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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO

EM MODELO ANIMAL DE COLITE INDUZIDA

POR DEXTRAN SULFATO DE SÓDIO

CARLOS ROBERTO DAMIANI

CRICIÚMA – SANTA CATARINAC

2006

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE




CARLOS ROBERTO DAMIANI

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck

Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

CRICIÚMA – SANTA CATARINA

2006

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Carlos Roberto Damiani

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck

Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

CRICIÚMA – SANTA CATARINA

2006

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À Tânia, minha amada esposa, que com extrema dedicação e infinita

compreensão, soube me incentivar e auxiliar nas horas em que os tentáculos do

desânimo pairavam sobre meus ombros.

Ao Rafael e Rodrigo, filhos queridos, que souberam entender o significado de um

projeto de pesquisa, inclusive com auxílio prático em determinadas ocasiões, e

que em momento algum cobraram minha constante ausência, embora fisicamente

presente, absorto nos estudos que me encontrava.

5

“Nenhum empreendimento lhe pareceu indigno de seu esforço. Em todos, levou

como única tocha seu ideal. Teria preferido morrer de sede a se saciar no

manancial da rotina”.

“O sábio busca a Verdade por buscá-la e se satisfaz, arrancando à natureza

segredos inúteis ou perigosos. O artista também busca a sua, porque a Beleza é

uma Verdade animada pela imaginação, mais que pela experiência. O moralista a

persegue no Bem, que é uma justa lealdade da conduta para consigo mesmo e

para com os outros. Ter um ideal é servir à sua própria Verdade. Sempre”

José Ingenieros, in O Homem Medíocre

6

Agradecimentos

Ao meu orientador, Prof. Emílio, pela sabedoria, força e beleza dedicados à

orientação deste trabalho.

Ao meu co-orientador, Prof. Felipe, pela objetividade e tranqüilidade

transmitidas durante o curso.

Ao César e Cristhopher, bolsistas do Laboratório de Bioquímica

Experimental, pela dedicação e competência desprendidas no desenvolvimento

deste projeto.

Ao Vilson, colega de curso, responsável pelo biotério, e sobretudo amigo de

infindáveis horas de estudo e trabalho madrugada a dentro.

À Silvana, coordenadora do Curso de Medicina da UNESC, que oportunizou

minha entrada no mundo acadêmico.

A todos os colegas do Curso de Mestrado em Ciências da Saúde, que com

companheirismo e afinidade faziam as horas de aulas teóricas tornarem-se

segundos de satisfação.

A todos os colegas do Laboratório, que souberam compreender minhas

eventuais ausências em virtude de motivos profissionais.

À Mônica, secretária do Mestrado em Ciências da Saúde, que com

simpatia, zelo e competência, resolvia de imediato todos os problemas à ela

dirigidos.

A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em

Ciências da Saúde.

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À Universidade do Extremo Sul Catarinense que possibilitou a realização

deste projeto de pesquisa.

A meus alunos do Curso de Graduação em Medicina, que mesmo sem

perceberem, são orientadores.

Aos meus preceptores dos idos tempos de Residência Médica, Nilo Cerato

e Valério Garcia, que semearam o germe da pesquisa no meu ser.

A meus Pais, pela oportunidade de vida, tudo mais é mera conseqüência.

À minha esposa, pelo apoio irrestrito em toda atividade que gera

enriquecimento da alma.

A meus filhos, por todas as horas de felicidade que me proporcionaram na

vida.

Ao Grande Arquiteto do Universo que tornou tudo isto possível.

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RESUMO

A colite ulcerativa é uma doença inflamatória crônica do trato

gastrointestinal. A sua etiologia ainda é pouco conhecida, mas parece resultar de

uma resposta imune e inflamatória exacerbada, com infiltração de leucócitos

fagocitários na mucosa intestinal. A produção e liberação de espécies reativas de

oxigênio pelos fagócitos desempenham um papel importante na fisiopatologia da

colite ulcerativa. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da N-acetilcisteína

e da deferoxamina no tratamento da colite induzida por dextran sulfato de sódio,

através da medida de parâmetros de estresse oxidativo, função mitocondrial e

avaliação visual micro e macroscópica tecidual em cólon de ratos. Além disso, foi

realizada a avaliação da resposta imune e inflamatória, através da contagem de

leucócitos. Os resultados demonstraram que o dextran sulfato de sódio aumentou

a contagem de leucócitos em 300% em relação ao controle, e que a N-

acetilcisteína e a deferoxamina não preveniram esse efeito. No entanto, os

animais tratados com dextran sulfato de sódio apresentaram aumento de 80% da

atividade do complexo IV da cadeia respiratória e a N-acetilcisteína e a

deferoxamina preveniram essa alteração. Além disso, a medida de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico, um marcador de lipoperoxidação, estão

aumentadas em 40% no cólon de ratos tratados com dextran sulfato de sódio. N-

acetilcisteína e deferoxamina, quando usadas em conjunto, preveniram o efeito. A

atividade do complexo II da cadeia respiratória e da succinato desidrogenase,

além do dano oxidativo a proteínas, não foram alteradas pelo dextran sulfato de

sódio. Especula-se que o uso de N-acetilcisteína e deferoxamina no tratamento da

colite possa ser importante. No entanto, mais estudos são necessários para

esclarecer esses efeitos.

Palavras-chave: Colite ulcerativa. Estresse oxidativo. Antioxidantes. Dextran

sulfato de sódio.

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ABSTRACT

Ulcerative colitis is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal

tract. Its etiology remains unclear, but it appears to result from a dysregulated

immune response, with infiltration of phagocytic leukocytes into the mucosal

interstitium. The production and release of reactive oxygen species by immune

cells seems to play a crucial role in phisiopathology of colitis. The aim of this work

was to evaluate the effects of N-acetylcysteine and deferoxamine in the treatment

of colitis induced by dextran sulfate sodium by measuring intestinal parameters of

oxidative stress and mitochondrial function, inflammatory response and bowel

histopathological alterations. The results show that dextran sulfate sodium

increased white blood cells count in 300 percent in relation to the control and that

N-acetylcysteine and deferoxamine did not prevent this effect. However, dextran

sulfate sodium increased 80 percent of the activity of mitochondrial respiratory

chain complex IV in colon of rats and N-acetylcysteine and deferoxamine

prevented this alteration. Besides, thiobarbituric acid reactive substances were

increased in 40 percent in the colon of dextran sulfate sodium -treated rats. N-

acetylcysteine and deferoxamine, when taken together, prevented this effect.

Complex II and succinate dehydrogenase were not affected by dextran sulfate

sodium, as protein carbonyl content. We speculate that N-acetylcysteine and

deferoxamine might be used for treatment of colitis, but further research is

necessary to clarify these effects.

Key words: Ulcerative colitis. Oxidative stress. Antioxidants. Dextran sulfate

sodium

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LISTA DE ABREVIATURAS

5-ASA – ácido 5-aminosalicílico

Acetil-CoA – acetil coenzima A

ADP – adenosina difosfato

ATP – adenosina trifosfato

CAT – catalase

DFX – deferoxamina

DII – doença inflamatória intestinal

DNA – ácido desoxirribonucléico

ERN – espécies reativas de nitrogênio

ERO – espécies reativas de oxigênio

FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo

GPX – glutationa peroxidase

GSH – glutationa reduzida

GTP – guanosina trifosfato

LPO – lipoperoxidação

NAC – N-acetilcisteína

NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo

NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

SDH – succinato desidrogenase

SOD – superóxido dismutase

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Cadeia respiratória mitocondrial............................................................ 22

12

SUMÁRIO

I INTRODUÇÃO................................................................................................... 13 1 - Doença Inflamatória Intestinal ..................................................................... 13 1.1 – Conceitos Fundamentais......................................................................... 13 1.2 – Epidemiologia........................................................................................... 13 1.3 - Apresentação Clínica................................................................................ 14 1.4 - Diagnóstico Diferencial ............................................................................ 16 1.5 – Fisiopatologia ........................................................................................... 16 1.6 - Tratamento Clínico.................................................................................... 20 2 - METABOLISMO E CADEIA RESPIRATÓRIA ............................................... 23 3 - RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO............................................. 28 3.1 - Radicais Livres.......................................................................................... 28 3.2 - Defesas Antioxidantes.............................................................................. 30 3.3 - Estresse Oxidativo.................................................................................... 32 3.4 - Colite e Estresse Oxidativo ...................................................................... 33 3.5 - N-acetilcisteína.......................................................................................... 35 3.6 – Deferoxamina............................................................................................ 36 4 – OBJETIVOS................................................................................................... 37 4.1 Geral .............................................................................................................. 37 4.2 Especificos ................................................................................................... 37 II RESULTADOS.................................................................................................. 38 1. Artigo: Oxidative stress and metabolism in animal model of colitis induced by dextran sulfate sodium................................................................................. 38 III DISCUSSÃO.................................................................................................... 60 5 DISCUSSÃO..................................................................................................... 60 6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 65 7 PERSPECTIVAS............................................................................................... 66 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 67

13

I – INTRODUÇÃO

1. DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL

1.1 Conceitos Fundamentais

As doenças inflamatórias intestinais (DII) compreendem um amplo

espectro de afecções causadas por inflamação crônica do trato gastrintestinal,

podendo ter ou não uma causa ou agente patogênico específico. O termo DII não-

específica refere-se àquelas que não possuem uma etiologia conhecida. Incluídas

nesta classificação estão a colite ulcerativa, que envolve exclusivamente o cólon e

reto e é caracterizada por infiltrado leucocitário na mucosa e ulceração epitelial.

