidade

o aldicarbe é o carbamato de maior toxicidade aguda, inclusive para

organismos não-alvos, como mamíferos, aves e peixes, de maneira que a

contaminação de produtos agrícolas e do ambiente com resíduos desse composto

pode causar efeitos adversos a esses organismos. Sua DL50 oral em camundongos

é da ordem de 0,5 a 1,0 mg.kg-1. A toxicidade desta substância para alguns

organismos é apresentada na Tabela 1.

A valiação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental - desenvolvimento e


Tabela 1 - Comparação da toxicidade do praguicida Aldicarbe frente a organismos

não-alvo.

Organismo Concentração/Dose Letal 50

Dafnias 40 - 200 jJg.L-1

Skeletonema costatum > 50.00 jJg.L-1

Misidáceo 13 jJg.L-1

Camarão branco 72 jJg.L-1

"Pinfish" 80 jJg.L-1

Truta arco-íris 780 jJg.L-1

"Catfish" 1,6 jJg.L-1

Coelhos 5,3 mg.kg-1

Ratos 283 mg.kg-1

(Fonte: Who, 2004)

Estudos em camundongos, ratos e cobaias mostraram que a inalação do

aldicarbe por cinco minutos é extremamente tóxica para estas três espécies

(Grendon et ai, 1994). O aldicarbe e seu produto de degradação aldicarbe sulfóxido

possuem toxicidade aguda semelhante para mamíferos, embora este último seja um

inibidor mais potente da acetilcolinesterase, o aldicarbe sulfona é menos ativo que o



aldicarbe (Burgess et ai , 1994). Estes compostos têm sido apontados como

indicadores da exposição ao aldicarbe, embora sejam estáveis por, no máximo, dois

dias em animais vivos ou mortos (Harper et ai, 1998; Cobb et ai, 2001).

A mutagenicidade do aldicarbe foi avaliada pelo teste de Ames usando 5

linhagens de Salmonella fyphimurium, o composto não demonstrou ter atividade

mutagênica (Ercegovich e Rashid, 1973). Dunkel et ai (1985) confirmaram esses

resultados , pois estudo real izados em 4 diferentes laboratórios que testaram a

mutagenicidade do aldicarbe em Salmonella fyphimurium (TA98, TA100, TA1535,

TA1537, e TA1538) e E. coli (WP2 uvrA) , com e sem ativação metabólica,

apresentaram respostas negativas para mutagenicidade.

Weil e Carpenter (1965) avaliaram os efeitos crônicos e subcrônicos de

aldicarbe em ratos através da introdução deste composto na dieta de animais pelo

período de dois anos. As doses testadas foram: 0,005; 0,025; 0,05 e 0,1 mg.Kg-1 de

peso corpóreo. O grupo era composto por 40 animais, 50% machos e 50% fêmeas.

Foram avaliadas as medidas de consumo alimentar, peso corpóreo , mortalidade,

incidência de infecção, peso de órgãos como rins e fígado em relação a

porcentagem de peso corpóreo, incidência de lesões e tumores, e atividade da

colinesterase eritrocitária , cerebral e plasmática. Não foram observadas alterações

significativas nos parâmetros avaliados no grupo experimental quando comparado

ao grupo controle.

Não há dados que indiquem potencial carcinogênico no praguicida aldicarbe.

Weil (1968) realizou um experimento em ratos machos aplicando uma solução de

aldicarbe (0,125%) nas costas dos animais duas vezes por semana durante 28

meses. Não foi observada nenhuma alteração significativa na incidência de tumores.



Testes de toxicidade aguda oral foram realizados em 5 espécies de aves e

teste agudo dietário foi realizado em uma espécie. A palatabilidade de grânulos de

aldicarbe foi estudada em experimentos com gaiola em cinco espécies sob

condições laboratoriais e de campo. Relatórios de estudos detalhados de

monitoramento da vida selvagem também foram realizados. Nos resultados obtidos

observou-se que o aldicarbe é altamente a extremamente tóxico para aves de forma

aguda, com a maioria das DL50 abaixo de 5mg.kg-1. Estudos em gaiola com 6

espécies mostram que aves podem consumir quantidades letais de grânulos de

aldicarbe, especialmente quando há pouco suprimento de alimento, mas que pelo

menos alguns indivíduos parecem rejeitar totalmente os grânulos. A supervisão em

campo tanto no Reino Unido quanto nos EUA confirmou que um número limitado de

aves pode morrer pelo uso de aldicarbe, mas sem afetar populações. Um baixo

número de carcaças foi recuperado (normalmente menos de dez espécimes) em

locais de estudo de campo individuais. A análise de resíduo do praguicida confirmou

exposição ao aldicarbe em cerca de metade dos espécimes examinados. Grânulos

que permaneceram expostos na superfície aparentaram ser a principal fonte de

exposição, mas outras fontes como minhocas contaminadas com aldicarbe também

foram identificadas (Inchem, 1991; NRA, 2001).

Para peixes o aldicarbe também se apresentou altamente tóxico em testes

estáticos com a truta arco-íris e o peixe-lua de guelra azul. O primeiro teste com a

truta arco-íris foi feito a 12°C utilizando uma formação granular 10% adicionada

diretamente a jarros contendo 15 L de água e cinco peixes por jarro (peso médio de

1,5 g). Um único indivíduo morreu na concentração de 0,32 mg.L-1, mas todos

morreram dentro de 48 horas com concentrações de 1,8 mg.L-1 (NRA, 2001). Perda

de equilíbrio foi percebida no período de 6 horas com concentrações acima de 1


mg.L-1. Outro teste realizado com a truta arco-íris seguiu um protocolo similar, mas

introduziu o toxicante em solução de acetona. A mortalidade só ocorreu nas duas

maiores concentrações do teste. A concentração de efeito não observado nominal

foi de 0,18 mg.L-1; os peixes demonstraram sinais de irritabilidade depois de 24

horas expostos a concentração de 0,32 mg.L-1 (Handley et ai , 1991).

Peixes guelra azuis foram testados a 22°C no mesmo laboratório do primeiro

teste com a truta arco-íris e de acordo com o mesmo protocolo. A resposta à dose foi

abrupta, com uma única mortalidade perto do fim do período de exposição a 0,1

mg.L-1, mas com mortalidade total, precedida por perda de equilíbrio, dentro de 24

horas a 0,32 mg.L-1. A 0,18 mg.L-1

, a mortalidade aumentou ao longo do período de

exposição até atingir 70%.

O segundo teste com o guelra azul utilizou aldicarbe purificado em solução

aquosa de acetona em jarros contendo 2 L de água de cultivo e 5 peixes (peso

médio 5 g)/jarro. A mortalidade aumentou de 5% a 0,06 mg.L-1 para 100% dentro de

24 horas a 0,25 mg.L-1. Testes com aldicarbe sulfóxido e sulfona provaram que estes

metabólitos são menos tóxicos do que o composto original (CL50 de 4 e 64 mg.L-1,

respectivamente) .

Para o teste realizado com o peixe guelra azul,.a mortalidade alcançou 20% a

0,056 mg.L-1 e 100% dentro de 48 horas a 0,100 mg.L-1. A concentração de efeito

não observado foi de 0,032 mg.L-1.

A base de dados EPA ajuda a compreender as sensibilidades discrepantes

das duas espécies para as quais os relatórios dos testes foram fornecidos. Os

peixes pele-de-marta partilham da mesma insensibilidade relativa da truta arco-íris,

com uma CL50 de 96 horas de 1,37 mg.L-1. Espécies marinhas partilham da



sensibilidade do peixe-lua guelra azul, como indicado pelos resultados para o

Sheepshead minnow (170 ~gr\ o pinfish (80 ~g.L-1) e o spot (200 ~g.L-1) .

A exposição crônica da truta arco-íris ao aldicarbe não revelou nenhuma

sensibilidade adicional comparada à exposição aguda. As trutas arco-íris (peso

médio 1,15 g) foram expostas a aldicarbe em concentrações entre 0,0056 e 0,056

mg.L-1 por 21 dias. Efeitos sub-letais (nadar na superfície ou no fundo , pigmentação

aumentada, perda de equilíbrio) foram observados somente na maior concentração

do teste (0 ,56 mg.L-1), que foi também a concentração limiar letal. Nessa

concentração a mortalidade aumentou pelo período de exposição até atingir 60%

depois de 21 dias (Handley et ai , 1995).

Um teste similar foi realizado sob condições de renovação estática com uma

solução estoque de aldicarbe (10 mg.L-1) preparada a partir de uma formulação

granular de 5%. A mortalidade só foi observada na maior concentração do teste

(1 ,73 mg.L-1) e somente nos 2 primeiros dias de exposição, atingindo 40%. Efeitos

sub-letais (curvatura anormal do corpo) foram vistos a partir de 0,175 mg.L-1 (Thun ,

1991 ).

Foram realizados testes de toxicidade aguda com dáfnias e misidáceos,

testes de reprodução com dáfnias , e testes de inibição do crescimento algal com a

alga verde. Alguns dados para os metabólitos sulfóxido e sulfona também foram

obtidos. Resultados laboratoriais foram corroborados por dados de campo. Os

resultados dos testes indicam que o aldicarbe é altamente tóxico para a maior parte

dos organismos sob condições de exposição aguda . Os crustáceos partilham de

sensibilidade aguda similar a dos, mas são afetados por concentrações mais baixas

quando expostos cronicamente. A mortalidade materna ao invés do impedimento



reprodutivo é o principal indicador de efeitos crônicos em dáfnias (Young Song et ai,

1997).

o aldicarbe sulfóxido e o aldicarbe sulfona têm toxicidade similar ao aldicarbe

quando testados com dáfnias e algas verdes, porém são menos tóxicos para as

algas (Hillman, 1990).

o teste com o mosquito-pólvora envolveu exposição de Chironomus riparius

por 24 horas ao aldicarbe, introduzido ao meio do teste em uma solução de acetona.

Certa atenuação da toxicidade foi notada quando o toxicante foi aplicado pela

primeira vez ao sedimento, com uma CL50 de 26,7 IJg .L-1. Concentrações de

exposição não foram confirmadas analiticamente, e não fica claro se a atenuação na

toxicidade reflete retenção pelo sedimento ou degradação do aldicarbe.

A toxicidade materna parece ter sido a resposta dominante em testes

reprodutivos com dáfnias e ocorreu em concentrações mais baixas que em

exposição aguda. Os efeitos da exposição ao aldicarbe na capacidade reprodutiva

foram estudados em um teste semi-estático de 21 dias com Oaphnia magna.

Análises dos meios de teste mostraram que as concentrações médias obtidas foram

106% das concentrações nominais, que foram utilizadas para relatar resultados. A

CE50 foi 0,09 mg.L-1, e sobreviventes em 0,18 mg.L-1 eram notadamente menores

em tamanho e mais pálidos em cor do que os controles. A toxicidade em adultos

reduziu o número total de jovens produzido por este grupo para 13% de níveis de

controle, mas não afetou significantemente o número de jovens produzidos por cada

fêmea. A CE50 para reprodução não pôde ser determinada, mas está em torno de

0,56 mg.L-1, uma concentração que matou toda a geração de pais (Handley et ai,

1995; Inchem, 1991).



Um segundo teste semi-estático examinou os efeitos de uma formulação

Temik® com concentrações de aldicarbe entre 0,018 a 1,45 mg.L-1 com um fator de

diluição serial de 2,4. Concentrações analíticas permaneceram em pelo menos 80%

do nominal. Todas as dáfnias morreram em 4 dias na dose mais alta, mas os índices

de imobilização não diferiram significantemente entre os organismos de teste e de

controle em concentrações mais baixas. O número de descendentes por adulto

sobrevivente permaneceu inalterado exceto por uma redução no dia 9 em 0.6 mg.L-1.

Os descendentes mortos foram um indicador mais sensível de efeitos, sendo

significantemente maior no dia 21 em 0,25 mg.L-1 e nos dias 11 , 16, 18 e 21 em 0,6

mg.L-1. Os dados não permitiram estimativa de valores de CE50 para imobilização

ou reprodução (Thun, 1991).

Mexilhões de água doce e mariscos asiáticos sobreviveram 96 horas em

exposição estática a 21°C a concentrações de aldicarbe variando até 320 mg.L-1. No

entanto, a atividade de colinesterase no músculo adutor do mexilhão foi diminuída

em concentrações de até 0,1 mg.L-1. A toxicidade aumentou drasticamente com o

amento da temperatura , com mortalidade ocorrendo em concentrações de até 5

mg .L-1 a 30°C (Moulton et ai , 1996).

A baixa toxicidade de aldicarbe em moluscos pode ser observada também na

base de dados da EPA, que lista uma CE50 de 48 horas de 8,8 mg.L-1 para ostras

do leste (US EPA, ).

