Estudo de dois membros da família das proteínas da...

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal

Estudo de dois membros da família das

proteínas da membrana externa de

Helicobacter pylori, hopM e hopN

Andrea Sofia Rebelo Santos

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

2011

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal

Estudo de dois membros da família das

proteínas da membrana externa de

Helicobacter pylori, hopM e hopN

Andrea Sofia Rebelo Santos

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

Dissertação orientada pela Doutora Mónica Oleastro do Instituto

Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e pelo Professor Doutor Pedro

Silva da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.

2011

A presente dissertação não foi redigida segundo o novo Acordo

Ortográfico da Língua Portuguesa por opção do autor.

Índice

ÍNDICE:

Agradecimentos……………………………………………………………………………………....i

Lista de Abreviaturas…………………………………………………………………………….…ii

Lista de Figuras………………………………………………………………..……………………iii

Lista de Tabelas……………………………………………………………………………………..iv

Resumo…………………………………………………………………………..……………………v

Abstract……………………………………………………………………………………………….vi

Capítulo 1: Introdução……………………………………………………………………………1

1. Helicobacter pylori- considerações gerais………..…………….…………………….…..1

2. Características da infecção por Helicobacter pylori…..…………………….……….….1

3. Diversidade Genética de Helicobacter pylori…………………………………….……..…2

4. Diversidade Geográfica de Helicobacter pylori…………………………………….…..…3

5. Factores de virulência de Helicobacter pylori……………………………………..……...4

5.1. Citotoxina vacuolizanteVacA…………………………………………………………….4

5.2. Ilhéu de patogenicidade cag……………………………………………………………..5

5.3. Proteínas da membrana externa………………………………………………………..5

5.3.1 Mecanismos de regulação da expressão das proteínas de membrana externa…7

Capítulo 2: Objectivos……………………………………………………………………………9

Capítulo3: Materiais e Métodos………………………………………………………………10

1. Estirpes de Helicobacter pylori e material genómico……………………………..…...10

Índice

2. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN…………………….....10

3. Avaliação da variabilidade genética, análise filogenética e parâmetros

evolutivos dos genes hopM e hopN…………………………………….…………………12

4. Análise Estatística…………………………………………………………………………….12

Capítulo 4: Resultados………………………………………………………………………….13

1. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN………………...……..13

1.1. Distribuição dos genes hopM e hopN por região geográfica…………………………..….14

1.2. Distribuição dos genes hopM e hopN por patologia………………………………………..14

1.3. Associação de hopM e hopN com o genótipo de virulência……………………………… 16

2. Análise filogenétiva, avaliação da variabilidade e parâmetros evolutivos dos

genes hopM e hopN……………………………………………………………………………....16

3. Variação Alélica………………………………………………………………………………….20

3.1 Distribuição dos alelos por gene e origem geográfica…………………………………22

3.2 Distribuição dos alelos dos genes hopM e hopN de acordo com a patologia

e perfil de virulência………………………………………………………………………………23

3.2.1 Distribuição dos alelos por patologia…………………………………………………..23

3.2.2 Distribuição dos alelos por perfil de virulência………………………………………..24

Capítulo 5: Discussão e Conclusão……………………………………………….…..26

Bibliografia…………………………………………………………………...……………….30

Anexos…………………………………………………………………………………….…….37

Agradecimentos

Andrea Santos i

Em primeiro lugar, não poderia deixar de agrader à Mónica Oleastro pela oportunidade

dada para a realização deste trabalho, pela orientação desta tese e pelo apoio científico

proporcionado ao longo destes 7 anos de trabalho.

Ao Professor Pedro Silva pela sua disponibilidade e ajuda nos momentos difíceis. A sua

orientação e a luz que trouxe à minha mente foram sem dúvida essenciais para a

elaboração desta tese.

Ao meu amigo e colega de trabalho João Benoliel, pela amizade, ajuda e apoio

oferecidos ao longo destes 7 anos de convivência. Sem ti, todo este trabalho seria bem mais

difícil e certamente ainda não teria terminado. Obrigada pela paciência para ouvires os meus

desabafos, pelas inúmeras palavras de incentivo e por assegurares o laboratório por mim,

libertando-me para a dedicação “quase” exclusiva à minha tese.

À Rita Cordeiro pela sua amizade, dedicação, orientação e pela imensa paciência

demonstradas durante a elaboração deste trabalho. Obrigada pela tua disponibilidade e

conhecimentos transmitidos durante todo o processo de desenvolvimento desta tese. Sem ti

nada disto seria possível, MUITO OBRIGADA!!

À Alexandra Nunes pela sua disponibilidade e ajuda na interpretação de alguns

resultados.

À Ana Pelerito, pela amizade, pelos sorrisos e momentos de descontracção

proporcionados nos momentos de trabalho.

A todos os meus amigos pela compreensão, apoio e amizade. Obrigada por fazerem

parte da minha vida!

Por fim, mas seguramente com maior importância…

Ao Nuno, por todo o amor, carinho e compreensão mas principalmente pelo seu grande

apoio e força nos momentos mais difíceis. És o meu porto de abrigo, quem me apazigua e

acalma…Obrigada meu querido!

À minha querida maninha, pelo seu carinho e incentivo ao longo de toda a nossa vida.

Aos meus queridos Pais, que ao longo de toda a minha caminhada têm estado ao meu

lado, incentivando e apoiando cada passo que tenho dado. Sem vocês nada disto seria

possível e agradeço todos os sacrifícos que fizeram para que chegasse até aqui…. Vocês

são o exemplo que pretendo seguir na minha vida… Este trabalho é dedicado a vocês!

Lista de Abreviaturas

Andrea Santos ii

Lista de Abreviaturas:

ADN Ácido Desoxirribonucleico

Ba bA Blood group antigen binding adhesin

cagA cytotoxin associated gene A

cag PAI ilhéu de patogenicidade cag

CG Cancro gástrico

CT Citosina/Timina

DDI Departamento de doenças infecciosas

EUA Estados Unidos da América

G Gastrite

G+C Guanina+Citosina

H.pylori Helicobacter pylori

IL-8 Interleucina-8

INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

Ka Substituições não sinónimas

Kb kilobases

kDA Kilodaltons

Ks Substituições sinónimas

Leb Lewis B Blood Group

MALT Mucosa associated lymphoid tissue

MLST Multilocus sequence typing

min. Minuto

N.D. Não definido

OipA Outer inflammatory protein A

OMPs Outer membrane protein

ORF Open reading frame

pb Pares de bases

PCR Polimerase chain reaction

s Segundo

SabA Sialic acid binding adhesin

SST4 Sistema de secreção do tipo IV

UP Úlcera péptica

vacA Vacuolating cytotoxin gene A

Lista de Figuras

Andrea Santos iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Análise filogenética das cinco famílias de parólogos da estirpe de referência da

estirpe de referência J99.-------------------------------------------------------------------------------------6

Figura 2: Distribuição do número de cópias e localização genómica de hopM e hopN, por

região geográfica.------------------------------------------------------------------------------------------------14

Figura 3: Frequência dos genes hopM e hopN nas estirpes de Helicobacter pylori de origem

ocidental e asiática de acordo com a patologia.---------------------------------------------------------15

Figura 4: Análise filogenética de 379 sequências de Helicobacter pylori, 147 do gene hopM

e 232 do gene hopN.------------------------------------------------------------------------------------------17

Figura 5: Representação gráfica da similaridade entre as 379 sequências de nucleótidos

dos genes hopM e hopN de estirpes de Helicobacter pylori.-----------------------------------------18

Figura 6: Representação gráfica da similaridade entre 147 sequências de nucleótidos do

gene hopM, identificando os 4 alelos.--------------------------------------------------------------------21

Figura 7: Alelos hopM e hopN. (A) Alinhamento representativo das variações ao nível das

sequências de aminoácidos do segmento 4 de hopM e hopN. (B) Esquema representativo

dos 4 alelos demonstrando que as variantes AIII e AIV são putativos recombinantes das

variantes AI e AII. -----------------------------------------------------------------------------------------------21

Figura 8: Gráficos de similaridade entre sequências de nucleótidos do gene hopM por

variante alélica. --------------------------------------------------------------------------------------------------21

Figura 9: Distribuição dos alelos por gene, na população geral. -----------------------------------22

Figura 10: Distribuição dos alelos de cada gene de acordo com a origem geográfica das

estirpes de Helicobacter pylori em estudo. ---------------------------------------------------------------22

Lista de Figuras

Andrea Santos iii

Figura 11: Frequência das quatro variantes alélicas de acordo com a patologia, na

população geral (A) e por origem geografia (B e C). ------------------------------------------------23

Figura 12: Frequência dos alelos hopM+hopN de acordo com genótipo de virulência da

estirpe na população geral. -----------------------------------------------------------------------------------24

Figura 13: Distribuição das quatro variantes alélicas na população ocidental, considerando

os genes em conjunto (A) e separados (B e C) de acordo com o genótipo de virulência das

estirpes de Helicobacter pylori. ------------------------------------------------------------------------------25

Lista de Tabelas

Andrea Santos iV

LISTA DE TABELAS:

Tabela 1: Primers utilizados na amplificação e sequenciação dos loci hopM e hopN. -------11

Tabela 2: Análise das distâncias moleculares, substituições sinónimas e não sinónimas para

as sequências correspondentes ao gene completo e segmentos 1,2,3 e 4 dos genes hopM e

hopN. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------19

Tabela 3: Análise das percentagens de identidade obtidas entre as sequências do segmento

4 de cada um das variantes alélicas de hopM e hopN. -----------------------------------------------20

Resumo

Andrea Santos V

RESUMO

Neste trabalho pretendeu-se estudar a diversidade genética e evolução dos genes hopM

e hopN, que codificam proteínas de membrana externa de H. pylori, bem como contribuir

para o esclarecimento do seu papel na virulência desta bactéria, através da identificação de

possíveis associações a patologias específicas e a marcadores moleculares de virulência

(cagA e vacAs1).

Foi utilizado um painel de 234 estirpes clínicas e sequências de 23 estirpes de referência,

isoladas de doentes de origem geográfica diferente e com diversas patologias gástricas.

A reconstrução filogenética destes dois genes sugere evolução divergente entre eles. Em

cada um dos genes, foram identificados dois clusters predominantes, sendo a segregação

entre eles motivada pela origem geográfica das estirpes, havendo uma diferenciação clara

entre as estirpes de origem ocidental e as de origem asiática.

Foi observada diversidade relativamente ao número de cópias de cada gene e à sua

localização genómica, sendo esta diferença notória entre grupos geográficos diferentes. Na

população ocidental ambos os genótipos, de cópia única e dupla cópia (mesmo gene ou

genes diferentes), foram observados. Contrariamente, na população asiática apenas foram

observados os genótipos de cópia única, enquanto no grupo africano apenas os genótipos

de dupla cópia foram apresentados.

Apesar de nenhum destes genótipos ser marcador da doença gastroduodenal, observou-

se uma associação estatisticamente significativa, na população ocidental, entre a dupla

cópia hopN e o genótipo mais virulento, e entre a dupla cópia hopM e o genótipo menos

virulento. No grupo de origem oriental, não se observou nenhuma associação

estatisticamente significativa com o perfil de virulência da estirpe.

A análise das sequências dos dois genes sugere a sua regulação por variação de fase e

ainda a possibilidade da ocorrência de fenómenos de recombinação intragenómica ou

intergenómica, podendo os mecanismos de duplicação ou conversão génica estar

implicados na regulação da sua expressão.

Os genes hopM e hopN revelaram um elevado grau de similaridade entre si, com uma

distância molecular de 0,146±0,006 ao nível da sequência de nucleótidos e de 0,161±0,011

ao nível da sequência de aminoácidos. Dentro de cada gene, verificou-se um grau de

conservação ainda superior, com distâncias moleculares e taxas de substituições de

nucleótidos muito similares, quando comparados os valores obtidos para cada gene.

Verificou-se ainda uma taxa superior de substituições sinónimas (Ks) do que não sinónimas

(Ka), sendo a razão Ka/Ks inferior a um, o que aponta para a existência de uma pressão

Resumo

Andrea Santos V

evolutiva para a conservação destes genes, através da acção da selecção negativa ou

purificadora.

Foram identificadas quatro variantes alélicas, comuns a ambos os genes, designadas por

AI, AII, AIII e AIV. No geral, foram observados dois alelos predominantes, os alelos AI

(39,2%) e o AII (42%,), enquanto os alelos AIII e AIV, putativos recombinantes dos alelos AI

e AII, foram observados com menor frequência nas estirpes estudadas (12,9% e 5,8%,

respectivamente). Na população ocidental e africana todos os alelos foram observados,

sendo o mais prevalente o alelo AI (49,8% e 69,6%, respectivamente). Nestas populações

não se verificou nenhuma associação entre as variantes alélicas e a patologia. No entanto,

na população ocidental, os alelos AII e AIII foram significativamente associados com o

genótipo de virulência da estirpe, mais concretamente o alelo AII com o genótipo menos

virulento e o AIII com o genótipo mais virulento. Na população asiática, o alelo AII foi o mais

prevalente (85,2%) e o alelo AIV não foi observado. Nesta população, não se verificou

nenhuma associação com suporte estatístico, entre as variantes alélicas e a patologia

gástrica ou o grau de virulência da estirpe.

Globalmente estes resultados sugerem que hopM e hopN fazem parte do grupo de genes

que codificam OMPs de H. pylori implicadas tanto na interacção da bactéria com o seu

hospedeiro humano, como na variação antigénica, contribuindo para a persistência e

sucesso da infecção. Mais, as variantes alélicas podem constituir biomarcadores de

virulência da estirpe em determinadas populações.

Palavras-chave: Helicobacter pylori; OMPs; hopM; hopN.

Abstract

Andrea Santos vi

ABSTRACT

This work aimed to study the genetic diversity and evolution of hopM and hopN genes,

which encode outer membrane proteins of H. pylori, as well as contribute to the clarification

of its role in the virulence of this bacterium, by identifying possible associations to specific

diseases and virulence markers (cagA and vacAs1).

We used a panel of 234 clinical strains and of 23 reference strains sequences isolated

from patients from different geographical origins and presenting different gastroduodenal

pathologies. The phylogenetic reconstruction of these two genes suggests a divergent

evolution between them. It also revealed a geographic segregation in each gene, with two

dominant clusters, with a clear differentiation among strains of Western and East Asian

origin.

Diversity was observed regarding the number of copies and their genomic localization,

with East Asian and Western strains presenting different genotypes. In the Western strains

both, the single and double copy genotypes were observed. In contrast, in the East Asian

group, only the single copy was presented, while in the African group only the double copy

genotype was observed.

While no association was found between these genotypes and gastroduodenal disease,

statistically significant associations between the hopN double copy genotype and the more

virulent profile, and between the hopM double copy genotype and the less virulent profile,

were observed in the Western group. In the East Asian group, there was no association

between hopM/hopN genotypes and the virulence profile of the strain.

The sequence analysis of these genes suggests regulation by phase variation. It also

indicates possible recombination events, leading to gene duplication or hopM/hopN

conversion which may be implicated in the regulation of these genes as well.

The hopM and hopN genes revealed a high degree of similarity between them, with a

moelcular distance of 0,146±0,006 at nucleotide level and of 0,161±0,011 at the aminoacid

level. Within each gene, there was an even higher degree of conservation, with very close

molecular distances and rates of nucleotide substitutions, when comparing the values

obtained for each gene. It was observed a higher level of synonymous substitutions (Ks) than

non-synonymous (Ka), and the ratio Ka/Ks<1, suggests an evolutionary pressure to maintain

the two genes by negative or purifying selection.

