Estudios del quitosano como portador de osteoblastos en cultivo

Chitosan studies as a carrier of cultured osteoblasts 1 Departamento de Ingeniería Química

lngenieros Industriales. UPM Madrid

2 Laboratorio de Fisiología Ósea Fundación Jiménez Díaz Madrid

3 Servicio de Traumatología Centro de Rehabilitación y Prevención FREMA P Majadahonda (Madrid)

4 Departamento de Óptica Facultad de Ciencias Físicas. UCM Madrid

RESUMEN

Introducción: El quitosano es un material potencialmente útil en el trans~orte de células humanas.

Objetivos: Comprobar la penetración por los osteoblastos humanos en cultivos en diversas pre~araciones de auitosano.

Materiales y métodos:Tras lampreparación y esterilización de diferentes formas de quitosano se procede a su adición a un cultivo primario de osteoblastos humanos. Mediante distintas técnicas microscópicas se analiza la penetración en el bioma- terial de las células cultivadas.

Resultados: Se ha encontrado penetrabilidad osteoblástica así como crecimiento superficial en membranas de quitosano de distintas concentraciones.

Palabras clave: Quitosano, osteoblasto, penetración, bioma- terial.

Larena A. 1

Cáceres D. A. 1

De la Piedra C. 2

Montero M. 2

Vicario C. 3

Fuentes A. 3

I barzábal A. 3

Bernabeu E. 4

Ribelles P. 4

ABSTRACT

Introduction: Chitosan is a potentially human cells carrier useful material.

0bjedves:To probe penetration in several chitosan prepa- rations by human cultured osteoblasts.

Material and methods: Different chitosan forms were pre- pared and sterilized. Then they were added to a primary hu- man osteoblasts culture. Osteoblasts penetration into the bio- material was analyzed using several microscopic techniques.

Results: Osteoblastic penetrability was found. Surface gro- wing on different concentrations chitosan membranes could be demonstrated.

Key words: Chitosan, osteoblast. penetration, biomaterial.

Larena A, Cáceres D A, de la Piedra C, Montero M, Vicario C, Fuentes A, Ibarzábal A, Bernabeu E, Ribelles P Larena A, Cáceres D A, de la Piedra C, Montero M, Vicario C, Estudios del quitosano como portador de osteoblastos Fuentes A, Ibarzábal A, Bernabeu E, Ribelles P en cultivo Chitosan studies as a carrier of cultured osteoblasts Patología del Aparato Locomotor, 2004; 2 (3): 7 99-204 Patología del Aparato Locomotor, 2004; 2 (3): 799-204

Correspondencia: A. Larena ETS Ingenieros Industria les Universidad Politécnica de Madrid C/ José Gutiérrez Abascal, 2 28006 Madrid

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A. Larena, D. A. Cáceres, C. de la Piedra, et al.

El quitosano, cadenas de N-acetilglucosami- na, es un derivado desacetilado de la quitina, polí- mero natural que se encuentra en estructuras de insectos, artrópodos y caparazones de crustáceos. Su capacidad como material biocompatible ha sido ampliamente demostrada en numerosos estu- dios (1,2).

Claire Chatelet, Odile Damour and Alain Do- mard investigaron la proliferación de keratinoci- tos y fibroblastos y las propiedades biológicas de membranas de quitosano de diferente grado de desacetilación (3) como paso previo para el estu- dio de la biocompatibilidad.

Para la correcta regeneración ósea una de las cualidades requeridas a los biomateriales es la capacidad para inducir la osteoinducción a tra- vés de una adecuada proliferación celular de os- teoblastos así como posibilitar la accesibilidad de otros tipos celulares a través de la penetrabilidad y porosidad del material. Sin embargo, se ha mos- trado que la adhesión de osteoblastos, mediada por integrinas (subunidades B1 y B5), caderinas (caderina E, 4 en bajos niveles, 11 y N-caderina) y conexinas (conexina 43 y conexina 45 in vitro) está condicionada por la superficie del biomate- rial y es necesario un entendimiento completo de la adhesión osteoblasto/material para optimizar la interface hueso/biomaterial (4).

El objetivo de este trabajo se basa en estudiar la biocompatibilidad de membranas de quitosa- no neutralizadas y sin neutralizar para el creci- miento de cultivos primarios de osteoblastos, su degradación en el medio de cultivo y la penetra- ción de los osteoblastos en dichos medios.

E l quitosano minimum 85% deacetilado de caparazones de cangrejo fue proporcionado por SIGMA. Se midió en el Centro de Ciencias Me- dioambientales del CSIC, el contenido de Pb, As y Hg en un equipo lnductive Coupled Plasma Per- kin Elmer Optima 4300 DV de una disolución de 1,5% de quitosano en 0,5% de ácido acético y se comprobó que en los tres casos el contenido era despreciable.