Para algas, testes em dois laboratórios diferentes demonstraram que o

aldicarbe é levemente a moderadamente tóxico para a alga verde Scenedesmus

subspicatus. A toxicidade dos produtos sulfóxido e sulfona se mostrou na mesma

faixa (NRA, 2001) .



o primeiro de dois resultados foi obtido usando aldicarbe de padrão analítico.

As algas foram cultivadas sob iluminação contínua em um misturador orbital a 24°C.

Concentrações analíticas permaneceram em 93% do nominal. Acúmulo e

deformação de células foi visto em concentrações de 0,8 e 1,6 mg.L-1. As CE50

foram as mesmas com respeito à taxa de crescimento (24 - 48 horas) e biomassa

(Hillman, 1990).

Bioensaios similares foram realizados com sulfóxido e sulfona. A CE50 de 96

horas para aldicarbe sulfóxido foi de 12 mg.L-1 baseada na biomassa e 22 mg.L-1

com relação à taxa de crescimento (0-24 horas). Nenhuma anormalidade foi

observada em culturas de controle ou de teste, mesmo na maior concentração de 50

mg.L-1. Concentrações declinaram tanto durante a fase de exposição que as CE50

baseadas nas concentrações medidas finais foram por volta de 70% (Handley et ai,

1994b). Para sulfona, as CE50 baseadas em biomassa e taxa de crescimento nas

primeiras 24 horas foram de 4,1 e 3,9 mg.L-1, respectivamente. Supostas perdas por

sorção reduziram concentrações finais analíticas para 19 - 58% da nominal, com os

maiores decréscimos em concentrações mais baixas (Handley et ai, 1994b).

Já para organismos terrestres estudos indicam que o aldicarbe é

moderadamente tóxico para minhocas. Besouros também demonstraram ser

suscetíveis ao aldicarbe, sofrendo mortalidade total logo após exposição a areia

tratada com o composto (Edwards e Coulson, 1992).

Estudos de campo não indicam nenhum dano a longo prazo em populações

de inseto não-alvo pelo uso de aldicarbe. Testes de laboratório com bactérias e

fungos indicam que efeitos em populações microbiais no campo são improváveis.

A valiação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental- desenvolvimento e


Uma revisão dos testes de toxicidade em minhocas cita os seguintes dados

de CL50 (mg.kg-1 solo de peso seco) a partir da exposição de várias espécies a

diferentes concentrações de aldicarbe por 14 dias: Eisenia fétida 20; Apporectodea

calignosa 4; A chlorotica 4; Lumbricus rubellus 8; L terrestris 26 (Edward, 1992).

Estes resultados indicam que o aldicarbe é moderadamente tóxico para minhocas. A

toxicidade do aldicarbe (CL50 de 3,1 - 50 mg.L-1) também foi aparente em um teste

não-padrão envolvendo breve imersão em solução contendo aldicarbe antes de

colocação em solo limpo. Edwards (1992), demonstrou que o aldicarbe é absorvido

pelo tecido da minhoca em solos encharcados.

Para microorganismos, Spurr e Sousa (1966, 1974) testaram os efeitos de

aldicarbe e seus produtos de transformação em fungos saprofíticos e patogênicos e

observaram que alguns desses microorganismos utilizam o aldicarbe como fonte de

carbono.

Alguns autores verificaram que concentrações entre 5 e 500 ppm da

formulação comercial de aldicarbe (100 g.Kg-1) causa diminuição da população de

Actinomycetes, Nitrosomonas europaea ,e Nitrobacter agilis nos primeiros 16 dias

de exposição (Kuseske et ai , 1974).

Para abelhas o aldicarbe é muito tóxico, e a via de intoxicação é por contato

direto. No entanto, não há menção de problemas significativos pelo uso comercial do

produto devido à baixa probabilidade das abelhas encontrarem resíduos de

superfície pela aplicação de grânulos no solo. A mortalidade das abelhas ocorre

através da exposição ao néctar de frutas cítricas tratadas com aldicarbe (NRA,

2001 ).

f aculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo



o Temik® 15G foi aplicado pouco antes da florescência em pomares de

laranja-baía e laranja valência com o intuito de determinar se resíduos tóxicos

ocorreriam na flor ou no pólen. Culturas de valências foram tratadas com 22.4 kg/ha

espalhados por 54% da área plantada. Pés de laranjas-baía foram tratados

separadamente com o equivalente a 22,4, 11,2, 5,6 e 2,8 kg/ha. Os grânulos foram

incorporados a 5 cm e irrigados. As concentrações mais elevadas na cultura de

laranjas-baía levou a 20% de mortalidade de abelhas em 20 dias após o tratamento,

aumentando para 52% em 23 dias antes de cair para níveis não-tóxicos em 25 dias.

O tratamento das laranjas valências , causou baixo nível de toxicidade para abelhas

após 20 dias de aplicação (Atkins et ai, 1975).

2.4. Contaminação ambiental por praguicidas

O emprego de praguicidas tornou-se essencial nos sistemas de produção

agrícola, porém a contrapartida do aumento de produtividade proporcionado pelo

seu uso, pode ser observada nos impactos ambientais. Esses impactos ambientais

são decorrentes da toxicidade dos praguicidas aos organismos não-alvo e da

contaminação do solo e dos recursos hídricos. Esse impacto das atividades

agrícolas sobre a qualidade das águas tornou-se conhecido em alguns países

industrializados há algumas décadas. Demonstrou-se altas taxas de lixiviação de

nitrato e outros íons em muitos solos submetidos ao plantio contínuo, sustentado por

aplicações de grandes quantidades de fertilizantes e praguicidas (Filizola et ai,

2002).

Em alguns casos, menos de 0,1% do volume de praguicidas aplicados

alcançam o alvo, sendo que o restante tem potencial para se mover para outros



compartimentos ambientais como as águas superficiais e subterrâneas. Sendo

assim, a contaminação de águas subterrâneas por praguicidas pode acontecer por

um processo de percolação da água no solo e através das fraturas dos solos e

rochas (Lourencetti et ai, 2005).

Estudos de monitoramento ambiental podem ser planejados e realizados

analisando-se diretamente água ou solo, já que o potencial de contaminação de uma

substância depende diretamente da sua mobilidade no solo. A presença de

praguicidas no solo depende diretamente de propriedades como a meia-vida da

substância no solo, coeficiente de adsorção a matéria orgânica (Koc) e solubilidade,

além da interação com certos parâmetros tais como teor de matéria orgânica e

propriedades hidráulicas (Filizola et ai, 2002).

o Estado de São Paulo, apesar de ter um programa de monitoramento da

qualidade das águas superficiais e subterrâneas implantado, não avalia praguicidas

do grupo dos carbamatos de forma sistemática (Cetesb, 2001).

Estudos sobre o destino do aldicarbe e seus produtos de degradação em solo

demonstraram que eles são intensamente lixiviados podendo alcançar lençóis

freáticos contaminando águas subterrâneas e superficiais (Inchem, 1991).

o aldicarbe é transformado no ambiente por reações oxidativas e hidrolíticas,

predominando uma ou outra de acordo com as condições do meio. A hidrólise leva a

formação de compostos menos tóxicos, enquanto que as reações oxidativas

transformam aldicarbe em sulfóxido e sulfona, e ambos mantêm atividade biológica

(Inchem, 1991).



A atividade microbiana ou catálise química pode intervir em ambas as vias de

transformação do aldicarbe, mas a hidrólise tende a ser a principal via de

transformação. A taxa de transformação é influenciada por numerosos fatores onde

os principais são: temperatura , pH, textura do solo , potencial redox, umidade e

atividade microbiana (Read , 1987).

o aldicarbe é usado diretamente no solo e, após a aplicação, é absorvido pela

raiz e distribuído por todo vegetal , de forma que a simples lavagem da planta não é

suficiente para eliminar o praguicida . Sendo assim, o consumo de certos produtos

inadequadamente tratados pode resultar em exposição ao aldicarbe (Farley e

MCfarland, 1999).

Há duas formas de contaminação, a contaminação direta, que resulta, em sua

maioria, da aplicação do praguicida para o controle de pragas agrícolas, e a

contaminação indireta, que resulta de outras fontes não relacionadas com a

aplicação direta para o controle de pragas. Citam-se como exemplos para este caso ,

os resíduos industriais contendo praguicidas ou compostos relacionados que são

freqüentemente lançados aos rios , as partículas de agrotóxicos suspensas no ar

após pulverizações e polvilhamentos que podem ser depositadas a grandes

distâncias, sendo que, somente de 10 a 20% dos agrotóxicos aplicados em

polvilhamento e de 25 a 50% em pulverizações, são depositados sobre a superfície

da planta. A erosão do solo também pode transferir restos de praguicidas para áreas

não tratadas. Assim como as enxurradas que transportam um grande volume de

resíduos tóxicos de áreas agrícolas para os oceanos, mares e rios , o descarte de

sobras de praguicidas e lavagem dos aplicadores na água, o lançamento de



produtos em esgoto doméstico e ainda o descarte de animais mortos por intoxicação

e de alimentos contaminados (Ferracini et ai, 2001).

o aldicarbe é muito persistente em águas subterrâneas, particularmente

naquelas que possuem características ácidas, a meia-vida de transformação em

produtos não-tóxicos varia de uma a algumas semanas, podendo estas substâncias

ficarem presentes por até alguns anos (US EPA, 1984).

Aldicarbe foi detectado em 111 de 1017 amostras de levantamentos de

entidades privadas e municipais de reservatórios de abastecimento no Canadá

(limites de detecção entre 0.01-3.0 j.1g.L-1); a concentração máxima encontrada foi

28 j.1g.L-1 (Hiebsch, 1988). Aldicarbe foi detectado em água de torneira nos EUA em

concentrações de 10 a 500 j.1g.L-1 (EPA, 1984). O aldicarbe e seus produtos de

transformação não foram detectados em amostras de água de abastecimento de

origem subterrânea oriundas de 700 comunidades da Flórida,EUA (limite de

detecção entre 2 e 5 j.1g.L-1 para cada composto) (Miller et ai, 1989). Concentrações

iguais ou superiores a 1 j.1g .L-1 foram detectadas em águas subterrâneas próximas

de plantações de batata em 31,3% das amostras testadas em Long Island, Nova

York, EUA; sendo que 0,9% das amostras continham aldicarbe em concentrações

acima de 100 j.1g.L-1 (Jones e Marquardt, 1987).

Águas subterrâneas canadenses foram monitoradas em Prince Edward

Island, New Brunswick, Novia Scotia, Quebec e Ontario. Regiões produtoras de

batata em províncias marítimas foram consideradas regiões de risco para

contaminação das águas subterrâneas após a descoberta de grandes

concentrações de aldicarbe nessas amostras (superior a 515 j.1g.L-1). A

contaminação de águas superficiais também foi relatada em cerca de 10% das



amostras colhidas de Prince Edward Island em 1983 e 1984. Posteriormente o uso

de aldicarbe em culturas de batata foi proibido no Canadá (CCREM, 1993).

No Brasil apenas um trabalho foi encontrado onde o aldicarbe foi avaliado em

águas superficiais, porém o mesmo não foi detectado em nenhuma das amostras

(Marques et ai, 2007) .

2.5. Legislação

No Brasil a Resolução 518/04 do Ministério da Saúde normatiza a qualidade

de água para consumo humano dando os valores máximos permitidos para um

grupo de 23 praguicidas onde não está contemplado o aldicarbe e nenhuma outra

substância do grupo dos carbamatos.

o Conselho Nacional do Meio Ambiente dispõe sobre os padrões de

qualidade de águas superficiais através da Resolução 357/05 onde estão definidos

os limites para cada grupo de substâncias dentro de cada tipo de corpo d'água e

sua classe.

As águas doces (salinidade igualou inferior a 0,5%), salobras (salinidade

superior a 0,5% e inferior a 30%) e salinas (salinidade igualou superior a 30%) são

classificadas de acordo com a qualidade necessária para seu uso.

Tabela 2 - Valores máximos permitidos para aldicarbe e seus produtos de

transformação em água.


Origem Limite Máximo Permitido (j.Jg.L-1

)

Água potável Proteção da vida aquática

US EPA 3,2 e 4<

OMS 10

Austrália

Argentina 3

Canadá 1

* aldicarbe, aldicarbe sulfona e aldicarbe sulfóxido, respectivamente.

No grupo das substâncias orgânicas estão incluídos alguns praguicidas mas

não há limites máximos estabelecidos para aldicarbe ou seus produtos de

transformação. Entretanto há um representante do grupo dos carbamatos , o

praguicida carbaril de menor toxicidade que o aldicarbe, cujo valor máximo permitido

é de: 0,02 j.Jg.L-1 para água doce classe 1, 70 I-lg.L-1 para água doce classe 3, 0,32

j.Jg.L-1 para água salina classe 1 e 0,32 j.Jg.L-1 para água salobra classe 1.

