ESTUDO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM MODELOS … · iii V925e Vera-Lozada, María Gabriela. Estudo da...

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu

MARIA GABRIELA VERA LOZADA

ESTUDO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM MODELOS COMPLEXOS: O LINFOMA DE HODGKIN CLÁSSICO

Orientadora: Prof: Dra. Rocio Hassan Co-orientadora: Dra. Paola Cappelletti

Rio de Janeiro

2013

ii


INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia



Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

como parte dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Oncologia

Orientadora: Prof: Dra. Rocio Hassan Co-orientadora: Dra. Paola Cappelletti

Rio de Janeiro

2013

iii

V925e Vera-Lozada, María Gabriela. Estudo da expressão gênica em modelos complexos: o linfoma Hodgkin clássico. / María Gabriela Vera Lozada. – Rio de Janeiro, 2013. xxvii, 153 f.: il. graf. tab. Dissertação (Mestrado em Oncologia) – Programa de Pós- Graduação em Oncologia - Instituto Nacional de Câncer José Gomes da Silva, 2013. Orientador: Rocio Hassan. 1. Linfoma de Hodgkin . 2. Microambiente tumoral. 3. Vírus Epstein-Barr. 4. Caspase. 5. Sobrevida. I. Hassan, Rocio (Orient.). III. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. IV. Título.

CDD 616.99446

iv


INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia



Orientador: Prof. Dra. Rocio Hassan Co-orientador: Dra. Paola Cappelletti Aprovada em: _ 21 _/_ 03 _/_2013_ EXAMINADORES:

Prof. Dr. Martin Hernan Bonamino Instituto Nacional de Câncer (INCA)

Prof. Dra. Renata Binato Instituto Nacional de Câncer (INCA)

Prof. Dr. Marcelo Pelajo Machado Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

Prof. Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares – Suplente I Instituto Nacional de Câncer (INCA)

Prof. Dr. Andre Luiz Mencalha – Suplente II Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)

RIO DE JANEIRO

2013

v

À minha Família: Carmen Teresa, Germán e Rafael Daniel.

vi

No importa que tan grande sean tus sueños, son tus sueños, tarde o temprano se dan.

Anônimo

vii

AGRADECIMENTOS

A Rocio, pela oportunidade brindada, pelo apoio, por compartilhar seus

conhecimentos, conselhos, pela amizade e por sempre acreditar em mim. Muito obrigada!

Ao Mário, pela ajuda, pelo apoio nas imunohistoquímicas e por compartilhar seus

conhecimentos para o desenvolvimento deste trabalho.

A Paola pela ajuda, carinho e pelos primeiros ensinamentos recebidos no momento em

que iniciei este caminho.

A Pós-Graduação em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer pela oportunidade e

ensinamentos.

A todas as pessoas do Laboratório de Oncovirología do CEMO, Vanessa, Bianca,

Priscilla, Arú, Jorge e Isabella pelo companheirismo e amizade compartilhada.

Ao Dr. Gustavo Stefanoff, pelo apoio, troca de conhecimentos, ajuda concedida desde

o primeiro dia da minha chegada até os experimentos de extração e integridade de RNA

FFPE.

A Dra. Ilana Zalcberg e a todo o pessoal do Laboratório de Biologia Molecular do

CEMO, em especial a Telma, por terem aberto as portas do laboratório, onde foi realizado

grande parte deste trabalho.

A Vanesa Scholl pelo ensino e discussões científicas nos experimentos de PCR em

tempo real e nas análises do ANOVA tipo nested.

A Priscilla pela amizade, solidariedade, ajuda, troca de conhecimentos e revisão deste

trabalho.

A Jackline pelo carinho e a amizade incondicional.

A Dra. Eliana Abdelhay e ao CEMO pela oportunidade de desenvolver este estudo.

A María Belen, parte deste logro foi iniciado por ti.

As equipes de trabalho do Cy0 e Labonnet pela ajuda nas analises de cinética e KOD.

Aos meus pais e irmão, pelo amor, apoio e entendimento da distância e porque mesmo

em todos os momentos me incentivam a superar as dificuldades.

viii

A Jesús, pelo amor, apoio, paciência e por sempre estar presente em todo momento.

A família Flores Silva, pela amizade, conselhos, carinho, apoio cordial e estarem

sempre dispostos a ajudar.

Aos meus amigos, Tállita, Suellen, Raphael Tavares, Carol, Daniel, Edson, Fran pelo

carinho no dia a dia.

A todas as pessoas que, por diferentes motivos, foram fonte de inspiração e coragem

nessa caminhada e que não é possível identificar.

A Coordenação de Ensino e Divulgação Científica (CEDC) – INCA pelo alojamento

concedido, que me permitiu ter concentração nos meus estudos em um ambiente confortável e

acolhedor.

As agências de Fomento, CNPq e FAPERJ, especialmente ao financiamento dado pelo

Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) para o Controle do Câncer (INCA).

ix



RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

María Gabriela Vera Lozada

O linfoma de Hodgkin clássico (LHc) caracteriza-se por apresentar 1-3% de células tumorais (Hodgkin-Reed-Sternberg, H-RS), em meio de um infiltrado inflamatório. Alterações em vias celulares, como ciclo celular e apoptose, assim como no microambiente tumoral foram associadas ao desfecho clínico em pacientes adultos. A avaliação quantitativa da expressão gênica é uma ferramenta importante para desenvolvimento de biomarcadores, porém, seu desempenho em sistemas celulares complexos deve ser avaliado para identificar as fontes de variabilidade e lograr maior precisão na quantificação. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar perfis de expressão de genes descritos com valor prognóstico em adultos, em um grupo de crianças com LHc, utilizando RNA extraído de material fixado em formalina e impregnado em parafina (FFPE). Para isto, uma metodologia de extração de RNA-FFPE e avaliação por reação de PCR quantitativa em tempo real após retrotranscrição (RT-qPCR) foi aperfeiçoada e avaliada mediante um desenho ANOVA tipo nested que identifica fontes de variabilidade biológica e técnica. Seguidamente, 93 linfonodos de crianças com LHc FFPE (3-18 anos) diagnosticados no Instituto Nacional de Câncer (INCA) foram estudados, realizando extração de RNA, retrotranscrição, pré-amplificação e RT-qPCR em um aparelho ABI7000 utilizando o sistema TaqMan®. Genes do ciclo celular (CENPF, CDK1, CCNA2, CCNE2 e HMMR), do apoptose (BCL2, BCL2L1 e CASP3), monócitos/macrófagos (STAT1 e LYZ) e IRF4 foram analisados; utilizando GUSB e HMBS como genes de referência mediante o método de quantificação 2-∆Cq e analisada em relação ao status do vírus Epstein-Barr (EBV), marcadores das células H-RS, subpopulações celulares do microambiente e sobrevida livre de progressão (SLP) e global (SG). Devido à alta correlação na expressão dos genes, análises de componente principal (PCA) foram realizadas, identificando três PCAs que explicaram 65,7% da variabilidade: PC1, genes do ciclo celular (39%); PC2, microambiente e apoptose (STAT1, LYZ, BCL2 e CASP3) (15,6%); PC3, BCL2L1 (11%). Em relação às subpopulações do microambiente, o número de eosinófilos apresentou correlação inversa com alguns genes do ciclo celular, apoptose e microambiente; células citotóxicas (CD8+, GRZB+, TIA1+) correlacionadas positivamente com CASP3, CDK1 e BCL2 e células TIA1+ ou GRZB+ com STAT1 e/ou LYZ; células CD68+ e CD163+ com os genes STAT1, LYZ e IRF4. Células Ki67+ e CASP3+ associadas a linfócitos CD8+ e CD20+ e à expressão de CENPF, HMMR, CDK1, CASP3 e STAT1. A presença do EBV foi associada com maior expressão de STAT1 (P=0,021) e LYZ (P=0,031). A SLP foi significativamente menor em casos com alta expressão de CASP3 (P=0,04), majoritariamente nos casos EBV- (P=0,012). Nossos resultados indicam que: (1) As fontes de variabilidade biológica e técnica devem ser avaliadas, especialmente em métodos usando amostras FFPE com objetivo de aplicação clínica; (2) Existem padrões de expressão gênica identificáveis e com sentido biológico no LHc pediátrico, associados às células H-RS e ao microambiente. A interação entre estes componentes pode ser melhor identificada por abordagens integradas de expressão gênica e imunohistoquímica; (3) O EBV modula a predição de prognóstico dos genes; (4) Modelos de predição clínica propostos em adultos não são reprodutíveis diretamente, precisando validação antes de serem aplicados no grupo das crianças.

x



ABSTRACT

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

María Gabriela Vera Lozada

Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is a B-cell neoplasia characterized by 1-3% of tumoral cells (Hodgkin-Reed-Sternberg, H-RS) in the middle of an inflammatory infiltrate. Alterations in cellular pathways, such as cell cycles and apoptosis, as in the tumor microenvironment were associated with clinical outcome in adult patients. The quantitative evaluation of gene expression is an important tool for the development of biomarkers, but their performance in complex cellular systems should be evaluated to identify the sources of variability and achieve greater precision in quantifying. The main objective of this study was to evaluate expression profiles of genes with prognostic value described in adul cHL in a group of children with cHL, using RNA extracted from formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissues. For this, an optimum method for extraction of RNA-FFPE for quantitative PCR reaction after retrotranscription (RT-qPCR) was chosen and evaluated by a nested-ANOVA design that identifies sources of biological and technical variability. Subsequently, 93 lymph nodes of children with cHL (3-18 years) diagnosed at the Instituto Nacional de Câncer (INCA) were studied by performing RNA extraction, retrotranscription, pre-amplification and RT-qPCR with TaqMan® system in an ABI7000. Cell cycle (CENPF, CDK1, CCNA2, CCNE2 and HMMR), apoptosis (BCL2, BCL2L1 and, CASP3), monocytes/macrophages associated genes (STAT1 and LYZ) and IRF4 were analyzed; using GUSB and HMBS as reference genes using 2-∆Cq as quantification method. Results were analyzed in relation to the status of Epstein-Barr virus (EBV), markers of H-RS cells, lymphocyte subsets of the microenvironment and progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). Because of high correlations among the gene expressions, principal component analysis (PCA) were done which identified three PCAs explaining 65.7% of the variability: PC1, cell cycle genes (39%); PC2, microenvironment and apoptosis genes (STAT1, LYZ, BCL2 and CASP3) (15.6%); PC3, BCL2L1 (11%). In relation to cell populations of the microenvironment, the number of eosinophils inversely correlated with several genes of the cell cycle, apoptosis and microenvironment; cytotoxic cells (CD8+, GRZB+, TIA1+) positively correlated with CASP3, CDK1 and BCL2 gene expression; as well with STAT1 and/or LYZ (TIA1+ or GRZB+ alone); macrophages (CD68+ and CD163+) with STAT1, LYZ and IRF4 gene expression. Immunoexpression of the proliferation marker Ki67+ associated with CASP3+, CD8+ and CD20+ cells, and with CENPF, HMMR, CDK1, CASP3 and STAT1 gene expression. EBV+ cases showed increased expression of STAT1 (P=0.021) and LYZ (P=0.031). The SLP was significantly lower in cases with high expression of CASP3 gene (P=0.04), mostly in the EBV- cases (P=0.012). Our results indicate that: (1) Evaluation of the sources of technical and biological variability is of value, especially in methods using FFPE samples with the objective of improving technical reproducibility for clinical application; (2) There are identifiable patterns of gene expression with biological meaning in pediatric cHL, associated with H-RS cells and the microenvironment. The interaction between these components can be better understood by integrated approaches including gene expression and immunohistochemistry; (3) EBV modulates the prognosis prediction of genes; (4) Clinical prediction models proposed in adults are not directly reproducible, requiring validation before be implemented in the group of children.

xi

INDICE

AGRADECIMENTOS VII

RESUMO IX

ABSTRACT X

INDICE XI

LISTA DE TABELAS XVI

LISTA DE FIGURAS XVII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS XIX

LISTA DE GENES E PROTEINAS XXV

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 O linfoma de Hodgkin clássico 1

1.2 Classificação histológica do linfoma de Hodgkin clássico 4

1.3 Resposta clínico-terapêutica no linfoma de Hodgkin clássico 5

1.4 O vírus Epstein-Barr no linfoma de Hodgkin clássico 6

1.5 Proliferação e escape da apoptose no linfoma de Hodgkin clássico 8

1.5.1 Prognóstico associado à proliferação e apoptose no linfoma de Hodgkin clássico 11

1.6 O microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico 12

1.7 Fatores prognósticos associados ao microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin

clássico 16

1.8 Estudos de expressão gênica no linfoma de Hodgkin 17

1.9 Análises da expressão gênica em material fixado e impregnado em parafina 19

1.10 Aplicação de análise da variância tipo nested 19

xii

1.11 PCR quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para validação de perfis de

expressão gênica com aplicação clínica 21

1.12 Métodos de determinação do valor de quantificação por PCR em tempo real 22

1.12.1 Método Cy0 25

1.13 Genes de referência e normalização 26

1.14 Estratégia de quantificação utilizada em PCR em tempo real 27

1.15 O linfoma de Hodgkin clássico como doença complexa dos tecidos: abordagem dos

estudos de expressão gênica 28

2 OBJETIVOS 30

2.1 Objetivo geral 30

2.2 Objetivos específicos 30

3 MATERIAIS E MÉTODOS 31

3.1 Amostras 31

3.2 Dados clínicos e epidemiológicos 31

3.3 Método de extração de RNA com o reagente Trizol® 32

3.4 Método de extração de RNA total a partir de amostras fixadas e impregnadas em

parafina 33

3.4.1 Desparafinização 33

3.4.2 Método Master PureTM 33

3.4.3 Método Recover AllTM 34

3.5 Desempenho dos métodos de extração de RNA 35

3.5.1 Eletroforese em gel de agarose 35

3.5.2 Número de integridade do RNA 35

xiii

3.6 Retrotranscrição 35

3.7 Pré-amplificação 36

3.8 Quantificação da expressão gênica 36

3.9 Avaliação da amplificação 38

3.10 Abordagens de quantificação relativa da expressão gênica 39

3.10.1 Método do ciclo threshold 39


3.11 Cálculo dos outliers 40

3.12 Desenho experimental ANOVA tipo nested 41

3.13 Análise do ANOVA tipo nested 41

3.14 Técnica de imunohistoquímica 42

3.15 Análise Microscópica Computacional Assistida 44

3.16 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH) 44

3.17 Definição de respostas e tempo de sobrevida 45

3.18 Análises estatísticas 46

3.19 Critérios Éticos 47

4 RESULTADOS 48

4.1 APERFEIÇOAMENTO DE UMA METODOLOGIA REPRODUTÍVEL PARA

EXTRAÇÃO DE RNA A PARTIR DE MATERIAL EM PARAFINA 48

4.1.1 Desempenho dos métodos de extração de RNA 48

4.1.2 Desenho experimental ANOVA tipo nested 50


xiv

4.1.4 Modificações do método de PCR em tempo real quantitativo 58

4.2 ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA EM UM GRUPO DE PACIENTES COM

LINFOMA DE HODGKIN CLÁSSICO PEDIÁTRICO 60

4.2.1 Características clínicas do grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico

pediátrico 60

4.2.2 Análise de expressão gênica em um grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin

clássico 63

4.2.2.1 Rendimento da extração de RNA no grupo total de pacientes 63

4.2.2.2 Avaliação da qualidade e determinação dos níveis de expressão gênica 64

4.2.3 Análise não supervisionada de cluster hierárquico 65

4.2.4 Análises de componente principal (PCA) 69

4.2.5 Expressão gênica em relação aos subtipos histológicos do linfoma de Hodgkin clássico

69

4.2.6 Correlação da expressão gênica com marcadores avaliados por imunohistoquímica nas

células de Hodgkin-Reed Sternberg e no microambiente tumoral 71

4.2.6.1 Marcadores das células de Hodgkin-Reed Sternberg e sua associação com a

expressão gênica 71

4.2.6.2 Microambiente tumoral e sua associação com a expressão gênica 72

4.2.6.2.1 Populações linfocitárias 74

4.2.6.2.2 Precursores monocíticos e macrófagos 74

4.2.6.2.3 Eosinófilos 74

4.2.7 Relação entre apoptose e proliferação no microambiente tumoral 78

4.2.8 Associação dos níveis de expressão gênica com a presença do vírus Epstein-Barr 80

xv

4.2.9 Expressão gênica associada ao prognóstico nos pacientes com linfoma de Hodgkin

clássico pediátricos 81

5 DISCUSSÃO 88

5.1 Aperfeiçoamento de uma técnica de extração de RNA a partir de material parafinado

para estudos de expressão gênica por RT-qPCR 88

5.2 Validação de perfis de expressão gênica em um grupo de pacientes com linfoma de

Hodgkin clássico 95

6 CONCLUSÕES 104

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106

ANEXO I 127

ANEXO II 128

ANEXO III 133

ANEXO IV 134

ANEXO V 140

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1

Tabela 4.1

Tabela 4.2

Tabela 4.3

Tabela 4.4

Tabela 4.5

Tabela 4.6

Tabela 4.7

Tabela 4.8

Tabela 4.9

Tabela 4.10

Ensaios utilizados para PCR em tempo real quantitativo.

Quantidade de RNA, pureza e RIN dos métodos comparados em

25 amostras pareadas.

Comparação do desempenho dos métodos Master PureTM e

Recover AllTM em relação à antiguidade da amostra.

Variabilidade estimada entre indivíduos, linfonodos e passos do

processamento das amostras em valores Cq e Cy0.

Variabilidade estimada entre indivíduos, linfonodos e passos do

processamento das amostras em valores ∆Cq e ∆Cy0.

Descrição das características clínicas, histológicas e associação

com o vírus Epstein-Barr no grupo de pacientes com linfoma de

Hodgkin clássico pediátrico.

Correlação entre a expressão gênica e variáveis relacionadas ao

ciclo celular e apoptose nas células de Hodgkin/Reed-Sternberg,

avaliados por marcações de imunohistoquimica (IHQ)

Correlação entre a expressão gênica e o número de células do

microambiente avaliadas por marcações de imunohistoquimica

(IHQ).

Valores de expressão gênica para os grupos de recaída vs. não recaída.

Análise de sobrevida livre de progressão (SLP) e global (SG) em

relação à expressão gênica no grupo de pacientes com linfoma de

Hodgkin clássico pediátricos

Regressão de Cox das variáveis de expressão gênica que

influenciaram a sobrevida livre de progressão em pacientes com

linfoma de Hodgkin clássico pediátricos

37

48

49

54

56

62

76

77

83

84

87

xvii

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1.1

Fig. 1.2

Fig. 1.3

Fig. 1.4

Fig. 1.5

Fig. 1.6

Fig. 1.7

Fig. 3.1

Fig. 4.1

Fig. 4.2

Fig. 4.3

Fig. 4.4

Fig. 4.5

Fig. 4.6

Fig. 4.7

Fig. 4.8

Fig. 4.9

Fig. 4.10

Fig. 4.11

Imagem histológica de um linfonodo característico com linfoma

de Hodgkin clássico.

Esquema representando a origem das H-RS a partir de células B

do centro germinativo pré-apoptóticas.

Descrição da via de morte celular (apoptose) dependente de

caspases.

Composição do microambiente tumoral e interações patogênicas

entre células H-RS e células infiltrantes.

Fases de uma curva de reação de PCR quantitativa.

Modelo sigmoide de quatro parâmetros.

Curva de PCR com os cinco parâmetros da função de Richard.

Desenho experimental ANOVA tipo nested para amostras

fixadas e impregnadas em parafina.

Avaliação de qualidade e quantidade de RNA extraído a partir de

amostras FFPE.

Gráfico de amplificação do gene GUSB no Indivíduo 2.

Gráfico de variabilidade interindividual para o gene GUSB.

Variabilidade total em porcentagem observada no desenho

ANOVA tipo nested para valores Cq.

Distribuição da variabilidade em valores desvio padrão

acumulada no ensaio ANOVA tipo nested.

Gráfico de Box plot mostrando os níveis de expressão dos genes

estudados.

Contribuição do Desvio Padrão (DP) acumulado no ensaio

ANOVA tipo nested para cada gene estudado.

Modificações da pré-amplificação no Indivíduo 2.

Modificações da pré-amplificação no Indivíduo 1.

Detecção do vírus Epstein-Barr através da técnica de

hibridização in situ.

Distribuição do rendimento da extração de RNA proveniente de

material FFPE nos casos com linfoma de Hodgkin clássico.

2

3

10

13

22

24

25

41

49

51

51

52

53

57

58

59

60

61

63

xviii

LISTA DE FIGURAS (continuação)

Fig. 4.12

Fig. 4.13

Fig. 4.14

Fig. 4.15

Fig. 4.16

Fig. 4.17

Fig. 4.18

Fig. 4.19

Fig. 4.20

Fig. 4.21

Fig. 4.22

Fig. 4.23

Fig. 4.24

Gráfico de Box plot mostrando a classificação dos níveis de

expressão dos genes estudados.

Gráfico de tipo heat-map da expressão gênica no grupo total de

pacientes.

Gráficos de Box plot das características das populações do

microambiente em pacientes com linfoma de Hodgkin clássico

pediátricos com baixa expressão nos genes do ciclo celular.

Análises de componente principal.

Análise do grau de esclerose nodular do linfoma de Hodgkin

clássico e sua relação com a expressão gênica.

Caracterização imunohistoquímica das células infiltrantes do

microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico

pediátrico.

Análise dos eosinófilos no microambiente do linfoma de

Hodgkin clássico pediátrico e suas relações com a expressão

gênica.

Padrão de expressão gênica segundo a expressão de marcadores

de proliferação e apoptose no microambiente celular.

Padrões de associação entre marcadores de proliferação e

apoptose no microambiente tumoral do linfoma de Hodgkin

clássico pediátrico.

Padrão de expressão dos genes LYZ e STAT1 segundo o status do

vírus Epstein-Barr em pacientes com linfoma Hodgkin clássico

pediátrico.

Sobrevida livre de progressão no linfoma de Hodgkin clássico

pediátrico em relação à expressão gênica de CASP3.

Sobrevida livre de progressão (SLP) no grupo de pacientes EBV-

com linfoma de Hodgkin clássico pediátrico.

Sobrevida livre de progressão (SLP) no grupo de alto risco de

linfoma de Hodgkin clássico pediátrico.

65

66

68

69

70

73

75

79

80

81

85

86

87

xix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Graus centigrados

σ2 Variância

∆(Rn-ROX) Delta do repórter normalizado

∆Cq Delta Cq

∆Cy0 Delta Cy0

λ Comprimento de onda

µg Microgramo

µL microlitro

µm Micrometro

Amp Amplificação

ANOVA Análise da variância (do inglês, analysis of variance)

BCR Receptor de células B (do inglês, B cell receptor)

BSA Albumina de soro bovino

CD Conjunto de diferenciação (do inglês, cluster of differentiation)

cDNA DNA complementar

CEMO Centro de Transplante de Medula Óssea

CG Centro germinativo

CGA Campo de grande aumento

CM Linfoma de Hodgkin clássico subtipo celularidade mista

Cq Ciclo de quantificação

xx

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS (continuação)

CTL Linfócitos citotóxicos CD8+

CV Coeficiente de variação

Cy0 Ciclo de quantificação Cy0

DEPC Dietil dicarbonato

dL Decilitro

DL Linfoma de Hodgkin clássico subtipo depleção linfocitária

DNA Ácido desoxirribonucleico

DNTPs Desorribonucleotídeos trifosfatado

DP Desvio padrão

EBER Pequenos RNAs não codificantes do vírus Epstein-Barr

EBNA Antígeno nuclear Epstein-Barr (do inglês, Epstein-Barr nuclear antigen)

EBV Vírus Epstein-Barr

EN Linfoma de Hodgkin clássico subtipo esclerose nodular

Fb Ruído da reação de fluorescência

Fmax Quantidade de fluorescência máxima

FFPE Fixado em formalina e impregnado em parafina (do inglês, formalin-fixed

paraffin-embedded)

Fig. Figura

FITC Fluóroforo Isotiocianato de fluoresceína

GDI Gene de interesse

GDR Gene de referência

xxi


GRZB Granzima B

H&E Coloração por hematoxilina-eosina

HIV Vírus da imunodeficiência humana

HR Razão de chance (do inglês, Hazard ratio)

H-RS Célula de Hodgkin – Reed Sternberg

IHQ Imunohistoquímica

IFN-γ Interferon gamma (produzido por células Th1)

IL Interleucina

INCA Instituto Nacional de Câncer

IPS Escore Prognóstico Internacional (do inglês, International Prognostic Score)

ISH Hibridização in situ

KMO Do inglês, Kaiser-Meyer-Olkin

KOD Detecção de outliers pela cinética da curva

LHc Linfoma de Hodgkin clássico

LHPLN Linfoma de Hodgkin com predomínio linfocítário nodular

LMP1 Proteína latente de membrana 1 (do inglês, Latent membrane protein 1)

LMP2A Proteína latente de membrana 2A (do inglês, Latent membrane protein 2A)

MAT Microambiente tumoral

mg Miligramo

MHC Complexo principal de histocompatibilidade (MHC; do inglês, major

histocompatibility complex)

xxii


MIQE Informação mínima para publicação em experimentos de quantificação em

PCR em tempo real

mL Mililitro

mM Milimolar

mm2 Milímetro quadrado

MNI Mononucleose infecciosa

MP Método Master Pure

MSA Medida de amostras adequadas (do inglês, Measures of Sampling Adequacy)

NF-κB Fator nuclear de transcriçao kappa B

NTC Controle sem amostra (do inglês, no template control)

OMS Organização Mundial da Saúde

P Valor de P

PAP Peroxidase-anti-peroxidase

PARP Familia de proteínas polimerase ribosa poli-ADP (do inglês, poly ADP ribose

polymerase)

pb Pares de bases

PBS Tampão fosfato salino

PCA Análises de componente principal (do inglês, principal component analysis)

PCR Reação em cadeia da polimerase

pré-Amp Pré amplificação

qPCR PCR quantitativa

xxiii


r.p.m. Rotações por minuto

R2 Regressão da curva

RA Método Recover All

RIN Número de integridade do RNA

RL Linfoma de Hodgkin clássico subtipo rico em linfócitos

RNA Ácido ribonucleico

RNAm RNA mensageiro

RT Transcrição reversa ou retrotranscrição

RT-qPCR PCR quantitativa a partir da transcrição reversa

SG Sobrevida global

SLP Sobrevida livre de progressão

SPSS Do inglês, Statistical Package for Social Sciences

TA Temperatura ambiente

TAM Macrófagos associados ao tumor (do inglês, Tumor-associated macrophages)

TBS Tampão tri salino

Th1 Linfócito T auxiliares 1 (do inglês, T helper cell)

Th2 Linfócito T auxiliares 2 (do inglês, T helper cell)

TLDA Do inglês, Taq Man Low Density Array

TMA Microarranjo tecidual (do inglês, tissue microarrays)

TNFR Receptor do fator de necrose tumoral

xxiv


TUNEL Marcação de Terminações dUTP pela Deoxinucleotidil Transferase Terminal

(do inglês, Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)

Treg Células T reguladoras

U/µL Unidade por microlitro

xxv

LISTA DE GENES E PROTEINAS

AICDA Proteína “Activation-induced cytidine deaminase”

BAD Proteína “Bcl2 antagonist of cell death”

BAK Proteína “Bcl-2 homologous antagonist/killer”

BAX Proteína “Apoptosis regulator BAX”

BCL2 Gene “B-cell CLL/lymphoma 2”

BCL2 Proteína “Apoptosis regulator Bcl-2”

BCL2L1 Gene “BCL2-like 1”

BCL2L1 Proteína “BCL2-like 1” (antigamente Bcl-XL)

BCL6 Proteína “B-cell lymphoma 6 protein”

BID Proteína “BH3-interacting domain death agonist”

BUB1 Proteína “Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1”

CASP3 Gene “caspase 3, apoptosis-related cysteine peptidase”

CASP3 Proteína “Caspase-3”

CCNA2 Gene “cyclin A2”

CCNE2 Gene “cyclin E2”

CDK1 Gene “cyclin-dependent kinase 1”

CDK2 Proteína “Cyclin-dependent kinase 2”

CDK4 Proteína “Cyclin-dependent kinase 4”

CENPF Gene “centromere protein F, 350/400kDa”

CSF1 Proteína “colony stimulating factor 1 (macrophage)”

xxvi

LISTA DE GENES E PROTEINAS (continuação)

CSF1R Proteína “Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor”

FAS Proteína “Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6”

FASL Proteína “Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6”

FOXP3 Proteína “FOXP3” (Marcador de células T reguladoras)

GATA3 Proteína “Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3”

(Marcador de células T auxiliares 1)

GRZB Proteína “granzyme B” (Marcador de células citotóxicas)

GUSB Gene “glucuronidase beta”

HDM2 Proteína “E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2”

hGAL Proteína “Germinal center-associated signaling and motility protein”

HMBS Gene “hydroxymethylbilane synthase”

HMMR Gene “hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)”

IL-2 Proteína “Interleukin-2”





IRF4 Gene “interferon regulatory factor 4”

Ki67 Proteína “Antigen KI-67”

LYZ Gene “lysozyme”

MAF Proteína “Transcription factor Maf”

xxvii

LISTA DE GENES E PROTEINAS (continuação)

MYC Gene “v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)”

NOTCH1 Gene “notch 1”

p14ARF Proteína “Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, isoform 4”

p16-INK4a Proteína “Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, isoforms 1/2/3”

p21(Cip1/WAF1) Proteína “Cyclin-dependent kinase inhibitor 1”

p27KIP1 Proteína “Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B”

p53 Proteína “Cellular tumor antigen p53”

PAX5 Proteína “Paired box protein Pax-5”

PCNA Proteína “Proliferating cell nuclear antigen”

Rb Proteína “Retinoblastoma-associated protein”

STAT1 Gene “signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa”

STAT1 Proteína “signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa”

TBX21 Proteína “T-box transcription factor TBX21” (antigamente TBET)

TIA1 Proteína “Nucleolysin TIA-1 isoform p40”

TOP2A Proteína “DNA topoisomerase 2-alpha”

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 O linfoma de Hodgkin clássico

O linfoma de Hodgkin (LH) representa 1% das neoplasias a nível mundial (PILERI et

al., 2002). Corresponde à terceira neoplasia mais prevalente em idades infantis (entre 10-30%

dos casos) e a aproximadamente 30% dos linfomas em adultos (FARRELL; JARRETT,

2011). No Brasil, os linfomas representam a segunda neoplasia na infância, atrás das

leucemias agudas, sendo que o LH é diagnosticado em aproximadamente 50% do total de

casos com linfoma (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA

SILVA, 2011; FERREIRA et al., 2012).

A entidade foi descrita pela primeira vez em 1832 por Thomas Hodgkin (HODGKIN,

1832). No entanto, foi só entre 1898 e 1902 que Carl Sternberg e Dorothy Reed descreveram

de maneira independente a célula tumoral como característica patognomônica para o

diagnóstico do LH (STERNBERG, 1898; REED, 1902). Em 1990, a Organização Mundial

da Saúde (OMS) denominou a neoplasia como linfoma.

Segundo a nova classificação das neoplasias linfoides pela OMS (SWERDLOW et al.,

2008), o LH pode ser classificado em duas entidades diferentes: o LH clássico (LHc) e o LH

com predomínio linfocítário nodular (LHPLN), dependendo da célula tumoral identificada.

O LHc é uma doença monoclonal de linfócitos B com fenótipo atípico (KUPPERS et

al., 1994); as células tumorais compõem de 1-3% da massa tumoral e são denominadas de

células de Hodgkin (mononucleadas) e Reed-Sternberg (multinucleadas) (H-RS), sendo que

ambas populações coexistem no mesmo tumor, mas a fração proliferativa está limitada às

células mononucleadas (HODGKIN, 1832; STERNBERG, 1898; REED, 1902). O restante

da massa tumoral está composto por estroma e um grande número e variedade de células

inflamatórias benignas, indispensáveis para a manutenção do estado neoplásico (POPPEMA,

2005) (Fig. 1.1).

2

Fig. 1.1: Imagem histológica de um linfonodo característico com linfoma de Hodgkin clássico. Na imagem pode ser observada a célula de H-RS rodeada de um infiltrado inflamatório. Na imagem ampliada há duas células tumorais, uma uninucleada e outra multinucleada. Coloração realizada com H&E. Crédito: Laboratório de Oncovirología-CEMO (MHM Barros).

A identificação da linhagem de origem da célula H-RS foi particularmente difícil,

devido a dois pontos cruciais: o número baixo destas na massa tumoral e à perda do fenótipo

B (KUPPERS, 2009b). De fato, a célula H-RS perde a expressão dos marcadores da linhagem

B, tais como CD19, CD79 e o receptor de células B (BCR), apresenta baixa expressão do

fator de transcrição PAX5 e, somente entre 20 e 30% dos casos expressam CD20. Em

contraposição, estas células passam a expressar marcadores específicos de outras linhagens,

como CD30, CD15 e o receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) (HERTEL et al., 2002;

SCHWERING et al., 2003). Mais especificamente nas crianças com LHc do Instituto

Nacional de Câncer (INCA), um estudo prévio da nossa equipe mostrou que somente 27%

dos casos expressam CD20 (BARROS et al., 2010).

A confirmação de que as células H-RS são oriundas de células B do centro

germinativo (CG) foi possível através de estudos de rearranjos e hiperpermutação somática

dos genes V da imunoglobulina, em células H-RS microdissecadas (KUPPERS et al., 1994;

KANZLER et al., 1996; BRAUNINGER et al., 2003). A perda da diferenciação B foi

atribuída a mutações sem sentido (do inglês, nonsense) em ~25% dos casos, ou a alterações na

transcrição do gene da imunoglobulina nos outros 75% dos casos, as quais deveriam ter

3

levado a célula a apoptose, mas por motivos tais como a presença do vírus Epstein-Barr

(EBV) e/ou alterações genéticas na via NF-κB a célula H-RS conseguiu sobreviver e ser

resgatada da apoptose (MARAFIOTI et al., 2000; KUPPERS, 2009a). Além disso, defeitos

epigenéticos acarretam na desprogramação B das células H-RS (KUPPERS, 2009a) (Fig. 1.2).

Fig. 1.2: Esquema representando a origem das H-RS a partir de células B do centro germinativo pré-apoptóticas. Células B naive ao entrar em contato com o antígeno cognato são ativadas. As células B ativadas migram para dentro do folículo, proliferam e se diferenciam em centroblastos, dando origem ao centro germinativo. As células B do centro germinativo sofrem hipermutação somática, aquelas células portadoras de mutações desfavoráveis são encaminhadas a apoptose via FAS-FASL, enquanto que aquelas células que apresentam o receptor de células B com alta afinidade pelo antígeno sobrevivem, abandonando o centro germinativo para se diferenciar em células B de memória ou células plasmáticas. Células B portadoras de um receptor de células B não funcional são normalmente encaminhadas a apoptose, mas, ao serem resgatadas pela ação de diferentes mecanismos, entre eles pelo vírus Epstein-Barr e/ou alterações genéticas primárias na via de NF-κB, podem dar origem às células H-RS. Adaptado de KAPATAI; MURRAY (2007); SEGGES (2012).

4

Já a entidade conhecida como LHPLN é menos frequente (~5% dos casos), acomete

quase que exclusivamente adultos, a célula tumoral é denominada de célula predominante

linfocítica, expressa marcadores da linhagem B (CD20, CD79), assim como marcadores do

CG (BCL6, hGAL, AICDA) e sua patogênese e relação com as células infiltrantes é diferente

da observada no LHc (SWERDLOW et al., 2008; SCHMITZ et al., 2009; SHANKAR;

DAW, 2012).

1.2 Classificação histológica do linfoma de Hodgkin clássico

Além da sua peculiaridade histogenética, o LHc é uma doença variável do ponto de

vista histopatológico sendo classificado em 4 subtipos: esclerose nodular (EN), celularidade

mista (CM), depleção linfocitária (DL) e rico em linfócitos (RL) (SWERDLOW et al., 2008).

Esta variabilidade pode ser causada por vários motivos, entre elas: a condição imune

específica na transformação maligna, a relação com a idade do paciente no momento de

desenvolvimento da doença e a associação com o EBV (POPPEMA, 2005; BAUMFORTH et

al., 2008; BARROS; HASSAN; NIEDOBITEK, 2011).

A EN representa aproximadamente 70% dos casos de LHc em países desenvolvidos e

em adultos jovens é caracterizada por um padrão de crescimento nodular com bandas de

colágeno circundando, ou tendo a circundar os nódulos (KUPPERS, 2009a). Na EN, o

número de células H-RS é variável, sendo observado muitas vezes, um halo claro ao redor

destas células (células lacunares). As células neoplásicas estão embebidas num infiltrado

inflamatório composto por células inflamatórias (LUKES; BUTLER, 1966; BUTLER;

PUGH, 1993).

A EN pode, por sua vez, ser classificada em dois subgrupos: grau I, caracterizada por

escassas células H-RS junto a um intenso infiltrado inflamatório não neoplásico, e grau II,

caracterizado por apresentar um maior número de células H-RS acompanhado de uma

alteração da morfologia ou redução do número dos linfócitos infiltrantes (MACLENNAN et

al., 1992; SWERDLOW et al., 2008). Originalmente, esta divisão foi correlacionada com a

sobrevida dos pacientes, sendo o grau II associado com um pior prognóstico (BENNETT; TU;

HUDSON, 1981; BENNETT et al., 1983; MACLENNAN et al., 1992), mas na atualidade,

esta graduação perdeu seu impacto prognóstico devido à melhora global da resposta aos

tratamentos poliquimioterápicos (VAN SPRONSEN et al., 1997).

