Estrutura genética populacional Stenella clymene (Gray, 1846) e sua...

Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua relação

filogenética com o gênero

Luana Barbosa Carvalho Nara

Dissertação de mestrado em Biodiversidade Tropical

Mestrado em Biodiversidade Tropical

Universidade Federal do Espírito Santo

São Mateus, Março de 2015

III

Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)

(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)

Nara, Luana Barbosa Carvalho, 1988 -

N218e Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e

sua relação filogenética com o gênero / Luana Barbosa Carvalho Nara.

– 2015.

52 f. : il.

Orientador: Ana Paula Cazerta Farro

Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Tropical) – Universidade

Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo.

1. Delphininae. 2. Citocromo b. I. Farro, Ana Paula Cazerta. II.

Universidade Federal do Espírito Santo. Centro Universitário Norte do

Espírito Santo. III. Título.

CDU: 502

IV

“You cannot change fate. However, you can rise to meet it, if you so choose.”

Princess Mononoke

V

Agradecimentos Agradeço à CAPES pelo apoio financeiro, mas principalmente a cada brasileiro e

brasileira que pagam seus impostos em dia apesar de um sistema econômico e fiscal que

não os beneficia.

Ao grande amor da minha vida, que em 17 anos me fez amar os animais mais do que

qualquer outra coisa, que me ensinou sem teoria alguma a respeitar todos os seres vivos

e que até hoje é a única razão pela qual eu não desisto. Eu devo e vou agradecer toda

minha vida à Salita por ser a fonte da força que eu tenho pra viver.

À Fiona, Madonna e Catuaba por terem sido a serendipity que eu precisava,

principalmente para suportar esses dois anos.

À 6ªturma da UNESP São Vicente por me lembrarem constantemente que a gente nasce

biólogo e continuarem sendo exemplos e fazendo de mim uma bióloga melhor.

À Prof.ª Dr.ª Ana Paula Cazerta Farro pelo apoio, amizade e paciência ao longo do

desenvolvimento desse projeto.

Ao Prof. Dr Mario Manoel Rollo Jr. pelo carinho, preocupação, incentivo e todo apoio que

foram além da graduação.

À Dr. Cecilia Kieruff por ter iluminado meus últimos meses no laboratório com tanto

conhecimento, experiência e alegria.

À Msc. Drienne Messa Faria por todo suporte laboratorial.

À Msc. Maria Paula Rozo pela amizade que se provou muito mais que verdadeira depois

de tantas horas rodando analises, arrumando ilustrações, discutindo resultados e

principalmente dividindo todo o sorvete e leite condensado possível.

À Kamyla Silva Amorim pelo apoio e todos os pavês e açaís que salvaram os dias ruins,

por não se preocupar apenas comigo, mas também com minhas filhotas e ser uma das

melhores coisas que me aconteceu no mestrado. E preciso agradecer muito ao Fernando

que foi diversas vezes obrigado a entrar nas suas loucuras pra me ajudar.

VI

Ao Leandro Rafael Perez que além da amizade foi quem mais me manteve firme e focada,

que desprendeu uma enorme paciência pra me ouvir tantas vezes, meu melhor

psicólogo, confidente, corretor ortográfico bilíngue e o escritor que eu pedi pra vida.

Ao André Sato, um amigo incrível, que me aturou em todos os meus momentos, foi meu

mestre do photoshop e ilustrator e sem o qual nenhum dos meus gráficos ou figuras

teriam o mínimo de qualidade.

Ao Caio Henrique de Araújo Bissa por perder uma boa parte de sua noite me ajudando

com correções do meu texto e embora tamanha distância e todos seus afazeres sempre

arrumar um tempinho pra me ver e matar as saudades.

À Janaina Barata por ser minha alma gêmea! Que mesmo com a vida de pernas pro ar e

cheia de problemas teve condições de ouvir e debater os meus problemas e aflições e

ainda ler minha dissertação. Ainda proporcionou o mínimo de vida social que tive

durante o mestrado, me levando para as melhores saídas de campo pra coletar as piores

formigas.

Aos meus pais, Carlos Alberto Carvalho Nara e Marcia Barbosa, que como diriam Renato

e Elis não posso culpá-los por tudo, afinal são crianças como eu e apesar de tudo que eu

faça eu sou como vocês. Pai sua visita foi muito importante.

Ao meu irmão, Carlos Eduardo Barbosa, que eu nunca vou saber como agradecer por

tudo que faz e é pra mim. Você não tinha obrigação nenhuma em assumir tantas funções

na minha vida e ainda assim faz sem se quer reclamar.

A minha vó Odete Elísio de Carvalho, minha tia Maria Cristina Alves Correa, meu tio

Pedro Alves Correa e minhas primas Camila Alves Correa, Beatriz Alves Correa e Heloiza

Alves Correa por serem a minha concepção de família. Na verdade o que vocês fizeram e

fazem por mim vai muito além do que a maioria das famílias são capazes e eu espero

poder um dia retribuir tudo.

À Livia Pires Martins Kaique, Ana Luiza Morati Receputi, Georgia Felix e Nair Hidelgard

que fizeram a minha estadia na cidade muito melhor e foram capazes de me deixar feliz

por estar em São Mateus. A companhia e o apoio de vocês fez toda a diferença nesses

últimos 2 anos, eu sei que não sou uma pessoa nem um pouco fácil de lidar, mas vocês

foram ótimas comigo, praticamente uma família. Ouviram todos os desabafos, me

VII

aguentaram bêbada, me alegraram, me acompanharam, me ajudaram muito e inclusive

cuidaram das minhas filhas. Definitivamente sem vocês eu talvez não teria conseguido

viver tanto tempo aqui.

À Luciana Cristina Raimundo de Souza e Vinicius Oliveira de Souza por terem sido a

melhor coincidência desses meus dois últimos anos e terem me acolhido como parte da

família inúmeras vezes. Se me perguntarem as melhores coisas de São Mateus vou logo

pensar em vocês.

Ao Raul Barbosa por aguentar todas as minhas lamurias, me fazer companhia mesmo

que por whatsapp e principalmente por ter me suportado e ainda cuidado de mim no dia

em que descontei todos os problemas no álcool.

Ao Sem Chance por não desistir de mim nesses dois últimos anos, atender minhas

ligações e me ligar pra conversar por horas e me deixar muito mais leve.

Aos amigos Darlan Storto, Ema, Franciele Vieira Sluminski, Jamille Oliveira, Nhanha,

Sayão, Thalissa Whertheimer, Valdemir e Wilson que na medida do possível se

mantiveram presentes nesses últimos anos independente da distância. Todos os

esforços de vocês para passarem mesmo que apenas alguns minutos comigo foram

muito importantes. E Jamille, desculpa, nunca vou conseguir retribuir a sua visita.

VIII

Sumário

Introdução Geral ................................................................................................................................ 3

Capítulo I - Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua relação

filogenética com o gênero .................................................................................................................. 7

Introdução ..................................................................................................................................... 7

Material e Métodos ....................................................................................................................... 9

Amostragem .............................................................................................................................. 9

Extração do DNA .......................................................................................................................10

Amplificação e sequenciamento do DNA ...................................................................................10

Alinhamento das sequências .....................................................................................................11

Análises de diversidade, estruturação e parâmetros filogenéticos .............................................12

Resultados ....................................................................................................................................14

Amplificação e sequenciamento ................................................................................................14

Stenella clymene no Brasil .........................................................................................................15

Stenella clymene no Atlântico ....................................................................................................18

Stenella clymene e o gênero ......................................................................................................20

Discussão ......................................................................................................................................29

Amplificação e Sequenciamento ................................................................................................29

Stenella clymene no Brasil .........................................................................................................29

Stenella clymene no Atlântico ....................................................................................................30

Stenella clymene e o gênero ......................................................................................................31

Conclusões ....................................................................................................................................33

Referências Bibliográficas ..............................................................................................................34

Anexos ..........................................................................................................................................40

Anexo I - Protocolo de extração de DNA utilizando solução salina Bruford et al. (1992). ............40

Anexo II - Protocolo de extração de DNA com resina Chelex. .....................................................41

Anexo III - Protocolo de extração de DNA de sangue adaptado de Montgomery and Sise (1990) e

Di Pietro et al. (2011). ...............................................................................................................41

Anexo IV - Protocolo de extração de DNA com fenol/clorofórmio o de Sheppard et al. (1992). ..42

Anexo V - Protocolo de extração de DNA para amostras em formol adaptado de Mesquita

(2001). ......................................................................................................................................43