A legislação vigente para controle de qualidade de águas subterrâneas é a

Resolução 396/08, onde estão descritos os valores máximos permitidos para

aldicarbe e seus produtos de transformação, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona,

sendo que, de acordo com o uso da água é que se tem o valor máximo permitido. Os

dados estão descritos na tabela a seguir:



Tabela 3 - Valores máximos permitidos de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe

sulfona em águas subterrâneas.

Usos da água

Consumo Dessedentação Substâncias Irrigação Recreação

Humano de Animais

Aldicarbe,

Sulfóxido e 10 IJg .L-1 11 IJg .L-1 55 IJg.L-1 NC

Sulfona

NC: não consta (Fonte: CONAMA 396/08)

2.6. Teste de toxicidade aguda com V. fischeri

Diferentes ensaios ecotoxicológicos foram desenvolvidos a partir da década

de 1970 para avaliação da toxicidade de substâncias químicas. Embora

tradicionalmente algas, crustáceos e peixes sejam usados para medidas de

toxicidade aquática, esses testes requerem maiores tempos de exposição e volume

de amostra do que testes de toxicidade que utilizam bactérias. Dentre esses, o teste

que utiliza a bactéria marinha luminescente Vibrio fischeri e recebe o nome de

Microtox® é, sem dúvida, o mais utilizado. Nesse teste é medida a redução da

luminescência emitida naturalmente pela bactéria quando ela é posta em contato

com um agente tóxico, o qual inibe a atividade da enzima luciferase (Olivi, 2008).



Os testes com a bactéria Vibrio fischeri e com o microcrustáceo Daphnia

magna são considerados de padrão internacional para testes de toxicidade aguda

(Knie e Lopes, 2004); sendo que o ensaio com a bactéria marinha é normalizado

pela ISO 11348-1 e DIN 38412-34 (Rodrigues e Pawlowsky, 2007)

O método para avaliação de toxicidade com a bactéria luminescente Vibrio

fischeri foi desenvolvido por Bulich em 1979. Essa bactéria é encontrada nos

oceanos, em vida livre ou associada a outros organismos marinhos como algumas

espécies de lula.

O teste de toxicidade com Vibrio fischeri baseia-se na medida da

luminescência registrada em um aparelho denominado luminômetro, que é capaz de

medir baixas quantidades de luz emitida por uma cultura de aproximadamente um

milhão de células bacterianas (Bulich, 1979). Durante seu metabolismo o Vibrio

fischeri utiliza parte da energia obtida no ciclo de Krebs para emitir luz. Desta forma,

ao entrar em contato com substâncias tóxicas, capazes de causar toxicidade a

bactéria, ocorre a inibição da produção de energia, as bactérias podem cessar ou

diminuir a emissão de luz. Essa diminuição da capacidade de produção de luz é

medida em porcentagem de inibição de luminescência. A principal vantagem deste

teste é a rapidez de resposta. Enquanto testes de toxicidade com microcrustáceos

como Daphnia e peixes levam de 24 a 96 horas para gerar um resultado, em apenas

15 minutos se obtém o resultado quando se utiliza o Vibrio fischeri (Umbuzeiro e

Rodrigues, 2004).

Os resultados dos testes de toxicidade podem ser expressos de modo

qualitativo (tóxico e não tóxico) ou quantitativo. Quanto menor a concentração de

uma substância capaz de causar efeito, maior sua toxicidade. Os resultados são



expressos em concentração letal 50 (CL50) ou concentração efetiva 50 (CE50) . A

CL50 é a concentração de uma substância que causa mortalidade de 50% dos

organismos expostos. A CE50 é a concentração capaz de imobilizar 50% dos

organismos ou causar inibição de 50% da produção de luz do Vibrio fischeri. Tanto a

CL50 como CE50 são usualmente expressas em mg.L-1 ou em % de amostra.

No Estado de São Paulo, é padronizado pela Norma Técnica CETESB L5227,

elaborada em 1987 e revisada em 2001. A CETESB foi pioneira na implantação

desse ensaio no Brasil e, atualmente, esse ensaio está credenciado junto ao

INMETRO de acordo com a norma NBR/ISO/17025 (Umbuzeiro e Rodrigues , 2004) .

o teste com a bactéria Vibrio fischeri é capaz de detectar toxicidade em

diferentes amostras ambientais , sendo uma alternativa especialmente importante no

monitoramento da qualidade de efluentes industriais, domésticos, corpos d'água

entre outros. O ensaio também é uma importante ferramenta quando se tem um

grande número de amostras e a necessidade de respostas em curto espaço de

tempo.

Os mecanismos bioquímicos pelos quais compostos tóxicos exercem o efeito

de redução da bioluminescência sobre a bactéria , são apenas parcialmente

compreendidos. Sabe-se que, a enzima luciferase catalisa a reação de óxido-

redução da riboflavina fosfato , que é o mecanismo responsável pela emissão de luz.

Este processo está relacionado com o metabolismo microbiano e, portanto, está

diretamente ligado ao efeito tóxico de uma substância sobre a bactéria. Isenberg

(1993), descreve que a concentração efetiva média (CE50) para uma variedade de

gases anestésicos são muito semelhantes para bactérias, ratos, cães , gatos, e

humanos, sendo desta forma possível avaliar a toxicidade de uma substância com



os testes de toxicidade in vitro , entretanto é de grande importante a comparação dos

resultados com outras espécies (Isenberg, 1993; Kaiser, 1998).

2.7. Técnicas analíticas e preparo de amostras

Devido ao grande número de princípios ativos utilizados na agricultura, as

análises exigem métodos eficientes, capazes de detectar limites máximos de

resíduos estabelecidos pela legislação (LMR) e concentrações consideradas de

alerta para a saúde humana (Lourencetti et ai, 2005).

2.7.1. Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa (CG) é aplicável para separação e análise de

misturas cujos constituintes tenham pontos de ebulição de até 300°C e que sejam

termicamente estáveis (Dawling, 2003; Collins et ai, 2006).

Quando se trata de compostos termicamente sensíveis, como os carbamatos,

é necessário que se avalie algumas parâmetros como concentração, temperatura do

injetor e comprimento da agulha de injeção, no intuito de otimizar a análise

permitindo a detecção destes compostos (Martínez et ai , 2005).

o sistema de cromatografia gasosa baseia sua separação na diferença da

distribuição de substâncias contidas em uma amostra entre uma fase estacionária e

uma fase móvel. A fase móvel é sempre um gás inerte que arrasta a amostra pela

coluna. Através de um sistema de injeção que pode ser manual ou automatizado, a

amostra é introduzida na coluna contendo a fase estacionária. O uso da temperatura



no local de injeção possibilita a vaporização das substãncias contidas na amostra e

de acordo com suas propriedades e as da fase estacionária, são mais ou menos

retidas e chegam em tempos diferentes na saída da coluna. O uso de um detector

na saída da coluna permite a detecção e quantificação das substâncias de interesse

(Collins et ai, 2006).

Diferentes tipos de detectores podem ser utilizados em cromatografia gasosa,

os principais são: detector por condutividade térmica, detector por ionização em

chama, captura de elétrons, detector de nitrogênio fósforo e por espectrometria de

massas. O acoplamento da cromatografia gasosa com o espectrômetro de massas

traz uma contribuição significativa para melhorar a eficiência na análise de misturas

complexas. Desta forma é possível detectar substâncias que coeluem e também

obter a identificação de substâncias desconhecidas (Aquino-Neto e Nunes, 2003;

Collins et ai, 2006).

2.7.2. Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês, high-performance

liquid chromatography) é uma importante técnica analítica, uma vez que permite a

separação de misturas que contêm um grande número de compostos orgânicos. Seu

emprego é indispensável em vários laboratórios, de diferentes áreas de atuação. Os

principais detectores utilizados nesta técnica são: ultravioleta, arranjo de diodos,

detectores eletroquímicos e por fluorescência, bem como o acoplamento com o

espectrômetro de massas. Com essa variedade de detectores, com diferentes níveis

de sensibilidade e seletividade, .tornou-se possível a detecção de uma faixa mais

ampla de compostos e a determinação de substâncias em baixas concentrações



presentes em matrizes complexas como sangue, alimentos e matrizes ambientais

(Collins et ai, 2006).

Na análise de praguicidas, a cromatografia líquida é bastante utilizada,

principalmente em métodos de triagem ou screening onde em uma mesma corrida

cromatográfica a separação é feita para vários compostos de interesse (Mourkidou e

Patsias, 1996).

Compostos não-voláteis, polares ou termolábeis, difíceis de serem

determinados por cromatografia gasosa, podem ser determinados por HPLC

ajustando-se parâmetros como tipo de fase estacionária (coluna cromatográfica) e

composição da fase móvel (Kupiec et ai, 2003).

Um sistema de cromatografia líquida é composto basicamente por bomba de

alta pressão (que pode trabalhar até 10.000 psi), sistema de injeção por válvulas,

coluna de separação e de detecção.

A cromatografia líquida pode ser dividida, de acordo com os modos de

separação (interação analito-fase móvel-fase estacionária), em cinco grupos:

- Fase normal: também conhecida como cromatografia líquida de adsorção. Neste

modo, a FE (fase estacionária) é um sólido, geralmente sílica ou alumina, que irá

reter os solutos por adsorção. A FM (fase móvel) geralmente é um solvente orgânico

apoiar (como hexano, clorofórmio, diclorometano). Pode-se afirmar que as

separações cromatográficas nasceram neste formato, mas atualmente este modo

está em desuso, sendo utilizada quase que exclusivamente para caracterização de

extratos de plantas.



- Fase reversa: a fase estacionária neste caso é composta por partículas de material

adsorvente (geralmente sílica) que são quimicamente ligadas a radicais orgânicos

variados sendo as mais comum cadeias com oito (octilsilano ou C-8) ou dezoito

(octadecilsilano, C-18) átomos de carbono. Nestas situações, a FE apresenta

características apoiares e a FM é composta por misturas de água ultra pura (ou

soluções tampão aquosas) e solventes orgânicos polares como metanol , acetonitrila

ou tetraidrofurano. Este é o modo de separação mais utilizado atualmente.

- Troca iônica: neste caso , a FE deve possuir carga iônica oposta à apresentada

pela substância que se quer determinar. A FM geralmente é composto por soluções

tampão que devem ter o pH e a força iônica ajustadas cuidadosamente.

- Cromatografia por exclusão de tamanho: a FE agora é composta por polímeros que

possuem poros de diâmetro muito bem definidos. Quanto maior o tamanho da

substância, menos ela entrará nos poros da coluna, e mais rápida será a eluição. O

inverso ocorre para substância de pequeno tamanho. É um modo de separação de

grande aplicação em biotecnologia, principalmente para isolamento ou determinação

quantitativa de peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos.

- Cromatografia quiral: utiliza colunas preenchidas por compostos capazes de

separar enântiomeros (compostos quirais) , como ciclodextrinas , éteres coroa ou

antibióticos macrolídeos. É utilizada sempre que for necessária a avaliação da

pureza ótica de uma substância. As colunas cromatográficas utilizadas para

separações quirais possuem custo elevado e vida útil. São muito utilizadas, por

exemplo, na indústria farmacêutica , pois em alguns casos um das formas quirais

possui atividade biológica e a outra é inativa , ou ainda podem ter ação antagônica.



Dentre os sistemas de detecção utilizados em HPLC, merecem destaque por

suas aplicações:

- Detecção por ultravioleta (UV): este tipo de detector pode ser utilizado para

detectar substâncias que absorvam a luz UV-VIS, é o tipo de detector mais comum,

pois apresenta boa sensibilidade e ampla faixa linear.

- Detecção por arranjo de diodos (DAD): comparado a detectores UV tradicionais, o

DAD é construído com sistema ótico invertido, pois toda a luz proveniente da fonte

luminosa incide sobre a cela de detecção (onde estará a amostra) e

subseqüentemente é decomposta por um prisma ou policromador, incidindo

finalmente em uma rede de fotodiodos , um chip contendo grande número de

estruturas eletrônicas sensíveis a luz dispostas lado a lado, cada um captando a luz

proveniente de um comprimento de onda distinto. Esta estrutura permite a aquisição

do espectro de UV-VIS on-line de cada pico eluído da coluna cromatográfica.

Utilizando este detector, não é necessário conhecimento prévio sobre as

características absortivas (como o comprimento de onda de máxima absorção) das

substâncias presentes na amostra , uma vez que é possível gerar cromatogramas no

comprimento de onda mais adequado (onde se tenha menor número de

interferentes, por exemplo) após a aquisição dos dados.