5

A CM é o subtipo mais comum nos países em desenvolvimento, nas crianças e nos

adultos mais velhos e nos casos EBV+ (CARBONE et al., 2011). A CM é caracterizada pela

ausência de bandas colágenas e nódulos, assim como do espessamento capsular, embora possa

haver a presença de fibrose. Assim como na EN, o número de células H-RS é pequeno e estas

células estão embebidas num infiltrado inflamatório composto principalmente por linfócitos,

plasmócitos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos (SWERDLOW et al., 2008).

Os subtipos RL e DL são os menos frequentes dentre os subtipos histológicos do LHc.

O RL representa 5% dos casos e exibe escassas células H-RS, fundo nodular (mais comum)

ou difuso de pequenos linfócitos, com pouca quantidade de neutrófilos e eosinófilos. Uma

proporção de células H-RS pode se assemelhar às células predominantes linfocitárias ou às

células lacunares mononucleares (SWERDLOW et al., 2008). Já o subtipo DL é uma forma

difusa do LHc e representa menos que 1% dos casos. Caracteriza-se por ser rico em células H-

RS e uma por apresentar uma diminuição do número de linfócitos não neoplásicos. Assim

como na CM, apresenta-se com maior frequência nos países em desenvolvimento e nos

indivíduos HIV positivos (SWERDLOW et al., 2008).

Em relação às diferenças histopatogênicas entre os dois subtipos principais do LHc,

EN e CM, BIRGERSDOTTER et al. (2009), através de análises de expressão gênica

comparativas, sugeriu que os dois subtipos têm características que recapitulam as diferentes

fases de um processo de cicatrização normal; enquanto que na EN é observado um perfil de

remodelamento da matriz extracelular, na CM observa-se a presença de uma resposta

citotóxica semelhante a outros linfomas.

1.3 Resposta clínico-terapêutica no linfoma de Hodgkin clássico

O LHc é caracterizado por ser uma doença heterogênea tanto do ponto de vista

histopatológico quanto clínico. O estadiamento Ann Arbor (CARBONE, et al., 1971) para o

LH, gradua esta doença em 4 níveis de acordo com número e a localização de cadeias

linfonodais envolvidas, sendo caracterizados os estádios I e II como doença localizada, e os

estádios III e IV, como doença avançada.

Na tentativa de se estabelecer uma terapia risco-específica, o LH é dividido em grupos

de risco, combinando-se o estadiamento clínico com a presença dos sintomas “B” (febre

maior que 38ºC por pelo menos 3 dias consecutivos, sudorese noturna e a perda de peso

inexplicada maior que 10% do peso corpóreo nos últimos 6 meses). Dois grandes grupos são

6

reconhecidos pela maioria dos protocolos de tratamento: desfavorável (estadiamentos IIB,

IIIB e IV) e favorável (demais estadiamentos) (VASSILAKOPOULOS et al., 2005).

O tratamento é baseado em quimioterapia, podendo ou não ser utilizada a radioterapia

na doença localizada (SPECHT et al., 1992). Os regimes quimioterápicos atuais são baseados

na utilização de antraciclinas e agentes alquilantes em baixas doses. A utilização destes

protocolos tem garantido uma sobrevida livre de eventos (SLE) em 5 anos que variam entre

75 a 97% (VASSILAKOPOULOS et al., 2005). Entretanto, cerca de 20 a 30% dos pacientes

podem apresentar uma recaída ou progressão da doença, sendo que para estes casos não

existem opções terapêuticas definidas e eficazes (DIEHL; THOMAS; RE, 2004).

Um sistema de pontuação clínica (escore), denominado escore de prognóstico

internacional (IPS: do inglês, International Prognostic Score) foi desenvolvido para predizer

o prognóstico de pacientes com estádios avançados, utilizando dados clínicos em conjunto

com dados laboratoriais e demográficos, como a idade do paciente, sexo, estádio da doença,

níveis séricos de albumina, hemoglobina, contagem de leucócitos e linfócitos

(HASENCLEVER; DIEHL, 1998). Este sistema é utilizado em adultos, entretanto, sua

aplicação no grupo de crianças não foi validado até o momento.

Diferentes estudos têm sido conduzidos visando desenvolver marcadores biológicos

capazes de identificar o grupo de pacientes com alto risco de recaída ou de progressão da

doença, permitindo uma intensificação da terapia adaptada a risco. Da mesma maneira, é

extremamente necessário beneficiar o grupo de menor risco com terapias menos agressivas,

diminuindo assim o risco de toxicidade e efeitos colaterais, característicos do esquema de

tratamento quimioterápico do LHc. Dentre os marcadores biológicos, há diversos tipos que

podem ser classificados em marcadores séricos, fatores genéticos ou marcadores tumorais

focados tanto na célula H-RS quanto nas células do infiltrado tumoral (HSI, 2008).

1.4 O vírus Epstein-Barr no linfoma de Hodgkin clássico

O EBV é um γ-herpesvírus que infecta assintomaticamente mais de 90% da população

humana (CRAWFORD, 2001). Na infecção primária, seguida à sua transmissão via a saliva, o

EBV ingressa no organismo pelo epitélio da orofaringe infectando linfócitos B circulantes e

estabelecendo latência nas células B de memória. Esta primo-infecção ocorre em idades

variáveis, dependendo das condições sócio-econômicas das populações, e embora a infecção

seja quase sempre controlada ao nível subclínico, quando ocorre durante a adolescência e

7

juventude pode ter como consequência uma doença conhecida como mononucleose infecciosa

(MNI) (FIELDS et al., 2001). No entanto, o EBV pode também estar associado causalmente

a processos neoplásicos como o linfoma de Burkitt endêmico, carcinoma de nasofaringe,

doença linfoproliferativa pós-transplante e uma fração dos casos com LHc. Por isto, a OMS

considera este vírus como carcinógeno humano do grupo I (IARC WORKING GROUP ON

THE EVALUATION OF CARCINOGENIC RISKS TO HUMANS, 1997; GANDHI;

TELLAM; KHANNA, 2004).

A hipótese da associação causal entre o EBV e o LHc foi baseada nas evidências

epidemiológicas de que uma história anterior de MNI aumentava em 5 vezes o risco de

desenvolvimento de LHc (HJALGRIM et al., 2000; MASSINI; SIEMER; HOHAUS, 2009),

e na detecção da natureza clonal da infecção das células H-RS pelo EBV em uma fração dos

casos (CRAWFORD, 2001). Em 2005, o papel causal do EBV na transformação das células

de H-RS foi demonstrado em modelos experimentais (BECHTEL et al., 2005; MANCAO et

al., 2005) passando a ser reconhecido como agente etiológico da doença.

O modelo mais aceito de manutenção do estado latente do EBV propõe que este vírus

explora a biologia da célula B para chegar ao comportamento de memória onde estabelece

latência, atravessando o CG (THORLEY-LAWSON, 2001). No CG, para que haja uma

reação folicular de sucesso, a célula B precisa dos estímulos provenientes da célula T auxiliar

(Th: do inglês T helper) através do CD40L, além de sinais tônicos fornecidos pelo BCR

(imunoglobulina de superfície) (VIKSTROM; TARLINTON, 2011). Quando um destes sinais

falha, a célula B é enviada para apoptose (KUPPERS, 2009a; NUTT; TARLINTON, 2011).

O EBV é capaz, por si só, de fornecer estes sinais, através de suas duas proteínas de

membrana, LMP1 e LMP2A (KAPATAI; MURRAY, 2007; KUPPERS, 2009b). No caso de

uma célula B destinada a apoptose, o vírus pode “enganar” o sensor de apoptose levando à

sobrevida destas células, com alto potencial de transformação. Este é o mecanismo proposto

para a origem do LHc EBV+.

O padrão de latência no CG é conhecido como latência tipo II, que inclui a expressão

das proteínas EBNA1, LMP1 e LMP2A, além dos RNAs não traduzidos EBER1 e 2. As

proteínas virais de membrana LMP1 e LMP2A possuem a capacidade de mimetizar a proteína

receptora de membrana CD40 (TNFR) e o BCR, respectivamente (THORLEY-LAWSON,

2001). Sendo assim, tanto LMP1 quanto CD40, através de seu ligante a nível extracelular

(CD40L), são capazes de induzir a ativação da via de fatores de transcrição nuclear κB (via

8

NF-κB), o que torna esta via permanentemente ativa nas células H-RS, seja de uma maneira

T-dependente no caso de CD40 ou T-independente (constitutiva) na LMP1 (POPPEMA,

2005)

A via NF-κB regula a expressão de diversos genes envolvidos na proliferação celular e

apoptose na resposta inflamatória, resistência a drogas, citocinas, entre outras (HINZ et al.,

2002) e é observada constitutivamente ativada tanto em pacientes EBV positivos como

negativos, indicando sua importância para o desenvolvimento da doença (YOUNG;

RICKINSON, 2004).

Ainda com relação à latência II do EBV, recentemente foi mostrado que a manutenção

deste padrão de latência no LHc é regulada pela interação da célula tumoral com estímulos

das células do microambiente, especificamente células T CD4+, mediado por IL-21 (KIS et

al., 2010).

Em relação aos subtipos de LHc, o vírus EBV tem sido associado majoritariamente

com o subtipo de CM (CARBONE et al., 2009) e a idades inferiores a 10 anos

(ARMSTRONG et al., 1993; CHABAY et al., 2008).

No que se refere à resposta terapêutica, aparentemente o EBV tem efeitos diferentes

no LHc de acordo com a idade do paciente: nas crianças apresenta um papel favorável

enquanto que uma pior resposta é observada no grupo de adultos (CLAVIEZ et al., 2005;

JARRETT et al., 2005; KEEGAN et al., 2005).

1.5 Proliferação e escape da apoptose no linfoma de Hodgkin clássico

Os estudos no LHc trazem junto de si um grande desafio metodológico, visto a

dificuldade de abordar de maneira teórica e funcional uma doença em que a população

tumoral não ultrapassa 2% da massa tumoral, e além disso, está composta por duas

populações neoplásicas, uma constituída por células que mantém sua capacidade proliferativa,

e uma população que perdeu a capacidade de proliferar, como as RS. De fato, as células H-RS

expressam marcadores de proliferação celular (Ki67, PCNA, TOP2A, etc.) em diversas

proporções indicando a entrada no ciclo celular; porém, não há correlação entre o nível de

expressão destes marcadores e o número de células tumorais (BAI et al., 2006; BARROS et

al., 2010). Isto sugere que a indução da replicação do DNA está desacoplada da divisão

celular. De fato, sabe-se que a multinucleação e poliploidia das células H-RS é devida à

parada mitótica seguida por defeitos na citocinese e/ou endoreduplicação do material

9

genético, assim como estádios mitóticos abortivos e defeitos na passagem de metáfase para

anáfase (KUPPERS, 2001; PARK et al., 2008; BARROS; ZALCBERG; HASSAN, 2009).

As células H-RS exibem alterações nas principais vias do ciclo celular. Os principais

mecanismos descritos até o momento são a desregulação de genes relacionados aos

checkpoints G1/S (por exemplo, ciclinas D1, D2 e D3, ciclina E, CDK2) e G2/M (por

exemplo, ciclinas A, B1, C, CDK4, BUB1) (BAI et al., 2005), assim como a inativação da

supressão tumoral através das vias p14ARF/HDM2/p53/p21(Cip1/WAF1), p16-INK4a/Rb e

p27KIP1 (TZANKOV et al., 2005; SANCHEZ-AGUILERA; MONTALBAN; et al., 2006).

Mesmo com grandes alterações na maquinaria do ciclo celular, mutações em p53 são

significativamente menores no LHc do que em outras neoplasias (ELENITOBA-JOHNSON

et al., 1996; MONTESINOS-RONGEN et al., 1999), e o modelo que vem sendo proposto

para a inativação da via de p53 nas células H-RS seria a perturbação estrutural ou topológica

de proteínas nucleares que regulam a estabilidade de p53 (GARCIA et al., 2002), tais como

HDM2 e p14ARF.

Em relação à apoptose, é sabido que no LHc há duas vias principais ativas,

tipicamente envolvidas no controle da apoptose nos linfócitos, como a via FAS-FASL e a via

endógena da família de proteínas BCL2 (BAI et al., 2005). As proteínas da família BCL2

podem ser indutoras e repressoras de morte celular programada e participam ativamente da

sua regulação. Proteínas como BCL2 e BCL2L1 (Bcl-XL) inibem a apoptose pois previnem a

liberação de citocromo c e são consideradas reguladores anti-apoptóticos. Por outro lado,

BAX, BID e BAK são proteínas pró-apoptóticas. Dada a sua importância no controle da

apoptose nos linfócitos, BCL2 e BCL2L1 estão constantemente alteradas em diversos tipos de

neoplasias hematológicas. No LH, um aumento nos níveis de BCL2, BCL2L1, BAX, BAD e

uma diminuição de BAK e BID tem sido descritos nas células de H-RS (GARCIA et al.,

2003; SANCHEZ-AGUILERA; MONTALBAN; et al., 2006; BAI et al., 2007). Apesar do

foco dos estudos sobre apoptose nas neoplasias hematológicas ser em BCL2, a alta expressão

de BCL2L1, BAX e BAD nas células H-RS indicam que estas proteínas podem ter papeis

predominantes na regulação da apoptose no LHc (BAI et al., 2007).

A execução do apoptose depende do funcionamento adequado de seus efetores,

especialmente das caspases. As caspases (cysteine-aspartic-acid-proteases) são um grupo de

proteínas que pertencem à família das cisteínas proteases (caracterizadas pela presença de

uma cisteína no sítio ativo) capazes de reconhecer e clivar substratos que possuem um resíduo

10

de ácido aspártico (D'AMELIO; CAVALLUCCI; CECCONI, 2010). São descritas 14

caspases humanas, entretanto, apenas seis (caspases -3, -6, -7, -8, -9 e -10) participam do

processo de apoptose. As outras caspases tem suas funções descritas na maturação de

citoquinas e seu papel na apoptose ainda não esta esclarecido (DENAULT; SALVESEN,

2002; BOATRIGHT; SALVESEN, 2003). A Caspase-3 (CASP3) é a principal efetora da

apoptose, clivando (ou modificando a função) de substratos celulares e sendo um importante

ponto de convergência das vias de apoptose extrínseca (iniciada por receptores na superfície

celular) e intrínseca (mitocondrial) (PORTER, 2006) (Fig. 1.3). Sua maturação depende de

modificações pós-traducionais catalíticas, a partir de uma forma inativa, a procaspase-3, cuja

clivagem gera a forma ativa ou CASP3 (SMITH; JIN; JOSHI, 2007). Assim, altos níveis de

ativação de CASP3 deveriam estar correlacionado com o funcionamento ótimo da maquinaria

apoptótica, resultando em células sensíveis à quimioterapia.

Fig. 1.3: Descrição da via de morte celular (apoptose) dependente de caspases. CASP3 pode ser ativada mediante duas vias: extrínseca ou intrínseca. A via extrínseca ocorre mediante a ativação dos receptores do fator de necroses tumoral, principalmente FAS-FASL, que ativa CASP8 (iniciadora) e finalmente à CASP3. Já na via intrínseca, a CASP3 é ativada via mitocondrial por estímulos de morte originados por p53 ou genes da família BCL2 que ativam à CASP9 (iniciadora) seguidamente de CASP3 causando o efeito de morte celular. FADD: FAS ativado. Adaptado de SMITH et al. (2007).

11

O papel das caspases não tem sido relacionado unicamente à morte celular, tendo sido

envolvidas em processos não apoptóticos como proliferação ou diferenciação nas células

hematopoiéticas, musculares e do sistema nervoso central (SCHWERK; SCHULZE-

OSTHOFF, 2003; D'AMELIO et al., 2010).

Em relação à expressão de CASP3 pelas células tumorais do LHc, diferentes resultados

tem sido relatados, desde uma alta expressão na maioria das células (67% de células

expressando CASP3) (BAI et al., 2007) a um menor número de células expressando-a (0-

13%) (DUKERS et al., 2002). Sua expressão foi correlacionada com outros marcadores da

apoptose, como TUNEL (do inglês, Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end

labeling), clivagem de PARP (família de proteínas poly ADP ribose polymerase), entre outros

(DUKERS et al., 2002; BAI et al., 2005; BAI et al., 2007). No entanto, até o momento não

existe uma caracterização da expressão de CASP3 e sua relação com a apoptose nas

subpopulações celulares do microambiente tumoral do LHc.

1.5.1 Prognóstico associado à proliferação e apoptose no linfoma de Hodgkin

clássico

Numa visão clássica do câncer, considera-se que as alterações da proliferação e

apoptose das células tumorais são determinantes na resposta destas células aos tratamentos.

No LHc, a busca por marcadores terapêuticos associados às células H-RS tem sido intensa,

para uso na estratificação de pacientes ao diagnóstico e adequação da intensidade das terapias

administradas, visto a baixa idade da maioria dos pacientes e a toxicidade das drogas básicas

utilizadas no tratamento (SCHWARTZ, 2003).

A desregulação de genes relacionados aos checkpoints G1/S e G2/M foi associado ao

prognóstico, como será descrito com mais detalhe na secção 1.8. Um conceito importante, e

ainda não provado, na biologia do LHc é que os defeitos do ciclo celular estariam associados

de forma intrínseca à aquisição do fenótipo de resistência a drogas (SANCHEZ-AGUILERA

et al., 2006).

Por outro lado, a positividade na imunoexpressão de p53 no LHc pode variar de 30% a

93% (MORENTE et al., 1997; GARCIA et al., 2003; MONTALBAN et al., 2004) e o

prognóstico desta expressão é controverso, principalmente devido à ausência de um ponto de

corte padronizado para a distinção entre casos positivos e negativos (MONTALBAN et al.,

2004; SPECTOR et al., 2005).

12

BCL2 tem sido alvo de vários estudos a fim de elucidar se a presença desta proteína

anti-apoptótica poderia influenciar a sobrevida no LHc com resultados contraditórios. Em

alguns estudos, a imunoexpressão de BCL2 esteve associada a uma pior sobrevida (BRINK et

al., 1998; SMOLEWSKI et al., 2000; SUP et al., 2005), enquanto em outros, não houve

diferenças na resposta ao tratamento (SMOLEWSKI et al., 1998; SPECTOR et al., 2005).

Em relação a CASP3, sua expressão nas células H-RS determinada por

imunohistoquímica (IHQ) foi correlacionada com o prognóstico; altos números de células

tumorais expressando CASP3 (≥5%) está correlacionada com uma boa resposta suportando a

noção que uma ativação da cascata da apoptose é essencial para o efeito da quimioterapia na

morte celular (DUKERS et al., 2002). Já BAI et al. (2007) não encontraram associação dos

níveis de expressão de CASP3 com o prognóstico da doença.

É possível que a combinação de marcadores relacionados ao funcionamento do ciclo

celular e a capacidade de morte celular possam ser mais hábeis no delineamento prognóstico

dos pacientes com LHc. Neste sentido, MONTALBAN et al. (2004) mostraram que a

expressão pelas células H-RS de p53, BCL2 e apoptose (TUNEL) poderia ser agrupada num

escore prognóstico capaz de definir grupos de risco biológicos com diferenças na sobrevida. É

importante ressaltar que, apesar de todos os esforços de pesquisa, nenhum destes marcadores

encontra-se validado para sua aplicação clínica nos dias de hoje.

1.6 O microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico

O recrutamento de células do sistema imune observado em muitos tumores,

especialmente nas neoplasias linfóides e, dentro delas, de maneira excepcional no LHc, indica

um papel primário dos processos inflamatórios e de vigilância tumoral na constituição do

microambiente, onde é possível enxergar pelo menos dois processos em conflito. Por um lado,

a célula H-RS produz diferentes tipos de citocinas e quimiocinas cuja função pode ser

autócrina (para seu próprio sustento) ou pode servir para recrutar células não malignas do

sistema imune, causando um processo inflamatório onde estas células atraídas contribuem à

manutenção e proliferação das células H-RS (Fig. 1.4) (ALDINUCCI et al., 2010). Por outro

lado, antígenos tumorais, ou, no caso do LHc EBV+, virais, podem estar deflagrando uma

resposta imune citotóxica tendente a combater as células tumorais. Mecanismos de contra-

insurgência destinados a suprimir, anergizar ou tolerizar esta resposta podem ser montados

pela célula tumoral. O resultante destes processos é o microambiente tumoral (MAT), que

13

poderia ser definido como o conjunto de elementos que rodeiam as células tumorais (células e

elementos formados e amorfos do estroma), assim como o “milieu” bioquímico formado por

proteínas (citocinas, quimiocinas, etc.) secretadas por células tumorais e não tumorais

infiltrantes.

As células H-RS são quase absolutamente dependentes dos estímulos do

microambiente, sendo dificilmente encontradas no sangue periférico, ou em crescimento em

culturas in vitro ou animais imunodeficientes (KUPPERS; ENGERT; HANSMANN, 2012).

Fig. 1.4: Composição do microambiente tumoral e interações patogênicas entre células H-RS e células infiltrantes. As células tumorais produzem citocinas e quimiocinas capazes de atrair diretamente ou indiretamente células inflamatórias ao seu redor para sustentar sua proliferação e constituir o microambiente do linfoma de Hodgkin clássico. De igual maneira as células infiltrantes não malignas produzem moléculas que vão modular as células H-RS. Adaptado de KUPPERS et al. (2012).

14

O MAT é formado por uma grande diversidade de células inflamatórias infiltrantes

como células T (reguladora, citotóxicas, auxiliares), células B, plasmócitos, monócitos,

macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocitas, entre outras (ALDINUCCI et al.,

2010), todas em quantidades variáveis. Foi mostrado que a composição do MAT depende do

subtipo histológico, da idade do paciente e da presença do EBV (MAGGIO et al., 2002;

ALDINUCCI et al., 2010; STEIDL; CONNORS; GASCOYNE, 2011)

Os linfócitos T são uma parte importante do infiltrado inflamatório do LHc. Estas

células podem ser classificadas em diferentes subtipos dependendo da sua função: células T

citotóxicas, células Th tipo 1, 2, 17 (existem outros tipos que escapam ao objetivo desta

revisão), células T reguladoras e células T de memória.

Os linfócitos citotóxicos CD8+ (CTLs) tem um papel na resposta imune antiviral,

assim como também são responsáveis pela vigilância e imunidade antitumoral (SUN;

LANIER, 2011). Sua ação é exercida de maneira direta através da citotoxicidade mediada por

sustâncias citolíticas contra as células alvo, como perforina, TIA1 e granzima B (GRZB)

(ANIKEEVA; SYKULEV, 2011; SANT; MCMICHAEL, 2012).

As células Th, CD4+ tem a função geral de ativar as células apresentadoras de

antígenos (células dendríticas, macrófagos ou células B) após reconhecimento do antígeno

restrito pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC; do inglês, major

histocompatibility complex) de classe II, que levam em primeiro lugar ao aumento de

expressão de co-receptores para ativação das células T efetoras, e em segundo lugar, à

polarização da resposta imune para pro-inflamatória ou supressora, dependendo das citocinas

secretadas. As células Th1 são produtoras de interleucina (IL) 2, interferon gamma (IFN-γ),

TNF e IL-12, e podem ser identificadas pela expressão nuclear do fator de transcrição (FT)

TBX21 (TBET). O papel funcional destas células é principalmente polarizar a resposta pró-

inflamatória acompanhada de uma ativação citotóxica e de macrófagos de tipo M1

(DENARDO; ANDREU; COUSSENS, 2010; VESELY et al., 2011). Já as Th2 são

produtoras principalmente de IL-4 e IL-10 sendo reconhecida principalmente pelo fator de

transcrição GATA3. O FT MAF é responsável pela regulação da expressão de IL10 e pode ser

considerado marcador de célula T CD4+ Th2/reguladora (ZHU; PAUL, 2008).

As células T reguladoras (Treg) caracterizam-se pelo imunofenótipo CD4+ CD25+

FOXP3+ e por apresentar uma função de imunoregulação, via principalmente a expressão de

15

IL10, suprimindo a proliferação de outros tipos celulares como CTLs. O FT FOXP3 é capaz

de inativar a via NF-κB assim como atuar na repressão de IL-2, IL-4 ou IFN-γ evitando a

polarização de outras células T (OBERG et al., 2011).

Um linfonodo normal está composto por um grande número de linfócitos B. No LHc,

estas células fazem parte do MAT, mas ainda seu papel e envolvimento no tumor é

desconhecido. Os linfócitos B podem atuar como células efetoras da imunidade humoral,

expressar citocinas e quimiocinas importantes nos processos de diferenciação, proliferação e

resposta inflamatória da célula B, ou ser apresentadoras de antígeno nas reações do centro

germinativo (STEIDL; CONNORS; et al., 2011). O desenvolvimento de melhores

marcadores celulares de diferenciação permitirá compreender melhor o envolvimento desta

linhagem nos processos tumorais.

Os monócitos/macrófagos são células caracterizadas por atuar na primeira linha de

defesa do organismo frente a patógenos e apresentam um papel importante tanto nos processo

de inflamação como na resposta imune do hospedeiro. Seu papel na resposta imune inata é

caracterizado por sua capacidade de reconhecimento de antígenos, enquanto que atuam como

células apresentadoras de antígenos para as células T na resposta imune adaptativa (BISWAS;

MANTOVANI, 2010; MANTOVANI et al., 2013).

No contexto tumoral, os monócitos são recrutados e transformados em macrófagos

para atuar como células efetoras em diferentes situações como na inflamação, na reparação

tecidual, e para produzir uma resposta ou erradicar uma infecção (MANTOVANI et al.,

2002). Por outro lado, as células macrofágicas se caracterizam por apresentar uma alta

plasticidade (MANTOVANI; LOCATI, 2009), podendo ser polarizadas dependendo do

estímulo encontrado: patógenos, tecido danificado, sub-populações de células T, mudando sua

função imunoreguladora para pró-inflamatória ou vice-versa (GUIDUCCI et al., 2005).

Os macrófagos podem reprogramar sua função e ser polarizados para diferentes

fenótipos:

1 Função pró-inflamatória causada por uma resposta Th1 a IFN-γ com a fosforilação de

STAT1 (MANTOVANI et al., 2002; SAHA et al., 2010).

2 Função imunoreguladora de remodelação tecidual, angiogênese e progressão tumoral

modulada por uma resposta Th2 (CAO et al., 2005; BISWAS; MANTOVANI, 2010).

16

No modelo do LHc, os macrófagos associados ao tumor (TAM) são considerados uma

população especial que expressam a proteína de membrana CD163, e desenvolvem funções

na resposta inflamatória e imune adaptativa, na remodelamentoo tecidual e no reparo

(MANTOVANI et al., 2002; ALLAVENA et al., 2008; BISWAS; MANTOVANI, 2010). O

estado de polarização intratumoral dos macrófagos no LHc não foi descrita até o momento.

Os eosinófilos são leucócitos com características multifuncionais que participam da

resposta imune inata, mas podem engajar-se em um “cross-talk” com a resposta adaptativa,

participando da resposta inflamatória, da regulação da resposta imune e da homeostase

tecidual. No caso do LHc, eles podem ser encontrados em grandes quantidades ao redor da

célula tumoral, sendo atraídos principalmente pela eotaxina produzida pelos fibroblastos e

interagem com a célula H-RS através do ligante da proteína de membrana CD30 (CD30L),

que reconhece o receptor CD30 na célula tumoral (ALDINUCCI et al., 2010; GATAULT et

al., 2012).

1.7 Fatores prognósticos associados ao microambiente tumoral no linfoma de

Hodgkin clássico

A composição do MAT no LHc tem sido relacionada à resposta terapêutica. Em

termos gerais, um maior número de CTLs (CD8+, TIA1+, GRZB+) e um menor número de

células Treg (CD4+ CD25+ FOXP3+) estão associadas a um pior prognóstico (ALVARO-

NARANJO et al., 2005; ALVARO et al., 2005; KELLEY et al., 2007; TZANKOV et al.,

2008). Isto é o oposto ao observado na maioria dos tumores sólidos, onde um pior prognóstico

é descrito associado a um maior número de células Treg (DELEEUW et al., 2012), em

concordância com um modelo de resposta imune citotóxica suprimida pelas Treg. Nas

neoplasias hematológicas, o observado aponta para a necessidade de refinar os conceitos da

resposta imune antitumoral baseado na imunovigilância.

O papel dos TAMs ainda é controverso, visto que a maioria dos trabalhos observou

uma associação desfavorável entre macrófagos CD68+ ou CD163+ e a sobrevida dos

pacientes adultos (SANCHEZ-AGUILERA; MONTALBAN; et al., 2006; STEIDL et al.,

2010; TZANKOV; MATTER; DIRNHOFER, 2010; KAMPER et al., 2011; TAN et al.,

2012; DEAU et al., 2013), porém, vários outros estudos não identificaram uma associação

com o prognóstico (AZAMBUJA et al., 2012; HARRIS et al., 2012). Nas crianças, um pior

17

prognóstico foi associado à presença de um número maior de macrófagos CD163+

(BARROS; HASSAN; NIEDOBITEK, 2012).

Quanto ao papel dos eosinófilos infiltrantes, um número maior foi associado a um pior

prognóstico no subtipo EN, não havendo impacto aparente na sobrevida nos outros subtipos

histológicos (GATAULT et al., 2012). Em contraste, nos tumores sólidos um número maior

destas células está associado a um melhor prognóstico (MURDOCH et al., 2008; GATAULT

et al., 2012).

1.8 Estudos de expressão gênica no linfoma de Hodgkin

Nos últimos anos, muitos estudos de expressão gênica global foram conduzidos no

câncer com o intuito de identificar marcadores moleculares que possam diferenciar perfis de

expressão e, consequentemente, auxiliar no diagnóstico, subclassificação, e/ou escolha

terapêutica. Todavia, são poucos os estudos que conseguiram ser validados para aplicação na

rotina clínica (VAN 'T VEER et al., 2002; VAN DE VIJVER et al., 2002; MALUMBRES et

al., 2008; XIE et al., 2011). Metodologias como a PCR (reação em cadeira da polimerase)

quantitativa a partir de RNA (RT-qPCR, reação de transcrição reversa seguida por PCR)

permitem quantificar com maior precisão a expressão gênica e por isto são candidatas a serem

validadas na rotina clínica (TANG et al., 2012).

No LHc, visto a complexidade do tumor, os estudos de expressão gênica em grande

escala tem sido realizados por diferentes autores, tendo como foco tanto a célula H-RS como

o MAT. DEVILARD et al. (2002), realizaram o primeiro estudo de identificação de perfis de

expressão gênica, utilizando RNA obtido da massa tumoral total e “chips” caseiros em

suporte de nylon para aproximadamente 1000 genes, visando diferenciar níveis de expressão

gênica com papel na predição da evolução clínica de 21 pacientes. Os autores encontraram as

vias da ativação dos fibroblastos e angiogênese associadas a um desfecho clínico

desfavorável.

Outro estudo em pacientes com LHc avançado foi realizado para identificar perfis

diferenciais, utilizando um chip de microarray com 9348 genes. Neste estudo, as vias

relacionadas à resposta imune do hospedeiro, ao microambiente (macrófagos, células T e

dendríticas), ao ciclo celular e à apoptose estiveram associadas ao grupo com desfecho

desfavorável, enquanto que genes relacionados às células B, células apresentadoras de

18

antígenos, remodelamento tecidual e fibroblastos foram expressos pelo grupo com desfecho

favorável (SANCHEZ-AGUILERA et al., 2006).

Ainda através da metodologia de microarray (Affymetrix), outro estudo realizado com

63 pacientes adultos observou que genes relacionados às células B e apoptose estavam

associados a um melhor prognóstico, enquanto que os genes da matriz extracelular foram

relacionados a uma pior sobrevida como genes relacionados ao colágeno, entre outros

(CHETAILLE et al., 2009).

Em relação à identificação de perfis de expressão específicos da célula H-RS, dois

estudos de microarray foram realizados mediante o uso de microdissecção da célula tumoral.

O primeiro estudo visou identificar padrões de expressão das células H-RS, sem qualquer

preocupação com o prognóstico clínico, e identificou um grupo de casos cuja células H-RS

expressavam genes relacionados à diferenciação citotóxica, receptores de sinalização de

superfície e apoptose na célula tumoral, concomitante a baixa expressão de genes de

diferenciação B. Genes relacionados à função dos macrófagos, a angiogênese e da via de

sinalização NF-κB estiveram associadas à falha do tratamento primário. A superexpressão de

CSF1R (receptor para CSF1) foi observada nas células H-RS. Em diferenças de perfis de

expressão foram atribuídos a presença do EBV, embora não tenha sido identificado uma via

específica. (STEIDL et al., 2012).

O segundo estudo, apesar de não observar uma assinatura diferenciada para os casos

EBV+ e EBV-, identificou 14 genes diferencialmente expressos apenas nos casos EBV

positivos. Por outro lado, detectou dois grupos de pacientes diferenciados pela assinatura de

genes relacionados a MYC, IRF4 e NOTCH1, assim como diferenças entre células H-RS

provenientes do subtipo EN em relação às de CM (TIACCI et al., 2012).

Recentemente, um estudo utilizando a metodologia de RT-qPCR em array (TaqMan

Low Density Array, TLDA) a partir de RNA da massa tumoral total identificou um desfecho

desfavorável associado a super-expressão de genes das vias do ciclo celular, apoptose

mitocondrial e checkpoint mitótico (células H-RS) e de genes relacionados às células T,

monócitos e macrófagos (MAT) (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2009). A partir deste

estudo, foi proposto um escore clinico para ser aplicado em pacientes adultos com LHc

avançado, cujo valor prognóstico foi baseado na alteração combinada da expressão gênica de

quatro vias funcionais (ciclo celular, apoptose, ativação de monócitos/macrófagos e o fator

19

regulador de interferon 4), onde uma superexpressão dos genes relacionados ao ciclo celular

e apoptose foram considerados como um fator negativo, enquanto que os relacionados ao

monócitos/macrófagos como um fator de proteção (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010).

1.9 Análises da expressão gênica em material fixado e impregnado em parafina

Tecidos fixados em formalina e impregnados em parafina (FFPE) são uma fonte

inestimável de material genético para estudos moleculares e uma maneira fácil e econômica

de guardar as amostras para que possam ser usadas em pesquisa ou refinamento diagnóstico.

O principal problema com estes materiais é que os ácidos nucleicos sofrem degradação, e a

etapa da fixação com o formaldeído produz ligações entre DNA, RNA e proteínas e adiciona

grupamentos monometil que comprometem a amplificação do RNA isolado (MASUDA et al.,

1999).

Em amostras provenientes de linfonodos, a extração de RNA de boa qualidade

apresenta maior dificuldade porque estes tecidos são muito frágeis e a morte celular começa

logo após a separação do tecido, e antes mesmo da ação do fixador ter início (ANTICA et al.,

2010). Como regra geral, nos RNAs provenientes de amostras FFPE, a amplificação das

reações de PCR ocorre com valores altos nos ciclos de quantificação (Cq), quando

comparados aos RNAs de amostras provenientes de tecidos frescos. Esta situação é causada

principalmente pela presença de inibidores que são coextraídos com o RNA (GODFREY et

al., 2000; KOCH et al., 2006; BAR; KUBISTA; TICHOPAD, 2012), afetando as análises de

qPCR no grupo de genes com baixo nível de expressão gênica.

Por tanto, vários estudos tem sido realizados visando a otimização tanto da extração

como da amplificação de RNA de material FFPE provenientes de amostras de linfonodos

(CHEN; BYRNE; LOSSOS, 2007; BOHMANN et al., 2009; SANCHEZ-ESPIRIDION et

al., 2010; ELLSWORTH et al., 2011; LENEHAN et al., 2012). Em termos gerais, estes

estudos são focados na avaliação de qualidade e amplificação do RNA.

1.10 Aplicação de análise da variância tipo nested

Uma abordagem muito interessante para avaliar a variabilidade introduzida em cada

etapa experimental de uma metodologia utilizada em biologia molecular foi proposta por

TICHOPAD et al. (2009) e KITCHEN; KUBISTA; TICHOPAD (2010) através de um

desenho ANOVA tipo nested que permite identificar a variação introduzida em cada etapa da

20

metodologia, fornecendo bases experimentais para realizar ajustes no desenho do estudo e nos

procedimentos técnicos.

ANOVA (do inglês, analysis of variance) é um método paramétrico usado para

comparar as médias de um grupo de amostras. A ideia subjacente é calcular as medias das

observações dentro de cada grupo e então comparar as variâncias entre essas médias à

variância media dentro de cada grupo. Sob a hipótese nula de que as observações nos

diferentes grupos tem a mesma média, a variância entre grupos não será diferente que as

observadas dentro de cada grupo. O estatístico calculado Fs é a razão da variância entre as

médias dos grupos dividida pela variância dentro dos grupos. No ANOVA de um fator há

uma variável contínua e uma variável nominal (fator). Múltiplas observações da variável

contínua devem existir para cada valor tomado pela variável nominal.

ANOVA tipo nested é uma extensão do ANOVA de um fator, onde cada grupo é

divido em subgrupos. No momento das análises os subgrupos são escolhidos de maneira

aleatória a partir de um conjunto maior de subgrupos possíveis (MCDONALD, 2009). O

primeiro desenho experimental foi desenvolvido por Ronald A. Fisher (FISHER, 1926), em

um método estruturado e organizado. Este desenho hierárquico permite conhecer os erros

introduzidos em cada nível onde é possível determinar as relações entre diferentes fatores e o

efeito dos processos experimentais em cada passo.