IX

Lista de tabelas

TABELA 1: AMOSTRAS DE STENELLA CLYMENE PROVENIENTES DE DIFERENTES REGIÕES DO LITORAL DO NORDESTE

BRASILEIRO. ................................................................................................................................... 9 TABELA 2: ESPÉCIES DO GÊNERO STENELLA E NÚMERO DE SEQUÊNCIAS (N) DE DNAMT REGIÃO D-LOOP, COI E CYT B

OBTIDAS NO GENBANK. ...................................................................................................................11 TABELA 3: RESULTADO DA AMPLIFICAÇÃO E O SEQUENCIAMENTO DOS MOLECULARES D-LOOP, COI, CYT B; AMOSTRAS

APENAS AMPLIFICADAS (A) E AMOSTRAS SEQUENCIADAS (X). ...................................................................14 TABELA 4: DIVERSIDADE HAPLOTÍPICA (H) E NUCLEOTÍDICA (Π), PARES DE BASES (PB), SÍTIOS POLIMÓRFICOS (SP) E

TRANSIÇÕES E TRANSVERSÕES PARA STENELLA CLYMENE. ........................................................................15 TABELA 5: DIVERSIDADE HAPLOTÍPICA (H) E NUCLEOTÍDICA (Π), PARES DE BASES (PB), SÍTIOS POLIMÓRFICOS (SP) E

TRANSIÇÕES E TRANSVERSÕES DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO ............................................18

X

Lista de figuras

FIGURA 1: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL PARA A REGIÃO D-LOOP (A), COI

(B), CYT B (C) E CONCATENADO (D) DO DNA MITOCONDRIAL. ...................................................................... 17

FIGURA 2: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO PARA A REGIÃO D-

LOOP (A), COI (B), E CYT B (C) DO DNA MITOCONDRIAL. ............................................................................. 19

FIGURA 3: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DO GÊNERO STENELLA PARA A REGIÃO D-LOOP (A), COI (B), E CYT B

(C) DO DNA MITOCONDRIAL, INCLUEM-SE INDIVÍDUOS DE DELPHINUS DELPHIS E TURSIOPS TRUNCATUS. ........... 22

FIGURA 4: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS

ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO D-LOOP DO DNA

MITOCONDRIAL. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO

VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS

INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE............................................................................ 23

FIGURA 5: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS

ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO COI DO DNA

MITOCONDRIAL. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO

VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS


FIGURA 6: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM

INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO CYT B DO DNA MITOCONDRIAL. VALORES À

ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE BOOTSTRAP,

SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS INDIVÍDUOS EXTERNOS

AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ........................................................................................................... 25

FIGURA 7: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO,

INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A

REGIÃO D-LOOP. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA

AO VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO

OS INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ...................................................................... 26

FIGURA 8: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO,

INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA.

VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE

BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS


FIGURA 9: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE

SEU GÊNERO, INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE

VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO CYT B. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A

POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%.

DESTACAM-SE EM VERMELHO OS INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ........................... 28

1

Resumo

As informações existentes sobre Stenella clymene são escassas, principalmente

relacionadas à genética da espécie, por conta disso encontra-se classificada como

“dados deficientes” pela lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN. O que dificulta

estudos com a espécie é que, por esta possuir uma distribuição restrita a áreas

profundas das regiões tropicais e temperadas do Oceano Atlântico, seus avistamentos e

encalhes não são frequentes. Dos poucos estudos genéticos já realizados,

questionamentos surgiram quanto à posição da espécie no gênero, bem como a

hipótese de S. clymene ter uma origem híbrida. O presente estudo analisou as regiões

citocromo oxidase I (CoI), citocromo b (Cyt b) e região controle (D-loop) do DNA

mitocondrial de indivíduos do nordeste do Brasil, comparando-os com sequências da

subfamília Delphininae disponíveis no Genbank. Os indivíduos do Brasil apresentaram

uma alta diversidade genética e provavelmente constituem uma mesma unidade

populacional. Ademais, foi encontrada uma diferenciação significativa e altos valores no

nível de FST entre as unidades populacionais de S. clymene do Atlântico Norte e Atlântico

Sul. Entre as unidades populacionais do Atlântico Sul e Golfo do México a diferenciação

foi significativa, mas o valor no nível de FST foi baixo; além disso, a rede haplotípica e a

recuperação filogenética indicam que provavelmente existe uma conectividade entre as

duas populações. Quanto à reconstrução filogenética por região mitocondrial, para D-

loop S. clymene se apresentou parafilético e grupo irmão do clado composto por

Stenella coeruleoalba, Delphinus delphis e Stenella frontalis, enquanto para a região CoI

e Cyt b S. clymene foi polifilético e grupo irmão de S. coeruleoalba.

Palavras-chave: Citocromo b, citocromo oxidase I, diversidade genética, D-loop,

Golfinho-de-Clymene.

2

Abstract

The existing information concerning Stenella clymene are scarce specially when

considering genetic approaches, which leads to the IUCN red list of threatened species

classification as “data deficient”. In many circumstances, molecular studies are difficult

as sightings and stranding events are infrequent due the restricted distribution of S.

clymene in tropical and temperate deep waters of the Atlantic Ocean. The former

studies raised up questions regarding the species position in the genera and a

hypothesis that S. clymene has a hybrid origin. The present study analyzed the

cytocromo oxidase I (CoI), cytocromo b (Cyt b) and control region (D-loop) of the

mitochondrial DNA of northeastern Brazil individuals comparing them with Delphininae

sequences obtained from Genbank. Brazilian individuals showed a high genetic diversity

and they probably constitute the same population unit. A significant differentiation and

high values in the level of FST was found between population units of North Atlantic and

South Atlantic Ocean. Between the population units of South Atlantic and Mexican Gulf

the differentiation was significant, but FST value was low, in addition the haplotype

network and the phylogenetic recovery suggest a connectivity between the two

populations. Moreover, in the phylogenetic reconstruction for D-loop region S. clymene

is paraphyletic and sister group of Stenella coeruleoalba, Delphinus delphis e Stenella

frontalis clade, while for CoI and Cyt b regions S. clymene is polyphyletic and sister

group of S. coeruleoalba.

Key-words: Clymene dolphin, cytocromo b, cytocromo oxidase I, D-loop, genetic

diversity.

3

Introdução Geral

Stenella clymene está classificada na ordem Cetartiodactyla, dentro da

infraordem Cetacea, parvordem Odontoceti, família Delphinidae, subfamília

Delphininae (Rice 2009). Incluída no grupo dos odontocetos, Stenella clymene,

comumente conhecida por golfinho-de-Clymene1, foi descrita pela primeira vez por

Gray (1846) como Delphinus metis. O mesmo em 1850 retificou a descrição e a

renomeou como Delphinus clymene. O nome Stenella clymene foi utilizado pela

primeira vez por Hershkovitz (1966), mas somente em 1981 Perrin et al. (1981)

reconheceram como uma espécie válida ao redescrevê-la.

A espécie é relativamente pequena (190 cm), pesando cerca de 80kg (Jefferson

et al. 1995), e possui um padrão tricolor com o dorso cinza escuro, as laterais cinza claro

e o ventre branco, sendo característica marcante para o diagnóstico da espécie um

“bigode” no dorso de seu rostro (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Jefferson

1996; LeDuc et al. 1999; Jefferson et al. 2003; Jefferson 2009). Stenella clymene pode

ser facilmente confundida com Delphinus delphis Linnaeus, 1758, Stenella attenuata

Gray, 1846 e Stenella longirostris Gray, 1828, principalmente considerando o fato que

muitas vezes utilizam o mesmo habitat (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Moreno

et al. 2005; Weir 2006; Jefferson 2009), mas também já foi confundida com Stenella

frontalis Cuvier, 1829 e Stenella coeruleoalba Meyen, 1833 (Perrin et al. 1981).

Estudos sobre a alimentação de S. clymene realizados nos Estados Unidos

sugerem que a espécie tem hábitos noturnos e/ou em águas mesopelágicas com uma

dieta de cardumes de peixes pequenos (10-15 cm), que inclui principalmente as famílias

Myctophidae, Argentinidae e Bregmacerotidae (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 2009).

No Golfo do México foi observado comportamento de alimentação cooperativa entre os

indivíduos (Fertl e Wursig 1995) e existem inclusive relatos de grupos de S. clymene

1 Os principais nomes populares de Stenella clymene utilizados na língua portuguesa são golfinho clímene, golfinho-de-Clymene e golfinho-fiandeiro-de-bico-curto, optou-se o uso do segundo em acordo com Perrin et al. (1981).

4

associados à grupos S. longirostris na região da Flórida, Caribe e Golfo do México

(Jefferson et al. 1995; Fertl et al. 2003).