Outra forma importante de DII é a doença de Crohn, que pode afetar qualquer

segmento do trato digestivo e é caracterizada por um processo inflamatório

transmural freqüentemente granulomatoso (Ahn et al.; 2001; Podolski, 1991;

Strober, 1998). Acredita-se que a primeira descrição da colite ulcerativa tenha sido

feita por Samuel Wilks em 1859 (Corman, 2005).

1.2. Epidemiologia

A colite ulcerativa afeta ambos os sexos e ocorre em todas as idades,

com um pico de ocorrência entre a segunda e quarta décadas, e um segundo pico

de ocorrência na sexta década de vida (Corman, 2005; Mazier, 1995).

14

Até o presente momento, o entendimento da epidemiologia dos

pacientes com colite ulcerativa é limitado. Pequeno é o conhecimento sobre a

distribuição e menor ainda sobre a natureza da doença. Estudos sobre a colite

ulcerativa são difíceis, provavelmente por que casos leves podem ser

negligenciados (Gordon, 1992), bem como em locais onde as diarréias infecciosas

são muito prevalentes pode ocorrer uma superestimativa da doença. Existe ainda

a dificuldade de diferenciar a colite ulcerativa da doença de Crohn, podendo

passar anos de evolução até o diagnóstico definitivo (Keighley, 1998). A incidência

das DII sofre diferenças geográficas e étnicas, sendo mais comum em brancos e

população originária do norte da Europa, e um pouco menos comum na América

do Sul, União Soviética e Japão. Assim como o câncer de cólon, indivíduos de

baixo risco para a doença, quando emigram para regiões de maior prevalência da

doença, passam a apresentar um risco aumentado de desenvolver a doença,

sugerindo o envolvimento de fatores ambientais (Corman, 2005). De uma maneira

geral, pode-se considerar uma incidência aproximada de 10 casos para 100.000

habitantes para a colite ulcerativa (Seril et al., 2003) e 3 casos para cada 100.000

habitantes para a doença de Crohn (Cotran et al., 2000).

1.3. Apresentação Clínica

A colite ulcerativa geralmente apresenta-se pela primeira vez como um

ataque agudo ou uma recaída em um paciente com uma história passada de um

episódio de diarréia sanguínea. A diarréia na colite ulcerativa usualmente associa-

se com exsudação de soro, secreção de muco e perda de sangue da mucosa

15

inflamada. Perturbações graves da homeostasia hídrica podem ocorrer na colite

aguda. As perdas diárias do cólon inflamado variam de 100 a 1500 mL de líquido,

10 a 100 mmol de sódio e 20 a 50 mmol de potássio. Além disso, a terapia

esteróide pode aumentar a perda de potássio.

A apresentação clínica da doença é composta de ataques intermitentes

de sangramento retal, diarréia, eliminação de muco, dor abdominal e perda de

peso. A doença tem gravidade e curso clínico variáveis; geralmente os ataques

começam na segunda à quarta década de vida, porém qualquer idade pode ser

afetada. Em 60 a 70% dos casos há ausência completa dos sintomas entre os

ataques, mas a doença recidiva com freqüência variável. Ocasionalmente, são

vistos pacientes assintomáticos que possuem alterações à endoscopia colorretal.

Os pacientes com DII podem apresentar anemia leve que passa despercebida

clinicamente até quadro de dispnéia decorrentes da baixa taxa de hemoglobina.

Existem eventualmente manifestações extra-intestinais, tais como:

doença hepática (icterícia, colangite, hepatomegalia, coagulopatia), artrite

(grandes articulações), lesões oculares (irite, episclerite, ceratite, blefarite, retinite,

neurite retrobulbar), manifestações cutâneas (eritema nodoso, piodermite

gangrenosa, ulceração aftóide), doença renal (pielonefrite, nefrolitíase) e

amiloidose secundária.

Não raro, os pacientes portadores de DII são levados à cirurgia de

urgência devido a complicações como perfuração intestinal, hemorragia,

megacólon tóxico ou eletivamente como alternativa à falha do tratamento clínico

ou como prevenção do câncer colorretal. Pacientes portadores de DII têm um risco

aumentado de desenvolvimento de câncer colorretal, principalmente na doença de

16

longa duração, comprometimento anatômico extenso e presença de

manifestações extra-intestinais (Itzkowitz e Yio, 2004).

1.4. Diagnóstico Diferencial

Na condução clínica das DII, além da colite ulcerativa e doença de

Crohn, outros diagnósticos diferenciais se impõem, tais como: colite isquêmica,

colite infecciosa, colite desfuncionalizante (conseqüência de ostomia prévia), colite

actínica, colite eosinofílica e colite de colágeno (Keighley, 1998).

1.5. Fisiopatologia

Dentro do processo fisiopatológico da colite ulcerativa, sabe-se que a

diarréia sanguinolenta é conseqüência da destruição tecidual resultante da

infiltração leucocitária na mucosa colônica e superprodução de mediadores pró-

inflamatórios, como citocinas e metabólitos do ácido araquidônico (Lobos et al.,

1987; Pravda, 2005; Sartor, 1991; Volwinker et al., 2004; Yavuz et al., 1999). No

entanto, o gatilho inicial neste processo permanece desconhecido. Inúmeros

fatores têm sido apontados como desencadeantes das DII, em especial a colite

ulcerativa.

Fatores microbiológicos envolvidos na gênese da colite ulcerativa,

através de estudos virais e bacteriológicos, mostraram algumas diferenças em

relação à população normal. No entanto, ainda está pouco claro se esses fatores

são causa ou conseqüência da doença. Alterações em número, atividade ou

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distribuição da microflora colônica também são vistos em pacientes portadores de

colite ulcerativa. Estudos genéticos mostraram associação entre colite ulcerativa e

antígenos do complexo maior de histocompatibilidade classe II (Pravda, 2005).

Embora a colite ulcerativa e a doença de Crohn não serem desordens genéticas

clássicas, a ocorrência de DII em membros de uma mesma família que vivem em

áreas distantes e a incidência aumentada entre judeus, além da tendência de

agregação familiar de casos com espondilite anquilosante na doença de Crohn,

sugerem um mecanismo geneticamente mediado na causa destas condições.

Vinte e nove por cento daqueles com colite ulcerativa e 35% daqueles com

doença de Crohn têm uma história familiar positiva para DII. O primeiro lócus de

suscetilibilidade para DII foi encontrado no cromossomo 16 e identificado como

IBD1 (Corman, 2005). Estudos imunológicos encontraram a presença de

anticorpos anti-células endoteliais e anti-citoplasma neutrofílico em pacientes com

colite ulcerativa.

Fatores dietéticos, especialmente leite de vaca, têm sido implicados

como uma possível causa do desenvolvimento de DII. Estudos recentes têm

mostrado um elevado nível de anticorpo anti-proteína do leite em pacientes com

colite ulcerativa. No entanto, outros estudos falharam em mostrar qualquer

relação. Outros fatores que têm sido investigados incluem aditivos químicos

alimentares, ingesta de mercúrio, quantidade inadequada de fibras e excesso de

açúcar refinado. Atualmente não existe um consenso sugerindo fatores

alimentares como desenvolvedores de um papel na etiologia tanto da colite

ulcerativa quanto da doença de Crohn (Corman, 2005).

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Curiosamente, o fumo tem um papel protetor na colite ulcerativa. Em

alguns casos, a remissão completa dos sintomas foi obtida através do uso de

goma de mascar com nicotina, e em outros casos houve exacerbação da doença

quando os pacientes cessaram o fumo. Inversamente, a doença de Crohn é mais

comum em fumantes do que naqueles que nunca fumaram. Da mesma forma

existem estudos mostrando que apendicectomia está associada inversamente

com o desenvolvimento de colite ulcerativa, sugerindo algum papel na imunidade

da mucosa (Corman, 2005; Pravda, 2005). Outros fatores, como o uso de

contraceptivos orais sugerindo uma possível base isquêmica, estão em estudo.

Fatores psicológicos envolvidos no desencadeamento ou exacerbação da colite

ulcerativa apresentam resultados conflitantes, onde alguns estudos mostram uma

alta incidência de esquizofrenia em pacientes portadores de colite ulcerativa, e

outros estudos não demonstram qualquer relação com a gênese da doença

(Corman, 2005).

