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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROIMUNOLOGIA PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE ESTUDO DO POSSÍVEL ENVOLVIMENTO DA SUBUNIDADE α7 DO RECEPTOR NICOTÍNICO DE ACETILCOLINA NA ATIVAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE CAMUNDONGOS MDX COM DISTROFIA MUSCULAR DO TIPO DUCHENNE Niterói 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROIMUNOLOGIA
PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE
ESTUDO DO POSSÍVEL ENVOLVIMENTO DA
SUBUNIDADE α7 DO RECEPTOR NICOTÍNICO DE
ACETILCOLINA NA ATIVAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NO
MÚSCULO ESQUELÉTICO DE CAMUNDONGOS MDX
COM DISTROFIA MUSCULAR DO TIPO DUCHENNE
Niterói 2007
Livros Grátis
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PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE
ESTUDO DO POSSÍVEL ENVOLVIMENTO DA
SUBUNIDADE α7 DO RECEPTOR NICOTÍNICO DE
ACETILCOLINA NA ATIVAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NO
MÚSCULO ESQUELÉTICO DE CAMUNDONGOS MDX
COM DISTROFIA MUSCULAR DO TIPO DUCHENNE
Dissertação submetida à coordenação do curso de pós-graduação em Neuroimunologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Neuroimunologia. Área de concentração: Patologia Celular.
Orientadoras
Prof.a Dr.a Thereza Quirico dos Santos
Prof.a Dr.a Edna Nanami Yamasaki
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
LEITE, Paulo Emílio Corrêa
Estudo do possível envolvimento da subunidade α7 do receptor
nicotínico de acetilcolina na ativação da inflamação no músculo esquelético de camundongos mdx com distrofia muscular do tipo Duchenne – Niterói: UFF, 2007.
96 f.
Dissertação – Mestrado em Neuroimunologia
Universidade Federal Fluminense
1. Distrofia Muscular 2. Camundongo mdx 3. Músculo Esquelético
4. Acetilcolina 5. Receptor de Acetilcolina 6. Macrófago
7. Via colinérgica anti-inflamatória
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PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE
ESTUDO DO POSSÍVEL ENVOLVIMENTO DA
SUBUNIDADE α7 DO RECEPTOR NICOTÍNICO DE
ACETILCOLINA NA ATIVAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NO
MÚSCULO ESQUELÉTICO DE CAMUNDONGOS MDX
COM DISTROFIA MUSCULAR DO TIPO DUCHENNE
Dissertação submetida à coordenação do curso de pós-graduação em Neuroimunologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Neuroimunologia. Área de concentração: Patologia Celular.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Newton Castro (UFRJ)
Prof. Dr. Wilson C. Santos (UFF)
Prof. Dr. Oswaldo Nascimento (UFF)
Prof.a Dr.a Jussara Lagrota-Cândido (Suplente e Revisora - UFF)
v
Dedico esta tese
À minha família, em especial aos meus pais Emílio
Ramos Leite e Elizia Corrêa Leite, não só por me apoiarem e
incentivarem de forma incondicional, mas principalmente por
terem julgado prioridade me educar nos termos da ética e
honestidade.
vi
AGRADECIMENTOS
• A Deus, por ter me concedido uma família maravilhosa e por ter
colocado as pessoas ideais em meu caminho.
• A meus pais, meus melhores amigos, presentes em todos os momentos
marcantes de minha vida.
• Às minhas orientadoras Profas Thereza Quírico-Santos e Edna Nanami
Yamasaki, que com suas excelências como pesquisadoras semearam
em mim a forma correta e ética de pesquisar.
• À Louise Moraes, pelos ouvidos sempre acessíveis, pelo incentivo e
companhia irrestrita. Agradeço também pela essencial colaboração para
a execução da técnica de imuno-histoquímica.
• Às minhas grandes amigas Bartira e Nina, pela amizade, pelo auxílio
nas técnicas laboratoriais além de serem ótimas companheiras de
trabalho e bate-papo.
• Aos amigos Délcio e Cristiane, por terem me incentivado e apresentado
à pesquisa.
vii
• Aos amigos Douglas, Bernardo, Lívia e Guilherme, que tiveram
participações fundamentais nos experimentos para o desenvolvimento
desta tese, e principalmente por terem se mostrado amigos fiéis.
• Ao amigo Ricardo Noboro, pela ajuda essencial no processamento
tecidual, e ao Prof. Marcelo Santiago, pela grande ajuda na microscopia
confocal.
• À amiga Jaíne, por ter me auxiliado inicialmente na técnica de western
blot.
• Ao amigo Erick, pelos conselhos e por ter se mostrado um amigo fiel.
• Aos amigos Marcela, Kristiane e Rafael, pela amizade e esforço em
disponibilizar camundongos suficientes para a pesquisa.
• A todos os meus amigos do laboratório, que pelo simples fato de
fazerem parte da rotina laboratorial, deram suas contribuições para o
desenvolvimento desta tese.
• A todos os meus colegas de pós-graduação e professores, tanto da
UFRJ quanto da UFF.
• A possibilidade de utilizar camundongos no trabalho, pois sem eles não
haveria pesquisa, e sem pesquisa não haveria saúde.
viii
"Desde que eu fui uma criança, tenho tido esse impulso instintivo por
expansão e crescimento. Para mim, a função e dever de um ser humano
de qualidade é o honesto e sincero desenvolvimento de seu potencial”.
Bruce Lee
ix
A parte experimental deste trabalho foi executada nos laboratórios
de Patologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Neurobiologia da Retina, e Neurobiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IBCCF – UFRJ).
x
SUMÁRIO Página
AGRADECIMENTOS.......................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xii
LISTA DE TABELAS..........................................................................................xiv
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................xv
RESUMO........................................................................................................... xvi
ABSTRACT....................................................................................................... xvii
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1
1.1 Características gerais da distrofia muscular de Duchenne....................... 1
1.2 Distrofina e o complexo............................................................................. 3
1.3 Receptores Nicotínicos de Acetilcolina (AChRs)...................................... 5
1.3.1 Estrutura molecular e distribuição............................................................. 5
1.3.2 Diferenças nos sítios de ligação................................................................ 8
1.4 Regulação neural autônoma da imunidade............................................... 9
1.4.1 Subdivisões do sistema nervoso............................................................... 9
1.4.2 Inflamação mediada pelo Fator de Necrose Tumoral-α (TNFα)............. 10
1.4.3 Via colinérgica anti-inflamatória e o reflexo inflamatório......................... 13
1.4.4 Mecanismos de comunicação e integração do sistema imune e SNC... 15
1.4.5 Modelo hipotético do reflexo inflamatório................................................ 17
1.5 Metaloproteases de matriz (MMPs)........................................................ 19
1.6 Tecido muscular...................................................................................... 21
1.6.1 Características gerais.............................................................................. 21
1.6.2 Sinalização na sinapse neuromuscular................................................... 24
1.6.3 Ação muscular......................................................................................... 27
1.7 Modelos animais de distrofinopatia......................................................... 28
2. OBJETIVOS............................................................................................ 30
2.1 Gerais...................................................................................................... 30
2.2 Específicos.............................................................................................. 30
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 31
3.1 Animais.................................................................................................... 31
3.2 Processamento Tecidual......................................................................... 32
3.3 Western Blot............................................................................................ 33
3.4 Extração de RNA Total............................................................................ 34
xi
3.5 Dosagem de RNA................................................................................... 35
3.6 Transcrição Reversa do RNA (RT-PCR)................................................. 35
3.7 PCR......................................................................................................... 36
3.8 Eletroforese de RNA............................................................................... 37
3.9 Zimografia............................................................................................... 37
3.10 Ensaio de imuno-histoquímica................................................................ 38
3.10.1 Microscopia convencional....................................................................... 38
3.10.2 Microscopia de fluorescência.................................................................. 39
3.12 Análise Quantitativa................................................................................ 41
3.13 Análise Estatística................................................................................... 41
4. RESULTADOS........................................................................................ 42
4.1 Ensaios de Western Blot......................................................................... 42
4.1.1 Expressão de AChRα7 no músculo esquelético..................................... 42
4.1.2 Expressão de TNFα no músculo esquelético de camundongos mdx..... 46
4.1.3 Expressão de β-Actina no músculo esquelético...................................... 47
4.1.4 Relação entre as isoformas solúvel e membranar da proteína TNFα..... 48
4.1.5 Relação entre as proteínas AChRα7-2 e TNFα solúvel.......................... 49
4.1.6 Equilíbrio entre TNFα solúvel e a AChRα7-2.......................................... 50
4.2 Ensaios de RT-PCR................................................................................ 51
4.2.1 Expressão de mRNA da proteína AChRα7 no músculo esquelético...... 51
4.2.2 Expressão de mRNA da proteína TNFα no músculo esquelético........... 53
4.2.3 Expressão de mRNA da proteína β-Actina no músculo esquelético....... 54
4.3 Atividade de metaloproteases no músculo esquelético.......................... 55
4.4 Análise Imuno-histoquímica.................................................................... 58
4.4.1 Microscopia convencional....................................................................... 58
4.4.2 Microscopia de fluorescência.................................................................. 59
5. DISCUSSÃO........................................................................................... 62
6. CONCLUSÕES....................................................................................... 80
7. PERSPECTIVAS FUTURAS................................................................... 83
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 85
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
αBgtx Alfa-bungarotoxina
αBgtx-AChR Receptor de acetilcolina sensível à alfa-bungarotoxina
ACh Acetilcolina
AChR Receptor de acetilcolina
AChRα7 Subunidade alfa 7 do receptor de acetilcolina
AChRα7-2 Isoforma 2 da subunidade alfa 7 do receptor de acetilcolina
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
AP Área postrema
ATP Adenosina tri-fosfato
BBB Barreira hemato-encefálica
CMD Distrofia muscular congênita
COX-2 Cicloxigenase -2
DGC Complexo de glicoproteínas associadas à distrofina
DMD Distrofia muscular de Duchenne
DMN Núcleo motor dorsal do nervo vago
HMGB1 Proteína do tipo high mobility group box 1
HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular -1
IL Interleucina
LPS Lipopolissacarídeo
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno
MCP-1 Proteína quimioatrativa de monócitos -1
MHC Miosina de cadeia pesada
MMP Metaloprotease de matriz
MP Metaloprotease
mRNA RNA mensageiro
NA Núcleo ambíguo
nAChR Receptor de acetilcolina não-sensível à alfa-bungarotoxina
NTS Núcleo do tracto solitário
PGE2 Prostaglandina E2
SDS Dodecil sulfato de sódio
xiii
SNC Sistema Nervoso Central
TGFβ Fator de transformação de crescimento β
TIMP Inibidor tecidual de metaloprotease
TNFα Fator de necrose tumoral alfa
V-CAM-1 Molécula de adesão vascular -1
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1. Anticorpos primários usados para imunodeteccção............................... 40
2. Seqüência de oligonucleotídeos utilizados............................................. 40
3. Síntese dos resultados obtidos............................................................... 79
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1. Complexo Distrofina-Glicoproteínas......................................................... 4
2. Modelo esquemático do receptor de acetilcolina...................................... 7
3. Domínio N-terminal extracelular da AChRα7 homopentamérica.............. 8
4. Estágios da migração de leucócitos........................................................ 12
5. Vias anti-inflamatórias humoral, colinérgica e simpática........................ 13
6. Sistema nervoso parassimpático............................................................ 14
7. Órgãos do sistema retículo-endotelial..................................................... 19
8. Representação esquemática do músculo esquelético............................ 22
9. Organização do músculo estriado esquelético....................................... 23
10. Fotomicrografia de uma unidade motora................................................ 25
11. Fotomicrografia de um botão sináptico................................................... 26
12. Fotomicrografia de uma placa motora.....................................................26
13. Expressão da AChRα7-2 no músculo esquelético.................................. 45
14. Expressão de TNFα no músculo esquelético de camundongos mdx..... 47
15. Expressão da proteína β-actina no músculo esquelético........................ 47
16. Relação entre a expressão muscular de TNFα solúvel e membranar.... 49
17. Relação entre a expressão muscular da AChRα7-2 e TNFα solúvel..... 50
18. Equilíbrio entre a expressão muscular de TNFα solúvel e AChRα7-2... 51
19. Expressão de mRNA da proteína AChRα7 no músculo esquelético...... 52
20. Expressão de mRNA da proteína TNFα no músculo esquelético........... 54
21. Expressão de mRNA da proteína β-actina no músculo esquelético....... 54
22. Atividade de metaloproteases no músculo esquelético.......................... 56
23. Atividade das MMP -9, pró -2 e -2 ativa no músculo esquelético........... 57
24. Imuno-histoquímica convencional de camundongos mdx com S12....... 58
25. Co-localização de F4/80 e AChRα7 no infiltrado inflamatório.................59
26. Imuno-histoquímica de fluorescência amplificada 20x de mdx com S12 60
27. Imuno-histoquímica de fluorescência amplificada 40x de mdx com S12 61
xvi
RESUMO
Camundongo mdx, modelo animal da distrofia muscular de Duchenne, desenvolve uma miopatia inflamatória recessiva ligada ao cromossomo X caracterizada por degeneração progressiva das fibras do músculo esquelético e substituição por tecido conjuntivo. A ativação do receptor de acetilcolina AChR, regula pela “via colinérgica anti-inflamatória”, a produção de citocinas inflamatórias em diferentes modelos de inflamação. Este trabalho teve como objetivo analisar o possível envolvimento da subunidade α7 do receptor nicotínico de acetilcolina (AChRα7) na ativação da inflamação no músculo esquelético gastrocnêmio de camundongos mdx com distrofia muscular do tipo Duchenne. Foram incluídos camundongos machos mdx nas idades correspondendo às diferentes fases da miopatia: lactentes (S2), mionecrose (S4), regeneração (S8 e S12) e fibrose (S24 e S48). Como controle pareado foram incluídos camundongos C57BL10 machos nas mesmas idades. Foram utilizadas as técnicas de western blot (WB) e RT-PCR para analisar a expressão protéica e do mRNA da AChRα7 e do fator de necrose tumoral alfa (TNFα); zimografia para determinar a atividade local das metaloproteases MMP-9 e MMP-2, e a técnica de imuno-histoquímica por microscopia confocal para demonstrar e quantificar a co-localização de AChRα7 em macrófagos com marcador F4/80 nas áreas da lesão. Neste trabalho foi possível demonstrar pela primeira vez, a modulação na expressão da isoforma funcional AChRα7-2 nas diferentes fases da miopatia. Comparado ao controle C57, o camundongo mdx mostrou aumento na expressão da AChRα7-2 na idade de S4 (predomínio de inflamação / mionecrose) até a idade de S12 (predomínio de regeneração), seguido de diminuição da expressão em S48, correspondendo à fibrose muscular. A produção de TNFα solúvel no gastrocnêmio do mdx foi maior no pico da inflamação (S4) quando comparado a S2 (p<0,05), então correspondendo à inflamação, com significativa redução (p<0,0005) em S8, S12 e S24. A expressão da isoforma protéica AChRα7-2 no músculo gastrocnêmio do camundongo mdx era inversamente proporcional à quantidade do TNFα solúvel presente em todas as idades, exceto no mdx lactente (S2). A atividade da MMP-9, relacionada com a migração de células inflamatórias e clivagem proteolítica do TNFα, estava aumentada no estágio inicial da doença em S4 quando comparado com S12 (p<0,05). A forma inativa pro MMP-2 estava aumentada em todas as idades, porém a forma ativa da MMP-2 que indica remodelamento tecidual estava aumentada somente no mdx com S8 e S12. Mdx com S12 mostrou aumento marcante (p<0,0005) de macrófagos co-expressando AChRα7-2 nas áreas de lesão muscular. Os resultados deste trabalho indicam um papel relevante da isoforma AChRα7-2 na fisiopatologia da lesão muscular do camundongo mdx influenciando a migração de células inflamatórias, a produção local de TNFα e a remodelagem tecidual através da ativação da “via colinérgica anti-inflamatória”.