Na maioria das avistagens da espécie os indivíduos estavam em grupos de

tamanho pequeno e em grupos com cerca de 200 indivíduos (Perrin et al. 1981; Mullin

et al. 1994; Fertl e Wursig 1995; Weir 2006). Os golfinhos-de-Clymene comumente

acompanham embarcações (Mullin et al. 1994) e apresentam comportamento aéreo, ás

vezes com saltos de rotação em torno do próprio eixo corporal (Mullin et al. 1994), o

que favorece possíveis confusões de identificação com S. longirostris, que realiza o

mesmo tipo de comportamento.

S. clymene tem sua distribuição restrita à regiões tropicais e ocasionalmente

utiliza águas quentes das regiões temperadas (Davis et al. 1998; Weir 2006).

Considerada uma espécie oceânica (Perrin et al. 1981; Mullin et al. 1994), pode ser

encontrada em áreas mais profundas (de 44 até 4.500 m) com circulação ciclônica ou

confluente (Davis et al. 1998; Weir 2006). No Oceano Atlântico está geralmente

associada à Corrente do Brasil, que possui águas quentes, de modo que não existem

registros da espécie além da região extremo sul do Brasil ou em águas argentinas e

uruguaias (Fertl et al. 2003). Essa distribuição restrita implica em uma maior

vulnerabilidade a impactos que as demais espécies com distribuição pantropical ou

cosmopolita (Frankham et al. 2008). E de acordo com a lista vermelha de espécies

ameaçadas da IUCN (2012), S. clymene se encontra como “dados deficientes” (DD).

Nos poucos estudos já desenvolvidos relacionados à genética da espécie, alguns

questionamentos foram apontados quanto ao posicionamento da espécie no gênero

Stenella. O primeiro desses estudos analisou o cariótipo de S. clymene (2n = 44), que

apresentou o padrão das bandas C e G morfologicamente similar ao de S. frontalis

(Arnason 1980). Uma parte de seu Citocromo b (Cyt b) foi sequenciada para um estudo

da relação filogenética da família Delphinidae, constatando que dentro do gênero

Stenella, S. clymene estava mais próxima à S. coeruleoalba (LeDuc et al. 1999). Além

disso, LeDuc et al. (1999) sugeriram que o gênero Stenella seria na verdade um

agrupamento artificial, uma vez que apresenta alguns indivíduos mais próximos de

Tursiops, Delphinus, Sousa ou Lagenodelphis. E, recentemente, em um estudo de Cyt b

e DNA nuclear foi levantada a hipótese de S. clymene ter sua origem de um hibridismo

entre S. longirostris e S. coeruleoalba (Amaral et al. 2014).

5

Além das incongruências quanto às análises de DNA mitocondrial (DNA) e DNA

nuclear, as espécies dentro do gênero Stenella possuem características craniais

complexas, o que cria um problema na hora de posicioná-las no gênero e até mesmo

dentro da subfamília (Perrin et al. 1981; McGowen et al. 2008; Kingston et al. 2009;

Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009).

A hibridização geralmente resulta de uma rápida radiação, na qual as barreiras

intrínsecas que evitariam o fluxo gênico entre espécies não são desenvolvidas por conta

do curto espaço de tempo (Seehausen 2004). Além disso, a divergência entre filogenias

de DNA mitocondrial e DNA nuclear, a distribuição incompleta das linhagens, as dúvidas

de posicionamento de táxons e um aumento na taxa de diversificação do grupo

sugerem que a subfamília Delphininae tenha surgido de uma radiação rápida (Kingston

et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009; Slater et al.

2010; Amaral et al. 2012).

A opção pela análise do genoma mitocondrial em diversos estudos se deve ao

fato deste ser relativamente fácil de ser amplificado, justamente por: aparecer nas

células em cópias múltiplas; nos animais se apresentar mais conservado, com poucas

duplicações, sem íntrons e pouquíssimas regiões intergênicas; ser bem variável em

populações naturais, devido sua elevada taxa mutacional, o que pode gerar sinais sobre

o histórico populacional em curtos espaços de tempo. Ainda que existam críticas ao uso

do DNA mitocondrial para estudos de diversidade genética e filogenia, ele ainda é o

marcador molecular de melhor custo benefício quando analisamos geneticamente uma

espécie para a qual não temos informação alguma. Além disso, o genoma mitocondrial

é mais eficaz em análises que utilizam amostras com DNA de baixa qualidade (Wan et

al. 2004; Frankham et al. 2008).

O DNA mitocondrial é uma região genômica haplóide, uma vez que sua herança

é estritamente materna e, portanto, não está sujeita aos mesmos padrões de

recombinação que a região autossômica (Wan et al. 2004; Frankham et al. 2008). Uma

das regiões mais variáveis no genoma mitocondrial é a região controle não-codificadora

denominada D-loop (displacement loop), que nos cetáceos apresenta um menor

número de deleções e inserções (Hoelzel et al. 1991). Para a maioria das espécies de

cetáceos as sequências do citrocromo oxidase I (CoI) são únicas, mas apesar de ser uma

ferramenta com potencial para o Barcode do grupo, o CoI não supera o sucesso

6

encontrado com sequências da região do citocromo b para cetáceos (Amaral et al.

2007; Viricel e Rosel 2012). O menor fragmento de Cyt b, comparado a um fragmento

de CoI duas vezes maior, apresenta o mesmo número de caracteres de diagnóstico para

membros de Stenella, Tursiops e Delphinus. Portanto, os menores fragmentos de Cyt b

são possivelmente uma opção melhor em relação aos fragmentos de CoI, mas a eficácia

da combinação de ambos os fragmentos ainda não foi relatada (Viricel e Rosel 2012).

Diante de todos os questionamentos em torno da espécie Stenella clymene,

estudos genéticos populacionais e filogenéticos tornam-se relevantes e necessários.

7

Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua

relação filogenética com o gênero2

Introdução

Stenella clymene encontra-se distribuída próximo à região equatorial do Oceano

Atlântico (Jefferson et al. 2003), podendo ser avistada no Brasil principalmente no

nordeste, percorrendo a costa brasileira de 3°S a 29°59’S, 050°07’W. Outras espécies do

gênero, como Stenella attenuata Gray, 1846 e Stenella longirostris Gray, 1828

apresentam uma sobreposição significativa de habitat com S. clymene em regiões de

águas profundas e quentes (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Moreno et al.

2005). Além de existir esta sobreposição sua identificação por observação é difícil, uma

vez que a espécie tem o corpo e extremidades em formato similares as demais espécies

do gênero (Jefferson et al. 2003).

Como S. clymene se restringe às águas quentes e temperadas do Oceano

Atlântico (Fertl et al. 2003), um possível isolamento reprodutivo entre populações

tornaria a espécie mais susceptível a impactos humanos, tais como capturas em redes,

atividades petrolíferas, excesso de ruídos na água, pesca desenfreada, entre outras

degradações ambientais (Frankham et al. 2008). Considerando que na lista vermelha de

espécies ameaçadas da IUCN, S. clymene está classificada dentre a categoria “DD”, ou

seja, com dados deficientes (IUCN, 2012) estudos focando a espécie são necessários,

principalmente quanto a sua estrutura populacional.

Análises envolvendo os polimorfismos existentes nas sequências de DNA entre

indivíduos de populações diferentes nos permitem explorar os processos evolutivos e

eventos demográficos das espécies (Nosil et al. 2009). Ademais, atualmente algumas

das ferramentas genéticas mais utilizadas para esse fim são os marcadores

mitocondriais, caracteristicamente haplóides por conta de sua herança exclusivamente

materna (Wan et al. 2004; Frankham et al. 2008), cujo padrão de herança os tornam

2 Optou-se pelo formato de artigo seguindo as normas da revista Conservation Genetics.

8

mais eficientes para análises que utilizam DNA de pouca qualidade, como no caso de

encalhes, que implicam no uso de fragmentos menores de DNA (Wan et al. 2004;

Frankham et al. 2008).

Estudos genéticos da espécie tornam-se necessários, pois atualmente existe a

hipótese de que Stenella clymene seja um híbrido de S. longirostris e S. coeruleoalba

Meyen, 1833 (Amaral et al. 2014) e ainda permanecem dúvidas quanto ao seu

posicionamento dentro do gênero Stenella e até mesmo em sua subfamília (Perrin et al.

1981; LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado

2008; Kingston et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009;

McGowen 2011).

É extremamente necessário esclarecer as questões filogenéticas de S. clymene

para adotar medidas adequadas de conservação da espécie, sendo assim o presente

estudo pretende enriquecer o conhecimento sobre a diversidade gênica de S. clymene

e sua estrutura populacional, bem como contribuir para o esclarecimento de seu

posicionamento filogenético no gênero.