Evidências recentes sugerem que o metabolismo oxidativo anormal

pode ter uma significância grande na atividade da DII. Atenção aumentada tem

sido dada ao papel dos radicais livres no metabolismo normal e defesa contra

doenças. Aparentemente, os metabólitos reativos de oxigênio são produzidos em

excesso na DII em atividade (Carrier et al., 2002; Poussios et al., 2003; Reifen et

al., 2004; Yavuz et al., 1999). Os efeitos de anti-inflamatórios antioxidantes

específicos, como os aminosalicilatos, são compatíveis com a proposição que

radicais livres têm um papel importante na patogênese das DII (Pravda, 2005;

Seril et al., 2003).

19

Considerando-se que o interior do cólon é um dos locais, ou o local

mais contaminado do planeta, é surpreendente imaginar o sistema de defesa que

deve possuir, sendo que a função de barreira colônica, separando o lúmem

intestinal de suas células estéreis, com muco formado por glicoproteínas, é o

principal meio pelo qual a mucosa colônica é preservada do ataque antigênico e,

como veremos mais adiante, está diretamente envolvida na etiopatogenia das DII

(Pravda, 2005; Seril et al.,2003).

Como comentado anteriormente, a sintomatologia clínica da colite

ulcerativa é decorrente da infiltração neutrofílica no epitélio colônico. Esta

infiltração leucocitária é devido à ruptura da barreira colônica com conseqüente

invasão bacteriana e estímulo antigênico. Ocorre liberação de mediadores

inflamatórios, como algumas citocinas e metabólitos do ácido araquidônico (Lobos

et al., 1987; Sartor, 1991; Vowinkel et al., 2004), bem como liberação de radicais

livres de oxigênio, o que poderia levar ao dano oxidativo, realimentando o ciclo

patogênico (Fiocchi, 1997; Fiocchi et al., 1994; Grisham e Yamada, 1992).

Os metabólitos do ácido araquidônico têm grande influência na função

intestinal e na reação inflamatória. O ácido araquidônico é liberado por

fosfolipases e metabolizado pela via da cicloxigenase para prostaglandinas e

tromboxanos, e também pela via da lipoxigenase, produzindo leucotrienos, que

são mediadores do processo inflamatório (Rampton e Hawkey, 1984). Pacientes

com DII em atividade apresentam uma resposta exagerada a estímulo externo

para produção de prostaglandinas (Riddell, 1985; Rubio et al., 1984).

20

1.6 – Tratamento clínico

Até os dias atuais não existe uma terapia clínica definitiva para colite

ulcerativa; os fármacos em uso visam produzir e manter estados de remissão da

doença, porém sem curá-las. Ao se instituir o tratamento clínico da doença,

levamos em consideração a severidade da doença (Corman, 2005).

Há muitos anos os fármacos mais utilizados para o tratamento da colite

ulcerativa leve e moderada são os aminosalicilatos, em especial a sulfassalazina.

Inicialmente acreditava-se que a melhora do quadro era devido ao efeito

antibiótico da mesma; hoje se sabe que existe uma atividade farmacológica

múltipla (inibição da síntese de prostaglandinas, inibição de enzimas proteolíticas

e imunossupressão); é utilizada na dose de 2 a 4 g por dia. Possui como efeitos

colaterais: “rash” cutâneo, depressão da medula óssea, náuseas, cefaléia,

hemólise em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase,

anorexia, deficiência de ácido fólico, hepatite, pancreatite, pneumonite, eosinofilia,

alveolite fibrosante, colite e anormalidades nos espermatozóides, podendo levar à

infertilidade masculina. Esses efeitos podem ser dose-dependentes ou devido à

reação idiossincrásica. A fração ativa mais importante da sulfassalazina é o ácido

5-aminosalicílico (5-ASA), sendo efetiva para tratamento e manutenção da

remissão (Corman, 2005; Dallegri et al, 1990; Miyachi et al., 1987; Pearson et al.,

1996).

Na colite ulcerativa moderada à severa, ou nos casos que não

respondem aos aminosalicilatos, empregam-se os corticosteróides, geralmente

numa dose diária inicial de 20 mg de prednisona. A budenosida é um

21

glicocorticóide que possui menos efeitos colaterais sistêmicos, porém o custo é

maior. Para terapia de manutenção não é recomendado o uso dos

corticosteróides, que podem ser utilizados também na forma de enemas para a

colite distal (colite esquerda). Os efeitos tóxicos dos corticosteróides dependem da

dose e duração do tratamento e incluem o mascaramento de abdomem agudo,

doenças metabólicas ósseas e retardo no crescimento em crianças (Corman,

2005).

Os imunomoduladores (azatioprina, mercaptopurina, ciclosporina) são

fármacos aceitos como apropriados para o manejo por longo tempo em pacientes

com DII. Seu uso racional é baseado na observação de mecanismos imunes

envolvidos na patogênese da doença. O tempo necessário para o medicamento

tornar-se efetivo é em torno de três meses, o que os contra-indicam para o

tratamento agudo. A ciclosporina é mais potente e tem início de ação mais

imediato, porém com mais efeitos colaterais (disfunção renal, neurotoxicidade e

infecções oportunistas), sendo reservada para o tratamento da doença severa,

refratária e com contra-indicações para tratamento cirúrgico (Corman, 2005).

Mais recentemente, o uso de agente anti-fator de necrose tumoral �

(TNF-�), tem demonstrado efetividade em casos de doença de Crohn em

pacientes corticóide-dependente ou pacientes intratáveis, bem como aqueles com

fístulas crônicas. O TNF-� está associado com injúria tecidual associada à

endotoxemia, estimula o crescimento de fibroblastos humanos, ativa neutrófilos e

osteoclastos, e é responsável pela indução de interleucina-1 e prostaglandina E2

(Corman, 2005; Wallace, 1992).

22

Outros agentes e medidas utilizadas na condução clínica das DII

incluem enema de sucralfato, enema de butirato, probióticos, nicotina, agentes

antidiarréicos, medidas dietéticas e psicoterapia (Corman, 2005).

23

2 – METABOLISMO E CADEIA RESPIRATÓRIA

Hans Krebs propôs, em 1937, uma série de reações do metabolismo

intermediário de carboidratos. Atualmente, o ciclo proposto por Krebs leva o seu

nome. Há aproximadamente meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que

as mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação

dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios. Alguns anos depois, Palade

e Sjöstrand, através da microscopia eletrônica, mostraram que a mitocôndria

apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961,

Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de

elétrons e a síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na

membrana mitocondrial interna. Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam

esse gradiente de prótons, que seria a força motriz para a síntese de ATP (Berg et

al., 2004).

Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como,

por exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, síntese de macromoléculas e

outras biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular.

A energia necessária para realizar essas funções é proveniente da oxidação de

substâncias na respiração celular. O ATP é o principal combustível da célula na

maioria dos processos que precisam de energia. A energia é liberada pela

hidrólise de ATP e serve para impulsionar uma série de reações (Nelson e Cox,

2000).

24

A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das

células e ocupa uma posição central no metabolismo. A glicose é transportada

para dentro das células por proteínas transportadoras específicas. Ao entrar na

célula, a glicose pode ser metabolizada em diferentes rotas metabólicas. A

principal via de degradação da glicose é a glicólise, uma rota que envolve uma

seqüência de reações que ocorre no citosol e forma como produto final o piruvato.

Uma molécula de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso,

a glicose pode participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar

NADPH, um doador de elétrons de fundamental importância em biossínteses

redutoras, e ribose-5-fosfato, precursor na biossíntese de nucleotídeos. Quando a

célula está com elevados níveis de ATP, a glicose pode ser armazenada na forma

de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado rapidamente se a célula

necessitar de energia, ou formar triacilglicerol (Berg et al., 2004; Clark et al., 1993;

Marks et al., 2005; Nelson e Cox, 2000).

Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de

glicose, pode seguir duas rotas metabólicas distintas. Quando há baixa quantidade

de oxigênio, como no trabalho muscular forçado ou na hipóxia, o piruvato pode ser

convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase, formando ATP e

consumindo NADH. No entanto, só uma pequena quantidade de energia da

glicose é liberada pela conversão de piruvato a lactato (Berg et al., 2004; Marks et

al., 2005; Nelson e Cox, 2000).

Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da

mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase, que

forma acetil coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA inicia o ciclo de Krebs. É

25

importante salientar que a acetil-CoA pode ser formada também pela oxidação de

ácidos graxos e aminoácidos (Berg et al., 2004; Clark et al., 1993; Marks et al.,

2005; Nelson e Cox, 2000).

O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial e consiste de uma

seqüência de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas

de NADH, uma de FADH2, duas de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2

produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de elétrons e são utilizados na

cadeia respiratória para a produção de ATP na fosforilação oxidativa (Marks et al.,

1996; Stryer, 1996; Nelson e Cox, 2000). Altos níveis de ATP inibem o ciclo de

Krebs por mecanismos complementares em vários locais do ciclo. Um dos pontos

de controle é a conversão de piruvato a acetil-CoA pela enzima piruvato

desidrogenase, inibida por ATP, acetil-CoA e NADH (Williamson e Cooper, 1980).