xvii
ABSTRACT
Mdx mouse, the animal model of Duchenne muscular dystrophy, develops an X-linked recessive inflammatory myopathy characterized by progressive degeneration of skeletal muscle fibers and connective tissue replacement. Acetylcholine receptor AChR activation has been shown to regulate via the “cholinergic anti-inflammatory pathway”, the production of inflammatory cytokines in different experimental models of inflammatory disease. The present work aimed at analyzing the possible involvement of nicotinic acetylcholine receptor subunit α7 (AChRα7) in activation of inflammation in the gastrocnemic skeletal muscle of mdx mice with Duchenne-type muscular dystrophy. Male mdx mice corresponding to different phases of myopathy were include weaning (2w), myonecrosis (4w), regeneration (8w and 12w) and fibrosis (24w and 48w). Male C57BL10 mice were included as paired non dystrophic control at the same ages. For analysis of protein and mRNA expression of AChRα7 and tumor necrosis factor alpha (TNFα), western blot and RT-PCR were used; for measurement of local metalloproteinase activity of MMP-9 and MMP-2, zymography was used; and to demonstrate and quantify co-localization of AChRα7 in macrophages expressing F4/80 cell marker in the muscular lesion, we have used immunohistochemistry with confocal microscopy. Herein we demonstrate, for the first time, the expression and modulation of a new functional isoform of AChRα7 (AChRα7-2) in gastrocnemic skeletal muscles of mdx mice at different phases of the myopathy. Comparing to control C57, mdx mice showed increased expression of AChRα7-2 from 4w of age (inflammation / myonecrosis prevalence) till 12w of age (regeneration prevalence), followed by diminished expression at 48w, corresponding to muscular fibrosis. Soluble TNFα production in mdx gastrocnemic muscle was higher at the onset of inflammation (4w) than at 2w (p<0.05), with significant reduction (p<0.0005) at 8w, 12w and 24w. Expression of the AChRα7-2 protein isoform was inversely related with the amount of TNFα soluble present in the gastrocnemic muscles of mdx mice at all ages except in mdx at 2w (weaning). MMP9 activity, related to migration of inflammatory cells and proteolytic cleavage of TNFα, was increased at early stages of the disease (4w) when compared to 12w (p<0.05). The inactive form pro-MMP2 was increased at all ages, but the active form MMP-2, a marker of tissue remodeling, was marked increased in mdx skeletal muscles at 8w and 12w. Mdx mice at 12w showed in the muscular lesion increased number (p<0.0005) of F4/80+ macrophages co-expressing AChRα7-2. Altogether the results indicate that the AChRα7-2 isoform plays a relevant role in the pathophysiology of mdx muscular lesion by influencing migration of inflammatory cells, local production of TNFα cytokine and tissue remodeling via the “cholinergic anti-inflammatory pathway”.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Características gerais da distrofia muscular de Duchenne
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia hereditária
recessiva ligada ao cromossomo X que afeta 1 a cada 3500 meninos nascidos
vivos (Voisin and de Ia Porte, 2004). A clonagem completa do gene dmd
mostra que mais de 50% da mutação em humanos envolve ampla deleção no
locus Xp21 (Kapsa et al., 2003), o que determina a ausência ou a expressão da
molécula truncada não-funcional da isoforma de 427 kDa da proteína distrofina
nas células musculares esqueléticas estriadas, células endoteliais e células do
Sistema Nervoso Central (SNC) (Mendell et al., 1995; Van den Bergh et al.,
1995; Mehler, 2000). O gene da distrofina é extremamente grande (3,4 Mb),
contém 79 exons e 2,4 milhões de bases. A sua grande complexidade propicia
uma alta taxa de novas mutações, deleções ou duplicações gênicas que são
evidenciadas em um terço dos pacientes com DMD (Hoffman, 1996).
Alguns pacientes com DMD apresentam retardo mental, porém as
principais alterações clínicas são evidentes ainda na primeira infância, por volta
de 3 a 5 anos de idade, afetando inicialmente os músculos da cintura pélvica e
posteriormente os músculos da cintura escapular. A substituição do tecido
muscular por tecido conjuntivo e adiposo causa pseudo-hipertrofia dos
músculos afetados. A perda da capacidade de deambular ocorre entre oito a
dez anos de idade, havendo a necessidade do uso de cadeira de rodas. A
evolução para o óbito ocorre em torno da segunda década de vida, geralmente
devido à insuficiência cardíaca ou respiratória (Anderson J. L. et al., 2002;
Jejurikar & Kuzon, 2003).
2
As características histológicas do músculo distrófico no início da doença
são os inúmeros focos de mionecrose, intenso infiltrado inflamatório, miofibras
hipertróficas com tamanhos variados e altos níveis de creatina quinase no soro.
Os ciclos repetidos de degeneração e regeneração esgotam a capacidade
regenerativa das células satélites, e mecanismos fibróticos causam uma
substituição progressiva do tecido muscular contrátil por tecido fibroso (Collins
& Morgan, 2003). As miofibras apresentam também sarcoplasma
grosseiramente granular e vacuolizado, apresentando fragmentação e
nucleação central.
Até o momento não existe uma terapia curativa para os pacientes com
DMD, apenas tratamentos temporários com o uso de corticóides associados à
fisioterapia e/ou cirurgia ortopédica para aliviar a escoliose (Skuk et al., 2002).
A terapia gênica somática com mioblastos transfectados com o gene da
distrofina surgiu como uma esperança para o tratamento da DMD. Contudo,
existem várias dificuldades a serem superadas nesse tipo de tratamento, como
a obtenção de um vetor apropriado para um gene tão grande como o da
distrofina, a expressão limitada de distrofina numa pequena área próxima à
inoculação e a meia-vida curta do mioblasto transfectado (Howell, 1999). Outra
possibilidade terapêutica é o transplante de células de medula óssea em
camundongos imunodeficientes, mostrando que células da medula óssea
migram para áreas de degeneração, passam por diferenciação e participam na
regeneração do tecido muscular (Ferrari et al., 1998). Contudo, estudos com
camundongos mdx mostraram que o número de progenitores miogênicos
recrutados da medula óssea talvez seja insuficiente para restaurar a massa
muscular. A estratégia atual é o desenvolvimento de condições de transplante
3
de medula óssea que permitam a expansão seletiva de progenitores
miogênicos in vivo (Cossu & Mavilio, 2000; Ferrari & Mavilio, 2002). Portanto,
estudos recentes indicam como estratégias promissoras no futuro, a terapia
genética e celular (Skuk et al., 2002; Kapsa et al., 2003; Khurana & Davies,
2003; Partridge, 2003).
1.2 Distrofina e o complexo de Glicoproteínas
Distrofina é uma proteína que pertence à superfamília das espectrinas,
sendo a mais abundante na fibra muscular, correspondendo a
aproximadamente 5% do seu citoesqueleto. Possui 427 kDa de peso molecular
formando quatro domínios funcionais.
A distrofina apresenta localização interna no sarcolema formando uma
trama associada a um complexo de glicoproteínas (DGC) constituído pelas
distroglicanas, sarcoglicanas, sintrofinas, distrobrevinas, sarcospan e actina
(Watkins et al., 2000). O domínio N-terminal com 336 aminoácidos permite a
ligação à actina; um domínio com 24 unidades de repetições longas,
constituído de segmentos de tripla hélice com 88 a 126 aminoácidos; um
domínio com 135 aminoácidos rico em cisteína, que se liga às proteínas do
sarcolema, e o domínio C-terminal com 320 aminoácidos e sítios de ligação
para sintrofina e distrobrevina (Figura 1).
A formação do complexo distrofina/DGC é crucial para a ligação da
matriz extracelular com o citoesqueleto (Kapsa et al., 2003). Atualmente
acredita-se que todo esse complexo, além do suporte estrutural, também
participe na transdução de sinais provenientes da interação da fibra muscular
4
com a matriz extracelular (Watkins et al., 2000). A organização desse complexo
é essencial para a integridade da fibra muscular e estabilidade do sarcolema.
Figura 1: Complexo Distrofina-Glicoproteínas. (http://www.humgen.nl/lab-vdeutekom/pictures/DGC.jpg)
A deficiência de distrofina e de outras proteínas do complexo DGC
resulta em diferentes tipos de distrofias musculares em várias espécies animais
(Roberts, 1995; Van den Bergh et al., 1995; Nonaka, 1998; Lapidos et al.,
2004). Mutações nos genes que codificam as sarcoglicanas causam as
distrofias musculares da cintura e membros (LGMD) enquanto que mutações
no gene da merosina causam distrofia muscular congênita (CMD) (Allamand &
Campbell, 2000). A perda de distrobrevinas causa distrofia muscular em
camundongos e defeitos em outras proteínas, incluindo colágeno VI, titina,
desmina e caveolina-3, causando miopatias graves em humanos (Martin,
2003).
5
1.3 Receptores Nicotínicos de Acetilcolina (AChRs)
1.3.1 Estrutura molecular e distribuição
Os AChRs formam uma família heterogênea de canais iônicos que são
expressos em muitas regiões com organização diferente no Sistema Nervoso
Central e no Sistema Nervoso Periférico. Essas proteínas multiméricas são
formadas pela combinação de diferentes subunidades. Muitos genes que
codificam essas subunidades já foram clonados, e como todos os outros
membros da superfamília de canais iônicos com alça de cisteínas, codificam
peptídeos onde todos têm uma porção extracelular amino-terminal hidrofílica,
seguido por três domínios transmembranares hidrofóbicos (M1, M2 e M3), uma
grande alça intracelular, e um quarto domínio transmembranar hidrofóbico (M4)
(Figura 2) (Sargent 1993; Hoog et al., 2003). Essas subunidades possuem um
ancestral comum e foram altamente conservadas durante a evolução, tendo a
mesma subunidade mais de 80% de homologia dos aminoácidos entre as
espécies de vertebrados (Le Novere & Changeaux, 1995).
No músculo, esses canais iônicos são constituídos por quatro diferentes
subunidades (α, β, δ e ε), sendo que nos músculos embrionário e adulto
desnervado a subunidade γ substitui a ε, conferindo assim diferentes
propriedades eletrofisiológicas ao receptor (Figura 2) (Duclert & Changeaux,
1995; Sala et al., 1996). As duas maiores classes de subunidades dos AChRs
são o tipo α, que inclui dez membros (α1-α10), e o tipo β, com 4 membros (β1-
β4). As subunidades α possuem duas cisteínas homólogas adjacentes
presentes nas posições 192 e 193, enquanto que as subunidades β perdem
esse par de cisteínas adjacentes (Le Novere & Changeaux, 1995).