O desenho ANOVA tipo nested quando é aplicado ao desenho experimental em qPCR

permite quantificar os ruídos no nível biológicos e técnicos incorporados no processamento de

amostras e assim determinar a precisão dos ensaios da expressão gênica. Uma diferença real

nos níveis de expressão causados pela condição clínica ou por manipulações experimentais

somente poderia ser percebida se conseguem superar as variabilidades técnicas e biológicas

(TICHOPAD et al., 2009).

Não existem dados na literatura avaliando os processamentos utilizados para extração

de RNA a partir de material FFPE, assim como a variabilidade biológica subjacente a

amostras complexas como é o caso do LHc.

21

1.11 PCR quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para validação de

perfis de expressão gênica com aplicação clínica

A invenção da metodologia de PCR em tempo real por HIGUCHI et al. (1992) teve

um papel muito importante na pesquisa biológica e na biologia molecular. Esta ferramenta

tem uma grande aplicação na medicina, e em particular na oncologia, para pesquisa, busca e

desenvolvimento de marcadores biológicos para o diagnóstico, seguimento e predição de

doenças, como para patógenos associados.

A PCR quantitativa é conhecida pelo termo de qPCR, ou RT-qPCR quando é referida

à amplificação a partir de RNA retrotranscrito. Esta metodologia permite a monitoração da

reação de PCR enquanto esta ocorre, medindo a cinética da reação desde as fases iniciais,

ciclo após ciclo, o que possibilita a quantificação mediante o uso de corantes fluorescentes.

Existem duas tecnologias principalmente utilizadas nas reações de qPCR: 1)

TaqMan®, baseada no fenômeno do FRET mediante a utilização de uma sonda e; 2) corantes

intercalantes onde a emissão de fluorescência é evidenciada pela ligação a duplas fitas

(exemplo: Syber Green) (KUBISTA et al., 2006).

As reações de RT-qPCR para análises de expressão gênica podem ser afetadas pela

pureza e integridade do RNA inicial, sendo a qualidade do mesmo uma condição importante

para o desenvolvimento de uma metodologia ótima (FLEIGE; PFAFFL, 2006). A presença de

contaminantes como DNA, proteínas ou inibidores (fenol, sais, etanol) nas amostras altera o

rendimento tanto das reações de retrotranscrição (RT) como da PCR (STAHLBERG et al.,

2004; TICHOPAD; DIDIER; PFAFFL, 2004; SUSLOV; STEINDLER, 2005)

A cinética de uma reação de qPCR está composta por diferentes fases de acordo à

disponibilidade dos reagentes na reação, considerando a eficiência de duplicação de produtos

em cada ciclo: línea de base (do inglês, baseline), exponencial, linear e platô (do francês,

plateau) (KUBISTA et al., 2006) (Fig. 1.5).

• Fase de línea de base: se localiza nos primeiros ciclos da reação e a fluorescência

produzida não é capaz de se diferenciar do ruído da reação.

• Fase exponencial: durante esta fase da reação o produto acumulado é exatamente o

dobro do produto amplificado em cada ciclo, podendo ser considerada que a reação se

22

encontra com 100% da eficiência. Neste passo a reação mostra a maior especificidade e

precisão.

• Fase linear (alta variabilidade): neste ponto parte dos componentes da reação estão

sendo esgotados, o que se reflete em uma cinética mais lenta combinado com a

degradação de alguns produtos da reação.

• Fase platô: é denominada também como o ponto final da reação, onde há um balanço

termodinâmico entre o que é produzido e o que é degradado.

Fig. 1.5: Fases de uma curva de reação de PCR quantitativa. A figura apresenta uma reação de PCR onde é possível diferenciar as quatro fases de uma reação: línea de base, exponencial, linear e platô. Adaptado de PFAFFL (2003).

Os processos exponenciais podem ser descrito utilizando a equação (1.1) que explica a

cinética da curva:

Ni = N0 x (1 + k)i (1.1)

Onde N0 representa o número de moléculas na amostra original; Ni: número de

moléculas no ciclo i (i=0-40); k: eficiência da reação durante a fase exponencial (0 < k < 1).

1.12 Métodos de determinação do valor de quantificação por PCR em tempo real

Durante muitos anos, o método do ciclo fixo tem sido considerado o método padrão de

quantificação por qPCR (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Existem dois métodos para

23

determinar este valor: 1) Método fit point, onde o sinal de fluorescência é capaz de atravessar

uma línea arbitrária denominada threshold que se encontra situada na região logarítmica (fase

exponencial da reação) (PFAFFL, 2004). O ciclo threshold (Ct) é definido como o número de

ciclo fracionar na região logarítmica-linear da reação, onde esta atinge um ponto pré-

estabelecido; 2) Método da segunda derivativa máxima, em que o ponto de quantificação é

situado onde a segunda derivativa da curva de intensidade de fluorescência atinge um valor

máximo calculado, conhecido na literatura como Cp (LUU-THE et al., 2005). Há na

atualidade uma tendência a denominar qualquer um dos mencionados como ciclo de

quantificação Cq (BUSTIN et al., 2009). Uma condição essencial para a adoção deste método

é que a eficiência das reações deve ser similar entre amostras padrões vs. desconhecidas, ou

gene de interesse vs. gene de referência.

Novas estratégias de determinação do ponto de quantificação baseados na cinética da

curva vem surgindo nos últimos anos, fundamentadas na observação da falta de similaridade

das cinéticas dos padrões em relação às amostras, principalmente quando estas apresentam

matrizes diferentes das dos controles (por exemplo, controles plasmidias e amostras de RNA

de parafina) que levam a diferenças no desempenho da reação de PCR, as quais não são

consideradas pelos métodos Cq. Os métodos baseados na cinética da curva de PCR buscam

superar a quantificação obtida a partir de um ponto único, visando capturar características da

cinética em todas as suas fases. A principal limitação é que a cinética da PCR não é

totalmente conhecida e não há modelo matemático satisfatório que possa descrever a reação

desde o início até a fase platô (SCHNELL; MENDOZA, 1997; KAINZ, 2000).

Por isto, o modelo clássico exponencial pode ser aplicado somente à parte inicial da

trajetória cinética da PCR. Para remediar isto, vários modelos empíricos não lineares foram

propostos, a maioria deles baseada numa eficiência constante na fase exponencial da reação,

mas com diferentes maneiras de realizar os cálculos da linha de base da fluorescência, a fase

exponencial, a eficiência, o limite de quantificação e o Cq. Alguns dos algoritmos propostos

são MAK2, FPK-PCR, LinRegPCR, Cy0 e Real time PCR-Miner (RUIJTER et al., 2013).

Neste trabalho, escolhemos comparar o método clássico de Cq (LIVAK; SCHMITTGEN,

2001) com o modelo denominado Cy0 (GUESCINI et al., 2008). Para entender este último,

apresentaremos inicialmente o modelo sigmoide de quatro parâmetros, estabelecido por

TICHOPAD et al. (2003).

Neste modelo, definido pela equação (1.2):

24

(1.2)

f representa o valor de fluorescência após n ciclos,

y0 = fluorescência basal,

a = diferença entre a máxima fluorescência adquirida e a fluorescência basal,

e = base do logaritmo natural,

n = número de ciclo fracional,

n0 = primeira derivativa máxima da função do ponto de inflexão da curva, e

b = pendente da curva em n0.

A Fig. 1.6 apresenta uma representação deste modelo.

Fig. 1.6: Modelo sigmoide de quatro parâmetros. A inspeção da curva permite reconhecer alguns elementos identificáveis na reação de qPCR. Por exemplo, valores altos de a correspondem a grande quantidade de produto de PCR acumulado após a amplificação completa; valores baixos de b se correspondem com uma alta Eficiência da reação; n0 (ponto de inflexão da curva) alto corresponde a retraso da reação devido a baixo número de cópias ou a baixa eficiência. Este último valor seria comparável ao Ct ou Cp, ficando então evidente o acréscimo de informação fornecido pelos outros parâmetros. Adaptado de TICHOPAD et al. (2003) e TICHOPAD (2004).

25

1.12.1 Método Cy0

O método Cy0 é um método de quantificação proposto por GUESCINI et al. (2008), e

se baseia na utilização da equação de Richards utilizando cinco parâmetros da curva, onde o

valor de quantificação é calculado pelo ponto de interseção entre o eixo da abscissa e a

tangente do ponto de inflexão da curva, obtido por uma regressão não linear (Fig. 1.7). Este

método não requer eficiências similares nas reações de dois genes, nem da utilização de um

nível pré-definido pelo usuário.

Fig. 1.7: Curva de PCR com os cinco parâmetros da função de Richards. Nos círculos abertos são mostrados os valores previstos da curva; linha acompanhada de pontos representa os dados obtidos experimentalmente; o losango representa o ponto de inflexão da curva; o valor de quantificação Cy0 é mostrado como círculo fechado; a tangente representada mediante uma linha continua. Adaptado de GUESCINI et al. (2008).

O algoritmo aplicado pelo método Cy0 para a quantificação é mostrado na equação

(1.3):

(1.3)

Onde, Fmax: fluorescência máxima da reação; c: ciclo fracionar em que a fluorescência de

reação atinge a metade de Fmax; b: inclinação da curva; d: coeficiente de Richard; Fb: ruído

da reação de fluorescência.

26

Como pode ser visto, as maiores diferenças com o método sigmoide é a utilização de

um quinto parâmetro e a necessidade de que a reação tenha atingido um platô. Os autores

propõem que este método é útil para detectar a presença de inibidores e, devido a recolher um

maior número de informação da curva, fornecer uma quantificação mais precisa nestes casos,

em que claramente as amostras não têm a mesma eficiência que os controles usados para

calcular esta eficiência.

1.13 Genes de referência e normalização

Erros na quantificação por qPCR vêm da acumulação de variações no material inicial

desde o processamento da amostras até a realização da reação de qPCR (diferenças de

amostragem, integridade de RNA, eficiências de RT, quantidade de cDNA colocada na

reação, entre outros). Uma ferramenta importante para diminuir esta variabilidade é o uso da

quantificação de um gene de referência (GDR), definidos como aqueles cuja variação entre

diferentes tecidos é mínima e que não se vejam afetados pelos tratamentos utilizados

experimentalmente. A normalização não é mais que a relativização da quantificação do gene

de interesse (GDI) frente ao GDR, calculado da seguinte maneira (equação 1.4):

Normalização = (Cq GDI – Cq GDR) (1.4)

Este passo apresenta grande importância quando as amostras são conservadas por

tempo variável, tomadas em diferentes tempos e indivíduos, diferentes tecidos e diferentes

situações experimentais, assim, é fundamental para compensar variações intra e inter qPCR

(amostras e corridas).

Diferentes modelos matemáticos têm sido propostos para escolher os melhores GDR

como (VANDESOMPELE; KUBISTA; PFAFFL, 2009):

• geNorm: se fundamenta no algoritmo matemático que determina um par GDR mais

estável de um grupo proposto, através do M-value de todos os genes candidatos,

eliminando o gene com maior M-value. Para poder ser aplicado este algoritmo é

necessário a comparação do mínimo três genes (VANDESOMPELE et al., 2002).

• Bestkeeper: se baseia no melhor par de GDR selecionados por analise de correlação e

regressão dos genes de a pares (PFAFFL et al., 2004).

27

• NormFinder: este algoritmo encontra o melhor GDR baseado em um teste de

ANOVA, calculando a variação intragrupo e intergrupo (ANDERSEN; JENSEN;

ORNTOFT, 2004).

1.14 Estratégia de quantificação utilizada em PCR em tempo real

As análises de expressão gênica podem ser realizadas mediante o uso de duas

estratégias: a quantificação absoluta ou a quantificação relativa. A quantificação absoluta é

realizada por calibração reversa em relação a uma curva padrão construída com diluições

seriadas com concentrações conhecidas do mesmo alvo a ser estudado, utilizando geralmente

um plasmídeo (PFAFFL; HAGELEIT, 2001). O valor de quantificação é expresso em número

de copias do transcrito (BUSTIN, 2000). A sua utilização principal é no contexto clínico, em

que a expressão de um alvo molecular pode ser assimilada ao valor da carga tumoral

(RENAULT et al., 2011). Para a análise de expressão gênica, prefere-se usar a estratégia de

quantificação relativa. Esta é utilizada para determinar as mudanças da expressão do RNAm

de um GDI em relação aos níveis de RNAm de um controle interno (GDR). Esta estratégia é

muito utilizada na procura de alterações fisiológicas no nível de expressão gênica (PFAFFL,

2004). Os valores de quantificação são expressos em fold change. Duas maneiras têm sido

propostas para calcular o valor da expressão relativa:

1 Sem correção da eficiência: denominado “método do Cq comparativo”, este método

não utiliza a correção da eficiência da reação, pois se baseia no requisito de que tanto

GDI como GDR apresentam uma eficiência ~100% e similares entre elas, com limites

de tolerância de 5-10% (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Para este cálculo,

estabelece-se uma amostra, linhagem celular, equivalente tecidual normal ou valor

grupal (por exemplo, média do grupo controle) como calibrador (valor 1). O cálculo é

realizado mediante a equação (1.5):

Fold change = 2-∆∆Cq (1.5)

Onde ∆∆Cq = [(Cq GDI amostra – Cq GDR amostra) - (Cq GDI calibrador – Cq GDR calibrador)]

e o número 2 representa uma eficiência de 100%.

Esta forma é utilizada quando o interesse é comparar dois grupos de amostras

pudendo ser um grupo de pacientes tratados vs. não tratados ou doentes vs. sadios.

28

SCHMITTGEN; LIVAK (2008) propõem que os dados de RT-qPCR também

podem ser apresentados como dado único, dispensando a calibração, onde o fold

change é calculado como 2-∆Cq.

2 Com correção de eficiência: este método é utilizado quando as eficiências entre o

GDI e GDR são diferentes e é baseado na seguinte equação (1.6) (PFAFFL, 2004):

Quantificação relativa = (Eficiência GDI) ∆Cq GDI (calibrador - amostra) (1.6)

(Eficiência GDR) ∆Cq GDR (calibrador - amostra)

Recentemente foi publicada uma guia sobre a mínima informação necessária para

publicação de experimentos usando RT-qPCR denominada MIQE (do inglês, Minimum

Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments), com a finalidade

de unificar os conceitos metodológicos, assim como a consistência e transparência dos

experimentos realizados (BUSTIN et al., 2009; BUSTIN et al., 2010).

1.15 O linfoma de Hodgkin clássico como doença complexa dos tecidos: abordagem

dos estudos de expressão gênica

A passagem para a multicelularidade a partir do estado unicelular da vida foi possível

a partir da aquisição evolutiva de mecanismos que articulam o controle molecular da divisão

celular e a decisão intrínseca da entrada em apoptose (e as outras formas de morte celular

programada) com estímulos vindos do meio extracelular, incluindo os que garantem a

homeostase tecidual no tempo (desenvolvimento) e no espaço (manutenção do estado

diferenciado). No nível organísmico, o desenvolvimento de sistemas de integração (nervoso,

imune, endócrino) permitiu a expansão da vida tal como hoje a conhecemos. A subversão

destes mecanismos requintados de controle trouxe como risco o câncer, que deste ponto de

vista deve ser considerado uma doença dos tecidos e não somente um processo de

transformação celular. Desta maneira, não é surpreendente encontrar que, entre os pilares

fundamentais que definem o estado neoplásico em geral, encontram-se as alterações no ciclo

celular e na resposta aos estímulos indutores de apoptose (HANAHAN; WEINBERG,

2000;2011), e mais recentemente, a inclusão do conceito de que não existe tumor que surja

alheio às condições de sustentação fornecidas pelo seu microambiente particular

(HANAHAN; WEINBERG, 2011). O LHc, com seu delicado balanço entre célula tumoral e

29

ambiente, representa um dos expoentes mais expressivos do conceito do câncer como doença

complexa dos tecidos.

De fato, o estudo destes fenômenos no LHc é extremamente difícil pelo baixo número

de células H-RS no tumor e pela dependência estrita da célula tumoral primária aos estímulos

bioquímicos e físicos do microambiente. Uma limitação importante para entender os defeitos

que levam ao fenótipo maligno das células H-RS é a inadequação dos modelos in vitro da

doença. Existem pouco mais de 10 linhagens celulares estabelecidas, todas elas EBV-, e

estabelecidas a partir de células circulantes (sangue periférico ou efusões de cavidades) de

pacientes com estádios avançados da doença, resistente a quimioterapia, onde as células cuja

ancoragem com o microambiente foi perdida. Quanto aos modelos animais, apesar do esforço

da comunidade científica, ainda não se chegou a um modelo tumoral que recrute um

microambiente similar ao do LHc.

Assim, a aplicação de modelos de pesquisa baseados na experimentação in vitro ou in

vivo para gerar hipóteses demostráveis em tumor primário de pacientes não é uma opção

válida hoje nesta doença. Os modelos aplicados, em geral, baseiam-se em inferir relações

patogênicas a partir do material primário, para depois confirmar mecanisticamente nos

modelos in vitro. Neste cenário, a transferência para a clínica se torna difícil; por exemplo,

nos últimos 30 anos, somente uma droga nova foi aprovada para tratamento da recaída da

doença (anticorpo monoclonal anti-CD30, brentuximabe vedotina), refletindo em parte a falta

de conhecimento dos mecanismos histopatogênicos básicos. As abordagens por IHQ tem sido

as de maior importância para caracterizar estes processos, apesar das limitações destes

métodos. Os estudos de expressão gênica, por sua vez, adolescem de falta de

reprodutibilidade, que pode ser devido à grande heterogeneidade biológica, evidente para

quem inspeciona os tumores no microscópio, mesmo sem ser patologista.

Esta dissertação apresenta uma trajetória de pesquisa para desenvolver métodos

reprodutíveis de análise da expressão gênica a partir de amostras sub-ótimas (RNA de

parafina), que começa com a extração da amostra e termina com a avaliação de métodos

alternativos de quantificação adequados ao material analisado. Apresentamos também a

aplicação dos métodos de expressão gênica padronizados em um grupo de pacientes com LHc

infantil visando identificar padrões de expressão com significado biológico, assim como

marcadores de prognóstico da doença.

30

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar perfis de expressão gênica relacionados à célula tumoral e ao microambiente

em um grupo de crianças diagnosticadas com linfoma de Hodgkin clássico, após o

desenvolvimento de uma metodologia para a extração de RNA a partir material fixado em

formalina e impregnado em parafina (FFPE) e PCR quantitativa em tempo real, visando

identificar padrões de importância biológica e clínica.

2.2 Objetivos específicos

• Desenvolver e aperfeiçoar metodologias para extração de RNA, retrotranscrição e

quantificação da expressão gênica a partir de linfonodos FFPE, no linfoma de

Hodgkin clássico.

• Avaliar as fontes de variabilidade (biológicas e técnicas) introduzidas na metodologia

desenvolvida para extração de RNA de parafina utilizando um desenho ANOVA tipo

nested.

• Comparar diferentes métodos para a quantificação de reações de PCR em tempo real

(ciclo pontual Cq vs. cinética da curva).

• Analisar os níveis de expressão de genes relacionados às vias do ciclo celular,

apoptose, ativação de monócitos/macrófagos e fator regulador de interferon 4 em um

grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátrico.

• Correlacionar os níveis de expressão gênica com as características das células

tumorais, os subtipos das células do microambiente tumoral e a resposta terapêutica

dos pacientes.

31

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Amostras

Foram incluídos pacientes com LHc com idade até 18 anos e cujo diagnóstico e

tratamento tenham sido feitos entre 1999 e 2006, no INCA (Rio de Janeiro). Só foram

incluídos os casos que dispunham do bloco de parafina contendo o material tumoral do

diagnóstico; negativos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e que tivessem

material genético amplificável para realização dos estudos moleculares. Ao todo, 93 casos

preencheram os critérios de inclusão.

Este grupo de pacientes pertence a um grupo total de 100 pacientes com LHc bem

caracterizados tanto do ponto de vista histológico, quanto imunológico. Todos os casos foram

revisados pelos patologistas M.H.M. Barros e G. Niedobitek (BARROS et al., 2010;

BARROS, 2011). A subclassificação histológica foi realizada segundo o estabelecido pela

OMS em EN, CM, DL e RL (SWERDLOW et al., 2008). Para a realização do estudo piloto

utilizando o desenho ANOVA tipo nested, três indivíduos com LHc do subtipo histológico

EN que dispunham de mais de um bloco do tumor com similar proporção tumor-estroma

foram avaliados e selecionados pelo patologista M.H.M. Barros.

O grupo controle não tumoral foi constituído por 6 linfonodos diagnosticados com

hiperplasia folicular reativa. Como controles de qualidade das reações de qPCR, um pool de

doadores sadios formado por 10 indivíduos e linhagens celulares de LHc (KMH2, L1236 e

L428), leucemia mielomonocítica (U937) e mieloma múltiplo (U266) foram incluídas.

3.2 Dados clínicos e epidemiológicos

Para cada paciente, os dados de procedência, história clínica, e exames clínico-

radiológico-laboratorial ao diagnóstico, durante o tratamento, ao final do tratamento e durante

o acompanhamento pós-tratamento, incluindo as informações a respeito da resposta

terapêutica foram obtidos a partir dos prontuários médicos.

Os pacientes foram estadiados, seguindo os critérios Ann Arbor (CARBONE et al.

1971). Pacientes com estádios IIB, IIIB e IV foram estratificados como doença desfavorável,

e pacientes com estadiamento I e IIA foram considerados como doença favorável

(VASSILAKOPOULOS et al., 2005).

32

O número de células tumorais, de eosinófilos e de células tumorais em mitose foi

determinado usando um microscópio Nikon modelo Eclipse-E2000 com um aumento total de

10x das lentes oculares e 40x da lente objetiva como previamente mostrado (BARROS,

2011).

Pacientes com o subtipo EN foram classificados segundo os critérios do Grupo

Nacional Britânico de Investigação de Linfoma (BENNETT et al., 1981) em EN grau I ou II,

de acordo ao número de células H-RS relacionadas à presença de quantidades de linfócitos,

inflamatório misto ou fibrohistiocítico (SWERDLOW et al., 2008).

3.3 Método de extração de RNA com o reagente Trizol®

O local de trabalho e instrumentos a utilizar foram mantidos em condições livres de

RNAses mediante limpeza escrupulosa com isopropanol 70% e uma solução comercial

(RNAse away). Foram utilizados micropipetas e material plástico especialmente dedicados

para a extração de RNA, assim como soluções e reagentes especialmente preparados e

armazenados.

A extração de RNA foi realizada a partir de 1 mL de Trizol® (Invitrogen, Life

Technologies, Carlsbad, CA) que continha um lisado celular de 5-8 x 106 células, foram

adicionados 200 µL de clorofórmio, agitados por inversão por 15 segundos e incubados por 3

minutos a temperatura ambiente (TA). Seguidamente, os tubos foram centrifugados durante

15 minutos a 12.000 rotações por minuto (r.p.m.) em uma centrifuga refrigerada a 4°C. A fase

aquosa que continha o RNA foi transferida para um tubo novo de microcentrifuga e

precipitado com 500 µL de isopropanol (Merck). Os tubos foram agitados de 30 a 40 vezes

por inversão e incubados por 1 hora a -20°C. Sucessivamente, as amostras foram

centrifugadas a 4°C por 10 minutos a 12.000 r.p.m. e o sobrenadante retirado e descartado

cuidadosamente ficando o pellet de RNA. Uma lavagem ao pellet de RNA foi realizada com

900 µL de etanol (Merck) 75% diluído em água tratada com dietil dicarbonato (DEPC)

seguida de uma centrifugação de 10.000 r.p.m. por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante e restos

de etanol foram retirados cuidadosamente e o pellet de RNA ressuspendido em 12 µL de

água-DEPC, solubilizado no termobloco a 65°C durante 30 segundos, seguido de 15 minutos

no gelo. O armazenamento do RNA foi realizado a -70°C.

33

3.4 Método de extração de RNA total a partir de amostras fixadas e impregnadas em

parafina

Seguindo todos os cuidados para trabalho em ambiente livre de RNAses, cinco seções

com espessura de 3µm foram obtidas a partir de cada bloco de parafina, usando um

micrótomo Leica Biosystems, escrupulosamente limpo com soluções livres de RNases antes e

depois do trabalho. Os cortes foram colocados em um tubo de microcentrifuga previamente

rotulado e submetidos ao processo de desparafinização, seguido pelos métodos específicos

para extração de RNA.

3.4.1 Desparafinização

Ao tecido previamente cortado, foi adicionado 1 mL de xilol 100% e colocado no

agitador à 37°C durante 20 minutos, seguido de centrifugação por 5 minutos à 13.000 r.p.m.

O sobrenadante foi descartado. Este passo foi realizado 3 vezes. Após o tratamento com xilol,

foram realizadas três incubações repetidas com 1,2 mL de etanol 100% no agitador à 37°C

durante 30 minutos, sempre descartando o sobrenadante. Ao final, foram eliminados os restos

de etanol e o pellet foi deixado a temperatura ambiente por 5 minutos, permitindo a

evaporação da maior quantidade de etanol.

Para a extração de RNA a partir de material FFPE, dois métodos comerciais foram

utilizados: Master PureTM (Epicentre, Madison, WI) (MP) e Recover AllTM Total Nucleic

Acid Isolation Kit (Ambion, Life Technologies) (RA).

3.4.2 Método Master PureTM

A extração de RNA foi realizada pelo método de purificação de RNA Master PureTM

seguindo a instruções do fabricante com modificações na etapa de digestão, como sugerido

por CHEN et al. (2007). A etapa de digestão com proteases foi realizada a partir do pellet do

tecido, adicionando 480 µL de solução de lise celular e de tecido (do inglês, Tissue and Cell

Lysis Solution) como recomendado pelo fabricante e 60 µL de proteinase K (Invitrogen) a 60

mg/mL, colocando o tubo no banho-maria a 65°C durante 20 horas ou até que o tecido

estivesse completamente disperso. Em seguida, a amostra foi colocada no gelo por 5 minutos.

Para a separação dos ácidos nucleicos das proteínas, 315 µL do reagente de precipitação de

proteínas MPC (do inglês, MPC Protein Precipitation Reagent) foram adicionados à amostra,

lisada e vortexada vigorosamente durante 10 segundos, continuamente centrifugadas por 10

34

minutos a 13.000 r.p.m. O sobrenadante (RNA) foi transferido para um tubo de

microcentrifuga novo e colocado em gelo por 5 minutos. Para a precipitação do RNA, 500 µL

de isopropanol foram adicionados ao sobrenadante e os tubos invertidos durante 30-40 vezes,

centrifugando a 4°C durante 10 minutos a 13.000 r.p.m. Em seguida, retirou-se o

sobrenadante com cuidado e o tratamento com DNAse I (200 µL do tampão e 5 µL da enzima

fornecida pelo fabricante) foi aplicado ao resíduo (RNA) e incubado durante 30 minutos à

37°C. Posteriormente, 200 µL da solução de lise C e T 2X (do inglês, 2X T and C Lysis

solution) foram adicionadas à amostra, vortexando por 5 segundos, acrescentando 200 µL do

reagente de precipitação de proteínas MPC e misturando por 10 segundos com o vortex. As

amostras foram colocadas no gelo por 5 minutos e centrifugadas a 4°C por 10 minutos a

13.000 r.p.m.. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo de microcentrifuga,

adicionando 500 µL de isopropanol, invertendo os tubos por 30-40 vezes e centrifugando-os

novamente a 4°C por 10 minutos a 13.000 r.p.m.. Duas lavagens foram realizadas com etanol

(Merck) 75% diluído em água-DEPC, seguidas de centrifugações a 4°C, 10.000 r.p.m. por 5

minutos. O tubo foi deixado aberto a TA por 5 minutos para permitir a evaporação dos restos

de etanol. Finalmente o pellet foi ressuspendido em 12 µL de água-DEPC e colocado 30

segundos no termobloco a 65°C para sua solubilização, seguido de 15 minutos no gelo. O

armazenamento do RNA foi realizado a -70°C.

3.4.3 Método Recover AllTM

A extração de RNA a partir de amostras FFPE com o método Recover AllTM foi

realizada seguindo as indicações do fabricante com modificações na etapa de digestão. Após a

desparafinização, o pellet que contém o tecido foi dissolvido em 200 µL de tampão de

digestão com 60 µL de proteinase K (Invitrogen) a uma concentração de 60 mg/dL, incubado

durante 15 minutos a 50°C, seguido de 20 horas a 65°C no banho-maria. Em seguida, foi

adicionado 240 µL do aditivo de isolamento (do inglês, Isolation Additive) fornecido pelo

fabricante com 550 µL de etanol 100%. Após a homogeneização, 700 µL da mistura foram

transferidos para um filtro de captura e centrifugado por 30 segundos a 10.000 r.p.m. As

etapas de lavagens foram realizadas adicionando 700 µL da solução de lavagem 1 e

centrifugando a 10.000 r.p.m. por 30 segundos, descartando o sobrenadante. O tratamento

com DNaseI foi aplicado nesta etapa, pela adição de 60 µL da solução de tratamento

composta por 6 µL do tampão de DNase, 4 µL de DNaseI e 50 µL de água livre de nucleases;

o tempo de incubação foi de 30 minutos a temperatura ambiente. Após o tratamento com

35

DNase I uma etapa de lavagem foi realizada com 700 µL da solução de lavagem 1 e duas com

500 µL da solução de lavagem 2/3, em cada etapa centrifugações a TA foram realizadas por

30 segundos a 10.000 r.p.m. Finalmente, a solubilização do RNA foi feita com 30 µL da

solução de eluição, centrifugando a 13.000 r.p.m. durante 1 minuto a TA. O RNA foi

armazenado a -70°C.

3.5 Desempenho dos métodos de extração de RNA

A quantificação e o grau de pureza do RNA foram avaliados por espectrofotometria

(Nanodrop, Wilmington, Delaware USA) a partir de uma alíquota de 1 µL da amostra, no

comprimento de onda (λ) 260, 280 e 230, que quantificam ácidos nucleicos, proteínas e

contaminação com álcool, fenol e EDTA, respectivamente. Uma amostra foi considerada de

qualidade ótima na presença de razões λ260/280 entre 1,8 - 2,0; e razões λ260/230 entre 2,0 -

2,2.

A integridade do RNA foi avaliada pela conservação relativa das frações do RNA

ribossômico (28S, 18S e 5S) através de duas metodologias:

3.5.1 Eletroforese em gel de agarose

O RNA (1 µL) junto com tampão de corrida para RNA foi aplicado em um gel de

agarose 1,2% preparado com tampão fosfato (Na2HPO4 0,01M), com coloração de brometo de

etídio (0,5 µg/mL) (Sigma), em condições livres de RNases. A eletroforese foi realizada por

30 minutos com voltagem constante de 80 volts. A avaliação das amostras foi realizada sob a

luz ultravioleta.

3.5.2 Número de integridade do RNA

A avaliação da integridade do RNA foi realizada com o kit RNA 6000 Nano na

plataforma Agilent (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies), seguindo as indicações do

fabricante. O número da integridade do RNA (RIN) apresenta uma faixa entre 1-10, em que 1

corresponde a amostras altamente degradas e 10, a RNAs de alta integridade.

3.6 Retrotranscrição

A transcrição reversa (RT) foi realizada com o conjunto de reagentes High-Capacity

cDNA Archive kit (Applied Biosystems) a partir de 1 µg de RNA total para o ensaio inicial

ANOVA tipo nested. Para o restante dos ensaios, foi utilizado 0,5 µg de RNA, devido às

36

melhoras observadas e a diminuição de erro introduzido durante o processamento técnico

(descrito na seção 4.1.4). O volume final da reação foi de 20 µL (10 µL de RNA diluído e 10

µL de mistura RT). A mistura RT foi preparada com 2 µL de tampão RT 10X, 0,8 µL de

dNTPs 25X, 2 µL de iniciadores randômicos (do inglês, Random primers) 10X, 1 µL da

enzima MultiScribe RT 50U/ul e 4,2 µL de água livre de nucleases. Esta reação foi incubada a

25°C por 10 minutos e a 37°C por 120 minutos e armazenada a -70°C.

3.7 Pré-amplificação

A pré-amplificação (pré-Amp) foi realizada com o conjunto de reagentes TaqMan

PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) em reações de 10 µL cujo volume final era

composto por: 5 µL de Master Mix 2X; 2,5 µL do conjunto iniciadores/sonda 20X diluídos

em tampão TE (tris-EDTA) e 2,5 µL de DNA complementar (cDNA). O passo inicial foi de

95°C por 10 minutos, seguido de 14 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por 4 minutos em

um termociclador Veriti. O produto foi diluído na proporção de 1:20 em água livre de

nucleases e usado para o análise na qPCR. Tanto os produtos como as diluições foram

armazenados a -70°C.

3.8 Quantificação da expressão gênica

As reações de RT-qPCR foram realizadas na plataforma ABI 7000 (Applied) usando

sondas de hidrólise (TaqMan) marcadas 5' 6-FAM-3'MGB e dois iniciadores específicos

para cada alvo. As reações de qPCR continham 1X TaqMan PCR Master Mix Universal

(Applied Biosystems), 1X do ensaio TaqMan de expressão gênica específico (Applied

Biosystems) e 4 µL de pré-Amp cDNA diluído na proporção 1:20 em 15 µL de volume final,

incubadas a 50°C por 2 minutos e 95°C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos por 15 segundos

à 95°C e 60°C por 1 minuto.

Todas as corridas foram realizadas com os controles de qualidade recomendados para

qPCR. As reações de qPCR foram preparadas em 3 ambientes separados (um para extração e

manipulação de ácidos nucleicos, um para realização das reações e um terceiro para

incorporação dos ácidos nucleicos à reação de qPCR). Controles da reação com ausência de

cDNA chamados de NTC (do inglês, no template control) foram colocados em cada placa (2

NTC por cada gene avaliado), o qual não deveria amplificar até o Cq <40 ciclos. Todas as

reações de PCR foram realizadas em duplicata. No desenho das placas, os genes de interesse

(GDI) e genes de referencia (GDR) foram colocados na mesma corrida, para evitar o uso de

37

calibradores interplaca. Como controles da reação de qPCR e sua variabilidade interplaca,

cDNAs provenientes de RNA de alto peso molecular da linhagem KMH2 e de um conjunto

de células mononucleares provenientes de doadores sadios foram colocadas em cada placa.

Os GDI foram selecionados baseados na descrição previa de genes com características

clinicas relevantes no LHc (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010) mostrados na tabela 3.1.

Os genes “glucuronidase, beta” (GUSB) e “hydroxymethylbilane synthase” (HMBS) foram

escolhidos como GDR.

Tabela 3.1: Ensaios utilizados para PCR em tempo real quantitativo. Símbolo do Gene

Nome do Gene* ID do ensaio Tamanho do amplicon (pb)

BCL2

BCL2L1

CASP3

CCNA2

CCNE2

CDK1

CENPF

HMMR

IRF4

LYZ

STAT1

GUSB#

HMBS#

“B-cell CLL/lymphoma 2”

“BCL2-like 1”

“caspase 3, apoptosis-related

cysteine peptidase”

“cyclin A2”

“cyclin E2”

“cyclin-dependent kinase 1”

“centromere protein F,

350/400kDa”

“hyaluronan-mediated motility

receptor (RHAMM)”

“interferon regulatory factor 4”

“lysozyme”

“signal transducer and activator

of transcription 1, 91kDa”

“glucuronidase, beta”

“hydroxymethylbilane synthase”

Hs00608023_m1

Hs00236329_m1

Hs00234385_m1

Hs00153138_m1

Hs00180319_m1

Hs00176469_m1

Hs00193201_m1

Hs00234864_m1

Hs00180031_m1

Hs00426231_m1

Hs00234829_m1

Hs99999908_m1

Hs00609297_m1

81

65

66

110

92

101

99

98

88

64

79

81

64

* De acordo com HUGO (WHITE et al., 1997); #Gene de Referência.

A eficiência dos iniciadores e sondas foi calculada para cada um dos genes a partir dos

valores de Cq obtidos pela amplificação de um conjunto de diluições seriadas (5 pontos) em

base 10 (log10) utilizando cDNA de alta qualidade proveniente de linhagens celulares (Anexo

I: Fig. S1). O Cq é o número fracionar do ciclo onde a fluorescência atravessa um limiar

estabelecido, sendo utilizado como valor de quantificação da reação.

38

O valor da eficiência foi calculado utilizando o software Genex enterprise (MultiD)

através da seguinte fórmula matemática (3.1):

Eficiência = [10 (-1/pendente)] – 1 * 100 (3.1)

Onde a pendente foi calculada utilizando a equação da reta

y = ax + b

Em que a = pendente; b = ponto na qual a reta cruza o eixo y= 0

O valor ideal aceito para a pendente foi entre – (3,3 – 3,4) e do coeficiente de

determinação de regressão da curva (R2) 0,997 < R2 < 1, o que explica que toda variação

apresentada por y é explicada pela variação de x.

Após observações realizadas nas reações, identificando o momento de ocorrência das

mínimas mudanças do sinal de fluorescência, valores fixos para a linha de base para

quantificação foram estabelecidos no instrumento, antes do qual os produtos produzidos

foram considerados ruído. A línea de base para reações particulares foi estabelecida entre os

ciclos da reação 3-15.

A lista das informações mínimas para publicação de experimentos em qPCR (MIQE),

de acordo com o recomendado por BUSTIN et al. (2009), encontra-se no Anexo II.

3.9 Avaliação da amplificação

A amplificação das amostras foi avaliada pela amplificação dos genes de referência

em Cq ˂35, assim como pela visualização da cinética da curva em escala exponencial.