9

Material e Métodos

Amostragem

Um total de 27 amostras de diferentes tecidos de Stenella clymene foram

utilizadas. Estas foram cedidas, em forma de parceria, pela Associação de Pesquisa e

Preservação de Ecossistemas Aquáticos (AQUASIS), pelo Instituto Mamíferos Aquáticos

(IMA) e Centro Mamíferos Aquáticos (ICMBio).

As amostras de tecidos foram removidas de animais encontrados encalhados

e/ou mortos em praias do litoral brasileiro. Dentre as 27 amostras, 12 são do litoral da

Bahia, seis do Ceará, quatro de Pernambuco, duas de Alagoas, duas de Sergipe e uma

da Paraíba (Tabela 1).

Tabela 1: Amostras de Stenella clymene provenientes de diferentes regiões do litoral do nordeste

brasileiro.

Registro Localidade Sexo Ano de coleta Amostra Conservação

Scl 1 Bahia Fêmea 2001 Ovário Formol

Scl 2 Bahia Fêmea 2003 Coração Álcool

Scl 3 Bahia Fêmea 2003 Fígado Álcool

Scl 4 Bahia Fêmea 2006 Ovário Álcool

Scl 5 Bahia Macho 2006 Fígado Álcool

Scl 6 Bahia Fêmea 2007 Coração Álcool

Scl 7 Bahia Fêmea 2007 Pele Álcool

Scl 8 Bahia Fêmea 2008 Músculo Álcool

Scl 9 Ceara Macho 2008 Pele Álcool




Scl 13 Ceara Macho 2012 Músculo Álcool

Scl 14 Ceara Fêmea 2009 Músculo Álcool

Scl 15 Bahia Fêmea 2006 Pele Álcool

Scl 16 Pernambuco Fêmea Não identificado Pele Formol

Scl 17 Alagoas Fêmea 2002 Músculo Formol

Scl 18 Bahia Fêmea 2003 Fígado Álcool

Scl 19 Bahia Macho 2000 Testículo Formol

Scl 20 Pernambuco Fêmea Não identificado Fígado Formol

Scl 21 Pernambuco Macho Não identificado Pele Formol

Scl 22 Paraíba Fêmea 2010 Baço Formol

Scl 23 Pernambuco Fêmea 2010 Fígado Formol

Scl 24 Sergipe Fêmea 2010 Músculo Formol

Scl 25 Bahia Fêmea 2010 Músculo Formol

Scl 26 Sergipe Macho 2010 Testículo Formol

Scl 27 Alagoas Macho Não identificado Fígado Formol

10

Extração do DNA

Foram realizados cinco protocolos de extração (Anexos I a V). Para as amostras

de tecidos musculares, que não apresentavam evidências de degradação e estavam

armazenadas em álcool, foi aplicado o protocolo de solução salina (Bruford et al. 1992)

(Anexo I). As amostras de tecidos epiteliais, sem sinais de degradação e armazenadas

em álcool, foram extraídas com a resina Chelex (Anexo II). Foi incluída uma amostra de

Stenella frontalis de tecido sanguíneo armazenado em EDTA para a qual foi utilizado um

protocolo adaptado de Montgomery e Sise (1990) e Di Pietro et al. (2011) (Anexo III).

Para as amostras de tecidos musculares, armazenadas em álcool, que apresentaram

degradação (tecido de coloração preta ou verde e/ou tecido desmanchando) utilizou-se

um protocolo de fenol-clorofórmio (Sheppard et al. 1992) (Anexo IV). Por fim, as

amostras de tecidos musculares e epiteliais que estavam conservadas em formol foram

extraídas com um protocolo adaptado por Mesquita et al. (2001) (Anexo V).

Uma vez extraído, o DNA foi quantificado por meio da espectrofotometria no

Nanodrop 2000 (Uniscience) utilizando-se 1 µl. Em seguida, este foi armazenado a –

20°C.

Amplificação e sequenciamento do DNA

Foram amplificadas três regiões do DNA mitocondrial: D-loop; Cyt b e CoI. A PCR

(Polymerase Chain Reaction) da região controle D-loop foi realizada com os primers de

Pichler et al. (2001). As reações foram conduzidas com um volume final de 12,5µl com

10-100 ng de DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 2 mM de MgCl2, 0,12 µM de cada

primer, 0,05 mM de dNTP e uma unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e o perfil

da PCR consistiu de 95°C por 1 min, 40 ciclos de 94°C por 30s, 54°C por 30s e 72°C por

30s e extensão final de 72°C por 5 minutos. Para a amplificação do citocromo b (Cyt b)

foram utilizados os primers de LeDuc et al. (1999) sendo as reações com um volume

final de 12,5µl com 10-100 ng de DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 1,52 mM de

MgCl2, 0,3 µM de cada primer, 0,04 mM de dNTP e uma unidade de Taq DNA

polimerase (Invitrogen) e o perfil da PCR foi de 94°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por

45s, 48°C por 45s e 72°C por 1 min e extensão final de 72°C por 5 minutos. E a

amplificação do citocromo oxidase I (Cox I) foi feita com os primers de Amaral et al.

(2007). As reações foram realizadas para um volume final de 12,5µl com 10-100 ng de

11

DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 1,52 mM de MgCl2, 0,3 µM de cada primer, 0,04

mM de dNTP e uma unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e o perfil da PCR foi

de 94°C por 2 min, 35 ciclos de 94°C por 45s, 52°C por 45s e 72°C por 1 min com

extensão final de 72°C por 8 minutos.

Os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose (1%) corado

com Gelred e então fotodocumentados. O produto total das PCRs (12,5 µl) foi

purificado adicionando-se a enzima Exonuclease I (10u/µl) e Shrimp alkaline

phosphatase (1u/ µl), Exo/Sap (1/1) e incubando-se a 37°C por 15 min e 80°C por 15

minutos. Em seguida, os fragmentos foram sequenciados, em ambas as direções

(forward e reverse), utilizando o Big Dye Terminator CycleSequencing Kit (Applied

Biosystems) e um sequenciador automático ABI3500 (Applied Biosystems).

Alinhamento das sequências

Além das sequências geradas, foram obtidas sequências do banco de dados do

Grupo de Estudo para Conservação de Mamíferos (GECOM), CEUNES - UFES e do

GenBanK (Tabela 2).

Tabela 2: Espécies do gênero Stenella e número de sequências (n) de DNAmt região D-loop, CoI e Cyt b

obtidas no Genbank.

Espécie Localidade

D-loop CoI Cyt b

n GenBank n GenBank n GenBank

Stenella

attenuata

Atlântico 10 GQ504120-247,

GQ504126-307 6

EU496336-3911,

EU49635311,

EU55709612

4

AF0840968,

X925253,

EF0930305,

X562946,

Pacifico 1 AF0840978

Stenella

coeruleoalba Atlântico 10

GQ5041497,

GQ504152-537,

GQ504158-607,

GQ504162-647

10

EF090640-441,

EU496341-4411,

KF28169510

10 KF692007-112,

KF692014-172

Stenella

clymene Atlântico 20

Scl6*, Scl9*,

Scl11-14*,

Scl16*, Sc21*,

DQ845446-477,

GQ504137-487

14 Scl6-14*, Scl17*,

EU496346-488 22

Scl6-7*,

Scl9-14*, Scl17*,

EU517711-128,

AF08408311,

KF6919582,

KF691985 -912,

KF691994-952,

KF692012-132

12

Stenella

frontalis

Cuvier, 1829

Atlântico 7

Sfr697*

KC204733-354,

KC204737-384,

KC2047404,

EF6828199

10

EU49634011,

EU496349-5211,

EU49635411,

EF5687141,

EF090645-461

KF28169610

5

AF084089-908,

EU517713-1411,

EU12109211

Stenella

longirostris

Atlântico 10 Banco de dados

do GECOM

10 Banco de dados

do GECOM

10 KF691972-752,

KF6919772,

KF691979-832

Total de

sequências

57 50 52

Referências: 1Amaral et al. 2007;2Amaral et al. 2014, 3Arnason e Gullberg 1996; 4Caballero et al. 2013, 5Harlin-

Cognato e Honeycutt 2006; 6Irwin e Arnason 1994;7Kingston et al. 2009; 8LeDuc et al. 1999; 9Quérouil et al. 2010;

10Alfonsi et al. 2013; 11Viricel e Rosel 2012; 12Xiong et al. (2009); Grupo de Estudos para Conservação de Mamíferos

(GECOM) .* presente estudo

As sequências foram alinhadas com o algoritmo MUSCLE (Robert 2004) por meio

do programa MEGA v.6 (Kumar et al. 1994; Tamura et al. 2013), no qual estas também

foram manualmente editadas. Para confirmação das espécies, todas as sequências

foram submetidas a uma comparação com outras depositadas no banco de dados do

GenBank e do DNA Surveillance (Ross et al. 2003).