6
As subunidades α4, α5, α7 e β4 são expressas também por células
musculares embrionárias de pinto tanto in vivo quanto in vitro (Corriveau, et al.,
1995; Sala et al., 1996;); e a subunidade α8 parece ser expressa apenas em
galinhas (Schoepfer et al., 1990; Gault et al., 1998), onde não apenas formam
receptores homoméricos, mas também heteroméricos juntamente com
receptores α7 (Keyser et al., 1993; Gotti et al., 1994). A expressão da
subunidade α9 é limitada a células ciliadas cocleares e à glândula pituitária
(Gault et al., 1998), e em embriões de ratos às camadas musculares da língua,
e não por outros músculos esqueléticos (Elgoyhen et al., 1994; Sala et al.,
1996). A seqüência de aminoácidos da subunidade α10 é similar à seqüência
da subunidade α9, mas em experimentos com injeção de mRNAs em ovócitos
não foram detectadas correntes quando a subunidade está sozinha ou em
combinação com subunidades α2-α6 ou β2-β4. Uma corrente distinta dos
receptores homoméricos α9 foi detectada apenas quando mRNAs das
subunidades α9 e α10 foram co-injetadas em ovócitos. Essa nova corrente
possui propriedades funcionais e farmacológicas indistingüíveis dos receptores
colinérgicos endógenos presentes nas células ciliadas cocleares, que possuem
cópias para ambos genes das subunidades α9 e α10 (Elgoyhen et al., 2001;
Sgard et al., 2002).
7
Figura 2: Modelo esquemático do receptor de acetilcolina. À esquerda, o AChR como uma glicoproteína heteromérica membranar. No meio e à direita, a topologia das subunidades M1, M2, M3 e M4 representam os quatro domínios transmembranares. (http://www.weizmann.ac.il/home/samson/aster_files/image002.gif)
Com base em suas diferenças filogenéticas, propriedades
farmacológicas e funcionais, essa heterogênea família de subunidades de
AChRs é agrupada em duas classes principais:
• Sensíveis à toxina de cobra (αBgtx-AChRs), formando AChRs
homopentaméricos (α7-α9), com cinco subunidades idênticas formando um
canal iônico (Figura 3); e heteropentaméricos (α7, α8 ou α9 e α10), onde o
canal iônico é formado por mais de um tipo de subunidade (Marks et al., 1986;
Wonnacott, 1986; Alkondon & Albuquerque, 1993; Amar et al., 1993; Zhang et
al., 1994; Lindstrom, 2000). O receptor homomérico é ativado pela acetilcolina
e bloqueado por concentrações nanomolares de αBgtx com alta
permeabilidade ao Ca2+ e rápida taxa de dessensibilização.
• Não-sensíveis à αBgtx (nAChRs) e possuindo ligação à nicotina com
alta afinidade, formando sempre AChRs heteropentaméricos: contêm um par
9
A identificação do sítio de ligação dos AChRs foi elucidada pela análise
estrutural por cristalografia da proteína ligadora de acetilcolina de caramujos
Lymnaea stagnalis, secretada nas sinapses colinérgicas (Brejc et al., 2001;
Smit et al., 2001) e é análoga ao domínio de ligação extracelular dos AChRs.
As diferentes subunidades do AChR podem formar quatro conformações
distintas do ponto de vista funcional, podendo estar abertos, fechados, e em
dois estados dessensibilizados fechados (I ou D) que são refratários à ativação
em uma escala de tempo em milissegundos (I) ou minutos (D), tendo alta
afinidade (pM-nM) por agonistas. A ligação da acetilcolina ao sítio de ligação do
receptor ou qualquer sítio alostérico pode modificar o equilíbrio entre os
diferentes estados conformacionais dos receptores (Changeux & Edelstein,
1998).
1.4 Regulação neural autônoma da imunidade
1.4.1 Subdivisões do sistema nervoso
O sistema nervoso é composto por sistemas sensitivos, que detectam o
estado de órgãos e outras estruturas do corpo, e sistemas motores, que
transmitem sinais para essas estruturas corporais. O sistema motor somático
controla os movimentos voluntários, enquanto o sistema motor autônomo
controla funções involuntárias, tais como funções viscerais e inervação de
glândulas. O sistema nervoso autônomo se subdivide em duas vias: a
simpática e a parassimpática, que trabalham em sinergia ou em oposição para
mediar respostas fisiológicas básicas em tempo real, como pressão sangüínea,
batimento cardíaco, freqüência respiratória, mobilidade gastrintestinal e
10
temperatura corporal (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005; Pavlov & Tracey,
2005).
O sistema nervoso autônomo recebe informações de receptores
sensoriais especializados em detectar o estado fisiológico, como baroceptores
que monitoram a pressão sangüínea e quimioceptores que monitoram a
atividade gástrica. O cérebro primitivo, incluindo o sistema límbico, tronco
encefálico e hipotálamo recebem os sinais desses receptores, coordenando
então respostas neurais simpáticas e parassimpáticas para manter a
homeostase e regular a digestão (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005). As
funções autônomas mediadas pelo nervo vago são integradas e reguladas
centralmente. Interconexões neurais recíprocas entre núcleos autônomos do
tronco cerebral, incluindo o núcleo do tracto solitário (NTS), núcleo motor dorsal
do vago (DMN) e núcleo ambíguo (NA), assim como estruturas cerebrais
superiores como o hipotálamo, amígdala e córtex insular, constituem a rede
autônoma central. Essa rede regula a atividade eferente do nervo vago,
correspondendo a funções viscerais periféricas (Pavlov & Tracey, 2005).
1.4.2 Inflamação mediada pelo Fator de Necrose Tumoral-α (TNFα)
O TNFα é uma citocina pleiotrópica com aproximadamente 17kDa,
produzida principalmente por macrófagos em resposta a patógenos e outros
estímulos danosos (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005). Possui funções que
podem variar de indução a choque na sepse a necrose de tumores (Peterson et
al., 2005). Baixos níveis de TNFα contribuem para os mecanismos de
imunidade inata do hospedeiro, limitando a resposta inflamatória local,
controlando a invasão microbiana e promovendo o processo de cura (Tracey,
11
2002; Czura & Tracey, 2005; Pavlov & Tracey, 2005). Em uma resposta
inflamatória normal, suas atividades protetoras e benéficas predominam,
entretanto a magnitude e duração da liberação de TNFα é limitada, por não ser
secretado sistemicamente (Tracey, 2002).
A produção exacerbada de citocinas pode causar manifestações clínicas
de doenças (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005; Pavlov & Tracey, 2005),
inclusive os sinais clínicos cardinais de inflamação, incluindo febre, edema, dor
e vermelhidão. O aumento sistêmico de TNFα promove dano tecidual
deprimindo a função cardíaca, induzindo trombose microvascular e mediando a
síndrome sistêmica de fraqueza vascular (Tracey, 2002). Esta citocina pode
também mediar a síndrome de perda muscular, conhecida como caquexia. A
caquexia se manifesta como complicação secundária, mas é potencialmente
letal em doenças crônicas como câncer (Peterson et al., 2005).
TNFα induz leucocitose e ativa nas células endoteliais genes de
moléculas de adesão como ICAM-1 (molécula de adesão intercelular -1),
VCAM-1 (molécula de adesão vascular -1) e diversas outras citocinas como
MCP-1 (proteína quimioatrativa de monócitos -1). Essas moléculas contribuem
para o aumento da adesão de neutrófilos, monócitos e macrófagos ao endotélio
vascular (Peterson et al., 2005; Saeed et al., 2005), facilitando o rolamento,
adesão, ativação e a migração celular (diapedese) (Figura 4) (Ransohoff et al.,
2003; Saeed et al., 2005). O TNFα é capaz de amplificar e prolongar a resposta
inflamatória e dano tecidual (Tracey, 2002) ativando outras células a produzir
citocinas como IL-1 (interleucina -1) e HMGB1 (high mobility group box 1), além
de outros mediadores como eicosanóides e óxido nítrico (NO), promovendo
dessa forma o aumento da inflamação (Tracey, 2002). Anticorpos anti-TNFα
12
têm sido utilizados na clínica no tratamento de doenças imune-inflamatórias
como artrite reumatóide e doença de Crohn (Czura and Tracey, 2005; Pavlov
and Tracey, 2005).
Figura 4: Estágios da migração de leucócitos. Através de uma série de interações programadas com o endotélio, segue-se a transmigração através da lâmina basal. (Ransohoff et al., 2003)
Trabalhos recentes indicaram que a expressão de TNFα é regulada
tanto em níveis transcricionais quanto traducionais (Czura & Tracey, 2005),
porém quando sua produção é interrompida, as células responsáveis por sua
síntese se tornam refratárias à estimulações posteriores. Este é um importante
mecanismo de controle que previne a produção exacerbada de TNFα. Outros
mecanismos conhecidos também são capazes de impedir a secreção
exagerada de TNFα, tais como o eixo hormonal adrenocorticotrópico-
glicocorticóide (ACTH – glicocorticóide), a via anti-inflamatória simpática (dor e
Substância P – adrenalina e noradrenalina) (Figura 5) e a atividade de outros
fatores anti-inflamatórios produzidos durante uma resposta inflamatória normal.
Também a IL-10 (interleucina-10) e o TGFβ (fator de transformação de
crescimento β), são capazes de suprimir independentemente a ativação de
macrófagos e liberação de TNFα. Descobertas recentes (Czura & Tracey,
2005) mostraram que a via colinérgica anti-inflamatória também inibe a
produção de TNFα em macrófagos.
13
1.4.3 Via colinérgica anti-inflamatória e o reflexo inflamatório
A via colinérgica anti-inflamatória é um mecanismo fisiológico que
modula as respostas inflamatórias do hospedeiro através de estimulação do
nervo vago (Borovikova et al., 2000; Tracey, 2002; Bernik et al., 2002; Czura &
Tracey, 2005). Esta via é chamada de colinérgica porque a acetilcolina é o
principal neurotransmissor, e anti-inflamatória porque macrófagos expostos a
esse neurotransmissor são eficientemente inibidos em secretar TNFα, IL-1β,
HMGB1 e uma série de outros mediadores inflamatórios (Figura 5) (Tracey,
2002).
Figura 5: Vias anti-inflamatórias humoral, colinérgica e simpática. (Tracey, 2002)
O nervo vago inerva os principais órgãos do corpo, incluindo os que
fazem parte do sistema retículo-endotelial: fígado, pulmões, baço, rins e
intestino (Figura 6) (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005). Fibras aferentes
sensoriais vagais, que residem no gânglio nodoso, são capazes de detectar a
inflamação através de suas projeções axonais que estão no sítio da
14
inflamação, transmitindo esse sinal para estruturas cerebrais envolvidas na
geração do controle neural da inflamação (Figura 5). As fibras aferentes vagais
chegam ao principal local de terminação: o NTS medular, que recebe
principalmente sinais de inflamação local. Os neurônios do NTS se projetam
para neurônios vagais pré-ganglionares no DMN e NA, que se comunicam com
a área postrema (AP), o qual não possui barreira hemato-encefálica (BBB).
(Pavlov et al., 2003; Pavlov & Tracey, 2005). Projeções bi-direcionais também
ocorrem entre o NTS, o hipotálamo e outras estruturas anteriores do cérebro
dentro da rede central autônoma (Loewy, 1990; Pavlov & Tracey, 2005). A AP e
outros órgãos circunventriculares funcionam como portais para citocinas
circulantes sinalizarem para o cérebro a presença de inflamação periférica
(Buller, 2001 apud Pavlov & Tracey, 2005).
Figura 6: Sistema nervoso parassimpático. Nervo vago inervando órgãos do sistema retículo-endotelial. (Czura & Tracey, 2005)
15
Os sinais aferentes transmitidos pelo nervo vago ativam o reflexo
inflamatório resultando em uma estimulação eferente. A acetilcolina liberada
pelas terminações sinápticas vagais dentro do sistema retículo-endotelial é
capaz de interagir especificamente com as AChRα7 de macrófagos, que se
localizam nas proximidades. A interação da acetilcolina com as AChRα7 de
macrófagos ocasiona sua desativação, resultando em inibição de secreção de
citocinas. Sinais inflamatórios, portanto, são capazes de ativar uma resposta
anti-inflamatória que rapidamente previne a produção exacerbada de citocinas
inflamatórias. O controle neural de produção e secreção de citocinas provê
uma importante alternativa para a regulação humoral por ser rápido, integrado,
e não dependente de gradientes de concentração (Czura & Tracey, 2005).