Four allelic variantes were identified in both genes and in all strains studied although with

different frequencies. In general, two dominant alleles were observed, alleles AI (39,3%) and

AII (42%), and two less predominant, putative recombinants of the dominant variants, alleles

Abstract

Andrea Santos vi

AIII (12,9%) e AIV (5,8%). In Western and in African strains all the alleles were observed,

althoug the AI allele was the most frequently found (49,8% and 69,6%, respectively). In these

populations, there were no correlation between any allele and disease. However in the

Western group, AII and AIII alleles were statiscally associated with the virulence genotype of

the strain, more specifically, the AII allele with the less virulent genotype and AIII with the

most virulent genotype. In East Asian strains, the allele AII was the most prevalent (85,2%)

and the allele AIV was not observed. In this group, despite the apparent associations

between some allelic variants and certain diseases, no statistical association was observed,

nor between hopM/hopN alleles and the virulence genotype of the strain.

Overall, the results of this study suggest that hopM and hopN are good candidates to be

part of the pool of H. pylori OMPs implicated in host-bacteria interface and also contributing

to the generation of antigenic variability, and thus involved in persistence and success of H.

pylori infection. Moreover, some allelic variants may constitute biomarkers of the virulence of

the strain in some populations.

Keywords: Helicobacter pylori; OMPs; hopM; hopN.

Introdução

Andrea Santos

1

Capítulo1: Introdução

1. Helicobacter pylori- Considerações gerais

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria Gram negativa espiralada que coloniza o

estômago humano [1,2]. Possui cinco a sete flagelos unipolares com bainha e extremidades

bulbares [3,4], essenciais para a motilidade e sobrevivência no estômago.

A primeira referência a esta bactéria, remonta a 1893 por Bizzozero, o qual descreve a

presença de “espiroquetas” no estômago de gatos e cães [5,6]. Desde essa data e até aos

anos oitenta, vários relatos foram feitos relativamente à presença deste microrganismo em

tecido gástrico, nomeadamente de doentes com úlcera péptica e cancro gástrico ou de

amostras colhidas post-mortem [4,5,7]. Só em 1983, o gastrenterologista Barry Marshall e o

patologista Robert Warren conseguem a primeira cultura bacteriana a partir de uma amostra

gástrica. Em 1989, é então criado o género Helicobacter [3,8].

Este género é actualmente composto por mais de 27 espécies [9,10] todas microaerófilas

[9]. A maioria das espécies são catalase e oxidase positivas e algumas, como H. pylori, são

também urease positiva [9]. A colonização do estômago e do tracto intestinal pelo género

Helicobacter é ubiquitária no reino animal, sendo as espécies intestinais incapazes de

colonizar o estômago e vice-versa. Há assim uma divisão em dois grupos dentro do género,

definidos de acordo com o seu tropismo para determinados órgãos [11].

H.pylori tem como nicho o epitélio gástrico humano e de outros primatas [11]. Apesar de

conseguir sobreviver em condições de pH bastante ácidas (pH<5), normalmente coloniza o

antro gástrico (parte inferior) onde a produção de ácido é menor. A sobrevivência deste

microrganismo nesta gama de pH deve-se à presença da enzima urease, que hidrolisa a

ureia em amoníaco e dióxido de carbono, levando à tamponização do microambiente que

rodeia a bactéria [2]. Mais concretamente, H.pylori localiza-se abaixo da camada de muco, à

superfície das células epiteliais, podendo encontrar-se aderente ou móvel e utiliza o pH do

muco como orientação quimiotática [2,12]. Dados mais recentes sugerem que pode também

invadir as células da mucosa gástrica, alternando entre o espaço intra e extracelular, aptidão

que pode estar implicada na persistência e patogenicidade de H.pylori [13].

2.Características da Infecção por Helicobacter pylori

O conhecimento actual sugere que a aquisição de H. pylori ocorre predominantemente na

infância, sendo o contágio intrafamiliar a forma mais comum de transmissão [14-16]. Uma

vez estabelecida no estômago, a infecção irá persistir durante toda a vida do hospedeiro se

não for tratada, levando ao aparecimento de doença gástrica severa, com as manifestações

clínicas a sobrevir sobretudo na idade adulta [17].

Introdução

Andrea Santos

2

Os principais factores de risco relacionados com a aquisição da infecção incluem práticas

sanitárias inadequadas, classe social mais baixa, elevada densidade populacional, entre

outros [14,17-19]. A prevalência mundial da infecção tem por isso uma variação bastante

acentuada entre países desenvolvidos e em desenvolvimento. Nos países em

desenvolvimento a taxa de infecção ronda os 50% nas crianças e mais de 90% dos adultos,

enquanto nos países desenvolvidos tem vindo a diminuir, atingindo cerca de 20-50% dos

adultos e 10% das crianças [20,21]. Em Portugal, a prevalência desta infecção atinge

valores muito próximos dos observados nos países em desenvolvimento, atingindo cerca de

80% da população adulta e variando entre aproximadamente 20% nas crianças até aos 5

anos e 50% nas crianças com idades compreendida entre 10 e 15 anos [22-24].

Vários estudos sugerem que a transmissão directa, pessoa a pessoa, é a via mais

provável de aquisição da infecção, quer seja por via oral-oral, gástrica-oral ou fecal-oral,

tendo sido detectado ADN de H. pylori no vómito, saliva, placa dentária, suco gástrico e

fezes [9,14,15,17,21,25,26]. Foram também sugeridas outras vias de transmissão, como

através da água, de animais e de endoscópios esterilizados incorrectamente [9,14,17,21,27-

31].

Clinicamente esta infecção é caracterizada pela presença de dores abdominais

persistentes, dores epigástricas pós-prandiais, vómitos e indigestão. A análise histológica da

biopsia gástrica destes doentes revela sempre a presença de gastrite crónica, que pode

evoluir para doença severa (15-20% dos indivíduos infectados), como úlcera duodenal ou

úlcera gástrica [17,32,33]. Menos frequentemente (cerca de 0,1- 4% dos casos) [17], a

infecção por H.pylori pode também progredir para carcinoma gástrico ou para o linfoma de

MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). No desenvolvimento destas patologias, para

além da infecção por H. pylori, os factores genéticos do hospedeiro e os factores

ambientais, desempenham um papel preponderante [17,34,35].

3. Diversidade Genética de Helicobacter pylori

Durante a longa convivência com os seres humanos, H. pylori tem desenvolvido

estratégias complexas de adaptação, no sentido de manter a inflamação do epitélio gástrico

num limiar que impeça a sua própria eliminação [17,32]. Esta adaptação constante a um

hospedeiro específico, traduz-se na grande diversidade encontrada nas estirpes de H. pylori

e são o reflexo das inúmeras alterações genómicas sofridas pela bactéria, essencialmente

por mecanismos de recombinação e mutação, durante o longo período de infecção [36,37].

Vários métodos moleculares permitiram demonstrar que é quase impossível encontrar dois

isolados independentes de H. pylori com perfis genómicos idênticos, o que sugere uma das

maiores variabilidades genómicas conhecidas entre as bactérias [36,37,38].

Introdução

Andrea Santos

3

Actualmente existem 31 genomas de H.pylori totalmente sequenciados e anotados,

obtidos de isolados clínicos independentes. A sua comparação permitiu verificar que cerca

de 10% dos genes presentes no genoma de H.pylori são específicos de estirpe [39-48] e

estão localizados em duas regiões genómicas denominadas de zonas de plasticidade 1 e 2

[44,49]. Estas regiões têm um conteúdo em G+C diferente do restante genoma (35%G+C,

em vez de 39%-percentagem média de G+C do restante genoma), o que sugere que a sua

aquisição possa ter resultado de transferência horizontal. As zonas de plasticidade contêm

várias sequências de inserção, bem como genes responsáveis pela transcrição de proteínas

com elevada homologia com algumas recombinases, integrases e topoisomerases. A

presença destas sequências sugere que estas regiões genómicas estariam implicadas em

eventos de recombinação, incluindo a transposição, levando a rearranjos genómicos entre

as estirpes [39,44,47,49].

A recombinação genética parece ser o mecanismo mais envolvido na adaptação desta

bactéria ao seu hospedeiro, resultando da troca de genes entre estirpes em colonização

mista [50-53]. Este mecanismo é possível porque H. pylori é naturalmente competente,

permitindo a entrada de ADN exógeno, cromossomal ou plasmídico, de outras estirpes de H.

pylori, normalmente sob a forma de pequenos fragmentos (417 pares de bases(pb)), que

são integrados no cromossoma [52,53]. A ocorrência de recombinação intragenómica,

também já foi descrita em H. pylori, especialmente em genes da família das proteínas de

membrana externa (OMPs, Outer membrane protein), levando a variações genómicas na

ausência de colonização mista [54,55].

As mutações pontuais são outro mecanismo que promove a elevada diversidade genética

de H. pylori, estando envolvido, por exemplo, no desenvolvimento de resistências aos

antibióticos [51,56]. Muitos genes identificados neste microrganismo contêm sequências

repetidas, homopoliméricas ou dinucleótidicas, que podem constituir locais preferenciais

para a ocorrência de mutações (hotspots), geradas pelo mecanismo de slipped strand

misparing, durante a replicação do ADN [39-48,57,58]. Este evento constitui um mecanismo

de regulação da expressão genética, alterando a funcionalidade dos genes ou afectando a

actividade do promotor, através da alteração da grelha de leitura desses genes [59,60].

Alguns autores sugerem que a elevada taxa de mutação desta bactéria, poderá dever-se

também à aparente ausência dos sistemas de reparação do ADN [36,61].

4. Diversidade geográfica de Helicobacter pylori

A comparação de sequências de várias categorias de genes de H. pylori, de diferentes

regiões geográficas, tem vindo a permitir identificar alelos distintos em determinados genes,

específicos ou mais expressos numa determinada região geográfica [36,38,53,62,63].

Assumindo que a infecção por H. pylori ocorre no seio familiar e que cada estirpe se adapta

Introdução

Andrea Santos

4

a um hospedeiro específico, é provável que a evolução desta bactéria tenha vindo a ocorrer

de forma particular em diferentes regiões geográficas [36,38,53]. Alguns autores sugerem

que os diferentes isolados analisados, reflectem tanto, as características iniciais da

população bacteriana que foi introduzida numa determinada região, como as pressões

antigénicas ou variações funcionais a que esteve sujeita, para persistir numa dada

população hospedeira [45,53,64]. Vários autores têm por isso utilizado as subdivisões

geográficas das estirpes de H. pylori, para traçar as migrações modernas e ancestrais do

Homem [53,65]. De uma forma geral, apesar da elevada taxa de recombinação observada,

as espécies de H. pylori podem ser divididas em seis populações e várias subpopulações

com distribuição geográfica distinta, baseadas nas diferenças de perfis de MLST (Multilocus

sequence typing) considerando sete genes housekeeping. Estas populações são

designadas por: hpEuropa (Europa e Países colonizados por Europeus); hpAfrica1 composta

pelas subpopulações hspWAfrica (África Oriental, África do Sul e América) e hspSAfrica

(África do Sul); hpEastAsian que é constituída pela subpopulação hspMaori (Polinésia,

Malásia e Tailândia), hspAmerind (Índios Americanos) e hspEAsia (Ásia Oriental);

hpNEAfrica (África do Norte); hpAfrica2 (população muito específica da África do Sul);

hpAsia2 (Ásia do Sul e Central) [53,65,66]. Recentemente foi identificada mais uma

população, a hpSahul que é constituída por estirpes isoladas de Aborígenes da Austrália e

de algumas tribos da Nova Zelândia [67,68].

Estas populações modernas são o resultado de dezenas de milhares de anos de

evolução conjunta com o Homem, reflectindo tanto as migrações, como o isolamento

geográfico de algumas populações humanas e as recombinações inter-estirpes [2,53,66,69].

5. Factores de virulência de Helicobacter pylori

São vários os factores de virulência já identificados em H. pylori, estando implicados tanto

na colonização e lesão do epitélio gástrico como na adaptação e sobrevivência do

microrganismo no estômago humano [9]. De entre eles destacam-se os flagelos, a enzima

urease e algumas adesinas (BabA, SabA, etc), assim como a presença da forma activa da

citotoxina vacuolizante VacA e do ilhéu de patogenicidade cag [9].

5.1 Citotoxina Vacuolizante VacA

A proteína VacA (vacuolating cytotoxin A) é uma toxina secretada por algumas estirpes

de H.pylori tendo sido inicialmente identificada devido à sua actividade vacuolizante das

células epiteliais gástricas [17,70]. A citotoxina é constituída por dois domínios, p33 e p55

que são clivados após secreção da toxina pela bactéria. O domínio p55 medeia a ligação às

células do hospedeiro, enquanto o p33, em conjunto com o N-terminal do domínio p55, é

responsável pela vacuolização celular [69,71,72]. Dependendo do pH do meio, a toxina pode

Introdução

Andrea Santos

5

apresentar-se sob a forma de oligómeros ou monómeros que são introduzidos na camada

lipídica da membrana das células epiteliais, formando canais iónicos [73,74]. Vários efeitos

celulares têm sido descritos para a proteína VacA, quer nas células epiteliais, interferindo

com a sua permeabilidade ou levando à formação de vacúolos ou à apoptose, quer em

células do sistema imunitário, interferindo com a proliferação das células T ou com a

apresentação do antigénio pelas células B [69,74-76]. Embora o gene vacA esteja presente

em 100% dos isolados de H. pylori, exibe um polimorfismo significativo que lhe confere

diferentes níveis de expressão e toxicidade [17,69,77]. Apresenta uma estrutura em

mosaico, resultante da diversidade alélica observada em três regiões distintas do gene: a

região 5’(s) que codifica o péptido sinal e para a região N-terminal da proteína madura

(alelos s1 ou s2), a região média (m) que codifica parte do domínio p55 (alelos m1 ou m2) e

a região intermédia (i) responsável pelo domínio p33 (alelos i1 ou i2) [12,69,78]. Todas as

combinações entre os alelos são possíveis, no entanto a combinação mais tóxica é a

s1m1i1 que corresponde a uma forma completamente activa da toxina, encontrada

frequentemente em estirpes isoladas de doentes com úlcera péptica e carcinoma gástrico

[17,69], sendo a combinação s2m2i2 a forma inactiva devido à presença de uma extensão

hidrofílica no N-terminal da proteína, que bloqueia as actividades de vacuolização e

formação de poros [69,79].

5.2 Ilhéu de patogenicidade cag

O ilhéu de patogenicidade cag (cag PAI) é uma região de aproximadamente 40 kb que

contém cerca de 31 genes implicados na virulência das estirpes de H.pylori [5]. Este ilhéu

pode estar ausente, presente ou não funcional, devido à interrupção do cag PAI pela

inserção de uma sequência IS605 ou por um grande fragmento de ADN cromossomal

[5,69,73].

Um cluster específico destes genes codifica componentes do sistema de secreção do tipo

IV (SST4), está envolvido no desencadear da resposta inflamatória e é responsável pela

injecção de moléculas bacterianas no interior das células do hospedeiro, como a proteína

CagA e o peptidoglicano [17,60,80-82]. O gene cagA, presente em cerca de 50-70% das

estirpes isoladas em países Ocidentais e em 90% das estirpes da Ásia Oriental, tem uma

associação epidemiológica forte com a úlcera duodenal e o carcinoma gástrico [83-87]. Ao

ser translocada para o interior das células epiteliais gástricas, a proteína CagA é fosforilada

em determinadas sequências repetidas (motivos EPIYA), por cinases do hospedeiro [88,89],

interferindo nas vias de sinalização das células epiteliais gástricas e alterando os seus

padrões morfológicos e de proliferação [90-92]. A interacção entre o SST4 e as células

hospedeiras resulta na indução de citocinas pró-inflamatórias in vivo [94,95], entre as quais

a interleucina-8 (IL-8) que é o principal mediador da inflamação na mucosa gástrica [69,96].