Amostras com amplificação em Cq> ciclo 35 e uma cinética da curva diferente da curva

sigmoide característica de uma reação de qPCR (fases exponencial, linear e platô) foram

consideradas como não amplificáveis. As amostras com inclinação à direita na curva de

reação (alteração na fase exponencial) foram suspeitas de presença de inibidores que

poderiam estar interferindo na reação de RT-qPCR, consequentemente, novas extrações de

RNA, sínteses de cDNA e novos produtos com suas diluições de pré-Amp foram obtidos e as

reações repetidas.

39

3.10 Abordagens de quantificação relativa da expressão gênica

A estratégia escolhida foi a da quantificação relativa que determina as mudanças de

expressão de um GDI em relação à expressão de um GDR. Dois métodos foram utilizados

para calcular o valor de quantificação das reações de RT-qPCR: o método do ciclo threshold e

o método do Cy0.

3.10.1 Método do ciclo threshold

A quantificação foi subministrada pelo instrumento ABI7000 em um arquivo

compatível com Microsoft Excel. Este método exige a determinação de um limiar ou

threshold (línea paralela ao eixo X, estabelecido na fase exponencial da reação), onde o valor

de quantificação é determinado no número de ciclo ao momento que a quantidade de

fluorescência da reação alcance sobrepassar o limiar estabelecido. O valor do threshold foi

estabelecido em 0,376 e mantido em todas as corridas realizadas. As reações foram realizadas

em duplicatas, aceitando como valor máximo diferencial de desvio padrão (DP) < +0,15

ciclos.

A quantificação foi realizada utilizando o modelo matemático proposto por LIVAK;

SCHMITTGEN (2001), sem a utilização de um calibrador (equação 3.2):

Quantificação relativa = 2-∆Cq (3.2)

Onde ∆Cq= Cq GDI – Cq GDR

A unidade de ∆Cq é a normalização da expressão de um GDI com a expressão de

GDR (controle interno), no qual a expressão não varia entre os tecidos, células ou na resposta

aos tratamentos experimentais. No caso da avaliação da expressão gênica no escore clínico, o

valor médio da quantificação dos genes GUSB e HMBS foi utilizado como Cq GDR, como

recomendado (VANDESOMPELE et al., 2002).

Para ser aplicado o algoritmo de quantificação relativa aos valores de quantificação

obtidos por este método é pré-requisito que as eficiências de reação dos GDI e GDR devem

ser similares. Experimentos de diluição para avaliação da eficiência foram realizados, e estas

não variaram em mais que +10% (Anexo I: Fig. S1 e Anexo II). O uso da terminologia Cq ao

longo do trabalho será referente às quantificações realizadas pelo método do ciclo threshold.

40

3.10.2 Método Cy0

Valores de quantificação das reações de RT-qPCR foram obtidos usando o método do

Cy0, em que o ponto de quantificação é denominado Cy0 (GUESCINI et al., 2008), baseado

na análise dos parâmetros da cinética da curva de qPCR.

Os dados iniciais para esta análise foram os valores do repórter normalizado [∆(Rn-

ROX)] para cada ciclo de cada amplificação de GDIs e GDRs para cada amostra. Estes

valores foram armazenados em planilhas Excel. A análise foi realizada com os resultados

obtidos no desenho de ANOVA tipo nested, para comparar o desempenho dos métodos Cq e

Cy0 e sua capacidade de identificar a possível presença de inibidores como causa da

variabilidade obtida nos níveis biológicos.

O uso da terminologia Cy0 ao longo do trabalho será referente às quantificações

realizadas pelo método da equação de Richards. Resultados do ∆Cy0 refere-se à normalização

realizada com resultados Cy0s (∆Cy0 = Cy0 GDI – Cy0 GDR).

3.11 Cálculo dos outliers

Um outlier é um valor dos resultados que se encontra afastado da distribuição do

conjunto total. Neste trabalho, a definição de outlier foi aplicada em relação aos parâmetros

técnicos, como elemento para avaliar a qualidade dos dados primários.

A determinação de outliers nos ensaios de expressão gênica foi realizada de duas

maneiras:

1 Software Genex enterprise (MultiD), mediante o teste de Grubbs que considera

valores outliers aqueles que se encontram dentro da área de 1% da distribuição

normal (média + 3 DP).

2 Software Kineret, baseado no método de estatística KOD (detecção de outliers pela

cinética da curva) (BAR et al., 2003), que realiza uma comparação da eficiência de

uma amostra desconhecida com a média das eficiências das curvas de qPCR de um

grupo de amostras de referência predeterminadas como de boa qualidade. Arquivos

com os dados do ∆(Rn-ROX) para cada ciclo de cada reação das amostras foram

enviados para a equipe de trabalho do Labonnet (http://labonnet.gene-

quantification.info/).

41

3.12 Desenho experimental ANOVA tipo nested

Um desenho experimental de tipo nested de seis níveis (3x2x2x2x2x2) foi usado para

investigar as fontes de variabilidade (biológicas e técnicas) em ensaios de expressão gênica.

Para tanto, foram utilizados 3 casos com LHc com 2 linfonodos, que foram analisados com

duplicatas de extração de RNA, seguidas de duplicatas de RT, pré-Amp e qPCR (Fig. 3.1).

Este desenho experimental produziu ao todo 96 valores de Cq para cada um dos 7 genes

avaliados (GDI: BCL2, CASP3, IRF4, LYZ e STAT1; GDR: GUSB e HMBS). As placas foram

desenhadas para incluir um GDI e o gene de referência para cada indivíduo na mesma placa.

O RNA foi extraído com o kit MP, selecionado por apresentar o melhor rendimento.

Quantificações de ∆Cq (Cq GDI – Cq GDR) utilizando os valores de quantificação do GUSB.

Níveis do desenho tipo nested Reações

Fig. 3.1. Desenho experimental ANOVA tipo nested para amostras fixadas e impregnadas em parafina. σ2: variância; RT: retrotranscrição; pré-Amp: pré-amplificação; qPCR: PCR quantitativa em tempo real.

3.13 Análise do ANOVA tipo nested

O modelo linear dos efeitos de processamento biológicos e técnicos foi calculado

como descrito por TICHOPAD et al. (2009) (equação 3.3):

Cqijklmn = µ + ai + bj(i) + ck(ji) + dl(kji) + em(lkji) + fn(mlkji) (3.3)

σσσσ

2+2σσσσ

2E(D)+4σσσσ

2D(C)+8σσσσ

2C(B)+16σσσσ

2B(A)

σσσσ

2+2σσσσ

2E(D)+4σσσσ

2D(C)+8σσσσ

2C(B)

Indivíduo 1 Indivíduo 2 Individuo 3

Indivíduos (n = 3)

Linfonodos (n = 3x2 = 6)

Extração RNA n (n = 3x2x2 = 12)

RTs (n= 3x2x2x2

= 24)

pré-Amps (n= 3x2x2x2x2

= 48)

qPCRs (n= 3x2x2x2x2 x2

= 96 )

σσσσ

2+2σσσσ

2E(D)+4σσσσ

2D(C)+8σσσσ

2C(B)+16σσσσ

2B(A)+32σσσσ

2A

B)

σσσσ2+2σσσσ2

E(D)+4σσσσ2

D(C)

σσσσ

2+2 σσσσ 2E(D)

σσσσ2

3333

6666

12121212

24242424

48484848

1152115211521152

42

Onde Cqijklmn é a quantificação individual de qPCR expressado em número de ciclos de

amplificação, incorporando o efeito randômico do sujeito (i), linfonodo (j), RNA (k) RT

(l) pré-Amp (m) e qPCR (n). µ é a média total do grupo; ai: efeito randômico do indivíduo

i; bj(i) efeito randômico do linfonodo j dentro de indivíduo i; ck(ij): efeito randômico dos

RNAs k do linfonodo j dentro do indivíduo i; dl(ijk) efeito randômico das RT l dentro do

RNA k, das amostras j dentro do sujeito i, e assim por diante.

As análises foram realizadas por ANOVA tipo nested de 6 fatores com efeito

randômico.

A partição da variância foi calculada através da seguinte fórmula (3.4) (KITCHEN et

al., 2010):

Variância = 100 x σ2x/σ

2Cq´ (3.4)

onde x= i, j, k, l, m, n;

A variabilidade biológica total foi calculada de maneira independente empregando a

somatória dos DP dos níveis interindividuais e linfonodos. De igual maneira, a variabilidade

técnica total foi calculada somando as variabilidades dos níveis RNA, RT, pré-Amp e qPCR.

O cálculo da variabilidade total do método foi realizado através da somatória da variabilidade

biológica total e a variabilidade técnica total, expressa em valores de DP.

O ruído total foi calculado como a variação acumulada em valores de DP de todas as

medidas de Cq, ∆Cq, Cy0 ou ∆Cy0 dos três indivíduos como se houvessem sido obtidas de

maneira independente. Já o ruído individual foi calculado pela somatória dos DP dos valores

Cq, ∆Cq, Cy0 ou ∆Cy0 por indivíduo (dividido por 3, número de indivíduos totais).

3.14 Técnica de imunohistoquímica

A partir de lâminas de microarranjo tecidual de 1 mm2 (TMA: do inglês, Tissue micro

array) foram realizadas imunomarcações para caracterizar as células H-RS e células

infiltrantes do MAT, com posterior análise microscópica computacional assistida. A análise

foi realizada pelo patologista M.H.M. Barros. No Anexo IV: Tabela S1 estão descritos os

anticorpos utilizados, clones, diluições e marcações esperadas.

Os ensaios de IHQ foram realizados com a técnica do complexo peroxidase-anti-

peroxidase (PAP), resumida nos seguintes passos:

43

1. As lâminas contendo as seções de material FFPE foram incubadas em estufa a 60°C

por 30 minutos, seguido pela desparafinização realizada por incubação em xilol por 10

minutos por duas vezes;

2. A hidratação foi realizada com concentrações de etanol descendentes (100% e 70%)

em banhos contínuos de 5 minutos. A seguir, os cortes foram lavados em água

corrente por 5 minutos.

3. A recuperação antigênica foi realizada em panela de pressão ou em um forno de

microondas na potência máxima, usando os tampões descritos no Anexo IV: Tabela

S1.

4. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio (10%

v/v) por 5 minutos, seguido de três lavagens de 5 minutos em água corrente.

5. As proteínas inespecíficas foram bloqueadas por incubação em uma solução de leite

em pó desnatado 3% por 20 minutos.

6. A incubação com 300 µL do anticorpo primário diluído em solução de albumina de

soro bovino (BSA) 3% foi realizada em câmara úmida por 1 hora a TA. Ao término, as

lâminas foram lavadas por 5 minutos em tampão fosfato salino (PBS).

7. O anticorpo secundário foi colocado e incubado por 30 minutos sobre cada corte.

Posteriormente, o excesso foi removido por três lavagens de 5 minutos em PBS,

seguido por incubação com streptavidina peroxidase por 20 minutos. Após este tempo,

as lâminas foram lavadas com três banhos de 5 minutos em PBS.

8. Como cromógeno, foi utilizada solução de DAB (DakoCytomation) por 5 minutos.

Após o tempo de incubação as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos

seguida da contra-coloração com hematoxilina de Harris por 30 segundos e lavagem

em água corrente por 5 minutos.

9. Por fim, as lâminas foram desidratadas em banhos contínuos de 5 minutos no etanol a

concentrações crescentes (70%, 100%, 100%), seguido de um banho final de xilol por

5 minutos.

10. As lâminas foram montadas com meio não aquoso e cobertas com lamínula.

44

3.15 Análise Microscópica Computacional Assistida

Cada caso foi fotografado em um aumento de 200x com a câmera AxioCam MRc

(Zeiss, Alemanha), as fotos foram transferidas para um computador e analisadas com o

programa HISTO (Biomas, Elangen, Alemanha), a fim de se determinar o número de células

imunomarcadas por mm2. Para esta análise, foi escolhido o core com o maior número de

células H-RS. Casos com negatividade dos marcadores em ambos os cores foram

desconsiderados.

3.16 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH)

A técnica de hibridização in situ (ISH) foi utilizada para investigar a presença do EBV

nas amostras de LHc. Foram usadas sondas biotiniladas para os RNAs virais não codificantes

EBERs, e condições estritas para evitar a presença de RNAses, como descrito anteriormente

(HASSAN et al., 2006). Em resumo:

1. As lâminas foram colocados na estufa à 60°C por 30 minutos, seguidas de

desparafinização em xilol por 10 minutos, por 2 vezes.

2. Posteriormente, os cortes foram hidratados em banhos sucessivos de etanol com

concentrações decrescente (etanol à 100%, etanol à 95% e etanol à 70%) e água

destilada por 5 minutos cada um.

3. O processo de digestão do tecido foi realizado com proteinase K (20µg/mL) em

câmara úmida à 65º C por 30 minutos, seguido de duas lavagens de 3 minutos em água

destilada.

4. A seguir, os cortes foram desidratados através de banhos em etanol com concentrações

crescentes (etanol à 70%, etanol à 95%, etanol à 100%), por um período de 5 minutos

cada um. As lâminas foram deixadas a TA para a secagem dos cortes.

5. 10 µL da ribosonda biotinilada contra EBER-1 (Novocastra) foram utilizadas em cada

corte. As lâminas foram acondicionadas em câmara úmida e incubadas a 65°C por 15

minutos, seguidas de incubação de à 37°C por 2 horas.

6. A seguir, foram realizados três banhos com tampão tri salino (TBS) 0,1% Triton X-

100, 3 minutos cada. O bloqueio inespecífico foi feito com 100 µL de solução

bloqueante (TBS 0,1%; Triton X-100; BSA 3%) durante 10 minutos à TA.

45

7. Posteriormente, 100 µL da solução de anticorpo secundário (anti-FITC conjugado com

fosfatase alcalina, Novocastra) diluído em solução bloqueante (1:200) foi encubado

por 20 minutos. Ao final, duas lavagens de 3 minutos com TBS foram realizadas,

seguida de incubação com solução de fosfatase alcalina (pH 9,0) por 5 minutos.

8. Como solução cromógena, foi utilizada 100 µL de uma solução composta de 1 mL de

solução de fosfatase alcalina, 8 µL do BCIP/NBT e 1 µL de Levamisole (Novocastra).

As lâminas com a solução cromogênica foram acondicionadas em câmara úmida

escura e encubadas durante 16 horas à TA.

9. A seguir, os cortes foram lavados em água corrente durante 5 minutos, seguidos de

contra-coloração com hematoxilina de Harris por 30 segundos e lavagem em água

corrente por 5 minutos.

10. As lâminas foram montadas em meio aquoso e armazenadas a 4ºC.

Como controle positivo, foi utilizado um caso com linfoma de Burkitt EBV+. A

presença de marcações enegrecidas no núcleo das células H-RS significou positividade da

reação. Os casos de LHc foram considerados associados ao EBV quando qualquer célula H-

RS foi EBER-ISH positiva.

3.17 Definição de respostas e tempo de sobrevida

Para avaliação do tipo de resposta e determinação do tempo de sobrevida, foram

utilizadas as informações clínico-radiológico-laboratoriais existentes nos prontuários médicos

de cada paciente incluído no estudo.

Resposta completa foi definida como ausência de tumor ao final do tratamento,

mantida por pelo menos 4 semanas. A resposta parcial foi considerada quando houve redução

de 50 a 99% de todas as lesões tumorais ao final do tratamento. A resposta menor foi

considerada como redução de 25 a 49% de todas as lesões tumorais ao final do tratamento. A

doença estável foi definida como indução de menos de 25% das lesões tumorais, sem o

surgimento de novas lesões ao final do tratamento. Já a progressão de doença foi definida

como o surgimento de novas lesões ou aumento em 25% de alguma das lesões iniciais ao final

do tratamento.

A sobrevida livre de progressão (SLP) foi considerada como o período, em meses,

compreendido entre o diagnóstico e progressão, ou recaída, ou início um tratamento não

46

planejado, ou último seguimento em casos de resposta completa. Já a sobrevida global (SG)

foi definida como o período compreendido, em meses, entre o diagnóstico e o óbito ou último

seguimento (do estudo).

Todos os pacientes foram tratados com protocolos baseados na administração de

antracíclicos e foram avaliados como um único grupo terapêutico, nos estudos de sobrevida,

conforme feito na literatura (EICH et al., 2010; BAUER et al., 2011; MEYER et al., 2012).

3.18 Análises estatísticas

Os testes não paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis foram usados para

análises de associação entre variáveis categóricas e continuas, Wilcoxon para análises de

relação entre duas amostras relacionadas e o teste de Spearman para correlações de variáveis

continuas.

Análise de componente principal (PCA) foi utilizada para detectar as relações entre as

variáveis de expressão gênica. A PCA é um método multivariado que visa a redução de dados,

onde transforma um grupo de variáveis correlacionadas a outro não correlacionadas

representadas em valores de covariância. A PCA foi realizada nos valores de expressão de 10

genes (exceto para IRF4) obtidos de 84 pacientes usando o programa SPSS. A relação entre

casos e número de genes avaliados (variáveis) foi de 8,4 para 1, superando os requerimentos

estabelecidos para o PCA que é de 5 para 1. Correlações substanciais na matriz de correlações

entre as variáveis foram identificadas. Para identificar se a amostra era adequada para PCR a

medida de amostra adequada (MAS: do inglês, Measures of Sampling Adequacy), foi avaliada

através do teste Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) na matriz anti-imagem para cada variável

individual, assim como para o set de variáveis, obtendo-se valores maiores a 0,5. A

identificação dos componentes principais foi realizada tendo em conta valores eigen maiores a

1, identificando posteriormente as variáveis que se carreavam com valores superiores a 0,5 em

cada componente. A validação dos resultados se realizou através das análises de

comunalidades (do inglês, communalities) com resultados maiores a 0,5.

A distribuição das sobrevidas foi estimada mediante o método Kaplan-Meier e as

diferenças foram comparadas usando o teste log-rank. O método de regressão de Cox para

análises multivariadas foi utilizado para determinar o valor prognóstico independente das

variáveis com valores P < 0,2 nas análises univariadas

47

Valores de P < 0,05 e P < 0,01 foram considerados significativos no testes

bicaudados. As análises estatísticas foram realizadas com os softwares GENEX enterprise

(MultiD), SPC (BPI Consulting, LLC) e SPSS 20.0.

3.19 Critérios Éticos

Este estudo obedece às normas regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres

humanos do Conselho Nacional de Saúde, em sua resolução nº 196 de 10 de outubro de 1996,

visando assegurar os direitos e deveres que dizem respeito à comunidade científica, aos

sujeitos da pesquisa e ao Estado. Medidas que proporcionam confidencialidade e privacidade

dos pacientes, foram adotadas, assim como sigilo e a segurança dos dados obtidos. Este

projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA (Protocolo 37/05) (Anexo

III).

48

4 RESULTADOS

4.1 APERFEIÇOAMENTO DE UMA METODOLOGIA REPRODUTÍVEL PARA

EXTRAÇÃO DE RNA A PARTIR DE MATERIAL EM PARAFINA

4.1.1 Desempenho dos métodos de extração de RNA

Os métodos de extração de RNA: MP (baseado em precipitação) e RA (baseado em

colunas) foram comparados para selecionar o melhor método. Diferentes concentrações e

tempos de digestão foram testados obtendo-se melhores resultados com 60 µL de proteinase

K (Invitrogen) concentrada a 60 mg/dL por 20 horas a 65 °C comparadas com os protocolos

propostos pelos kits.

Para comparar os resultados dos métodos de extração de RNA entre os dois kits

utilizados, foram analisadas 25 amostras de maneira pareada, observando-se uma melhor

quantidade de RNA, assim como maior pureza no método MP que no método RA. Diferenças

nos valores médios do RIN não foram observadas nas 10 amostras pareadas avaliadas,

indicando que o RNA proveniente de material FFPE é altamente degradado

independentemente da metodologia utilizada para a extração (Tabela 4.1 e Fig. 4.1).

Tabela 4.1: Quantidade de RNA, pureza e RIN dos métodos comparados em 25 amostras pareadas.

Desempenho Master PureTM

Média + DP Recover AllTM

Média + DP P-valor

Quantificação absoluta (µg) 40,06 + 16,87 14,31 + 4,96 0,016

Pureza OD 260/280 1,84 + 0,15 1,77 + 0,20 0,094

Pureza OD 260/230 1,83 + 0,33 1,39 + 0,57 0,000

RIN 2,46 + 0,10 2,30 + 0,10 0,293

O valor P foi obtido através do teste de Wilcoxon

49

Fig. 4.1: Avaliação de qualidade e quantidade de RNA extraído a partir de amostras FFPE. A e B: Gel de agarose 1,2% em tampão fosfato (Na2HPO4 0,01M); C e D: eletroferograma obtido na plataforma Bioanalizer; A e C: Amostras controle (RNA de alto peso molecular proveniente de linhagem celular); B e D: Amostras proveniente de material FFPE.

O desempenho dos métodos foi avaliado em relação à antiguidade dos blocos de

parafina, sendo estes classificados em dois grupos: 1999-2002 vs. 2003-2006. Como

esperado, o grupo de amostras mais recentes (2003-2006) mostrou melhores resultados com

ambos os métodos, especialmente com o método RA. Por sua vez, o método MP não mostrou

diferenças significativas em relação à antiguidade das amostras (Tabela 4.2), indicando que o

método MP é menos sensível a esta variável, cuja associação com pior qualidade dos ácidos

nucleicos é reconhecida.

Tabela 4.2: Comparação do desempenho dos métodos Master PureTM e Recover AllTM em relação à antiguidade da amostra. Métodos

Master PureTM

Recover AllTM

Desempenho 1999-2002

Média + DP 2003-2006

Média + DP P-valor

1999-2002 Média + DP

2003-2006 Média + DP

P-valor

Quantificação absoluta (µg)

18,51 + 18,28 68,07 + 118,34 0,706 3,59 + 3,68 28,25 + 31,36 0,002

Pureza OD 260/280

1,84 + 0,13 1,85 + 0,19 0,904 1,68 + 0,20 1,89 + 0,13 0,010

Pureza OD 260/230 1,76 + 0,37 1,93 + 0,27 0,801 1,03 + 0,46 1,86 + 0,31 0,010

∆Cq (pré-Amp - sem pré-Amp)

9,02 10,07 0,675 6,83 8,78 0,456

DP: desvio padrão. ∆Cq: delta Cq. O valor P foi obtido através do teste de Mann-Whitney.

ControleRIN: 9,1

Amostra 12RIN: 2,3

AC DA B

50

Referente à amplificação dos genes de referência (GDR), os valores de Cqs foram

menores naquelas amostras que apresentaram uma relação ótima RNA/proteínas (λ260/280

entre 1,80-2,00), independentemente do método de extração utilizado e do GDR testado

(GUSB-MP, GUSB-RA, HMBS-RA, P<0,05; HMBS-MP P<0,005; teste de Mann-Whitney).

A análise comparativa dos métodos permitiu identificar o método MP como o de

melhor desempenho, devido à quantidade, qualidade, reprodutibilidade e relação custo-

benefício (Tabela 4.2).

Em um grupo de 10 amostras cujo RNA não foi amplificável com nenhuma das duas

metodologias após duas extrações e, havendo disponibilidade de um segundo bloco, a

amplificação do RNA foi realizada nesta segunda amostra. Este resultado indicou que a falta

inicial de amplificação é principalmente devida a problemas intrínsecos da amostra (por

exemplo, fixação) e levou a utilizar um novo bloco de parafina sempre que disponível,

quando ocorresse a falta de amplificação na primeira tentativa.

O procedimento de pré-Amp resultou em um aumento significativo de sensibilidade

comparada com as amostras sem pré-amplificação. O incremento médio em GUSB foi de 8,7

ciclos de valores Cq (10,1+1,5 ciclos para MP vs. 7,3+3,8 ciclos para RA).

4.1.2 Desenho experimental ANOVA tipo nested

O método MP foi selecionado para dar continuidade aos experimentos. Um desenho

experimental ANOVA tipo nested (hierárquico) foi realizado para avaliar as fontes de

variabilidade introduzidas em cada etapa da metodologia aplicada, para a análise de expressão

gênica a partir de material FFPE.

O primeiro experimento consistiu em avaliar os GDR e mostrou que GUSB

apresentava um melhor desempenho comparado com HMBS [Cq médio 23,085 vs. 24,017;

DP +0,120 vs. +0,139 e coeficiente de variação (CV), 0,520 vs. 0,581 respectivamente] (Fig.

4.2). Por isto¸ GUSB foi selecionado para normalizar os seguintes experimentos do desenho

ANOVA tipo nested. Foi observado que os Indivíduos 1 e 2 mostraram valores Cq similares

(faixa 21-23 ciclos) enquanto que o Individuo 3 mostrou valores Cqs maiores (24-26 ciclos)

(Fig. 4.3). Esta variabilidade poderia ter sido causada por diferentes quantidades de RNA

incluídas no ensaio de RT, apesar de terem sido usadas quantidades iniciais de RNA total de 1

µg para os 3 Indivíduos que tinham sido submetidas a digestão com DNAseI. Outra possível

51

causa seria a presença de inibidores na RT no Indivíduo 3. Não obstante a variabilidade

observada, se decidiu incluir o Individuo3 no ensaio de ANOVA tipo nested, para tentar

reproduzir as condições encontradas nas amostras primárias de tumor.

Fig. 4.2: Gráfico de amplificação do gene GUSB no Indivíduo 2. No eixo horizontal são representados os ciclos fracionais; no eixo vertical valores de intensidade de fluorescência acumulada (∆Rn). A linha horizontal que corta as curvas de acumulação de fluorescência representa o limiar ou threshold que foi 0,376 para todos os ensaios. As curvas dos NTCs (controles sem cDNA) não atravessam o limiar.

Fig. 4.3: Gráfico de variabilidade interindividual para o gene GUSB. Os valores da ordenada representam o Cq. Em cada sujeito estão acumuladas as variabilidades dos diferentes níveis do ensaio, correspondendo o primeiro nível a linfonodo, o segundo a extração de RNA e assim por diante. Cq: ciclo de quantificação; pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição. Méd: média.

Cq

Subject 1 Subject 2 Subject 3

Aver

Pre-Amp

RT

RNA

Lymph node

Sujeito 1 Sujeito 2 Sujeito 3

Pré-Amp

RT

RNA

Linfonodo

Gráfico de Variabilidade

Méd

Indivíduo 1 Indivíduo 2 Indivíduo 3

52

Os diferentes ensaios mostraram ser reprodutíveis. A variação inter-ensaio, usando

valores Cq de GUSB de cada Indivíduo foi aceitável, com valores de CV de 2,07% para o

Indivíduo 1, 1,71% para o Indivíduo 2 e 2,03% para o Indivíduo 3 (CV médio: 1,94%). Os

DPs variaram entre +0,37 - +0,51 por indivíduo, em 5 placas avaliadas para cada um.

As fontes de variabilidade, tanto biológicas (interindividual e interlinfonodo) ou

técnicas (RNA, RT, pré-Amp e qPCR) são mostradas nas Fig. 4.4 como porcentagem de

variação. A fim de comparar os resultados provenientes de amostras de alta complexidade

FFPE com trabalhos prévios que exploraram a mesma abordagem metodológica (TICHOPAD

et al., 2009), estes serão apresentados primeiramente em valores Cq (Tabela 4.3 e Anexo IV:

Tabela S2).

Depois de ter aplicado o desenho tipo nested para os GDR, o mesmo experimento foi

realizado para 5 genes previamente descritos no LHc: LYZ, STAT1, IRF4, BCL2 e CASP3

(SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010).

Como esperado, a variação biológica contribuiu significativamente para a variação

total em todos os casos (>90%), em quanto que a variação técnica foi mais significativa nos

passos de RNA (1,3% em LYZ a 7,1% em CASP3) e pré-Amp (0,6% em IRF4 a 6,0% em

CASP3) (Anexo IV: Tabela S2 e Fig. 4.4).

Fig. 4.4: Variabilidade total em porcentagem observada no desenho ANOVA tipo nested para valores Cq. qPCR: PCR quantitativa em tempo real; pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição. Os valores numéricos são mostrados no Anexo IV: Tabela S2.

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

GUSB HMBS LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3

( %)

qPCR

pré-Amp

RT

RNA

Linfonodo

Sujeito

Por

cent

agem

tota

l de

vari

ação

53

Na Fig. 4.5 são mostradas as variações cumulativas expressas em valores DP de Cq

(A) e ∆Cq (B). Esta forma de representar os dados permite visualizar a carga de variabilidade

total em cada gene, além da contribuição de cada etapa. Assim o gene LYZ foi aquele com

maior variabilidade e os genes IRF4 e STAT1 com menor. Também é possível reconhecer que

a normalização dos dados leva a uma diminuição importante da variabilidade. Os valores

numéricos estão apresentados na Tabela 4.3 (valores Cq e Cy0) e Tabela 4.4 (valores ∆Cq e

∆Cy0).

Fig. 4.5: Distribuição da variabilidade em valores desvio padrão acumulada no ensaio ANOVA tipo nested. A: quantificação em valores Cq; B: quantificação em valores ∆Cq. Cada uma das barras representa um gene com o valor de DP acumulado por fonte de variação. Cq: ciclo de quantificação; ∆Cq: delta Cq; pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição.

Como mostrado na Tabela 4.3, os genes GUSB, HMBS, STAT1, IRF4, BCL2 e CASP3

mostraram um comportamento similar, com ruídos totais entre +1,17 a +1,68 ciclos (DP),

média +1,57 ciclos. Em termos de fold change, isto representa uma diferença de 2,97 vezes

entre as amostras (21,57). Por outro lado, o gene LYZ apresentou uma variabilidade mais

elevada com ruído total de +2,37 ciclos (DP).

Quantificação∆Cq

Des

vio

padr

ão a

cum

ulad

o

Quantificação Cq

Des

vio

padr

ão a

cum

ulad

o

A

B

54

Tabela 4.3: Variabilidade estimada entre indivíduos, linfonodos e passos do processamento das amostras em valores Cq e Cy0. Cq GENES Cy0 GENES

GUSB HMBS LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3 GUSB HMBS LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3

Média 23,085 24,017 18,460 19,565 21,260 24,764 27,176 22,962 24,050 19,024 19,066 21,662 24,966 26,853

Variabilidade biológica Interindividual (DP) 1,824** 1,522** 2,676* 1,860** 1,386** 1,507** 1,818* 1,757** 1,521** 2,368** 1,869** 1,451** 1,490** 1,751**

Linfonodo (DP) 0,000 0,039 0,809** 0,000 0,000 0,000 0,316 0,148 0,165 0,280 0,076 0,000 0,000 0,000

Variabilidade biológica total (Soma DP)

1,824 1,561 3,485 1,866 1,386 1,507 2,134 1,905 1,686 2,648 1,945 1,451 1,490 1,751

Variabilidade técnica

RNA (DP) 0,305* 0,320* 0,321* 0,338** 0,223** 0,322** 0,527** 0,216 0,242 0,426** 0,282** 0,235** 0,258 0,565**

RT (DP) 0,153 0,251* 0,105 0,000 0,110* 0,304 0,117 0,129 0,230** 0,181* 0,158* 0,088 0,241 0,095

pré-Amp (DP) 0,228** 0,260** 0,349** 0,237** 0,109** 0,284** 0,487** 0,280** 0,196** 0,225** 0,151** 0,150** 0,223* 0,438**

qPCR (DP) 0,120 0,139 0,059 0,105 0,072 0,084 0,096 0,111 0,105 0,072 0,105 0,163 0,333 0,069

Variabilidade técnica total (Soma DP)

0,806 0,970 0,834 0,680 0,514 0,994 1,227 0,736 0,773 0,904 0,696 0,636 1,055 1,167

Variabilidade total (Soma DP biológica e técnica)

2,630 2,531 4,319 2,546 1,900

2,501 3,361 2,641 2,459 3,552 2,641 2,087

2,545 2,918

Ruído total (DP) 1,551 1,343 2,368 1,579 1,169 1,316 1,681 1,449 1,317 2,024 1,577 1,233 1,315 1,586

Ruído individual (DP) 0,366 0,454 0,635 0,369 0,248

0,457 0,712 0,384 0,387 0,502 0,346 0,304

0,473 0,622

* P-valor < 0,05; ** P-valor < 0,01

Cq: ciclo de quantificação; Cy0: quantificação Cy0; DP: Desvio padrão. RT: retrotranscrição; pré-Amp: pré-amplificação; qPCR: PCR quantitativa em tempo real. Ruído total foi calculado como a variação acumulada expressada em valores DP de todas as medições dos valores Cq dos três casos como se tivessem

sido obtidas independentemente. Ruído individual foi calculado como ∑DP de cada Cq por individuo/número de indivíduos. Valores de P obtidos na analises ANOVA tipo nested.

55

A interpretação dos valores ∆Cq foi considerada mais informativa. Primeiro, nas

condições metodológicas deste estudo, a variabilidade diminuiu sistematicamente depois da

normalização com o GDR. Isto pode ser observado na comparação dos ruídos totais dos

valores Cqs vs. ∆Cqs (Tabelas 4.3 e 4.4), e foi confirmado com o cálculo do DP usando a

covariância. Na análise ∆Cq, os ruídos totais variaram entre +0,39 e +0,70 (DP) para STAT1,

IRF4, BCL2 e CASP3, média do ruído total +0,65 (DP) que representa 1,57 fold change entre

as amostras. Entretanto LYZ manteve uma alta variabilidade, com +1,02 DP.

Em segundo lugar, considerando a variabilidade introduzida durante os passos

técnicos em valores Cq, uma contribuição significante na etapa de RNA foi registrada para

todos os genes, que desapareceu após a normalização. Por outro lado, a etapa de pré-Amp foi

uma fonte significante de variabilidade introduzida para todos os genes antes e depois da

normalização.

Com respeito à variabilidade biológica total em valores ∆Cq, LYZ mostrou o maior

valor (DP +1,43 ciclos); enquanto que STAT1 apresentou a menor variação biológica (DP

+0,24 ciclos). BCL2 mostrou uma variabilidade interindividual significante, por outro lado

IRF4 e LYZ manifestaram variabilidade interlinfonodo, isto poderia ser causado por um

número de células diferentes representadas nas amostras que expressam estes genes.

Uma vez que trabalhos prévios mostraram um efeito do nível de expressão gênica na

variabilidade (TICHOPAD et al., 2009), os genes de interesse (GDI) foram caracterizados de

acordo com os níveis de expressão: LYZ, STAT1 e IRF4 foram considerados genes de alta

expressão (∆Cq médios de -4,218, -3,029 e -1,422, respectivamente), BCL2 como

intermediário (∆Cq médio de 1,679) e CASP3 como gene de baixa expressão (∆Cq médio de

4,340) (Fig. 4.6). Genes com expressão intermediaria e baixa sofreram mais os efeitos da

manipulação técnica que os genes de alta expressão (valor médio do DP 0,930 vs. 0,541,

respectivamente, excluindo os valores de LYZ). STAT1 e IRF4 foram os menos afetados pela

variabilidade técnica, enquanto que CASP3 exibiu um profundo efeito técnico (Tabela 4.4).

56

Tabela 4.4: Variabilidade estimada entre indivíduos, linfonodos e passos do processamento das amostras em valores ∆Cq e ∆Cy0.

* P-valor ≤ 0,05; ** P-valor ≤ 0,01 Cq: ciclo de quantificação; ∆Cq: delta Cq; Cy0: quantificação Cy0; ∆Cy0: delta Cy0; DP: desvio padrão; RT: retrotranscrição; pré-Amp: pré-amplificação; qPCR: PCR quantitativa em tempo real. Ruído total foi calculado como a variação acumulada expressada em valores DP de todas as medições dos valores Cq dos três casos como se foram obtidas independentemente. Ruído individual foi calculado como ∑DP de cada Cq por indivíduo /número de indivíduos. Valores de P obtidos na analises ANOVA tipo nested.

∆Cq GENES DE INTERESSE ∆Cy0 GENES DE INTERESSE

LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3 LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3

Média ∆Cq -4,218 -3,029 -1,422 1,679 4,340 -4,322 -4,537 -1,832 2,004 3,412

Variabilidade biológica

Interindividual (DP) 0,832 0,090 0,491 0,548* 0,318 1,163** 0,314 0,516 0,567* 0,000

Linfonodo (DP) 0,601* 0,154 0,248* 0,000 0,170 0,000 0,229 0,224* 0,163* 0,346

Variabilidade biológica total (Soma DP)

1,433

0,244

0,739

0,548

0,488

1,163

0,543

0,740

0,730

0,346

Variabilidade técnica

RNA (DP) 0,208 0,000 0,066 0,120 0,280 0,000 0,104 0,042 0,000 0,207

RT (DP) 0,000 0,139 0,145 0,173 0,134 0,264 0,000 0,130 0,217 0,000

pré-Amp (DP) 0,485** 0,346** 0,194** 0,362** 0,547** 0,430** 0,235** 0,201** 0,295** 0,666**

qPCR (DP) 0,106 0,103 0,090 0,124 0,120 0,136 0,177 0,184 0,352 0,112

Variabilidade técnica total (Soma DP)

0,799 0,588 0,495 0,779 1,081 0,830 0,516 0,557 0,864 0,985

Variabilidade total (Soma DP

biológica e técnica) 2,232 0,832 1,234

1,327 1,569 1,993 1,059 1,227 1,508 1,331

Ruído total (DP) 1,024 0,388 0,533 0,624 0,702 1,070 0,454 0,560 0,669 0,712

Ruído individual (DP) 0,601 0,346 0,306

0,405 0,610 0,448 0,342 0,334

0,460 0,651

57

Fig. 4.6: Gráfico de Box plot mostrando os níveis de expressão dos genes estudados. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico o valor mínimo e máximo do conjunto de dados. Círculos vermelhos: dados outliers. ∆Cq: delta Cq.