A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de

Krebs, ocorrem nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série

de complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons doados por

NADH e FADH2. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao

bombeamento de prótons da matriz para o lado citosólico da membrana

mitocondrial interna. O gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese de

ATP (Erecinska e Dagani, 1990; Heales et al., 1999; Wallace, 1999; Nelson e Cox,

2000).

A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV) e

da ATPsintase (fig.2.1). O complexo I, também chamado de NADH: ubiquinona

oxirredutase, realiza a transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona,

formando ubiquinol. Essa reação faz com que dois prótons sejam bombeados para

26

o espaço intermembrana. O complexo II, também denominado de succinato:

ubiquinona oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH) e

três subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs e

transfere elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O

complexo III, ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o

citocromo c, reação que serve para o bombeamento de mais quatro prótons. O

complexo IV, mais conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do

citocromo c para o oxigênio e forma água. Nessa etapa os últimos dois prótons

são bombeados (Berg et al., 2004; Voet e Voet, 1995; Wallace, 1999).

O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons

durante a cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força motriz para a

ATPsintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). O ATP é transportado para fora

da mitocôndria com o concomitante transporte de ADP para dentro da mitocôndria,

através de um sistema antiporte (Berg et al., 2004; Heales et al., 1999; Wallace,

1999; Nelson e Cox, 2000; Voet e Voet, 1995).

Deficiências no funcionamento normal da cadeia respiratória

mitocondrial levam à diminuição da síntese de ATP (Heales et al., 1999). Sabe-se

também que o dano causado à mitocôndria leva a uma rápida queda na produção

de energia e morte celular (Ankarcrona et al., 1995).

27

Figura 1. Cadeia respiratória mitocondrial (Adaptado de Heales et al., 1999).

28

3 RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO

3.1 Radicais livres

Em 1954, Gersham e Gilbert propuseram que alguns efeitos tóxicos do

oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. McCord e

Fridovich, em 1968, descreveram a enzima antioxidante superóxido dismutase,

uma descoberta muito importante no estudo de radicais livres. A teoria da

toxicidade do oxigênio pelo ânion superóxido, desenvolvido por Fridovich, em

1975, sugeria que a formação dessa espécie reativa de oxigênio “in vivo” seria

responsável pelos efeitos tóxicos do oxigênio (Halliwell e Gutteridge, 1984; Pryor,

1988).

Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz

de existir de forma independente e que contenha um ou mais elétrons

desemparelhados. Por isso, são muito reativos e atacam moléculas, como

lipídeos, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres, podem-se destacar dois

grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de

nitrogênio (ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido, radical

hidroxila, peróxido de hidrogênio, ânion hipoclorito e o oxigênio “singlet”. O óxido

nítrico e o peroxinitrito constituem as principais ERN (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Os radicais livres são gerados em processos de oxidação biológica. A

redução do oxigênio à água forma radicais livres, e o ânion superóxido é o

primeiro radical livre formado nesse processo. Na cadeia respiratória mitocondrial,

29

5% do oxigênio utilizado não é completamente reduzido à água, e ocorre a

formação de ânion superóxido. Essa ERO é muito reativa e é removida

rapidamente pela enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), formando

peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio forma o radical hidroxil e não

existe nenhuma enzima que o remova. Por isso, as enzimas que decompõem o

peróxido de hidrogênio, como a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPX),

são tão importantes (Halliwell e Gutteridge, 1999; Cadenas e Davies, 2000).

Os radicais livres são gerados em muitos processos fisiológicos e

exercem funções importantes no organismo. Eles participam da fagocitose,

processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de

algumas proteínas, em condições fisiológicas (Ward e Peters, 1995; Halliwell e

Gutteridge, 1999). O óxido nítrico desempenha funções importantes no sistema

nervoso central, tais como neurotransmissão, plasticidade sináptica e aprendizado

e memória. O óxido nítrico também tem função importante no controle da pressão

arterial (Heales et al., 1999).

Os radicais livres podem provocar reações em cadeia e causar dano a

um grande número de moléculas. O ataque de radicais livres a lipídios de

membrana é chamado de lipoperoxidação (LPO). Na LPO, um radical livre reage

com um lipídio insaturado (as membranas celulares são formadas principalmente

por lipídios insaturados e proteínas), provocando uma reação em cadeia (com

lipoperóxidos como produtos intermediários) e modificações das propriedades da

membrana, como permeabilidade e fluidez, além de causar dano a proteínas

transmembrana, como enzimas e receptores. A LPO tem como produto final, entre

outros, o malondialdeído, que pode ser quantificado e usado para avaliação desse

30

processo. Os radicais livres também podem atacar proteínas, principalmente nos

resíduos de cisteína. As proteínas podem sofrer alterações na sua conformação e

perda na sua função. O DNA também pode ser alvo de ataque de radicais livres

(Halliwell e Gutteridge, 1999).

3.2 Defesas antioxidantes

Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, em baixas

concentrações em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a

oxidação desse substrato. Desse modo, os antioxidantes atuam como protetores

da oxidação de biomoléculas por radicais livres e impedem a propagação da

reação em cadeia provocada pelos mesmos (Halliwell e Gutteridge, 1999; Fang et

al., 2002).

As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a SOD, CAT e

GPX. Além disso, antioxidantes não-enzimáticos, como a glutationa reduzida

(GSH), tocoferol (vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C), entre outros, auxiliam

no combate às ERO.

Os antioxidantes estão amplamente distribuídos nos organismos vivos e

constituem um sistema de defesa muito importante em condições aeróbicas

(Halliwell e Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).

A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a

produção intracelular de radicais livre, catalisando a dismutação do ânion

superóxido (Hollander et al., 2000). Está presente na matriz mitocondrial (Mn-

SOD), no citosol (CuZn-SOD) e no meio extracelular. Embora o ânion superóxido

31

não seja altamente danoso, pode extrair elétrons de diversos componentes

celulares causando reações em cadeia de radicais livres (Halliwell e Gutteridge,

1999). O produto resultante da reação catalisada pela SOD é o peróxido de

hidrogênio que deve se retirado do meio o mais rápido possível.

A CAT catalisa a degradação do peróxido de hidrogênio. Na reação,

uma das moléculas de peróxido de hidrogênio é oxidada a oxigênio molecular e a

outra é reduzida à água (Chance et al, 1979). Está localizada, principalmente, no

peroxissoma, entretanto, outras organelas como as mitocôndrias podem conter

alguma atividade da CAT. A catálise do peróxido de hidrogênio é importante pois,

na presença de Fe+2, leva à formação de radical hidroxil (reação de Fenton),

altamente reativo e danoso às biomoléculas.

A GPX é uma enzima selênio-dependente que catalisa a redução do

peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos para água e álcool, usando a

GSH como doadora de elétrons e está localizada tanto no citosol quanto na matriz

mitocondrial (Halliwell e Gutteridge, 1999).

A GSH é um dos mais abundantes agentes antioxidantes biológicos,

atua na conversão de dissulfidas para tióis e serve como um substrato para a GPX

e glutationa S-transferase. O nível intracelular de GSH é regulado pelo equilíbrio

entre sua utilização e síntese (Halliwell e Gutteridge, 1999).

O organismo contém diferentes tocoferóis, mas o mais potente é o �-

tocoferol, também conhecido como vitamina E, e é lipossolúvel. Por isso, o �-

tocoferol está presente nas membranas celulares, nas mitocôndrias e em

lipoproteínas plasmáticas. Assim, ele quebra as reações em cadeia provocadas

pelos radicais livres. Os lipoperóxidos atacam preferencialmente o �-tocoferol, em

32

vez de outro lipídio de membrana. Com a oxidação, forma-se o radical �-

tocoferoxil, que pode ser regenerado a �-tocoferol pelo ácido ascórbico ou pela

GSH (Halliwell e Gutteridge, 1999; Sokol, 1989; Ward e Peters, 1995).

O ácido ascórbico, também conhecido como vitamina C, tem como

principal função a regeneração do �-tocoferol e forma nesse processo a forma

oxidada, denominada ácido deidroascórbico (Ward e Peters, 1995). O ácido

ascórbico tem excelente ação antioxidante “in vitro” e atua como seqüestrador de

vários radicais livres. Além disso, a vitamina C atua como cofator de enzimas

envolvidas com a síntese de colágeno.

3.3 Estresse oxidativo

Os radicais livres são formados normalmente no metabolismo celular.

As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a

toxicidade dessas espécies e são responsáveis pela manutenção da homeostase

entre a produção e a eliminação de radicais livres. No entanto, em certas

condições, pode ocorrer aumento da produção de radicais livres suficiente para

ultrapassar a capacidade antioxidante ou uma diminuição das defesas

antioxidantes no organismo, favorecendo o que chamamos de estresse oxidativo

(Bondy e Le Bel, 1993; Cadenas e Davies, 2000).