Introdução

Andrea Santos

6

5.3 Proteínas da membrana externa

As proteínas da membrana externa bacterianas (OMPs) estão envolvidas na interacção

entre a bactéria e o meio envolvente, desempenhando um papel essencial quer na sua

sobrevivência, quer na sua patogenicidade. Dependendo das espécies, estas proteínas

podem estar envolvidas no transporte de moléculas, funcionando como porinas, na

aderência e colonização do hospedeiro ou na evasão à resposta imunitária [97]. A análise

das sequências do genoma das estirpes de referência J99 e 26695 revelou a presença de

uma grande família de genes que codificam proteínas da membrana externa em H. pylori,

correspondendo a cerca de 4% do total de regiões codificantes de cada estirpe [39,58].

Foram identificadas cinco famílias de genes parálogos, contendo entre 3 e 33 membros que

variam em tamanho entre 27 e 135 kDA [97] (Figura 1).

ho

rD

0.05

ho

rD

0.05

fecA

hom

frpB

hof

hef

hop e hor

Figura 1: Análise filogenética das cinco famílias de parólogos da estirpe de referência J99 [Adaptado

de 98]. O tracejado identifica os 5 pares de genes duplicados.

A família 1 é constituída pelas proteínas Hop que contêm as regiões N e C terminais

altamente conservados e pelas proteínas Hor que não têm o motivo Hop no N-terminal [97].

Nesta família, as regiões conservadas podem ter estruturas e funções semelhantes, tais

como a integração da proteína na membrana externa ou a interacção proteína-proteína com

Introdução

Andrea Santos

7

outros membros da família, enquanto as regiões variáveis parecem estar envolvidas em

funções específicas, como por exemplo, a capacidade de agir como adesina ou porina [97].

Sabe-se actualmente que as proteínas HopA e HopE funcionam como porinas [99],

enquanto as proteínas HopB (AlpB), HopC (AlpA), HopS (BabA), HopP (SabA), HopZ e

HopH (OipA), funcionam como adesinas [96,100,101,102].

A família 2 é constituída por oito membros sem função conhecida e que exibem um

elevado nível de similaridade ao nível das proteínas (>95%) [97].

A terceira família é constituída por 4 membros (HomA, HomB, HomC e HomD) que

apresentam os terminais C e N conservados e domínio central variável, estando envolvidos

tanto na adaptação a hospedeiros específicos como na virulência de H. pylori. Até à data, os

membros melhor caracterizados desta família, são as proteínas HomA e HomB. O gene

homB é 90% homólogo com o homA [63,96,97]. Estudos recentes sugerem que o gene

homB constitui um novo factor de virulência dado a sua associação com a doença ulcerosa

péptica, enquanto o gene homA, foi correlacionado com a dispepsia não ulcerosa

[96,102,103]. O genótipo homB parece ainda constituir um marcador molecular na distinção

entre o cancro gástrico e a úlcera péptica [104]. Foi também demonstrado que a proteína

HomB é antigénica e é capaz de activar a secreção da IL-8 in vitro, através do seu papel

como adesina [96,103].

A família 4 (FecA e FrpB) tem homologia com OMPs de outras bactérias, envolvidas na

regulação do ferro, enquanto a família Hef (família 5) é constituída por três membros (HefA,

HefD e HefG) altamente conservados, homólogos a genes que codificam sistemas de efluxo

[97].

Dada a importância destas proteínas na relação entre bactéria e hospedeiro, H. pylori

dispõe de vários mecanismos implicados na regulação e diversidade ao nível da expressão

das OMPs, que fazem variar a composição proteica da membrana externa, bem como a

antigenicidade dos seus constituintes. De entre esses mecanismos destacam-se a

duplicação, delecção ou conversão génica, a regulação por variação de fase, a diversidade

alélica e a presença de genes específicos de estirpe.

5.3.1 Mecanismos de regulação da expressão das proteínas da membrana externa

A análise das sequências de diversas OMPs revelou que alguns genes hop apresentam

duas cópias no mesmo genoma. Ambas as estirpes de referências 26695 e J99 contêm 5

pares de genes duplicados: hopJ/hopK, hopM/hopN, hopS(babA)/hopT(babB),

hopP(sabA)/hopO(sabB) e homA/homB que também estão presentes na maioria das

estirpes clínicas [96,97] (Figura 1). A presença destes genes duplicados pode dever-se a

processos evolutivos em curso onde os genes duplicam, por recombinação intragenómica,

acumulando posteriormente mutações para divergirem gradualmente em genes que

Introdução

Andrea Santos

8

codificam novas proteínas, funcionalmente distintas. Este processo é provavelmente similar

ao que gerou a família Hop inteira [97]. Foi também sugerido que a duplicação destes genes

representaria uma forma de regulação da expressão de proteínas para a adaptação às

mudanças na inflamação e na resposta imunitária do hospedeiro [55,97], bem como na

evolução da doença gástrica. Por exemplo, o genótipo de dupla cópia homB foi associado à

úlcera péptica, o que sugere que a duplicação não é um fenómeno aleatório e pode

constituir uma vantagem biológica facilitando a adaptação a um hospedeiro específico [96].

Para além da duplicação, alguns genes hop contêm repetições de dinucleótidos CT na

região 5’ e são regulados por variação de fase [97,101,102,105]. Durante a replicação do

ADN, na zona de repetições pode ocorrer um desemparelhamento entre as bases

complementares (misparing), o que leva ao “deslize” da polimerase na grelha de leitura,

resultando na adição ou delecção de unidades CT. Estas alterações no número de

repetições podem originar a adição ou remoção de codões STOP, alterando a expressão da

proteína devido à mudança de fase on/off [60]. Os genes já identificados regulados por este

mecanismo em H. pylori são: babB, sabA e sabB, hopZ, oipA e homB. A variação de fase

como mecanismo de diversidade é utilizado por várias espécies bacterianas e tem mostrado

contribuir para a variação antigénica e virulência durante a infecção [58,96].

A variação alélica é também um mecanismo de diversidade em vários genes de H. pylori,

como babA, hopQ, hopZ, homA e homB [63,96,102,106,107]. Em todos estes genes é

observado um perfil conservado de segmentação, com a região variável localizada na região

média do gene e com a existência de pelo menos duas variantes alélicas conservadas.

Estas variantes podem associar-se em alguns casos, a determinadas apresentações

clínicas da infecção e podem também contribuir para a diversidade antigénica [106]. Por

exemplo no gene hopQ, a família alélica do tipo I é mais frequente em estirpes isoladas de

doentes com úlcera, estando associada ao genótipo virulento, cagPAI+/vacAs1 [106]. No

entanto, nos genes babA e babB, foram descritas 3 e 5 variantes alélicas respectivamente,

não estando nenhuma delas relacionadas com o genótipo de virulência ou com a

capacidade de adesão da estirpe [107]. O mesmo acontece com os genes homA e homB

[63]. Assim, nestes casos a variação alélica parece ser um mecanismo utilizado por H. pylori

para originar estirpes com diferentes perfis antigénicos que vão permitir evadir-se à resposta

imunitária [63,107].

Para além de todos estes mecanismos, algumas estirpes contêm ainda genes específicos

que codificam OMPs, tais como, hopU e homB, fenómeno que pode representar uma

vantagem adaptativa a hospedeiros específicos [97].

Objectivos

Andrea Santos

9

Capítulo 2: Objectivos

As OMPs estão envolvidas na relação entre H. pylori e a mucosa gástrica humana,

contribuindo para a colonização e persistência da infecção [108].

Aproximadamente 4% do genoma de H. pylori contém informação para a codificação de

pelo menos 32 OMPs [97,109], sendo que as principais proteínas associadas com a

patogenicidade e adesão de H. pylori são: BabA, SabA, OipA, AlpA, AlpB e HomB

[59,96,103,109,110]. A adesina BabA interage com as células epiteliais gástricas, através da

ligação ao antigénio do grupo sanguíneo Lewis b (Leb), que também é produzido ao nível

destas células [108,110]. A interacção BabA-Leb levou a que esta OMP tenha sido

considerada, até à data, a principal adesina de H. pylori [108-110]. O gene babA tem um

gene parólogo, babB, cuja função é ainda desconhecida [110]. Foi demonstrado no entanto

que a recombinação entre os dois loci contribui para a dinâmica de adesão da bactéria às

células gástricas, aumentando a sua fitness [113].

Um estudo do “complexoma” de H. pylori mostrou que BabA e BabB formam complexos

com outras OMPs, nomeadamente HopM e HopN [109]. Estudos recentes sugerem que

nenhuma das proteínas BabA ou BabB é capaz de induzir resposta imunitária em macacos,

nem são os antigénios imunodominantes em humanos [109,111,112]. Uma hipótese que

poderia explicar este facto seria a de que as proteínas de membrana que interagem com

BabA ou BabB, por exemplo, HopM e HopN, poderiam mascarar os epítopos daquelas

proteínas e consequentemente serem elas próprias expostas e assim antigénicas [109].

Esta hipótese é ainda corroborada pelo facto de HopN/HopM terem demonstrado

reactividade contra soros de pacientes positivos para H. pylori [109,113]. Estes dados

sugerem que estas proteínas poderão desempenhar um papel importante na relação entre a

bactéria/hospedeiro, nomeadamente, constituindo prováveis antigénios e consequentemente

importantes alvos vacinais; por outro lado, o facto de formarem complexos com BabA

poderá indiciar o seu papel na adesão de H. pylori à célula epitelial gástrica [109,110].

Este trabalho tem como objectivo o estudo dos genes hopM e hopN, nomeadamente a

sua diversidade genética, a análise filogenética e evolutiva. Pretende-se também contribuir

para o esclarecimento do seu papel na virulência de H. pylori, através da identificação de

possíveis associações destes genes a patologias específicas e a marcadores moleculares

de virulência. Para tal, foi estudada uma amostra de estirpes clínicas de H. pylori, isoladas

de biopsias gástricas de doentes de diferentes regiões geográficas, apresentando diversas

patologias gástricas, nomeadamente, úlcera péptica, gastrite e cancro gástrico. Foram

também utilizadas as sequências nucleotídicas de 23 estirpes de referência de H. pylori,

cujos genomas já se encontram sequenciados e anotados.

Materiais e Métodos

Andrea Santos

10

Capítulo 3: Materiais e Métodos

1.Estirpes de Helicobacter pylori e material genómico

Foram estudadas 234 estirpes clínicas de H. pylori isoladas de biopsias gástricas de

doentes de diversas origens geográficas, apresentando diferentes patologias

gastroduodenais, nomeadamente dispepsia não ulcerosa com gastrite (G), doença ulcerosa

péptica (UP) gástrica ou duodenal, e cancro gástrico (CG) (Anexo I). As estirpes de H. pylori

estudadas pertencem à colecção de estirpes bacterianas da Unidade de

Campylobacter/Helicobacter do Departamento de Doenças Infecciosas (DDI) do Instituto

Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA); o material genómico de algumas estirpes de

H. pylori não pertencentes à colecção do INSA, foi gentilmente cedido pelo Doutor Yoshio

Yamaoka, Department of Medicine, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

and Baylor College of Medicine, Houston, Texas, EUA.

Foram ainda utilizadas três estirpes de referência de H. pylori, as estirpes 26695 (ATCC

700392), J99 (ATCC 700824) e HPAG1, cujos genomas já se encontram sequenciados,

como controlos das reacções de amplificação e de sequenciação [39,46,58].

Cultura das estirpes de Helicobacter pylori

As estirpes de H. pylori conservadas a -80ºC em meio TSB com glicerol, foram cultivadas

em meio HP selectivo e não selectivo (Biogerm, Maia, Portugal), e incubadas a 37ºC numa

atmosfera de microaerófilia (5% de O2; 10% de CO2; 85% de N2), durante 48 horas. Uma

placa de cultura foi utilizada para extracção de ADN e a outra para congelar a estirpe de

modo a repor a colecção de bactérias (Anexo II).

Extracção de ADN genómico

A extracção de ADN genómico foi realizada utilizando o kit comercial QIAamp® DNA Mini

(Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante [114].

2. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN

Para o estudo da diversidade genómica dos genes hopM e hopN, na amostra de estirpes

em estudo, foram identificados os loci de cada gene alvo, por análise dos genomas de

estirpes sequenciadas (Anexo III), e desenhados oligonucleótidos iniciadores (doravante

designados por primers) nas respectivas regiões genómicas flaqueantes e no interior dos

genes (Tabela 1). Todos os primers descritos neste trabalho foram desenhados com recurso

ao software Web Primer3 (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi).

Procedeu-se depois à amplificação e sequenciação de cada locus, pelas técnicas de PCR e

sequenciação.

A reacção de amplificação foi realizada num volume final de 25μl contendo: 1μl de ADN,

Tampão 1X (Bioline Ltd, Londres, Reino Unido), 2,8mM de MgCl2, 200μM de cada dNTP

http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi


Andrea Santos

11

(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), 0,5μM de cada primer, 1U de Bio-X-

ActTM Long DNA Polimerase e água destilada estéril. Em cada ensaio usou-se um controlo

negativo constituído por água destilada estéril, e como controlos positivos o ADN das três

estirpes de referência. A reacção de amplificação consistiu num ciclo inicial de 5min a 95ºC

e 1min a 57ºC, seguido de 35 ciclos constituídos por extensão de 3min a 68ºC,

desnaturação a 95ºC durante 30s e hibridação dos primers a 57ºC durante 30s, com um

ciclo de extensão final de 10min a 68ºC, realizada num Termociclador GeneAmp® PCR

System 9700 (Applied Biosystems Inc., Foster City, EUA).

Tabela 1: Primers utilizados na amplificação e sequenciação dos loci hopM e hopN. Os primers internos utilizados são os mesmos nas duas regiões genómicas estudadas.

Região Genómica Primer Sequência (5’ 3´) TM (ºC)

hopM (primers externos) hopMF2 GCCATTCTTTTTGTATCTTTT 50,1 hopMR2EXT CTGTTGATTCTTCCATAAAAAACTC 50,6

hopN (primers externos) hopNF2 TCCCTATCGCTTATAGCTTGA 55,9 hopNR1 TATGCGGGTATTGGTTTTGC 45

hopMR4 CGCTAAAGCCACAGCTTGATA 47 hopMR3 GCGTTTTCATTAGCCTTAAG 43

hopM/hopN hopMR5 CCTTAACCCGCACCTTCT 56

(primers internos) hopMR6 AGGCCCTTGAATGCTGTG 56

hopMR7 TAGGGCCAGGGCCACAGC 52

hopMR8 GGTTTAAAGCGGTTTGGAT 42

Os produtos de amplificação foram detectados por electroforese em gel de agarose 1% e

corado com GelRedTM (1:10000) (Biotium Inc., Hayward, EUA), em tampão de corrida TBE

0,5X (Anexo IV). Foi utilizado como marcador de peso molecular o 1Kb DNA Ladder com

fragmentos de ADN de 500 pb a 12 Kb (Invitrogen S.A, Barcelona, Espanha).

Os produtos de amplificação foram purificados com o kit QIAquick® PCR Purification Spin

(Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), segundo instruções do fabricante [115] e seguidamente

sujeitos a sequenciação enzimática utilizando o Big Dye® Terminator (Applied Biosystems

Inc.) e o Sequenciador automático Genetic Analyser Abi-Prism 3130 xl (Applied Biosystems

Inc.). A reacção de sequenciação foi realizada num volume final de 10μl contendo: 2μl de

Big Dye® V1.1 (Applied Biosystems Inc.), 0,5μM de primer, 0,5 a 7,5μl de ADN purificado e

água destilada estéril. O programa de sequenciação consistiu num ciclo inicial de

desnaturação de 30s a 96ºC, seguido de 25 ciclos constituídos por uma desnaturação de

10s a 96ºC, uma hibridação de 5s a 45ºC e uma extensão de 4min a 60ºC. Estas reacções

foram realizadas num Termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems

Inc.). Após a reacção cíclica os produtos foram entregues na Unidade de Tecnologia e

Inovação do INSA para sequenciar. As sequências de nucleótidos obtidas foram

visualizadas no programa Chromas LITE (Version 2.01) e comparadas recorrendo ao

programa MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). Em seguida, foram traduzidas

http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/


Andrea Santos

12

em sequências de aminoácidos correspondentes recorrendo ao programa EMBOSS transeq

(www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/).