1.4.4 Mecanismos de comunicação e integração do sistema imune e SNC
A inflamação periférica é detectada pelo SNC por meio de dois
importantes mecanismos de comunicação: rota humoral e rota neural. Na rota
humoral, o TNFα e a IL-1β são ativamente transportados através da BBB,
enquanto a IL-1α penetra diretamente no cérebro através dos órgãos
circunventriculares onde a BBB é inexistente ou descontínua, induzindo
cicloxigenase -2 (COX-2) que processa ácido araquidônico e libera
prostaglandina E2 (PGE2). Receptores de PGE localizam-se em áreas
cerebrais que possuem importantes funções na resposta inflamatória periférica
como ativação do eixo HPA, febre e anorexia (Tracey, 2002; Czura & Tracey,
2005). As estruturas do complexo dorsal do nervo vago respondem ao aumento
de TNFα circulante, alterando a atividade do nervo (Tracey, 2002), sendo este
16
o meio predominante para a comunicação do sistema imune com o SNC
quando os níveis de citocinas estão bem elevados (Czura and Tracey, 2005).
Na rota neural, mesmo quando os níveis de citocinas ainda estão baixos,
o SNC é capaz de ser informado sobre o estado da inflamação via sinais
neurais aferentes. Esta sinalização é possível devido à inervação vagal nos
órgãos e células do sistema retículo-endotelial. A rota neural da inflamação
funciona em baixos níveis de detecção, e ativa respostas mesmo quando os
agentes inflamatórios estão presentes nos tecidos em níveis não suficientes
para alcançar o cérebro pela circulação sangüínea (Tracey, 2002; Czura &
Tracey, 2005). Alguns pesquisadores já observaram que a secção vagal
impede o surgimento de febre em animais expostos a baixas doses intra-
abdominais de IL-1α ou endotoxina (Watkins et al., 1995; Czura & Tracey,
2005). Ainda não está totalmente claro todo o mecanismo de detecção de
mediadores inflamatórios, mas neurônios do nervo vago expressam tanto o
mRNA quanto o receptor de IL-1α (Goehler et al., 2000; Czura & Tracey, 2005).
Estudos eletrofisiológicos também indicaram que o nervo vago pode ser
ativado por TNFα e outras citocinas, mecanoceptores, quimioceptores,
sensores de temperatura e osmolaridade, o qual podem ser ativados no sítio da
inflamação (Tracey, 2002; Berthoud & Neuhuber, 2000; Czura and Tracey,
2005).
Os sinais aferentes humorais e neurais são processados ao chegar no
cérebro, seguido de respostas humorais e neurais coordenadas adequadas. As
fibras aferentes vagais chegam no NTS e AP, regiões ativadas durante a
inflamação periférica (Tracey, 2002; Czura & Tracey, 2005). Em seguida, há
ativação de neurônios de segunda ordem no NTS via atividade de glutamato
18
mudanças internas, produzindo uma resposta integrada enviada aos
neurônios vagais eferentes;
3) a via colinérgica anti-inflamatória é ativada e as fibras nervosas vagais
eferentes encaminham o sinal anti-inflamatório à periferia;
4) a ACh liberada nas terminações dos axônios colinérgicos interage com
as AChRα7 das células imunes (macrófagos), resultando na inibição de
secreção de citocinas pró-inflamatórias e restauração da homeostase
imunológica (Figura 7) (Pavlov and Tracey, 2005).
O mecanismo exato pelo qual a ACh liberada nas terminações vagais
exerce seu efeito nos receptores nicotínicos das células imunes ainda precisa
ser melhor pesquisado. É possível considerar o “modelo de difusão”, onde
teoricamente, a ACh liberada de neurônios colinérgicos se difunde pelo
parênquima dos órgãos do sistema retículo-endotelial antes de interagir com as
AChRα7 das células imunes adjacentes às terminações axonais. Entretanto,
neste modelo há uma limitação: o rápido catabolismo da ACh pela
acetilcolinesterase. Por outro lado, a colina, produto da reação mediada pela
acetilcolinesterase, é um agonista natural específico da AChRα7 (Pavlov &
Tracey, 2005). Torna-se então possível que a colina se difunda das
terminações vagais e ative as AChRα7 das células imunes. Isto porque
anatomicamente, os gânglios vagais parassimpáticos localizam-se muito
próximos ou até mesmo dentro dos órgãos inervados. Isso aumenta a
possibilidade de além dos neurônios pós-ganglionares, os neurônios pré-
ganglionares liberem o “neurotransmissor anti-inflamatório” ACh ou o seu
produto, a colina (Pavlov & Tracey, 2005).
19
Figura 7: Órgãos do sistema retículo-endotelial. A ACh liberada pelas terminações vagais é capaz de interagir com as AChRα7 de macrófagos nesses órgãos, inibindo assim a liberação de TNFα, HMGB1, IL-1β e outras citocinas pró-inflamatórias. (Tracey, 2002)
1.5 Metaloproteases de matriz (MMPs)
As metaloproteases (MPs) são uma grande família de enzimas que
possuem um íon de zinco no sítio ativo de seu domínio catalítico. As
metaloproteases de matriz (MMPs) fazem parte de um grupo distinto de MPs,
constituído por pelo menos 26 membros o qual inclui: colagenases,
gelatinases, estromelisinas, metaloproteases de membrana, matrilisinas e
metaloelastases (Chandler, et al., 1996; Mannello et al., 2003; Frederiks &
Mook, 2004). Dos muitos tipos de MMPs, focalizaremos mais a MMP-2 ou
gelatinase A, que possui 72 kDa em humanos e 60 kDa em camundongos, e a
MMP-9 ou gelatinase B, com 92 kDa em humanos e 100 kDa em camundongos
(Kherif, et al., 1999; Frederiks & Mook, 2004). As MMPs são endoproteases
dependentes de Ca+/Zn2+ envolvidas na fisiologia de processos patológicos,
20
modulando a degradação e re-síntese da matriz extracelular incluindo a
membrana basal.
As MMPs possuem características semelhantes, incluindo o modo
comum de ativação, seqüência de aminoácidos conservados na região de
ligação do sítio ativo, e inibição por proteases inibidoras específicas conhecidas
como inibidores de metaloproteases de tecidos (TIMPs). A atividade de
degradação das MMPs in vivo é resultado da interação com muitos fatores que
controlam a expressão e ativação das enzimas latentes, interação de enzimas
ativas com inibidores, assim como sua ativação e degradação. A maioria das
MMPs são secretadas como pró enzimas latentes, podendo ser ativadas por
muitos fatores, como outras proteases por exemplo (Kherif, et al., 1999). A
ativação das MMPs se dá por duas etapas: primeiramente, ocorre clivagem
inicial por ativadores como citocinas, hormônios, fatores de crescimento e NO
em uma região exposta no peptídeo, desestabilizando a interação entre o Zn2+
e as cisteínas (Zhang et al., 2003); em seguida ocorre clivagem, geralmente
por outra MMP, liberando o radical amino-terminal da enzima madura (Johnson
et al., 1998), caracterizada pela perda de aproximadamente 10 kDa (Kherif, et
al., 1999) referente à seqüência de 80 aminoácidos que sofreu clivagem. O
balanço entre produção e ativação excessiva de MMPs parece ser uma
característica fundamental da patologia de muitas doenças inflamatórias
(Chandler, et al., 1996; Kherif, et al., 1999).
21
1.6 Tecido muscular
1.6.1 Características gerais
O músculo esquelético é um tecido complexo composto por células
multinucleadas que formam fibras inervadas por neurônios motores localizados
no tronco cerebral ou no corno ventral da medula espinhal (Hughes et al.,
2006). A miofibra esquelética tem a função primária de gerar força e induzir
movimento (Kandel et al., 2003). As miofibras se formam da fusão de
precursores de mioblastos durante o desenvolvimento embrionário.
Os músculos esqueléticos são ditos estriados porque possuem à
microscopia de alta resolução estrias ou faixas claras e escuras alternadas. As
faixas escuras são constantes em espessura, já as bandas claras possuem
tendência a se alongarem ou contraírem à medida que o músculo se alonga ou
contrai. Seu controle é voluntário, isto é, o consciente comanda a contração e o
relaxamento. O músculo cardíaco compõe predominantemente a parede
cardíaca e apesar de também ser estriado, não possui contração voluntária. O
músculo liso não apresenta estrias, é de contração involuntária e está presente
em estruturas internas, vasos sangüíneos e cavidades viscerais (Spence et al.,
2002; Kandel et al., 2003; Martin, 2003).
As miofibras fazem ligação com a lâmina basal da matriz extracelular. As
proteínas da lâmina basal se ligam a um complexo de proteínas no sarcolema
que se associam às proteínas do citoesqueleto actina/miosina e aos filamentos
intermediários, definindo as bandas 1, A e sarcômeros individuais da linha Z. A
estriação da miofibra é formada pela repetição de unidades iguais - os
sarcômeros, formados pela região da miofibra compreendida entre duas linhas
Z sucessivas e uma banda A separando duas semibandas 1. Estas são
22
constituídas de filamentos de actina e filamentos grossos de miosina dispostos
longitudinalmente (Figura 8). Essa organização é mantida por diversas
proteínas como a desmina, que liga as miofibras umas às outras, e a distrofina,
que liga os filamentos de actina às proteínas integrais da membrana
plasmática. A banda M é uma estrutura transversa que atravessa os filamentos
no centro e provê um perfeito alinhamento da banda A na ativação do
sarcômero (Spence et al., 2002; Martin, 2003).
Figura 8: Representação esquemática do músculo esquelético. (http://3dotstudio.com/prenhall/muscle.jpg)
Os músculos esqueléticos de mamíferos co-expressam diferentes tipos
de miosina e somente um tipo de actina, mostrando que a diversidade entre os
tipos de fibras musculares é primariamente causada pela diferença dos tipos de
miosina. A molécula de miosina é formada por duas cadeias pesadas de
miosina e dois pares regulatórios de cadeia leve. A miosina de cadeia pesada
23
(MHC) é uma das principais proteínas sarcoméricas responsáveis pela
diferenciação do mioblasto e tem sido usada como um marcador de
diferenciação muscular, que junto com outras proteínas estruturais, formam as
primeiras estruturas do sarcômero (Fulton & Alftine, 1997; Rafael, 2000; Muller
et al., 2001). No músculo esquelético de mamíferos são encontradas sete
isoformas de MHC, quatro dessas no músculo esquelético adulto e uma
adicional predominando no músculo cardíaco (Weiss & Leinwand, 1996).
O tecido conjuntivo presente no músculo são as fáscias, que circundam
as fibras musculares. O epimísio recobre todo o músculo, o perimísio recobre
os fascículos que são feixes de fibras musculares, e o endomísio envolve
individualmente cada fibra muscular. Essa disposição do tecido conjuntivo
mantém as fibras musculares juntas e permite certa liberdade de movimento
entre elas. Esses revestimentos se prolongam do músculo até o tendão rico em
colágeno, cuja função é fixar o músculo ao osso. O tecido conjuntivo também
está presente revestindo os vasos e nervos que irrigam e inervam os músculos
(Figura 9).
Figura 9: Organização do músculo estriado esquelético. (http://academic.wsc.edu/faculty/jatodd1/351/muscle_gross_anatomy)
24
O sistema de proteínas actina/miosina/titina é responsável pela geração
de força das miofibras. Isto envolve um caminho complexo em diferentes
pontos da célula, que incluem a linha Z e a transdução de força via sarcômero,
permitindo a interação com a matriz extracelular e costâmeros. Contudo, a
sinalização também pode ocorrer via tecido conjuntivo endomisial e tendão
(Martin, 2003).
1.6.2 Sinalização na sinapse neuromuscular
O axônio de um neurônio motor perde sua camada de mielina e se
subdivide em múltiplas ramificações ao se aproximar da fibra muscular que irá
inervar (Kandel et al., 2003; Ruff, 2003; Hughes et al., 2006). O conjunto de
fibras musculares que contraem quando um potencial de ação se propaga
através das ramificações axonais de um neurônio é chamado de unidade
muscular, e o conjunto juntamente com seu neurônio motor é chamado de
unidade motora, sendo a menor estrutura contrátil que o sistema nervoso pode
ativar (Figura 10). Essas ramificações formam expansões ou varicosidades
múltiplas conhecidas por botões sinápticos ou também por junções
neuromusculares, situados sobre dobras juncionais e sendo estas estruturas
depressões profundas na superfície da fibra muscular pós-sináptica que
abrigam os receptores nicotínicos de acetilcolina (Figura 11). A conexão
funcional entre um neurônio motor e uma fibra muscular é uma sinapse química
chamada “placa motora” (Figura 12) (Kandel et al., 2003).
Ambas membranas pré e pós-sinápticas são separadas por fendas com
cerca de 100nm de largura, onde o neurônio motor libera seu neurotransmissor
ACh presente em vesículas através de uma região da membrana neuronal
25
especializada chamada zona ativa. Cada zona ativa na membrana pré-
sináptica está em oposição a uma dobra juncional na membrana pós-sináptica
(Figura 11) (Kandel et al., 2003). A abundância de moléculas de acetilcolina
liberadas do nervo é um fator que promove uma comunicação consistente com
o músculo. A difusão de acetilcolina pela fenda sináptica após sua liberação é
rápida e constante devido à pequena distância a ser atravessada (Land et al.,
1984; Hughes et al., 2006).