O estresse oxidativo pode provocar perda de função celular, por causar

alterações no metabolismo das células. É importante ressaltar que o estresse

oxidativo pode ocorrer em condições fisiológicas (fagocitose) e patológicas.

33

3.4 Colite e estresse oxidativo

A colite ulcerativa é uma doença inflamatória crônica, cuja etiologia

permanece desconhecida. Vários fatores etiológicos, incluindo genética,

imunológicos e ambientais, têm sido implicados (Kirsner and Shorter, 1982; Jewell

and Patel, 1985). Recentemente, o estado alterado do mecanismo

oxidante/antioxidante no cólon inflamado tem recebido atenção (Cetinkaya et al.,

2005). Evidências sugerem que ERO, como o ácido hipocloroso e derivados

oxidantes são produzidos em excesso pela mucosa inflamada e podem ser

patogênicos na doença inflamatória intestinal (Grisham, 1994; Keshvarzian et al.,

1990; Millar et al., 1996). As fontes principais de ERO na mucosa inflamada são

neutrófilos e leucócitos fagocitários ativados, capazes de produzir superóxido e

uma cascata de várias espécies reativas levando à formação do radical hidroxila e

peróxido. Esses produtos causam um distúrbio na estabilidade da membrana

celular e morte da célula por peroxidação lipídica nas doenças inflamatórias

intestinais (Buffinton and Doe, 1985; Fantone and Ward, 1982; Flohe et al., 1985).

Estes produtos intermediários do metabolismo do oxigênio (superóxido, radical

hidroxila e peróxido de hidrogênio) são controlados por vários mecanismos

celulares de defesa antioxidante enzimáticas e não-enzimáticas (Cetinkaya et al.,

2005).

Pravda (2005) aponta o peróxido de hidrogênio como o principal

responsável pela cascata de eventos que leva à colite ulcerativa, no que ele

chama de “Teoria da Indução Radical da Colite Ulcerativa”, onde numa primeira

fase, pré-clínica, denominada “indução radical”, os colonócitos são induzidos a

34

gerar um excesso de peróxido de hidrogênio não neutralizado devido ao estresse

oxidativo do metabolismo celular. Radical hidroxila e peróxido de hidrogênio têm

meia vida curta, o que limita sua atividade destrutiva nas moléculas intracelulares

(DNA, enzimas) e estruturas extracelulares adjacentes à célula (membrana basal

e junções comunicantes). Citocinas pró-inflamatórias, entretanto, podem ser

carreadas a sítios distantes para exercer seus efeitos. Desse modo, a difusão

inicial intermitente de peróxido de hidrogênio de células epiteliais compromete a

barreira local da mucosa colônica, e causa uma transitória ativação imune

resultando em produção de citocina e manifestações extra-intestinais, como artrite,

uveíte e manifestações cutâneas (pioderma gangrenoso, eritema nodoso). A

continuação do insulto oxidativo na barreira colônica culmina com infiltração

neutrofílica, iniciando a segunda fase do processo, onde o paciente apresenta

sinais de comprometimento da integridade da mucosa (sangramento). A contínua

estimulação de neutrófilos da mucosa pelas bactérias fecais converte a condição

em uma auto-estimulação e auto-perpetuação do processo que Pravda chama de

“propagação”.

O aumento do estresse oxidativo e diminuição das defesas

antioxidantes têm sido demonstrados em biópsias de mucosa colônica de

pacientes com DII (Lih-Brody et al., 1996). Tem sido sugerido que o desequilíbrio

entre mecanismos pró-oxidantes e anti-oxidantes na DII pode ser controlado por

tratamento antioxidante. Alguns agentes provaram ser efetivos em condições

experimentais, tais como vitamina E, selênio, trimetazidina (Ademoglu et al., 2004;

Kuralay et al., 2003; Yoshida et al., 1999) e N-acetilcisteína (NAC) (Cetinkaya et

al., 2005).

35

3.5 N-acetilcisteína (NAC)

A NAC tem sido utilizada largamente como antioxidante “in vivo” e “in

vitro” (Cetinkaya et al. 2005). Ela também é eficiente no tratamento de algumas

situações de overdose de alguns fármacos, como paracetamol (Prescott et al.,

1979), e como mucolitico (De Flora, 2001). A NAC é doadora de grupos tióis que

atua como um precursor da cisteína intracelular, aumentando a produção de

glutationa (GSH) (Pinho et al., 2005), quando a demanda de GSH está

aumentada, como durante excessivo estresse oxidativo, ou durante certos

processos patológicos (Cetinkaya et al., 2005). A maioria dos efeitos benéficos da

NAC é sugerida como sendo um resultado de sua habilidade tanto de reduzir

cistina extracelular em cisteína, ou ser uma fonte de grupos tióis. Como fonte de

grupos tióis, a NAC estimula a síntese de glutationa, aumenta a atividade da

glutationa-S-transferase, e atua nos radicais oxidantes reativos (De Vries e De

Flora, 1993). A NAC é também um poderoso seqüestrador do ácido hipocloroso.

Esse ácido é produzido pela ação da mieloperoxidase no peróxido de hidrogênio

na presença de ânions hipoclorosos e está envolvido na reação inflamatória na

colite (Cetinkaya, 2005). Estudos têm mostrado que o uso de NAC está associado

com prevenção de câncer colorretal associado à colite ulcerativa em associação

com a supressão do dano celular nitrosativo, bem como a prevenção de pólipos

colorretais (De Flora et al., 1996; De Leon e Roncucci, 1997; Serill et al., 2002).

36

3.6 Deferoxamina (DFX)

A deferoxamina (DFX) é empregada rotineiramente para o tratamento

de várias doenças hematológicas, com um bom perfil de segurança. É um potente

quelante de ferro e tem sido estudado em eventos cardiovasculares (Hurn et al.,

1995) e na sépsis (Ritter et al., 2004). Existem evidências que a deferoxamina tem

a capacidade de aumentar a capacidade antioxidante da NAC (Ritter et al., 2004).

A DFX pode prevenir ou reverter os efeitos da produção de radicais

livres, por impedir a geração de radical hidroxila através da reação de Fenton

(Vulcano et al., 2000). Embora o uso crônico possa agravar uma possível anemia

nos pacientes portadores de colite ulcerativa, onde a suplementação de ferro

poderia piorar o quadro clínico, baseados em estudos que demonstram uma

aumento da atividade da doença nesta situação (Uritski et al., 2004),

possivelmente por aumentar a produção das ERO pela reação de Fenton (Carrier

et al., 2002), o uso de DFX por um curto período de tempo poderia ser benéfico ao

produzir sinergismo com NAC (Ritter et al., 2004).

37

4 OBJETIVOS

4.1 Geral

- Estudar o efeito da NAC e da DFX sobre a colite ulcerativa induzida por dextran

sulfato de sódio (DSS) em ratos, através da análise da função mitocondrial

envolvida na geração de ERO.

4.2 Específicos

- Verificar o efeito do tratamento com NAC e DFX sobre os seguintes parâmetros,

em tecido intestinal e sanguíneo de ratos submetidos ao modelo de colite por

DSS:

– Marcadores inflamatórios

– Dano tecidual (Avaliação micro e macroscópica do tecido)

– Metabolismo energético mitocondrial

– Estresse oxidativo

38

PARTE II - RESULTADOS

Oxidative stress and metabolism in animal model of colitis induced by dextran sulfate sodium Carlos R. Damiani, César A. F. Benetton, Cristhopher Stoffel, Katrine C. Bardini, Vilson H. Cardoso, Gabriela Di Giunta, Ricardo A. Pinho, Felipe Dal-Pizzol, Emilio L. Streck Artigo submetido à revista Journal of Gastroenterology and Hepatology

39

Oxidative stress and metabolism in animal model of

colitis induced by dextran sulfate sodium

Carlos R. Damiani1, César A. F. Benetton

1, Cristhopher Stoffel

1,

Katrine C. Bardini2, Vilson H. Cardoso

1, Gabriela Di Giunta

1,2,

Ricardo A. Pinho3, Felipe Dal-Pizzol

2, Emilio L. Streck

1

1Laboratório de Bioquímica Experimental, Universidade do Extremo Sul

Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;

2Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul

Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;

3Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, Universidade do

Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil

Correspondence: Prof. Emilio L. Streck, Laboratório de Bioquímica Experimental,

Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-003, Criciúma, SC, Brazil. Fax:

55 48 3341 2750. E-mail: [email protected]

40

ABSTRACT

Ulcerative colitis is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract. Its etiology remains unclear, but it appears to result from a dysregulated immune response, with infiltration of phagocytic leukocytes into the mucosal interstitium. The production and release of reactive oxygen species by immune cells seems to play a crucial role in phisiopathology of colitis. The aim of this work was to evaluate the effects of N-acetylcysteine (NAC) and deferoxamine (DFX) in the treatment of colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) by measuring intestinal parameters of oxidative stress and mitochondrial function, inflammatory response and bowel histopathological alterations. The results show that DSS increased white blood cells count and that NAC and DFX did not prevent this effect. However, DSS increased mitochondrial respiratory chain complex IV in colon of rats and NAC and DFX prevented this alteration. Besides, thiobarbituric acid reactive substances were increased in colon of DSS-treated rats. NAC and DFX, when taken together, prevented this effect. Complex II and succinate dehydrogenase were not affected by DSS, as protein carbonyl content. We speculate that NAC and DFX might be used for treatment of colitis, but further research is necessary to clarify these effects. Key words: colitis, oxidative stress, respiratory chain, N-acetylcysteine, deferoxamine, dextran sulfate sodium.