3. Avaliação da variabilidade genética, análise filogenética e dos parâmetros

evolutivos dos genes hopM e hopN

De modo a avaliar a variabilidade genética e os parâmetros filogenéticos e evolutivos, foi

realizada uma análise bioinformática das sequências nucleotídicas e respectivas sequências

de aminoácidos previstas. Foram também utilizadas as sequências nucleotídicas das 23

estirpes de referência de H. pylori (Anexo III).

A variabilidade genética foi determinada a partir de gráficos de similaridade, utilizando

alinhamentos gerados pelo programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9

(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), com recurso à aplicação do programa

SimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot/).

A análise da filogenia foi realizada através de árvores filogenéticas criadas pelo programa

MEGASoftware 4.0.2 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)

(http://www.megasoftware.net/), a partir de alinhamentos múltiplos das sequências de

nucleótidos e respectivas sequências de aminoácidos previstas, obtidos no BioEdit

Sequence Alignment Editor 7.0.9 pela aplicação ClustalW. Foi utilizado o teste de filogenia

Bootstrap Neighbor Joining Tree com 1000 réplicas e o modelo de Kimura 2-parameter

[63,116,117].

Os parâmetros evolutivos foram determinados recorrendo ao programa MEGASoftware

4.0.2, utilizando alinhamentos também gerados no BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9,

calculando-se: distância molecular pelo método p-distance, frequência de substituições

sinónimas (Ks), frequência de substituições não-sinónimas (Ka) e razão entre substituições

não-sinónimas e substituições sinónimas (Ka/Ks), pelo método de Nei Gojobori [63,116].

4. Análise Estatística

Para testar associações entre duas variáveis qualitativas, foram utilizadas tabelas de

contingência de 2x2, recorrendo-se ao teste Exacto de Fisher com recurso à aplicação do

programa EpiInfoTM 3.5.3. (http://www.cdc.gov/epiinfo). Todos os testes utilizados foram

bilaterais. Foi estabelecido em 5% o nível de significância dos testes, tendo-se rejeitado a

hipótese nula quando a probabilidade de significância do teste (p value) foi inferior a este

valor. Os valores p apresentados referem-se à comparação entre ter ou não o gene ou um

determinado alelo por patologia ou por genótipo de virulência (genótipo de virulência ou

genótipo não virulento).

http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot/

http://www.megasoftware.net/

http://www.cdc.gov/epiinfo

Resultados

Andrea Santos

13

Capítulo 4: Resultados

1.Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN

Considerando a classificação da estirpe de referência HPAG1, os genes hopM e hopN,

estão localizados no locus HPAG1_0230 (locusM) e no locus HPAG1_1289 (locusN),

respectivamente. Nas estirpes clínicas foram obtidos produtos de amplificação que variaram

entre 2604-2616 pb para o locusM e 2559-2589 pb para o locusN. Neste último, verificou-se

ainda para algumas estirpes (24,6%), a amplificação de produtos de menor peso molecular,

variando entre 200 e 1500 pb. Todos estes produtos de amplificação foram posteriormente

sequenciados e as respectivas sequências de nucleótidos foram analisadas recorrendo ao

programa MultAlin, sendo posteriormente traduzidas para as sequências de aminoácidos

correspondentes, recorrendo ao programa EMBOSS transeq.

Verificou-se em todas as estirpes estudadas (clínicas e de referência), que os genes

hopM e hopN ocupavam ambos os loci (M/N) indiferentemente. Os produtos de menor

tamanho localizados no locusN correspondiam a uma região intergénica (estirpes asiáticas),

a uma ORF (Open Reading Frame) mais curta com homologia com a região 3’ dos genes

hopM e hopN (estirpes ocidentais) ou ainda a uma ORF que correspondia à fusão entre a

região codificante do péptido sinal de HopM e HopN e a região 3’ de uma DNA-

metiltransferase de H. pylori (dnpA) (estirpes asiáticas).

Foram obtidas 468 sequências a partir de 234 estirpes clínicas, 132 correspondendo ao

gene hopM, 206 ao gene hopN, 115 Loci “vazios” e 15 sequências que não pertenciam a

nenhuma destas três categorias e que serão descritas seguidamente. Os dois genes foram

identificados com recurso à aplicação BLAST, Basic Local Alignment Search Tool

(http://blast.ncbi.nml.nih.gov/Blast.cgi). Apesar do elevado grau de similaridade entre hopM e

hopN (94% similaridade, calculado para as sequências da estirpe de referência HPAG1), os

genes diferenciam-se ao nível da extremidade 5’ na região compreendidade entre os 396 e

900 pb (Anexo V e Figura 5).Foram identificadas três estirpes ocidentais que apresentavam

uma sequência que correspondia a uma fusão entre os dois genes (quimeras hopM/N)

(Anexo V). Nestas três estirpes, duas apresentavam a quimera apenas no locusM, enquanto

a outra apresentava este putativo gene recombinante em ambos os loci.

Ambos os genes possuem na extremidade 5’ repetições de dinucleótidos CT. Verificou-se

em cinco estirpes clínicas e numa estirpe de referência (6/234, 2,6%) a existência de

proteínas putativas truncadas em ambos os loci, devido a alterações no número de

repetições.

As quimeras e as ORF’s truncadas foram eliminadas da restante análise de resultados.

http://blast.ncbi.nml.nih.gov/Blast.cgi

Resultados

Andrea Santos

14

1.1 Distribuição dos genes hopM e hopN por região geográfica

Foram incluídas neste trabalho as sequências hopM/hopN de 226 estirpes clínicas e 23

estirpes de referência (n=249 estirpes) (Anexos I e III). Pelo menos uma cópia de hopM ou

hopN foi detectada em todas as estirpes analisadas. Foi observada diversidade

relativamente ao número de cópias de cada gene e à sua localização genómica (Figura 2). A

distribuição dos genes hopM e hopN relativamente ao número de cópias e loci que ocupam,

por origem geográfica, encontram-se representados na figura 2. Nas estirpes ocidentais os

genótipos de cópia única e dupla cópia (mesmo gene e genes diferentes) foram observados,

sendo o genótipo de dupla cópia mais prevalente. Contrariamente, nas estirpes de origem

asiática, apenas o genótipo de cópia única foi observado, enquanto na população africana

todas as estirpes estudadas possuíam o genótipo de dupla cópia. Verificou-se ainda que no

caso de cópia única, o gene ocupava sempre o locusM enquanto no caso de dupla cópia os

dois genes ocupavam indiferentemente os dois loci.

A) ESTIRPES OCIDENTAIS (n=167)

Genótipo cópia única

LocusM LocusN

Genótipo dupla cópia

LocusM Locus N

hopM

hopNhopN

hopM

17%

11,3%

hopM

hopM hopN

hopN

46,5%

hopN

hopM

x

x

18,9%

6,3%

x

x

B) ESTIRPES ASIÁTICAS (n=71)

LocusM Locus N

hopN

hopM 31,2%

68,8%

C) ESTIRPES AFRICANAS (n=11)

LocusM Locus N

hopM

hopNhopN

hopM

50%

16,7%

hopM hopN

hopN hopM

33,3%

Genótipo cópia única

Genótipo dupla cópia

Figura 2: Distribuição do número de cópias e localização genómica de hopM e hopN, por região geográfica. As

percentagens indicam a frequência de cada genótipo nas populações Ocidental, Asiática e Africana. O X representa ausência do gene hopM ou hopN completo.

1.2 Distribuição dos genes hopM e hopN por patologia

Para realizar esta análise foram incluídas apenas as estirpes para as quais havia

informação sobre a situação clínica do doente de onde tinha sido isolada (n= 224), com a

seguinte distribuição: 127 (56,7%) casos de úlcera péptica (UP), 82 (36,6%) de gastrite (G) e

15 (6,7%) de cancro gástrico (CG). Todas as estirpes com uma cópia de cada gene no seu

genoma (71/224, 31,7%) foram numa primeira abordagem eliminadas.

Verificou-se que o gene hopN foi o mais prevalente em todas as patologias, estando

presente em 73,3% das estirpes de UP (63/86), em 62,5% das G (35/56) e em 90,9% das

estirpes de CG (10/11).

Resultados

Andrea Santos

15

Com o objectivo de perceber se, para além da presença dos genes, a forma como eles se

distribuem no genoma (número de cópias e loci que ocupam), estaria associada com

patologias específicas, foi efectuada a análise da distribuição dos diferentes genótipos por

patologia. Considerando todas as estirpes, verificou-se que o genótipo mais frequentemente

encontrado na UP foi a cópia única hopN (35,4%), seguido da dupla cópia MN (31,5%). Na

gastrite, os genótipos mais frequentes foram a dupla cópia MN (31,7%) e a cópia única

hopN (26,8%) e no CG, o genótipo mais frequentemente encontrado foi o de cópia única

hopN (76,9%).

Posteriormente efectuou-se o mesmo tipo de análise por origem geográfica (Figura 3). Na

população ocidental o gene hopM foi mais frequentemente encontrado na G do que na UP,

enquanto o hopN foi mais frequente na UP. Na população asiática, o gene hopM foi mais

frequentemente identificado na G enquanto o gene hopN foi mais prevalente na UP e CG.

Na população africana todas as estirpes foram isoladas de UP sendo o gene hopN o mais

frequente (n=10, 85,7% hopN). Apesar de existir uma associação aparente entre a presença

do gene e a patologia, nenhuma associação é suportada estatisticamente, uma vez que o

hopN é o gene mais prevalente em todas as populações.

População Ocidental (n=83)A)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

hopM hopN

26,1%

73,9%

37,8%

62,2%

UP G

% d

e e

sti

rpes p

osit

ivas

(n=46) (n=37)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

hopM hopN

29,7%

70,3%

35%

65%

23,1%

76,9%

UP G CG

População Asiática (n=70)B)

(n=37) (n=20) (n=13)

% d

e e

sti

rpes p

osit

ivas

Figura 3: Frequência dos genes hopM e hopN nas estirpes de H. pylori de origem ocidental (A) e asiática (B) de

acordo com a patologia (úlcera péptica (UP), gastrite (G) e cancro gástrico (CG)). As percentagens foram calculadas para cada patologia.

Relativamente ao genótipo hopM/hopN, na população ocidental o mais prevalente foi a

dupla cópia MN tanto nas estirpes isoladas de UP (47,5%, 38/80) como nas de G (42,6%,

26/61). Na população asiática, o genótipo mais prevalente nas estirpes isoladas de UP foi a

cópia única hopN (70,3%, 26/37 UP), assim como em 65% (17/20) das G e em 76,9%

(10/13) dos CG. Na população africana, as estirpes foram todas isoladas de doentes com

UP, sendo o genótipo mais frequente a dupla cópia hopN (6/10, 60%). Assim, apesar de se

verificarem diferenças relativamente à prevalência dos diferentes genótipos por origem

geográfica, esse genótipo é também o mais encontrado em todas as patologias nessa

população.

Resultados

Andrea Santos

16

1.3 Associação dos genes hopM e hopN com o genótipo de virulência

Foram estudadas 222 estirpes com o objectivo de verificar a associação entre a

presença de hopM e hopN com outros genes de H.pylori associados à virulência,

nomeadamente a presença do gene cagA, marcador da presença do ilhéu de

patogenicidade cag e do alelo s do gene vacA. Definiram-se como estirpes virulentas as

estirpes positivas para o gene cagA e para o alelo citotóxico vacAs1, e estirpes não

virulentas as estirpes negativas para o gene cagA e com o alelo vacAs2 (alelo não

citotóxico) [79,83]. De uma forma geral, verificou-se a associação entre a presença de

dupla cópia M e da dupla cópia MN e o genótipo não virulento (57,9% MM vs 26,6%;

47,2% MN vs 20,7% outros genótipos, respectivamente) e a associação entre a cópia

única N e genótipo virulento (88,7% cópia única hopN vs 62,3%), sendo estas associações

suportadas estatisticamente (p=0,01, p<0,001 e p<0,001, respectivamente). Por origem

geográfica, na população ocidental observou-se que 80,8% das estirpes com dupla cópia N

eram virulentas, contra 56,5% de outros genótipos (p=0,03) e que 64,7% das estirpes com

dupla cópia M eram não virulentas, contra 37,5% de outros genótipos (p=0,05). Na

população asiática, não foi possível observar qualquer tipo de associação com o genótipo

de virulência, uma vez que todas as estirpes são cagA e vacAs1 positivas. Na população

africana, 60% das estirpes virulentas apresentam a dupla cópia N no seu genoma, não

tendo no entanto esta associação suporte estatístico, provavelmente devido ao pequeno

número de estirpes estudadas.

2.Análise filogenética, avaliação da variabilidade genética e parâmetros evolutivos

dos genes hopM e hopN

Para todas as estirpes em estudo (n=249), foi obtida uma sequência codificante em pelo

menos um dos loci analisados. Todas as sequências obtidas foram identificadas por

homologia com o respectivo gene, hopM ou hopN, recorrendo à aplicação BLAST. As

sequências correspondentes ao gene hopM variaram entre os 2082 e 2097 pb, enquanto

para o gene hopN variaram entre 2075 e 2100 pb.

A reconstrução filogenética das 379 sequências obtidas em ambos os loci (147 hopM e

232 hopN) mostra dois ramos independentes para cada um dos genes o que sugere

evolução divergente (Figura 4). Dois clusters predominantes foram identificados em ambos

os genes, sendo a segregação entre eles motivada pela origem geográfica das estirpes

(bootstrap=86). O cluster I foi identificado como grupo Ocidental e é composto por estirpes

isoladas de Portugal, França, Alemanha, Suécia, Brasil, Colômbia e EUA, enquanto o cluster

II foi identificado como grupo Oriental/Ameríndio e é composto por estirpes originárias da

Ásia Oriental (Japão, Singapura e Coreia do Sul) e da América do Sul (Peru e Venezuela)

(Figura 4). As estirpes africanas (Burquina-Faso, Gâmbia e África do Sul) encontram-se

Resultados

Andrea Santos

17

mais próximas das estirpes ocidentais e o facto de não se observar a formação de um

cluster específico, deve-se provavelmente ao baixo número de estirpes analisadas (n=11).

Esta hipótese é corroborada pela análise filogenética por gene, onde se observa a formação

de um pequeno cluster de estirpes africanas, embora não seja sustentado por valores de

bootstrap (resultado não apresentado).