Análises de diversidade, estruturação e parâmetros filogenéticos

Por meio do programa Arlequin v.3.5 (Excoffier et al. 2005) calcularam-se os

componentes de variância, incluindo as diversidades haplotípica (H) e nucleotídica (π),

além da Análise de Variância Molecular (AMOVA) entre as diferentes localidades,

baseada no FST com 1000 permutações (Nei 1987).

As redes de haplótipos foram construídas com cálculos de Median Joining no

programa Network (Bandelt et al. 1999) e nomearam-se os haplótipos de acordo com a

espécie e o código identificação de cada indivíduo (para as amostras do GenBank foram

utilizados os últimos dígitos). Para as análises apenas com os indivíduos do Brasil, foi

possível realizar um concatenado das três regiões mitocondriais. Para as análises com

indivíduos de outras localidades, foram realizados testes de estruturação considerando-

se três localidades: norte do Oceano Atlântico (AN), Golfo do México (GM) e o sul do

Oceano Atlântico (AS).

13

Para as inferências filogenéticas obteve-se o melhor modelo evolutivo para cada

região do gene mitocondrial (D-loop: HKY+I+G; CoI: HKY+I+G; Cyt b: GTR+I+G) através

do programa JModeltest v2.1.6 (Guindon and Gascuel 2003; Darriba et al. 2012),

utilizando o teste AKAIKE information content (AIC).

No programa BEAST v.1.8.1 (Drummond et al. 2012) foram realizadas as análises

de inferência bayesiana para a reconstrução filogenética. O número de gerações para o

método da cadeia de Monte Carlo Markov (MCMC) estabelecido foi de 10.000.000 com

burning value foi de 1.000. E na plataforma PhyMl v3.0 (Guidon et al. 2003) realizarem-

se as análises de máxima verossimilhança com 1.000 de bootstrap.

A construção das árvores filogenéticas foi realizada no programa FigTree v.1.4.2

(Rambaut 2009), permanecendo os valores de probabilidade a posteriori acima de 0,5

de suporte e valor de bootstrap superior a 500.

Optou-se utilizar como outgroup para D-loop indivíduos de Pontoporia blainvillei

(GenBank: KF270692) e Sotalia guianensis Van Beneden, 1875 (GenBank: KF571740),

para CoI e Cyt b Megaptera novaeanglia Borowski, 1781 (GenBank: AP006467),

Pontoporia blainvillei Gervais e D’orbigny, 1844 (GenBank: respectivamente EU496358 e

AF334488) e Sotalia guianensis (GenBank: respectivamente JF681039 e KJ879248). E

uma vez que existem incongruências dentro da subfamília Delphininae, para as análises

do gênero foram incluídas sequências do GenBank de Delphinus delphis Linnaeus, 1758

(D-loop: EU365132, EU365134-41; CoI: DQ465991-98, EF090638-39; Cyt b: DQ378144-

49, DQ378151-53, DQ378159) e Tursiops truncatus Montagu, 1821 (D-loop: KF650828-

36; CoI: DQ466010-15, EU496324-28; Cyt b: AF084093-95, EF093029, DQ466025-29).

Estes são os dois gêneros que geralmente nos estudos filogenéticos estão relacionados

com Stenella (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-

Collado 2008; Möller et al. 2008; Kingston et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et

al. 2009; Charlton-Robb et al. 2011; McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al.

2014).

14

Resultados

Amplificação e sequenciamento

Do total de 27 amostras, foram obtidas sequências de oito indivíduos para a

região D-loop, dez para a região citocromo oxidase I e nove para a região citocromo b

(Tabela 3).

Tabela 3: Amplificação e sequenciamento dos fragmentos das regiões D-loop, CoI, Cyt b; amostras apenas amplificadas (A) e amostras sequenciadas (X).

Sequenciamento

Registro D-loop CoI Cyt b

Scl 1 A

Scl 2 A

Scl 3

Scl 4

Scl 5 A

Scl 6 x x x

Scl 7 x x

Scl 8 x

Scl 9 x x x

Scl 10 x x

Scl 11 x x x

Scl 12 x x x

Scl 13 x x x

Scl 14 x x x

Scl 15

Scl 16 x A

Scl 17 A x x

Scl 18

Scl 19

Scl 20 A A

Scl 21 x A

Scl 22

Scl 23 A

Scl 24

Scl 25

Scl 26

Scl 27 A

15

Sete amostras amplificaram, porém não resultaram em uma sequência com

qualidade (cinco apresentaram picos pouco definidos e duas amplificaram

pseudogenes). Além disso, cinco eram amostras conservadas em formol. Duas destas

devem ter sido armazenadas em estágio avançado de decomposição, pois

apresentavam uma coloração esverdeada.

Stenella clymene no Brasil

Todas as regiões mitocondriais apresentaram uma alta diversidade haplotípica,

sendo que essa variou de 0,98 para CoI e Cytb a 1,0 para D-loop. A diversidade

nucleotídica variou de 0,006, quando os marcadores estavam concatenados, a 0,0261

para CoI (Tabela 4).

Para se verificar uma possível estruturação entre os indivíduos do Brasil foi

realizada a AMOVA e a análise de distância genética considerando-se as unidades

amostrais (Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco e Sergipe) como unidades populacionais.

Os resultados obtidos não foram significativos entre nenhuma localidade para nenhuma

das regiões mitocondriais (Dloop: FST-= 0,29/p=0,9; CoI: FST =-0,25/p=0,7; Cytb: FST =

0,25/p=0,12).

Tabela 4: Diversidade haplotípica (H) e nucleotídica (π), pares de bases (pb), sítios polimórficos (sp) e transições e transversões para todos os indivíduos de Stenella clymene analisados.

n pb Sp Transições Transversões H π

D-loop 8 356 14 11 3 1,0 +/-0,1 0,0133 +/-0,0

CoI 10 746 61 51 12 0,98 +/-0,0 0,0261 +/-0,0

Cytb 9 948 28 24 4 0,98 +/-0,1 0,007 +/-0.0

Concatenado

CoI/Cytb/D-loop

6 2052 32 27 5 1,0 +/-0,6 0,006 +/-0,0

Para a região D-loop o indivíduo Scl 11 apresentou maior distância em relação

aos demais: nove passos mutacionais (Figura 2A). Já para a região CoI os indivíduos Scl

10 e Scl 08 apresentaram maior distância em relação aos demais (33 passos

mutacionais), sendo que Scl 08 se encontra a 15 passos mutacionais de Scl 10 (Figura

2B). E para a região Cyt b o indivíduo Scl 10 apresentou 12 passos mutacionais em

relação aos demais, o Scl 17 mais de 50 passos mutacionais e Scl 07 mais de 100 (Figura

2C). No concatenado temos novamente o indivíduo Scl 11 pelo menos 13 passos

16

distantes dos demais (Figura 2D).

17

Figura 1: Rede de haplótipos dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil para a região D-loop (A), CoI (B), Cyt b (C) e Concatenado (D) do DNA mitocondrial.

A

B

D

C

18

Stenella clymene no Atlântico

Para as análises de estruturação populacional no Oceano Atlântico adotou-se a

divisão das unidades populacionais pelas localidades em norte e sul. Como a análise de

FST para o marcador Cyt b resultou em uma maior distância intrapopulacional (FST =

0,92/p=0,04) que interpopulacional (FST = 0,08/p=0,04), para essa região mitocondrial

optou-se por dividir os indivíduos entre as localidades norte, sul e Golfo do México,

considerando todos os indivíduos de Amaral et. al (2014) como a unidade populacional

do Golfo do México.

Para a região D-loop, ambas as localidades, AN e AS, apresentaram uma

diversidade gênica de 1,0 e nucleotídica de 0,02. Já para a região do CoI a diversidade

gênica variou de 0,99 para o AS a 1,0 para o AN e uma baixa diversidade nucleotídica de

0,0042 para o AN a 0,0234 para o AS. E quanto à região do Cyt b, a diversidade gênica

variou de 0,83 para o GM a 1,0 para o AS; e a nucleotídica de 0,006 para o AS a 0,0128

para o GM (Tabela 5).