A variabilidade total (soma dos DPs das variabilidades biológica e técnica) aumentou

em proporção inversa à expressão de cada gene, exceto para LYZ que apresentou tanto a maior

expressão quanto a maior variação, com valores de correlação de R2= 1,00 (P<0,001;

correlação de Spearman, excluindo LYZ).

4.1.3 Método Cy0

Os resultados de qPCR foram também analisados aplicando o método Cy0 que avalia

a cinética da curva, visando identificar o efeito potencial dos inibidores nas reações de PCR.

Quando as médias dos valores ∆Cq e ∆Cy0 foram comparadas para cada gene, o método Cy0

resultou em níveis aumentados de expressão para todos os genes, com exceção de BCL2.

Análises pareadas (96 valores de qPCRs para cada gene) revelaram diferenças significativas

(P< 0,001 para todos os genes, teste de Wilcoxon), exceto para a expressão de LYZ (P= 0,120,

teste de Wilcoxon) (Tabela 4.4).

Em geral, não houve um efeito significativo do método de quantificação (threshold vs.

cinética) na diminuição da variabilidade biológica e técnica. Não obstante, foi observado que

a variabilidade biológica total e o ruído individual diminuíram para LYZ e CASP3 quando

utilizado o método Cy0. Não foram observadas diferenças no ruído técnico total (Tabela 4.4 e

Fig. 4.7).

58

Fig. 4.7: Contribuição do Desvio Padrão (DP) acumulado no ensaio ANOVA tipo nested para cada gene estudado. A: quantificação em valores Cy0; B: quantificação em valores ∆Cy0. DP: desvio padrão; Cy0: ciclo de quantificação Cy0; ∆Cy0: delta Cy0 pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição.

A variabilidade introduzida no passo da pré-Amp foi detectada, indiferentemente da

metodologia de quantificação, indicando que o erro introduzido neste passo foi

especificamente técnico e não gene ou dependente de inibidores.

4.1.4 Modificações do método de PCR em tempo real quantitativo

Visando diminuir a variabilidade introduzida na etapa de pré-Amp, algumas

modificações foram testadas. Para isto, foram selecionados os GDI CASP3 (baixa expressão e

alta variabilidade técnica) e STAT1 (alta expressão e baixa variação técnica); o Indivíduo 2 foi

escolhido devido a menor variabilidade observada. Assim, o ensaio ANOVA tipo nested foi

composto por cinco níveis (linfonodo, RNA, RT, pré-Amp e qPCR).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0


Quantificação Cy0

qPCR

Pré-Amp

RT RNA

Linfonodo Sujeito

A

Des

vio

padr

ão a

cum

ulad

o

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

LYZ STAT1 IRF4 BCL2 CASP3

Quantificação ∆Cyo

qPCR

pré-Amp

RT

RNA

Linfonodo Sujeito

B

Des

vio

padr

ão a

cum

ulad

o

59

O primeiro experimento consistiu em: (i) mudança da diluição final da pré-Amp de

1:20 para 1:10 com 14 ciclos de pré-Amp e (ii) mudança da diluição final da pré-Amp de 1:20

para 1:10 com 10 ciclos de pré-Amp. Estas modificações não foram capazes de melhorar a

etapa de pré-Amp e ainda aumentaram a variabilidade neste nível (Fig. 4.8).

Fig. 4.8: Modificações da pré-amplificação no Indivíduo 2. A: valores originais, pré-amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:20 (condições iniciais); B: pré-amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:10; C: pré-amplificação com 10 ciclos e diluição final 1:10. DP: desvio padrão; pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição.

A terceira modificação foi realizada no Individuo 1 devido ao consumo do material

biológico do Indivíduo 2. Esta consistiu na diminuição da quantidade inicial de RNA no

ensaio de RT de 1 µg para 0,5 µg, mantendo 14 ciclos de pré-Amp com diluição final de 1:20.

Esta última modificação resultou na melhora da variabilidade da pré-Amp para os genes

CASP3 e STAT1, assim como na diminuição da variabilidade total biológica e técnica,

(CASP3 com Cq médio de 25,71 + 1,19 a Cq 27,66 + 0,58; média de ∆Cq de 4,02 a 4,32; e

STAT1, de Cq médio 18,34 + 0,78 a 20,21 + 0,58 DP; média de ∆Cq -3.16 to -2.83). Em

valores ∆Cq, STAT1 diminui a variabilidade total enquanto que CASP3 manteve a

variabilidade absoluta, entretanto, a variabilidade técnica diminuiu em 0,33 de DP (Fig. 4.9).

Fig. 4.9: Modificações da préRNA, pré-amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:20 (condições iniciais); B: retrotranscrição com 0,5 µg de RNA, seguido da prfinal 1:20. DP: desvio padrão; pré

4.2 ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA EM UM GRUPO DE PACIENTES COM

LINFOMA DE HODGKIN CLÁSSICO PEDIÁTRICO

4.2.1 Características clínicas do grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin

clássico pediátrico

Um grupo de 93 pacientes

avaliar a expressão de um conjunto de 11 genes associados com vias celulares do LHc. As

características clínicas encontram

Os pacientes apresentavam 3 a 18 anos (mediana 14 anos) no mome

diagnóstico. Quando classificados segundo a idade em dois grupos utilizando como ponto do

60

4.9: Modificações da pré-amplificação no Indivíduo 1. A: valores originais com 1 amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:20 (condições iniciais); B:

com 0,5 µg de RNA, seguido da pré-amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:20. DP: desvio padrão; pré-Amp: pré-amplificação; RT: retrotranscrição.

ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA EM UM GRUPO DE PACIENTES COM

LINFOMA DE HODGKIN CLÁSSICO PEDIÁTRICO

Características clínicas do grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin

clássico pediátrico

Um grupo de 93 pacientes com LHc pediátricos contou com material suficiente para


características clínicas encontram-se resumidas na Tabela 4.5.

apresentavam 3 a 18 anos (mediana 14 anos) no mome


A: valores originais com 1 µg de amplificação com 14 ciclos e diluição final 1:20 (condições iniciais); B:

amplificação com 14 ciclos e diluição icação; RT: retrotranscrição.

ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA EM UM GRUPO DE PACIENTES COM

Características clínicas do grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin

ricos contou com material suficiente para


apresentavam 3 a 18 anos (mediana 14 anos) no momento do


61

corte 10 anos, 24 (25,8%) pacientes tinham <10 anos, enquanto que 69 pacientes (74,2%)

apresentaram idade >10 anos. Houve uma maior frequência de pacientes do sexo masculino

(61 casos; 65,6%) que do sexo feminino (32 pacientes; 34,4%). Com respeito ao

estadiamento, a maioria (60,2%) dos pacientes apresentava estadios clínicos I e II, comparado

com 39,8% dos tipos III e IV. A metade do grupo (44/88 pacientes) foi caracterizado como

de risco favorável.

Quarenta e oito pacientes (54,5%) apresentaram sintomas B (febre, sudoração noturna,

perda de peso). A presença de massa mediastínica foi observada em 59 (66,3%) pacientes,

sendo que 11 de 88 pacientes (12,5%) apresentaram comprometimento de algum sítio

extranodal.

No que se refere às características histológicas do LHc, o subtipo majoritariamente

encontrado foi EN em 66 pacientes (71,0%), seguido de 21 casos (22,6%) com CM e 9 (6,4%)

que mostraram características do subtipo DL. Quando os casos de EN se estratificaram

segundo o grau, 36 (54,5%) se agruparam no grau I, enquanto que o grupo grau II foi

representado por 30 pacientes (45,5%).

Em relação à presença do EBV nas células H-RS, definida pela técnica de ISH para os

transcritos EBERs (EBER-ISH), 36 casos (40%) foram EBV+. A Fig. 4.10 apresenta o

resultado da técnica de hibridização in situ para EBERs em uma amostra de LHc EBV+.

Fig. 4.10: Detecção do vírus Epstein-Barr através da técnica de hibridização in situ. A positividade das células tumorais (H-RS) é observada pela marcação escura no núcleo celular.

62

Tabela 4.5: Descrição das características clínicas, histológicas e associação com o vírus Epstein-Barr no grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátrico. Variável Casos analisados Valor percentual Idade (anos) Faixa 3-18 Media/Mediana 13/14 ≤ 10 anos 24/93 25,8% ˃ 10 anos 69/93 74,2% Sexo Masculino 61/93 65,6% Feminino 32/93 34,4% Massa Mediastínica Sim 59/89 66,3% Não 30/89 33,7% Estadio I 9/88 10,2% II 44/88 50,0% III 24/88 27,3% IV 11/88 12,5% Sitio extranodal Sim 11/88 12,5% Não 77/88 87,5% Sintomas B Sim 48/88 54,5% Não 40/88 45,5% Grupo de Risco Favorável 44/88 50,0% Não favorável 44/88 50,0% Diagnóstico histopatológico Esclerose nodular 66/93 71,0% Celularidade mista 21/93 22,6% Depleção linfocítica 6/93 6,4% Grau de esclerose nodular I 36/66 54,5% II 30/66 45,5% Associação com EBV Sim 36/90 40,0% Não 54/90 60,0%

63

4.2.2 Análise de expressão gênica em um grupo de pacientes com linfoma de

Hodgkin clássico

4.2.2.1 Rendimento da extração de RNA no grupo total de pacientes

A partir do grupo de 93 pacientes, extrações de RNA foram realizadas utilizando o

método MP. Este método foi escolhido por apresentar o melhor rendimento do RNA a partir

de material FFPE (descrito com detalhe na seção 4.1). A quantificação absoluta de RNA foi

de média 6,49 + 7,79 µg, apresentando uma média de pureza na λ260/280 e λ260/230 de 1,80

+ 0,14 e 1,39 + 0,66 respectivamente. Em termos gerais, o RNA obtido apresentou alto nível

de degradação. Mais de 50% dos casos apresentaram valores de quantificação superiores a

3,51 µg, λ260/280 de 1,84 e λ260/230 de 1,6; como observado na Fig. 4.11.

Fig. 4.11: Distribuição do rendimento da extração de RNA proveniente de material FFPE nos casos com linfoma de Hodgkin clássico. A: quantificação absoluta em µg; B: relação RNA/proteínas (λ260/280); C: relação RNA/sais (λ260/230). Cada uma das barras representa a quantificação de um paciente com o valor em µg¸ λ260/280 ou λ260/230.

λ260

/280

λ

260/

230

A

B

C

64

4.2.2.2 Avaliação da qualidade e determinação dos níveis de expressão gênica

Um grupo de 11 genes pertences às vias do ciclo celular (CENPF, CDK1, CCNA2,

CCNE2 e HMMR), apoptose (BCL2, BCL2L1 e CASP3), genes do microambiente das células

relacionados à ativação de macrófagos (LYZ e STAT1) e IRF4 (células H-RS e

microambiente) foram caracterizados por ser altamente expressos em um grupo de pacientes

adultos com LHc avançado (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010). A avaliação por RT-

qPCR foi realizada seguindo os métodos com melhor desempenho previamente definidos (ver

secção 4.1.4: modificações do método de RT-qPCR).

Dois critérios de qualidade foram utilizados para a exclusão dos casos das análises

estatísticas: 1) falta de amplificação dos GDR (Cq>35 ciclos), o que levou à exclusão de 6

casos e; 2) quando 5 ou mas GDI amplificaram com um Cq>35 ciclos, nesta situação 3 casos

adicionais foram excluídos. Assim, 84 pacientes tiveram critérios de qualidade para ser

incluídos no estudo de expressão gênica.

Em relação aos níveis de expressão gênica no grupo avaliado, foram identificados dois

grupos, utilizando como valor de quantificação a mediana de fold change de cada gene: o

grupo de genes de alta expressão composto por IRF4 (0,54); BCL2L1 (1,11); STAT1 (2,51) e

LYZ (3,17) e um grupo de genes de baixa expressão formados por CCNA2 (-5,40); HMMR (-

4,83); CDK1 (-4,75); CASP3 (-4,47); CCNE2 (-3,97); CENPF (-2,78) e BCL2 (-2,46) (Fig.

4.12).

65

Fig. 4.12: Gráfico de Box plot mostrando a classificação dos níveis de expressão dos genes estudados. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Círculos vermelhos: dados outliers. No marco verde os genes de baixa expressão e no vermelho os genes de alta expressão. Fold change em valores de 2-∆Cq.

Em relação aos genes de baixa expressão, para descartar a hipótese de que estes

valores fossem artificialmente baixos devido a inibição das reações de qPCR, análises foram

realizadas utilizando o método KOD (detecção de outliers pela cinética da curva), onde

aqueles pacientes com resultado positivo para um valor fora da distribuição da data, uma nova

extração foi realizada, como descrito na seção 3.11.

Todas as corridas de qPCR foram realizadas utilizando um controle inter-placa (pool

de cDNA de doadores sadios) para cada gene. A avaliação inter-ensaio mostrou que o método

era reprodutível, com coeficientes de variação (CV) aceitáveis para todos os genes [BCL2

(1,51%), BCL2L1 (1,96%), CASP3 (0,70%), CCNA2 (1,71%), CCNE2 (1,67%), CDK1

(2,07%), CENPF (2,69%), HMMR (1,55%), IRF4 (1,43%), LYZ (1,18%), STAT1 (2,15%),

GUSB (1,35%) e HMBS (1,55%)] (Anexo II).

4.2.3 Análise não supervisionada de cluster hierárquico

A expressão gênica do grupo total de paciente foi representada em um gráfico de

heat-map. Dois conjuntos foram identificados tanto para os genes avaliados como para grupo

de pacientes (Fig. 4.13). Os dois grupos classificados em relação aos genes foram segregados

66

segundo o nível de expressão: 1) genes de baixa expressão, incluindo: CENPF, BCL2,

CCNA2, HMMR, CDK1, CCNE2, e CASP3 e; 2) genes de alta expressão, incluindo: IRF4,

BCL2L1, LYZ e STAT.

Em relação aos pacientes, um grupo de 25 pacientes se distinguiu por apresentar

baixa expressão nos genes do ciclo celular, principalmente de CCNA2, HMMR, CDK1 e

CNNE2, junto com uma diminuição do nível de CASP3. Este grupo de pacientes foi

caracterizado por ser em sua maioria EBV- com subtipo EN grau II. Não foram identificadas

diferenças entre as idades dos pacientes, grupo de risco ou recaída.

Fig. 4.13: Gráfico de tipo heat-map da expressão gênica no grupo total de pacientes. Em cada fila é representado cada um dos genes avaliados; cada coluna representa os resultados de um paciente. A: Características do grupo de pacientes. Quadrado preto: idade >10 anos; azul: presença do EBV; laranja: recaída; verde: paciente com alto risco; amarelo: subtipo esclerose nodular; vinho; subtipo esclerose nodular grau II; cinza: sem informação. Dentro da elipse azul: características relevantes do grupo dos 25 pacientes com baixa expressão de genes de ciclo celular e apoptose. B: representação do gráfico heat-map, valores representados na unidade de fold change em valores de 2-∆Cq; verde: baixa expressão; vermelho: alta expressão;

Visando identificar as características do microambiente tumoral (MAT) deste grupo de

25 pacientes que apresentou baixa expressão nos genes do ciclo celular, análises não

paramétricas foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney. Pacientes com o perfil de

baixa expressão apresentaram maior número de eosinófilos contados em 10 campos de grande

aumento (CGA) (mediana 146 células/10 CGA comparado com o grupo de pacientes com alta

expressão, mediana 62 células/mm2) (P= 0,002). Por outro lado, um menor número de células

67

citotóxicas GRZB+ (mediana 5 vs. 17 células/ mm2) (P= 0,035), linfócitos Ki67+ (mediana 61

vs. 105 células mm2) (P= 0,008), MAF+ (mediana 26 vs. 82 células mm2) (P= 0,008) e

macrófagos CD163+ (mediana 76 vs. 202 células mm2) (P= 0,005) foram observadas no

grupo de alta expressão vs. o grupo de baixa expressão, respectivamente (Fig. 4.14).

Fig. 4.14: Gráficos de Box

pacientes com linfoma de Hodgkin clássico ciclo celular. A: em relação à mediana do número de eosinófilos quantificados em 10 campos de grande aumento (CGA); B: em relação à mediana do número de células GRZB+/mmem relação à mediana do número de linfócitos Ki67+/mmnúmero de células MAF+/mmA barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo máximo do conjunto de dados. * e **: diferença estatisticamente significativa aos níveis P<0,05 e P<0,01; teste Mann

68

Box plot das características das populações do microambiente em com linfoma de Hodgkin clássico pediátricos com baixa expressão nos genes do

em relação à mediana do número de eosinófilos quantificados em 10 campos de grande aumento (CGA); B: em relação à mediana do número de células GRZB+/mmem relação à mediana do número de linfócitos Ki67+/mm2; D: em relação à mediana do

+/mm2; F: em relação à mediana do número de células CD163+/mmA barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo máximo do conjunto de dados. * e **: diferença estatisticamente significativa aos níveis

0,01; teste Mann-Whitney.

das características das populações do microambiente em pediátricos com baixa expressão nos genes do

em relação à mediana do número de eosinófilos quantificados em 10 campos de grande aumento (CGA); B: em relação à mediana do número de células GRZB+/mm2; C:

; D: em relação à mediana do ; F: em relação à mediana do número de células CD163+/mm2.

A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. * e **: diferença estatisticamente significativa aos níveis

69

4.2.4 Análises de componente principal (PCA)

A expressão do grupo total de genes estudados apresentou uma alta correlação entre

eles (Anexo IV: Tabela S3), por tal motivo foram realizadas análises de PCA com a finalidade

de reduzir a correlação entre as variáveis e identificar padrões de agrupamento subjacentes.

Foram identificados 3 componentes principais com valores eigen >1 que explicaram

65,7% da variabilidade total. O primeiro componente estava formado pelos genes do ciclo

celular (CENPF, CDK1, CCNA2, CCNE2 e HMMR) e explicava um 39% da variação; o

segundo componente estava constituído por genes do microambiente (STAT1 e LYZ) e

apoptose (CASP3 e BCL2) que explicavam 15,6%; e o terceiro componente principal

representado pelo gene BCL2L1 responsável por 11,0% da variabilidade (Fig. 4.15).

Fig. 4.15: Análises de componente principal. Nas elipses cada um dos componentes principais. Elipse vermelha: primeiro componente; elipse verde: segundo componente; elipse amarela: terceiro componente. Cada quadrado representa a media de cada gene.

4.2.5 Expressão gênica em relação aos subtipos histológicos do linfoma de Hodgkin

clássico

Análises de expressão gênica foram realizadas categorizando os casos segundo o

subtipo histológico. Pacientes com subtipo EN (62 casos) apresentaram menor expressão de

CASP3 e CDK1 quando comparados com os outros subtipos histológicos (principalmente

CM), com medianas da expressão de -4,89 vs. -4,00 (P=0,031) e -5,06 vs. -3,82 (P=0,044)

respectivamente (teste de Mann-Whitney).

CENPF, CDK1, CCNA2,

CCNE2, HMMR

STAT1, LYZ, BCL2, CASP3

BCL2L1

70

Como descrito previamente por nossa equipe (BARROS et al., 2011), os subtipos

histológicos apresentaram diferenças na composição do microambiente em relação aos

linfócitos T, sendo que os casos com EN mostraram um número aumentado de linfócitos

CD4+ (P=0,034) e uma diminuição de células citotóxicas TIA1+ (P=0,037) e GRZB+

(P=0,018). Os casos com EN mostraram também uma menor quantidade de precursores

monocíticos CD14+ (P=0,009). Em concordância com isto, os casos com CM tiveram um

infiltrado com menor quantidade de células CD4+ e maior quantidade de células CD8+

(P=0,049), TIA1+ (P=0,036), GRZB+ (P=0,019), CD14+ (P=0,003) e macrófagos CD163+

(P=0,021).

Com respeito à expressão gênica diferencial entre a EN de grau I (29 casos) vs. grau II

(33 casos), a EN grau I apresentou níveis mais altos de expressão dos genes CDK1 (-4,53 vs. -

6,51: P=0,009), CASP3 (-4,37 vs. -5,13: P=0,030), STAT1 (2,68 vs. 1,89: P=0,013) e LYZ

(3,35 vs. 2,39: P=0,022) (teste de Mann-Whitney) (Fig.4.16).

Fig. 4.16: Análise do grau de esclerose nodular do linfoma de Hodgkin clássico e sua relação com a expressão gênica. A e B: Gráficos de Box plot da expressão gênica em relação ao grau de esclerose nodular para genes de baixa e alta expressão respectivamente. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Expressão em valores de 2-∆Cq; *: diferença estatisticamente significativa no nível P<0,05); **: diferença estatisticamente significativa, no nível P<0,01. Teste Mann-Whitney. EN: esclerose nodular.

71

4.2.6 Correlação da expressão gênica com marcadores avaliados por

imunohistoquímica nas células de Hodgkin-Reed Sternberg e no

microambiente tumoral

Uma vez que o estudo da expressão gênica não é capaz de identificar as células

expressando os RNAm específicos, nós visamos identificar associação entre os níveis de

expressão gênica e a expressão de algumas proteínas envolvidas em vias celulares específicas

ou com marcadores de sub-populações celulares infiltrantes no MAT.

4.2.6.1 Marcadores das células de Hodgkin-Reed Sternberg e sua associação com

a expressão gênica

As células H-RS tinham sido caracterizadas em relação ao número, presença de

divisão mitótica, expressão de Ki67 (marcador clássico de proliferação), assim como à

expressão de p21, p53, e BCL2 em um trabalho da equipe previamente publicado (BARROS

et al., 2010). As correlações entre as expressões proteicas e gênicas são mostradas na Tabela

4.6.

O número de células de H-RS e o número de células em mitoses não tiveram

correlação com os níveis de expressão dos genes analisados. Considerando P<0,01 como

valor significativo para as análises de correlação para mitigar os efeitos das comparações

múltiplas.

Quando categorizados os casos com ponto de corte em 50% de células H-RS

expressando as proteínas, foi observado que 35/77 (45,5%) dos casos apresentaram

positividade para p53 e 39/74 (52,7%) expressavam p21. Pacientes com baixos níveis de p53

(<50%) apresentaram um aumento da expressão de RNAm de CASP3 (P=0,04; teste de

Mann-Whitney). Não houve correlação entre a expressão de p21 e qualquer um dos genes

investigados.

Devido ao fato de a imunomarcação de BCL2 ter sido registrada através da

porcentagem de células H-RS, esta foi categorizada em positiva: BCL2 > 10% das células H-

RS e negativa: <10% das células H-RS. Não houve diferença na expressão de RNAm de

BCL2 para estas duas categorias (P=0,63; teste de Mann-Whitney).

72

4.2.6.2 Microambiente tumoral e sua associação com a expressão gênica

Em relação ao MAT, a caracterização das sub-populações celulares T infiltrantes se

encontra publicada em BARROS et al. (2012) (Anexo V). Adicionalmente, foram

caracterizadas as populações de macrófagos (CD68+ e CD163+), monócitos (CD14+), assim

como o estado de proliferação das células infiltrantes (Ki67+) e a imunoexpressão de

CASP3+ ativa por estas células (Fig. 4.17; Anexos IV: Tabelas S4 e S5).

Os resultados de RT-qPCR para cada um dos genes avaliados foram correlacionados

com o número de células do microambiente identificadas por IHQ por mm2. Na Tabela 4.7

são mostrados os valores de correlação (R2) entre o número de células e a expressão gênica,

aceitando P< 0,01 como valor significativo da correlação (teste de Spearman).

Fig. 4.17: Caracterização imunohistoquímica das células infiltrantes do microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico pediátrico.linfócitos T citotóxicos CD8+ no microambiente tumoral (aumento 40com alto número de precursores/número de macrófagos CD68+ (aumento 4macrófagos CD163+ no microambiente tumoral (aumento 40número de linfócitos Ki67+ no microambiente tumoral (aumento alto número de linfócitos CASP3+ no microambiente tumoral (aumento 40

73

4.17: Caracterização imunohistoquímica das células infiltrantes do microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico pediátrico. A: caso de LHc com alto número de linfócitos T citotóxicos CD8+ no microambiente tumoral (aumento 40

alto número de precursores/monócitos CD14+ (aumento 400x); C: caso de LHc com alto número de macrófagos CD68+ (aumento 400x); D: caso de LHc com alto número de macrófagos CD163+ no microambiente tumoral (aumento 400x); E: caso de LHc com alto

nfócitos Ki67+ no microambiente tumoral (aumento 1000x); F: caso de LHc com alto número de linfócitos CASP3+ no microambiente tumoral (aumento 40

D

4.17: Caracterização imunohistoquímica das células infiltrantes do microambiente A: caso de LHc com alto número de

linfócitos T citotóxicos CD8+ no microambiente tumoral (aumento 400x); B: caso de LHc x); C: caso de LHc com alto

0x); D: caso de LHc com alto número de x); E: caso de LHc com alto

00x); F: caso de LHc com alto número de linfócitos CASP3+ no microambiente tumoral (aumento 400x).

74

4.2.6.2.1 Populações linfocitárias

O número de células citotóxicas (CD8+, GRZB+, TIA1+), mostrou uma correlação

positiva com a expressão de CASP3, CDK1 e BCL2. O número de células expressando

proteínas citotóxicas foi também associado com os níveis de expressão de genes relacionados

à ativação de macrófagos (STAT1 e/ou LYZ).

Um alto número de células expressando o fator de transcrição MAF+ (linfócitos Th2)

teve correlação com alta expressão de RNAm de CASP3, sendo que um menor número de

linfócitos Th2 foi correlacionado com maior expressão de BCL2L1.

4.2.6.2.2 Precursores monocíticos e macrófagos

No que se refere aos monócitos e macrófagos intratumorais, nos 84 casos avaliados

houve um número maior de macrófagos CD68+ (mediana: 284 células/mm2; faixa: 44-601

células/mm2) e CD163+ (mediana: 137 células/mm2; faixa 0-413 células/mm2) que de

monócitos/precursores CD14+ (mediana: 49 células/mm2; faixa 0-275 células/mm2).

O número de monócitos (células CD14+) mostrou correlação positiva com a expressão

de STAT1, e de maneira importante a expressão de STAT1, LYZ e IRF4 foi associada a um

aumento no número de macrófagos CD68+ e CD163+ (Tabela 4.7).

4.2.6.2.3 Eosinófilos

O número de eosinófilos no MAT foi variável nos 84 casos analisados, com infiltração

de entre 0 e 3500 células em 10 CGA (mediana de 27 células/10 CGA) (Fig. 4.18). Houve

uma correlação inversa com a expressão dos genes das vias do ciclo celular (CENPF e

CDK1), apoptose (CASP3 e BCL2), genes do microambiente relacionados a macrófagos

(STAT1 e LYZ) e o gene IRF4 (Tabela 4.7). Adicionalmente, testes de Mann-Whitney

mostraram diferenças significativas entre maior número de eosinófilos (> 27 eosinófilos/10

CGA) e menor expressão de CENPF (P <0,001), CDK1 (P=0,001), CASP3 (P=0,007), LYZ

(P=0,007), STAT1 (P=0,001) e IRF4 (P<0,001) (Fig. 4.19).

Fig. 4.18: Análise dos eosinófilos no microambiente do linfoma de Hodgkin clássico pediátrico e suas relações com a expressão gênica. (aumento 1000x) e baixo núH&E (aumento 1000x); C e D: mediana de eosinófilos para genes de alta e baixa expressão respectivamente. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispvalores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Expressão(P<0,01); teste Mann-Whitney.

75

4.18: Análise dos eosinófilos no microambiente do linfoma de Hodgkin clássico pediátrico e suas relações com a expressão gênica. A e B: Linfonodo tumoral com alto

e baixo número de eosinófilos infiltrando o microambiente, respectivamente 0x); C e D: Gráficos de Box plot da expressão gênica em relação à

mediana de eosinófilos para genes de alta e baixa expressão respectivamente. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispvalores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Expressão em valores de 2-∆Cq; **: diferença estatisticamente significativa

Whitney.

4.18: Análise dos eosinófilos no microambiente do linfoma de Hodgkin clássico nodo tumoral com alto

mero de eosinófilos infiltrando o microambiente, respectivamente da expressão gênica em relação à

mediana de eosinófilos para genes de alta e baixa expressão respectivamente. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do

; **: diferença estatisticamente significativa

76

Tabela 4.6: Correlação entre a expressão gênica e variáveis relacionadas ao ciclo celular e apoptose nas células de Hodgkin/Reed-Sternberg, avaliados por marcações de imunohistoquimica (IHQ). Marcações por IHQ GENES DE INTERESSE CENPF CDK1 CCNA2 CCNE2 HMMR CASP3 BCL2 BCL2L1 LYZ STAT1 IRF4

No. de células H-RS 0,070 0,027 0,022 -0,112 0,070 -0,023 0,155 -0,010 0,020 -0,130 0,136

No. de mitoses -0,081 -0,125 0,025 -0,083 0,073 -0,093 -0,136 0,040 -0,227* -0,012 -0,022

p53 -0,124 -0,015 -0,099 -0,041 -0,035 0,001 -0,023 -0,013 -0,030 0,025 0,000

p21 0,022 0,058 -0,077 -0,058 -0,015 0,163 -0,108 0,069 -0,047 0,138 0,076

* P< 0,005: ** P< 0,001. Valores P obtidos através da correlação de Spearman. Na tabela estão representados os valores de R2 (positivos: correlação direta entre as quantificações; negativos: correlação inversa entre as quantificações).

77

Tabela 4.7: Correlação entre a expressão gênica e o número de células do microambiente avaliadas por marcações de imunohistoquimica (IHQ). Marcações por IHQ GENES DE INTERESSE CENPF CDK1 CCNA2 CCNE2 HMMR CASP3 BCL2 BCL2L1 LYZ STAT1 IRF4

CD3+ 0,204 0,082 0,181 0,315** 0,194 -0,007 0,307** -0,037 -0,047 0,071 0,330**

CD4+ 0,314** 0,085 0,069 -0,097 0,020 0,113 0,401** -0,034 0,077 0,033 0,231

CD8+ 0,097 0,310** 0,065 0,198 0,106 0,259* 0,300** -0,021 0,098 0,230* 0,231*

GRZB+ -0,004 0,264 0,087 0,061 0,132 0,246** 0,123 -0,125 0,328** 0,283 -0,027

TIA1+ 0,218 0,281** -0,033 0,216 0,055 0,347** 0,245* 0,176 0,335** 0,467** 0,182

FOXP3+ 0,009 -0,046 -0,198 -0,087 -0,076 0,033 -0,113 0,231* -0,048 0,033 0,055

TBX21+ (TBET) -0,034 0,097 0,041 -0,071 0,044 0,097 -0,080 -0,270* 0,129 0,223 -0,060

MAF+ 0,019 0,203 0,137 0,029 -0,034 0,324** 0,260* -0,318** 0,060 0,025 0,208

CD14+ 0,003 0,092 -0,008 -0,090 -0,021 0,271 0,034 -0,042 0,297* 0,308** -0,047

CD68+ -0,027 -0,029 -0,074 -0,032 -0,175 0,179 0,014 0,154 0,462** 0,329** 0,300**

CD163+ -0,01 0,219 0,155 0,031 0,024 0,403** -0,021 0,033 0,295** 0,300** 0,358**

CD20+ 0,114 0,120 0,150 0,179 -0,008 0,138 0,154 0,060 -0,170 0,044 0,257*

Eosinófilos -0,400** -0,376** -0,275* -0,265* -0,208 -0,353** -0,329** 0,047 -0,306** -0,343** -0,517**

Ki67+ 0,079 0,350** 0,190 0,108 0,261* 0,220 0,048 -0,133 0,110 0,231* 0,146

CASP3+ 0,353** 0,089 0,040 0,181 0,236 0,018 0,211 0,008 0,058 0,173 0,423**

* P< 0,005: ** P< 0,001. Valores P obtidos através da correlação de Spearman. Na tabela estão representados os valores de R2 (positivos: correlação direta entre as quantificações; negativos: correlação inversa entre as quantificações). IHQ: imunohistoquímica.

78

4.2.7 Relação entre apoptose e proliferação no microambiente tumoral

Visando obter informações sobre a proliferação e morte celular das células do MAT,

marcações por IHQ para Ki67 e CASP3 respectivamente, foram realizadas e as células no

MAT expressando estes marcadores foram contadas.

O número de linfócitos intratumorais expressando o marcador de proliferação Ki67+

variou entre 3 e 352 (mediana 91 células Ki67+/mm2), enquanto que o número de linfócitos

com compromisso CASP3+ variou entre 41 e 864 (mediana 397 células CASP3+/mm2). Em

termos gerais, não houve correlação entre os números de linfócitos em proliferação e

apoptose.

Uma vez que duplas marcações não foram ainda realizadas para identificar as

populações responsáveis por estes números, foram realizados testes de correlação, os quais

mostraram que a quantidade de linfócitos CASP3+ teve uma forte correlação positiva com o

número de linfócitos T (CD3+) especialmente T CD8+, assim como com linfócitos B

(CD20+). Monócitos (CD14+), linfócitos T citotóxicos (CD8+ e GRZB+), Th1 (TBX21+)

mostraram correlação positiva com o marcador de proliferação. Todas estas correlações

tiveram um valor de significação P< 0,01 (Anexo IV: Tabela S5)

Referente à expressão gênica, foi encontrada uma correlação entre alto número de

linfócitos CASP3+ no microambiente com altos níveis de expressão de RNAm de CENPF e

IRF4; no mesmo sentido, houve correlação do número de linfócitos Ki67+ com a expressão

de CDK1 (Tabela 4.7).

Seguidamente, os níveis de expressão gênica foram comparados, utilizando como

valor de corte a mediana de células expressando Ki67+ no microambiente (91 células/mm2).

Um alto índice proliferativo no microambiente foi associado com uma maior expressão de

STAT1 (P=0,007), CDK1 (P<0,001), CASP3 (P=0,039) e HMMR (P=0,010) (teste de Mann-

Whitney). Por outro lado, um maior número de linfócitos CASP3+ (valor de corte, mediana

397 células/mm2) foi associado a um aumento de RNAm de CENPF (P=0,042), HMMR

(P=0,047) e IRF4 (P=0,009) (teste de Mann-Whitney) (Fig. 4.19).

79

Fig. 4.19: Padrão de expressão gênica segundo a expressão de marcadores de proliferação e apoptose no microambiente celular. A: gráficos de Box plot em relação à mediana de expressão da proteína CASP3+ no microambiente; B: gráficos de Box plot de expressão genes do ciclo celular em relação à mediana da proteína Ki67+; C: gráficos de Box plot de expressão gênica de STAT1 em relação à mediana da proteína Ki67+. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Expressão em valores de 2-∆Cq; *: diferença estatisticamente significativa (P<0,05); **: diferença estatisticamente significativa (P<0,01). O P-valor foi calculado mediante o teste Mann-Whitney.

Após serem avaliados os marcadores Ki67+ e CASP3+ de maneira independente, os

casos foram agrupados em relação ao valor da mediana do apoptose e proliferação em

conjunto em uma das quatro categorias seguintes: 1) maior número de células em apoptose

junto com um aumento de células em proliferação (>CASP3+/>Ki67+) (19 casos); 2) um

aumento de células em apoptose acompanhado de poucas células em proliferação

(>CASP3+/<Ki67+) (9 casos); 3) diminuição de células em apoptose combinado com maior

número de células proliferando (<CASP3+/>Ki67+) (14 casos) e; 4) número reduzido de

células em apoptose e em proliferação (<CASP3+/<Ki67+) (15 casos). A distribuição das

80

subpopulações celulares no microambiente de acordo com essas 4 categorias foi analisada

pelo método de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. Resultados significativos foram

encontrados para os linfócitos CD3+ (P= 0,023); CD8+ (P= 0,041); GRZB+ (P= 0,003);

TBX21+ (P= 0,005); CD20+ (P= 0,009). Como mostrado na Fig. 4.20 A, o comportamento

das subpopulações T CD8+ e B foi contrastante; enquanto que a população CD20+ aumenta

na presença de altos números de células CASP3+ independente de Ki67+, a população CD8+

aumenta concomitantemente ao marcador de proliferação. As células citotóxicas (GRZB+) e

Th1 (TBX21+) refletem em geral o comportamento da população CD8+ (Fig. 4.20 B). No que

concerne à expressão gênica, diferenças foram encontradas nos genes CDK1 (P= 0,042) e

HMMR (P= 0,012).

Fig. 4.20: Padrões de associação entre marcadores de proliferação e apoptose no microambiente tumoral do linfoma de Hodgkin clássico pediátrico. A e B: gráficos de Box plot tendo como fatores os grupos >CASP3+/>Ki67+ (N=19); >CASP3+/<Ki67+ (N=9); <CASP3+/>Ki67+ (N=14) e <CASP3+/<Ki67+ (N=15), categorizados de acordo à mediana. A: linfócitos T CD8+ e linfócitos B; B: Linfócitos citotóxicos (GRZB+) e Th1 (TBX21+). As diferenças entre as categorias foram significativas (P< 0,05 para CD8+ e P< 0,01 para as demais subpopulações utilizando o teste de Kruskal-Wallis). A comparação das variáveis em pares foi feita com o teste de Mann-Whitney. *: diferença estatisticamente significativa (P<0,05); **: diferença estatisticamente significativa (P<0,01).