Cluster I

Cluster I

JPJ2

3ho

pN1P

U

JPJ1

87h

opN

1P

U

JPJ2

22ho

pN1G

CJP

J42h

opN

1GC

JPJ6

3hop

N1G

C

JPJ2

15ho

pN1P

U

JPJ1

43ho

pN1G

C

JPJ4

4hop

N1G

C

JPJ1

41A

hopN

1PU

JPJ2

13ho

pN1P

U

JPJ6

4hop

N1G

C

JPJP

T42C

hopN

1G

SG

1200

2hop

N1

JP51

Bho

pN1G

JPF30

hopN

1PU

F30hop

N1

KRDual61

hopN

1PU

JPJ1

19AhopN1PU

KRNUD26hopN1G

KRNUD21hopN1G

SG8038hopN1

JPF32hopN2GC

F32hopN2

JPJ206hopN1PU

KRTriple90hopN1PU

KRDual2hopN1PU

KRDual9hopN1PU

JPJP101ADhopN1PU

JPJPT395ChopN1G

JPJ272hopN1PU

JPJ258hopN1PU

JPJ214hopN1PUKRNUD49hopN1GJPJ147hopN1GC

KRDual18hopN1PUJPF16hopN2GF16hopN2

KRNUD40hopN1GJPJ90hopN1PUKRDual58hopN1PU

JPJ80hopN1GC

SG12001hopN1

KRDual74hopN1PUSG7003hopN1

KRCA108hopN1GCKRNUD23hopN1G

KRDual24hopN1PU

NO35AhopN1

35AhopN1PUKRDual88hopN1PU

FRAnt170hopN1PU

SE24hopN1PU

DE948hopN1G

SE38hopN1PUSE59hopN1G

DE959hopN2G

DE959hopN1G

PT23hopN2G

PT23hopN1G

BF3hopN2PU

BF3hopN1PU

US2721ChopN2G

US2721ChopN1GPT70hopN1PU

US1904DhopN1PU

PTB26hopN2G

CO967DhopN1PU

PTB50hopN2

PTB50hopN1PTB13hopN2G

PTB47hopN1

PT559/02hopN1PUPT565/99hopN1G

PT219/99hopN1PU

PT285/99hopN1PU

PT228/99hopN1G

PTB53hopN1G

CO152ChopN1G

SE27hopN1G

NON29hopN2PU

SE47hopN1G

SES570hopN1PU

FR901hopN1G

CO216DhopN1G

COCol83hopN1G

PT28hopN1PU

SJM180hopN2G

PT38hopN1G

PTB59hopN2

PTB19hopN1

KRNUD6hopN

1GPTB

44hopN2G

PT1776/05hopN

1

PT255/99hopN

2PU

CO

Col635hopN

2PU

CO

817DhopN

1PU

CO

221ChopN

2GC

O928D

hopN2P

U

BF18A

BFhopN

1PU

BF2A

BFhopN

1PU

BF2A

BFhopN

2PU

BF18A

BFhopN

2PU

Gam

bia94/24hopN1

BR

198.96hopN1G

C

CO

817hopN2P

U

US

2766ChopN

2G

US

2791ChopN

1G

BF

16AB

FhopN

2PU

BF

16AB

FhopN

1PU

CO

Col635D

hopN1P

U

BR

198.95hopN1G

CB

R198.96hopN

2GC

BR

313

.03h

opN

1G

PT

1198

/04ho

pN2P

UP

T11

98/04

hopN

1P

U

US

166

5Dh

opN

1P

U

BF

5hop

N2

PU

US

157

8Dh

opN

1P

UU

S1

578D

hop

N2

PU

BF

25A

BF

hop

N2

PU

BF

25

AB

Fh

op

N1

PU

BR

131

1.95ho

pN1G

C

US

277

7Ch

opN

1G

US

277

9hop

N1G

US

278

7Ch

opN

2G

US

278

7Ch

opN

1G

BR

112

6.95ho

pN1P

UB

F1A

BF

hopN

1PU

BF

19A

BF

hop

N2P

U

BF

19AB

FhopN

1PU

PT

2hop

N1

PU

PT

B27

hop1

N

PT

B16

hopN

1P

UIn

dia

7hop

N1

PT

1089

/03ho

pN2P

U

PT

1089

/03h

opN

1PU

PT

372/

99ho

pN2P

U

PT

372/

99ho

pN1P

U

PT

B21

hopN

1G

ITG

27ho

pN1

G27

hopN

2

PTB

15ho

pN1P

U

PTB

51ho

pN1P

U

PT12

4/99

hopN

1PU

PT14

5/99

hopN

2PU

B8h

opN

1PU

PTB

8hop

N1

PTB

10ho

pN1G

PT7

71/9

9hop

N1P

U

US16

75Dho

pN1P

U

PT4

1hop

N2G

PT41

hopN

1G

PTB

68ho

pN1P

U

PTB17ho

pN1

PT255/

99hop

N1P

U

PT133/

99hop

N1PU

PTB9hop

N1PU

PTB18hopN1

PT36/00hopN2G

PT107hopN2PU

BR55.01hopN2G

BR55.01hopN1G

KRDual67hopN1PU

KRDual33hopN1PU

KRNUD9hopN1G

DE940hopN1PUSouthAfrica7hopN1

SG8033hopN1

JPJ103hopN1GC

52hopN2PU

DE951hopN1PU

GBN83hopN1PU SE30hopN1PU

SE3hopN2G

SE3hopN1G

PT95hopN2PU

SE1hopN1PU

SE10hopN1G

DE938hopN1PUPT194/99hopN2PU

PT194/99hopN1PU

SEEN35hopN1PU

PT137/99hopN2PU

US2752ChopN2GUS2752ChopN1G

FR2432hopN1G

DE946hopN1PU

DE937hopN1PU

DE944hopN1PUGBEN37hopN1PU

26695hopN1G

GB26695hopN1G

26695hopN2GGB26695hopN2GNON28hopN1PU

SE6hopN1PUSE7hopN1PUFRS583hopN1PU

FRS583hopN2PUSEEN24hopN1PU

GBEN36hopN2PUHPAG1hopN2GDE956hopN1G

DE943hopN1PUDE953hopN1G

DE963hopN1G

PTB3hopN1PU

COCol83hopN2GPT1hopN2G

PT1hopN1G

DE952hopN1G

DE942hopN1PUPTB59hopN1

PTB31hopN1GPT351/99hopN1PU

PT197/99hopN2PU

PT197/99hopN1PU

PTB14hopN1PT499/02hopN2PU

PT1152/04hopN1PU

PTB71hopN1

FRF93hopN1PU

PT1786/05hopN2G

PT1846/05hopN2PU

PT1786/05hopN1G

PT1846/05hopN1PU

PTB35hopN1G

PTB26hopN1G

PTB6hopN1

PTB22hopN1G

PTB34hopN1G

BR1361.95hopN1PU

PTB60hopN2PU

PTB60hopN1PU

PT181/99hopN1PU

PT417/02hopM2PT417/02hopM1PUCO152ChopM2GKRDU852hopM1PUPTB27hopM2FRHorhopM2PU

FRHorhopM1PUFRB38hopM1ML

FRB38hopM2MLPTB57hopM1G

PT124/99hopM2PU

PTB57hopM2G

PT95hopM1PU

US2781ChopM2G

US2781ChopM1GFRAnt170hopM2PU

PT655/99hopM1G

PT655/99hopM2G

PTB34hopM2G

PT224/99hopM1PUPT351/99hopM2

KRDual30hopM1PU

SEHPAG1hopM1G

DE952hopM2G

SE58hopM1PU

CO216ChopM2G

SES580hopM1PU

PT137/99hopM1PU

DE950hopM1G

PT41hopM2G

BR1361.95hopM2PU

PTB44hopM1G

PTB3hopM2PU

US3058ChopM1G

US3058C

hopM2G

BR313.03hopM

2G

GM

Gam

bia94/24hopM2

BF5hopM

1PUBF1A

BFhopM

2PU

US2777C

hopM2G

BR

198.95hopM2P

U

PTB

22hopM2G P

ESJM

180hopM1G

PE

PeC

an4hopM1G

C

PT28hopM

2PU

NO

N29hopM

1PU

SE

S569hopM

1PU

DE

P12hopM

1PU

DE

P12hopM

2PU

PT181/99hopM

2PU

PTB

65hopM1G

PTB

36hopM1

DE

955hopM1GS

E56hopM

1GG

BE

N24hopM

2PU

NO

N28hopM

2PU

PTB

71hopM2

PTB

69hopM2

PT

69hopM1

PT

B65hopM

2G

US

2766ChopM

1G

SE

S569hopM

2PU

GB

EN

35hopM2P

U

JPJP

30AD

hopM1P

U

JPJ167hopM

1PU

KR

NU

D36hopM

1G

JPJ188hopM

1PU

KR

NU

D34hopM

1G

JPF

57hopM1G

C

KR

NU

D47hopM

1GK

RD

ual23

hopM

1P

U

KR

NU

D14

hopM

1GK

RD

ual17

hopM

1P

UJP

JPT

1160

Cho

pM1G

JPJ83

hopM

1GC

VE

v225d

hopM

1G

PE

Cuz2

0hop

M1

PE

Sh

i470

hopM

1G

PE

Sa

t464h

opM

1

JPJ1h

opM

1P

U

KR

dua

l5hop

M1

PU

US

305

2Ch

opM

1G

KR

51h

opM

1PU

KR

dua

l15ho

pM1P

U

SE

5hop

M1P

U GB

EN

30ho

pM1

PU

GB

EN

36ho

pM1

PU

NO

N3

0hop

M1

PU

SE

10ho

pM2

PU

GB

EN

37ho

pM2

PU

ZA

Sou

thA

frica7ho

pM2

DE

942

hopM

2P

U

PT

B36

hopM

2

PT

285/9

9hop

M2P

UP

T17

76/05

hopM

2P

TB

68ho

pM2P

UP

TB

13ho

pM1G

PT

B25

hopM

2G

PT

B25hopM

1G

BR

358.96hopM2P

U

BR

358.96hopM1P

UFR

2432hopM2G

PTB

31hopM2G

PT38hopM

2G

US

2718ChopM

2G

US

2718ChopM

1G

PTB

15hopM2P

U

PTB

6hopM2

PTB

2hopM1P

U

DE948hopM

2G

PTB

19hopM2P

U

PT224/99hopM

2PU

PTB

21hopM2G

PTB47hopM2

PT228/99hopM

2G

PT207/99hopM2G

PT207/99hopM1G

US1904hopM2PU

SE57hopM1G

USJ99hopM1PU

USJ99hopM2PU

PT173/00hopM2G

PT173/00hopM1G

SE18hopM1PU

PT70hopM2PU

PTB2hopM2PUUS2779ChopM2G

BR1126.95hopM2PU

BR1311.95hopM2GC

BF11ABFhopM2PU

BF11ABFhopM1PU

PTB51hopM2PU

PT107hopM1G

US1675DhopM2PU

PTB17hopM2

PT145/99hopM1PU

FRF93hopM2PU

PT2hopM2PU

USB8hopM2PU

PT771/99hopM2

SG8033hopM2PTB16hopM2PU

PTB10hopM2GPT219/99hopM2PU

PTB8hopM2 CO967DhopM2PU PTB18hopM2 PTB9hopM2PUPTB14hopM2

0,02

100

hopN

hopM

Cluster II

Cluster II

86

86

Figura 4: Análise filogenética de 379 sequências, (147 hopM e 232 hopN) de H. pylori. O país de origem (PT,

Portugal; FR, França; SE, Suécia; DE, Alemanha; GB, Inglaterra; NO, Noruega; US, EUA; CO, Colômbia; JP, Japão; KR, Coreia; SP, Singapura; BF, Burquina-Faso) e a patologia (PU, úlcera péptica; G, gastrite; GC, cancro gástrico) estão representados no início e no fim da designação de cada estirpe clínica, respectivamente. O valor do índice de comprimento dos ramos está representado na árvore. Os números junto dos ramos principais indicam os valores de bootstrap>75 depois de 1000 interacções. Os círculos tracejados assinalam os dois clusters originados por segregação geográfica das estirpes. Cluster I, a azul corresponde ao grupo ocidental; cluster II, a vermelho corresponde ao grupo asiático.

Seguidamente foi avaliado o grau de similaridade entre as sequências de nucleótidos

de hopM e hopN. A observação do gráfico de similaridade sugere a existência de 4 regiões

distintas nos dois genes, à semelhança do que foi descrito recentemente num trabalho

analisando apenas estirpes de referência [118], designadas por segmento 1 (hopM: 1-

360pb; hopN: 1-360pb), segmento 2 (hopM: 360-873pb; hopN: 360-867pb), segmento 3

(hopM: 873-1824pb; hopN: 867-1818pb) e segmento 4 (hopM: 1824-2085pb; hopN: 1818-

2079pb) (Figura 5).

Resultados

Andrea Santos

18

Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento 4

Sim

ilari

dade

(%

)

Posição (pb)

hopM

hopN

Região que diferencia os dois genes

Figura 5: Representação gráfica da similaridade entre as 379 sequências de nucleótidos dos genes hopM e hopN de estirpes de Helicobacter pylori. Os gráficos foram gerados com o modelo Kimura 2-parameter, uma janela de 200pb, um passo de 20pb, sem Gap Strip e como referência a sequência hopM da estirpe HPAG1.

O segmento 1 corresponde à região 5’ e é uma zona relativamente conservada entre os

dois genes, apresentando uma similaridade superior a 84% na região mais extensa deste

segmento. Observa-se no entanto que nos primeiros 100 pb em ambos os genes, esta

similaridade diminui para aproximadamente 64%, o que pode reflectir a variação no número

de repetições CT observada nesta zona. O segmento 2 é a região que apresenta maior

variabilidade (similaridade mínima≈34%) e que corresponde à região de diferenciação dos

dois genes, enquanto o segmento 3 é uma zona bastante conservada, tanto entre genes

como intragene (similaridade≈80%). No segmento 4, observa-se um grau de polimorfismo

considerável (similaridade mínima≈68%), mas ao contrário dos segmentos anteriores, a

diversidade é observada quer entre sequências do mesmo gene, quer entre sequências dos

dois genes. Esta observação aponta para a existência de variantes alélicas, com zonas de

cruzamento entre as sequências das diferentes estirpes, sugerindo fenómenos de

recombinação.

Relativamente aos parâmetros evolutivos, calcularam-se para os dois genes as distâncias

moleculares das sequências de nucleótidos e de aminoácidos, e foi determinado o número

de substituições sinónimas (Ks) e não sinónimas (Ka), assim como a razão Ka/Ks. Dentro de

cada gene, as distâncias moleculares obtidas para as sequências nucleotídicas foram para o

gene hopM de 0,084±0,003 e para hopN de 0,079±0,003 (Tabela 2). Observou-se ainda que

as duas sequências da dupla cópia do mesmo gene (parólogos) eram mais próximas entre

si (0,025±0,004 para a dupla cópia hopM e 0,026±0,003 para a dupla cópia hopN), do que o

mesmo gene em estirpes diferentes (ortólogos) (Tabela 2). Relativamente à sequência de

aminoácidos, as distâncias moleculares obtidas foram bastante similares (Tabela 2). As

frequências Ks e Ka foram semelhantes para os dois genes, bem como o valor da razão

Ka/Ks (Tabela 2), verificando-se uma maior proporção de substituições sinónimas. Assim,

Resultados

Andrea Santos

19

tendo em conta que as substituições sinónimas são mais frequentes do que as não

sinónimas (Ks>Ka) e que o resultado da razão Ka/Ks é inferior a um, podemos especular

que o tipo de selecção que está a actuar sobre estes genes é a selecção negativa ou

purificadora [117]. Esta hipótese foi testada pelo método Codon-Based Z-test [119], sendo

suportada estatisticamente para os dois genes (pZ-test<0,001).

Foram também comparados os dois genes entre si e obteve-se para a sequência de

nucleótidos a distância molecular de 0,146±0,006 e para a proteína a distância de

0,161±0,011, o que corresponde a uma percentagem de identidade de 85,4% de 83,9%,

respectivamente.

Tabela 2: Análise das distâncias moleculares, substituições sinónimas e não sinónimas para as sequências correspondentes ao gene completo e segmentos 1, 2, 3 e 4 dos genes hopM e hopN.

hopM (n=147) Distância Molecular Ks

& Ka

& Ka/Ks

#

(nt) (a.a) Gene inteiro 0,084±0,003* 0,073±0,005 0,287±0,016 0,041±0,003 0,143±0,013 Segmento 1 0,073±0,007 0,041±0,009 0,280±0,040 0,025±0,006 0,089±0,025 Segmento 2 0,062±0,005 0,056±0,009 0,187±0,023 0,031±0,005 0,166±0,034 Segmento 3 0,088±0,005 0,076±0,008 0,327±0,026 0,041±0,005 0,110±0,015 Segmento 4 0,128±0,012 0,142±0,023 0,427±0,077 0,084±0,016 0,197±0,052

hopN (n=232) Distância Molecular Ks

& Ka

& Ka/Ks

#

(nt) (a.a) Gene inteiro 0,079±0,003 0,071±0,005 0,266±0,016 0,038±0,003 0,143±0,014 Segmento 1 0,076±0,008 0,044±0,010 0,291±0,039 0,026±0,006 0,089±0,024 Segmento 2 0,055±0,005 0,063±0,010 0,147±0,020 0,032±0,005 0,218±0,045 Segmento 3 0,079±0,005 0,066±0,008 0,300±0,025 0,035±0,005 0,117±0,019 Segmento 4 0,126±0,012 0,143±0,023 0,427±0,076 0,084±0,015 0,197±0,050

n, número de sequências analisadas. nt, nucleótidos; aa, aminoácidos &Ks, substituições sinónimas; Ka, substituições não-sinónimas.