41

INTRODUCTION

Inflammatory bowel disease (IBD) consists of a group of illnesses with

chronic inflammation of the gastrointestinal tract, which causes life-impairing

symptoms, necessitates long-term dependence on powerful drugs and often

results in debilitating surgery and even death. However, IBD etiology remains

unclear and appears to result from a dysregulated immune response.1,2

One of the hallmarks of IBD is the infiltration of large numbers of phagocytic

leukocytes into the mucosal interstitium.3

Besides the enhanced inflammatory

infiltrate, extensive mucosal injury occurs, resulting in production and release of

reactive oxygen species (ROS), such as superoxide and hydrogen peroxide. These

species interact in the presence of transition metals such as iron in order to

generate the highly reactive and cytotoxic hydroxyl radical. Hydroxyl radical is one

of the most potent oxidants produced in biological systems and is capable of

oxidizing and peroxidizing a wide variety of biomolecules, such as proteins,

carbohydrates, lipids and DNA. In addition to classic ROS, activated neutrophils

and monocytes also secrete the hemoprotein myeloperoxidase into the

extracellular medium, where it catalyzes the oxidation of chloride ions via hydrogen

peroxide to yield the highly reactive oxidizing and chlorinating agent hypochlorous

acid. The latter has been shown to degrade gastrointestinal mucin, enhance

mucosal permeability, and injure intestinal epithelial cells.2–6

In addition, it was

42

demonstrated overproduction of ROS in the colon of IBD patients. These evidence

suggest that colonic inflammation may produce high levels of oxidants

that probably exceed the low antioxidant capacity and lead to epithelial cell

disruption.5

A number of studies have demonstrated the antioxidant role of NAC,

including IBD animal models. Thus, NAC supplementation was found to reduce

oxidative stress by improving the thiol redox status, to inhibit neutrophil and

monocyte chemotaxis and oxidative metabolism and to scavenge superoxide,

hydrogen peroxide and hydroxyl radicals. It has been recently shown that NAC

attenuates acute colitis induced by intraretal acetic acid administration,2

and that

NAC also prevented ulcerative colitis-associated colorectal cancer induced by

dextran sulfate sodium (DSS).7

On the other hand, isolated administration of NAC

could produce pro-oxidant effects.8

For example, the oxidative metabolism of NAC

can generate thiyl free radicals and NAC can reduce Fe+3

ions to participate in the

generation of hydroxyl radical via Fenton reaction.9

We recently demonstrated that

the combination of N-acetylcysteine (NAC) plus deferoxamine (DFX), but not their

isolated use, is an effective treatment for several inflammatory diseases.10–12

This

is of great importance in IBD, since iron seems to be involved in the oxidative

damage during colitis development.

We here describe the effects of NAC, DFX or both in the treatment of colitis

induced by DSS by measuring intestinal parameters of oxidative stress and

43

mitochondrial function, degree of inflammatory response and bowel

histopathological alterations.

Methods

Animals

Male Wistar rats (100–120 g) obtained from Central Animal House of

Universidade do Extremo Sul Catarinense were housed individually under standard

conditions (12-h light/dark cycles with room temperature of 22–24°C). All studies

were performed in accordance with National Institutes of Health guidelines and

with the approval of Ethics Committee from Universidade do Extremo Sul

Catarinense.

DSS-induced colitis

After 7 days of acclimation, acute colitis was induced in all rats by including

50 g/L of dextran sulfate sodium (DSS) (MW 8000; Sigma-Aldrich) in drinking water

for 5 days. Rats were divided into the following eight groups, each consisting of five

rats: normal control group (group I), normal control group treated with NAC 20

mg/kg s.c. (group II), DFX 20 mg/kg s.c. (group III) or both (group IV), DSS-

induced colitis group (group V), DSS-induced colitis group treated with NAC 20

mg/kg s.c. (group VI), DFX 20 mg/kg s.c. (group VII) or both (group VIII). NAC was

44

administered twice a day and DFX once a day during the period of induction of

colitis by DSS.6,10–12

Tissue and homogenate preparation

On the fifth day of the study, all rats were anesthetized by intraperitoneal

administration of sodium pentobarbital (50 mg/kg) and killed by cardiac puncture.

Blood was collected and white blood cells (WBC) count obtained with a

hemacytometer chamber immediately after the obtaining of the sample. Colon was

removed from the colocecal junction to the anal verge. The colon was then

opened, rinsed with ice-cold isotonic saline, and the mucosal lesions were

examined macroscopically. After that, the colon was cut longitudinally in two pieces

for histological evaluation and tissue measurements, respectively. For histological

examinations, the colon was fixed in 10% formalin, embedded in paraffin and

stained with hematoxylin and eosin. The remaining colon were homogenized (1:10,

w/v) in SETH buffer, pH 7.4 (250 mM sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base,

50 IU/ml heparin). The homogenates were centrifuged at 800 x g for 10 min and

the supernatants kept at −70oC until used for enzyme activity determination. The

maximal period between homogenate preparation and enzyme analysis was

always less than five days. Protein content was determined by the method

described by Lowry and colleagues (1951) using bovine serum albumin as

standard.13

45

Determination of colonic damage

Macroscopic scoring of the colonic damage was performed using the criteria

outlined in Table 1.14

Histological assessment was performed by the

criteria outlined in Table 2.15

Macroscopic and microscopic scoring of tissue

samples were performed by an observer unaware of the treatment groups.5

Respiratory chain enzyme activities

The activities of the respiratory chain enzyme complexes succinate: DCIP

oxireductase (complex II) and succinate: phenazine oxireductase (soluble

succinate dehydrogenase (SDH)) were determined according to the methods of

Fischer and colleagues (1985).16

Complex II (succinate: DCIP oxireductase)

activity was measured by following the decrease in absorbance due to the

reduction of 2,6-DCIP) at 600 nm with 700 nm as reference wavelength (� = 19.1

mM−1

x cm−1

). The reaction mixture consisting of 40 mM potassium phosphate, pH

7.4, 16 mM succinate and 8 �M DCIP was preincubated with 40–80 �g

homogenate protein at 30oC for 20 min. Subsequently, 4 mM sodium azide and 7

�M rotenone were added and the reaction was initiated by addition of 40 �M DCIP

and was monitored for 5 min. The activity of succinate: phenazine oxireductase

(soluble SDH) was measured following the decrease in absorbance due to the

reduction of 2,6-DCIP at 600 nm with 700 nm as reference wavelength (� = 19.1

mM−1

x cm−1

) in the presence of phenazine methasulphate (PMS). The reaction

mixture consisting of 40 mM potassium phosphate, pH 7.4, 16 mM succinate and 8

46

�M DCIP was preincubated with 40–80 �g homogenate protein at 30 oC for 20 min.

Subsequently, 4 mM sodium azide, 7 �M rotenone and 40 microM DCIP were

added and the reaction was initiated by addition of 1 mM PMS and was monitored

for 5 min. The activity of cytochrome c oxidase). The reaction buffer contained 10

mM potassium phosphate, pH 7.0, 0.6 mM n-dodecyl-d-maltoside, 2–4 �g

homogenate protein and the reaction was initiated with addition of 0.7 �g reduced

cytochrome c. The activity of complex IV was measured at 25C for 10 min.

(complex IV) was measured by the method of Rustin and colleagues (1994).17

Complex IV activity was measured by following the decrease in absorbance due to

the oxidation of previously reduced cytochrome c at 550 nm with 580 nm as

reference wavelength (� = 19.1 mM−1

x cm−1o

Oxidative stress parameters

The formation of TBARS during an acid-heating reaction was measured as

an index of oxidative stress as previously described.18

Briefly, the samples were

mixed with 1 mL of trichloroacetic acid 10% and 1 mL of thiobarbituric acid 0.67%

(Sigma Chemical, St. Louis, MO) and then heated in a boiling water bath for 15

mins. Malondialdehyde equivalents were determined by the absorbance at 535 nm

using 1,1,3,3-tetramethoxypropane (Sigma Chemical) as an external standard.

Results were expressed as malondialdehyde equivalents per milligram of protein.