Tabela 5: Diversidade haplotípica (H) e nucleotídica (π), pares de bases (pb), sítios polimórficos (sp) e transições e transversões de Stenella clymene do Oceano Atlântico

n pb Sp H π

D-loop AS 8 400 14 1,0 +/-0,02 0,02 +/-0,01

AN 14 400 24 1,0 +/-0,02 0,02 +/-0,01

CoI AS 10 636 44 0,99 +/-0,04 0,0234 +/-0,1

AN 3 636 4 1,0 +/-0,27 0,0042 +/-0,01

Cytb AS 9 783 19 0,97 +/-0,06 0,006 +/-003

AN 3 783 11 1,0 +/-0,27 0,0112 +/-0,001

GM 12 783 51 0,83 +/-0,08 0,0128 +/-0,007

Na AMOVA, os resultados foram significativos entre todas as localidades para

todas as regiões mitocondriais D-loop, FST= 0,88 (p = 0,00), CoI, FST = 0,70 (p = 0,00) e

Cyt b, FST= 0,86 (p = 0,00), sendo que para o Cyt b os valores de FST entre AN e AS (FST=

0,96/p = 0,00) e entre AN e GM (FST= 0,93/p = 0,00) foram maiores do que entre AS e

GM (FST = 0,11/p = 0,00).

Na rede de haplótipos de D-loop, CoI e Cyt b podemos notar um padrão de

distribuição que corrobora os resultados de estruturação populacional entre as

localidades norte e sul do Oceano Atlântico (Figura 2). Nota-se que para Cyt b, apesar

das localidades AS e GM se encontrarem separadas, existem indivíduos mantendo a

conexão entre elas.

19

Figura 2: Rede de haplótipos dos indivíduos de Stenella clymene do Oceano Atlântico para a região D-loop (A), COI (B), e Cyt b (C) do DNA mitocondrial.

20

Stenella clymene e o gênero

Nas redes de haplótipos do gênero, incluindo D. delphis e T. truncatus pode-se

notar uma evidente separação entre as espécies, todavia D. delphis e T. truncatus estão

dentro do gênero Stenella, resultados esses congruentes para os três marcadores

moleculares (Figura 3).

Para a região D-loop S. clymene encontra-se mais próxima de S. frontalis e em

ambos os agrupamentos são encontrados indivíduos de D. delphis (Figura 3A). Quanto a

região CoI temos S. clymene próxima de S. coeruleoalba, mas os indivíduos Scl 10 e Scl

08 de S. clymene estão próximos do indivíduo Ttr 15, T. truncatus, estando esses três

indivíduos distantes dos demais agrupamentos (Figura 3B). Para a região Cyt b, S.

clymene também se encontra próxima de S. coeruleoalba, mas um indivíduo de S.

clymene (GM 58) está agrupado com S. longirostris (Figura 3C).

Nas análises de recuperação filogenética para os três marcadores moleculares

do gênero Stenella, quando considerados apenas os indivíduos de S. clymene do Brasil,

foram recuperadas como monofiléticas as espécies S. attenuata, S. frontalis e S.

longirostris, contudo S. clymene foi recuperada como monofilética apenas para D-loop e

S. coeruleoalba somente para Cyt b. Além disso, temos S. frontalis como grupo irmão do

clado S. clymene e S. Coeruleoalba, com exceção para D-loop em que S. clymene é grupo

irmão do clado S. coeruleoabla e S. frontalis. (Figuras 4, 5 e 6).

Para a região D-loop, a árvore de verossimilhança foi discordante da árvore

bayesiana e apresentou baixos suportes para os valores de bootstrap. Como não

contribuiria para as discussões, optou-se por ilustrar apenas a árvore bayesiana. Nessa

destaca-se o fato de que S. coeruleoalba não é monofilética, pois três de seus indivíduos

formam um grupo irmão de S. clymene (Figura 4). Na árvore de CoI S. coeruleoalba não

apresenta-se monofilética, pois dois de seus indivíduos formam um grupo irmão de S.

clymene. O mesmo ocorre com S. clymene, pois dois indivíduos estão em ramos

externos a todos os demais (Figura 5). E para Cyt b, S. clymene não é monofilética, uma

vez que um de seus indivíduo está em um ramo externo ao agrupamentos de S. clymene

e S. coeruleoalba (Figura 6).

Na relação filogenética recuperada do gênero, considerando os indivíduos de S.

clymene do Oceano Atlântico e incluindo D. delphis e T. truncatus, as principais

mudanças devem-se à inclusão de D. delphis e T. truncatus (Figuras 7, 8 e 9). Nessas

21

análises foram recuperadas como monofiléticas as espécies S. attenuata, S. frontalis e S.

longirostris. Entretanto S. clymene foi recuperada como monofilética apenas para D-

loop e S. coeruleoalba somente para Cyt b, enquanto D. delphis não foi recuperada

como monofilética apenas para D-loop e T. truncatus para CoI.

Para o marcador D-loop, D. delphis torna-se mais próxima de S. coeruleoalba do

que S. frontalis e as três são grupo irmão de S. clymene. Além disso, S. coeruleoalba não

é monofilética, pois os mesmos três indivíduos permanecem como grupo irmão de S.

clymene. D. delphis também não se mostrou monofilética, uma vez que um de seus

indivíduos está dentro do clado de S. clymene e outro indivíduo c está dentro do clado

de S. frontalis (Figura 7).

Na árvore de CoI, S. clymene permanece próxima de S. coeruleoalba, mas S.

frontalis encontra-se próxima de D. delphis e mais próxima de T. truncatus do que de S.

clymene e S. coeruleoalba. Ademais, junto aos dois indivíduos de S. coeruleoalba que

formam um grupo irmão de S. clymene encontra-se um indivíduo de D. delphis. E S.

clymene não é monofilética, pois os indivíduos da localidade norte do Oceano Atlântico

formam um grupo irmão do clado S. clymene e S. coeruleoalba. Junto aos dois

indivíduos de S. clymene que estão em ramos externos a todos os demais, encontra-se

um indivíduo de T. truncatus (Figura 8).

Já para Cyt b, permanecem as relações entre S. clymene, S. coeruleoalba e S.

frontalis, mas D. delphis e T. truncatus tornam-se mais próximas desse agrupamento do

que S. longirostris e S. attenuata. S. clymene não se mostrou monofilética já que um

indivíduo do Golfo do México encontra-se junto ao indivíduo do Brasil que está fora do

clado, e um indivíduo do Golfo do México encontra-se dentro do clado de S. longirostris.

Além disso dois indivíduos da localidade norte do Oceano Atlântico estão em ramos

externos a todas as demais espécies (Figura 9).

22

Figura 3: Rede de haplótipos dos indivíduos do gênero Stenella para a região D-loop (A), COI (B), e Cyt b (C) do DNA mitocondrial, incluem-se

indivíduos de Delphinus delphis e Tursiops truncatus.

23

Figura 4: Relação filogenética recuperada dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência

Bayesiana e de Verossimilhança para a região D-loop do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a

posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos

externos ao agrupamento de sua espécie.

24

Figura 5: Relação filogenética recuperada dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência

Bayesiana e de Verossimilhança para a região CoI do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a

posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos

ao agrupamento de sua espécie.

25

Figura 6: Relação filogenética de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência Bayesiana e de Verossimilhança

para a região Cyt b do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de

bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua

espécie.

26

Figura 7: Relação filogenética de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros

próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança para a região D-loop. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a

posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos

ao agrupamento de sua espécie.

27

Figura 8: Relação filogenética de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua espécie.

28

Figura 9: Relação filogenética recuperada de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança para a região Cyt b. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua espécie.

29

Discussão

Amplificação e Sequenciamento

A amplificação e o sequenciamento de algumas amostras ficaram

comprometidos e não foram incluídos nas análises, devido à qualidade das amostras.

Por tratar-se de uma espécie oceânica, com preferência por áreas mais profundas

(Davis et al. 1998; Fertl et al. 2003; Weir 2006), os eventos de encalhes são mais raros e,

quando ocorrem, geralmente os indivíduos encontram-se em estágio avançado de

decomposição. Outro fator de importante influência é a forma de armazenamento das

amostras, já que muitas amostras cedidas estavam conservadas em formol que não é o

reagente adequado para conservação de material para análises moleculares. De 15

amostras conservadas em formol e/ou de pouca qualidade, após testes e adaptações

em protocolos de extração, conseguiu-se incluir quatro destas amostras nas análises.

Stenella clymene no Brasil

As amostras de S. clymene do Brasil apresentaram alta diversidade haplotípica

para todos os marcadores testados; já a nucleotídica foi alta para os marcadores CoI e

D-loop, sendo esses resultados similares ao encontrado em estudos com outros

Delphinidae (Natoli et al. 2005; Adams and Rosel 2006; Amaral et al. 2007; Quérouil et

al. 2007; Caballero et al. 2013; Stockin et al. 2014). Uma baixa diversidade nucleotídica

(0,006) foi encontrada para o marcador Cyt b, diferente do obtido no estudo de (Amaral

et al. 2014) em que S. clymene apresentou diversidade nucleotídica de 0,012 para Cyt b.