* valor±erro. # pZ-test<0,001 para hipótese purificadora (Ka/Ks<1).

De uma maneira geral, dentro de cada gene, observa-se que o segmento 2 é o mais

conservado, enquanto o segmento 4 é o que apresenta maior distância molecular, quer ao

nível da sequência de nucleótidos quer ao nível da sequência de aminoácidos, corroborando

a análise do gráfico de similaridade (Figura 5). Curiosamente o segmento 2 do gene hopN,

apresenta uma distância molecular maior nas sequências de aminoácidos, do que nas

nucleotídicas, o que está de acordo com a maior razão Ka/Ks observada neste segmento,

comparativamente com os restantes segmentos. Relativamente às frequências Ks e Ka é de

realçar a maior taxa de substituição no segmento 4, com particular ênfase nas substituições

não sinónimas (aproximadamente quatro vezes superior). No global, os parâmetros

evolutivos mostram que este segmento é o mais variável dentro de cada gene, apoiando a

hipótese de constituir uma região de variação alélica (Tabela 2). À semelhança do que foi

observado para o gene completo, o valor da razão Ka/Ks obtido para cada um dos

Resultados

Andrea Santos

20

segmentos, foi inferior a um, sugerindo a existência de uma pressão evolutiva para a

manutenção das sequências de cada segmento. Esta hipótese foi testada pelo método

Codon-Based Z-test [119], sendo suportada estatisticamente (pZ-test<0,001) nos quatro

segmentos de ambos os genes.

3. Variação alélica

O segmento 4 de ambos os genes revelou-se bastante polimórfico, apresentando

diferenças nucleótidicas acentuadas, tanto entre genes (Figura 5) como dentro de cada

gene (Figura 6). Este polimorfismo é consistente com a elevada taxa de substituição de

nucleótidos observada neste segmento (Tabela 2). Para além disso, observa-se uma maior

distância molecular das sequências deste segmento, comparativamente com os outros três,

sendo esta distância ainda maior se compararmos as sequências de aminoácidos, o que

corrobora a ideia da existência de variantes alélicas.

Assim, a partir de um alinhamento gerado com sequências de aminóacidos

correspondentes ao segmento 4 dos genes hopN e hopM (Figura 7A), observou-se a

existência de 4 variantes alélicas distintas, designadas por AI, AII, AIII e AIV, comuns a

ambos os genes e com grau de similaridade entre genes (Tabela 3) idêntico ao grau de

similaridade dentro do mesmo gene (resultado não mostrado). Estas variantes foram

identificadas em todas as estirpes estudadas, embora com frequências diferentes. Assim

foram observados dois alelos predominantes, os alelos AI (39,2%, 149/379) e o AII (42%,

159/379), sendo as frequências dos alelos AIII e AIV de 12,9% (49/379) e de 5,8% (22/379),

respectivamente.

Tabela 3: Análise das percentagens de identidade obtidas entre as sequências do segmento 4 de cada uma das

variantes alélicas de hopM e hopN.

Alelo hopM vs alelo hopN (n=379) % Similaridada AI (n=149) AII (n=159) AIII (n=49) AIV (n=22)

nt 94,5 93,3 93,7 94,2 aa 95 94,8 94,6 96,4

n, número de sequências analisadas. nt, sequência de nucleótidos; aa, sequência de aminoácidos

A análise dos gráficos de similaridade por variante alélica (Figura 8), em conjunto com a

análise do gráfico de similaridade considerando todos os alelos (Figura 6), suporta a

definição do segmento 4 como a região alélica, já que dentro de cada alelo esta região é das

mais conservadas (Figura 8) e a mais diversa quando se consideram todos os alelos do

mesmo gene (Figura 6). A análise dos gráficos de similaridade considerando todos os alelos

(Figura 5 e 6), bem como a análise das sequências de aminoácidos do segmento 4 (Figura

7A) sugere que os alelos AIII e AIV resultam de fenómenos de recombinação entre as

variantes AI e AII. Esta hipótese é ainda suportada pela análise da similaridade dos alelos

dois a dois, verificando-se que os pares mais afastados são o AI/AII e o AIII/AIV

Resultados

Andrea Santos

21

(similaridade mínima de 66% e 70%, respectivamente), e os pares AI/AIII e AII/AIV os mais

próximos (similaridade mínima de 80% e 82%, respectivamente). Si

mila

ridad

e (%

)

Posição (pb)

Segmento 4Segmento3Segmento2Segmento 1

Figura 6: Representação gráfica da similaridade entre 147 sequências de nucleótidos do gene hopM,

identificando os 4 alelos (AI, vermelho; AII, verde; AIII, amarelo e AIV, azul). Os gráficos foram gerados com o modelo Kimura 2-parameter, uma janela de 200pb, um passo de 20pb, sem Gap Strip e como referência a sequência do alelo AI obtida no locusM da estirpe de referência HPAG1. Um resultado semelhante foi obtido para o gene hopN (não apresentado).

A I A III

A II A IV

hopM AIhopM AII

hopN AIII

hopN AIV

hopN AIIhopN AI

hopM AIIIhopM AIV

A

B

Figura 7: Alelos hopM e hopN. (A) Alinhamento representativo das variações ao nível das sequências de aminoácidos do segmento 4 de hopM e hopN (aminoácidos 620 ao 700). A sequência do gene hopM da estirpe

HPAG1, que apresenta o alelo AI foi utilizada como referência. Os pontos indicam a presença de aminoácidos iguais à estirpe de referência. (B) Esquema representativo dos quatro alelos demonstrando que as variantes alélicas AIII e AIV são putativos recombinantes das variantes AI e AII.

PT285/99hopM1PU

PTB25hopM2G

PTB36hopM2

BF11ABFhopM1PU

PTB13hopM2G

DE942hopM2PU

US2779ChopM2G

FR2432hopM2G

PTB31hopM1G

PTB68hopM1PU

PT38hopM1G

Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: Off, Kimura (2-parameter), T/t: Variable

Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y S

core

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

PT285/99hopM1PU

PTB25hopM2G

PTB36hopM2

BF11ABFhopM1PU

PTB13hopM2G

DE942hopM2PU

US2779ChopM2G

FR2432hopM2G

PTB31hopM1G

PTB68hopM1PU

PT38hopM1G


Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y S

core

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

USJ99hopM2PU

PESJM180hopM1G

PTB47hopM2

PTB19hopM2PU

PTB21hopM2G

PTB15hopM2PU

PT28hopM2PU

DE948hopM2G

DE952hopM2G

CO216ChopM2G

BR313.03hopM2G

NON29hopM1PU

PTB2hopM1PU

PT224/99hopM2PU


Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y S

core

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

USJ99hopM2PU

PESJM180hopM1G

PTB47hopM2

PTB19hopM2PU

PTB21hopM2G

PTB15hopM2PU

PT28hopM2PU

DE948hopM2G

DE952hopM2G

CO216ChopM2G

BR313.03hopM2G

NON29hopM1PU

PTB2hopM1PU

PT224/99hopM2PU


Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y S

core

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

PTB51hopM1PU

BR1126.95hopM2PU

NON30hopM1PU

US3052ChopM1G

JPJ83hopM1GC

JPJP30ADhopM1PU

JPJPT160ChopM1G

JPJ1hopM1PU

JPJ167hopM1PU

KRDual17hopM1PU

KRNUD14hopM1G

KRNUD47hopM1G

KRNUD34hopM1G

KRNUD36hopM1G

KRDual15hopM1PU

KRDual5hopM1PU

PEShi470hopM1G

KR51hopM1PU

JPF57hopM1GC

PECuz20hopM1

PESat464hopM1Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: Off, Kimura (2-parameter), T/t: Variable

Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y Sc

ore

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

PT655/99hopM2G

US2718ChopM2G

SE58hopM1PU

DE950hopM1G

DE955hopM1G

KRDU852hopM1PU

KRDual30hopM1PU

PEPeCan4hopM1GC

PTB25hopM1G

PTB57hopM2G

PTB57hopM1G

PT224/99hopM1PU

PT417/02hopM2

PT417/02hopM1PU

BR358.96hopM2PU

BR358.96hopM1PU

SES569hopM1PU

FRHorhopM2PU

FRHorhopM1PU

US2781ChopM2G

US2781ChopM1GWindow : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: Off, Kimura (2-parameter), T/t: Variable

Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y Sc

ore

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

PTB51hopM1PU

BR1126.95hopM2PU

NON30hopM1PU

US3052ChopM1G

JPJ83hopM1GC

JPJP30ADhopM1PU

JPJPT160ChopM1G

JPJ1hopM1PU

JPJ167hopM1PU

KRDual17hopM1PU

KRNUD14hopM1G

KRNUD47hopM1G

KRNUD34hopM1G

KRNUD36hopM1G

KRDual15hopM1PU

KRDual5hopM1PU

PEShi470hopM1G

KR51hopM1PU

JPF57hopM1GC

PECuz20hopM1

PESat464hopM1Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: Off, Kimura (2-parameter), T/t: Variable

Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y Sc

ore

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

PT655/99hopM2G

US2718ChopM2G

SE58hopM1PU

DE950hopM1G

DE955hopM1G

KRDU852hopM1PU

KRDual30hopM1PU

PEPeCan4hopM1GC

PTB25hopM1G

PTB57hopM2G

PTB57hopM1G

PT224/99hopM1PU

PT417/02hopM2

PT417/02hopM1PU

BR358.96hopM2PU

BR358.96hopM1PU

SES569hopM1PU

FRHorhopM2PU

FRHorhopM1PU

US2781ChopM2G

US2781ChopM1GWindow : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: Off, Kimura (2-parameter), T/t: Variable

Position

2.0001.8001.6001.4001.2001.0008006004002000

Sim

ilarit

y S

core

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

Alelo AI hopM (n=48)

Sim

ilari

dade

(%)

A)

Segmento 1 Segmento2

Alelo AII hopM (n=68)

Alelo AIII hopM (n=18) Alelo AIV hopM (n=13)

Sim

ilari

dade

(%)

Sim

ilari

dade

(%)

Sim

ilari

dade

(%)

C)

B)

D)

Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento 4 Segmento 2 Segmento 3 Segmento 4Segmento 1

Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento 4Segmento 3 Segmento4

Figura 8: Gráficos de similaridade entre sequências de nucleótidos do gene hopM, por variante alélica. Os gráficos foram gerados pelo método de Kimura 2-parameter, uma janela de 200pb, um passo de 20pb, sem Gap Strip e utilizando como referência as estirpes de referência: HPAG1N2 (A) e F30N1 (B) e as estirpes clínicas PT194/99hopN2PU (C) e PT285/99hopN2PU (D). Um resultado semelhante foi obtido para o gene hopN (não apresentado).

Resultados

Andrea Santos

22

3.1 Distribuição dos alelos por gene e origem geográfica

No geral, foram observados dois alelos predominantes em ambos os genes, os alelos AI

e o AII. No gene hopM o alelo AI estava presente em 32,7% das estirpes (48/147) e o alelo

AII em 46,3% (68/147). No gene hopN o alelo mais frequente foi o AI em 43,5% das estirpes

(101/232), seguido do AII em 39,2% das estirpes (91/232). Os alelos AIII e AIV foram

encontrados menos frequentemente em ambos os genes (Figura 9).

AI32,7%

AII46,3%

AIII12,2%

AIV8,8%

AI43,5%

AII39,2%

AIII13,4%

AIV3,9%

Alelos hopM (n=147) Alelos hopN (n=232)

Figura 9: Distribuição dos alelos por gene, na população geral.

Posteriormente, foi estimada a frequência de cada alelo por grupo geográfico (Figura 10).

AI35,7%

AII37,5%

AIII15,2%

AIV11,6%

Grupo Ocidental (n=275)

Alelos hopM (n=112)

AI59,5%

AII14,1%

AIII17,8%

AIV8,6%

Alelos hopN (n=163)

AI11,1%

AII81,5%

AIII7,4%

Grupo Asiático (n=81)

Alelos hopM (n=27)

AI9,3%

AII87,0%

AIII3,7%

Alelos hopN (n=54)

AI37,5%

AII25%

AIII25%

AIV12,5%

Alelos hopM (n=8)

Grupo Africano (n=23)

AI86,7%

AII13,3%

Alelos hopN (n=15)

Figura 10: Distribuição dos alelos de cada gene de acordo com a origem geográfica das estirpes de H. pylori.

Na população ocidental observou-se a presença das quatro variantes alélicas em cada

gene, sendo os alelos mais frequentes os alelos AI no gene hopN e o alelo AII no gene

hopM. No grupo de estirpes de origem asiática, o alelo AII foi o mais frequentemente

observado em ambos os genes e o alelo AIV não foi detectado. Na população africana, no

gene hopM foram identificados as quatro variantes alélicas, sendo a mais frequente a

variante AI. No gene hopN o alelo AI foi igualmente o mais prevalente e curiosamente não

foram detectadas as variantes recombinantes (AIII e AIV) (Figura 10).

Resultados

Andrea Santos

23

Globalmente, verificou-se que na população ocidental e africana o alelo AI foi o mais

prevalente, com frequências de 49,8% (137/275) e de 69,6% (16/23) respectivamente,

enquanto o AII foi o alelo mais prevalente na população de origem asiática (85,2%, 69/81).

3.2 Distribuição dos alelos dos genes hopM e hopN de acordo com a patologia e

perfil de virulência

Com o intuito de verificar uma possível associação entre os alelos hopM/hopN e a

patologia ou o perfil de virulência das estirpes, foi avaliada a distribuição dos alelos dos dois

genes em conjunto e separadamente, tendo em conta estes dois parâmetros. Para esta

análise foram excluídas as estirpes isoladas de doentes sem informação da patologia

associada ou para as quais não tinha sido previamente determinado o genótipo de virulência

(cagA e vacAs1 positivos). Os valores de p apresentados referem-se à comparação entre ter

ou não o alelo por patologia (G ou UP) ou o alelo por genótipo de virulência (virulento/não

virulento).

3.2.1 Distribuição dos alelos hopM/hopN de acordo com a patologia

No geral, verifica-se uma frequência muito semelhante de cada um dos alelos tanto na

UP como na G, à expeção do alelo AIV que apresenta uma frequência superior na G

relativamente à UP. O alelo AII foi o mais prevalente nas estirpes de CG (Figura 11).

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

(n=191)

(n=127)

(n=15)

População Geral (n=333)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

I II III IV

45,5

34,0

15,2

5,2

43,3

33,9

12,6 10,213,3

86,7

UP

G

CG

0

10

20

30

40

50

60

I II III IV

52,7

22,9

16,8

7,6

52,9

25,5

10,8 10,8

25,0 25,0

50,0

UP G CG

Grupo Ocidental (n=237)

(n=131) (n=102) (n=4)

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

0

20

40

60

80

100

I II

13,5

86,5

4,5

77,3

5,9

70,6

UP G CG

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

Grupo Asiático (n=76)

(n=37) (n=22) (n=17)

A

B C

Figura 11: Frequência das 4 variantes alélicas de acordo com a patologia, na população geral (A) e por origem

geográfica (B e C).