4.2.8 Associação dos níveis de expressão gênica com a presença do vírus Epstein-

Barr

Dos 11 genes avaliados, os casos EBV+ apresentaram um maior nível de expressão

nos genes LYZ e STAT1, característicos da ativação de macrófagos, quando comparados aos

casos EBV-. Quanto à expressão de LYZ, os casos EBV+ apresentaram uma média de

81

expressão relativa de 3,29 + 1,43 vs. EBV- com 2,57 + 1,63 (P= 0,031, teste de Mann-

Whitney). Quanto à expressão de STAT1, os casos EBV+ mostraram uma media de 2,72 +

0,94, frente aos casos EBV- com valores médios de 2,10 + 1,10 (P-valor: 0,021) (Fig. 4.21).

Estes resultados estão de acordo com o observado a nível celular, em que a presença

do EBV foi associada a um maior número de células CD14+ (P<0,001), CD68+ (P=0,003) e

CD163+ (P=0,013) (teste de Mann-Whitney).

Fig. 4.21: Padrão de expressão dos genes LYZ e STAT1 segundo o status do vírus Epstein-Barr em pacientes com linfoma Hodgkin clássico pediátrico. A barra dentro da caixa representa a mediana de expressão de cada gene, os limites da caixa à dispersão dos valores entre os quartis 25 e 75 e os extremos do gráfico os valores mínimo e máximo do conjunto de dados. Expressão em valores de 2-∆Cq; EBV: vírus Epstein-Barr; +: presença do EBV; - : ausência do EBV; *: diferença estatisticamente significativa. O P-valor foi calculado mediante o teste Mann-Whitney.

4.2.9 Expressão gênica associada ao prognóstico nos pacientes com linfoma de

Hodgkin clássico pediátricos

Análises foram realizadas na procura de um valor prognóstico relacionado com a SG e

SLP avaliada em um acompanhamento médio de 60 meses. Para análises da SLP, 78

pacientes foram avaliados, com uma sobrevida de 76,9%; enquanto que para as análises da

SG, 81 pacientes tiveram dados disponíveis, com uma sobrevida de 88,5%.

Em relação ao status do EBV, foi encontrada uma pior SG para os casos EBV

negativos (80,4%) quando comparados aos EBV positivos (96,9%) (p= 0,059), enquanto que

para a SLP foi observada uma tendência a um pior prognóstico na ausência do EBV (68,9%)

82

comparada com a presença do vírus (87,1%) (P=0,083). Não houve sobrevida

significativamente diferente por grupo de risco da doença.

Para categorizar o grupo de pacientes segundo o nível da expressão gênica em alta e

baixa expressão, o valor da mediana do grupo foi estabelecido como ponto de corte. Na

Tabela 4.8 são mostrados os valores em média + DP e mediana da expressão gênica para os

grupos que mostraram recaída vs. não recaída. As análises de sobrevida para cada um dos

genes avaliados são apresentadas na Tabela 4.9.

83

Tabela 4.8: Valores de expressão gênica para os grupos de recaída vs. não recaída.

RECAIDA NÃO RECAIDA DIFERENÇA#

GENE MEDIA + DP MEDIANA IC 95% MEDIA + DP MEDIANA IC 95% MEDIA

BCL2 -2,564 + 1,216 -2,343 - (3,189 – 1,939) -2,960 + 2,328 -2,388 - (3,562 – 2,359) 0,306

BCL2L1 1,107 + 0,625 1,327 0,786 – 1,428 1,095 + 0,586 1,108 0,943 – 1,246 0,012

CASP3 -4,897 + 2,138 -4,076 - (5,996 – 3,798) -5,675 + 2,679 -4,852 - (6,368 – 4,983) 0,778

CCNA2 -5,627 + 2,365 -5,009 - (6,843 – 4,411) -6,420 + 2,983 -5,629 - (7,191 – 5,649) 0,793

CCNE2 -5,019 + 3,551 -3,604 - (6,845 – 3,193) -5,813 + 3,621 -4,320 - (6,748 – 4,877) 0,794

CDK1 -5,342 + 2,836 -4,397 - (6,801 – 3,884) -6,502 + 3,630 -4,865 - (7,440 – 5,564) 1,160

CENPF -2,940 + 3,09 -2,140 - (4,530 – 1,351) -3,539 + 2,581 -2,492 - (4,206 – 2,872) 0,599

HMMR -4,536 + 0,827 -4,487 - (4,962 – 4,111) -5,805 + 2,840 -5,041 - (6,539 – 5,071) 1,269

IRF4 0,700 + 1,211 1,083 0,077 – 1,323 0,227 + 1,924 0,492 - 0,270 – 0,724 0,473

LYZ 2,664 + 1,005 2,391 2,148 – 3,181 2,859 + 1,700 3,187 2,420 – 3,298 0,195

STAT1 2,557 + 1,083 2,698 2,000 – 3,113 2,223 + 1,094 2,316 1,941 – 2,506 0,334

Os resultados são mostrados em valores fold change (2-∆Cq) para cada um dos 11 genes avaliados. Diferença#: representa a diferença entre médias do grupo recaído - não recaídos, em valores absolutos. IC 95%: intervalo de confiança 95%.

84

Tabela 4.9: Análise de sobrevida livre de progressão (SLP) e global (SG) em relação à expressão gênica no grupo de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátricos.

Variável Expressão

gênica Casos

analisados SLP (%)

Análises univar.

Casos analisados

SG (%)

Análises univar.

BCL2 (Faixa) Média/Mediana > -2,46 < -2,46 BCL2L1 (Faixa) Média/Mediana > 1,11 < 1,11 CASP3 (Faixa) Média/Mediana > -4,47 < -4,47 CCNA2 (Faixa) Média/Mediana > -5,40 < -5,40 CCNE2 (Faixa) Média/Mediana > -3,97 < -3,97 CDC2 (Faixa) Média/Mediana > -4,75 < -4,75 CENPF (Faixa) Média/Mediana > -2,78 < -2,78 HMMR (Faixa) Média/Mediana > -4,83 < -4,83 IRF4 (Faixa) Média/Mediana > 0,54 < 0,54 LYZ (Faixa) Média/Mediana > 3,17 < 3,17 STAT1 (Faixa) Média/Mediana > 2,51 < 2,51

-12,50-(- 0,60) -2,90/-2,46

-0,29-2,82 1,10/1,11

-13,39-(-2,47) -5,40/-4,47

-14,13-(-1,38) -6,11/-5,40

-15,27-(-0,24) -5,47/-3,97

-14,82-(-1,76) -6,13/-4,75

-14,13-0,00 -3,42/-2,78

-13,51-(-2,31) -5,43/-4,83

-10,70-2,40 0,34/0,54

-2,71-6,03 2,86/3,17

-0,58-4,65 2,32/2,51

43/78 35/78

42/78 36/78

38/77 39/77

40/78 38/78

39/78 39/78

38/78 40/78

41/78 37/78

37/78 41/78

40/78 38/78

38/78 40/78

38/78 40/78

76,7% 77,1%

73,8% 80,6%

68,4% 87,2%

72,5% 81,6%

71,8% 82,1%

73,7% 80,0%

70,7% 83,8%

70,3% 82,9%

72,5% 81,6%

84,2% 70,0%

76,3% 77,5%

P= 0,921

P= 0,440

P= 0,044

P= 0,358

P= 0,281

P= 0,471

P= 0,238

P= 0,187

P= 0,465

P= 0,129

P= 0,859

43/81 38/81

43/81 38/81

41/80 39/80

42/81 39/81

40/81 41/81

40/81 41/81

42/81 39/81

40/81 41/81

42/81 39/81

40/81 41/81

40/81 41/81

93,0% 81,6%

83,7% 92,1%

82,9% 92,3%

90,5% 84,6%

85,0% 90,2%

87,5% 87,8%

85,7% 89,7%

82,5% 92,7%

88,1% 87,2%

92,5% 82,9%

85,0% 90,2%

P= 0,197

P= 0,422

P= 0,107

P= 0,591

P= 0,480

P= 0,865

P= 0,816

P= 0,134

P= 0,809

P= 0,226

P= 0,498

Análises univar: análises univariadas; SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global. A distribuição das sobrevidas foi calculada utilizando o método de Kaplan-Meier e a significação das comparações usando o teste de log-rank.

85

Nas análises da SLP para o grupo inteiro, alta expressão de CASP3 esteve associada a

um pior prognóstico (68,4%) comparado com os casos que mostraram baixa expressão

(87,2%) (P< 0,05, teste de log-rank) (Fig. 4.22). Por outro lado, não foi encontrada

associação da expressão gênica do resto dos genes avaliados com a SLP. Em relação à SG,

não foi identificado qualquer impacto da expressão dos genes na sobrevida.

Fig. 4.22: Sobrevida livre de progressão no linfoma de Hodgkin clássico pediátrico em relação à expressão gênica de CASP3. Verde: pacientes com baixa expressão de CASP3; azul: pacientes com alta expressão de CASP3. O P-valor foi calculado utilizando o método Kaplan-Meier usando o teste de log-rank.

As análises de SLP foram então conduzidas para os grupos estratificados segundo o

status do EBV. Foi observado que no grupo EBV negativo (46 pacientes avaliados), alta

expressão de CASP3 foi associada a pior prognóstico (54,5%) frente ao grupo com baixa

expressão (84,6%) (P= 0,012). Por outro lado, uma tendência na diminuição da SLP, foi

observada nos casos com alta expressão de CDK1 (57,1%) vs. baixa expressão (80,8%) (P=

0,066), assim como nos casos com alta expressão de HMMR (59,1%) vs. baixa expressão

(80,0%) (P=0,082) (Fig. 4.23). No grupo de pacientes EBV positivos, não foram observadas

diferenças significativas na sobrevida.

86

Fig. 4.23: Sobrevida livre de progressão (SLP) no grupo de linfomas de Hodgkin clássico pediátrico EBV-. A e B: curvas de Kaplan-Meier; A: sobrevida livre de progressão associada ao nível de expressão de CASP3; B: sobrevida livre de progressão associada ao nível de expressão de CDK1. Verde: pacientes com baixa expressão; azul: pacientes com alta expressão. O P-valor foi calculado utilizando o teste de log-rank.

Em termos gerais, não foram observadas diferenças significativas nas análises de SG

para o grupo estratificado segundo o status do EBV.

As análises de SLP foram realizadas estratificando o grupo de pacientes segundo o

risco da doença. Para o grupo de alto risco formado por 38 pacientes, foi observada uma

tendência a um melhor prognóstico nos pacientes com alta expressão de LYZ (93,3%) vs.

aqueles com baixa expressão (65,2%) (P= 0,052). De maneira contrária, um aumento da

expressão de CASP3 (alta expressão 66,7% vs. baixa expressão 93,8%, P=0,050) apresentou

uma tendência a um pior prognóstico (Fig. 4.24). Não foram observadas diferenças

significativas na SG no grupo estratificado para o risco da doença.

87

Fig. 4.24: Sobrevida livre de progressão (SLP) no grupo de alto risco de linfoma de Hodgkin clássico pediátrico. A e B: Distribuição da SLP de acordo ao método de Kaplan-Meier; A: SLP de acordo ao nível de expressão de LYZ; B: SLP de acordo ao nível de expressão de CASP3. Verde: pacientes com baixa expressão; azul: pacientes com alta expressão. O p-valor foi calculado utilizando o teste de log-rank.

Análises de regressão de Cox foram realizadas para verificar o impacto independente

do nível de expressão de CASP3 na SLP, incluindo genes com significação menor que P=0,2.

Como mostrado na Tabela 4.10, o valor prognóstico de CASP3 foi mantido (HR 3,31; IC 95%

1,14 - 9,6; P=0,027); inclusive para o grupo estratificado para o EBV (HR 3,260; IC 95%

1,12 - 9,48; P= 0,030); e segundo o risco da doença (HR 3,158, IC 95% 1,05-9,49; P=0,040).

Tabela 4.10: Regressão de Cox das variáveis de expressão gênica que influenciaram a sobrevida livre de progressão em pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátricos. Intervalo de confiança (95%) Variável HR (β) P- valor Inferior Superior

Grupo total

LYZ 0,41 0,085 0,15 1,13 HMMR 2,14 0,135 0,79 5,80 CASP3 3,31 0,027 1,14 9,60

HR: razão de chance (do inglês, hazard ratio); HR estimado em relação ao grupo de baixa expressão.

O valor independente de CASP3 na SLP não se manteve após regressão de Cox em

relação aos dois fatores prognóstico previamente identificados (doença extranodal e linfócitos

CD8+ GRZB+ (BARROS et al., 2012) (CASP3 HR 2,94; P=0,067; extranodal HR 3,250; P=

0,076 e GRZB+ HR 3,73; P=0,089).

88

5 DISCUSSÃO

Durante os últimos anos, os estudos de expressão gênica tomaram relevância no

diagnóstico e na pesquisa biomédica, e uma ênfase cada vez maior vem sendo colocada na

necessidade de controle das etapas pré-analiticas e analíticas, desde a obtenção de material

genético de qualidade, até o controle de qualidade dos resultados, visando o desenvolvimento

de metodologias que possam capturar com precisão a complexidade dos sistemas biológicos e

que possam ser aplicadas com resultados reprodutíveis. Este trabalho foi desenvolvido em

duas partes: 1) aperfeiçoamento de uma metodologia eficiente para extração de RNA a partir

de material FFPE, e aplicação de um desenho experimental para conhecer as variabilidades

introduzidas, tanto biológicas (inerentes à diversidade de indivíduos e doença), como a

técnica para seu uso nas análises de expressão gênica e; 2) a aplicação da metodologia

anteriormente desenvolvida em um grupo de pacientes, visando validar um conjunto de genes

associados a um pior prognóstico descrito em pacientes adultos com LHc.

5.1 Aperfeiçoamento de uma técnica de extração de RNA a partir de material

parafinado para estudos de expressão gênica por RT-qPCR

Neste trabalho é mostrada a importância de selecionar cuidadosamente o método de

extração de RNA quando se trabalha com ácidos nucleicos de baixa qualidade. Diferentes

fatores podem afetar a qualidade e quantidade de RNA extraído, como por exemplo,

qualidade e tempo dos processos de fixação e antiguidade do bloco de parafina (MASUDA et

al., 1999; SRINIVASAN; SEDMAK; JEWELL, 2002; CRONIN et al., 2004). Dos dois

métodos comerciais comparados neste estudo, o método baseado na precipitação (MP)

superou em rendimento ao método baseado em purificação através de colunas (RA),

basicamente pelo rendimento estável do primeiro, independente da antiguidade dos blocos de

parafina. Diferentes trabalhos vêm mostrando um alto rendimento com o uso do método RA

aplicado ao material FFPE, que é de fato, o mais amplamente usado na literatura

(DOLESHAL et al., 2008; LI et al., 2008; ROBERTS et al., 2009; OKELLO et al., 2010).

ARZT et al. (2011) reportam alta qualidade na relação dos ácidos nucleicos/proteínas

(λ260/280), similares aos resultados obtidos neste trabalho. Entretanto, nenhum dos trabalhos

prévios compara a utilização dos métodos e seu desempenho em relação à qualidade e

antiguidade das amostras. Desta maneira, nós contribuímos com a observação de que o

método MP tem um melhor desempenho e é mais estável quando se pretende estudar uma

89

série de amostras obtidas ao longo do tempo, em que os métodos de fixação e o uso de

formalina tamponada podem ter variado.

Um segundo motivo que estimulou este trabalho é a característica da extrema

complexidade do LHc, em que se observam não somente diferentes subtipos histológicos,

com suas particulares relações entre quantidade de fibrose e células H-RS (SWERDLOW et

al., 2008), mas também a grande variabilidade interindividual na composição da massa

tumoral em relação às células inflamatórias (linfócitos T, linfócitos B, macrófagos, entre

outras). Esta grande variabilidade biológica é a causa da falta de reprodutibilidade de padrões

na expressão gênica global entre diferentes estudos (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2009;

SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010; STEIDL et al., 2012), e afeta diretamente o poder

estatístico para detectar diferenças no prognóstico clínico. Assim, uma diferença real nos

níveis de expressão gênica associados à doença somente poderia ser percebida se estes níveis

forem superiores à variabilidade introduzida durante o processamento técnico e à

heterogeneidade biológica de base da doença.

TICHOPAD et al. (2009) abordaram o problema da variabilidade nos estudos de

expressão gênica e conseguiram mostrar experimentalmente que a variabilidade biológica é

maior nos tecidos sólidos (fígado bovino, com ruído total: + 1,4 desvio padrão médio, DP),

que no sangue periférico (+ 0,6 DP médio), que nas linhagens celulares (+ 0,44 DP médio).

Do ponto de vista da variabilidade técnica nos tecidos sólidos, esta é incluída

predominantemente nas etapas de RT, sendo que também há um componente gene-específico.

O estudo da expressão de células simples foi o que mostrou maior variabilidade (+ 2 DP

médio), em acordo com um modelo proposto de distribuição de Poisson, em comparação com

uma distribuição normal da variação na expressão gênica nos outros tecidos (AUDIC;

CLAVERIE, 1997).

Sendo assim, esta abordagem seria adequada para responder as nossas perguntas sobre

o impacto da variabilidade no LHc e não tinha, até o momento, sido aplicada na avaliação de

extrações de RNA de parafina. Neste estudo, o desenho ANOVA tipo nested foi expandido e

adaptado para sua aplicação em amostras de RNA FFPE em LHc usando seis níveis, pela

incorporação de mais um nível biológico (diferenças entre linfonodos de um mesmo paciente)

e mais um nível técnico (pré-Amp).

90

A primeira análise foi realizada considerando os valores Cq e sua variabilidade

expressa em DP, a efeitos de comparação com os resultados previamente descritos

(TICHOPAD et al., 2009). O valor do ruído total capturado pelos genes de referência (GDR)

usados neste trabalho (GUSB e HMBS) foi similar e menor ao descrito pelos autores para

ACTB em tecidos sólidos frescos (fígado) (média dos DP, 23,55 Cq + 1,45 ciclos neste

trabalho vs. 20,41 +1,63 para ACTB em TICHOPAD et al. (2009). A escolha dos GDR para

este trabalho foi guiada por um trabalho prévio que mostrou uma maior estabilidade destes no

LHc (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2009), e os nossos resultados com uma abordagem

diferente confirmam a sua adequação como GDR nesta doença.

Em relação aos genes de interesse (GDI) avaliados, STAT1, IRF4, BCL2 e CASP3

mostraram ruídos totais entre + (1,17 - 1,68) ciclos (DP), média + 1,57 ciclos, o que foi

similar ao publicado previamente para tecidos a fresco (1,0 a 1,7 DP, média + 1,3), indicando

que a utilização de RNA de parafina não acarreta em uma variabilidade adicional intolerável

para estudos com sentido biológico. Uma comparação entre RNAs extraídos de linfonodos

FFPE e “frescos”, que não foi feita neste trabalho, permitiria confirmar esta afirmação.

Entretanto, visto a complexidade do LHc, parece improvável que a variabilidade dos

linfonodos a fresco seja significativamente menor que a relatada para o fígado no trabalho

tomado como referência.

Em relação à distribuição da variabilidade biológica, houve diferenças entre os dois

estudos, sendo que a variabilidade biológica em nosso estudo, integrada pelas diferenças entre

casos (N=3) e linfonodos dentro de casos (N=3x2) deu conta de entre 83,8% e 96,0% da

variabilidade observada, com contribuição mínima do linfonodo. No estudo de TICHOPAD et

al. (2009), a variabilidade entre indivíduos foi desprezível, enquanto que a etapa que eles

chamaram de “amostragem” (3 biopsias por cada fígado), teve variabilidade entre 35,0% e

94,0%. Isto faz sentido, na medida em que os indivíduos do estudo relatado eram mais

homogêneos (gado) em comparação aos humanos estudados no presente trabalho. Mais ainda,

aponta para a manutenção das características tumorais nos diferentes linfonodos acometidos

pela doença, minimizando então o efeito de “amostragem” na seleção entre linfonodos para

estudo.

Quanto à variabilidade técnica, os nossos valores foram superiores aos relatados no

estudo de referência (média + 0,86 vs. + 0,67 DP), o que é justificável se se tem em conta que

o desenho para parafina incluiu 4 níveis de processamento técnico vs. somente 2 (RT e qPCR)

91

no trabalho de referência, porém o nosso gene de maior variabilidade técnica teve níveis

comparáveis com os do gene com maior variabilidade do referido estudo (CASP3 vs. FGF7, +

1,23 e + 1,29 DP, respectivamente).

Diferentes estudos têm mostrado a importância do uso de valores normalizados em

estudos de expressão gênica por qPCR (VANDESOMPELE et al., 2002; BUSTIN et al.,

2009), o que corresponde no nosso trabalho ao cálculo de ∆Cq. Entretanto, não é claro qual é

o melhor valor para descrever a distribuição de variabilidade num ensaio ANOVA tipo

nested. É intuitivo pensar que a utilização de ∆Cq, no qual a expressão do GDI referencia-se

ao nível de RNAm incluído na reação, levaria a uma redução da variância. No entanto, uma

inspeção das ferramentas estatísticas usadas no cálculo permite ver que este não é sempre o

caso. O DP do ∆Cq é calculado como a razão entre: (raiz quadrada) da somatória das

variâncias de alvo (GDI) e endógeno (GDR) e a covariância dos Cqs do GDI e GDR. A

covariância é a medida de como as variações em cada nível afetam o GDI e GDR em

conjunto. Se a variação sempre afeta ambos os genes no mesmo sentido, então a covariância é

alta e o DP do ∆Cq será menor. Se a covariância é menor que a soma das variações de GOI e

GDI, então a normalização vai realmente aumentar o ruído. Se o processamento afeta a ambos

os genes de maneira diferente ou independente, a normalização não tem sentido e pode até

afetar a qualidade dos dados (TICHOPAD et al., 2009).

Em nosso estudo foi observado que, após normalização, a variabilidade total diminui

com valores em todos os genes avaliados no desenho ANOVA tipo nested. Isto está em

contraste com o mostrado em outro estudo, no qual os genes de baixa expressão não se

beneficiaram da normalização (KITCHEN et al., 2010), sugerindo que a fonte do material

genético (parafina vs. fresco) seja mais importante que o nível de expressão gênica na

normalização.

De maneira importante, a variação na etapa de extração de RNA foi reduzida após a

normalização, indicando que as diferenças significativas encontradas na análise do Cq

obedeceram a diferenças na quantidade de RNA inicial. Tendo em conta que a mesma

quantidade de RNA foi incluída em todas as reações, é possível que as diferenças sejam

devidas à presença de DNA que aumentou artificialmente a densidade óptica a 260nm, e que

nas amostras de RNA provenientes de parafina, a contaminação com DNA de baixo peso

molecular seja mais difícil de eliminar com tratamentos de DNase I. Em contraste, a

variabilidade da pré-Amp não diminuiu significativamente com a normalização, indicando

92

que, para diminuir a variabilidade nesta etapa, seriam necessárias modificações nas condições

técnicas de processamento. Em conclusão, os resultados das comparações feitas neste trabalho

indicam o uso do ∆Cq para avaliar os dados de um ensaio ANOVA tipo nested em RNA de

parafina.

Daqui em diante, serão discutidas algumas características observadas no ensaio

ANOVA tipo nested utilizando os valores de ∆Cq. TICHOPAD et al. (2009) descreve que a

variabilidade introduzida numa metodologia pode variar de acordo ao nível de expressão

gênica, sendo esta variação dependente de cada gene em particular. Neste trabalho, nós

estendemos esta descrição a um maior número de genes. Quando classificados segundo o

nível de expressão gênica, foi observado que genes de alta expressão apresentaram menores

valores de ruído total (exceto LYZ), comparado com os genes de intermediaria e baixa

expressão. O gene CASP3 foi o que apresentou a maior variabilidade técnica total dentre os

genes estudados. Vários motivos podem ser apontados, em primeiro lugar, as conhecidas

limitações do método de quantificação para baixos níveis, decorrentes da perda de linearidade

(PFAFFL, M. W.; HAGELEIT, 2001). Além disso, esta situação faz com que o viés

introduzido pela presença de inibidores seja amplificado. Os níveis técnicos superiores (RNA

e RT) são muito sensíveis à inibição, seja pela própria enzima transcriptase reversa

(SUSLOV; STEINDLER, 2005), como por inibidores co-extraídos com o RNA (BAR et al.,

2003). Este efeito não é bem capturado pela análise de ANOVA, uma vez que o erro

estatístico não se propaga de maneira linear para os níveis inferiores do modelo hierárquico.

Poderia ser especulado que CASP3, como gene de baixa expressão, sofra diferencialmente o

efeito técnico nestes níveis.

No extremo oposto tanto no nível de expressão como na contribuição da variabilidade,

encontra-se o gene LYZ. Este gene, o de maior expressão, apresentou uma variabilidade muito

elevada, com DP de + 2,37 ciclos (Cq), compatível com o relatado para single cells. Esta

variabilidade persistiu mesmo após normalização, com ruído total de + 1,02 DP, que

representa uma variabilidade de ~2 vezes (fold change) de caso a caso. Como a variabilidade

é majoritariamente biológica, ou seja, subjacente ao processamento técnico, o emprego deste

conjunto iniciador/sonda para quantificar o gene LYZ com propósitos diagnósticos ou de

estratificação de risco não seria recomendável. O comportamento particular do gene LYZ

neste estudo mostra características próprias que não são explicáveis pelas condições do

ensaio.

93

A pré-Amp é uma estratégia utilizada para obter uma melhor amplificação de RNAm

a partir de tecidos FFPE, incrementando a sensibilidade na quantificação de genes de baixa

expressão (DENNING et al., 2007; LI et al., 2008; NOUTSIAS et al., 2008). Os trabalhos

que utilizam esta metodologia não avaliam a variabilidade introduzida nesta etapa, ou o fazem

com ensaios de baixo poder estatístico (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010). No mesmo

sentido, as descrições do fabricante são assertivas sobre a reprodutibilidade desta metodologia

(APPLIED, 2007). A variabilidade introduzida no nível de pré-Amp foi significativa para os

sete genes avaliados durante o ensaio ANOVA tipo nested, e persistiu após normalização.

Esta etapa foi eficiente para melhorar os valores de Cq, e, em alguns casos, amostras que

poderiam ser consideradas não amplificáveis (Cq > 35), foram recuperas pela aplicação desta

técnica. Isto foi logrado às custas de introduzir maior quantidade de variabilidade técnica.

Esta poderia ser causada pela presença de inibidores que diminuem a eficiência a

retrotranscrição refletindo na variabilidade.

Referente às duplicatas de qPCR, foi observado que em todos os genes avaliados

apresentaram uma variação menor de DP< + 0,15 ciclos (incluindo o gene de baixa

expressão), similar ao relatado na literatura e recomendado pelas abordagens atuais de

quantificação (STAHLBERG et al., 2004; TICHOPAD et al., 2009). De fato, para os ensaios

posteriores foi estabelecido um valor de DP <+ 0,15 ciclos como limite aceitável das

duplicatas das reações de qPCR.

Um conjunto de abordagens novas tem sido descritas, que aplicam algoritmos

matemáticos para estudar as cinéticas das curvas de qPCR, evitando assim o estabelecimento

de um limiar e o uso da curva de eficiência (ZHAO; FERNALD, 2005; GUESCINI et al.,

2008; RUIJTER et al., 2009; BOGGY; WOOLF, 2010; BAR et al., 2012; RUIJTER et al.,

2013). Durante o desenho ANOVA tipo nested foi proposto aplicar o método Cy0, com o

intuito de comparar ambas as abordagens. Em primeiro lugar, as analises comparativas entre

Cq e Cy0 confirmaram que o primeiro método subestima a expressão gênica (PFAFFL, M.

W., 2004; BAR et al., 2012; RUIJTER et al., 2013), sendo a expressão quantificada pelo

método Cy0 significativamente de maior magnitude. Além disso, esta abordagem permitiu

diminuir, mesmo que levemente, a variabilidade de LYZ e CASP3 (GUESCINI et al., 2008),

nos níveis biológicos e técnicos. É possível que a alta variabilidade nestes genes tenha sido

devida a um efeito diferencial de inibidores, que sabidamente apresentam um maior efeito nos

níveis superiores comparados com os níveis inferiores da metodologia, onde o efeito de

94

diluição reduz a quantidade de inibição em cada etapa pelos processos de diluição (BAR et

al., 2012). Comparações mais extensas do desempenho de ambos os métodos e aplicação para

um grupo maior de amostras encontram-se em curso.

Visto que as análises de expressão gênica a partir de material FFPE são cada vez mais

frequentes, e que são sistematicamente afetadas pela presença de inibidores, os novos

métodos de quantificação mediante a cinética da curva podem ser uma alternativa mais

eficiente, entretanto, comparações que mostrem superioridade significativa são necessárias,

dada a relativa dificuldade do cálculo, que requer a manipulação de valores crus de

fluorescência e aplicação do algoritmo específico, antes do pré-processamento rotineiro dos

valores de quantificação. Até o momento, não existem estudos na literatura utilizando a

metodologia do Cy0 em amostras FFPE, e sua avaliação mediante o desenho ANOVA tipo

nested poderá contribuir com informação relevante.

Que modificações podem ser propostas a partir da experiência realizada com o LHc, e

que possam ser aplicadas a qualquer processo envolvendo extração de RNA e quantificação

da expressão gênica a partir de linfonodos FFPE?

Em primeiro lugar, o incremento na concentração e tempo de digestão da Proteinase K

foi considerado a modificação mais importante para melhorar a quantidade de RNA para

ambos os métodos. Isto foi previamente relatado (CHEN et al., 2007), sugerindo que os

protocolos de extração de RNA a partir de amostras de parafina podem ser beneficiados com

esta mudança.

Em relação aos fatores que afetam a amplificação do RNA, foi observado que há um

efeito associado à peça patológica (bloco de parafina) e não ao tumor em si, indicando que

defeitos na fixação ou processamento do bloco são irreversíveis, requerendo a utilização de

novo material. Isto foi anteriormente relatado para DNA obtido de material FFPE

(STEFANOFF et al., 2003), e é um fenômeno bem conhecido na prática do diagnóstico

patológico: quando uma amostra apresenta defeitos de fixação, o diagnóstico se vê

prejudicado, desde a observação microscópica até a biologia molecular.

Visto que a etapa de pré-Amp foi a que sistematicamente introduziu variabilidade

técnica, foram realizadas modificações na metodologia. As alterações que visaram concentrar

o produto para diminuir o efeito randômico em genes de baixa expressão (diminuição da

95

diluição final e aumento do número de ciclos usados na pré-Amp), resultaram em um

incremento ou manutenção da variabilidade na etapa de pré-Amp.

Com a ideia de que a variabilidade poderia ser causada nas etapas anteriores, a

quantidade de RNA colocada na etapa de RT foi diminuída para desta maneira atenuar o

efeito de possíveis inibidores. Observamos então que a variabilidade introduzida na pré-Amp

diminuiu (porém manteve-se significativa) e que esta poderia ser causada pela propagação de

variabilidade das etapas superiores. O resultado dos experimentos indicou a vantagem de se

utilizar menor quantidade de RNA para as próximas etapas. Outros experimentos estão em

curso para melhorar o desempenho desta importante etapa do processamento de amostras

FFPE.

Em suma, diferentes fontes de variabilidade foram identificadas neste trabalho nas

amostras trabalhadas: (i) a presença de uma marcada heterogeneidade biológica causada por

cada condição individual (paciente); (ii) a variabilidade técnica inerente a cada etapa, com

ênfase na etapa de RT e pré-Amp; (iii) a presença de sustâncias inibidoras que interferem de

maneira não linear e; (iv) variações inerentes às reações de PCR que são especificas de cada

gene e que ainda são desconhecidas.

A conclusão geral desta parte do trabalho é que o conhecimento das variabilidades

biológicas e técnicas que resultam da complexidade dos sistemas biológicos ou que são

introduzidas durante as etapas do processamento técnico é essencial para um desenho

experimental apropriado toda vez que a detecção de uma diferença de expressão gênica é o

objetivo principal do estudo.

5.2 Validação de perfis de expressão gênica em um grupo de pacientes com linfoma

de Hodgkin clássico

Neste trabalho, foi avaliada a expressão de 11 genes previamente identificados como

fator prognóstico no LHc avançado de adultos (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010). O

conjunto de genes foi avaliado em um grupo de 84 crianças com LHc, que assim serviria

como coorte de validação independente, visando determinar a aplicabilidade desse escore

prognóstico nas crianças com esta doença. No LHc, nesse grupo etário há uma grande

necessidade de biomarcadores para estratificação das terapias, visto que mesmo o escore

clínico internacional (IPS) amplamente usado em adultos não e aplicável nas crianças. O

96

tratamento do LHc é considerada um balanço de riscos entre a recaída, se o tratamento não for

o suficientemente intenso, e a ocorrência de efeitos tardios devido a um excesso de

quimioterápicos (KLUMB et al., 2007; MORAIS et al., 2009).

Para validar o escore baseado na expressão de 11 genes, os mesmos conjuntos de

iniciadores e sondas, assim como as mesmas abordagens metodológicas propostos no estudo

original foram aplicados (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010). Apesar da unificação

metodológica, neste estudo identificamos apenas a expressão gênica de CASP3 associada ao

prognóstico no grupo pediátrico; com associações similares as descritas para os adultos.

Dentre as possíveis razões para a falta de reprodutibilidade dos resultados podemos ressaltar

(i) a complexidade histológica da doença que dificulta a reprodutibilidade; (ii) impacto das

variações técnicas, e finalmente, não podemos descartar (iii) diferenças na composição das

células H-RS e do microambiente entre adultos e crianças, previamente descritas (BARROS

et al., 2012).

Há também uma limitação relacionada ao número de casos neste estudo (78 casos, 18

eventos), cujo poder estatístico para descobrimento é baixo. Entretanto, esta limitação é

menor se entendemos o presente como um grupo de validação independente, para marcadores

já descritos na mesma patologia e utilizando a mesma abordagem metodológica.

Apontando para a complexidade biológica como responsável pela falta de

reprodutibilidade, existem discrepâncias inclusive entre o trabalho que originalmente

identificou os 11 genes associados a prognóstico por TLDA (SANCHEZ-ESPIRIDION et al.,

2009) e o trabalho de desenvolvimento do escore (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010) no

que diz respeito à super-expressão do perfil de marcadores de macrófagos (STAT1 e LYZ), que

no primeiro estudo está associado a prognóstico desfavorável, enquanto que no segundo, a um

prognóstico favorável. Recentemente, outro escore clínico para predizer a SG foi

desenvolvido baseado na expressão gênica por PCR digital a partir de RNA de parafina

(SCOTT et al., 2012). Este escore estava composto por 23 genes, incluindo também genes

associados a macrófagos como ALDH1, CD68, STAT1 e LYZ, cuja super-expressão foi

associada a sobrevida global mais curta em um grupo de pacientes adultos. Nesse trabalho, a

expressão de CASP3 não foi associada a prognóstico. Estes resultados, em conjunto com os

obtidos no presente trabalho indicam que, mesmo usando metodologias quantitativas

altamente reprodutíveis, como RT-qPCR, os perfis de expressão gênica não são uma

97

ferramenta que possa ser facilmente transposta para a clínica com resultados multicêntricos

aceitáveis.

Quanto à variabilidade técnica, controles de qualidade para avaliação da cinética das

reações de qPCR, assim como critérios de identificação de falta de amplificação de uma

amostra foram estritamente seguidos neste estudo. Alterações na cinética da curva,

especificamente na pendente são indicadores da presença de inibidores, que poderia dar como

resultado um falso negativo (BAR et al., 2003; TICHOPAD et al., 2010). SANCHEZ-

ESPIRIDION et al. (2010), utilizam como critérios de exclusão uma pureza do RNA de

λ260/230 <1,7; ou amplificação dos GDR em Cq>35 ciclos, ou falta de amplificação em 30%

dos genes. Nosso grupo decidiu aceitar as amostras de RNA com λ260/230 < 1,7; casos com

amplificação nos GDR Cq>35 ciclos foram excluídos, aqueles que mostrarem alterações na

curva sigmoide ou falta de amplificação em pelo menos 5 genes dos 11 do grupo total

avaliados eram encaminhados para uma nova extração de RNA e posteriormente excluídos na

presença do mesmo padrão.

É possível pensar que se a expressão gênica estivesse afetada extremamente pela

variabilidade biológica interindividual e pela variabilidade técnica, os níveis de expressão

gênica seriam randômicos e não seria possível descrever padrões e perfis no grupo total, o que

não foi o caso.

A análise de cluster hierárquico não supervisionado identificou um grupo com baixa

expressão dos genes da via do ciclo celular, majoritariamente EBV- e EN grau II. Este subtipo

da EN caracteriza-se por apresentar um maior número de células tumorais (BENNETT; TU;

HUDSON, 1981) e inicialmente foi associada a uma resposta desfavorável às terapias

(MACLENNAN et al., 1992). Em termos gerais, o ciclo celular na célula H-RS se encontra

desregulado, com alta expressão das ciclinas e de CDKs, assim como alterações no checkpoint

mitótico levando a uma proliferação e divisão aberrante causando uma multinucleação e

poliploidia (KUPPERS, 2001; GARCIA et al., 2003; BAI et al., 2005; SANCHEZ-

AGUILERA; GARCIA; et al., 2006; ALVARO et al., 2008; BARROS et al., 2009). A

diminuição da expressão dos genes do ciclo celular neste grupo poderia ser reflexo da

existência de alguma subpopulação de células H-RS com parada na divisão celular, o que

poderia estar associado potencialmente com resposta terapêutica desfavorável. Já foi descrita

uma relação entre maior fração proliferativa e eficácia maior das drogas quimioterápicas

(RADULOVIC; JELIC, 1997), inclusive no LHc de crianças por nosso grupo e por outros

98

autores (BARROS; ZALCBERG; HASSAN, 2008; DINAND et al., 2008; MORAIS et al.,

2009). Alternativamente, uma vez que não houve uma diminuição de Ki67 nas células

tumorais nesse grupo, é possível que o perfil de expressão reflita a composição particular do

MAT, caracterizado por um baixo número de células citotóxicas GRZB+ e macrófagos

CD163+ e baixa fração proliferativa linfocitária. Esta constelação de características

particulares nunca antes foi descrita e sua potencial associação com prognóstico desfavorável

(não mostrado, por falta de poder estatístico) estimula a ampliar o número de casos para

melhor descrever este possível grupo prognóstico.