The oxidative damage to proteins was assessed by the determination of carbonyl

groups based on the reaction with dinitrophenylhidrazine (Sigma Chemical) as

previously described.19

Briefly, proteins were precipitated by the addition of 20%

47

trichloroacetic acid and redissolved in dinitrophenylhidrazine, and the absorbance

was read at 370 nm.

Statistical analysis

Data were analyzed by Student’s t-test or one-way analysis of variance

followed by the Duncan multiple range test when F was significant. All analyses

were performed using the Statistical Package for the Social Science (SPSS)

software.

Results

In the present work, we evaluated the effects of NAC and DFX on the

treatment of ulcerative colitis caused by DSS. Our results showed that DSS caused

a significant increase in white blood cells (WBC) count and that NAC and DFX did

not prevent such effect (F(7,32)=21.40; p<0.01), when compared to group without

DSS administration. However, by evaluating only DSS-treated groups, we verified

that WBC count was significantly higher in NAC-treated rats, when compared to

DSS control group (F(3,16)=4.83; p<0.01) (Figure 1).

As seen on Figure 2, the microscopic evaluation of the colonic damage

showed increased score in DSS-treated rats. Besides, NAC and DFX, when

administered alone, did not prevent this increase. When the drugs were

administered together, we verified a decrease in colonic damage score, similar to

48

that obtained in control group (F(7,32)=5.75; p<0.01). However, when we evaluate

only DSS-treated groups, we verified that NAC and DFX, alone or together, did not

prevent the increase in microscopic score caused by DSS

administration (F(3,16)=4.37; p=0.29). The macroscopic evaluation showed

the same effect of DSS, but in this case the use of NAC and DFX, alone or

together, decreased the levels of damage, also similar to control group

(F(7,32)=5.77; p<0.01). The statistical analysis with DSS-treated groups showed

the same prevention by NAC and DFX taken alone or together (F(3,16)=4.18;

p<0.05).

We also evaluated the activity of mitochondrial enzymes in colon of DSS-

treated rats. We observed that mitochondrial respiratory chain complex II

(F(8)=0.53, p=0.80) and succinate dehydrogenase (F(8)=0.13, p=0.24) (Table 3)

activities were not affected by DSS. However, the activity of complex IV was

increased by DSS and NAC and DFX prevented this effect, when compared to

control group (F(7,32)=6.12; p<0.01). Besides, by evaluating only DSS-treated

groups, we verified that complex IV activity was significantly decreased in NAC and

NAC plus DFX treated rats, when compared to DSS control group (F(3,16)=8.86;

p<0.01) (Figure 3).

Besides, we showed that DSS increased TBARS, when compared to control

group (Figure 4). NAC alone did not prevented TBARS increase, but DFX alone or

together with NAC prevented lipoperoxidation (F(7,32)=2.65; p<0.05). Finally, the

statistical analysis of DSS-treated groups showed that NAC plus DFX treated rats

presented significantly increased levels of lipoperoxidation, when compared to DSS

49

control group (F(3,16)=2.70; p<0.05). On the other hand, protein carbonyl content

was not affected by DSS treatment (F(8)=0.19, p=0.96) (Table 3).

Discussion

Because therapeutic agents such as sulfasalazine, steroids and

immunosuppressive agents are not fully satisfactory, the development of safer and

more effective therapeutic agents is greatly needed. There are some studies

showing that NAC and iron chelators had some benneficial effects on the treatment

of colitis.20–22

It is believed that ROS such as superoxide and hydrogen peroxide

interact in the presence of iron and may enhance hydroxyl ion production via

Fenton reaction.3

It was also demonstrated that overproduction of ROS occurs in

colon of IBD patients. In conclusion, colonic inflammation probably produce high

levels of oxidants that exceed the antioxidant capacity and lead to epithelial cell

disruption.5

So, we tested NAC and DFX on the treatment of ulcerative colitis

induced by DSS in rats.

As seen on Figure 1, our results showed that WBC count were increased in

DSS-treated rats. However, NAC and DFX did not prevent this effect. Besides, we

verified that DSS-treated rats presented higher colonic damage score, micro and

macroscopically. In this case, the histological tissue evaluation showed that NAC

and DFX, when used alone or together, prevented the increase of the score. In

50

Figure 5, some representative histological slides from rats receiving water (control

group) and DSS (colitis group) are shown. The colon of a rat from the control group

is showed in Panel 5A. The colon of a rat from the colitis group can be observed in

Panel 5B, where extensive mucosal necrosis and marked inflammatory infiltrate is

shown. In Panel 5C and 5D the colon of rats with colitis and treated only with NAC

or with NAC plus DFX are shown, respectively. As can be seen, there is less

extensive mucosal injury in Panel 5C, and in Panel 5D, light inflammatory infiltrate.

The macroscopic evaluation showed that NAC and DFX did not have the same

effect, when used alone, but together were much more effective. These findings

suggest that NAC nad DFX may prevent colonic damage, specially when used in

association.

We observed similar results by evaluating mitochondrial respiratory chain

complex IV in colon, where DSS-treated rats presented a higher activity of this

enzyme, and NAC and DFX, alone or in association, prevented the effect. It is

possible that the process of cellular lesion and inflammation requires a higher

production of ATP for tissue regeneration. As we observed, NAC and DFX seems

to decrease the inflammation (by colonic damage score), and may also decrease

ATP needs. Consequently, ATP production is similar to control animals. Besides,

we verified that mitochondrial respiratory chain complex II and succinate

dehydrogenase were not affected in colon of rats with colitis induced by DSS.

An interesting finding was observed in oxidative stress parameters

evaluation. TBARS, a marker of lipoperoxidation, was increased in DSS-treated

rats. When used alone, NAC did not prevent such effect and DFX, alone or in

association with NAC, prevented. So, it is tempting to speculate that the use of

51

NAC and DFX in association may be more interesting for the treatment of colonic

damage in colitis. Evidence from literature show that NAC may enhance the

We believe that the use of DFX, an iron chelator, blocked the pro-oxidant effect of

NAC. Besides, we verified that protein carbonyl content, a marker of oxidative

damage to proteins, were not altered by DSS. producton of ROS via Fenton

reaction.8

The hypothesis is based on the inflammatory reaction caused by DSS. It is

possible that mucosal injury enhances ATP production for tissue regeneration.

Consequently, more oxygen is consumed and more ROS are produced. The

antioxidant capacity of colon is relatively low, and oxidative stress occurs. More

tissue injury and inflammatory cells infiltration occurs, resulting in exacerbation of

inflammatory response and mucosal damage. We believe that whether oxidative

stress is prevented, this circle may be broken. Finally, our results suggest that NAC

and DFX play an important role in prevention of oxidative damage in colon of rats

with colitis.

These findings clearly demonstrate that NAC and DFX have important

effects on treatment of ulcerative colitis. Our results showed that these drugs

prevented many effects caused by DSS.

Acknowledgements

This work was supported by CNPq and UNESC

52

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55

Figure 1 – White blood cells (WBC) count in animal model of colitis induced

by DSS. Data are expressed for five animals.

# – Different from control (group without DSS administration) p<0.01

a – Different from DSS-control (group wit DSS administration) p<0.01

56

Figure 2 – Micro and macroscopic evaluation on colonic damage animal

model of colitis induced by DSS. Data are expressed as score points, for five

independent experiments.



61

Figure 3 – Mitochondrial respiratory chain complex IV activity in colon of rats

treated with DSS. Data are expressed as nmol/min.mg protein, for five

independent experiments performed in duplicate.



62

Figure 4 – Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in colon of rats

treated with DSS. Data are expressed as nmol MDA/min.mg protein, for five

independent experiments performed in duplicate.



63

Figure 5 – Representative histological slides from rats receiving DSS. Colitis

was induced in Wistar rats by DSS oral administration for five days as described

under Methods. Panel A: Water (control); Panel B: DSS (colitis); Panel C: DSS

plus NAC; Panel D: DSS plus NAC plus DFX. (Hematoxylin and eosin; 400x).

5A: no tissue damage; 5B: extensive mucosal necrosis and marked inflammatory

infiltrate; 5C: less extensive mucosal injury; 5D: light inflammatory infiltrate.

60

PARTE III

5 DISCUSSÃO

Apesar de aproximadamente cento e cinqüenta anos terem se

passado desde que Samuel Wilks descreveu a colite ulcerativa (Cormam,

2005), uma terapia que possa ser considerada altamente satisfatória do ponto

de vista de remissão da doença associada com baixa taxa de recidiva, e

mínimos efeitos colaterais, ainda é objeto de inúmeros estudos. Talvez a

dificuldade em encontrar um fármaco realmente eficaz resida no entendimento

incompleto da patogênese da moléstia. Sabe-se que inúmeros fatores estão

implicados, tais como a infiltração neutrofílica e a produção elevada de

mediadores inflamatórios, ocorrendo uma produção excessiva de espécies

reativas de oxigênio que ocasionaria ou perpetuaria o processo de dano

tecidual (Pearson et al., 1996; Pravda, 2005; Yavuz et al.,1999).