Resultados

Andrea Santos

24

Por origem geográfica, na população ocidental (Figura 11B) verifica-se a mesma

tendência observada na população geral, não se observando nenhuma associação

estatisticamente significativa entre alelo e patologia. Os dados mostram no entanto, uma

associação entre o alelo AIII e o CG, embora sem significado estatístico dado o pequeno

número de estirpes estudadas. Na população asiática (Figura 11C), o alelo AII foi mais

frequentemente encontrado em todas as patologias, devido provavelmente à sua elevada

prevalência nesta população. No grupo africano, as estirpes foram todas isoladas de

doentes com UP, sendo a distribuição dos alelos AI, AII, AIII e AIV respectivamente de 65%

(13,20), 15% (3,20), 15% (3,20) e 5% (1/20).

3.2.2 Distribuição dos alelos do gene hopM e hopN por perfil de virulência

Foi também avaliada a associação entre os alelos hopM/hopN e os genótipos de

virulência de H. pylori. No geral, verifica-se uma maior prevalência dos alelos AII e AIII nas

estirpes com perfil mais virulento e dos alelos AI e AIV com o genótipo menos virulento,

apesar das diferenças observadas não serem suportadas estatisticamente (Figura 12).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

I II III IV

42,7

36,2

16,1

5,0

48,3

34,8

7,9 9,0

virulento

não virulento

% d

e es

tirp

es p

osi

tiva

s

População Geral (n=288)

(n=199)

(n=89)

Figura 12: Frequência dos alelos hopM+hopN de acordo com genótipo de virulência da estirpe, na população

geral.

Considerando a distribuição dos alelos por genótipo de virulência em cada grupo

geográfico, verifica-se na população ocidental (Figura 13), que os alelos AI e AIII estão

associados ao genótipo de virulência, sendo a associação do AIII ao perfil mais virulento,

estatisticamente significativa. Os alelos AII e AIV são mais prevalentes no grupo de estirpes

com genótipo menos virulento, tendo a associação do Alelo AII ao genótipo menos virulento

suporte estatístico. Estas mesmas associações foram observadas considerando apenas os

alelos hopN (Figura 13C), não se verificando na distribuição dos alelos hopM (Figura 13B).

Na população asiática, as estirpes são todas do genótipo virulento, independemente do

alelo que apresentam, de acordo com o que foi descrito anteriormente [84,103]. No entanto,

o alelo AII foi o mais frequentemente detectado, com uma frequência de 85,2% (69/81) o

que parece indicar uma forte relação deste alelo com esta população. Na população

Resultados

Andrea Santos

25

africana, o alelo AIV não foi encontrado associado ao genótipo de virulência e os alelos AII e

AIII foram identificados apenas em estirpes com perfil virulento, apresentando ambos uma

frequência de 18,2% (2/11) respectivamente. Relativamente ao alelo AI, foi observado tanto

em estirpes virulentas como em não virulentas, sendo a sua frequência respectivamente de

63,6% (7/11) no grupo de estirpes com perfil virulento e de 100% (n=3) no grupo menos

virulento.

0

10

20

30

40

50

60

I II III IV

57,8

13,3

21,1

7,8

45,9

35,3

8,210,6

Virulento

não virulento

Alelos hopM + hopN (n=213)A

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

(n=128)

(n=85)

0

10

20

30

40

50

I II III IV

37,9

27,6

20,7

13,8

35,1

48,6

8,1 8,1

Virulento não virulento

Alelos hopMB

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

(n=29) (n=37)

0

10

20

30

40

50

60

70

I II III IV

63,6

9,1

21,2

6,1

54,2

25,0

8,312,5

virulento não virulento

% d

e e

sti

rp

es p

osit

ivas

Alelos hopNC

(n=99) (n=48)

p=0,003

p=0,02

p=0,02p=0,05

Figura 13: Distribuição das quatro variantes alélicas na população ocidental, considerando os genes em conjunto (A) e separadamente (B e C), de acordo com o genótipo de virulência das estirpes de H.pylori.

Discussão e Conclusão

Andrea Santos

26

Capítulo 5: Discussão e Conclusão

O presente trabalho teve como objectivo o estudo de dois membros das OMPs de H.

pylori, hopM e hopN, mais concretamente o estudo da sua diversidade genética, evolução e

a avaliação da sua associação com a patologia gástrica e com marcadores moleculares de

virulência de H. pylori, nomeadamente com os genes cagA e vacA.

Foram estudadas 234 estirpes clínicas e 23 estirpes de referência isoladas de doentes de

origem geográfica diferente e apresentando diversas gastropatologias. Em todas as estirpes

foi identificada pelo menos uma cópia de um destes genes no seu genoma, o que sugere a

existência de pressão selectiva para serem mantidos na bactéria, como já foi descrito para

outros genes codificantes de OMPs, tais como homA/homB, babA/babB, sabA e oipA

[99,104,120].

A análise de ambos os genes revelou diversidade tanto relativamente ao número de

cópias de cada gene como à sua localização genómica. Esta diversidade não foi associada

à patologia da qual a estirpe foi isolada, mas mostrou especificidade geográfica, havendo

uma diferença clara entre as estirpes de origem oriental e as de origem ocidental, à

semelhança do que foi descrito para outros factores de virulência de H. pylori [63,64,88,121-

123]. Na população ocidental todos os genótipos possíveis de hopM/hopN foram

identificados (cópia única ou dupla cópia, do mesmo gene ou genes diferentes), enquanto

na população asiática apenas os genótipos de cópia única foram observados.

Curiosamente, na população africana apenas foram identificados os genótipos de dupla

cópia, embora dado o número reduzido de estirpes analisadas, não se possa concluir se

este resultado reflecte uma tendência desta população, ou não. Vários estudos apontam

para que a variação no número de cópias de genes que codificam OMPs, esteja implicada

na adaptação da bactéria a hospedeiros específicos, sendo um factor crucial para o

desenvolvimento de uma infecção crónica e persistente [56,100,120]. Assim, sugere-se que

a especificidade geográfica no número de cópias hopM/hopN reflicta igualmente o papel

destes genes neste processo adaptativo.

O facto de estes genes terem demonstrado uma elevada similaridade tanto ao nível da

sequência de nucleótidos (Tabela 2) como na sequência de aminoácidos, especialmente na

região 5’ e 3’ (Tabela 2, segmentos 1 e 3), sugere a possibilidade de ocorrência de

fenómenos de recombinação intra e intergenómica, que podem levar a duplicação, delecção

ou conversão génica entre hopM e hopN, como resposta a variações ambientais. A

presença de uma ORF mais pequena no locusN de todas as estirpes asiáticas e de algumas

estirpes ocidentais, sugere que nestes casos o gene foi perdido, deixando um remanescente

que pode possibilitar a sua integração novamente no genoma, tal como foi sugerido para


Andrea Santos

27

outros genes codificantes de OMPs de H.pylori (homA/homB, babA/babB) [64].

Curiosamente, estas proteínas putativas mais pequenas correspondem nas estirpes

ocidentais à região alélica (segmento 4) e no caso das estirpes asiáticas à fusão do péptido

sinal de hopM/hopN com a região 3’ de uma ADN-metiltransferase, constituindo assim locais

onde a elevada homologia com os genes, facilitam a recombinação e a integração do gene

no locus vazio. Um estudo recente sugere que estes fenómenos de perda e ganho de hopM

e hopN estão associados a um mecanismo complexo de recombinação, no qual ocorre uma

duplicação seguida de inversão de uma extensa região cromossómica [118,124].

A análise das sequências dos genes hopM e hopN mostrou, na maioria das estirpes

estudadas, a presença de uma ORF completa, havendo no entanto cerca de 2,6% das

estirpes com sequências truncadas. Em todas estas estirpes o desfasamento da grelha de

leitura deveu-se ao desemparelhamento entre as bases complementares (misparing),

resultando na adição ou delecção de unidades CT na região 5’ de ambos os genes. Esta

alteração do número de repetições pode originar a adição ou remoção de codões STOP,

alterando a expressão da proteína devido à mudança de fase on/off [60]. Assim, em ambos

os genes pode ocorrer variação de fase e regulação da expressão génica pelo mecanismo

de slipped-strand misparing, à semelhança do que já foi descrito para outros genes de

OMPs, tais como babB, sabA e sabB, hopZ, oipA e homB [64,104,105,108,125]. A variação

de fase como mecanismo de diversidade é utilizada por várias espécies bacterianas e tem

sido sugerido como marcador consistente de genes envolvidos da adaptação a um nicho

específico ou na evasão à resposta imunitária, contribuindo para a variação antigénica e/ou

virulência durante a infecção [60,127,128]. Um exemplo deste mecanismo foi demonstrado

para os genes babA e babB, no qual a mudança de fase de leitura possibilita à bactéria a

constituição de uma população heterogénea, com dinâmicas de adesão diferentes

permitindo-lhe adaptar-se a diferentes condições ambientais [99]. Assim, tendo em conta a

possibilidade de ambos os genes hopM e hopN serem regulados por variação de fase e por

eventos de recombinação intra e intergenómica, podemos mais uma vez especular que

estes genes estão envolvidos na adaptação de H. pylori ao seu hospedeiro humano.

Um estudo de complexos de proteínas de H. pylori mostrou que BabA e BabB formam

complexos com HopM e HopN [109]. Por outro lado, estudos recentes sugerem que

nenhuma das proteínas BabA ou BabB é capaz de induzir resposta imunitária em macacos

[109,111], nem são os antigénios imunodominantes em humanos [109,112]. Uma hipótese

que poderia explicar este facto seria a de que as proteínas de membrana que interagem

com BabA ou BabB, por exemplo, HopM e HopN, poderiam mascarar os epítopos daquelas

proteínas e consequentemente serem elas próprias expostas e assim antigénicas [109].

Esta hipótese é ainda corroborada pelo facto de as proteínas HopN e HopM terem

demonstrado reactividade contra soros de pacientes positivos para H. pylori [109,113].


Andrea Santos

28

Todos estes dados sugerem que as proteínas HopM e HopN poderão desempenhar um

papel importante na relação entre a bactéria e o seu hospedeiro, nomeadamente,

constituindo prováveis antigénios e consequentemente importantes alvos vacinais [109,110],

ou por outro lado, poderão desempenhar um papel na adesão de H. pylori à célula epitelial

gástrica, visto que formam complexos com uma das principais adesinas, BabA [109,110].

Com o objectivo de tentar clarificar o papel destes genes na virulência das estirpes de

H.pylori, foram avaliadas as associações entre a presença dos genes hopM/hopN e a

patologia e o perfil de virulência da estirpe. No geral, foi verificada uma associação

estatisticamente significativa entre a cópia única hopN e o genótipo mais virulento (cagA e

vacAs1 positivas), e entre a dupla cópia hopM e a dupla cópia MN e o genótipo menos

virulento (cagA negativo, vacAs2). Verificou-se ainda, na população de origem ocidental, a

associação estatisticamente significativa entre a dupla cópia hopN e o genótipo mais

virulento e da dupla cópia hopM e o perfil menos virulento. Mais uma vez, estes dados

sugerem um papel determinante destes genes na relação entre a bactéria e o seu

hospedeiro. A clarificação das suas funções é por isso crucial e será posteriormente

avaliada através de estudos funcionais das respectivas proteínas, nomeadamente a

avaliação das propriedades antigénicas e da contribuição de HopM e HopN para as

características pró-inflamatórias de H. pylori, bem como o esclarecimento do envolvimento

destas proteínas na adesão à mucosa gástrica.

A reconstrução filogenética dos genes hopM e hopN sugere uma segregação baseada na

origem geográfica da estirpe, com as estirpes de origem ocidental e asiática a apresentarem

uma maior divergência entre si. Esta divergência foi também observada noutros genes de H.

pylori, tais como, genes que codificam outras OMPs (homA/homB e babA/babB), genes de

virulência (cagA e vacA) e genes housekeeping [38,63,107,129].

Os dois genes revelaram um elevado grau de similaridade entre si, com uma distância

moleular de 0,146±0,006 ao nível da sequência de ADN e de 0,161±0,011 na sequência de

aminoácidos. Estes resultados são bastante similares aos observados para outros genes

duplicados de OMPs [54,97] o que sugere a existência de fenómenos de duplicação ou

conversão génica e de recombinação intra e intergenómica entre eles.

Globalmente, os genes hopM e hopN apresentaram taxas de substituição de nucleótidos

muito semelhantes, com predomínio das substituições sinónimas, sugerindo que os dois

genes estão sujeitos aos mesmos constrangimentos funcionais, sendo estes mantidos por

acção da selecção negativa ou purificadora.

De uma maneira geral, dentro de cada gene, observa-se uma maior conservação do

segmento 2 (Figura 5 e 6 e Tabela 2), enquanto o segmento 4 apresenta maior distância

molecular, quer ao nível da sequência de nucleótidos quer ao nível da sequência de

aminoácidos. Mais concretamente, o segmento 4 de ambos os genes revelou um elevado


Andrea Santos

29

polimorfismo, apresentando diferenças acentuadas, tanto entre genes (Figura 5) como

dentro de cada gene (Figura 6). Este polimorfismo foi consistente com a elevada taxa de

substituição de nucleótidos observada neste segmento (Tabela 2) e com a maior distância

molecular das sequências deste segmento quando comparado com os outros três,

permitindo identificá-lo como região alélica. Assim, no segmento 4, foi possível identificar

quatro variantes alélicas, comuns aos dois genes, à semelhança do que foi previamente

descrito num trabalho utilizando apenas estirpes de referência [118]. A existência de

variação alélica entre genes que codificam OMPs, é um mecanismo de diversidade

amplamente identificado, tendo sido já várias vezes descrito em H.pylori

[63,64,105,109,110]. Para hopM e hopN, observaram-se duas variantes alélicas globalmente

mais prevalentes (alelos AI e AII) e toda a análise realizada ao nível das sequências sugere

que as outras duas variantes (alelos AIII e AIV), menos prevalentes a nível mundial,

resultaram de fenómenos de recombinação intra ou intergenómicas, entre as variantes mais

frequentes.

No global, nenhum alelo foi significativamente associado com a patologia ou a origem

geográfica da estirpe, provavelmente devido à maior frequência dos tipos AI e AII, tanto nas

diferentes patologias estudadas como nas diferentes origens geográficas. No entanto, são

de sublinhar duas diferenças marcadas, o facto de o alelo AII ser o mais prevalente nas

estirpes asiáticas e não o AI como nas estirpes ocidentais e africanas, e o alelo AIV não ter

sido detectado em nenhuma estirpe asiática.

A distribuição das variantes alélicas pelo genótipo de virulência, na totalidade da

população em estudo, não mostrou nenhuma associação. No entanto, considerando cada

grupo geográfico individualmente, verificou-se na população ocidental a associação

estatisticamente significativa entre o alelo AII e o genótipo menos virulento e do alelo AIII

com o genótipo mais virulento, para os dois genes em conjunto e também para estes alelos

do gene hopN. Estas diferenças verificadas em populações de origem geográfica diferente

podem reflectir a adaptação da bactéria a pressões selectivas distintas, encontradas em

hospedeiros específicos, afectando a sua virulência [63,64]. Assim, a variação alélica

observada nos genes hopM e hopN, para além de contribuir para a variação antigénica,

pode ter um papel importante na virulência da estirpe, numa determinada população

humana, reflectindo o complexo processo evolutivo que ocorre durante uma infecção

persistente, resultado das pressões antigénicas ou variações funcionais a que esteve

sujeita, para persistir numa população hospedeira específica.

Em suma, os resultados obtidos no presente trabalho, sugerem que os genes hopM e

hopN contribuem para a adaptação e logo para a persistência da infecção por H. pylori.

Mais, as variantes alélicas podem constituir biomarcadores da virulência da estirpe em

determinadas populações.