El KOH 90% escamas puro y la glicerina 87% purísima, peso molecular 92,10 gmlmol fueron proporcionados por PANREAC.

El medio de cultivo de osteoblastos utilizado fue el Dulbecco's Modified Eagle Medium 1 0938, proporcionado por GlBCO lnvitrogen Corpora- tion que fue suplementado además por 100 Ulml de penicilina, 100 pglml de estreptomicina, L-glu- tamina 2 mM y 20% de suero bovino fetal.

Preparación de los filmes de quitosano

Se realizaron distintos tipos de películas de quitosano en función de su concentración utili- zando como soporte placas Petri de polietileno de alta densidad de 9 cm de diámetro según el método reportado por Qiao-ling Hu, Zheng-ping Fang, Ying Zhao and Cheng-wei Xu (2001) (5) con ligeras modificaciones (6, 7).

Estas disoluciones se mantuvieron a tempera- tura y condiciones de humedad relativa del aire ambiente (aproximadamente 23 "C + 2 "C, 50% respectivamente) hasta total desecación del disol- vente (acético 1,5% en medio acuoso).

Después de formadas las membranas se pesa- ron. Algunas membranas se lavaron con una diso- lución acuosa de 12 ml de KOH 1 % (cuatro lava- dos) seguido de lavado con abundante agua desionizada (cuatro lavados) utilizando una pipe- ta de 10 ml para la eliminación de los restos de iones potasio y acetato, y se sometieron a estufa de desecación a 45" C durante una hora. Otras no fueron neutralizadas y por tanto no fueron sometidas a este proceso.

De cada película se cortaron muestras para sumergirlas en placas multipocillo con medio de cultivo de aproximadamente 1 cm de diámetro. Se pesaron las membranas antes y después del lavado con KOH para ver la pérdida de compo- nentes y, por tanto, la solubilidad de la membra- na, tras este tratamiento.

La espesores de los filmes neutralizados se observaron usando el microprocessor Coating Thickness Gauge MINITEST 21 00 (ELEKTRO - HYSIK'KOLN).

Esterilización de las membranas

Las esterilizaciones de las membranas se rea- lizaron en la Unidad de Esterilización del Centro de Rehabilitación de FREMAP en Majadahonda. Se siguieron varios métodos para la esterilización

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Estudios del quitosano como portador de osteoblastos en cultivo

de las membranas para comparar su posible re- percusión en la biocompatibilidad de las mismas.

Membranas sin neutralizar con la disolución de KOH 1 % se sometieron a esterilización con formaldehído a 60 "C y se dejó desgasificar las muestras para la posible eliminación de todo el formaldehído remanente en las muestras intro- ducido en las membranas a través de sus poros.

El proceso de esterilización tipo fue el siguien- te (Fig. 1 y Tabla 1):

Membranas sin neutralizar con la disolución de KOH 1 O/O y las membranas neutralizadas se sometieron a una esterilización rápida en auto- clave a 134-1 38 "C durante aproximadamente 15- 20 minutos aproximadamente.

El proceso de autoclavado rápido comprendió las fases de: marcha (Pc 1 ,O1 7b Tc 1 03,4 "C), pur-

Fig. 1. Tratamiento de esterilización en formaldehído.

TABLA l. Concentraciones de las membranas de quitosano sin neutralizar sometidas a esterilización

en formaldehído

Cm de quitosano AcH 5% (ml) Glicerina 5% (ml)

0 2 2 o 1,6 0,5 20 1,6

ga de aire (Pc 2,266b Tc 122,3 "C), inyección de vapor (Pc 2,273b Tc 122,2 "C), prevacío (Pc 0,398bTc 82,9 "C), inyección de vapor (Pc 2/01 9b Tc 108,2 OC), prevacío (Pc 0,39913 Tc 82,6 "C), calentamiento (Pc 3,04913 Tc 134,O OC), esterili- zación (Pc 3,140b Tc 135,O "C), desvaporización (Pc 0,196b Tc 79 "C), secado (Pc 0,057b Tc 79 "C) e igualación (Pc 0,93b Tc 109,8 "C). Tempe- ratura mínima de esterilización: 134,O 'C. Tem- peratura máxima de esterilización: 135,l "C. Du- ración total del proceso: 26 minutos (Tablas II y 111).