- Detecção por fluorescência : é o detector mais sensível disponível comercialmente

para HPLC na análise de compostos orgânicos, podendo ser até 1000 vezes mais

sensível que o detector por UV; sendo muito útil para análise de substâncias

fluorescentes ou que se tornem fluorescentes após reações de derivatização. Neste

sistema, um comprimento de onda escolhido incide sobre a cela de detecção, onde

estará a substância após ser eluída da coluna. A substância então é excitada e



emite luz em comprimentos de onda maiores que o utilizado para excitação. Esta luz

emitida é então captada pelo fotodetector, que está em ângulo reto com a fonte de

luz de excitação para evitar aumento no ruído do aparelho. Além de ser o mais

sensível, este detector é também um dos mais seletivos pois só são detectadas

aquelas substâncias que forem excitadas e que emitirem luz nos comprimentos de

onda selecionados.

A cromatografia líquida por ser uma técnica analítica não destrutiva (exceto

quanto acoplada a espectrometria de massas), permite que vários sistemas de

detecção sejam acoplados em linha, proporcionando um maior número de

informações qualitativas sobre a amostra analisada (Kupiec et ai, 2003).

o método padrão para determinação de aldicarbe e outros praguicidas

carbamatos, preconizado pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos

(Environmental Protection Agency, EPA) , baseia-se na cromatografia líquida com

detecção por fluorescência através de derivação pós-coluna (Morrica et ai, 2005) . As

substâncias são separadas na coluna cromatográfica e quando eluídas são

hidrolisadas em meio alcalino, e a amina primária resultante da hidrólise reage com

orto-ftalaldeído (o-C6H4(CHOh - OPA) resultando em compostos fluorescentes

podendo então ser detectados (US EPA, 1989).

2.7.3. Eletroforese capilar

Os anos 80 foram marcados pelo aparecimento da terceira grande técnica

instrumental de separação, a eletroforese capilar. O rápido avanço da eletroforese

capilar deve-se principalmente à variedade dos modos de separação que podem ser



efetuados em uma única coluna capilar e da diversidade dos compostos que podem

ser determinados em cada um destes modos. Também se destaca pelo baixo

consumo de reagentes e solventes e rapidez da análise.

Na eletroforese capilar a separação é conduzida em tubos com dimensões de

15 a 100 IJm de diâmetro interno, e 50 a 100 cm de comprimento, preenchidos com

um eletrólito condutor e submetidos à ação de um campo elétrico. O uso do capilar

possibilita a dissipação eficiente do calor, gerado pela passagem da corrente

elétrica, fenômeno conhecido como efeito Joule (Tavares, 1996). Além disso, a alta

resistência elétrica do capilar permite a aplicação de campos elétricos elevados, o

que promove a diminuição do tempo de análise. Uma fonte de alta tensão é usada

para estabelecer um campo elétrico ao longo do capilar. Estas fontes podem operar

à tensão constante ou corrente constante, com valores que variam de 0-30 kV e de

0-300 !-lA respectivamente.

Em eletroforese capilar, as amostras podem ser introduzidas no capilar por

métodos hidrodinâmicos ou eletrocinéticos. Na injeção hidrodinâmica, uma alíquota

representativa da composição do soluto na amostra é introduzida no capilar. Na

prática, é aplicada uma pressão determinada, por um breve período no recipiente da

amostra , havendo uma transferência de volume para o interior do capilar. Em

seguida, os recipientes do eletrólito são inseridos nas duas extremidades do capilar,

uma tensão é então aplicada e a separação iniciada. A injeção eletrocinética é

realizada pela aplicação de um determinado potencial no recipiente da amostra por

um dado período de tempo. Analitos iônicos são injetados como resultado da

combinação entre as velocidades eletroforética e eletrosmótica, enquanto analitos

neutros são injetados somente devido ao fluxo eletrosmótico. Um problema inerente



à Injeção eletrocinética, é que a quantidade injetada de um determinado soluto ,

depende da condutividade da amostra. Desse modo, quando soluções de padrão

apresentam diferenças de condutividade em relação à amostra , ou as amostras

diferem entre si , a quantidade de analito injetada será diferente. Geralmente,

quando curvas de calibração são construídas para analitos em baixas

concentrações, a concentração do mesmo influenciará na condutividade , com isso,

não é possível atingir uma boa correlação entre a área do pico do soluto e a

concentração do mesmo. Uma maneira de se contornar o problema é adicionar

tanto à amostra quanto ao padrão, uma elevada concentração de um eletrólito

condutor, de modo a minimizar diferenças de condutividade entre a amostra e o

padrão. O eletrólito adicionado preferencialmente não deve ser detectado.

Outras vantagens da eletroforese capilar são: pequenas quantidades de

amostra , completa automação da análise e compatibilidade com vários sistemas de

detecção disponíveis para cromatografia líquida. Tais detectores podem ser: de

absorção no UV-vis, fluorescência , fluorescência induzida por laser, espectrometria

de massas, condutividade, amperometria , radioatividade , índice de refração ,

dicroísmo circular e Raman (Tavares, 1996). Cabe ao analista escolher o tipo de

detector a ser utilizado de acordo com as propriedades do soluto em análise e da

faixa de concentração contemplada. O acoplamento da eletroforese capilar ao

espectrômetro de massas, pode levar a um aumento da sensibilidade e seletividade

da técnica de eletroforese e ainda minimizar possíveis interferências da matriz

(Molina et ai , 2001)

Um aspecto bastante importante da eletroforese capilar é a simplicidade da

instrumentação. Na Figura 5 um equipamento de eletroforese capilar é representado

esquematicamente, o qual consiste de uma fonte de alta tensão , capilares



(normalmente de sílica fundida), eletrodos (geralmente de platina), um detector

apropriado e um computador para o tratamento dos dados.

Vários modos de separação, com mecanismos singulares e seletividade

característica são possíveis em eletroforese capilar, os principais são: eletroforese

capilar em zona ou em solução livre (free solution capillary electrophoresis, FSCE ou

capillary zone electrophoresis, CZE), cromatografia eletrocinética micelar

(electrokinetic chromatograhphy, MEKC), eletroforese capilar em gel (capillary

electrochromatography, CEC), isotacoforese (capillary isotachophoresis, CITP) e

focalização isoelétrica (capillary isoeletric focusing, CIEF) (Tavares, 1996; Silva et

al.,2007) .

Computador

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Eletroferograma

Recipiente de eletrólito Recipiente de eletrólito

Figura 5 - Representação esquemática de um equipamento de eletroforese capilar.

A análise de compostos neutros (como os carbamatos) por eletroforese

capilar deve ser realizada em meio micelar (cromatografia eletrocinética micelar,



MEKC), onde a separação dos analitos se dá por diferença de interação com as

micelas, que são arrastadas pelo fluxo eletrosmótico (Tavares, 1996).

As principais variáveis a serem alteradas em MEKC normalmente são a

adição de diferentes tipos de solventes, e em diferentes faixas de concentração, a

variação do pH do eletrólito, a concentração de eletrólito, a adição de diferentes

tipos de tensoativos entre outras (Tavares, 1997).

A CE apresenta-se como técnica analítica complementar à cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) e à cromatografia gasosa (GC). A Tabela 2

apresenta uma comparação racional entre estas três técnicas de separação. Deve-

se ressaltar que a CE pode oferecer vantagens significativas sobre as técnicas

cromatográficas: requer pequeno volume de amostra (apenas alguns )lL) , pode

utilizar detecção por absorção da luz ultravioleta em comprimentos menores do que

200 nm, sem que haja aumento de ruído ou dríft de linha de base (problema comum

em HPLC), além de permitir a determinação de uma vasta gama de compostos

desde íons até macromoléculas utilizando a mesma coluna capilar. Os instrumentos

de CE e HPLC convencionais (utilizando detectores ópticos) possuem custo

equivalente, mas o custo operacional é significativamente menor na CE,

principalmente pelo baixo consumo de solventes e com o baixo custo das colunas

capilares (Perrett, 2003; Picó et ai , 2003; Anastos et ai , 2005).

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2.7.4. Espectrometria de massas

A massa atômica ou molecular é uma das informações mais características de

um átomo ou molécula. Estas massas são infinitamente pequenas, impossíveis de

serem medidas mesmo com as micro-balanças mais sofisticadas. Contudo, estas

massas podem ser determinadas indiretamente, utilizando-se a espectrometria de

massas (MS, do inglês, mass spectrometry).

A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica poderosa muito

utilizada na identificação de compostos desconhecidos, quantificação de materiais

conhecidos e elucidação de propriedades químicas e estruturais de moléculas.

Basicamente um espectrômetro de massas é dividido em uma fonte de íons, um

analisador da relação carga/massa deste íon e um detector (Cole, 1997). Um

espectro de massas é um gráfico onde no eixo das abscissas é mostrada a relação

massa-carga (m/z) dos íons formados e no eixo das ordenadas é mostrada a

abundância (intensidade) de cada fragmento.

A espectrometria de massas apresenta a mesma desvantagem das demais

técnicas espectroscópicas citadas anteriormente, não pode ser aplicada diretamente

na análise de misturas de substâncias, pois o espectro obtido será a soma dos

espectros das diversas substâncias presentes na amostra. Este problema pode ser

resolvido utilizando-se a MS acoplada a técnicas de separação. (Kirkbride, 2000;

Watson, 2003).

A MS é baseada na geração de moléculas dotadas de carga ou fragmentos

moleculares em um sistema submetido a alto vácuo. Inicialmente as moléculas

analisadas são levadas a um estado excitado ionizado. O modo clássico como isso

pode ser feito é através do bombardeamento da molécula por um feixe de elétrons

Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental - desenvolvimento e


(ionização por impacto de elétrons). Como o feixe de elétrons possui energia

potencial (geralmente 70 eV) muito maior que as energias de ligação existentes

entre os átomos que compõem a molécula , esta se rompe, originando fragmentos

característicos. O processo de fragmentação não é randômico , ocorrem

principalmente onde as ligações químicas forem mais fracas, ou em locais onde os

fragmentos formados sejam mais estáveis (Cody e Foltz, 1995).

O perfil de fragmentação de uma molécula, ou seja , seu espectro de massas

é reprodutível se a energia utilizada na ionização for constante. Isso possibilitou o

desenvolvimento de bibliotecas de espectros de massas, que representam uma das

ferramentas de investigação mais importantes. Espectros de massas obtidos durante

a análise de amostras de conteúdo desconhecido podem ser confrontados contra

centenas de milhares de espectros de massas referência de modo automático (via

software) , permitindo identificação rápida e precisa dos componentes da amostra

(Codye Foltz, 1995).

Com o objetivo de se adquirir resultados sensíveis e seletivos a

espectrometria de massas pode ser utilizada em combinação com técnicas

cromatográficas (GC e HPLC) e eletroforese capilar (CE). Os maiores avanços

tecnológicos obtidos atualmente em espectrometria de massas estão relacionados

ao desenvolvimento de novas técnicas de ionização e no acoplamento desta técnica

às técnicas cromatográficas, em especial à cromatografia líquida e à eletroforese

capilar. O acoplamento entre a cromatografia gasosa e a MS é relativamente

simples , pois as moléculas a serem analisadas já deixam o cromatógrafo em fase

gasosa, não sendo necessário "separá-Ias" da fase móvel (Cole, 1997).


No caso de técnicas que operam em meio líquido como a cromatografia

líquida e a eletroforese capilar, é necessária a utilização de uma fonte de ionização

que possa transmitir moléculas da fase líquida para a fase gasosa e ao mesmo

tempo transferir carga a estas moléculas. A técnica de ionização por electrospray

(ESI) é a mais utilizada (Watson, 2003). Basicamente três características fazem com

que o electrospray seja considerado uma técnica distinta das outras técnicas de

ionização (Grossman e Colburn, 1992a):

i) capacidade para produzir íons multiplamente carregados, com número de cargas

elevado, reduzindo assim, a razão massa/carga (m/z), de tal modo que seja possível

analisar compostos de elevada massa molecular;

ii) as amostras a serem analisadas devem ser introduzidas em solução, o que

permite o acoplamento com diversas técnicas de separação;

iii) o fato de ser o electrospray uma técnica de ionização suave que permite que as

interações não covalentes entre moléculas que existem em solução sejam

preservadas na fase gasosa.

A produção de íons em electrospray requer essencialmente dois passos,

dispersão de gotas altamente carregadas quase à pressão atmosférica seguida de

condições que permitam a evaporação da gota. A ionização por electrospray não é

um método de ionização propriamente dita, mas um método de transferência de um

íon da fase líquida para a fase gasosa, e a ionização de moléculas neutras em fase

líquida é um processo secundário.

A técnica de ionização por electrospray é assim chamada devido à formação

de um spray eletrostático, este processo ocorre devido à passagem de uma solução



contendo íons por um capilar onde uma alta tensão é aplicada (1000 a 5000 V); com

isso a solução é nebulizada eletrostaticamente com formação de pequenas gotas

altamente carregadas. A nebulização da solução é em alguns casos facilitada pela

ajuda de um gás nebulizador (normalmente nitrogênio). Posteriormente as moléculas

são direcionadas a uma região de alto vácuo onde ocorre a separação dos íons e

conseqüentemente a sua detecção em um analisador de massas.