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Anexos

Andrea Santos

Anexo I: DISTRIBUIÇÃO DAS ESTIRPES CLÍNICAS DAS Helicobacter pylori (n=234) em ESTUDO

DE ACORDO COM A REGIÃO GEOGRÁFICA, PATOLOGIA, SEXO E IDADE DOS DOENTES

Origem Patologia N.º de estirpes

(n=234)

Sexo masculino

(%)

Média idade ±

SD (anos)

Países Ocidentais

Portugal

UP 36

47,3 51,8 ± 15,4 G 26

ND 12

Total 74

Alemanha UP 8

50,0 58,6 ± 11,9 G 9

Total 17

Suécia UP 13

58,8 66,6 ± 11,2 G 8

Total 21

França UP 4

ND ND G 2

Total 6

Noruega UP 3 ND ND

Inglaterra UP 7 ND ND

EUA UP 4

ND ND G 13

Total 17

Brasil

UP 4

52,5 52,8 ± 16,4 G 2

CG 2

Total 8

UP 4 57,9 50,0 ±12,7 Colômbia G 3

Total 7

Países Ásia Oriental

Japão

UP 16

57,9 44,3 ± 12,7 G 5

CG 10

Total 31

UP 17

76,1 44,7 ± 9,9 Coreia do Sul G 11

CG 1

Total 29

Singapura ND 5 ND ND

Países África Ocidental Burquina-Faso UP 9 ND ND

Nº, número; SD, Desvio padrão; G, gastrite; UP, úlcera péptica; CG, cancro gástrico; ND, Não disponível

Anexos

Andrea Santos

Anexo II: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CONSERVAÇÃO DE ESTIRPES DE Helicobacter pylori

e OBTENÇÃO DE MATERIAL GENÓMICO

A) Isolamento e conservação das estirpes

Reagentes e Material:

Meio HP selectivo (Agar Wilkins Chalgrin suplementado com Vancomicina (10mg/ml),

Trimetroprim (5mg/ml), Fungizona (1ml), Cefsulodina (2mg/ml) e com 10% de sangue de

cavalo) (Biogerm)

Meio HP não selectivo (Agar Wilkins Chalgrin suplementado com 10% de sangue de

cavalo) (Biogerm)

Meio TSB (Trypticase Soya Broth) com 15% de Glicerol

Jarras de anaerobiose Mart® Microbiology (Mart Microbiology B.V., Drachten,

Holanda)

Equipamento:

Sistema gerador de gás AnoxomatTM (Mart Microbiology B.V.)

Procedimento:

Isolamento:

Descongelou-se um tubo contendo a estirpe conservada a -80ºC em TBS com 15% de

glicerol, e semeou-se o homogeneizado em meio selectivo (HP selectivo) e em meio não

selectivo (HP não selectivo). De seguida, as placas foram incubadas a 37ºC, em atmosfera

de microaerofilia (5% de O2, 10% de CO2 e 85% de N2). A atmosfera foi obtida por um

sistema gerador de gás AnoxomatTM. Prolongou-se a incubação durante dois dias, com

renovação da atmosfera e observação diária das placas.

Identificação presuntiva:

Foi observada a morfologia típica das colónias de H.pylori (pequenas, brilhantes,

convexas e translúcidas). Foi realizada coloração de Gram de forma a confirmar a

morfologia espiralada e a percentagem de células cocóides.

Conservação:

Após 48h, recuperou-se a cultura bacteriana, tendo-se preparado uma suspensão

bacteriana em 0,5ml de meio TBS com 15% de glicerol, e distribuiu-se em dois tubos de

congelação, que foram guardados a -80ºC.

B) EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO

A extracção de DNA genómico foi realizada pelo kit QIAamp® DNA Mini (Qiagen GmbH),

segundo as instruções do fabricante (114).

Anexos

Andrea Santos

Anexo III: CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ESTIRPES DE REFERÊNCIA DE Helicobacter pylori

TOTALMENTE SEQUENCIADAS E ANOTADAS (n=23) QUE FORAM INCLUÍDAS NO ESTUDO

Estirpe N.º de acesso

de GenBank # Patologia Origem População* Referência

26695 AE000511 G Reino Unido Ocidental (hpEurope) 58

J99 AE001439 UP EUA Africano (hpsWAfrica) 39

HPAG1 CP000241 G Suécia Ocidental (hpEurope) 46

Shi470 CP001072 G Peru Ameríndio(hpsAmerind) 45

G27 CP001173 ND Itália Ocidental (hpEurope) 40

P12 CP001217 UP Alemanha Ocidental (hpEurope) 130

B38 FM991728 MALT França Ocidental (hpEurope) 48

B8 FN598874 UP EUA Ocidental (hpEurope) 42

SJM180 CP002073 G Peru Ocidental (hpEurope) ND

51 CP000012 UP Coreia do Sul Oriental (hpsEAsia) ND

52 CP001680 UP Coreia do Sul Oriental (hpsEAsia) ND

35 A CP002096 UP Coreia do Sul Oriental (hpsEAsia) ND

F30 AP011941 UP Japão Oriental (hspEAsia) 44

F16 AP011940 G Japão Oriental (hpsEAsia) 44

F32 AP011943 CG Japão Oriental (hpsEAsia) 44

F57 AP011945 CG Japão Oriental (hpsEAsia) 44

V225d CP001582 G Venezuela Ameríndio (hpsAmerind) 57

Sat464 CP002071 ND Peru Ameríndio (hpsAmerind) ND

PeCan4 CP002074 CG Peru Ameríndio (hpsAmerind) ND

Cuz20 CP002076 ND Peru Ameríndio (hpsAmerind) ND

Gambia94/24 CP002332 ND Gâmbia Africano (hpsWAfrica) ND

SouthAfrica7 CP002336 ND África do Sul (hspSAfrica) ND

India7 CP002331 ND Índia (hspAsia2) ND

G, gastrite; UP, úlcera péptica; C, cancro gástrico; MALT, Mucosa Associated Lymphoid Tissue;

N.D., Não disponível;

# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lpoks.cgi;

* Classificação da população de H. pylori segundo a distribuição geográfica das estirpes adaptada

de 66,131

.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lpoks.cgi

Anexos

Andrea Santos

Anexo IV: DETECÇÃO DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO POR ELECTROFORESE EM GEL DE

AGAROSE

Reagentes:

Agarose UltraPureTM (Invitrogen S.A)

Tampão TBE 0,5X (0,045M Tris; 0,045M Ácido bórico; 0,01M EDTA)

GelRedTM (10,000x) (Biotium Inc)

Solução de aplicação (0,25% Azul bromofenol; 0,25% Xileno cianol; 15% Ficoll;

120mM EDTA)

Marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen S.A)

Equipamento:

Tina de electroforese de mini géis horizontal i Mupid (Eurogentec S.A, Seraing,

Bélgica)

Transluminador Gel Doc 2000 (Bio Rad Laboratories Ltd.)

Aparelho fotográfico P93 (Mitsubishi Electric Europe B.V., Barcelona, Espanha)

Micropipetas (Eppendorf)

Procedimento:

A agarose foi pesada (1,2g para gel de 1%) e dissolvida, por meio de calor, em tampão

TBE 0,5X (120ml). Após o arrefecimento da agarose, adicionou-se o Gel RedTM (1,5μl) e

distribui-se o preparado pelo tabuleiro, colocando o pente apropriado para a aplicação das

amostras. Estes volumes permitem preparar dois géis de 25ml e quatro de 15ml.

Depois de o gel ter solidificado, colocou-se na tina de electroforese e encheu-se a tina

com tampão TBE 0,5X, de modo a que o gel fique completamente imerso. De seguida,

colocaram-se as amostras (5μl produto de amplificação + 2μl solução de aplicação) e o

marcador de peso molecular nos poços e procedeu-se à corrida com uma voltagem

constante de 100V, durante 30min. No fim, monitorizou-se o gel no transiluminador e tirou-

se uma fotografia.

Anexos

Andrea Santos

Anexo V: Alinhamento representativo de algumas sequências de nucleótidos dos genes hopM e hopN, de estirpes clínicas e de referência em estudo, da região onde é possível distinguir os dois genes (300 a 800 pb). 350 500

SE13MUP GTGGCAAGTCATAGCCCTTTTTATCGGCTGTGGCCCTGGCCCTA-------CC-----------GATAATCAAAGCTATCAATCGTTTGGTAACACACCAG---------------CCCTTAATAG---GACAACCACCACTTGCAATGG

PT499/02MU GTGGCAAGTCATAGCCCTTTTTATTGGCTGCGGCCCTGGCCCTA-------CC-----------AACAATCAAAGCTACCAATCGTTTGGTAACACACCAG---------------CCCTTAATGG---GACAACCACCACTTGCAATCA

USJ99MUP GTGGCAAGTCATAGCCTTTGGCATCAGCTGTGGCCCTGGCCCCAATCTTGGCCCAGAACATTTAGAAAATGGGGGCGTTCGATCGTTTGACAACACGCCAAACTACAGCTACAACACCGGTAGCGGAACGACCACCACCACTTGTAATGG

PTB66MG GTGGCAAGTCATAGCCTTTGGCATCAGCTGTGGCCCTGGCCCCAATCTTGGCCCAGAACATTTAGAAAATGGGGGCGTTCGATCGTTTGACAACACGCCAAACTACAGCTACAACACCGGTAGCGGAACGACCACCACCACTTGCAATCA

PTB66NG GTGGCAAGTCATAGCCTTTGGCATCAGCTGTGGCCCTGGCCCCAATCTTGGCCCAGAACATTTAGAAAATGGGGGCGTTCGATCGTTTGACAACACGCCAG---------------CCCTTAATGG---GACCACCACCACTTGCAATCA

SEHPAG1NG GTGGCAAGTCATAGCCCTTTTTATTGGCTGCGGCCCTGGTCCTA--------CCA----------ACAATCAAAGCTACCAATCGTTTGGTAACACACCAG---------------CCCTTAATGG---GACAACCACCACTTGCAATCA

GB26695hNG GTGGCAAGTCATAGCCCTTTTTATTGGCTGTGGCCCTGGCCCTA--------CCA----------ATAATCAAAGCTATCAATCGTTTGGTAACACACCAG---------------CCCTTAATGG---GACCACCACCACTTGCAATCA

Consensus GTGGCAAGTCATAGCCcTTtttATcgGCTGtGGCCCTGGcCCtA.......cCca.........gA.AATcaaaGCtatCaATCGTTTGgtAACACaCCAg...............CCctTAatgG...GACcACCACCACTTGcAATca

501 650

SE13MUP GGCTAGTAATGTGGGGCCCAATGGCATTCTATMTAGCAGSGAATACCAGGTTCTCAATACCGCTTATCAAACTATCCAAACCGCTTTAAACCAAAACCAAGGAGGCGGGATGCCTGCCTTGAATGGCTCTAAAAATAT---GGTAGTCAA

PT499/02MU AGCGTATGGGACAGGCCCTAATGGCATTCTATCCATTGATGAATACCAAAAACTCAACCAAGCTTATCAAATTATCCAAACCGCTTTAAACCAAAACCAAGGAGGCGGGATGCCTGCCTTGAACAGCTCCAAAAATAT---GGTAGTCAA

USJ99MUP AGCCAGTAATGTAGGGCCCAATGGTATCCTATCTAGCAGCGAATACCAGGTTCTCAATACCGCTTATCAAACTATCCAAACCGCTTTAAACCAAAACCAAGGAGGCGGGATGCCTGCCTTGAATAGCTCCAAAAATAT---GGTAGTCAA

PTB66MG AGCATACGGGACAGGCCCTAATGGCATTCTATCCATTGATGAATACCAAAAACTCAACCAAGCTTATCAAATTATCCAAACCGCTTTAAACCAAAACCAAGGAGGCGGGATGCCTGCCTTGAATGACACCACCAAAACAGGGGTAGTCAA

PTB66NG AGCATACGGGACAGGCCCTAATGGCATTCTATCCATTGATGAATACCAAAAACTCAACCAAGCTTATCAAATTATCCAAACCGCTTTAAACCAAAACCAAGGAGGCGGGATGCCTGCCTTGAATGACACCACCAAAACAGGGGTAGTCAA

SEHPAG1NG AGCGTATGGGACAGGCCCTAATGGCATTCTATCCATTGACGAATACCAAAAACTCAACCAAGCTTATCAGATCATCCAAACCGCTTTAAACCAAAATCAAGGGGGTGGGATGCCTGCCTTGAATGACACCACCAAAACAGGGGTAGTCAA

GB26695hNG AGCATATGGGACAGGCCCTAATGGCATCCTATCTATTGATGAATACCAAAAACTCAACCAAGCTTATCAGATCATCCAAACCGCTTTAAACCAAAATCAAGGGGGTGGGATGCCTGCCTTGAATGACACCACCAAAACAGGGGTAGTCAA

Consensus aGC.tatgggacaGGcCCtAATGGcATtCTATccAttgatGAATACCAaaaaCTCAAccaaGCTTATCAaAttATCCAAACCGCTTTAAACCAAAAcCAAGGaGGcGGGATGCCTGCCTTGAAtggCtCcAaaAAtAt...GGTAGTCAA

651 800

SE13MUP TATCAATCAAACTTT------------CACAAAAAACCCTACAACAGAATACACTTACCCTAA---TGGGAATGG-----CAAT-TATTATTCAGGCGGATCATCAATCCCAATCCAGCTAAAGATTAGTAGCGTCAATGACGCTGAAAA

PT499/02MU TATCAATCAAACTTT------------CACAAGAAACCCTACCACAGAATACACTTACTCTGA---TGGGAATGG-----CAAT-TATTATTCAGGCGGTTCATCAATCCCAATCCAGCTAAAGATTAGCAGCGTCAATGACGCTGAAAA

USJ99MUP TATCAATCAAACTTT------------CACAAAAAACCCTACCACAGAATACACTTACCCCGA---TGGGAATGG-----CAAT-TATTATTCAGGCGGTTCATCAATCCCAATCCAGCTAAAGATTAGTAGCGTCAATGACGCTGAAAA

PTB66MG CATACAACAAACCAATTATAAGACCACCACACAAAACAATATCATACAGCATTATTATGATGAGAATGGGAAAGAGATTCCAACCTATTATTCAGGCGGATCATCATTCTCGCCTACGATACAATTGAAATACAATAATAACGCTGAATA

PTB66NG CATACAACAAACCAATTATAAGACCACCACACAAAACAATATCATACAGCATTATTATGATGAGAATGGGAAAGAGATTCCAACCTATTATTCAGGCGGATCATCATTCTCGCCTACGATACAATTGAAATACAATAATAACGCTGAATA

SEHPAG1NG CATACAACAAACCAATTATAGAACCACTACACAAAACAATATCATAGAGCATTATTATACAGAGAATGGGAAAGAGATCCCAACCCATTATTCAGGCGGATCATCATTCTCGCCTACAATACAATTGACATACCACAATGACGCTGAATA

GB26695hNG CATACAACAAACCAATTATAGGACCACCACACAAAACAATATCATAGAGCATTATTATACAGAGAATGGGAAAGAGATCCCAGTCTCTTATTCAGGCGGATCATCATTCTCGCCTACAATACAATTGACATACCATAATAACGCTGAAAA

Consensus tATcaAtCAAACttt............cACAaaAAACccTAccAcAgAatAcacTTAc.ctgA...TGGGAAtGg.....CAat.taTTATTCAGGCGGaTCATCAaTCcCaatccagcTAaAgaTtAg.agCgtcAATgACGCTGAAaA

hopN

hopN

hopM

hopM

hopN

hopM

Nota: Foram incluídas as sequências correspondentes às quatro quimeras, identificadas da seguinte

forma: SE13MUP, PT499/02MU, PTB66MG e PTB66NG. As setas das cores respectivas ao lado de

cada gene (por exemplo:. hopN) indicam se a sequência é similar a hopM ou hopN, ao longo da

região localizada entre os 300 e os 800 pb destes genes. A posição da segunda seta de cada cor

indica a base a partir da qual uma determinada sequência alterou de um gene para outro. O

alinhamento foi efectuado com as estirpes de referência USJ99M (jhp0212, hopM), GB26695N

(HP1342, hopN) e HPAG1N (HPAG1_1289, hopN). O N/M identificam o locus de onde a sequência

foi obtida.

Estudo de dois membros da família das proteínas da...

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