A análise de componentes principais identificou três componentes que explicavam

~70% da variabilidade na expressão gênica no grupo de pacientes com LHc pediátricos. Isto

era esperado, visto a escolha dos alvos baseado em vias celulares, reforçando a ideia de que a

marcada variabilidade interindividual não impede a identificação de padrões com sentido

biológico no LHc. Este trabalho é o primeiro a analisar a expressão gênica exclusivamente em

crianças com LHc, mostrando a reprodutibilidade destes perfis nesse grupo etário. Chamou a

atenção o segundo PCA composto por dois genes do microambiente (STAT1 e LYZ) e dois

genes da via da apoptose (CASP3 e BCL2). Como o PCA captura grupos de genes em vetores

ortólogos, este PCA fornece uma informação que pode estimular a pesquisa da interação dos

macrófagos com a célula tumoral e outras células do microambiente, vista sua importância na

resposta terapêutica. Quais são as células expressando CASP3 e BCL2 moduladas pela

população de macrófagos, somente poderá ser respondido por ensaios funcionais. Neste

trabalho é mostrado que as células do microambiente expressam CASP3 ativada em

proporções variáveis, e sabe-se que BCL2 é uma proteína altamente expressa pelos linfócitos

B para sua sobrevivência dentro dos folículos dos nódulos linfáticos, o que justifica a

agrupação de genes do microambiente com os representantes da via da apoptose.

A análise supervisionada (comparação entre grupos selecionados) mostrou que o

subtipo histológico EN apresentou menor expressão dos genes CASP3 e CDK1 quando

comparados com a CM. Este perfil de expressão gênica pode ser, ao menos em parte, adstrito

ao MAT, uma vez que a EN tem baixo número de células citotóxicas, cuja associação com a

expressão de CASP3 ativada no microambiente foi mostrada neste estudo. Além disso, a

baixa expressão de CDK1 pode estar associada a um menor número de linfócitos proliferantes

no MAT, visto a correlação entre a expressão deste gene e o número de linfócitos Ki67+.

99

Um estudo de expressão gênica a partir da massa tumoral total utilizando a

metodologia de microarray (Affymetrix), foi realizado por BIRGERSDOTTER et al. (2009)

visando diferenciar os subtipos EN e CM. Este estudo mostrou que existem perfis

diferenciais, a EN apresenta uma alta expressão de genes relacionados à matriz extracelular e

seu remodelamento e inflamação, enquanto que a CM se caracteriza pela presença de

moléculas inflamatórias e genes associados à resposta citotóxica. A análise combinada da

expressão gênica e composição do microambiente tumoral por IHQ em nossos casos apoia a

caracterização gênica descrita por BIRGERSDOTTER et al. (2009).

Como mencionado anteriormente, no presente trabalho, uma alta expressão de CASP3

foi associada a uma pior SLP. Como este resultado é contra-intuitivo em relação ao papel da

CASP3 como efetora da apoptose, decidimos investigar a expressão da proteína CASP3

ativada por IHQ. Infelizmente, a imunomarcação de CASP3 nas células tumorais não pode ser

registrada com confiança, devido a problemas de índole técnica; a identificação das células H-

RS expressando CASP3 ativada e sua distinção dos macrófagos contendo corpos apoptóticos

no citoplasma viu-se dificultada pelo insucesso das duplas marcações com CD30, muito

provavelmente porque esta proteína desaparece da membrana celular durante as fases

precoces do apoptose (DUKERS et al., 2002). Duplas marcações com CD68 e CASP3

poderão ajudar a resolver esta questão. Isto é relevante, pois há controvérsias na literatura

sobre o valor prognóstico de CASP3 nas células H-RS. Um maior número de células tumorais

CASP3+ foram associadas a um melhor prognóstico (DUKERS et al., 2002), enquanto que

não tiveram associação significativa no estudo de (BAI et al., 2007). Esta discrepância pode

dever-se a diferenças nos critérios de registro de positividade nos dois estudos.

Assim, decidimos focar a análise no número de células CASP3+ no MAT, análise que

não tinha sido feita anteriormente na literatura, e compará-la com a expressão gênica e com as

diferentes subpopulações neste microambiente. Em nosso grupo de pacientes, a expressão de

CASP3 foi correlacionada com o número de células citotóxicas (CD8+, GRZB+, TIA1+) no

microambiente, assim como foi encontrada uma associação positiva entre o número de

linfócitos CASP3+ e o número de linfócitos citotóxicos CD8+. Não houve associação entre

expressão de CASP3 e número de células expressando CASP3 ativada, evidenciando a

preeminência da regulação pós-traducional destas (DENAULT; SALVESEN, 2002;

BOATRIGHT; SALVESEN, 2003).

100

A associação entre células citotóxicas no microambiente do LHc e a expressão de

proteínas pró e anti-apoptóticas nas células H-RS, inclusive CASP3, foi mostrada

anteriormente (DUKERS et al., 2002; ALVARO et al., 2008). A interpretação possível é que

os estímulos pró-apoptóticos mediados pelas células citotóxicas tenham como resultado a

indução da apoptose na células H-RS, ou uma resposta de escape, via por exemplo a super-

expressão de BCL2L1.

Os resultados da expressão de CASP3 nas células do microambiente devem ser

interpretadas desde outro ângulo. Em primeiro lugar, junto com a documentação da

proliferação dos linfócitos pela primeira vez na literatura sobre o LHc, mostra que há uma

“vida linfocitária” no linfonodo doente, ou seja, as células não somente são recrutadas, mas

também proliferam e morrem, certamente em relação a estímulos obtidos in situ. Desta

maneira, o modelo de partida segundo o qual o MAT no LHc reflete primariamente o que é

recrutável na periferia (POPPEMA, 2005) - exemplificado na constituição do MAT nos LHc

associados ao HIV (THOMPSON et al., 2004; BIGGAR et al., 2006; HARTMANN et al.,

2013) ou proposto por nossa equipe ao relacionar a histogênese do LHc de criança com a

condição imune no momento da transformação maligna (BARROS et al., 2011)- é uma

simplificação ou subestimação das interações celulares que ocorrem nos linfonodos tumorais.

Em segundo lugar, é preciso de perguntar sobre a natureza e estado fisiológico dos

parceiros dessas interações, e o grau em que os mecanismos de homeostase linfocitária no

linfonodo doente são propriamente saudáveis. Os resultados apresentados aqui são claramente

inadequados para responder estas perguntas, e a sua resposta cabal deverá esperar até o

desenvolvimento de modelos experimentais para esta doença. No entremeio, a linha de

interpretação baseada nos estudos de associação podem ajudar na formação de hipóteses.

Previamente em trabalhos desenvolvidos por nossa equipe no mesmo grupo de

pacientes, uma pior SLP foi associada a um maior número de células citotóxicas (GRZB+)

(BARROS et al., 2012), em concordância com a maioria dos estudos prévios que

investigaram prognóstico associado com o microambiente no LHc de adultos (ALVARO-

NARANJO et al., 2005; ALVARO et al., 2005; KELLEY et al., 2007; TZANKOV et al.,

2008).

A principal associação das células expressando CASP3+ no MAT é com as células T

CD8+ e com as células B. Isto permite oferecer uma primeira explicação para a observação do

101

pior prognóstico relacionado à alta expressão do gene CASP3: as células expressando este

gene não se limitam às H-RS (na qual se esperaria um efeito favorável na resposta

terapêutica), senão também, e em maior medida, CASP3 é expressa as células do MAT. Como

há número proporcional de células CD8+ e CASP3+, a causa do prognóstico desfavorável

poderia ter a mesma origem biológica

O resultado de um alto número de células GRZB+ associado a falha terapêutica é

oposto ao modelo de imunovigilância, em que as CTLs estariam controlando o crescimento

tumoral. Esta característica não tem ainda uma explicação científica, mas uma das

interpretações possíveis é que as CTLs estivessem controlando outra/s subpopulação/ções

com função anti-tumoral. A análise conjunta de CASP3 e Ki67 identificou duas populações

com “comportamentos” opostos no tumor. O número de células CD8+, assim como as células

diferenciadas para citotoxicidade aumenta concomitantemente ao marcador de proliferação,

independentemente a CASP3+, refletindo provavelmente sua natureza de célula ativada. A

população CD20+ aumenta na presença de altos números de células CASP3+ independente do

marcador de proliferação Ki67+. Isto poderia ser interpretado como que o número de

linfócitos B não dependesse tanto da proliferação, quanto da diminuição (apoptose) de uma

população que controla o seu número?

Por outro lado, a ativação de CASP3 pode também estar envolvida na diferenciação de

diferentes tipos celulares (ALAM et al., 1999; SCHWERK; SCHULZE-OSTHOFF, 2003).

Esta condição poderia explicar a expressão de CASP3+ em células em proliferação (Ki67+).

Novas estratégias de identificação celular devem ser implementadas com o intuito de

caracterizar as subpopulações expressando estes dois marcadores, juntos e separados. Estudos

com marcação de TUNEL devem ser realizados para identificar se as células expressando

CASP3+ estão de fato sendo encaminhadas para a apoptose ou a proteína está cumprindo

papeis diversos nos diferentes tipos celulares que compõem a massa tumoral. Por exemplo,

SORDET et al. (2002) mostraram que a ativação da CASP3 nem sempre leva à morte celular

em monócitos, podendo contribuir à diferenciação de macrófagos.

A presença e expressão de macrófagos no MAT é um motivo constante na literatura

recente sobre o LHc (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2009; SANCHEZ-ESPIRIDION et al.,

2010; STEIDL et al., 2010; TZANKOV et al., 2010; BARROS; HASSAN; NIEDOBITEK,

2012; HARRIS et al.,2012; SCOTT et al., 2012; TAN et al., 2012; DEAU et al., 2013),

devido às evidências crescentes de seu papel desfavorável na resposta terapêutica (STEIDL;

102

FARINHA; GASCOYNE, 2011; BARROS; HASSAN; NIEDOBITEK, 2012; TAN et al.,

2012). Neste trabalho, foi encontrado que o número de macrófagos CD68+ e CD163+ esteve

altamente correlacionado com a expressão de STAT1, LYZ e IRF4. Isto reforça a assinatura

gênica dos macrófagos, tendo em conta que IRF4 é um importante fator de transcrição na

polarização de macrófagos M2 (SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2009; SATOH et al., 2010).

Entretanto, em nosso grupo de pacientes, esta assinatura não teve valor prognóstico, em

concordância com a própria variabilidade observada no estudo original (SANCHEZ-

ESPIRIDION et al., 2009; SANCHEZ-ESPIRIDION et al., 2010), e na possibilidade de que

a expressão não reflita a subpopulação de macrófagos realmente associada com o prognóstico.

Neste sentido, a perspectiva é que a IHQ quantitativa deva ser refinada para fornecer

biomarcadores de macrófagos com valor prognóstico reprodutível nas diversas situações

clínicas em que os pacientes são tratados. A heterogeneidade e plasticidade dos macrófagos

pode ser um empecilho para este objetivo.

Os macrófagos têm sido classificado em 3 categorias: M1 caracterizados pelo

marcador de membrana CD68 e a expressão de STAT1, M2 identificados pela marcação de

CD163 e a expressão de STAT6, e os macrófagos associados ao tumor (TAM) sendo

denominados como macrófagos M2 like que apresentam o marcador de membrana CD163

(MANTOVANI et al., 2002; ÁLVARO et al., 2006; BISWAS; MANTOVANI, 2010). Esta

visão está sendo confrontada por alguns trabalhos que mostram heterogeneidade na

diferenciação dentro de um mesmo tumor (PETTERSEN et al., 2011), inclusive por dados da

nossa equipe, em relação à polarização e a CD163 como marcador de macrófago M2

(BARROS et al., 2013, em preparação).

A presença do EBV nas células H-RS foi associada a um aumento da expressão gênica

de STAT1 e LYZ. Esta associação decorre do enriquecimento do MAT dos casos EBV+ com

células da linhagem monocítica/macrófago (CD14+, CD68+ e CD163+), observada por nós

nas crianças e por outros autores no LHc de adulto (KAMPER et al., 2011; STEIDL et al.,

2011; BARROS et al., 2012) . Os mecanismos de recrutamento dos macrófagos pelo vírus são

desconhecidos, assim como o estado de ativação destas células nos casos EBV+ e EBV-.

Entretanto, nas crianças com LHc, diferente do observado em adultos, o EBV parece modular

a resposta desfavorável associada aos macrófagos CD163+ (BARROS et al., 2012). De fato,

esta observação também foi feita no presente trabalho em relação a CASP3 e CDK1, em que a

presença do vírus amenizava o impacto prognóstico deste marcador.

103

O papel causal do EBV na patogênese da doença é bem estabelecido (HSI, 2008;

KUPPERS, 2009a; ALDINUCCI et al., 2010; KUPPERS et al., 2012), enquanto que seus

papeis na progressão da mesma e na resposta terapêutica ainda precisam ser melhor

entendidos. Nas crianças com LHc parece haver uma resposta imune antitumoral/antiviral

mais efetiva nos casos EBV+ que pode modular o efeito das quimioterapias (BARROS et al.,

2012). Isto seria responsáveis pela melhor sobrevida e resposta clínica nos casos EBV+ da

infância (CLAVIEZ et al., 2005). Os nossos resultados prévios, em conjunto com os deste

trabalho mostram que a presença do EBV é um importante modulador dos potenciais fatores

prognósticos investigados (BARROS, HASSAN, NIEDOBITEK, 2012; BARROS et al.,

2012). Estas características diferenciais podem ser também responsáveis pela falta de impacto

prognóstico de marcadores biológicos de reconhecida importância nos adultos.

Este conjunto de características que contribuem para a complexidade deste doença

precisam ser melhor entendidas, sobre tudo nesta época de grandes desenvolvimentos

terapêuticos alvo-específicos. O LHc de criança é uma doença pouco estudada e com este

trabalho esperamos ter feito uma contribuição em relação às condições de aplicação das

metodologias de estudo, assim como em atrair atenção para uma situação biológica, clínica e

terapêutica diferenciada dentro do LHc, que requer maiores esforços de pesquisa visto a curta

idade dos pacientes e a necessidade de tratamentos cada vez mais precisos.

104

6 CONCLUSÕES

Durante este estudo, uma metodologia para extração de RNA a partir de material

FFPE foi desenvolvida e aperfeiçoada, introduzindo modificações que aumentaram o

rendimento e a qualidade do RNA extraído. Esta metodologia foi utilizada com sucesso para

estudos de perfis de expressão gênica em pacientes com LHc. O método otimizado mostrou

aplicabilidade similar em amostras de arquivo independentemente do tempo de

armazenamento.

Um desenho experimental ANOVA tipo nested (hierárquico) foi realizado para avaliar

as fontes de variabilidade introduzidas em cada etapa da metodologia aplicada. Os genes

avaliados (LYZ, STAT1, IRF4, BCL2 e CASP3 como alvos e GUSB e HMBS como referência)

mostraram variabilidades similares às publicadas para tecidos a fresco, indicando que a

utilização de RNA de parafina não acarreta em uma variabilidade adicional que impeça ter

resultados com sentido biológico. Todos os genes mostraram alto impacto da variabilidade

biológica. Os genes de baixa expressão sofreram mais os efeitos da variabilidade técnica. O

uso de valores normalizados (∆Cq) resultou em uma diminuição da variabilidade. A etapa de

pré-Amp do cDNA é uma fonte sistemática de variabilidade técnica, devendo ser otimizada

previamente aos estudos com material primário.

Um método de quantificação das reações de PCR em tempo real baseado na análise da

cinética da curva (Cy0) foi aplicado, pondo em evidência o efeito potencial de inibidores nos

genes com mais variabilidade biológica e técnica (CASP3 e LYZ). Visto que as reações a

partir de RNA FFPE são sistematicamente afetadas pela presença de inibidores, os novos

métodos de quantificação mediante a cinética da curva podem ser uma alternativa mais

eficiente, entretanto, comparações que mostrem superioridade significativa com o método Cq

são ainda necessárias.

Este trabalho é o primeiro a analisar a expressão de genes relacionados às vias do ciclo

celular (CENPF, CDK1, CCNA2, CCNE2 e HMMR), apoptose (CASP3, BCL2, BCL2L1),

ativação de monócitos/macrófagos (STAT1, LYZ) e fator regulador de interferon 4 (IRF4) em

um grupo exclusivamente de crianças com LHc (N=84), mostrando a reprodutibilidade destes

perfis nesse grupo etário. A análise de componentes principais identificou três componentes

que explicavam ~70% da variabilidade na expressão gênica. O subtipo EN apresentou baixos

níveis dos genes CASP3 e CDK1 quando comparado com a CM.

105

Dos 11 genes com valor prognóstico relatado em adultos, apenas a alta expressão de

CASP3 foi associada com pior SLP. Quando estratificados pelo status do EBV, os casos EBV

negativos mostraram uma sobrevida ainda pior na presença de altos níveis de CASP3. A

expressão da CASP3 não reflete somente as células H-RS, uma vez que a presença da proteína

CASP3 ativada foi detectada no MAT. Foi detectada uma associação consistente e com

provável valor clínico entre expressão gênica de CASP3, populações citotóxicas no MAT e

expressão de CASP3 ativada nestas mesmas células.

Escores clínicos proposto em pacientes com LHc em adultos não são reprodutíveis em

pacientes pediátricos.

Os casos associados ao EBV mostraram uma super-expressão de STAT1 e LYZ, em

concordância com um maior número de monócitos e macrófagos no MAT. O número de

células citotóxicas (CD8+, GRZB+, TIA1+), mostrou uma correlação positiva com a

expressão de CASP3, CDK1 e BCL2, STAT1 e/ou LYZ. Houve uma correlação inversa entre a

presença de alto número de eosinófilos com a expressão dos genes das vias do ciclo celular

(CENPF e CDK1), apoptose (CASP3 e BCL2), e relacionados a macrófagos (STAT1 e LYZ).

A abordagem integrada de expressão gênica e IHQ quantitativa pode fornecer pistas

sobre processos de interação patogênica entre as células H-RS e as células do MAT, que

possam estar envolvidos na resposta clínica do LHc pediátrico.

106

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127

ANEXO I

Fig. S1: Eficiência dos iniciadores/sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real

quantitativo (RT-qPCR)

No eixo dos épsilons valores Cq; no eixo dos xis diluições seriadas em escala log10.

Eficiência: 100,40%Pendente: - 3,31R2 : 0,997

Eficiência: 100,80% Pendente: - 3,30R 2 : 0,999

Eficiência: 94,90%Pendente: - 3,45 R2 : 0,999




Eficiência: 96,20% Pendente: -3,42R 2 : 0,999

Eficiência: 99,20%Pendente: -3,34 R2 : 0,998



Eficiência: 95,70%Pendente: -3,43R2 : 0,999



128

ANEXO II

INFORMAÇÃO MÍNIMA PARA PUBLICAÇÃO EM EXPERIMENTOS DE

QUANTIFICAÇÃO EM PCR EM TEMPO REAL (MIQE), SUGERIDAS POR

BUSTIN et al. (2009).

1 Desenho experimental

• Grupo experimental: linfonodos de crianças e adolescentes com linfoma de Hodgkin

clássico (LHc) e tonsilas com Hiperplasia Reativa

• Número de pacientes: 93 LHc e 6 LHR

2 Amostras

• Descrição: linfonodos fixados e impregnados em parafina (FFPE)

• Quantidade de amostra processada: 5 cortes de parafina de 3 µm cada um

• Procedimento do processamento de fixação: formol 10% por 24 horas.

• Tempo e condições de armazenamento das amostras: 6-12 anos a 20-22°C em

ambiente fechado

3 Extração do RNA

• Kits utilizados: 1) Máster PureTM RNA purification kit (MP) (Epicentre, Madison,

WI) com 480 µL de solução de lise celular e de tecido e 60 µL de proteinase K 60

mg/dL a 65°C por 20 horas. 2) RecoverAllTM total nucleic acid isolation kit (RA)

(AmbionTM por Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA) com 200 µL de tampão de

digestão e 60 µL de proteinase K (60mg/dL), incubado a 50°C por 15 minutos e

depois 20 horas a 65°C

• Reagentes adicionais usados: proteinase K (Invitrogen por Life TechnologiesTM,

Carlsbad, CA) a 60 mg/dL.

• Tratamento com DNase: 1) Método MP: 200 µL da solução DNase I (5 µL de DNase I

e 200 µL de 1X de tampão de DNase) supridos pelo kit a 37°C por 30 minutos. 2)

Método RA: 60 µL de mix DNase (6 µL tampão de DNAse 10X, 4 µL DNase e 50 µL

água livre de nucleases) supridos pelo kit a temperatura ambiente por 30 minutos.

• Avaliação de contaminação por DNA: não se aplica

• Quantificação do RNA:

129

� Método e aparelho: espectrofotometria no Nanodrop (ND-1000

Spectrophotometer, Wilmington, USA).

� Pureza: λ260/280: 1,80 + 0,14

λ260/230: 1,39 + 0,66

• Integridade do RNA:

� Método e aparelho: análise de RNA pela metodologia microfluídica na plataforma

2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)

� RIN:1,2 – 3,6

� Eletroforese: gel de agarose 1,2% em tampão fosfato (Na2HPO4 0,01M) com

coloração de brometo de etídio (0,5 µg/mL).

• Teste de inibição: não realizado. Problema de inibição abordado na análise de qPCR.

• Armazenamento do RNA: -70°C

4 Transcrição reversa

• Condições da reação: 2 µL tampão RT 10X, 0,8 µL dNTPs 25X, 2 µL iniciadores

randômicos 10X, 1 µL de MultiScribe RT 50U/µL, 4,2 µL água livre de nucleases.

• Quantidade de RNA e volume da reação: 0,5 µg de RNA diluído em 10µL de água

para um volume final da reação de 20µL.

• Estratégia de iniciadores: Uso de iniciadores hexaméricos randômicos

• Transcritase reversa e concentração: MultiScribe™ Reverse Transcriptase em 50

U/µL.

• Temperatura e tempo: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos e 85°C por 5

minutos.

• Fabricante e número de catálogo: Applied por Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA

com o número 4368814.

• Estocagem do cDNA: -70°C

130

5 Alvos de PCR

Símbolo Gene*

Eficiência (%)

# Acesso sequência

Localiz amplicon

Iniciador exon

ID do ensaio Tam amp

(pb) BCL2

BCL2L1

CCNA2

CCNE2

CDK1

CENPF

CASP3

HMMR

IRF4

LYZ

STAT1

GUSB

HMBS

98,60

99,13

99,20

105,62

95,85

95,70

96,20

98,10

97,40

98,6

94,90

100,4

100,8

NM_000633.2

NM_138578.1

NM_001237.3

NM_057749.2

NM_001170407.1

NM_001786.4

NM_033379.4

NM_016343.3

NM_004346.3

NM_001142556.1

NM_001142557.1

NM_012484.2

NM_012485.2

NM_001195286.1

NM_002460.3

NM_000239.2

NM_007315.3

NM_139266.2

NM_000181.3

NM_000190.3

1081

930

520

705

121

121

121

8155

250

1448

1221

1445

1400

1339

1342

358

1171

1171

1925

186

2-3

2-3

1-2

7-8

1-2

1-2

1-2

14-15

2-3

11-12

8-9

11-12

10-11

8-9

8-9

2-3

9-10

9-10

11-12

1-2

Hs00608023_m1

Hs00236329_m1

Hs00153138_m1

Hs00180319_m1

Hs00176469_m1

Hs00193201_m1

Hs00234385_m1

Hs00234864_m1

Hs00180031_m1

Hs00426231_m1

Hs00234829_m1

Hs99999908_m1

Hs00609297_m1

81

65

110

92

101

99

66

98

88

64

79

81

64

* De acordo com HUGO (WHITE et al., 1997). Localiz amplicon: localização do amplicon segundo o RefSeq; Tam amp: tamanho do amplicon

• Screening de especificidade in silico (BLAST): não se aplica

• Variantes de splicing nos alvos: não se aplica

6 Oligonucleotideos da qPCR

• Sequência do iniciador: Descrito de acordo com a localização na RefSeq

• Sequência da sonda: Descrito de acordo com a localização na RefSeq

• Localização e identidade de alguma modificação: não se aplica

• Fabricante dos oligonucleotideos: Applied por Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA

7 Protocolo de qPCR

• Condições completa da reação: volume final da reação de 15 µL: 7,5 µL TaqMan

universal PCR Máster Mix 2X, 0,75 µL Iniciador/Sonda 20X, 2,75 µL água livre de

nucleases e 4 µL cDNA pré-amplificado.

131

• Volume da reação e quantidade de cDNA: volume final de 15 µL com 4 µL cDNA

específico pré-amplificado previamente diluído 1:20 em água livre de nucleases.

• Concentração de iniciadores, sonda, Mg++ e dNTP: padrão no reagente TaqMan

universal PCR Máster Mix (Applied, Life TechnologiesTM)

• Identificação e concentração da polimerase: padrão no reagente TaqMan universal PCR

Máster Mix (Applied, Life TechnologiesTM)

• Aditivos: não foram usados

• Fabricante das placas e número de catálogo: Applied Biosystems, número de catálogo

N8010560

• Parâmetros completos da termociclagem: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos. 40

ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto.

• Fabricante do instrumento de qPCR: ABI 7000, Applied Biosystems.

8 Validação de qPCR

• Especificidade: gel de agarose 3%

• NTC: Cq ˃40

• Curva standard com slope e intersecção em y: vide Anexo I

• Eficiência da PCR (slope): (-3,30) – (-3,43)

• R2 da curva standard: 0,994 - 0,999

• Rango dinâmico linear: 4-5 log10

• Variação do Cq no limite baixo: DP ≤ 0,5

• Evidencia para o limite de detecção: não determinado

• Multiplex, eficiência e LOD para cada ensaio: não determinado

9 Data analise

• Programa de análise de qPCR (fonte, versão): Genex enterprise (MultiD analyses)

• Método de determinação Cq: 2-∆Cq

• Identificação e disposição dos outliers: teste Grubbs e KOD

• Resultados dos NTCs: Cq˃40

• Justificação do número de genes de referência selecionados: foram selecionados os dois

genes mais estável descritos para LHc reportado por Sanchez-Espiridion et al, Clin

Cancer Res 2009;1367:15(4).

• Descrição do método de normalização: não se aplica

132

• Número e estado (qPCR) de replicatas técnicas: 2 qPCR

• Reprodutibilidade (variação inter-ensaio): BCL2 (1,51%), BCL2L1 (1,96%), CASP3

(0,70%), CCNA2 (1,71%), CCNE2 (1,67%), CDK1 (2,07%), CENPF (2,69%), HMMR

(1,55%), IRF4 (1,43%), LYZ (1,18%), STAT1 (2,15%), GUSB (1,35%) e HMBS

(1,55%).

• Métodos estatísticos para a significância dos resultados: teste Mann-Whitney para 2

amostras independentes e teste Spearman para correlações bivariadas.

• Software (fonte e versão): SPSS 20.0

Carta de aprovação do estudo pelo comitê de ética em pesquisa

133

ANEXO III


•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•


134

ANEXO IV

TABELAS SUPLEMENTARES

• Tabela S1: Descrição dos anticorpos utilizados para imunohistoquímica no estudo das

células do microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico.

• Tabela S2: Distribuição da variabilidade introduzida em porcentagem em cada etapa

da metodologia utilizada na avaliação de amostras FFPE.

• Tabela S3: Correlações entre a expressão gênica do microambiente do linfoma de

Hodgkin clássico pediátrico, avaliadas por PCR em tempo real quantitativo (qPCR).

• Tabela S4: Caracterização e quantificação das células do microambiente tumoral em

pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátricos.

• Tabela S5: Correlações entre células infiltrantes no microambiente do linfoma de

Hodgkin clássico pediátrico, avaliadas por marcações de imunohistoquimica

quantitativa.

135

Tabela S1: Descrição dos anticorpos utilizados para imunohistoquímica no estudo das células do microambiente tumoral no linfoma de Hodgkin clássico. ANTICORPO * CLONE FABRICANTE DILUIÇÃO TAMPÃO IMUNODETECÇÃO MARCAÇÃO TIPO DE

CÉLULA

CD3 Policlonal DakoCytomation 1:50 EDTA LSAB Membrana Linfócitos T

CD4 1F6 Novocastra 1:50 EDTA Envision Membrana Linfócitos T

CD8 C8/144B DakoCytomation 1:50 EDTA Envision Membrana LTC

CD14 7 Novocastra 1:50 Citrato ZytoChem Plus HRP Polymer Membrana Monócitos

CD20 L-26 DakoCytomation 1:1000 Citrato LSAB Membrana Linfócitos B

CD68 PG-M1 DakoCytomation 1:250 EDTA ZytoChem Plus HRP Polymer Membrana Macrófagos

CD163 10D6 Novocastra 1:400 Citrato ZytoChem Plus HRP Polymer Membrana Macrófagos

MAF M-153 Santa Cruz 1:50 EDTA ZytoChem Plus HRP Polymer Nuclear Linfócitos Th2

FOXP3 22510 Abcam 1:150 EDTA Envision Nuclear Linfócitos Treg

GRZB GrB-7 DakoCytomation 1:90 Citrato Envision Citoplasma LTC ativado

TBX21(TBET) 4B10 Santa Cruz 1:50 EDTA ZytoChem Plus HRP Polymer Nuclear Linfócitos Th1

TIA1 TIA1 Abcam 1:150 Citrato Envision Citoplasma LTC

ativadas/repouso

p53 DO-7 DakoCytomation 1:500 EDTA LSAB Nuclear Cél H-RS

p21 SX-118 DakoCytomation 1:50 EDTA LSAB Nuclear Cél H-RS

BCL2 124 DakoCytomation 1:50 EDTA Envision Citoplasma Cél H-RS

CASP3 CPP32 Novocastra 1:1000 EDTA/Citrato ZytoChem Plus HRP Polymer Núcleo/Citoplasma Linfócitos

Ki67 MIB-1 DakoCytomation 1:50 Citrato LSAB Nuclear Linfócitos * De acordo com HUGO (WHITE et al., 1997). LTC, linfócito T citotóxico; Treg: linfócitos T reguladores; Cél: célula

136

Tabela S2: Distribuição da variabilidade introduzida em porcentagem em cada etapa da metodologia utilizada na avaliação de amostras FFPE. GENES

Etapa da metodologia


Sujeito (%) 94,8 90,1 88,9 95,0 96,0 88,9 83,8

Linfonodo (%) 0,0 0,1 8,1 0,0 0,0 0,0 2,5

RNA (%) 2,6 4,0 1,3 3,1 2,5 4,1 7,1

RT (%) 0,7 2,4 0,1 0,0 0,6 3,6 0,4

pré-Amp (%) 1,5 2,6 1,5 1,6 0,6 3,1 6,0

qPCR (%) 0,4 0,8 0,1 0,3 0,3 0,3 0,2

Total (%) 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

RT: retrotranscrição; pré-Amp: pré-amplificação; qPCR: PCR quantitativa em tempo real.

137

Tabela S3: Correlações entre a expressão gênica do microambiente do linfoma de Hodgkin clássico pediátrico, avaliadas por PCR em tempo real quantitativo (qPCR).

GENES DE INTERESSE

CENPF CDK1 CCNA2 CCNE2 HMMR BCL2 CASP3 BCL2L1 LYZ STAT1 IRF4

CENPF 1,000 0,463** 0,337** 0,385** 0,430** 0,246* 0,178 0,101 0,316** 0,432** 0,603**

CDK1 0,463** 1,000 0,468** 0,436** 0,302** 0,272* 0,510** -0,071 0,423** 0,456** 0,422**

CCNA2 0,337** 0,468** 1,000 0,331** 0,559** 0,143 0,140 -0,106 0,233* 0,296** 0,279*

CCNE2 0,385** 0,436** 0,331** 1,000 0,232* 0,265* 0,225* 0,137 0,332** 0,459** 0,453**

HMMR 0,430** 0,302** 0,559** 0,232* 1,000 -0,056 -0,042 -0,139 0,050 0,160 0,185

BCL2 0,246* 0,272* 0,143 0,265* -0,056 1,000 0,201 0,026 0,353** 0,343** 0,366**

CASP3 0,178 0,510** 0,140 0,225* -0,042 0,201 1,000 -0,017 0,390** 0,363** 0,395**

BCL2L1 0,101 -0,071 -0,106 0,137 -0,139 0,026 -0,017 1,000 -0,035 0,266** 0,130

LYZ 0,316** 0,423** 0,233* 0,332** 0,050 0,353** 0,390** -0,035 1,000 0,736** 0,272*

STAT1 0,432** 0,456** 0,296** 0,459** 0,160 0,343** 0,363** 0,266* 0,736** 1,000 0,358**

IRF4 0,603** 0,422** 0,279* 0,453** 0,185 0,366** 0,395** 0,130 0,272* 0,358** 1,000

* P< 0,005: ** P< 0,001. Valores p obtidos através da correlação de Spearman. Na tabela estão representados os valores de R2 (positivos: correlação direta entre as quantificações; negativos: correlação inversa entre as quantificações).

138

Tabela S4: Caracterização e quantificação das células do microambiente tumoral em pacientes com linfoma de Hodgkin clássico pediátricos.

Variável Células/mm2 Casos analisados Porcentagem casos

analisados CD3+ (Faixa) 70-1187

Média/Mediana 654/692 74/84 88,1%

CD4+ (Faixa) 3-624

Média/Mediana 182/161 72/84 85,7%

CD8+ (Faixa) 11-847

Média/Mediana 189/143 77/84 91,7%

CD14+ (Faixa) 0-524

Média/Mediana 81/50 72/84 85,7%

CD20+ (Faixa) 1-885

Média/Mediana 249/203 74/84 88,1%

CD68+ (Faixa) 44-601

Média/Mediana 297/299 73/84 86,9%

CD163+ (Faixa) 0-560

Média/Mediana 165/139 74/84 88,1%

MAF+ (Faixa) 3-498

Média/Mediana 102/68 70/84 83,3%

FOXP3+ (Faixa) 1-513

Média/Mediana 107/49 75/84 89,3%

GRZB+ (Faixa) 1-451

Média/Mediana 33/11 76/84 90,5%

TBX21+ (Faixa) 2-269

Média/Mediana 55/35 73/84 86,9%

TIA1+ (Faixa) 1-396

Média/Mediana 115/69 73/84 86,9%

Ki67+ (Faixa) 3-352

Média/Mediana 102/96 75/84 89,3%

CASP3+ (Faixa) 6-175

Média/Mediana 42/31 58/84 69,0%

TBX21= TBET

139

Tabela S5: Correlações entre células infiltrantes no microambiente do linfoma de Hodgkin clássico pediátrico, avaliadas por marcações de imunohistoquimica quantitativa.

MARCAÇÕES POR IHQ DE LINFÓCITOS

CD3+ CD4+ CD8+ CD20+ CD14+ CD68+ CD163+ MAF+ FOXP3+ GRZB+ TBX21+ TIA1+ CASP3+ Ki67+

CD14+ 0,011 0,138 0,439** 0,009 1,000 0,470** 0,550** 0,039 0,111 0,497** 0,501** 0,407** 0,303* 0,329**

CD68+ -0,177 0,078 0,188 -0,088 0,470** 1,000 0,476** -0,063 0,426** 0,435** 0,140 0,384** 0,013 0,073

CD163+ -0,195 -0,074 0,264* 0,072 0,550** 0,476** 1,000 -0,063 0,101 0,442** 0,406** 0,380** 0,013 0,221

CASP3+ 0,381** 0,069 0,329* 0,439** 0,303* 0,014 0,013 -0,053 0,059 0,086 0,224 0,245 1,000 0,242

Ki67+ 0,065 0,157 0,439** 0,133 0,329** 0,073 0,221 0,547** 0,232* 0,569** 0,407** 0,294* 0,242 1,000

* P< 0,005: ** P< 0,001. Valores p obtidos através da correlação de Spearman. Na tabela estão representados os valores de R2 (positivos: correlação direta entre as quantificações; negativos: correlação inversa entre as quantificações). IHQ: imunohistoquímica; TBX21= TBET

140

ANEXO V

TRABALHO PUBLICADO E APRESENTAÇÕES EM CONGRESSO

• VERA-LOZADA MG, BARROS MH, STEFANOFF CG, HASSAN R. Expressão de

marcadores de ativação e diferenciação de macrófagos no linfoma de Hodgkin clássico

como marcadores prognóstico: a propósito das condições técnicas de aplicação. In:

Congresso Brasileiro de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular – HEMO 2012,

Rio de Janeiro.

• VERA-LOZADA MG, BARROS MH, SCHOLL V, CAPPELLETTI P,

STEFANOFF CG, HASSAN R. Avaliação de perfis de expressão gênica com valor

prognóstico no linfoma de Hodgkin clássico da infância e adolescência. In: Congresso

Brasileiro de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular – HEMO 2012, Rio de

Janeiro.

• BARROS, M.H., VERA-LOZADA, G., SOARES, F.A., NIEDOBITEK, G. e

HASSAN R. Tumor microenvironment composition in pediatric classical Hodgkin

lymphoma is modulated by age and Epstein-Barr virus infection. Int J Cancer, v.

131, n. 5, p. 1142-52, Sep 1 2012.