Uma vez que se verificou compartilhamento de haplótipos entre diferentes

regiões e não foi possível constatar um padrão de estruturação geográfico, pode-se

dizer que os indivíduos das diferentes localidades do Brasil constituem uma mesma

unidade populacional. Esse resultado poderá ser confirmado aumentando-se o número

de indivíduos, uma vez que isso diminuiria as chances de viés nas estimativas de FST

(Kalinowski 2005).

Ademais, a baixa diversidade nucleotídica encontrada para o marcador Cyt b e a

existência de haplótipos mais distantes dos agrupamentos encontrados para todos os

marcadores sugerem a ocorrência de um evento de gargalo na população como o

30

relatado em outros estudos de cetáceos (Hoelzel et al. 2002; Hoelzel et al. 2007; Luca et

al. 2009).

Stenella clymene no Oceano Atlântico

As diversidades haplotípicas e nucleotídicas foram similares para todos os

marcadores e para todas as localidades, exceto para o CoI nas amostras do Atlântico

Norte que apresentou uma menor diversidade nucleotídica em relação ao Atlântico Sul.

Tal fato pode ser devido as poucas amostras disponíveis para a região do CoI do AN.

Todos os resultados obtidos para AMOVA, distâncias genéticas, redes de

haplótipos e recuperações filogenéticas evidenciam uma estruturação populacional

entre as localidades do Atlântico Norte e Atlântico Sul e entre Atlântico Norte e Golfo

do México. A unidade populacional AN apresentou um alto FST em relação as unidades

populacionais AS e GM, o que foi confirmado com as recuperações filogenéticas nas

quais encontram-se em clados distintos. Já entre a unidade populacional AS e GM

observa-se um baixo valor de FST, o qual é refletido nas distâncias de apenas um passo

mutacional entre os indivíduos das redes haplotípicas e nas árvores filogenéticas onde

os indivíduos dessas unidades populacionais estão no mesmo clado.

Adams e Rosel (2006) em um estudo de estruturação populacional de S. frontalis

também encontraram diferenciação entre as localidades do Atlântico Norte e Golfo do

México e sugeriram que a hipótese mais provável seria a influência da distribuição de

suas presas, as quais teriam sua dispersão limitada por barreiras como as correntes

oceânicas (Dowling e Brown 1993; Hoelzel 1994). A mesma hipótese se aplica para S.

clymene considerando a relação com a distribuição das presas já que as principais

seriam espécies mesopelágicas (Jefferson et al. 2003) que sofrem influência até mesmo

da estratificação vertical das massas de água (Davis et al. 1998).

Um fato interessante que deve ser destacado é que tanto nas análises das redes

haplotípicas quanto nas árvores filogenéticas quando a região do Cyt b foi analisada

considerando apenas o Brasil, o indivíduo Scl 10 encontrou-se mais distante dos demais,

e quando considerado o Oceano Atlântico o indivíduo Scl 10 aproximou-se do indivíduo

GM 95 (Figura 3). Uma hipótese para explicar tal resultado seria a existência de fluxo

gênico entre as unidades populacionais do AS e GM, já que é possível que ocorra uma

migração sazonal da unidade populacional de S. clymene do Atlântico Sul para a região

31

do Golfo do México. Tendo em vista que no estudo de Stramma et al. (1995) foi

verificado que durante a primavera austral na corrente do Norte do Brasil temos uma

corrente submarina de intensa velocidade nos 1000m superiores da coluna d’agua

(profundidade dentro do raio de preferência de S. clymene) que pode influenciar a

migração de fito e zooplâncton e por consequência a dos demais níveis tróficos,

principalmente de peixes mesopelágicos com migração vertical, os quais já foram

reconhecidos como presas de S. clymene (Jefferson et al. 2003).

Stenella clymene e o gênero

Para a recuperação filogenética do gênero Stenella, quando considerados

apenas os indivíduos de S. clymene do Brasil, temos tanto para a região CoI como para a

Cyt b S. clymene e S. coeruleoalba como espécies irmãs e S. frontalis a espécie

imediatamente mais próxima, resultado similar ao de todos os estudos filogenéticos

realizados com Cyt b (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e

May-Collado 2008; Möller et al. 2008; Mcgowen et al. 2009; Bilgmann et al. 2011;

McGowen 2011; Amaral et al. 2014). Já para a região D-loop, temos S. coeruleoalba e S.

frontalis como espécies irmãs e S. clymene a espécie mais próxima desse clado. O

agrupamento entre S. coeruleoalba e S. frontalis foi verificado no estudo de McGowen

(2011), para análises de DNA nuclear, nas quais S. clymene não estava inclusa. S.

clymene mostrou-se monofilética para a região D-loop, entretanto polifilética para as

regiões CoI e Cyt b, corroborando o verificado nas análises de Cyt b do estudo de

Amaral et al. (2014). Na árvore de D-loop temos S. coeruleoalba parafilética com

indivíduos dentro do clado de S. clymene, para CoI temos S. coeruleoalba polifilética

com indivíduos dentro do clado de S. clymene e S. frontalis, enquanto na árvore de Cyt

b é monofilética. O resultado obtido para CoI corrobora o encontrado por Amaral et al.

(2014).

Quanto à recuperação filogenética do gênero Stenella, considerado os indivíduos

de S. clymene do Oceano Atlântico e incluindo D. delphis e T. truncatus, os resultados

obtidos para D-loop, CoI e Cyt b incluem dentro do clado de Stenella as espécies D.

delphis e T. truncatus, o que corroboram as análises filogenéticas de Delphininae (LeDuc

et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado 2008; Möller et

32

al. 2008; Kingston et al. 2009; Steeman et al. 2009; Charlton-Robb et al. 2011;

McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al. 2014).

Para a região D-loop temos S. clymene como grupo irmão do clado S.

coeruleoalba, S. frontalis e D. delphis, resultados que diferem do observado

anteriormente por Charlton-Robb et al. (2011). Neste estudo S. clymene é grupo irmão

de T. aduncus, seguida de S. frontalis, e D. delphis é mais próxima de S. attenuata. Mas

essa diferença entre os resultados possivelmente ocorreu, pois o foco de Charlton-Robb

et al. (2011) eram os indivíduos do gênero Tursiops, de modo que utilizaram poucos

indivíduos dos gêneros Stenella e Delphinus.

Tanto para CoI quanto para Cyt b o clado S. clymene e S. coeruleoalba

permaneceu, independentemente da inclusão de D. delphis e T. truncatus. Tal dado é

corroborado por estudos prévios realizados com Cyt b (LeDuc et al. 1999; May-Collado

e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado 2008; Möller et al. 2008; McGowen 2011).

No atual estudo foi recuperado para a região CoI o clado S. frontalis e D. delphis,

seguido de T. truncatus. Enquanto para Cyt b, D. delphis e T. truncatus ficam

posicionadas entre o clado S. clymene, S. coeruleoalba e S. frontalis e o clado S.

longirostris. Esses resultados foram obtidos pela primeira vez no presente estudo

provavelmente porque foi utilizado um número de indivíduos por espécie superior ao

dos estudos anteriores (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e

May-Collado 2008; Möller et al. 2008; Kingston et al. 2009; Steeman et al. 2009;

Charlton-Robb et al. 2011; McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al. 2014).

Na recuperação filogenética para a região Cyt b temos apenas um indivíduo de S.

clymene dentro do clado de S. longirostris, diferente do encontrado por Amaral et al.

(2014), considerando que seus indivíduos de S. longirostris e S. clymene foram utilizados

nas análises do presente estudo. No estudo de Amaral et al. (2014) dois indivíduos de S.

clymene encontravam-se dentro do clado de S. longirostris, resultado que levantou a

hipótese de uma introgressão já que o estudo sugere que a espécie S. clymene tenha

uma origem hibrida de um cruzamento entre S. coeruleoalba e S. longirostris. Contudo,

o resultado aqui apresentado contradiz essa proposta de introgressão, uma vez que

demonstra que a inclusão de indivíduos de diferentes localidades aumentou a resolução

dos relacionamentos filogenéticos da espécie e fez com que seqüências analisada por

33

Amaral et al. (2014) fosse incluída no clado com indivíduos de Stenella clymene do

Atlântico Sul e não com outra espécie.