Figura 10: Fotomicrografia de uma unidade motora. (http://www.dmacc.cc.ia.us/instructors/Mtrndpl)
A membrana basal se localiza na fenda sináptica, recobrindo a
membrana muscular e sendo composta por proteínas de matriz extracelular e
por colágeno, sendo este o ancorador da enzima acetilcolinesterase, um rápido
hidrolisador de acetilcolina (Kandel et al., 2003). A ação da acetilcolinesterase
juntamente com a difusão natural da acetilcolina na sinapse finaliza a ação
desta. Já a inibição da atividade da enzima aumenta a ativação dos receptores
nicotínicos e reduz a velocidade de decaimento da corrente induzida pela
26
acetilcolina (Katz & Miledi, 1973; McMahan et al., 1978; Hughes et al., 2006).
Isto permite que as fibras musculares respondam prontamente ao próximo
potencial de ação. Vale ressaltar que cada fibra muscular é inervada por
apenas um neurônio motor (Kandel et al., 2003).
Figura 11: Fotomicrografia de um botão sináptico. Setas pretas indicam vesículas neuronais contendo acetilcolina prontas para serem liberadas através de zonas ativas. (http://starklab.slu.edu/neuro/nmj)
Figura 12: Fotomicrografia de uma placa motora. (http://www.bodybuilding.com/fun/peak36a)
27
Quando um potencial de ação neural alcança a junção neuromuscular,
ocorre a liberação de acetilcolina na sinapse, que irá ativar os receptores
nicotínicos e canais de sódio voltagem-dependente presentes em alta
densidade no sarcolema da membrana pós-sináptica. A ativação dos
receptores nicotínicos permite a passagem de cátions através de seu poro
central, ocasionando a geração do potencial de ação na fibra muscular e
promovendo dessa forma a sua contração (Hughes et al., 2006).
Para ocorrer uma contração muscular efetiva, é necessário que a
entrada de cátions seja suficiente para elevar o potencial de repouso muscular
de -90mV para -55mV e gerar um potencial de ação que se propague ao longo
da fibra, conduzido pelo sarcolema (Kandel et al., 2003).
1.6.3 Ação muscular
Para alcançar toda a miofibra, o potencial de ação se propaga através
do sistema de túbulos T (“T” de Transverso), o qual começa no sarcolema e
penetra na fibra, causando a liberação do cálcio armazenado no retículo
endoplasmático que se difunde dentro da miofibra. Nos sarcômeros, filamentos
grossos de miosina e finos de actina na proporção de um para seis
respectivamente, deslizam entre si aproximando as bandas Z. Desta forma,
temos a redução do comprimento do sarcômero causando a contração
muscular. O deslizamento entre essas moléculas ocorre devido à presença de
estruturas específicas (“cabeças”) situadas na miosina que podem se ligar à
actina. Quando não há cálcio presente, a miosina não pode se ligar a actina
porque os sítios de ligação desta estão ocupados por outra proteína, a
troponina. Quando ocorre um potencial de ação, o cálcio é liberado e se liga à
28
troponina resultando na exposição dos sítios de ligação da actina às “cabeças”
da miosina. Também há alteração na forma da proteína tropomiosina, que
expõe os sítios de ligação da miosina aos da actina. Nesse processo, as
“cabeças” da miosina sofrem uma mudança conformacional que as faz girar,
sendo essa rotação que puxa os filamentos finos de actina, um de cada vez,
como um mecanismo de catraca fazendo o músculo contrair. A contração
continua enquanto o cálcio e o ATP estão disponíveis, sendo uma das funções
do ATP quebrar a ligação entre a miosina e a actina fazendo com que a
miofibra volte ao seu estágio inicial, relaxado. Isso explica a rigidez muscular
cadavérica (ausência de ATP). A quantidade de cálcio liberada pelo retículo
endoplasmático depende da freqüência dos potenciais de ação na fibra
muscular (Kandel et al., 2003). A energia da hidrólise de ATP é convertida em
trabalho mecânico para a contração muscular (Schiaffino & Reggiani, 1996;
Hitomi et al., 2005).
1.7 Modelos animais de distrofinopatia
Alguns animais como o camundongo, gato e o cão são usados como
modelos experimentais da DMD por apresentarem alteração no gene que
codifica a proteína distrofina. Algumas raças de cães, como o labrador golden
retriever, rottweiler, fox terrier, selter e pointer alemão podem também
apresentar deficiência de distrofina (Watchko et al., 2002). A progressão da
doença é acompanhada pelo enfraquecimento e contratura muscular desde os
três meses de idade seguida de morte antes da vida adulta. Nos felinos, a
deficiência de distrofina ocasiona o óbito prematuro devido à hipertrofia da
língua e da parte caudal do diafragma (Watchko et al., 2002). O camundongo
29
mdx, um mutante da colônia de C57BL/10ScSn, foi identificado pelos altos
níveis da enzima creatina quinase no soro e lesões histológicas semelhantes a
DMD humana (Bulfield et al., 1984; Nonaka, 1998; Watchko et al., 2002). O
camundongo mdx apresenta uma mutação espontânea no códon terminal do
exon 23 no gene da distrofina (Sicinski et al., 1989), sendo atualmente
considerado o modelo animal mais adequado ao estudo da fisiopatologia da
DMD (Khurana and Davies, 2003). Contudo, os camundongos mdx com 4
semanas apresentam intensa mionecrose e regeneração evidenciada pela
freqüente expressão de fibras com a isoforma da cadeia pesada da miosina
fetal e por fibras com nucleação central (Blake et al., 2002). Essa fase de
degeneração é acompanhada por hipertrofia muscular transitória (Charge &
Rudnicki, 2004) com aumento de fibras com nucleação central e uma
diminuição da expressão da cadeia pesada da miosina fetal (Blake et al.,
2002). Embora ocorra um processo contínuo de degeneração e regeneração
em níveis baixos e relativamente constantes ao longo da vida, os animais
idosos (acima de 15 meses) têm um processo de regeneração defeituoso e
tornam-se extremamente fracos morrendo antes do camundongo do tipo
selvagem (Charge & Rudnicki, 2004).
No diafragma onde a patologia é mais acentuada, ocorre perda de fibra
muscular e alta deposição de colágeno (Coirault et al., 2003). A degeneração
progressiva do diafragma é semelhante à que ocorre nos músculos de
humanos com DMD (Stedman et al, 1991; Coirault et al., 2003), não sendo o
músculo capaz de manter os ciclos repetidos de degeneração e regeneração e
ocorrendo excessiva produção de tecido conjuntivo com progressiva perda de
função e enfraquecimento muscular (Coirault et al., 2003).
30
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
– Investigar o envolvimento da via colinérgica anti-inflamatória na
regulação da inflamação nas diversas fases da miopatia de camundongos mdx
com distrofia muscular de Duchenne.
2.2 Específicos
1. Analisar a expressão do mRNA e das isoformas protéicas da AChRα7
nas células do microambiente do músculo esquelético nas diferentes fases
da miopatia do camundongo mdx;
2. Analisar a expressão do mRNA do TNFα e de suas isoformas protéicas,
a solúvel (17 kDa) e a membranar (27 kDa) no microambiente do músculo
esquelético nas diferentes fases da miopatia do camundongo mdx;
3. Analisar a dinâmica da expressão das proteínas TNFα solúvel e
AChRα7-2 no microambiente do músculo esquelético nas diferentes fases
da miopatia do camundongo mdx;
4. Analisar a atividade das metaloproteases MMP-2 e MMP-9 e
correlacionar com a expressão de TNFα no microambiente do músculo
esquelético nas diferentes fases da miopatia do camundongo mdx;
5. Correlacionar a expressão das proteínas AChRα7-2, TNFα e atividade
de cada uma das metaloproteases no microambiente do músculo
esquelético nas diferentes fases da miopatia do camundongo mdx;
6. Analisar por imuno-histoquímica a possível existência de co-localização
da proteína AChRα7 em macrófagos de camundongos mdx com S4 e S12
nos sítios com infiltrado inflamatório no músculo esquelético.
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Os camundongos distróficos mdx e C57BL10/J foram mantidos no
Biotério de Patologia Celular do Instituto de Biologia da UFF em gaiolas
plásticas forradas com maravalha de pinus autoclavada, em ambiente
climatizado com temperatura controlada a 21ºC e ciclo de iluminação de 12:12
horas. Em cada gaiola havia no máximo 4 animais da mesma idade, gênero e
sempre da mesma prole, para minimizar o estresse. Os animais receberam
ração Nuvital (Paraná, Brasil), suplementação alimentar semanal com farelo de
trigo e água filtrada em bebedouros com canudo longo. Foi realizado
mensalmente o controle de endo e ectoparasitas, e a cada seis meses os
animais eram vermifugados.
Para a obtenção dos resultados através das técnicas de Western Blot,
RT-PCR, Zimografia e Imuno-histoquímica, foram retirados os músculos
gastrocnêmios de camundongos machos com idades correspondentes ao
período que antecede o desmame (2 semanas) e às principais alterações
histológicas da DMD: predomínio de mionecrose (4 semanas), regeneração (8
e 12 semanas) e fibrose (24 e 48 semanas). Os animais foram anestesiados
com pentobarbital (200mg/kg) e em seguida sacrificados por ruptura da medula
cervical, sendo feita assepsia com solução de álcool iodado e procedida a
retirada dos músculos.
32
3.2 Processamento Tecidual
Para a técnica de western blot, os músculos gastrocnêmios dos animais
controle e mdx foram coletados, pesados e homogeneizados (1:5,
peso/volume) em tampão inibidor de protease (Sigma®, EUA) a 4ºC. Após
centrifugação a 12000xG por 15 minutos, as proteínas foram dosadas com
base no método de Bradford. Após estabelecer a mesma concentração de
proteínas para todas as amostras, foram adicionados a elas volumes iguais de
tampão de amostra 3x pH 6,8 (0,173M Tris; 30% glicerol; 3% SDS; 3% β-
mercaptoetanol e 1mg azul de bromofenol), sendo em seguida desnaturadas a
100ºC por 5 minutos.
Para a técnica de zimografia, os músculos gastrocnêmios dos animais
controle e MDX foram coletados e imediatamente congelados em nitrogênio
líquido (-196ºC) para melhor preservação. Os músculos foram pesados e
homogeneizados (1:10, peso/volume) em tampão de extração (100mM Tris-
HCL pH 7,6; 200mM NaCl; 100mM CaCl2 e 1% Triton X-100) a 4ºC. Após
centrifugação a 12000xG por 15 minutos, os sobrenadantes foram divididos em
alíquotas, e a concentração protéica foi determinada através do método de
Lowry.
Para a técnica de imuno-histoquímica, os animais foram anestesiados
com pentobarbital (200mg/kg) e perfundidos rapidamente com solução salina
heparinizada 0,25% para retirar o excesso de sangue existente. Logo após,
foram imediatamente perfundidos com paraformaldeído 4% até 5 minutos após
o surgimento do rigor-mortis, sendo depois perfundidos apenas com solução
salina para retirar o excesso de paraformaldeído. Os músculos gastrocnêmios
foram retirados e pós-fixados sob imersão em paraformaldeído 4% por 6 horas
33
a 4ºC. Terminada a pós-fixação, estes foram imersos a 4ºC progressivamente
em soluções de sacarose 10% por 2 horas, 20% por 4 horas e finalmente 30%
por 12 horas, para os tecidos desidratarem devidamente. Após o procedimento
de perfusão e fixação, os músculos foram congelados em OCT por imersão em
nitrogênio líquido. As lâminas foram previamente tratadas com gelatina 0,5% e
depois filmadas com poly-L-lysina (200mg/ml), para os cortes dos músculos
gastrocnêmios feitos em criostato (Leica CM3050 S, Nussloch, ALE) a -22ºC
com a espessura de 10µm aderirem. Vale ressaltar que os cortes tiveram um
espaçamento de 200µm para subseqüente contagem de macrófagos que co-
expressam AChRα7.
3.3 Western Blot
Foram adicionados 50µg ou 20µg de proteína em cada poço dos géis
com 1,5mm de espessura de poliacrilamida (GIBCO, EUA) de 10% ou 12,5%,
para a análise da expressão da AChRα7 e TNFα, respectivamente.
A eletroforese foi realizada juntamente com o seguinte padrão de peso
molecular: Molecular Rainbow Weight Marker™ (Amersham Biosciences, R.U.),
para a separação e identificação futura por peso molecular das proteínas a 90
Volts por um tempo médio de 150 minutos (Power Pac 200 – Bio-Rad, EUA),
sendo em seguida transferidas para membranas PVDF (Hybond™-P,
Amersham Biosciences, R.U.) a 50 Volts por 150 minutos (Power Pac 200 –
Bio-Rad, EUA). Terminada a transferência, as membranas foram bloqueadas
com 5% de leite desnatado, 1% BSA e 1% soro normal de cabra (Sigma®,
EUA) em TBST (tris-buffered saline + 0,05% Tween20) pH 7,4 em temperatura
ambiente sob agitação por 120 minutos. Ao fim do bloqueio, iniciou-se a
34
incubação com os anticorpos primários específicos individualmente (Tabela 1),
a 4ºC por 16 horas. Após a lavagem das membranas, foi utilizado o anticorpo
secundário cabra anti-IgG de rato conjugado à peroxidase (Sigma®, EUA) na
diluição de 1:5000 para a marcação do anticorpo anti-AChRα7 em temperatura
ambiente sob agitação por 120 minutos, e streptavidina conjugada à
peroxidase (Extr Avidin®-Peroxidase, Sigma Immuno Chemicals, EUA) para
marcação do anticorpo anti-TNFα biotinilado na diluição de 1:3000, também em
temperatura ambiente e sob agitação por 120 minutos.