2.7.5. Preparo de amostras - extração em fase sólida

As análises de substâncias presentes em diferentes matrizes são realizadas

pela utilização de técnicas cromatográficas que requerem etapas de pré-tratamento

da amostra, cujo objetivo é separar os analitos de interesse de demais compostos

presentes na amostra e que possam ser incompatíveis com a coluna cromatográfica,

ou interferentes diretos da análise. Outro objetivo claro do preparo de amostras é

servir como etapa de pré-concentração das substâncias que possam estar presentes

em concentrações tão baixas quanto nanogramas ou picogramas (Queiroz et ai,

2001; Aquino-Neto e Nunes, 2003).

A introdução da extração em fase sólida (EFS) foi uma grande inovação

dentre os processos a extração e/ou pré-concentração. O uso de colunas de

extração como processo alternativo à tradicional extração líquido-líquido aparece

com grande freqüência em publicações científicas destinadas às análises de

praguicidas (Herrera et ai, 2002; Román et ai, 2004; Neto e Siqueira, 2005; Alwis et

ai, 2006; Menezez-Filho et ai, 2006; Sundberg et ai, 2006).

As vantagens da EFS residem na grande seletividade que pode ser obtida



através da escolha da fase extratora adequada, o menor consumo de solventes

orgânicos (quando comparado à extração líquido-líquido), não formação de

emulsões (que diminuem o rendimento da extração líquido-líquido) e a possibilidade

de automação principalmente através do acoplamento à cromatografia liquida de alta

eficiência (Aquino-Neto e Nunes, 2003; Lanças, 2004) .

o procedimento de extração por EFS pode ser resumido em quatro etapas:

1 - Condicionamento ou ativação da fase extratora, pela passagem de solvente

orgânico polar (frequentemente utiliza-se metanol) , seguido por água ou solução

tampão. Esta etapa é necessária para permitir que os sítios extratores responsáveis

pela ligação com os analitos estejam disponíveis.

2 - Aplicação da amostra , que deve passar através da fase sólida numa velocidade

adequada que permita o contato entre os analitos e a fase extratora. A amostra pode

ainda ser tamponada em um pH que favoreça a interação entre os analitos e a fase

extratora. A adição de padrão interno à amostra deve ser feita antes desta ser

aplicada na coluna.

3 - Lavagem da coluna com solventes para remoção de interferentes. Uma vez

aplicada a amostra, ficarão retidos na fase extratora não apenas os analitos

desejados, mas também alguns interferentes, que serão eliminados nesta etapa do

processo, onde normalmente utiliza-se água ou soluções tampão, por vezes com

adição de pequena porcentagem de solvente orgânico polar (como metanol ou

acetonitrila) para lavar a coluna extratora . É fundamental que a solução utilizada na

lavagem da coluna tenha força suficiente apenas para eluir os interferentes,

mantendo os analitos retidos na fase sólida. Após a lavagem, a fase extratora deve



ser seca pela passagem de ar através da fase extratora (de 2 a 5 minutos de vácuo) ,

para que todo resíduo água ou tampão seja retirado.

4 - Eluição e coleta dos analitos, etapa que geralmente utiliza pequeno volume de

solventes orgânicos para arrastar as substâncias até então retidas na fase extratora.

o solvente utilizado na eluição depende das características da fase extratora e do

analito que está sendo extraído. Os solventes orgânicos utilizados na eluição são

então evaporados e o resíduo desta evaporação é reconstituído com pequeno

volume de solvente adequado para o método de análise empregado.

O tipo de fase sólida que será utilizada na extração depende de

características do analito a ser extraído, sendo as mais comuns:

Fase normal: empregada quando se deseja extrair compostos polares presentes em

matrizes orgânicas. Este tipo de fase pode ser de sílica gelou sílica quimicamente

ligada a radicais que contenham grupamentos funcionais ciano , diol ou amino. O

principal mecanismo de interação neste tipo de EFS é a formação de ligações de

hidrogênio entre o analito e a fase extratora . A eluição dos analitos é feita utilizando-

se soluções tampão de alta força iônica.

Fase reversa: é baseada na interação entre analitos orgânicos presentes em meio

aquoso e uma fase extratora apoiar, como por exemplo sílica quimicamente ligada a

radicais octadecil (C-18) . A interação entre o analito não ionizado (apoiares) e a fase

sólida é baseada em ligações de Van der Waals, sendo utilizados solventes

orgânicos apoiares para eluição dos analitos.

Troca iônica: é baseada na interação dipolar entre íons de cargas opostas presentes

na amostra e na fase sólida. Utiliza como fase extratora sílica quimicamente ligada a


radicais que contenham grupamentos funcionais sulfonil, carboxílico ou

trimetilamino. A eluição dos analitos normalmente é feita pela mudança do pH

(passagem de soluções tampão, que podem ser preparados em água ou metanol).

Fase extra tora mista: a fase sólida neste caso apresenta dois ou mais tipos de

materiais, combinando fase extratora apoiar (como sílica quimicamente ligada a

radicais octadecil) com uma fase de troca iônica (como sílica quimicamente ligada a

radicais sulfonil). Este aumento no tipo de interações que podem ocorrer entre os

analitos e a fase estacionária permite que substâncias de características químicas

diferentes sejam extraídas utilizando-se apenas uma coluna extratora. Por esta

versatilidade, este tipo de fase extratora tem sido muito utilizada, a eluição neste tipo

de EFS ocorrerá por mudanças do pH e uso de solventes orgânicos.

Na literatura internacional existem muitos trabalhos sobre a determinação de

aldicarbe em matrizes ambientais. A tabela 3 apresenta trabalhos de detecção de

aldicarbe em água por diversas técnicas analíticas publicados a partir de 2000.

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3. OBJETIVO

Este trabalho tem como objetivos:

./ desenvolvimento de métodos analíticos para separação e quantificação

de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona, por cromatografia

líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos,

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas e

eletroforese capilar com detecção por arranjo de diodos;

./ avaliação da toxicidade aguda do aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e

aldicarbe sulfona através do teste com a bactéria marinha

luminescente Vibrio fischeri.



4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material

4.1.1. Equipamentos

• sistema de eletroforese capilar Hewlett Packard® modelo Hp3DCE, Agilent

Technologies, composto por sistema de refrigeração do capilar por ar

forçado, detector de arranjo de diodos (DAD), controlado através do

software HP ChemStation, ver 08.03;

• cromatógrafo líquido de alta eficiência Thermo-Finnigan®, modelo Surveyor

Plus, composto por bomba quaternária, sistema de injeção automática,

forno de coluna e detector de arranjo de diodos, controlado através do

software Xcalibur™;

• espectrômetro de massas Thermo-Finnigan®, modelo LCQ Deca XP MAX,

com fonte de ionização por electrospray e analisador de massas do tipo ion

trapo

• sistema de purificação de água Milli-Q Plus, Millipore®;

• banho de ultra-som;

• luminômetro;

• pHmetro digital;

• balança analítica;

• agitador mecânico tipo "vortex";



• estufa de secagem;

• bomba a vácuo

4.1.2. Reagentes e materiais

• capilar de sílica fundida (Polymicro Technologies) , revestidos externamente

com poliimida, com 75 f.lm de diâmetro interno, 48,5 cm de comprimento

total e 40 cm até o detector;

• coluna analítica para cromatografia líquida de alta eficiência Zorbax® -

Eclipse XDS C18 (150mm x 4,6mm - 51Jm)

• coluna analítica para cromatografia líquida de alta eficiência Phenomenex®

Sinergi Max RP 80 (30mm x 2 mm - 4 IJm)

• cartucho para extração em fase sólida C18 Lichrolut® (500 mg/6 mL)

Merck;

• sistema para extração em fase sólida

• filtros Millex em polietileno com poro de 0,45 f.lm, 33 mm de diâmetro,

Millipore®;

• seringa de 5mL;

• pipetas automáticas, com diferentes capacidades volumétricas;

• vial de polipropileno, com tampa de borracha (1,0 mL), para injetor

automático do sistema de eletroforese capilar;



• vial de vidro, com tampa de rosca e septo (2,0 mL), para injetor automático

do sistema cromatográfico;

• balões volumétricos de 5, 10, 25, 50, 100 e 500 mL;

• tubo cônico de plástico com capacidade para 15 e 50 mL com tampa de

rosca;

• suporte universal, garra e argola;

• metanol J.T. Baker®, grau HPLC;

• dodecil sulfato de sódio, Merck®, grau HPLC;

• tetraborato de sódio, Merck®, grau HPLC;

• hidróxido de sódio, Merck®, grau HPLC;

• ampola de bactéria Vibrio fischeri liofilizada linhagem NRRL B-11177,

BIOLUX®Lyo

4.1.3. Soluções-Padrão

Os padrões de aldicarbe, aldicarbe sulfona e aldicarbe sulfóxido foram

gentilmente cedidos pela Bayer S/A. O padrão de metomil, utilizado como padrão

interno, foi obtido da Sigma-Aldrich (Milwaukee, EUA). Soluções estoque foram

preparadas em balão volumétrico por pesagem dos sais e diluição em metanol,

obtendo-se concentração de 1000 mg.L-1.



Para análise por cromatografia líquida, foram preparadas soluções de

trabalho de aldicarbe, sulfóxido e sulfona, a partir de diluições das soluções-estoque,

obtendo-se concentrações finais de 5; 10; 25; 50; 100; e 500 jJg.L-1 (para realização

dos adicionados).

Para análise por eletroforese capilar, foram preparadas soluções de trabalho

de aldicarbe, sulfóxido e sulfona, a partir de diluições das soluções-estoque,

obtendo-se concentrações finais de 50; 75; 100; 125; 150 e 200 mg.L-1 (para

realização dos adicionados).

Todas as soluções preparadas (estoque e trabalho) foram armazenadas em

frasco de vidro com tampa e lacre de alumínio e mantidas em freezer (-20° C).

4.1.4. Amostras de Referência Negativa

As amostras de água de torneira utilizadas foram coletadas no próprio

laboratório em béquer de vidro no momento da análise. As amostras de água de rio

e represa utilizadas foram coletadas de acordo com os procedimentos padrões da

CETESB armazenadas em frascos de vidro com tampa, identificados com data e

local da coleta e mantidas sob refrigeração até o momento da análise. Para melhor

organização do texto, os diferentes tipos de amostras foram identificadas por letras

como indica a Tabela 3.


Tabela 6. Diferentes tipos de amostras de água utilizadas no desenvolvimento do

trabalho e seus respectivos pHs.

Procedência pH

Água de Torneira 6.0

Água de Rio 6.5

Água de Represa 6 .7

Água Ultrapura 6.0

4.2 Métodos

4.2.1. Determinação de aldicarbe e aldicarbe sulfona por HPLC-DAD



Extração

./ BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

As amostras de água, fortificadas e branco, foram submetidas ao processo de

extração em fase sólida descrito abaixo:

./ Condicionamento da coluna extratora C18 Lichrolut® com 1 mL de

metanol e em seguida 1 mL de água ultrapura

./ Passagem de 10 mL da amostra através da coluna extratora, com fluxo

de 1 mL min-1

./ Lavagem com 5 mL de água ultrapura

./ Secagem da coluna por 5 minutos, sob vácuo

./ Eluição com 1 mL de metanol, com fluxo de 1 mL min-1

./ Evaporação do solvente sob fluxo de nitrogênio

./ Ressuspensão do extrato com 1 mL da mistura água/metanol na

proporção 85% e 15%, respectivamente .

./ Ultrasom por 5 minutos


Condição cromatográfica

Coluna cromatográfica: Zorbax® - Eclipse XDB C18 (150mm x 4,6mm - 51Jm)

Fase móvel: Água ultrapura : Metanol

Gradiente: Tempo (min) % Água % Metanol

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Volume de injeção: 20 IJL

Temperatura do forno: 30°C

Detecção DAD: 204nm e 252nm



4.2.2. Determinação de aldicarbe por CE-DAD

Soluções padrão de aldicarbe foram utilizadas nas concentrações de 10, 25,

50, 75 e 100 mg.L-1, adicionadas em água. O padrão interno utilizado foi tiofanato

metílico na concentração 50 mg.L-1.

Condicão eletroforética

Capilar de sílica fundida com 75 I-lm de diâmetro interno, 48,5 cm de comprimento

total e 40 cm até o detector. O capilar era condicionado diariamente antes do início

dos trabalhos com passagem de hidróxido de sódio 1 moI,L-1, água ultrapura e

eletrólito de corrida (5 minutos cada).

Eletrólito: solução aquosa de tetraborato de sódio 10 mmol L-1 e dodecil sulfato de

sódio 50 mmol L-1.