Conclusões

A partir deste estudo pode-se concluir que os indivíduos de S. clymene do Brasil

apresentam alta diversidade haplotípica e que constituem uma mesma unidade

populacional. Também é possível afirmar que no Oceano Atlântico existe uma unidade

populacional bem definida localizada na região norte e que provavelmente existe outra

unidade populacional que transita entre as localidades da região sul e o Golfo do

México. Ademais, S. clymene é provavelmente grupo irmão de S. coeruleoalba com S.

frontalis como a espécie mais próxima.

A inclusão de um maior número de indivíduos de diferentes localidades e

marcadores moleculares seria interessante para complementar os resultados aqui

apresentados. Ademais, é necessário promover a interdisciplinaridade entre os ramos

da ecologia, anatomia, comportamento e biogeografia, aprofundando assim as

discussões em torno da filogenia e conservação da espécie.

34

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40

Anexos

Anexo I - Protocolo de extração de DNA utilizando solução salina Bruford et al. (1992).

Solução de lise adaptada: volume final 50ml

Tris-HCl (1M, pH 8,0): 0,5 ml

EDTA (5 M, pH 8,0): 1,0 ml

ddH2O: 48,5 ml

Com uma pinça e lâmina de bisturi devidamente esterilizados a amostra é foi

cortada até atingir o tamanho mínimo possível. FoiÉ colocada em um microtubo (1,5

ml), devidamente nomeado, e são adicionados 410µl de buffer de extração, 80 µl de

SDS (10%) e 10µl de proteinase K. O microtubomicrotubo é deixado no banho-maria à

55°C durante 12 horas. Então centrifuga-se à 13.000 rpm por 5 min e o sobrenadante é

transferido para um novo microtubo. São adicionados 180 µl de NaCl (5M) e inverte-se

a amostra gentilmente 50 vezes até homogeneizar. Centrifuga-se à 13.000 rpm por 5

min e o sobrenadante é transferido para um novo microtubo. Adiciona-se 1ml de

isopropanol (gelado) e inverte-se a amostra gentilmente 20 vezes até homogeneizar.

Centrifuga-se à 13.000 rpm por 7 min e o sobrenadante é descartado. Adiciona-se 250

µl etanol (80%) e inverte-se a amostra gentilmente 50 vezes até homogeneizar.

Centrifuga-se à 13.000 rpm por 7 min e toda fase aquosa é descartada. Deixa-se secar

por completo o pellet. Quando o microtubo estiver completamente seco o DNA é

resuspendido em 20ul de ddH2O e armazenado a -4°C.

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Anexo II - Protocolo de extração de DNA com resina Chelex.

Com uma pinça e lâmina de bisturi, devidamente esterilizados, a amostra é

cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml),

devidamente nomeado, e são adicionados 200 µl de resina Chelex (5%). O microtubo é

deixado no banho-maria à 65°C durante 16 horas. Então são colocados em outro

banho-maria à 95°C durante 15 minutos. Centrifuga-se à 14.000 rpm por 3 min e o

sobrenadante é transferido para um novo microtubo e armazenado a -20°C.

Anexo III - Protocolo de extração de DNA de sangue adaptado de Montgomery and Sise

(1990) e Di Pietro et al. (2011).

Para realizar a digestão celular em um microtubo (2 ml) são adicionados 500ul

de amostra de sangue, 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5), 500 µl de fenol e 500 µl de água ultra

pura. O microtubo é levado ao vortex por 10 min e depois ao banho-maria à 55°C por

20min. O processo de vortexar e levar ao banho-maria é repetido durante 3 horas. A

amostra digerida é centrifugada à 7.500 rpm por 5min e a fase aquosa é removida e

colocada em um novo microtubo (2 ml). São adicionados 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5)

saturado com fenol-clorofórmio, centrifuga-se à 7.500 rpm por 5 min e o sobrenadante

é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml). São adicionados 500 µl de Tris-HCl

(pH 7,5) saturado com clorofórmio, centrifuga-se à 7.500 rpm por 5 min e o

sobrenadante é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml). Novamente são

adicionados 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5) saturado com clorofórmio, centrifuga-se à 7.500

rpm por 5 min e o sobrenadante é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml).

Então para precipitar o DNA são adicionados NaCl (5M) numa proporção de 1:1/10 do

volume de sobrenadante e isopropanol na proporção de 1:1, deixando-os reagir, em

temperatura ambiente por 5 min. Centrifuga-se à 11.000 rpm por 10 min e dessa vez o

sobrenadante é descartado. Permanecerão algumas gotículas no microtubo que devem

secar à temperatura ambiente. Uma vez que o microtubo estiver completamente seco o

DNA é resuspendido em 100 µl de TE (1x) e por fim armazenado a -20°C.

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Anexo IV - Protocolo de extração de DNA com fenol/clorofórmio o de Sheppard et al.

(1992).

Soluções: volume final 50ml

Solução X Solução Y

Tris-HCl (2M, pH 6,8): 0,25 ml 7,5 ml

EDTA (0,5 M, pH 8,0): 1,00 ml 10,0 ml

NaCl (5M): 0,60 ml -

SDS 10%: 2,50 ml 3,7 ml

ddH2O: 39,5 ml 45,65 ml 28,8 ml


cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml) e

são adicionados 250 µl de solução X e 1,25 µl de proteinase K (20mg/ml). O microtubo é

deixado no banho-maria à 55°C por 30min. Adiciona-se 250 µl de solução Y e inverte-se

a amostra gentilmente 10 vezes até homogeneizar. O microtubo é deixado no freezer

por 10 min. São adicionados 500 µl de fenol e inverte-se a amostra gentilmente até

obter um aspecto leitoso. O microtubo é deixado no freezer por 3 min. Centrifuga-se à

14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante para um novo microtubo. São

adicionados 250 µl de fenol e 250 µl de clorofórmio e inverte-se a amostra gentilmente

até obter um aspecto leitoso. O microtubo é deixado no freezer por 3 min. Centrifuga-

se à 14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante para um novo microtubo. São

adicionados 500 µl de clorofórmio e inverte-se a amostra gentilmente até

homogeneizar. Centrifuga-se à 14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante

para um novo microtubo. Adiciona-se 1 ml de etanol absoluto gelado e inverte-se

a amostra gentilmente até homogeneizar. A amostra é deixada overnight no freezer. No

dia seguinte é centrifugada à 14.000 rpm por 30 min e dessa vez descartar-se o

sobrenadante. São adicionados 70 µl de etanol (70%), centrifuga-se à 14.000 rpm por 5

min e descartar-se o sobrenadante. O pellet é deixado para secar à temperatura

ambiente. Quando o microtubo estiver completamente seco o DNA é resuspendido em

50 µl de TE (1%) e armazenado a -4°C.

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Anexo V - Protocolo de extração de DNA para amostras em formol adaptado de

Mesquita (2001).

Solução de lise adaptada: volume final 50ml

Tris-HCl (1M, pH 8,0): 0,5 ml

EDTA (0,5 M, pH 8,0): 1,0 ml

NaCl (1M): 1,0 ml

SDS 10%: 8,0 ml

ddH2O: 39,5 ml


cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml) e

são adicionados 200 µl de solução de lise e 25ul de proteinase K (20mg/ml). O

microtubo é deixado no banho-maria à 55°C por 4 dias, sendo que em cada dia são

adicionados 12,5 µl de proteinase K (250 µl /ml) e a amostra é vortexada levemente. No

último dia a amostra é retirada do banho-maria à 55° C e colocada em outro banho-

maria à 95°C por 10min, parando a ação de digestão da enzima. Então são adicionados

1ml de fenol 99% (pH 8,0) e centrifuga-se à 4.200 rpm por 20 min e o sobrenadante é

colocado em um novo microtubo (1,5 ml). São adicionados 500 µl de fenol, 480 µl de

clorofórmio e 20 µl de álcool isopropílico, centrifuga-se à 4.200 rpm por 20min e o

sobrenadante é colocado em um novo microtubo (1,5 ml). São adicionados 2 volumes

de etanol absoluto gelado e acetato de amônio (7 M) na proporção de 1/10 do volume

de amostra. A amostra é deixada overnight no freezer. No dia seguinte a amostra é

centrifugada à 19.600 rpm por 20 min e dessa vez descartar-se o sobrenadante. São

adicionados 70 µl de etanol (70%), centrifuga-se à 14.000 rpm por 5 min e descartar-se

o sobrenadante. O pellet é deixado para secar à temperatura ambiente. Quando o

microtubo estiver completamente seco o DNA é resuspendido em 50 µl de TE (1%) e

armazenado a -4°C.

Estrutura genética populacional Stenella clymene (Gray, 1846) e sua...

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