As bandas foram detectadas por quimioluminescência com o uso do kit
ECL Plus™ (Amersham Biosciences, R.U.) e subseqüente exposição ao filme
Hyperfilm ECL™ (Amersham Biosciences, R.U.) por 5 minutos.
3.4 Extração de RNA Total
Os músculos esqueléticos gastrocnêmios foram homogeneizados na
proporção de 1ml de Trizol (Invitrogen™, EUA) para 100mg de tecido. A seguir,
as amostras foram centrifugadas a 12.000xG por 10 minutos a 8ºC para
remover o fragmento de tecido não dissolvido no Trizol. Os sobrenadantes
foram retirados e adicionados 200µl de clorofórmio, seguindo-se de uma nova
homogeneização por 15 segundos. Após 2 minutos à temperatura ambiente, a
mistura foi centrifugada a 12000xG por 15 minutos a 8ºC. A fase aquosa foi
coletada e transferida para outro tubo, adicionando-se 500µl de isopropanol. As
soluções foram agitadas e incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos
seguindo-se de nova centrifugação a 12000xG por 10 minutos a 8ºC. O pellet
foi lavado com 1ml de etanol 75%, homogeneizado e submetido à nova
centrifugação a 7500xG por 5 minutos a 8ºC. O tubo com o pellet de RNA
35
permaneceu aberto na posição horizontal por 5 minutos para secar. Após esta
etapa, o mesmo foi dissolvido em 20µl de água livre de RNAse tratada com
DEPC e incubado por 10 minutos a 55ºC, sendo em seguida imediatamente
estocado a -70ºC.
3.5 Dosagem de RNA
Após a extração do RNA, o mesmo foi diluído (1:200) em água livre de
RNAse (DEPC). A leitura no espectrofotômetro (U-1500, Hitachi Inc., EUA) foi
realizada em luz ultravioleta e com cubeta de quartzo em dois comprimentos de
onda: 260 nm, a fim de medir a concentração de RNA da amostra, e 280 nm,
para medir a concentração de proteína. Em seguida foi realizada a razão
desses valores obtidos nas leituras, sendo esta razão ideal quando maior que
1,8. A partir dos dados da leitura da densidade óptica em 260 nm e da diluição,
foi feito o cálculo da concentração de RNA de cada amostra extraída. Para a
realização da técnica de RT-PCR, calculamos a concentração final de 2µg de
RNA a partir da concentração do RNA de cada amostra.
3.6 Transcrição Reversa do RNA (RT-PCR)
Em um tubo contendo 2µg de RNA após o tratamento com DNAse, foi
adicionado 1µl de DNTP Mix 10mM, 1µl de hexâmero 250ng/ml e água livre de
RNAse, tratada com DEPC para um volume final de 13µl. Os tubos então foram
aquecidos a 65ºC por 5 minutos no termociclador (PCR Express – Thermo
Hybaid), sendo logo em seguida incubados a 4ºC por 2 minutos e adicionado
em cada tubo 7µl do Mix contendo: 4µl de tampão 5x, 1µl de DTT 0,1M, 1µl de
RNAse Out 40 unid./µl e 1µl da enzima Super Script III (Invitrogen™, EUA). As
36
amostras foram homogeneizadas e incubadas a 25ºC por 5 minutos, seguidas
de incubação a 50ºC por 60 minutos e logo depois inativadas a 70ºC por 15
minutos, sendo finalmente estocadas a -70ºC.
3.7 PCR
Após a obtenção do cDNA a partir do RT, foi possível realizar o PCR.
Em um tubo foram adicionados 2µl de cDNA. Em outro tubo, foram adicionados
para a produção do mix: 14 µl de água livre de RNAse (DEPC), 2 µl de tampão
IB 10x (PCR-MgCl2), 0.6 µl de MgCl2 50 mM, 0.4 µl de DNTP Mix 10mM, 0.4 µl
de primer F 10mM, 0.4 µl de primer R 10mM e 0.2 µl de TAQ DNA Polymerase
5 U/µl, sendo este tubo agitado e centrifugado rapidamente. O mix foi realizado
com margem de erro equivalente a um tubo, ou seja, com um volume
sobressalente de 18 µl. Os reagentes citados foram adquiridos do fabricante
Invitrogen™, EUA. No tubo com cDNA foram acrescentados 18 µl do mix, para
um volume final de 20 µl.
Foram utilizados primers para AChRα7, TNFα e β-actina (Tabela 2),
sendo este último para controle interno. O RNA com seus respectivos primers
utilizados foram amplificados no termociclador (PCR Express – Thermo Hybaid)
a 35, 30 e 19 ciclos (cc) respectivamente. As temperaturas utilizadas foram:
94ºC por 3 minutos, 65º por 1 minuto, e 72ºC por 1 minuto para a AChRα7;
94ºC por 3 minutos, 62º por 1 minuto, e 72ºC por 1 minuto para o TNFα; e 94ºC
por 3 minutos, 58ºC por 1 minuto, e 72ºC por 1 minuto para a β-actina. A
reação foi completada por um último estágio de inativação a 72ºC por 10
minutos. Ao final, as amostras foram estocadas a -20ºC.
37
3.8 Eletroforese de RNA
As amostras foram descongeladas e para cada 10 µl de amostra foram
acrescentados 2 µl de azul de bromofenol (0.25% bromophenol blue). As
amostras foram aplicadas em poços do gel de agarose a 1,5 % com brometo
de etídio (10mg/ml) submerso em tampão TAE 1X. A eletroforese foi realizada
juntamente com o padrão de pares de base φX174RF DNA Hae III Fragments
(Invitrogen™, EUA) durante tempo médio de 35 minutos a 80 Volts. Após a
eletroforese, o gel foi fotografado em câmara escura com filme Polaroid 667
ISO 3000/DIN 36 (31/4x41/4in., 8.5x 10.8 cm, Black & White Instant Pack Film).
3.9 Zimografia
A zimografia foi executada para determinar a atividade gelatinase das
metaloproteases (MMP-9, pro -2 e -2 ativa). Os géis de separação de
poliacrilamida 7,5% foram impregnados com gelatina tipo A (2mg/ml) de pele
de porco (Sigma®, St. Louis Mo., EUA), e os géis de entrada foram de
poliacrilamida 4%. A eletroforese foi realizada com a concentração de 60µg de
proteína para cada uma das amostras aplicadas nos géis a 165 Volts por um
tempo médio de 60 minutos (Power Pac 200 – Bio-Rad, EUA).
Em seguida, os géis foram lavados duas vezes por 30 minutos em
solução 2,5% Triton X-100 à temperatura ambiente e incubados por 24 horas
em tampão de desenvolvimento (10mM Tris-HCL, 5mM CaCl2, 1µM ZnCl2) pH
7,5 a 37ºC. Os géis foram corados (30% metanol, 10% ácido acético e 0,5%
Coomassie Brilliant Blue R-250) e depois descorados com a mesma solução
sem o corante. A atividade gelatinase foi detectada por bandas não coradas em
fundo azul, representando áreas de proteolise da proteína substrato (gelatina).
38
3.10 Ensaio de imuno-histoquímica
3.10.1 Microscopia convencional
As lâminas foram sempre lavadas com PBS 10mM pH 7,4 3 vezes por 5
minutos entre uma etapa e outra. Os cortes primeiramente sofreram inibição da
peroxidase endógena com 3% de peróxido de hidrogênio em PBS por 15
minutos em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram incubados
com a solução de bloqueio (3% BSA, 5% soro de cabra e 1% glicina) em PBST
(phosphate-buffered saline + 0,05% Twen20) por 2 horas também em
temperatura ambiente. Para a detecção da AChRα7, os cortes foram incubados
com o anticorpo primário apropriado (Tabela 1) diluído em PBS BSA 3% a 4ºC
por 16 horas, sendo depois incubados com o anticorpo secundário cabra anti-
IgG de rato conjugado à biotina (Vector Laboratories, EUA) na diluição de
1:200 em temperatura ambiente por 2 horas. Seguiu-se incubando os cortes
com a solução Vectastain® Elite ABC “Avidina – Biotina – Complex” (Vector
Laboratories, EUA) na diluição de 1:50 de ambos reagentes A e B em PBS por
1 hora em temperatura ambiente. Após nova série de lavagens, os cortes foram
incubados em TBS pH 7,6 por 5 minutos objetivando equilibrar o pH para a
próxima etapa. Os cortes foram revelados com o uso do Vector® SG Substrate
Kit for Peroxidase (Vector Laboratories, EUA) na seguinte diluição: 1 gota de
SG + 1 gota de H2O2 para cada 1,67 ml de PBS, expostos por 5 minutos em
câmara escura. Para a detecção da proteína F4/80, um excelente marcador de
macrófagos, em outros cortes seguiu-se incubando com o anticorpo primário
apropriado (Tabela 1) em temperatura ambiente por 2 horas. Em seguida, os
cortes foram incubados com streptavidina conjugada à peroxidase (Extr
Avidin®-Peroxidase, Sigma Immuno Chemicals, EUA) para marcação do
39
anticorpo anti-F4/80 biotinilado na diluição de 1:200 em temperatura ambiente
por 1 hora. Após nova série de lavagens, os cortes foram incubados em
tampão acetato pH 5,2 por 5 minutos objetivando equilibrar o pH para a
próxima etapa. Os cortes foram revelados com solução AEC 5% H2O2 0,5% em
tampão acetato expostos por 5 minutos em câmara escura. Em seguida, os
cortes foram contra-corados com Hematoxilina de Mayer por 2 minutos para
visualização de núcleos.
As imagens foram adquiridas através de câmera digital acoplada em
microscópio óptico com objetivas de 20x e 40x (Zeiss, ALE).
3.10.2 Microscopia de fluorescência
As lâminas foram sempre lavadas 3 vezes por 5 minutos entre as etapas
com PBS 10mM pH 7,4. Os cortes foram incubados com a solução de bloqueio
(3% BSA, 5% soro de cabra e 1% glicina) em PBST por 2 horas em
temperatura ambiente. Para a detecção da AChRα7, os cortes foram incubados
com o anticorpo primário apropriado (Tabela 1) a 4ºC por 16 horas, sendo
depois incubados com o anticorpo secundário cabra anti-IgG de rato conjugado
à fluoresceína – FITC (Gibco BRL) na diluição de 1:250 a 37ºC por 2 horas.
Para a detecção nesses mesmos cortes da proteína F4/80, seguiu-se
incubando com o anticorpo primário apropriado (Tabela 1) em temperatura
ambiente por 2 horas. Em seguida, os cortes foram incubados com
streptavidina conjugada – Cy3™ (Jackson Immuno Research) juntamente com
TOPRO-3 (Molecular probes, EUA), este último objetivando contra-corar
núcleos celulares, ambos na diluição de 1:1000 em temperatura ambiente por 1
hora.
40
Os sinais fluorescentes emitidos dos marcadores de macrófagos e
AChRα7 foram detectados usando microscópio confocal Zeiss LSM510 META
(Zeiss, ALE). Foram quantificados 3 campos aleatórios de infiltrado inflamatório
de cada um dos 4 cortes de músculo oriundos de 3 animais mdx diferentes,
sendo depois analisados para co-localização através do programa AxioVert
(Zeiss, ALE).
Tabela 1 Anticorpos primários usados para imunodeteccção
Ac / Clone Tipo Western blot titulação
Imuno-histoquímica titulação Origem
AChRα7 / 319 Rato monoclonal 1:400 1:250 Covance Inc., EUA.
TNF / MP6-XT3 Rato monoclonal Biotinilado 1:3000 - BD Pharmingen™,
EUA.
β-Actina / I -19 Cabra policlonal HRP 1:1000 - Santa Cruz Inc.,
EUA. F4/80 / A3-1 C57BL
Rato monoclonal Biotinilado - 1:40 Serotec Ltda.,
ING.
Tabela 2 Seqüência de oligonucleotídeos utilizados
Primer Forward Reverse Origem
AChRα7 5’-CGC TGG TTC CCT TTT GAT GTG-3’
5’-ATG GTG CTG GCG AAG TAT TGT-3’ Invitrogen, BRA.
TNFα 5’-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3’
5’-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG-3’ Invitrogen, BRA.
β-Actina 5’-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GC-3’
5’-GAT GGA GGG GCC GGA CTC AT-3' Invitrogen, BRA.
41
3.12 Análise Quantitativa
A análise quantitativa por densitometria óptica foi realizada utilizando o
programa de análise de imagem Scion Program (National Institutes of Health,
Image Program, USA) para as técnicas de western blotting, RT-PCR e
zimografia. A análise quantitativa para co-localização foi realizada utilizando o
programa AxioVert (Zeiss, ALE).
3.13 Análise Estatística
Microsoft Excel software (Microsoft, Seattle, WA) foi utilizado para
calcular médias e desvios padrões. O teste t de Student´s foi aplicado para
calcular a significância dos resultados.