Voltagem: 25 kV

Injeção: hidrodinâmica 50 mbar por 5 segundos

Temperatura do capilar: 20°C

Detecção DAD: 252 nm

4.2.3. Determinação de aldicarbe e aldicarbe sultana por LC-MS



Condição cromatográfica

Coluna cromatográfica: Phenomenex Sinergi Max RP 80 (30 x 2 mm - 4 IJm)

Fase móvel: Formiato de amônio em água ultrapura 10 mmol L-1 Formiato de

amônio em metanol 10 mmol L-1

Gradiente:

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Volume de injeção: 20 IJL

Temperatura do forno: 40°C



Condições do espectrômetro de massas:

Tensão do spray: 4,5 kV

Temperatura do capilar de transferência: 350°C

Fluxo de gás nebulizador (N2): 35 unidades arbitrárias

Modo de análise: tull scan de 150 a 300 amuo

4.2.4. Teste de toxicidade com bactéria luminescente Vibrio fischeri

o teste de toxicidade aguda foi realizado com a bactéria Vibrio tischeri

disponível comercialmente. A ampola contendo a biomassa liofilizada foi retirada do

freezer (onde é conservada até o momento do teste) e deixada em temperatura

ambiente por 15 minutos, onde em seguida adicionou-se 1 mL da solução tampão

de reativação e a ampola foi homogeneizada. A concentração de bactérias por

ampola é de 108 e a solução reconstituída é estável por 4h em geladeira. Soluções

de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona foram preparadas em água

ultrapura e de represa (para verificar efeito matriz). A concentração inicial de

aldicarbe foi de 200 mg.L-1 e de aldicarbe sulfóxido e sulfona 100 mg.L-1. Foram

realizadas 5 diluições a partir da concentração inicial. Um controle negativo (água,

solução salina e solução teste) e um "branco" foram adicionados em todas as

análises. A leitura foi realizada em luminômetro a 492nm em tempo O e após 15

minutos de exposição da bactéria aos analitos testados, verificou-se a inibição

causada e o cálculo de CE50 é feito através da curva dose-resposta.


4.3. Validação analítica

A validação do método foi realizada estabelecendo-se os valores de

recuperação, linearidade, seletividade, precisão intraensaio, exatidão, limite de

detecção e de quantificação (Peters e Maurer, 2002; Ribani et ai, 2004). Todos os

cálculos foram realizados através do programa Microsoft Excel® 2003 para sistema

operacional Windows® XP-Professional.

Seletividade

Este parâmetro foi avaliado através das análises de amostras de água

referência negativa (água de torneira e amostra de água coletada na região do Alto

Cotia) . Considerou-se como critério de seletividade a ausência de picos interferentes

no tempo de retenção dos analitos investigados e do padrão interno . .

Recuperação

A eficiência do procedimento de extração foi avaliada através da recuperação.

Para o estudo da recuperação do método, amostras de água referência negativa

foram enriquecidas com o padrão interno e com os analitos de interesse na

concentração de 100 J.!g.L-1 e submetidas ao método de extração descrito no item

4.2.1. Outro grupo de amostras de água referência negativa foram enriquecidas

apenas com o padrão interno, submetidos ao processo de extração, e os analitos de

interesse foram adicionados apenas no instante da ressuspensão dos extratos. A

recuperação absoluta foi avaliada pela área relativa média obtida no primeiro grupo



(resposta do analito adicionado à matriz antes da extração) em relação à área

relativa média obtida no segundo (resposta do analito adicionado à matriz após a

extração), expressos em porcentagem.

Curva analítica (Linearidade)

A curva analítica para o método proposto foi realizada através de fortificação

de água de torneira (referência negativa) coletada no dia da análise. As amostras

foram fortificadas a partir de soluções padrão de aldicarbe e aldicarbe sulfona a fim

de se obter as concentrações de 5; 10; 25; 50; 100 e 500 ).!g.L-1 para cromatografia

líquida e 10; 25; 50; 75 e 100 mg.L-1 para eletroforese capilar (n=3 para cada

concentração investigada). As amostras fortificadas foram submetidas aos

procedimentos de extração e às condições cromatográficas e eletroforéticas

especificadas acima.

A curva analítica foi obtida pela projeção das concentrações do analito no eixo

das abscissas e das relações entre a área do analito e do padrão interno (metomil)

no eixo das ordenadas, utilizando-se a regressão linear pelo método dos mínimos

quadrados para a obtenção da equação da reta.

A linearidade, definida como a capacidade do método em gerar resultados

proporcionais da espécie em estudo, foi avaliada através do coeficiente de

determinação (,-2) da curva (Ribani , et ai, 2004).

Precisão intra-ensaio



Os estudos de precisão intra-ensaio foram conduzidos indiretamente pelo

cálculo de imprecisão através da determinação do coeficiente de variação (CV) das

áreas relativas (razão entre área absoluta do analito e a área absoluta do padrão

interno). Este parâmetro avalia a proximidade entre várias medidas efetuadas em

uma mesma amostra (Peters e Maurer, 2002; Ribani et ai, 2004) . A precisão

intraensaio (repetibilidade) foi determinada através da análise, em um mesmo dia, de

seis replicatas de amostras de água adicionadas nas concentrações 10, 50 e 500

Ilg.L-1.

Exatidão

A exatidão representa o grau de concordância entre os resuitados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como

verdadeiro (Ribani et ai, 2004).

Neste estudo, a exatidão foi determinada através do cálculo das

concentrações médias (seis replicatas) obtidos de amostras de água referência

negativa fortificadas em três níveis de concentração (10, 50 e 500 Ilg.L-1) e

submetidas ao procedimento analítico proposto. Os valores de área relativa foram

convertidos em valores de concentração de analito, através das respectivas

equações de regressão linear obtidas das curvas analíticas. Considerou-se exatidão

como a porcentagem do erro sistemático, expresso pela tendenciosidade (diferença

entre o valor real e o valor obtido) (Ribani et ai, 2004).

Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)



Para determinação do LOD e LOQ, foi empregado o método empírico, que

consiste em analisar amostras de água referência negativa adicionadas de

quantidades decrescentes dos analitos em questão, sendo observada a relação

sinal/ruído produzida nas análises cromatográficas e/ou eletroforéticas. Considerou-

se como limite de detecção a concentração que forneceu relação sinal/ruído = 3 e

limite de quantificação a concentração que forneceu relação sinal/ruído = 10 (Peters

e Maurer, 2002; Ribani et ai, 2004).

4.4. Teste de toxicidade aguda

o teste de toxicidade aguda com a bactéria Vibrio fischeri foi realizado em

água deionizada coletada no momento do teste, adicionada de soluções padrão de

aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona também preparadas em água. As

amostras foram testadas em diferentes concentrações e os resultados foram

expressos em CE50 - concentração efetiva da amostra que causa 50% de inibição

da produção de luz emitida pela bactéria, medida em luminômetro. Este teste

também foi realizado utilizando água de rio, coletada em frascos adequados,

mantida sob refrigeração até o momento do teste e adicionada de soluções padrão

de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona. Todos as testes foram

realizados com um controle negativo, ou seja, sem adição de aldicarbe. Tanto a

água deionizada quanto a água de rio foram submetidas a um ajuste osmótico com

solução salina 20 g.L-1, visto que o microorganismo utilizado é proveniente de

ambiente marinho.



5. RESULTADOS

5.1. Resultados cromatografia líquida

As condições instrumentais para o método foram otimizadas de modo a se

obter completa resolução cromatográfica dos analitos investigado e do padrão

interno. A escolha da melhor coluna cromatográfica foi feita a partir de injeções de

soluções padrão de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido, aldicarbe sulfona e padrão interno

metomil. A figura 6 mostra o cromatograma obtido com as colunas Atlantis® e

Zorbax®.

180000 -

160000 -

140000 -

120000 -

100000 -

80000 -

60000 -

40000 -

20000 -

4.92 4.47

5.73

8.74

o 1 '" A 1\1, 1\ 1I

180000 -

160000 -

140000 -

120000 -

100000 -

80000 -

60000 - 4.96 4.47

5.66

8.94

Atlantis

Zorbax

40000 -

'00': ] Ih-,~JWl, , ,-"h,,~-, '- 1- '-o 2 4 6 8 10 12 14

Time (min)

Figura 6 - Cromatograma de amostra de água deionizada adicionada testando a

melhor coluna cromatográfica Zorbax® e Atlantis®.



A Figura 7 apresenta cromatograma de amostra referência negativa de água

de torneira adicionada com padrão de aldicarbe sulfona, aldicarbe sulfóxido, padrão

interno metomil e aldicarbe (nesta ordem de eluição), bem como respectivos

espectros de absorção na região do ultravioleta de cada substância, obtidos através

do detector DAD.

""'-_ ... ,.-.. ",-.'" ... ,,, .. ,,, .. , ... .. , "' , ... " ... --.

5.6,7

8.99

.96

4 .47

1000

0 1 'no /'n )U~ fi i i i i i \ i I i (, ri i i i i i i i I i' i I \ I i i i f i i i t I Iril~$'T "''' O \ i i I i ír\ i i \ \ i

2 3 4 5 6 9 7 8 Time

Figura 7 - Cromatograma de amostra referência negativa de água de torneira

adicionada com padrão de aldicarbe sulfona, aldicarbe sulfóxido, padrão interno

metomil e aldicarbe, respectivamente, indicados na seta os espectros ultravioleta de

cada substância, obtidos através do detector DAD. Condições cromatográficas, vide

item 4.2.1 .



3.02

300000

290000

280000

270000

260000

250000

240000

230000

220000

210000

200000

190000

180000

170000

160000

150000

140000

130000

120000

11 0000

100000

90000

80000

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

o ci 2

I I i \ i I i I i \ 4 5 6 7 8 9 3

Time (min)

Figura 8 - Cromatograma de amostra referência negativa de água de torneira

adicionada com padrão de aldicarbe sulfóxido, sendo observada degradação do

analito em questão (alteração no tempo de retenção e no espectro de absorção

ultravioleta - vide Figura 7 para comparações). Condições cromatográficas, vide

item 4.2 .1.



5.2. Otimização do procedimento de extração

Para a extração em fase sólida foram selecionados três tipos de cartuchos de

extração, com propriedades extratoras (retenção na fase estacionária) semelhantes.

Os cartuchos foram utilizados para extração de águas referência negativa (água de

torneira e água de represa) adicionada com soluções padrão de aldicarbe, aldicarbe

sulfona e aldicarbe sulfóxido, sendo comparadas as recuperações obtidas. Os

resultados de recuperação são apresentados na tabela a seguir:

Tabela 7 - Resultados obtidos no teste de recuperação (em %) para os analitos

investigados, utilizando diferentes cartuchos extratores, avaliados em triplicata.

Cartucho Extrator Aldicarbe Aldicarbe Sulfóxido Aldicarbe Sulfona

Água de torneira

Abs Elut 94% 85% 80%

Stracta X 96% 93% 97%

C18 93% 96% 97%

Água de represa

Abs Elut 93% 83% 75%

Stracta X 94% 90% 90%

C18 91% 90% 95%



A seletividade foi avaliada pela análise de amostras de água referência

negativa. Considerou-se o método proposto como seletivo, uma vez que não foi

detectada presença de picos interferentes no tempo de retenção dos analitos

investigados (e do padrão interno). A Figura 9 apresenta cromatograma de amostra

de água de represa referência negativa submetida ao procedimento analítico

descrito no item 4.2.1. A Figura 10 apresenta cromatograma de extrato de amostra

de água de represa referência negativa adicionada de solução padrão de aldicarbe

sulfona e aldicarbe (50 )lg.L-1).

1400

1300

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

o , o 2 3 4 5

Time

6 7 8 9

Figura 9 - Cromatograma de extrato de amostra de água de represa referência

negativa submetida ao procedimento analítico descrito no item 4.2.1 .



1400

1300

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

o ...JJIJ[ ,JL r1\ I

o 2 3 4

4.54

) I

5

Time

,..., /\ 6

7.11

IJ\.~. 7

I 8 9

Figura 10 - Cromatograma de extrato de amostra de água de represa referência

negativa adicionada de solução padrão de aldicarbe sulfona e aldicarbe (50 )lg.L-1) e

submetida ao procedimento analítico descrito no item 4.2.1.

Ainda avaliando a seletividade do método, a Figura 11 apresenta

cromatograma de amostra de água de rio referência negativa submetida ao

procedimento analítico descrito no item 4.2.1. A Figura 12 apresenta cromatograma

de extrato de amostra de água de rio referência negativa adicionada de solução

padrão de aldicarbe sulfona, aldicarbe e do padrão interno metomil (50 )lg.L-1).