Cultivo de osteoblastos humanos

El cultivo de osteoblastos provenían de explan- tes de hueso esponjoso de mujeres postmeno- páusicas sometidas a artroplastia total de cadera, crecidos según procedimientos descritos por el Laboratorio de Fisiopatología Ósea de Fundación Jiménez Díaz.

Cultivo primario de osteoblastos humanos: Se utilizó la técnica de Nácher y cols. (8). E l hueso trabecu lar, procedente de explantes de operacio- nes quirúrgicas del Servicio de Traumatología de la Fundación Jiménez Díaz, se cortó en peque- ños fragmentos y se depositó sobre una malla de nylon en una placa Petri. La muestra se incubó

TABLA II. Composición de las membranas de quitosano sin neutralizar sometidas a esterilización

en autoclave

Gm de quitosano AcH 5% (m]) Glicerina 5% (ml)

0 2 2 o 1,6 0,5 2 0 1,6

TABLA III. Composición de las membranas de quitosano neutralizadas sometidas a esterilización

en autoclave

Cm de quitosano AcH 5% (ml) Glicerina 5% (ml)

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con D-MEM, suplementado. Los osteoblastos mi- gran del hueso y crecen sobre la malla de nylon. Cuando las células han cubierto la superficie de la malla (aproximadamente 45 días), se tripsini- zan y se subcultivan en frascos F75. Las expe- riencias se realizaron con células de posteriores subcultivos entre el 2." y 6." pase. Los osteoblas- tos se caracterizaron por su actividad fosfatasa alcalina, analizada química e histoquímicamen- te, y por la estimulación de la síntesis de osteo- calcina en respuesta al l,25 dihidroxicalciferol.

Método experimental: Se colocaron, en el fon- do de pocillos de placas P24, fragmentos de la correspondiente muestra de quitosano de forma circular de unos 4 mm de diámetro. A continua- ción se sembraron sobre la muestra de biomate- rial 50.000 osteoblastos procedentes del cultivo primario, se realizaron controles sin la adición de células. Posteriormente se añadió 1 ml de medio de cultivo D-MEM en las mismas condiciones que las descritas anteriormente. El medio de cultivo se cambió cada dos días. Al cabo de cinco días, los fragmentos de quitosano se sacaron del medio de cultivo y se introdujeron en formaldehído.

Transcurridos los diferentes tiempos, se reali- zan estudios de biocompatibilidad y bioestabili- dad de las muestras de quitosano con el cultivo celular de osteoblastos. Los filmes de quitosano fueron fijados en formaldehído o etanol y poste- riormente en parafina para su observación al microscopio óptico mediante un procedimiento convencional de análisis clínico llevado a cabo por el Servicio de Anatomía Patológica de la Fun- dación Jiménez Díaz. Los tratamientos de fija- ción de las muestras no fueron superiores a 24 horas.

Técnicas de observación microscópicas

Microscopio óptico LElCA tipo 302603

Se han observado distintos comportamientos de la membrana de quitosano de acuerdo a su concentración en el proceso de inclusión en para- fina. El procedimiento técnico de tinción fue la utilización de hematoxilina-eosina que consiste básicamente en desparafinar e hidratar, incubar durante diez minutos en hematoxilina de Caraz- zi, lavar durante diez minutos, contrastar con solu- ción alcohólica de eosina, deshidratar, aclarar y montar.

Microscopio con foca1 SENSOFA R L Pp

Las membranas fueron puestas por triplicado en una placa de 96 pocillos e inmersas en medio de cultivo DMEM con 20% de suero fetal. Tras cinco días de incubación el medio sobrenadan- te fue eliminado y las muestras se dejaron secar al aire bajo condiciones ambientales y sin nin- guna técnica de esterilidad. Posteriormente se embebieron las muestras de quitosano en parafi- na y se cortaron transversalmente.

Microscopio electrónico de barrido (SEM) modelo Jeol, JSM 6400 (Centro de microscopia electrónica. UCM)

Se realizaron al menos tres mediciones al azar de las membranas de quitosano en el microsco- pio electrónico de barrido. E l tratamiento de las muestras para su observación fue el siguiente: se sumergió la muestra en glutaraldehído disuelto en agua al 2,5% durante 40 minutos. Se lavó con agua destilada, se deshidrató en una serie de solu- ciones de etanol de concentraciones 25%, 5O0/0, 75% y 90% durante cinco minutos. Finalmente se sumergió en etanol puro (1 00%) durante diez minutos y se secó la muestra mediante la técni- ca del punto crítico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Preparación de las membranas

En la Tabla IV se muestran las diferencias de peso de las membranas debido al lavado de las mismas. Se puede observar que las pérdidas en todos los casos se sitúan en torno a los 4-6 dg no extrapolándose una relación lineal entre gramos de quitosano en la membrana y pérdida de peso.