42
4 RESULTADOS
4.1 Ensaios de Western Blot
4.1.1 Expressão da AChRα7 no músculo esquelético
Observamos através da técnica de western blot a existência de duas
isoformas da proteína AChRα7. A primeira marcação correspondia a um peso
molecular em torno de 45kDa e a segunda em torno de 30kDa.
Segundo Herber e colaboradores (2004), estas marcações encontradas
em tecido cerebral de camundongos pelo ensaio de western blot poderiam ser
inespecíficas. Entretanto, Severance e colaboradores (2004) mostraram ter
encontrado uma nova isoforma da proteína em neurônios centrais e periféricos
de ratos oriunda da ocorrência de uma clivagem alternativa, havendo inclusão
de um novo exon entre os exons 4 e 5 próximo à região N-terminal, chamado
portanto de exon 4a. Relatam também que a seqüência do exon 4a de ratos
possui 85% de homologia com o intron 4 do gene da AChRα7 de
camundongos, de acordo com a detecção de uma nova isoforma da AChRα7
no cérebro de camundongos em estudos preliminares do grupo. Esta nova
isoforma derivada da inclusão do novo exon 4a foi chamada de AChRα7-2,
formando αBgtx-AChR homopentaméricos funcionais e possuindo diferentes e
peculiares propriedades biofísicas e farmacológicas da proteína AChRα7
clássica (AChRα7-1) quando expressas em ovócitos.
Comparada com a isoforma AChRα7-1, a AChRα7-2 descrita por
Severance e colaboradores é capaz de se dessensibilizar mais lentamente,
possui maior afinidade à ACh e liga-se à αBgtx rapidamente e de maneira
43
reversível. Por isso, esta nova isoforma AChRα7-2 é capaz de permear uma
quantidade muito maior de íons Ca+ do que a isoforma clássica.
Por outro lado, Saragoza e colaboradores (2003) também descreveram
uma nova isoforma da proteína AChRα7 (AChRα7-2), mas dessa vez em
camundongos, produto de clivagem alternativa do intron 9, resultando na
inserção de um novo exon entre os exons 9 e 10, chamado exon 9b. Com base
na possível estrutura desta nova isoforma, a proteína codificada pelo seu
mRNA deve ser truncada logo após a terceira região transmembranar (M3),
perdendo a alça intracelular e a quarta região transmembranar (M4). Contudo,
a ocorrência deste fato ocasiona em não-tradução de parte da proteína
AChRα7-2 do camundongo, mais especificamente dos aminoácidos oriundos
de parte do exon 9 e exon 10.
Esses resultados justificam as duas marcações encontradas pelo ensaio
de western blot neste trabalho. Utilizamos o anticorpo monoclonal mAb319
para detectar a AChRα7 que acabou por reconhecer duas isoformas da
proteína. Isto se deve ao anticorpo reconhecer a seqüência de aminoácidos
365-384 relativos ao último exon, exon 10, sendo a inclusão do exon 4a
ocorrida entre os exons 4 e 5. A inclusão do exon 4a fará com que um número
maior de aminoácidos seja traduzido sem alterar a região de reconhecimento
do anticorpo, havendo também produção de uma proteína maior e mais pesada
(em kDa). Portanto, há o reconhecimento de duas isoformas da AChRα7 pelo
mAb319. A AChRα7-2 o qual detectamos não deve ser a descrita por Saragoza
e colaboradores, devido a proteína descrita por esses autores não possuir os
aminoácidos oriundos do exon 10. Dessa forma, o anticorpo mAb319 não seria
44
capaz de reconhecer esta nova isoforma. Portanto, a nova isoforma descrita
por Severance e colaboradores é a que mais se enquadra com nossos dados.
Observamos através da técnica de western blot que não houve diferença
significativa na expressão da AChRα7-1 entre os camundongos controle e mdx
em nenhuma das idades analisadas, diferente do ocorrido com a AChRα7-2.
A expressão da AChRα7-2 do grupo controle possui uma tendência
linear, diferente do ocorrido com os camundongos mdx. O camundongo mdx
com S2, quando comparado ao grupo controle (C57) de mesma idade, não
apresentou diferença significativa na expressão da AChRα7-2. Contudo, o mdx
com S4 de idade mostrou aumento significativo de 68,8% (±12%, p<0,05) em
comparação ao respectivo controle, sem diferença significativa em relação ao
mdx com S2. Não encontramos diferença significativa entre os grupos com S8
de idade, embora tenha havido significância entre o mdx de S8 e S2 (p<0,005).
Em S12 podemos observar o pico máximo de expressão da AChRα7-2 no
camundongo mdx, correspondendo a um aumento significativo de 56% (±8%,
p<0,005) comparado ao respectivo controle. Como a idade de S12 do mdx
correspondeu ao pico máximo de expressão da AChRα7-2, observamos então
na idade de S24 uma acentuada e progressiva queda, mas ainda assim com
aumento significativo de 30% (±13%, p<0,05) quando comparado ao respectivo
controle. Finalmente, quando o camundongo mdx completou S48 de vida,
apresentou queda na expressão, com redução significativa de 25% (±8%,
p<0,05%) em comparação ao respectivo controle. Observamos também que no
camundongo mdx com S48 de idade, a expressão da AChRα7-2 era parecida à
encontrada na idade de S2 (Figura 13).
45
Comparando a expressão da AChRα7-2 dos camundongos mdx de S4
com os de S12, sendo essa última idade correspondente ao pico máximo de
sua expressão, observamos que houve um aumento marcante de 74% (±8%,
p<0,005). Já os camundongos mdx com S48 de idade apresentaram redução
na expressão da AChRα7-2 de 50% (±8%, p<0,005) quando comparados aos
camundongos mdx de S12 (Figura 13). Os controles negativos foram
realizados com êxito.
______ ______ ______ ______ ______ ______ S2 S8 S24S4 S12 S48 _______
Expressão da AChR
0
30
60
90
120
2s 4s 8s 12s 24s 48s
Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
C57
MDX
Figura 13: Expressão da AChRα7-2 no músculo esquelético. Western blot (A) e respectiva quantificação (B) de camundongos controle C57 e mdx em diferentes fases da miopatia inflamatória. Cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de 3 camundongos por grupo e idade. A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗ p<0,05 e ∗∗ p<0,005.
C M _______ C M _______ C M _______ C M _______ _______ C M C M
α7-2A
α7-1
∗∗
∗ ∗
∗∗
α7-2
B
∗
∗∗
S2 S4 S8 S12 S24 S48
46
4.1.2 Expressão de TNFα no músculo esquelético de camundongos mdx
Análise da expressão de TNFα por western blot nos camundongos mdx
teve como objetivo pesquisar um dos principais indicadores de inflamação
local. Os resultados mostraram a existência de duas isoformas de TNFα.
Dados da literatura mostram que a isoforma de 27kDa é encontrada na
membrana celular de inúmeras células, correspondendo ao TNFα membranar
ou forma não-clivada, envolvida na indução de inflamação por contato célula-
célula. A segunda possui 17 kDa, sendo produto da clivagem de enzimas como
por exemplo, a MMP-9, possui capacidade maior de induzir inflamação devido
a sua solubilidade, sendo portanto um indicador de inflamação mais eficiente
(Figura 14 A).
Nos camundongos mdx com S2, o TNFα solúvel (17kDa) estava menos
expresso 47% (±13,5%, p<0,005) que a forma não-clivada (27kDa). Já na idade
de S4, a forma não-clivada diminuiu enquanto que a forma solúvel aumentou
significativamente 48% (±5,5%, p<0,05), porém sem diferença significativa
entre as duas formas nesta idade. Quando comparados o TNFα solúvel das
idades de S4 e S12, observamos queda marcante e significativa de 61% (±5%,
p<0,0005) em sua expressão, sendo que a forma solúvel já se encontrava
menos expressa que a não-clivada na idade de S8 em 32% (±5%, p<0,05) e na
idade de S12 em 42% (±5%, p<0,05). A expressão de TNFα solúvel continuou
a decrescer até a idade de S24, o qual já era significativamente menos
expressa que a forma não clivada em 55% (±2%, p<0,0005). Esta diferença
diminuiu em 28% (±8%, p<0,05) quando os camundongos possuíam S48, onde
a forma não-clivada teve uma forte queda enquanto que a forma solúvel
aumentou discretamente (Figura 14 B).
47
Notamos também que na maioria das idades, enquanto uma das formas
do TNFα aumentava, a outra diminuía, salvo em S8, o qual ambas reduziram
(Figura 14). O C57 com S4 mostrou marcação muito fraca para o TNFα
membranar e solúvel. Os controles negativos foram realizados com êxito.
_____ __________ _____ _____ _____ S2 S48 S4 S8 S12 S24
27kDaAMDX
17kDa
Expressão da proteína TNF
0
25
50
75
100
2s 4s 8s 12s 24s 48s
Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
TNF 27 kDa
TNF 17 kDa
α
B αα
∗∗∗
∗∗
∗
∗∗
∗∗∗
∗
S2 S4 S8 S12 S24 S48
Figura 14: Expressão de TNFα no músculo esquelético de camundongos mdx. Western blot (A) e respectiva quantificação (B) em diferentes fases da miopatia inflamatória. Cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de 3 camundongos por idade. A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗ p<0,05, ∗∗ p<0,005 e ∗∗∗ p<0,0005.
4.1.3 Expressão de β-Actina no músculo esquelético
A marcação da proteína β-actina foi realizada pela técnica de western
blot para fins de controle de carregamento, objetivando igualar a quantidade de
proteína de todas as amostras dos dois grupos estudados (Figura 15).
______ ______ ______ ______ ______ ______ S2 S8 S24S4 S12 S48 ________
Figura 15: Expressão da proteína β-actina no músculo esquelético.
C M ________ C M ________ C M ________ C M ________ ________ C M C M
43kDa
48
4.1.4 Relação entre as isoformas solúvel e membranar da proteína TNFα
Com a finalidade de analisar por western blot durante as diversas fases
da miopatia inflamatória a dinâmica de expressão do TNFα solúvel, foi
idealizada uma fórmula para obtenção de um fator (razão).
Fator = TNFα 17kDa ÷ TNFα 27kDa
Observamos que, quando comparados aos camundongos mdx com S2,
os mdx com S4 apresentaram aumento significativo de 70% (±19%, p<0,05) de
TNFα solúvel em relação ao TNFα não-clivado. Os camundongos mdx com
S12 mostravam uma redução marcante de 35,5% (±10%, p<0,05) em
comparação ao mdx com S4 no pico de mionecrose. A expressão de TNFα
solúvel em relação ao TNFα não-clivado quando os camundongos
apresentavam S12 de vida era semelhante ao mdx com S2, mesmo após o
forte aumento encontrado quando os camundongos possuíam S4 de idade. A
diminuição na expressão do TNFα solúvel ainda era percebida nos mdx de S24
(p<0,0005), entretanto, quando apresentavam S48, mostravam aumento
marcante de 62% (±18%, p<0,05) em comparação à idade de S24 (Figura 16).
Todas as idades analisadas apresentaram resultados significativos,
salvo em S4, devido ao fato de não haver diferença significativa entre o TNFα
não-clivado e o solúvel nesta idade (Figura 16), como mostrado e citado
anteriormente no gráfico “Expressão da proteína TNFα” (Figura 14 B).
49
Relação TNF solúvel e membranar
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
s 2s 4s s
Idade (semanas)
TNF
olúv
el /
mem
bran
arα
MDX∗∗
∗∗
∗∗∗∗
∗∗∗
s
α
2sS2 4sS4 8S8 1S12 2S24 48S48
Figura 16: Relação entre a expressão muscular de TNFα solúvel e membranar. Análise por western blot em diferentes fases da miopatia inflamatória, onde cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de 3 camundongos por idade. A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗ p<0,05, ∗∗ p<0,005 e ∗∗∗ p<0,0005.
4.1.5 Relação entre as proteínas AChRα7-2 e TNFα solúvel
Com a finalidade de analisar por western blot ao longo das diversas
fases da miopatia inflamatória a dinâmica de expressão da AChRα7-2,
seguimos efetuando a razão com o TNFα solúvel para obtermos um fator
(razão).
Fator = AChRα7-2 ÷ TNF 17kDa
Inicialmente, observamos que não houve diferença significativa na
expressão da AChRα7-2 em relação ao TNFα solúvel entre os camundongos
mdx com S4 e os com S2. Os mdx com S8 de idade já apresentavam aumento
significativo (p<0,0005). Entretanto, o ápice na expressão da AChRα7-2 foi
atingido nos mdx com S12, que apresentaram aumento significativo de 263%
(±4%, p<0,0005) quando comparado aos mdx com S4. A idade do mdx com
S12 correspondeu ao pico máximo de expressão da AChRα7-2 em relação à
inflamação. Foi observado então uma progressiva queda de 40% (±16%,
50
p<0,0005) em sua expressão até a idade de S48. Ainda assim, a expressão da
AChRα7-2 em relação à inflamação na idade de S24 era significativa
(p<0,0005) e parecida com a encontrada na idade de S8. Todas as idades
analisadas apresentaram resultados significativos em relação ao fator obtido
anteriormente (Figura 17).