8500

8000

7500

7000

6500

6000

5500

5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

o o

'--~~~~~ ~

2 3 4 5 Time

6 7 8 9

Figura 11 - Cromatograma de extrato de amostra de água de rio referência negativa

submetida ao procedimento analítico descrito no item 4 .2.1.



3800

3600 -

3400

3200 -

3000 -

2800 -

2600 -

2400 -

2200 -5.12

2000 -

1800 -

1600 -

1400 -

1200 - 7.l5 1000 -

800 - 4.57

600 -

400 -

20001 i=r ).~ ~~\~~~~~~~ ri o 2 3 4 5

Time 6 7 8 9

Figura 12 - Cromatograma de extrato de amostra de água de rio referência negativa

adicionada de solução padrão de aldicarbe sulfona , aldicarbe e do padrão interno

metomil (50 /-lg.L-1) e submetida ao procedimento analítico descrito no item 4.2.1.

As Figuras 13 e 14 apresentam as curvas analíticas obtidas durante a

validação do método para análise de aldicarbe e aldicarbe sulfona, respectivamente.

Já a Tabela 8 apresenta os resultados obtidos nos testes de precisão e exatidão do

método.


6,00

5,00

4,00 -I

3,00 -I

2,00

1,00

Curva analítica - aldicarbe

y = 0,0106x + 0,0498

R2 = O 9993 , 0,00 -f'~-----r-------r------.------;------,--------l

o 100 200 300 400 500 600

Concentração (ug.Lo11)

Figura 13 - Representação da curva analítica de aldicarbe em água nas

concentrações de 5 a 500 IJg .L-1, utilizando o método descrito no item 4.2.1.

Curva analítica - Aldicarbe Sulfona

4,50 .,_---------------------------

4,00

3,50

3,00

2,50 -

2,00

1,50

1,00

0,50

y = 0,008x + 0,0153

R2 = 0,9998 0,00 ~~~--__,_----__r----_._----_,_----.,_------j

o 100 200 300 400 500 600

Concentração (ug.L-1)

Figura 14 - Representação da curva analítica para a determinação de aldicarbe

sulfona em água nas concentrações de 5 a 500 IJg.L-1, utilizando o método descrito

no item 4.2.1.



Tabela 8 - Valores de precisão e exatidão do método descrito no item 4.2.1 (n = 6).

Concentração Aldicarbe Aldicarbe Sulfona

(Jjg.L-1) Precisão (%CV) Exatidão (%) Precisão (%CV) Exatidão (%)

10 3,4 - 34 3,9 - 19

50 2,5 7,6 0,6 1,2

500 0,8 -0,4 0,6 - 0,1

%CV = coeficiente de variação

o limite de detecção obtido para o método proposto foi de 0,5 1J9.L-1 para

aldicarbe e aldicarbe sulfona . O limite de quantificação foi de 2,0 1J9.L-1 para os dois

analitos.



5.3. Resultados - eletroforese capilar

A Figura 15 apresenta eletroferograma de amostra de água de torneira

referência negativa submetida ao procedimento analítico descrito no item 4.2.2. Já a

Figura 16 apresenta eletroferograma de amostra de água de torneira adicionada

com padrão de aldicarbe na concentração 100 mg.L-1 e padrão interno tiofanato na

concentração 50 mg.L-1, submetida ao mesmo procedimento analítico citado para a

Figura 15.

mAU

4

3

2

o

-1

-2

o 5 10 15 min

Figura 15 - Eletroferograma de amostra de água de torneira referência negativa

submetida ao procedimento analítico descrito no item 4.2.2.



mAU

40

7.55

30

20

5.92

10

o-~

o 5 10 15 min

Figura 16 - Eletroferograma de amostra de água torneira adicionada com padrão de

aldicarbe na concentração 100 mg .L-1 e padrão interno tiofanato na concentração 50

L-1 mg ..

A Figura 17 apresenta a curva analítica obtida durante a validação do método

para análise de aldicarbe por ~Ietroforese capilar. Já a Tabela 9 apresenta os

resultados obtidos nos testes de precisão e exatidão do método.



0,9000

0,8000

0,7000

0,6000

0,5000

0,4000

0,3000

0,2000

0,1000

0,0000

O 20

y = 0,0082x + 0,0006

R 2 = O 9995 ,

40 60 80 Concentração (mg.L-1

)

100 120

Figura 17 - Representação da curva analítica de aldicarbe em água nas

concentrações de 10 a 100 mg.L-1, utilizando o método descrito no item 4.2.2.

Tabela 9 - Valores de precisão e exatidão do método descrito no item 4.2.2.

Aldicarbe

Concentração (mg.L-1)

Precisão (%CV) Exatidão (%)

50 5,4 - 12,4

125 1,5 1,3

200 1,0 -2,4

o limite de detecção obtido para o método proposto foi de 3 mg.L-1 para

aldicarbe e o limite de quantificação foi de 10,0 mg.L-1.



5.4. Resultados cromatografia líquida acoplada a espectrometria de

massas

A Figura 18 apresenta cromatograma de amostra de água de torneira

adicionada com padrão de aldicarbe na concentração 1000 ug.L-1, submetida ao

procedimento analítico descrito no item 4.2.3. Já a Figura 19 apresenta

cromatograma de amostra de água de torneira adicionada com padrão de aldicarbe

na concentração 100 ug.L-1.

100

90

80

70

~

160

.5 50 « ~ 40 -\i Ir

30

20

RT: 6.24 AA: 40656478 SN: 680RMS

Aldicarbe

NL: 1.21E7

Base Peak m/z= 207.50-208.50 F: MS ICIS BG_lppm_080 619002138

10 fi ~. JL o. ~~~ ~

100

90

80

70

li .g 60 §

~ 50 ~

~ 40 Ir

30

20

AA: 24507066 5 .72E6 SN: 263 RMS Base Peak

m/r-221 .50·222.50 F: MS ICIS BG_lppm_080

Aldicarbe sulfona 619002138

10

O ~ : ~t,."·' i ,'y<?, ,#, ' i "I'" 'r~ r:'·,; i ":Y;~:"'~

~ 1

í~'i';';i"'I"':"I,L ~-t"'''''~-mr'''f''~'''~''''''''-= O 1 2 3 4

Time (min)

Figura 18 - Cromatograma obtido a partir da injeção direta de amostra de água de '

torneira referência negativa adicionada com padrões de aldicarbe e aldicarbe sulfona

na concentração 1000 ug.L-1 e analisados por LC-MS.


100

90

80

70

m

160

.5 50

'" m

~ 40

o: 30

20

10

100

90

80

70

60

50

40

30

20

Time (mio)

RT: 6.16 AA: 3924457 SN: 114RMS

Aldicarbe

AA: 3840000 SN:74RMS

I Aldicarbe sulfona

NL: lA5E6

Base Peak m/z= 207.50-208.50 F: MS ICIS 8G_l00ppb

NL: 1.20E6

Base Peak m/z= 221.50-222.50 F: MS ICIS 8G_l00ppb

Figura 19 - Cromatograma obtido a partir da injeção direta de amostra de água de

torneira referência negativa adicionada com padrões de aldicarbe e aldicarbe sulfona

na concentração 100 ug.L-1 e analisados por LC-MS.

As Figuras 20 e 21 apresentam as curvas analíticas obtidas durante a

validação do método para análise de aldicarbe e aldicarbe sulfona por LC-MS. Já a

Tabela 10 apresenta os resultados obtidos nos testes de precisão e exatidão do

método.



Unearidacle Aldicarbe

8OOOOOOO TI---------------------------------------------------------------,

7CXXXXXJO

6CXXXJOOO -

5CXXlOOOO -

4OOOCXXX) -

3CXXXXlOO -;

2CXXXXXJO

1CXXXXXJO

O I -

O 500 1000 1500

y = 35590x + 1 E+06

Ff=O,9939

2000 2500

Figura 20 - Representação da curva analítica para a determinação de aldicarbe em

água nas concentrações de 50 a 2000 I-lg .L-1, utilizando o método descrito no item

4.2.3.

Unearidacle Aldicarbe Sulfona

~'I --------------------------------------------~

4CXXXXXX)

3ElXXXXX) -

:nxxxm 2trrXXXX) -

2aXXXXXJ

1ElDXXXJ

1cxxxxxx) y = 1amx + 3E+a3

~=0,9382 ElDXXXJ

o l~·~------~------~--------~------~------~ o 5Cü 1CXXJ 15Cü 2CXX) 25CX)

Figura 21 - Representação da curva analítica para a determinação de aldicarbe

sultona em água nas concentrações de 50 a 2000 I-lg.L-1, utilizando o método

descrito no item 4.2.3.



Tabela 10 - Valores de precisão e exatidão do método descrito no item 4.2.3 (n = 6).

Concentração Aldicarbe Aldicarbe Sulfona

(~g.L-1) Precisão (%CV) Exatidão (%) Precisão (%CV) Exatidão (%)

50 4,6 - 12 2,0 - 8,7

500 4,1 8,6 4,1 3,2

1000 2,8 -4,4 3,2 - 7,1

%CV = coeficiente de variação

o limite de detecção obtido para o método proposto foi de 5 IJg .L-1 para aldicarbe

e aldicarbe sulfona. O limite de quantificação foi de 50,0 IJg.L-1 para os dois

analitos.



5.5. Teste de toxicidade aguda com Vibrio fischeri

Foram realizados dois ensaios utilizando soluções padrão preparadas em

água ultrapura e água de rio. O primeiro se deu no tempo O (TO) , e após 6 dias (T6)

à temperatura ambiente (cerca de 25°C em frascos de vidro com tampa) as soluções

foram novamente testadas e os valores de CE50 permaneceram muito próximo dos

iniciais, os resultados estão apresentados na tabela 10. A estabilidade dos

compostos foi monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência através do

método descrito no item 4.2.1. e não demonstrou transformação do aldicarbe em

aldicarbe sulfóxido e sulfona.

Tabela 11 - Resultados de CE50 obtidos no teste de toxicidade com a bactéria

luminescente Vibrio fischeri após 15 minutos de exposição, nos tempos O e após 6

dias à temperatura ambiente.

Analitos

Amostra

Aldicarbe Sulfóxido Sulfona

Água ultrapura - TO 54,7 mg.L-1 7,6 mg.L-1 44,3 mg.L-1

Água ultrapura - T6 56,0 mg.L-1 8,2 mg.L-1 48,0 mg.L-1

Água de rio - TO 55,0 mg.L-1 8,0 mg.L-1 46,0 mg.L-1

Água de rio - T6 56,0 mg.L-1 7,8 mg.L-1 47,0 mg.L-1



Observa-se que o aldicarbe sulfóxido é cerca de 7 vezes mais tóxico para o V.

fischeri que o próprio aldicarbe, e 6 vezes mais tóxico que o aldicarbe sulfona.

O segundo ensaio foi realizado variando o pH das soluções a serem testadas,

como descrito na literatura o aldicarbe é estável em meio neutro e levemente ácido,

mas pouco estável em meio alcalino. Desta forma foram preparadas soluções

padrão de aldicarbe em água ultrapura com concentração em torno de 0,25 mg.mL-1

em pH 5.8 e 8.8, em seguida essas soluções foram submetidas ao teste para

verificar a influência do pH na estabilidade do composto. O pH ácido não foi testado

porque a bactéria é sensível ao pH baixo, podendo gerar um resultado falso positivo.

Os resultados estão apresentados na tabela 11.

Tabela 12 - Resultados de CE50 para aldicarbe obtidos no teste de toxicidade

com a bactéria luminescente Vibrio fischeri em diferentes pHs nos tempos O e

após 6 dias.

pH estudado CE50

5.8 - TO 41,4 mg.L-1

5.8 - T6 45,1 mg.L-1

8.8 - TO 41,1 mg.L-1

8.8 - T6 42,6 mg.L-1



6. DISCUSSÃO

A Agência de Proteção Ambiental Americana (US EPA) estabelece como

método padrão para determinação de praguicidas carbamatos em água, a

cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência e derivação

pós coluna (US EPA, 2001) . Visto que essas substâncias não são naturalmente

fluorescentes, é necessário a etapa de derivatização para dar a elas essa

característica. A corrida cromatográfica do método referido separa doze compostos,

entre princípios ativos e seus produtos de transformação em um tempo total de 30

minutos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos analíticos alternativos ao

método padrão da US EPA, para determinação do praguicida aldicarbe e seus

produtos de transformação aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona em amostras de

água.

A otimização da condição cromatográfica para determinação de aldicarbe e

seus produtos de transformação, baseou-se em métodos já descritos na literatura

como Nogueira et ai (2003). Para esses três compostos obteve-se uma condição de

separação com 10 minutos de corrida, sem etapa de derivatização pois o detector

utilizado foi arranjo de diodos. Os detectores baseados na absortividade da luz

ultravioleta, são menos seletivos que o detector por fluorescência. Desta forma é

possível obter níveis de detecção muito baixos com o fluorescência, mas se o

composto não for naturalmente fluorescente é necessário a etapa de derivatização,

que por vezes pode ser demorada e de alto custo. As amostras de água testadas

passaram por uma etapa de extração em fase sólida onde realizou-se a pré

concentração dos analitos, tornando assim possível a detecção dos compostos na

faixa dos limites máximos permitidos pela OMS, que é de 10 IJg.L-1 de aldicarbe

(WHO,2003).