Tumor microenvironment composition in pediatric classicalHodgkin lymphoma is modulated by age and Epstein-Barr virusinfectionMario Henrique M. Barros1,2, Gabriela Vera-Lozada1, Fernando A. Soares3, Gerald Niedobitek2 and Rocio Hassan1

1 Bone Marrow Transplantation Center, Instituto Nacional de Cancer (INCA), Rio de Janeiro, Brazil2 Institute for Pathology, Unfallkrankenhaus Berlin, Berlin, Germany3 Pathology Department, Hospital A.C. Camargo, Sao Paulo, Brazil

Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is characterized by a small number of neoplastic cells in a background of reactive cells.

Children and adults differ in constitution and functionality of the immune system and it is possible that there may be age-

related differences in tumor microenvironment composition in cHL. One hundred children with pediatric cHL were studied.

Tumor-infiltrating lymphocytes were analyzed by immunohistochemistry (IHC) and image analysis. Epstein-Barr virus (EBV)

status was determined by EBER-specific in situ hybridization and IHC. Results were analyzed in the context of age-group,

histological characteristics and clinical follow-up. EBV-status was not associated with age-group. Children <10 years and

EBV1 cases were characterized by a more intense T cell infiltrate, exhibiting a cytotoxic/Th1 profile, characterized by higher

numbers of CD31, CD81, TIA11 and TBET1 lymphocytes. Extranodal disease (p 5 0.016) and high number of GranzymeB1

lymphocytes (p 5 0.04) were independently associated with reduced progression-free survival (PFS). Yet, in EBV1 cases,

improved outcome was observed in cases with low numbers of FOXP31 lymphocytes (p 5 0.046), FOXP3/CD8 ratio < 1 (p 5

0.021) and TBET/CMAF ratio < 1 (p 5 0.017). By contrast, in EBV2 cases, poor survival was observed in cases with

extranodal disease (p 5 0.028), MC subtype (p 5 0.009) and high numbers of TIA11 (p 5 0.044) and GranzymeB1 (p 5

0.04) lymphocytes. The results suggest that in EBV1 cHL an effective immune response directed against viral or tumor

antigens may be triggered in the tumor microenvironment and that physiological and age-related changes of the immune

system may also modulate the tumor microenvironment in pediatric cHL.

Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is characterized by asmall number of neoplastic, Hodgkin and Reed-Sternberg(HRS) cells, in a background of inflammatory non-neoplasticcells, mainly B and T cells.1 The clinical and pathologicalcharacteristics of cHL are thought to result from an immunedysfunction, characterized by the deregulated expression ofseveral cytokines and chemokines,2 and an inadequate

immune response due to poor immunogenicity of HRS cells,the immunosuppressive effects exerted by the tumor cellsand/or the poor response of the host immune system.2

At a local level, the tumor microenvironment is main-tained by a crosstalk between malignant and reactive cells inthe microenvironment, mediated by cytokines and chemo-kines expressed by both, HRS and inflammatory cells.2

Increasing evidence of the importance of tumor microenvir-onment in the pathogenesis of and clinical response to cHLhas come from immunohistochemical and molecular stud-ies.2–4 Particularly, the number of several intratumoral cellpopulations, such as cytotoxic and regulatory (Treg) Tcells,2,5,6 or the ratio between these populations7–9 have beendescribed as being associated with therapeutic response.

Up to now, however, all these studies have been con-ducted in adult patients or a mixture of adolescents andadults. It is possible that children and adults differ in theirresponse to the tumor, not only with respect to the recruitedcell types, but also to the functional status of these cells. Inhealthy individuals, the numbers of T and B lymphocytes inthe peripheral blood differ between children and adults.10–13

Furthermore, in adults aging of the immune system charac-terized by the accumulation of CD8!CD28" cells may con-tribute to the shaping of the immune response to tumor orviral antigens.14–16

Key words: Hodgkin lymphoma, children, Epstein-Barr virus,lymphocyte, tumor microenvironment, prognosisAdditional Supporting Information may be found in the onlineversion of this article.Grant sponsor: INCT para Controle do Cancer; Grant number:

CNPq 573806/2008-0; Grant sponsor: FAPERJ; Grant number:

E26/170.026/2008 (Brazil); Grant sponsor: Swissbridge Foundation(Switzerland), Grant sponsor: Fundaçao de Amparo a Pesquisa doEstado do Rio de Janeiro (FAPERJ); Grant number: E26/111.432/2010; Grant sponsor: CAPES-DAAD program (Brazil-Germany)DOI: 10.1002/ijc.27314History: Received 26 Aug 2011; Accepted 26 Sep 2011; Online 25Oct 2011Correspondence to: Mario Henrique M. Barros, Institute forPathology, Unfallkrankenhaus Berlin, Warener Str. 7, 12683 Berlin,Germany, Tel: !49 30 5681 3750; Fax: !49 30 5681 3753,E-mail: [email protected]

Tum

orIm

mun

olog

y

Int. J. Cancer: 131, 1142–1152 (2012) VC 2011 UICC

International Journal of Cancer

IJC

The presence of Epstein-Barr virus (EBV), which clonallyinfects HRS cells in a proportion of cases, is another variablecapable of modulating the tumor microenvironment byinducing the expression of cytokines involved in cell migra-tion and of viral immunogenic proteins.17–19 In fact, molecu-lar profiling studies have identified a distinct immune molec-ular signature for EBV-associated cHL.18,20

In this study, we have analyzed the composition of the tu-mor microenvironment and its prognostic impact in a largeseries of pediatric cHL comprising comparable numbers ofEBV! and EBV" cases.

Material and MethodsPatients

One hundred children and adolescents (up to 18 year old)diagnosed with cHL at the Instituto Nacional do Cancer(INCA, Brazil) between 1999 and 2006 were included in thisstudy, based on availability of formalin-fixed paraffin-embed-ded tissue and complete clinical data for retrospective analy-sis. All patients were negative for the human immunodefi-ciency virus (HIV) infection. Patients were classified in twoage groups (#10 years vs. >10 years) to investigate microen-vironment characteristics in younger vs. older children.10–13,21

Pretreatment factors evaluated were disease stage accordingto the Ann Arbor staging criteria,22 presence of B symptomsand mediastinal mass, number of involved anatomic areas(IAA) (nodal and extranodal), presence of anemia (children<12 years: Hb <12 g/dl; male 12–18 years: Hb <13.5 g/dl;female 12–18 years: 11.5 g/dl), leukopenia (<4,000 leukocytes/mm3) and lymphopenia (<800 lymphocytes /mm3). Evalua-tion of IAA was performed as previously described.20 Chil-dren with Stages I, IIA or IIIA were classified as favorableclinical presentation and children with Stages IIB, IIIB or IVwere classified as unfavorable clinical presentation, accordingpediatric oncology guidelines.23 All patients were treatedaccording pediatric protocols and received adriblastine-basedchemotherapy:24,25 53 children (53%) were treated accordingto the ABVD-protocol (adriamycin, bleomycin, vinblastineand dacarbazine) and 47 children (47%) according to theGerman pediatric protocol HD90, consisting of OPPA (vin-cristine, procarbazine, prednisone and doxorrubicine) forgirls, OEPA (vincristine, procarbazine, prednisone and doxor-rubicine) for boys and COPP (cyclophosphamide, vincristine,procarbazine and prednisone) for both when they were notpresenting with early stage disease (Stages I and IIA).25

Radiotherapy was administered only when was proposed bythe protocols.24,25 This study was approved by the INCAEthics Committee.

Histology

Diagnosis of cHL was established by morphologic criteriaaccording to the WHO classification.1 All cases were inde-pendently reviewed by two pathologists (MHMB and GN);discordant cases were discussed at a double-headedmicroscope. In cases no agreement was reached, cases were

designated ‘‘unclassifiable’’. The interfollicular pattern wasdefined as the presence of frequent residual follicles or exten-sive follicular hyperplasia with interfollicular tumor infil-trates.26 All histological parameters were evaluated in conven-tional H&E-stained slides.

Tissue microarray design

A Tissue arrayer device (Beecher Instrument, SilverSpring,MD) was used to assemble the tissue microarray (TMA)blocks. From each case, two 1-mm-diameter cores, selectedfrom two different representative tumor areas, were included.

Immunohistochemistry

TMA blocks were sectioned at a thickness of 3 lm. Sectionswere dried for 12 hr at 56$C. Dewaxed paraffin sections wererehydrated and submitted to endogenous peroxidase block-ade. Antigen retrieval was performed by heat treatment in apressure-cooker for 1 min. Buffers used for antigen retrievaland primary antibodies are listed in the Supporting Informa-tion Table S1. Briefly, the antibodies used were anti- CD3,CD4, FOXP3, CD8, TIA1, Granzyme B and CD20. Anti-TBET and anti-CMAF antibodies were used for characteriza-tion of Th1 and Th2 cells, respectively, as previouslyreported.27 Proliferative activity of reactive non-neoplasticlymphocytes was evaluated by Ki67 immunostaining.

After incubation with primary antibody, immunodetectionwas performed using labeled streptavidin biotin (LSAB) visu-alization system (Dako, Glostrup, Denmark), Envision kit(Dako) or ZytoChem Plus HRP polymer kit (Zytomed Sys-tems, Berlin, Germany) (Supporting Information Table S1),employing diaminobenzidine (DAB) chromogen as substrate.Sections were counterstained with hematoxylin. External andinternal controls included in the TMA were taken into con-sideration to interpret stainings.

EBV detection

Latent EBV infection was determined in all patients by insitu hybridization (ISH) with fluorescein-conjugated probesfor EBV-encoded RNAs (EBER-ISH) and by IHC againstlatent membrane protein 1 (LMP1) as described.20

Computer-assisted microscopical analysis

For lymphocyte subset evaluation, each core was photo-graphed using AxioCam MRc camera (Zeiss, Germany) at a200% magnification. The numbers of labeled lymphocyteswere determined per 1 mm2 using the image analysis soft-ware HISTO (Biomas, Elangen, Germany). Germinal centerswithout colonization by neoplastic cells, when present in thecore, were not considered in the cell count.

Threshold

For each lymphocyte subset, the 25th and 50th percentileswere used to categorize the intensity of the lymphocyte infil-tration. Cases displaying no labeled lymphocytes in bothcores were considered not evaluable for technical reasons.

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Statistical analysis

Pearson’s chi-square and Fisher’s exact test were used to testassociation between dichotomous variables. Mann-Whitneytest was used to test association between dichotomous andcontinuous variables, while Spearman’s correlation was usedto test association between continuous variables. Differenceswere considered significant at p < 0.05 in two-tailed tests.Primary treatment was defined as a failure if the lymphomahad progressed at any time after the initiation of therapy;treatment success was defined as the absence of progressionor relapse. Progression-free survival (PFS) was the interval(in months) from diagnosis to progression at any time,relapse from complete response, or initiation of new, previ-ously unplanned treatment or to the last follow-up in thepatients with treatment success. Overall survival (OS) refersto the interval (in months) from the diagnosis to death orlast follow-up. Survival distributions were estimated by theKaplan-Meier method and differences were compared usinglog-rank test. Multivariate Cox proportional hazard regres-sion method was used to determine the independent prog-nostic value of statistically significant variables in univariateanalyses. Data were analyzed using Statistical Package for theSocial Sciences 13.0 (SPSS).

ResultsClinico-pathological parameters and EBV status

The age at diagnosis ranged from 3 to 18 years (median 14years), with a male:female ratio of 1.7:1 (64 males and 36females). Similar numbers of patients were allocated to favor-able and unfavorable clinical presentation groups (52.6% vs.47.4%).The number of IAA ranged from 1 to 9 (median 3).

NS was the predominant subtype (69/100, 69%), followedby mixed cellularity (MC) (23/100, 23%). The presence ofgranulomas was observed in 37% of cases (37/100 cases), pre-dominantly in MC subtype (14/23 MC cases with granulomasvs. 21/69 NS cases with granulomas, p & 0.007, v2). Granulo-mas were found preferentially in the young age-group (15/27children # 10 years had granulomas, and 22/73 children >10 years had granulomas. p & 0.019, v2). There was no asso-ciation of this histological feature with EBV status or otherclinical-histological variables.

Overall, EBV was detected in 44.8% cases, with the MCsubtype (15/22, 68.1%) showing a higher association than theNS subtype (28/74, 37.8%) (p & 0.012); there was no associa-tion with age-groups (# vs. >10 years; p & 0.185). The mainclinical and histological characteristics are listed in Table 1.

Lymphocyte subsets in pediatric cHL

CD3! T cells as well as T-cell subsets showed no specificdistribution in the tumor microenvironment, being some-times observed in the vicinity of HRS cells in a rosette-likefashion, but without predominance of this feature (Fig. 1).The CD20! B cells were distributed uniformly in the tumormicroenvironment, without specific localization.

A detailed summary of the numbers of each lymphocytepopulation per mm2 is given in the Table 2. A higher numberof CD3! T cells in comparison to CD20! B lymphocytes wasobserved (median 645 cells/mm2 vs. 196 cells/mm2, respec-tively). However, CD20! B cells were observed at least as fre-quently as any T cell subset individually [CD4! (median 155cells/mm2), FOXP3! (median 49 cells/mm2), CMAF! (median68 cells/mm2), TBET! (median 32 cells/mm2), CD8! (median143 cells/mm2), TIA1! (median 69 cells/mm2) and GranzymeB! (median 11 cells/mm2)] (Fig. 2).

Ki67 immunostaining was evaluated in the small maturebenign lymphocytes. A large variation was observed regard-ing the number of non-neoplastic Ki67! lymphocytes (3–352cells/mm2, median: 91 cells/mm2). These lymphocytesshowed no specific distribution in the tumor microenviron-ment. No association with histological features or with EBV-status was found. A direct correlation (Spearman’s correla-tion) was observed between the number of benign Ki67!lymphocytes and the number of FOXP3! (p & 0.042),CD8! (p < 0.0005), TIA1! (p & 0.015), Granzyme B! (p< 0.0005), TBET! (p < 0.0005) and CMAF! (p < 0.0005)lymphocytes (Supporting Information Fig. S1).

Lymphocyte subsets are associated with clinical and

histological features

Age groups. The younger age group (#10 years) was charac-terized by a more intense T cell infiltrate, exhibiting a cyto-toxic/Th1 profile, characterized by higher numbers of CD3!(p & 0.025; Mann-Whitney test), CD8! (p & 0.016, Mann-Whitney test), TIA1! (p & 0.008, Mann-Whitney test) andTBET! (p & 0.045, Mann-Whitney test) lymphocytes,whereas in older children (>10 years) FOXP3!, CMAF!and CD4! cells were more prevalent (Table 3).

Clinical characteristics. In general, favorable clinical parame-ters were associated with a more intense T lymphocyte infil-trate. Stages I/II were associated with high numbers of CD3!(median 748 cells/mm2 vs. 510 cells/mm2 in III/IV stages,p & 0.004, Mann-Whitney test), CD4! (median 209 cells/mm2 vs. 99 cells/mm2 in III/IV stages, P & 0.005, Mann-Whitney test) and CMAF! (median 94 cells/mm2 vs. 29cells/mm2 in III/IV stages, p & 0.003, Mann-Whitney test)lymphocytes. Conversely, children with '4IAA exhibited lownumbers of CD3! (median 457 cells/mm2 vs. 752 cells/mm2

with <4IAA, p < 0.0005, Mann-Whitney test), CD4! (me-dian 91 cells/mm2 vs. 209 cells/mm2 with <4IAA, p & 0.027,Mann-Whitney test), CMAF! (median 44 cells/mm2 vs. 94cells/mm2 with <4IAA, p & 0.032, Mann-Whitney test) andCD8! (median 111 cells/mm2 vs. 183 cells/mm2 with<4IAA, p & 0.008, Mann-Whitney test) lymphocytes in thetumor microenvironment.

Histopathological characteristics. MC subtype was associatedwith high numbers of CD8! (p & 0.049, Mann-Whitneytest), TIA1! (p & 0.036, Mann-Whitney test) and GranzymeB! (p & 0.019, Mann-Whitney test) lymphocytes, typical ofa cytotoxic profile, when compared with all other types. This

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1144 Tumor Microenvironment in Pediatric Classical Hodgkin Lymphoma


Table 1. Summary of clinical, histological and Epstein-Barr virus data at diagnosis and their associations with progression free survival inpediatric classical Hodgkin lymphoma cases

Variable Cases analyzed (%) 5-years PFS (%) Univariate analysis (p)

Age, years

# 10 27/100 (27) 78.0 0.7

> 10 73/100 (73) 78.9

Sex

Male 64/100 (64) 77.9 0.74

Female 36/100 (36) 79.4

Number of sites

Median (range) 58/95 (61.1) 83.6 0.07

# 4 37/95 (38.9) 68.6

> 4

Mediastinal mass

Yes 63/96 (65.6) 78.0 0.85

No 34/96 (34.4) 75.8

Stage

I 11/95 (11.6) 90.0 0.14

II 48/95 (50.5) 79.5

III 25/95 (26.3) 80.0

IV1 11/95 (11.6) 54.5

Extranodal disease

Yes 11/95 (11.6) 54.5 0.028

No 84/95 (88.4) 81.0

B symptoms

Yes 51/95 (53.7) 75.0 0.71

No 44/95 (46.3) 81.0

Clinical presentation

Favorable 50/95 (52.6) 83.0 0.16

Unfavorable 45/95 (47.4) 72.1

Leukopenia

Yes 11/96 (11.5) 50.0 0.034

No 85/96 (88.5) 80.0

Histopathological diagnosis

Nodular sclerosis 69/100 (69) 79.4 0.24

Mixed cellularity 23/100 (23) 61.9

Lymphocyte-depleted 1/100 (1) 100.0

Lymphocyte-rich 2/100 (2) 100.0

Unclassifiable 5/100 (5) 100.0

Granuloma

Yes 37/100 (37) 63.6 0.025

No 63/100 (63) 84.5

EBV association

Yes 43/96 (44.8) 86.1 0.082

No 53/96 (55.2) 69.2

1Lung compromised in five children; pericardium compromised in two children; long bones compromised in two children; bone marrowcompromised in two children; adrenal compromised in one child and liver compromised in one child.Abbreviations: PFS, progression free survival; EBV, Epstein-Barr virus.

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was independent of EBV status. Moreover, as previouslydescribed,28 MC was characterized by low numbers of CD4!lymphocytes (p & 0.048, Mann-Whitney test), high numbersof CD20! lymphocytes (p & 0.046, Mann-Whitney test) andCD4/CD20 ratio <1 (p & 0.005, Fisher’s test).

Conversely, NS subtype was characterized by high num-bers of CD4! (p & 0.037, Mann-Whitney test) and lownumbers of cytotoxic CD8! (p & 0.041, Mann-Whitneytest), TIA1! (p & 0.032, Mann-Whitney test) and GranzymeB! (p & 0.016, Mann-Whitney test) lymphocytes when com-pared with MC subtype (Supporting Information Table S2).

The interfollicular pattern was associated with high num-ber of CD8! (median 272 cells/mm2 vs. 143 cells/mm2 in ab-sence of this pattern, p & 0.024, Mann-Whitney test), TIA1!(median 152 cells/mm2 vs. 62 cells/mm2 in absence of thispattern, p & 0.037, Mann-Whitney test) and CD20! (median360 cells/mm2 vs. 168 cells/mm2 in absence of this pattern, p& 0.003, Mann-Whitney test) lymphocytes.

Epstein-Barr virus. EBV! cases displayed a predominantlycytotoxic microenvironment profile characterized by highnumbers of CD8! (p & 0.001, Mann-Whitney test), TIA1!(p & 0.002, Mann-Whitney test), Granzyme B! (p & 0.002,

Mann-Whitney test), as well as TBET! (p & 0.031, Mann-Whitney test) lymphocytes. There was no difference in rela-tion to the number of Treg cells (p & 0.1, Mann-Whitneytest). Detailed results are shown in Table 3.

Characteristics of the tumor microenvironment are

associated with overall survival and prognosisOS at 60 months was 89.4%. Clinical features associated withpoor OS were absence of EBV-association (p & 0.029, log-rank) and low CD3! lymphocytes number (<25th percen-tile) (p & 0.04, log-rank). A trend for unfavorable survivalwas observed in cases with low CD20! lymphocytes number(<25th percentile) (p & 0.06, log-rank) (Supporting Informa-tion Fig. S2). All variables lost significance in the multivariateCox analysis.

PFS at 60 months was 78.6%. Clinical features associatedwith poor PFS were extranodal disease (p & 0.028, log-rank)and leukopenia (p & 0.034, log-rank) (Table 1). EBV-associ-ated cases showed a trend to a better PFS (p & 0.082, log-rank). Regarding the tumor microenvironment variables,worse PFS was observed in children with granulomas (p &0.026, log-rank) (Table 2), low CD3! lymphocytes number(<25th percentile) (p & 0.037, log-rank) and high Granzyme

Figure 1. (a) Example of cHL case with high number of CD3! lymphocytes in the tumor microenvironment, as described for adult cases(original magnification %10). (b) Example of case with high number of CD20! lymphocytes in the tumor microenvironment. This featurewas observed frequently in young children (#10 years) (original magnification %10). (c) Example of cHL case with high number of CD8!lymphocytes in the tumor microenvironment. As CD20! lymphocytes, this feature was observed frequently in young children (#10 years)(original magnification %10). (d) Example of cHL case with high number of FOXP3! lymphocytes in the tumor microenvironment(lymphocytes with brown color in the nucleus) (original magnification %40). (e) Example of cHL case with high number of TIA1!lymphocytes in the tumor microenvironment. It is possible to see that some TIA1! lymphocytes touch a Hodgkin cell (originalmagnification %40). (f) Example of cHL case with high number of benign Ki67! lymphocytes in the tumor microenvironment (originalmagnification %10). In detail, it is possible to see the typical brown color in the nuclei of the lymphocytes (original magnification %40).[Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

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Table 2. Description of the lymphocyte subsets in the tumor microenvironment of pediatric classical Hodgkin lymphoma and theirassociation with progression free survival

Variable Labeled cells/mm2 Cases analyzed (%) 5-Years PFS (%) Univariate analysis (p)

CD3 (cells/mm2)

Range 70 to 1187

(Mean/Median) (643.43/645)

# 451 (25th percentile) 22/83 (26.5) 60.0 0.037

> 451 (25th percentile) 61/83 (73.5) 80.4

# 645 (50th percentile) 42/83 (50.6) 71.8 0.37

> 645 (50th percentile) 41/83 (49.4) 78.4

CD4 (cells/mm2)

Range 1 to 624

(Mean/Median) (180.02/155)

# 70 (25th percentile) 21/83 (25.3) 73.7 0.96

> 70 (25th percentile) 62/83 (74.7) 73.7

# 155 (50th percentile) 42/83 (50.6) 71.1 0.63

> 155 (50th percentile) 41/83 (49.4) 76.3

FOXP3 (cells/mm2)

Range 1 to 513

(Mean/Median) (101.64/49)

# 12 (25th percentile) 21/84 (25) 81 0.50

> 12 (25th percentile) 63/84 (75) 73.7

# 49 (50th percentile) 44/84 (52.4) 76.7 0.83

> 49 (50th percentile) 40/84 (47.6) 74.3

CMAF (cells/mm2)

Range 3 to 498


# 20.75 (25th percentile) 19/76 (25) 83.3 0.31

> 20.75 (25th percentile) 57/76 (75) 71.2

# 68.5 (50th percentile) 38/76 (50) 80.0 0.23

> 68.5 (50th percentile) 38/76 (50) 68.6

TBET (cells/mm2)

Range 2 to 269

(Mean/Median) (54.93/ 32)

# 15.5 (25th percentile) 20/81 (24.7) 66.7 0.47

> 15.5 (25th percentile) 61/81 (75.3) 75.0

# 32 (50th percentile) 41/81 (50.6) 71.8 0.83

> 32 (50th percentile) 40/81 (49.4) 74.3

CD8 (cells/mm2)

Range 11 to 847

(Mean/Median) (185.26/143)

# 76 (25th percentile) 22/86 (25.6) 71.4 0.64

> 76 (25th percentile) 64/86 (74.4) 76.3

# 143 (50th percentile) 44/86 (51.2) 74.4 0.94

> 143 (50th percentile) 42/86 (48.8) 75.7

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B! lymphocytes number (>25th percentile) (p & 0.045, log-rank) (Table 2, Fig. 3).

A trend towards a worse PFS was observed for MC sub-type (p & 0.057, log-rank), high TIA1! lymphocytes number(>25th percentile) (p & 0.08, log-rank) and high number ofKi67! non-neoplastic lymphocytes (>25th percentile) (p &0.093, log-rank) (Table 2) (Fig. 3). In the Cox regression,extranodal disease (p & 0.016) and the number of GranzymeB! lymphocytes (p & 0.04) maintained an independentprognostic impact (Supporting Information Table S3).

EBV infection of HRS cells may modulate the prognostic

role of the tumor microenvironment

Given that EBV may be able to modulate the tumor microen-vironment composition and local EBV-specific immunity,18,29

the impact of these variables on survival was investigated

according to EBV-status. In the EBV-negative group, a worsePFS was observed for MC subtype (p & 0.009, log-rank), andfor cases with TIA1! lymphocytes > 25th percentile (p &0.044, log-rank) and Granzyme B! lymphocytes > 25th per-centile (p & 0.04, log-rank). Although extranodal disease isnot a microenvironment variable, it is important to note thatthe observed worse PFS for patients presenting with extrano-dal disease was restricted to EBV-negative patients (p &0.028, log-rank) (Supporting Information Table S4). In Coxregression, MC subtype (p & 0.005), number of cytotoxiccells (p & 0.024) and extranodal disease (p & 0.002) main-tained their prognostic impact in EBV-negative cases (Sup-porting Information Table S5).

On the other hand, in EBV! cases, a worse PFS wasfound in children with granulomas (p & 0.035, log-rank),FOXP3! lymphocytes > 50th percentile (p & 0.046, log-

Table 2. Description of the lymphocyte subsets in the tumor microenvironment of pediatric classical Hodgkin lymphoma and their associationwith progression free survival (Continued)

Variable Labeled cells/mm2 Cases analyzed (%) 5-Years PFS (%) Univariate analysis (p)

TIA1 (cells/mm2)

Range 1 to 396


# 39 (25th percentile) 20/81 (24.7) 89.5 0.08

> 39 (25th percentile) 61/81 (75.3) 69.1

# 69 (50th percentile) 41/81 (50.6) 78.4 0.45

> 69 (50th percentile) 40/81 (49.4) 70.3

Granzyme B (cells/mm2)

Range 1 to 451


# 4 (25th percentile) 24/85 (28.2) 90.9 0.045

> 4 (25th percentile) 61/85 (71.8) 69.6

# 11 (50th percentile) 44/85 (51.8) 77.5 0.63

> 11 (50th percentile) 41/85 (48.2) 73.7

CD20 (cells/mm2)

Range 1 to 885

(Mean/Median) (240.86/196)

# 79 (25th percentile) 21/83 (25.3) 73.7 0.75

> 79 (25th percentile) 62/83 (74.7) 75.4

# 196 (50th percentile) 42/83 (50.6) 79.5 0.47

> 196 (50th percentile) 41/83 (49.4) 70.3

Ki67! Lymphocytes (cells/mm2)

Range 3 to 352


# 44 (25th percentile) 22/85 (25.9) 86.4 0.093

> 44 (25th percentile) 63/85 (74.1) 69.6

# 91 (50th percentile) 43/85 (50.6) 76.2 0.58

> 91 (50th percentile) 42/85 (49.4) 72.2

Abbreviation: PFS, progression free survival.

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rank), FOXP3/CD8 ratio >1 (p & 0.021, log-rank), FOXP3/TIA1 ratio >1 (p & 0.06, log-rank) and TBET/CMAF ratio>1 (p & 0.017, log-rank) (Supporting Information Table S4).Because of the small number of children in this group, Coxanalysis was not performed.

DiscussionThe tumor microenvironment in cHL has been considered tobe a manifestation of host immune reactions to malignantcells.2 In this context, it is important to note that as yet all cHLtumor microenvironment studies were performed with adultsor a mix of adolescents and adults and that it is not clear if chil-

dren and adolescents have a particular composition of tumormicroenvironment. This is a pertinent point because immuno-logical differences exist between children and adults.10,11 It isconceivable that such differences could affect the immunologi-cal response to HRS cells or to viral antigens in EBV! cases.

In our pediatric group, we have observed higher numbersof CD3! over CD20! lymphocytes in the tumor microenvir-onment, in line with previous studies. However, an analysisby T cell populations showed that B lymphocytes were morefrequent than any of the T cell subsets investigated, includingCD4! cells. Thus, this first study of pediatric cHL suggeststhat the tumor microenvironment composition is indeed dif-ferent from that observed and adults with cHL, where CD4!cells are more prevalent than CD20! lymphocytes2,4,30 andthat the described predominance of infiltrating CD4! Tcells3,5,8 is not an invariable attribute of cHL.

This distinct feature of pediatric cHL may reflect thehigher number of CD20! in relation to CD4! lymphocytesobserved in peripheral blood of healthy children, when com-pared to adults.12,13,21 The quantitative contribution ofCD20! lymphocytes to the cHL microenvironment is start-ing to attract attention, since this lymphocyte subset has beenassociated with a favorable response to therapy.18,31 In ourstudy, the CD20! population showed a marginal impact onoverall survival. A more detailed characterization of intratu-moral B-cells, for example with reference to B-1 and B-2cells, will be required to fully appreciate any effects of B-cellson outcome in pediatric cHL.

It is possible that the shift from a cytotoxic/Th1 tumormicroenvironment to a more regulatory/Th2 profile, asobserved in older children in our study, may mirror thephysiological behavior of lymphocyte populations in the

Figure 2. Box-plot graph showing the numerical distribution ofeach lymphocyte population studied in the tumormicroenvironment of pediatric classical Hodgkin lymphoma.

Table 3. Description of the lymphocyte subsets by age-group and EBV-association in pediatric classical Hodgkin lymphoma

Variable

Age group EBV

#10 years1 (median) '10 years1 (median) p Positive1 (median) Negative1 (median) p

CD3! cells 161–1170 (803) 70–1187 (621) 0.025 234–1170 (700) 70–1187 (664) 0.4

CD4! cells 14–478 (155) 1–624 (167) 0.8 1–434 (187) 3–6249 (136) 0.9

FOXP3! cells 1–416 (41) 1–513 (79) 0.3 2–387 (79) 1–51310 (44) 0.1

TBET! cells 2–264 (58) 4–2692 (32) 0.045 2–269 (61) 4–26411 (29) 0.03

CMAF! cells 3–4983 (64) 3–387 (70) 0.9 3–387 (67) 3–498 (71) 0.9

CD8! cells 41–847 (272) 11–533 (170) 0.016 49–847 (264) 11–533 (132) 0.001

TIA1! cells 36–396 (143) 1–3964 (58) 0.008 22–396 (152) 1–35812 (61) 0.002

GRANZYME B! cells 1–1425 (12) 1–4516 (17) 0.4 1–451 (32) 1–88 (10) 0.002

CD20! cells 44–8857 (222) 1–8798 (181) 0.1 20–698 (258) 1–88513 (190) 0.1

The p value is from Mann-Whitney Test.1The numbers represent labeled cells/mm2 and the numbers in the bracket represent the median value. 2In this range, there are three outlier caseswith 167, 201 and 269 TBET! cells/mm2. 3In this range, there is one outlier case with 498 CMAF! cells/mm2. 4In this range, there are four outliercases with 325, 360, 376 and 396 TIA1! cells/mm2. 5In this range, there is one outlier case with 142 Granzyme B! cells/mm2. 6In this range,there are four outlier cases with 90, 123, 211 and 451 Granzyme B ! cells/mm2. 7In this range, there is one outlier case with 885 CD20! cells/mm2. 8In this range, there are two outlier cases with 783 and 879 CD20! cells/mm2. 9In this range, there is one outlier case with 624 CD4! cells/mm2. 10In this range, there are four outlier cases with 349, 416, 457 and 513 FOXP3! cells/mm2. 11In this range, there are three outlier cases with114, 184 and 264 TBET! cells/mm2. 12In this range, there are two outlier cases with 325 and 358 TIA1! cells/mm2. 13In this range, there are twooutlier cases with 783 and 885 CD20! cells/mm2.Abbreviation: EBV, Epstein-Barr virus.

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periphery. In line with this, Faria et al. showed that age-related changes in peripheral lymphocyte subsets in healthyBrazilian populations are not progressive and equally steadyfor all cell populations, but instead show an oscillatorybehavior which is characteristic for each cell population indifferent age groups.21 Previous studies have emphasized therole of cytokines and chemokines produced by the neoplasticcells in shaping the microenvironment of cHL. Our resultsnow raise the possibility that physiological and age-relatedchanges of the immune system may also modulate the tumormicroenvironment in pediatric cHL.

In our cases, an intense T cell infiltrate was associatedwith favorable disease presentation (low disease stages andtumor burden). In colorectal cancer it is well recognized thathigh numbers of intratumoral CD3! lymphocytes are associ-ated with a less aggressive disease course.32,33 In cHL such anassociation has not been confirmed and may reflect the pres-ence of a systemic mechanism of immunosurveillance.

In this pediatric series, we were not able to confirm thevalue of FOXP3! Treg population for prediction of favorableoutcome. As in adults,5–7 higher numbers of cytotoxic cellswere independently associated with worse PFS.

The positive correlation between the number of benignKi67! lymphocytes and different lymphocyte subsets, described

for the first time in this study, indicates that lymphocytes fromtumor microenvironment are able to proliferate in situ inresponse to antigens and/or cytokine stimuli. High numbers ofKi67! lymphocytes showed a borderline association with unfav-orable outcome in univariate analysis. This is in apparent con-trast to the positive prognostic effect of a high CD3! T-cellcount and suggests that proliferation may be restricted to T-cellsubsets with adverse prognostic impact. Additional studies arerequired to establish the phenotype and functional status of theKi67! benign lymphocytes.

This pediatric series was composed of comparable num-bers of EBV! and EBV" cases, allowing an analysis of therole of the EBV in modulating the immune response at themicroenvironment level. Although previous in vitro studiesshowed that EBV can induce the production of cytokinesinvolved in the Treg-CD4! cell migration,34 we did notobserve differences in the number of CD4!, FOXP3! andCMAF! cells between EBV! and EBV" cases. On the otherhand, EBV! cases were characterized by high numbers ofintratumoral CD8!, TIA1!, Granzyme B! and TBET! cells.This is in line with seminal research that showed that, com-pared with EBV" cases, EBV! cHL expresses significantlyhigher levels of MCH Class I, an intact antigen presentationmachinery and higher numbers of intratumoral activated

Figure 3. Kaplan-Meier curves of the variables associated with the progression-free survival in pediatric classical Hodgkin lymphoma.(a) Mixed cellularity; (b) Granuloma; (c) CD3! lymphocyte >451/mm2 (25th percentile); (d) Granzyme B! lymphocytes >39/mm2 (25thpercentile); (e) Ki67! lymphocytes >44/mm2 (25th percentile). [Color figure can be viewed in the online issue, which is available atwileyonlinelibrary.com.]

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cytotoxic T lymphocytes.35–37 Recently, Chetaille et al.,18 usingsamples of adults and children, described a molecular signa-ture of EBV! cHL that is characterized by genes associatedwith Th1 and antiviral responses, which is validated in ourexclusively pediatric population. However, in adults, it is pos-sible that cytotoxic T cells (in parts responsible for this antivi-ral signature) are not effective in the immune response againstEBV in the HRS cells, as previously shown by Frisan et al.29

In addition, acquisition of genetic alterations by HRS cells canresult in resistance to apoptosis and therefore resistance to cy-totoxic T cell-mediated killing.38–40

In the EBV! group, characterized by a better therapeuticresponse, a worse PFS was observed in cases with high numberof FOXP3 lymphocytes, FOXP3/CD8 ratio >1 and FOXP3/TIA1 ratio >1 suggesting that: (1) the immune response againstEBV is mediated by CD8! cytotoxic lymphocytes and (2)FOXP3! lymphocytes are inhibiting the cytotoxic responsedirected against EBV, as demonstrated by several studies.19,41,42

EBV is able to modulate immune escape mechanisms2,17,35,43,44

and several studies point to an adverse prognosis for EBV-asso-ciated adult cHL.45–47 Nevertheless, it appears likely that in pedi-atric cHL, the interaction between EBV! HRS and the immunesystem follows a different scenario. In fact, a favorable outcomewas described for EBV! young cHL patients,48,49 including theseries reported here, suggesting that in children with EBV!

cHL, EBV may elicit an effective immune response, which isnegatively modulated by a suppressor microenvironment.42,50

Cytotoxic T-cells are an adverse factor in EBV" but not inEBV! cases. On the contrary, FOXP3! cells had a negativeprognostic effect in EBV! but not in EBV" cases. This becameparticularly evident when examining the ratio of FOXP3! Tregover cytotoxic effector cell populations. This reinforces our hy-pothesis that in pediatric patients, an EBV-specific immuneresponse may be mounted locally and that inhibition of thisimmune response by FOXP3! cells may negatively affect out-come. If confirmed, this would have significant implications forthe application of microenvironment targeted therapies in thepediatric settings.

We are, nevertheless, aware that the number of cases inthis study imposes a limitation in relation to the prognosticimpact of the described variables. However, we think our se-ries of sequential cases with similar distribution in relation toEBV-status is appropriate for the immunological evaluationperformed here.

In conclusion, this study suggests that the tumor microen-vironment of pediatric cHL has particular characteristics, notonly with respect to the number of lymphocytes, but also inrelation to the functional status of these cells. Validationstudies are necessary to confirm the prognostic impact of thevariables described in this study.

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