Debido al arrugamiento sufrido tras el proce- so de lavado, estas medidas se consideran poco representativas.

Observación al microscopio óptico

Existe un efecto crucial de los métodos de este- rilización sobre la adhesión celular que pueden estar relacionados con las modificaciones quí- micas superficiales inducidas por la esterilización

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TABLA IV. Pérdidas de peso sufridas por las membranas tras el lavado con KOH

Composición Antes de Después Diferencias de quitosano KOH 1 % de KOH 1 % de peso

(g) (g) (g) (S> 0 2 0,2885 0,2386 0,0499 02 0,2895 0,2390 0,0505 0,4 0,5150 0,4693 0,0457 ot4 0,5198 0,4835 0,0363 ot5 0,6425 0,581 9 0,0606 0, 5 0,6238 0,5680 0,0558 0, 7 0,8860 0,8285 0,0575 1 1,2881 1,2486 0,0395

[5] y observadas en investigaciones anteriores del grupo 16, 71. Así se pudo observar que el trata- miento con formaldehído producía fragilidad en las membranas y un manejo difícil de las mismas por la fragmentación para tiempos superiores a 24 horas de fijación acorde con las membranas obtenidos por el tratamiento de esterilización con formaldehído. E l formaldehído podría quedar incluido dentro de las cadenas de quitosano man- teniendo una estructura más rígida y menos fle- xible que podría ser el origen de la fragilidad.

Se ha visto que se produce una degradación rápida de las membranas tras el cultivo en medio con osteoblastos. Sin embargo, la membranas de tipo 111 (0,7 g de quitosano, tratamiento de esteri- lización en autoclave y membrana neutralizada) pueden ser observadas al microscopio. La tipo IV (1 g de quitosano, tratamiento de esterilización en autoclave neutralizada) no fue observada tras su corte de pie después de siete días de cultivo. Las membranas 1 (0,5 g de quitosano tratamiento de esterilización en autoclave sin neutralizar) y II (0,5 g de quitosano y tratamiento de esteriliza- ción en autoclave, membrana neutralizada) se deshacen tras permanecer siete o más días en con- tacto con el medio de cultivo.

Sin embargo al hacer un cultivo de células impronta durante cinco días se puede apreciar un crecimiento generalizado de los osteoblastos en las membranas 1, 11, Ill y IV.

observación al microscopio confocal. Así se pudo observar porosidades de pequeño tamaño, micro- porosidades, de aproximadamente 1 pm y de 3 a 5 pm (Fig 2).

Observación al microscopio electrónico de barrido (SEM)

Los osteoblastos se apreciaron tanto en la superficie como en cortes transversales y demos- traron que había penetrabilidad celular. Sin embar- go, las colonias fueron mayores en impronta que en el corte transversal manifestando que si bien había penetrabilidad no todas las células eran capaces de migrar a través del material. En la Figu- ra 3 se puede apreciar tales resultados para una membrana neutralizada de 1 g de contenido de quitosano en un corte transversal de la misma.

En impronta se pueden apreciar más colonias celulares tal y como lo demuestra la Fig 4.

Observación al microscopio confocal

Los tacos de parafina preparados conservaban restos de membrana y eran adecuadas para su

Fig. 2A. Observación de microporosidades de - 1 pm en cortes de membranas de quitosano, por microscopia ópti- ca confocal (objetivo 50x). B. Observación de mesopo- rosidades - 3 a 5 pm en cortes de membranas de quito- sano, por microscopia óptica confocal (objetivo 50x).

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Fig. 3. Microfotografía de SEM de un osteoblasto en un c&e transversal de una membrana neutralizada de 1 gm de quitosano. El objetivo utilizado fue de 1.000X.

600pm I

Fig. 4. Microfotografía de SEM de poblaciones de oste- oblastos en impronta de una membrana neutralizada de 1 g de quitosano. El objetivo utilizado fue de 1 OOX.

CONCLUSIONES

En el presente estudio se ha demostrado que los osteoblastos humanos penetran y crecen en la superficie de diversas membranas de quitosa- no. Por ello se considera este material como ade-

cuado para el transporte de osteoblastos en téc- nicas de ingeniería tisular. Para ello, sin embar- go, es preciso continuar con el estudio y el desa- rrollo de un modelo experimental animal adecuado.

Agradecimientos

Agradecemos la colaboración de doña María José Luque del Centro de Rehabilitación y Pre- vención de FREMAP en la esterilización de las muestras y de don Octavio Cedenilla del Centro de Ciencias Medioambientales del CSlC en la determinación de los metales pesados por ICP.

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