Para a escolha da melhor coluna de extração foram selecionadas colunas

disponíveis comercialmente com fase C 18, onde uma delas possui recheio de sílica

e duas possuem recheio de resina (Lichrolut® Merck, AbsElut® Varian , e StractaX®

Waters, respectivamente). A vantagem da resina sobre a sílica está no fato de que

durante o processo de extração não haverá problemas se a fase secar, se entre o

condicionamento da coluna e introdução da amostra não houver líquido na fase

nenhum dano ocorrerá prejudicando o processo de extração. As colunas com

recheio de sílica são mais sensíveis a secagem, portanto nas etapas de

condicionamento da coluna , introdução da amostra e lavagem não pode faltar

líquido, apenas após a lavagem e antes da eluição é que haverá a secagem por

vácuo. A vantagem das colunas com recheio de sílica frente as resinas está no baixo

custo . Os valores de recuperação obtidos para as colunas testadas foram parecidos,

cerca de 90%, entre a resina AbsElut® e a sílica Lichrolut®. Desta forma optou-se por

utilizar a de menor custo, pois este é um fator que pode ser determinante para a

implantação do método em uma rotina de análises.

As colunas cromatográficas testadas para obtenção da melhor resolução

possuem características similares, ambas C18 com comprimento de 150 mm, e com

modificações químicas que permitem a separação de compostos polares e apoiares.

A coluna Atlantis® tem tamanho de partícula igual a 3 !-Im, enquanto que a coluna

Zorbax® tem tamanho de partícula igual a 5 !-Im. Essa diferença poderia gerar na

Atlantis® cromatogramas com picos mais delgados o que levaria a uma maior

resolução. Entretanto isso não foi observado e a separação foi bastante similar em

ambas as colunas como demonstrado na figura 6.

Faculdaée de Ciências Farmacéuticas

Universidade de S;jo P;JI'lo Avaliação do praguicida aldicarbe e seus produtos de transformação em matriz ambiental- desenvolvimento e


No início do trabalho os padrões de aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe

sulfona foram gentilmente cedidos pela empresa Bayer. Os mesmos padrões

também foram adquiridos junto a empresa Sigma-Aldrich. Os testes de seleção de

coluna cromatográfica, definição das condições de separação, as primeiras

extrações para verificação dos níveis de recuperação e o ensaio de toxicidade com

V fischeri foram realizados com os três analitos. Entretanto observou-se que o

aldicarbe sulfóxido que no início era um sal de coloração branca, adquiriu um

aspecto amarelado e formava pequenos grumos. Soluções preparadas com este

padrão não apresentavam mais o pico referente ao sulfóxido no cromatograma, e

outro pico com tempo de retenção diferente surgiu. Ao comparar o espectro

ultravioleta deste pico com o espectro do aldicarbe sulfóxido observou-se que não

eram iguais (vide Figuras 7 e 8). Quando essa solução padrão foi injetada no

método por LC-MS, observou-se que realmente era outro composto com baixa

estabilidade, visto que quando foi injetado pela segunda vez, um novo espectro de

massas foi detectado. Quando então se concluiu que o padrão de aldicarbe sulfóxido

cedido pela Bayer havia degradado, foi aberta a ampola adquirida da empresa

Sigma-Aldrich, que estava armazenada nas condições indicadas pelo fornecedor,

em temperatura ambiente e mantido em dessecador. Contudo, o padrão

apresentava-se na forma de líquido levemente amarelado, diferente da

especificação do fabricante que dizia ser um sólido branco. Desta forma não foi

possível realizar a validação dos métodos com o aldicarbe sulfóxido, sendo

utilizados apenas o aldicarbe e aldicarbe sulfona na validação dos métodos

analíticos.

A técnica de eletroforese capilar foi otimizada buscando uma análise mais

rápida, com menor consumo de amostra e menor consumo de solventes quando



comparada a técnica de cromatografia líquida. Pelo fato de os analitos aldicarbe e

aldicarbe sulfona serem compostos neutros, o modo de separação utilizado foi o

micelar. Micelas aniônicas foram testadas em eletrólito com pH alto e modo de

injeção positiva , assim o fluxo eletrosmótico é o responsável pela migração, pois as

micelas aniônicas são atraídas para o injetor pela diferença de carga. Nesta

condição a migração dos compostos que estão sendo carreados pelas micelas é

mais lento pois somente o fluxo eletrosmótico é o responsável pela migração. O

tempo de migração obtido para o aldicarbe foi de 5,9 minutos, já o aldicarbe sulfona

chega ao detector junto com o fluxo eletrosmótico, o que indica que este composto

tem baixa afinidade com a micela. Quanto maior a afinidade do composto pela

micela mais tempo ele levará para chegar ao detector (Grossman e Colburn, 1992b).

Assim sendo a quantificação dessa substância ficou comprometida uma vez que ela

estava no fluxo eletrosmótico, região onde qualquer substância que não possui

mobilidade eletroforética sairá podendo ser um interferente.

Outra alternativa seria a utilização de uma micela catiônica em eletrólito com

pH baixo para então poder suprimir o fluxo eletrosmótico, e ocorrer a migração em

direção ao detector somente pela atração das cargas das micelas. Essa condição foi

testada mas a resposta para os analitos em questão não foi satisfatória uma vez que

o aldicarbe teve um tempo de migração maior que na condição com as micelas

aniônicas e o aldicarbe sulfona também apresentou um tempo de migração bastante

alto para o esperado em análises eletroforéticas.

A sensibilidade para o método proposto por eletroforese capilar em meio

micelar poderia ser melhorada testando uma condição de pré-concentração das

amostras online (sfacking) . Esse fenômeno de pré-concentração é baseado na

migração do composto analisado em meios de diferentes composições



(concentração, condutividade) ou por manipulação da migração de micelas dentro

do capilar (Perez et ai, 2007).

Outra possível alternativa seria o acoplamento com a espectrometria de

massas como ferramenta para quantificação dos compostos de interesse. O grande

problema da análise em meio micelar utilizando a espectrometria de massas está no

momento da ionização por electrospray, pois as micelas suprimem a volatilização.

Biensen e Bottaro, (2006) propõem um método de análise em meio micelar por

espectrometria de massas utilizando como agente surfactante o perfluoroctanoato de

amônio, um surfactante volátil, obtendo limites de quantificação entre 10 e 80 I-lg.L-1.

Na literatura a técnica analítica que mais aparece como ferramenta para

determinação de aldicarbe e seus produtos de transformação é a cromatografia

líquida de alta eficiência (de acordo com a Tabela 5). Isso ocorre devido as

características físico-químicas dos analitos. A eletroforese capilar é uma opção mais

viável para matrizes que contenham uma concentração maior das substâncias, pois

seu limite de detecção em modo micelar é bastante reduzido. O método

desenvolvido pode ser aplicado por exemplo em situações onde há mortandade de

peixes, pois nesses casos há uma alta concentração de aldicarbe e seus produtos

de transformação, não sendo possível sua aplicação para quantificação dos analitos

em níveis de traços.

No método proposto para determinação do praguicida aldicarbe por

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, obteve-se limites de

quantificação próximos aos observados no método proposto por cromatografia

líquida com detecção por arranjo de diodos. As análises foram realizadas no modo

fullscan, poderia ser testada a análise no modo de fragmentação seriada, pois desta



forma a relação sinal/ruído seria melhorada podendo talvez alcançar limites de

detecção mais baixos para o método.

o praguicida aldicarbe possui meia-vida em solo bastante variável com

estudos demonstrando valores entre 10 dias a 36 meses, de acordo com a classe de

solo, profundidade, umidade, temperatura e pH (Rigitano et ai, 2001). Estudos sobre

a lixiviação do aldicarbe e seus produtos de transformação sulfóxido e sulfona em

solo, revelaram uma alta mobilidade desses compostos, especialmente dos produtos

de transformação. Isso pode ser atribuído a baixa lipofilicidade e ao baixo coeficiente

de adsorção na matéria orgânica do solo. A quantidade de resíduos lixiviados

depende das propriedades físico-químicas do solo, mas sabe-se que em áreas de

solos rasos, arenosos, ácidos e localizados em regiões de chuvas intensas, a

aplicação do aldicarbe pode resultar na contaminação de lençóis freáticos e águas

superficiais que tenham baixos níveis de correnteza (Lourencetti, 2005) .

Fenômenos de eutrofização que são o crescimento excessivo das plantas

aquáticas a níveis tais que gerem um excessivo grau de nutrientes no corpo d'água,

principalmente nitrogênio e fósforo (Sperling, 1996), pode levar entre outras

alterações ao aumento do pH do meio. Esse ambiente propicia para o aldicarbe uma

condição instável onde rapidamente ele se transforma em aldicarbe sulfóxido e

aldicarbe sulfona. Outros compostos não carbamatos também podem ser formados.

Desta forma, considerando que seus produtos de transformação são mais tóxicos

para organismos aquáticos que o próprio aldicarbe, poderia surgir uma condição

agravante no caso de um ambiente eutrofizado e contaminado com resíduos do

praguicida.



o teste de toxicidade aguda com a bactéria Vibrio fischeri.pode ser utilizado

como parâmetro de controle de lançamento de efluentes, para cálculo de avaliação

de impacto ambiental em águas, avaliação da eficiência de estações de tratamento,

como teste complementar a avaliação das condições ambientais de rios, lagos,

águas marinhas, reservatórios, estuários e efluentes industriais. Quando realizado

em conjunto com outros testes ecotoxicológicos pode também auxiliar na

identificação de contaminantes em corpos d'água (Rodrigues e Pawlowsky, 2007).

Na literatura não há dados sobre a toxicidade dos produtos de transformação

do aldicarbe para a bactéria Vibrio fischeri. Desta forma este trabalho poderá

contribuir fornecendo esses dados. Na tabela 11 estão indicados os resultados do

teste de toxicidade aguda realizado. Pode-se observar que o aldicarbe sulfóxido é

cerca de 7 vezes mais tóxico que o próprio aldicarbe. Essa informação está coerente

com dados de toxicidade do aldicarbe e aldicarbe sulfóxido para outras espécies

como peixes e microorganismos aquáticos (Inchem, 1991). No teste com variação

de pH, observa-se que em pH alcalino a toxicidade se manteve igual no TO e no T6,

isso pode ser explicado pelo curto período entre o primeiro e segundo teste, 6 dias.

Esse período pode não ser suficiente para transformação do aldicarbe em sulfóxido

que é mais tóxico para a bactéria, e desta forma apresentaria aumento na

toxicidade.

o V. fischeri se mostrou sensível ao aldicarbe e seus produtos de transformação,

mas sua sensibilidade é muito menor que a de microcrustáceos (ex. misidáceo CL50

13 IJg.L-1) e peixes (ex. truta arco-íris CL50 780 IJg.L-1

). Apesar da facilidade de

execução e rapidez de resposta, o teste não é indicado para ser utilizado como

alerta na prevenção de mortandade de peixes eventualmente causada por

carbamatos como o aldicarbe.



7. CONCLUSÕES

./ A melhor condição de extração para aldicarbe, aldicarbe sulfóxido e

aldicarbe sulfona, foi obtida com a coluna de extração em fase sólida

Lichrolut®, com uma recuperação média de 90% para todos os analitos;

./ O método de análise com extração em fase sólida e quantificação por

cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos apresentou

sensibilidade satisfatória para análise das 3 substâncias de interesse,

com limites de quantificação inferiores ao limite máximo permitido de

aldicarbe em água de acordo com a OMS;

./ A técnica de eletroforese capilar não apresentou resultados

satisfatórios nas condições testadas para análise em níveis de traços,

mas o método desenvolvido pode ser utilizado em situações onde os

analitos estejam em concentrações na ordem de mg.L-1;

./ A técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de

massas se mostrou eficiente na quantificação dos analitos de

interesse, com um limite de quantificação muito próximo ao da

cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos;

./ O teste de toxicidade com a bactéria V. fischeri forneceu dados da

toxicidade dos produtos de transformação sulfóxido e sulfona até então

não disponíveis na literatura. A sensibilidade dessa bactéria para o

aldicarbe é menor que para outros microrganismos aquáticos, não

sendo o V.fischeri, um indicador ideal para situações de monitoramento

e prevenção de mortandade de peixes e outros organismos aquáticos.



8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Erica Rodrigues de Souza - teses.usp.br · A definição de praguicida segundo a Organização para...

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