Neste estudo utilizou-se como marcadores da atividade inflamatória

a contagem de leucócitos e dosagem da proteína C reativa. O processo

inflamatório desencadeia uma resposta quimiotáxica levando à liberação

medular de glóbulos brancos, geralmente ocasionando leucocitose. Os

resultados mostraram que no grupo de ratos que recebeu somente água para

beber, não houve aumento do número de leucócitos, sugerindo ausência de

processo inflamatório neste grupo de animais. Além disso, a administração de

NAC e DFX isoladamente ou em conjunto, não interferiu na contagem de

61

leucócitos. No grupo de ratos com colite induzida por DSS, houve aumento da

contagem leucocitária em todos os animais, demonstrando a existência de

processo inflamatório nos mesmos. O tratamento com NAC e DFX isolada ou

conjuntamente não reverteu este parâmetro inflamatório. Não houve diferença

estatística no grupo DSS, porém nota-se uma tendência a um maior número de

leucócitos nos ratos que receberam apenas NAC.

A proteína C reativa é uma proteína cuja concentração plasmática

aumenta durante estados inflamatórios, uma característica que tem sido

longamente empregada com propósitos clínicos. Ela rapidamente aumenta sua

síntese após injúria tecidual ou infecção, sugerindo que contribua para defesa

do hospedeiro e que seja parte de uma resposta imune inata, podendo ativar a

via clássica do complemento, estimular a fagocitose e se ligar a

imunoglobulinas receptoras. (Black et al., 2004). No presente estudo, em

contraste com o esperado, não se evidenciou qualquer diferença dos níveis de

proteína C reativa entre o grupo controle e o grupo que recebeu DSS, talvez

por ter sido utilizado um modelo de colite aguda, o que não daria tempo da

síntese hepática de proteína C reativa.

O dano tecidual, seguindo escores previamente descritos por Yavuz

e colaboradores (1999), foi analisado conforme parâmetros micro e

macroscópicos. Nos animais que receberam apenas água para beber, não

houve diferença intergrupos, independente de terem sido tratados ou não com

NAC e/ou DFX. A análise microscópica do tecido evidenciou um dano tecidual

nos ratos que receberam DSS, dano este que não foi amenizado pelo uso de

NAC ou DFX usados isoladamente. Entretanto, nos animais com colite induzida

pelo DSS que receberam NAC associada ao DFX, as alterações microscópicas

62

são estatisticamente idênticas ao grupo controle, demonstrando um efeito

protetor do dano tecidual sinérgico entre os dois fármacos, fato este que

corrobora com achados de estudos prévios (Ritter et al., 2004; Vulcano et al.,

2000).

A análise macroscópica do dano tecidual, no grupo DSS não tratado

com NAC e/ou DFX mostrou alterações em relação ao grupo controle. Chama

a atenção o fato de que NAC e DFX isoladamente ou em associação,

preveniram o aparecimento de lesões macroscópicas, levando à níveis

idênticos ao grupo que não recebeu DSS, em contraste com o achado

microscópico, onde somente a associação NAC + DFX produziu melhora do

dano.

O complexo II da cadeia respiratória mitocondrial não foi alterado

nos ratos que tiveram colite induzida pelo DSS, bem como a SDH não sofreu

alterações. O complexo IV da cadeia respiratória no grupo com colite induzida

por DSS e que recebeu salina como tratamento, apresentou um aumento

estatisticamente significante de sua atividade, sugerindo uma maior produção

de ATP, possivelmente como resposta ao processo lesão/regeneração tecidual.

Os ratos com colite induzida por DSS que receberam tratamento antioxidante

tiveram uma atividade do complexo IV idêntica ao grupo controle.

O dano oxidativo a lipídeos, medido pelo TBARS, foi evidente no

grupo colite que recebeu salina e no grupo colite que recebeu somente NAC

como tratamento, confirmando estudos prévios que mostram um efeito pró-

oxidante da NAC, presumivelmente pela reação de Fenton, com formação de

radical hidroxil, efeito este que foi neutralizado pela DFX, por se tratar de um

63

quelante de ferro (Vulcano, 2000). Além disso, não foi detectado dano à

proteínas nos animais tratados com DSS.

No presente estudo, ficou evidente a atividade inflamatória existente

nos ratos com colite induzida por DSS, pelo aumento da contagem leucocitária

e pela análise macro e microscópica dos espécimes, simulando claramente o

que acontece em humanos. O uso de NAC e DFX foi capaz de amenizar os

danos macroscópicos nos ratos. No entanto, em nível microscópico, apenas o

grupo que utilizou a associação NAC + DFX mostrou redução do dano tecidual.

Isto sugere muito fortemente que a associação NAC + DFX é superior que a

utilização isolada dos mesmos, embora em nível macroscópico tenha ocorrido

redução dos níveis de lesão tecidual. O que se deseja no tratamento dos

pacientes não é apenas a redução dos sintomas, mas também a melhora

histológica das lesões, até por razões de prevenção do aparecimento de

tumores secundários às DII (Itzkowitz e Yio, 2004).

O papel dos radicais livres nas DII tem sido relatado em vários

estudos (Carrier et al., 2002; Poussios et al., 2003; Reifen et al., 2004; Yavuz et

al., 1999), fazendo crescer o interesse pelo efeito benéfico dos antioxidantes

como terapia da colite ulcerativa. Neste estudo conseguiu-se demonstrar o

dano oxidativo em lipídeos através do TBARS, porém o dano oxidativo em

proteínas não ficou demonstrado pela medida de grupos carbonil. A NAC não

foi capaz de diminuir o dano oxidativo em lipídeos, quando utilizada

isoladamente e a DFX foi efetiva em diminuir o dano oxidativo a lipídeos,

conforme demonstrado em nossos resultados.

A colite induzida por DSS produz processo inflamatório, ocasionando

um ciclo de lesão e regeneração tecidual, produzindo uma maior necessidade

64

tecidual de ATP, como foi demonstrado no presente estudo. Isto leva a um

maior consumo de oxigênio pela cadeia respiratória mitocondrial, que por sua

vez, aumenta a produção de ERO, que ao superar a atividade antioxidante do

organismo, vai aumentar a atividade inflamatória e consequentemente o ciclo

de lesão e regeneração tecidual será perpetuado. O uso de substâncias

antioxidantes visa à diminuição de radicais livres circulantes e a melhora do

status inflamatório da doença. No presente estudo, a associação NAC + DFX

mostrou ser capaz de reduzir o dano tecidual e diminuir o dano oxidativo a

lipídeos.

O uso de antioxidantes como terapia de diversas doenças, dentre

elas, as DII, abre novas perspectivas como alternativas no tratamento dessas

patologias que promovem sintomas altamente debilitantes ao paciente, e

produzem sentimentos de frustração aos profissionais da área da saúde que

lidam com estes pacientes e muitas vezes não vêem resultados satisfatórios ao

tratamento empregado.

65

6 CONCLUSÕES

1- A colite induzida por DSS produziu aumento da contagem leucocitária.

2- NAC e DFX não interferiram na contagem leucocitária.

3- Não houve diferença nos níveis de proteína C reativa entre os grupos

sem colite e os com colite induzida por DSS.

4- O dano tecidual macroscópico foi amenizado pelo uso de NAC e DFX

utilizados em conjunto ou isoladamente.

5- O dano tecidual microscópico foi mantido quando utilizamos NAC e DFX

isoladamente, e foi amenizado somente no grupo que utilizou NAC

associada ao DFX.

6- Os ratos com colite induzida por DSS apresentaram um aumento da

atividade do complexo IV da cadeia respiratória, que foi neutralizado

pelo uso de NAC e DFX isoladamente ou em associação.

7- A atividade do complexo II da cadeia respiratória, bem como a atividade

da SDH não foi modificada pelo DSS.

8- Não houve dano oxidativo em proteínas, nos ratos com colite induzida

por DSS.

9- Os ratos com colite induzida por DSS apresentaram dano oxidativo a

lipídeos.

10- O uso de DFX ou DFX + NAC preveniu o dano oxidativo a lipídeos.

11- O uso de NAC isoladamente não preveniu o dano oxidativo a lipídeos.

66

7 PERSPECTIVAS

A partir do presente trabalho pretende-se continuar as pesquisas

realizando estudos com fármacos de uso corrente no tratamento das DII, tais

como sulfassalazina, ácido 5-aminosalicílico e corticosteróides, fazendo

comparações quanto à melhora do quadro de dano tecidual e oxidativo em

modelo animal de colite e/ou enterite, em relação aos antioxidantes. Pode-se,

assim, esclarecer mais dados da fisiopatologia e tratamento das DII, visando

identificar novos agentes terapêuticos que apresentem melhora do quadro da

doença com custos e efeitos indesejáveis menores que os fármacos

atualmente disponíveis.

67

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