Relação AChR
eα7-2 TNF
51
mdx com S24 ainda apresenta este padrão de progressiva redução de TNFα
solúvel, mas já com diminuição na expressão da AChRα7-2. Quando chegam à
idade de S48, a expressão de TNFα solúvel aumenta enquanto que a AChRα7-
2 diminui, reduzindo a discrepância antes citada (Figura 21).
Equilíbrio entre TNF
sα olúvel e AChR em camundongos mdx
0
4
8
12
8s
Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
α7-2
TNF
AChRα
α7-2
2sS2 4sS4 8sS8 12sS12 24sS24 4S48
Figura 18: Equilíbrio entre a expressão muscular de TNFα solúvel e AChRα7-2. Análise por western blot em diferentes fases da miopatia inflamatória, onde cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de 3 camundongos por idade.
4.2 Ensaios de RT-PCR
4.2.1 Expressão de mRNA da proteína AChRα7 no músculo esquelético
A fim de investigar a expressão de mRNA da proteína AChRα7 em
ambos os grupos, utilizamos a técnica de RT-PCR. Observamos a presença de
apenas uma marcação para o mRNA, ao contrário da proteína, que mostrou a
presença de duas isoformas, sugerindo alteração apenas na tradução protéica.
Nossos resultados mostraram que o mdx com S2, quando comparado ao grupo
controle de mesma idade, não apresentou diferença significativa, além de
possuir baixa variação entre as amostras. Contudo, quando o camundongo
mdx apresentava S4, mostrava aumento significativo de 110% (±23%, p<0,05)
52
na expressão de mRNA da AChRα7 comparado ao grupo controle de mesma
idade, e aumento marcante de 187,5% (±23%, p<0,05) quando comparado ao
mdx com S2. Por outro lado, quando os mdx completaram S8, passaram a
expressar menos mRNA da AChRα7 em 67% (±20%, p<0,005) quando
comparados ao grupo controle de mesma idade, e significativa redução na
expressão em 200% (±20%, p<0,05) quando comparados aos mdx com S4.
Não houve diferença significativa nas idades de S12 e S24, mas sim uma
tendência a aumento nos animais mdx, devido ao aumento significativo em S48
de 89% (±14%, p<0,05) em comparação com o respectivo grupo controle
(Figura 18). Os controles negativos foram realizados com êxito.
Expressão de mRNA da AChR
0,0
0,5
1,0
1,5
2s 4s 8s 12s 24s 48s
Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
C57
MDX
Figura 19: Expressão de mRNA da proteína AChRα7 no músculo esquelético. RT-PCR (A) e respectiva quantificação (B) de camundongos controle C57 e mdx em diferentes fases da miopatia inflamatória. Cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de 3 camundongos por grupo e idade. A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗ p<0,05 e ∗∗ p<0,005.
______ ____ S2 C M CN ______
____ S4C M ______
____ S8C M ______
____ S12C M ______
____ S24 C M ______
____ S48 C M A
603bp
310bp
α7
B ∗
∗
∗
∗∗∗
S2 S4 S8 S12 S24 S48
53
4.2.2 Expressão de mRNA da proteína TNFα no músculo esquelético
A fim de investigar a expressão de mRNA da proteína TNFα nos
camundongos mdx e no grupo controle, foi utilizada a técnica de RT-PCR.
Nossos resultados mostraram que os camundongos mdx com S2, quando
comparados ao grupo controle de mesma idade, não apresentaram diferença
significativa além de possuírem baixa variação entre as amostras. Todavia,
quando os camundongos mdx apresentavam S4, era evidente o aumento
significativo de 355% (±13%, p<0,005) na expressão de mRNA do TNFα
comparados ao grupo controle de mesma idade, e forte aumento de 268%
(±13%, p<0,005) quando comparados aos camundongos mdx com S2.
Entretanto, quando os camundongos mdx completaram S8, passaram a
expressar menos mRNA do TNFα em 43% (±11%, p<0,05) comparados aos
mdx com S4. Não foi evidente diferença significativa nas idades de S8, S12 e
S24 dos camundongos mdx em comparação aos respectivos grupos controles.
Entretanto, podemos visualizar uma tendência a aumento o qual culmina em
S48 de 805% (±12%, p<0,0005) em comparação com seu respectivo grupo
controle (Figura 19). Os controles negativos foram realizados com êxito.
55
4.3 Atividade de metaloproteases no músculo esquelético
As MMPs são secretadas de forma latente e requerem clivagem do NH2
terminal para se tornarem ativas. A exposição de pró-enzimas dos extratos de
tecidos ao SDS durante a eletroforese leva à ativação sem clivagem
proteolítica.
Utilizamos a técnica de zimografia a fim de investigar a atividade da
MMP-9 (100kDa), pro-MMP-2 (60kDa) e a forma ativa da MMP-2 (55kDa) em
ambos os grupos. Não foi observada atividade da MMP-9 em nenhuma das
idades analisadas do grupo controle, assim como nos camundongos mdx com
S2. Os camundongos mdx com S4 apresentaram atividade marcante e
significativa da MMP-9 (p<0,05), seguido de redução de 54% (±17%) na idade
de S8 (p<0,0005). Quando a atividade da MMP-9 foi comparada entre as
idades de S4 e S12 (p<0,0005), observamos significativa redução de 87%
(±14%, p<0,05). Os mdx com S24 e S48 não apresentaram atividade da MMP-
9 detectável pelo ensaio.
A análise da atividade da pro-MMP-2 mostrou que ambos os grupos com
S2 não apresentaram diferença significativa entre si. Enquanto o grupo controle
manteve sua atividade até a idade de S4, os camundongos mdx apresentaram
forte aumento de 159% (±10%, p<0,005), tanto quando comparado ao grupo
controle de mesma idade, quanto comparado aos mdx com S2. A idade de S4
é correspondente ao seu pico máximo de atividade. Comparando os
camundongos mdx com o grupo controle, na idade de S8 observamos aumento
na atividade da pro-MMP-2 de 289% (±16%, p<0,0005) e na idade de S12
aumento de 242% (±9%, p<0,005). Não encontramos diferença significativa
entre os grupos com S24 de idade. Entretanto, os camundongos mdx com S48
56
apresentaram aumento na atividade da pro-MMP-2 de 257% (±28,5%, p<0,05)
comparado ao grupo controle de mesma idade. Comparando a atividade da
pro-MMP-2 entre os mdx com S4 e os com S12, observamos que houve
marcante redução de 51% (±9%, p<0,005). Notamos também que o grupo
controle tende a seguir uma constância na atividade da pro-MMP-2 enquanto
nos camundongos mdx essa constância é restrita às idades de S24 e S48.
A análise da atividade da forma ativa da MMP-2 mostrou não haver
diferença significativa entre os grupos com S2, da mesma maneira que ocorre
na análise das MMP-9 e pro-MMP-2. O grupo controle ao chegar à idade de S4
não mostrou nenhuma atividade desta MMP, assim como todas as outras
idades posteriores analisadas. O mdx com S4 apresentou aumento significativo
na atividade da forma ativa da MMP-2 (p<0,0005) quando comparado ao
respectivo controle, embora em comparação ao mdx com S2 foi observado
forte redução de sua atividade em 73% (±17%, p<0,05). Quando a atividade da
forma ativa da MMP-2 foi comparada entre as idades de S4 e S12 (p<0,05) dos
camundongos mdx, passando por S8 (p<0,0005), observamos forte e
significativo aumento de 730% (±20%, p<0,005). As idades de S24 e S48 não
apresentam nenhuma atividade da forma ativa da MMP-2 (Figura 22 e 23).
_____ _____ _____ _____ _____ _____ S4 S8 S12 S24 S48 S2 _______ _______
Figura 22: Atividade de metaloproteases no músculo esquelético. Zimogramas de músculo esquelético de camundongos controle C57 e mdx em diferentes fases da miopatia inflamatória.
_______ C M C M C M _______ _______ _______ C M C M C M
MMP-9
pro-MMP-2 MMP-2 ativa
57
At
ividade da MMP-9
A
0
1000
2000
3000
Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
C57
MDX
2sS2 4sS4 8sS8 12sS12 24sS24 48sS48
Atividade da pró MMP-2
0
4000
8000
12000
2sS2 4sS4 8sS8 12sS12 24sS24 48sS48Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
C57
MDX
Atividade da MMP-2 Ativa
0
400
800
1200
2sS2 4sS4 8sS8 12sS12 24sS24 48sS48Idade (semanas)
Uni
dade
Arb
itrár
ia
C57
MDX
∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗
∗∗
∗∗
∗
∗∗
∗∗
∗∗ ∗
∗∗∗
B
∗
C
Figura 23: Atividade das MMP -9 (A), pro -2 (B) e -2 ativa (C) no músculo esquelético. Cada ponto representa média e respectivo desvio padrão de no mínimo 3 camundongos por grupo e idade. As idades de S2 e S8 de ambos os grupos correspondem a n=4 e n=6 respectivamente. A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗ p<0,05, ∗∗ p<0,005 e ∗∗∗ p<0,0005.
58
4.4 Análise Imuno-histoquímica
4.4.1 Microscopia convencional
Objetivando investigar nos camundongos mdx de S12 a localização da
59
4.4.2 Microscopia de fluorescência
Objetivando investigar nos camundongos mdx com S4 e S12 a possível
existência de co-localização da proteína AChRα7 em macrófagos nos sítios de
infiltrado inflamatório, e quantificar o número de células duplamente marcadas,
foi utilizada a técnica de Imuno-histoquímica de fluorescência.
Observamos que houve co-localização da AChRα7 em determinados
macrófagos localizados nos sítios inflamatórios, principalmente em S12
(Figuras 26 e 27), variando em quantidade numérica em comparação com S4.
Quando comparados aos camundongos mdx com S4, os camundongos mdx
com S12 apresentaram aumento marcante e significativo de 908% (±23%,
p<0,0005) no número de macrófagos que expressavam a proteína AChRα7
(Figura 25). O infiltrado inflamatório em S12 continua extenso, como podemos
observar em imagens menos amplificadas (Figura 26). Os respectivos controles
negativos foram realizados com êxito.
Macrófagos expressando AChR
0
1
2
3
4
Núm
ero
de c
élul
as (x
10-3
α7
/ µ m
2 ) 4 semanas
12 semanas∗∗∗
Figura 25: Co-localização de F4/80 e AChRα7 no infiltrado inflamatório. Quantificação do número de macrófagos expressando AChRα7 de camundongos mdx em duas fases distintas da miopatia inflamatória: inflamatória (S4) e regenerativa (S12). A análise estatística foi baseada no teste t de Student, onde: ∗∗∗ p<0,0005.
60
A AChRα7 B TOPRO
C F4/80 D Merge
Figura 26: Imunohistoquímica de fluorescência amplificada 20x de mdx com S12.
E Merge F
H I
G
Referente ao infiltrado inflamatório do músculo esquelético, onde: (A) Marcação da AChRα7, (B) TOPRO, (C) F4/80 e (D) sobreposição. (E) Visualização de outro campo com sobreposição de imagens. Setas brancas em (D) indicando imagens detalhadas em (F) e (G). Setas brancas em (E) indicando imagens detalhadas em (H) e (I). Escala: 50 µm.
61
A B TOPROAChRα7
C F4/80 D Merge
Figura 27: Imunohistoquímica de fluorescência amplificada 40x de mdx com S12.
F
H I
GE Merge
Referente ao infiltrado inflamatório do músculo esquelético, onde: (A) Marcação da AChRα7, (B) TOPRO, (C) F4/80 e (D) sobreposição. (E) Visualização de outro campo com sobreposição de imagens. Setas brancas em (D) indicando imagens detalhadas em (F) e (G). Setas brancas em (E) indicando imagens detalhadas em (H) e (I). Escala: 20 µm.
63
imunes. Passado este estágio inicial, os níveis de MMP-9 diminuem e a MMP-2
atinge o auge de sua expressão, talvez pela necessidade da degradação do
colágeno tipo IV e outros componentes da membrana basal para a estimulação
de células satélites, via fatores de crescimento que são liberados durante o
processo. As metaloproteases por muito tempo foram consideradas moléculas
pró-inflamatórias, porém atualmente são consideradas imunomoduladoras,
atuando de diferentes maneiras dependendo do contexto fisiológico no qual
estão inseridas, em uma tentativa de retornar à homeostase (Kherif, et al.,
1999). Portanto, as MMPs são importantes e potenciais alvos terapêuticos
(Frederiks & Mook, 2004), bem como o uso de inibidores de MMPs, que já
mostraram eficácia em modelos de câncer e doenças inflamatórias agudas e
crônicas (Chandler, et al., 1997).
Várias técnicas são utilizadas para determinar a presença de proteases
nos tecidos, onde o RT-PCR e o northern blot são utilizados para quantificar
mRNA nos extratos de tecidos, enquanto que a hibridização é utilizada para
localizar mRNA em preparados de células ou em cortes teciduais. Entretanto, a
atividade transcricional não necessariamente reflete na quantidade e atividade
do produto proteína. As técnicas de western blot e imunohistoquímica são
utilizadas para determinar o nível de expressão e localização das proteases,
mas não para se obter informações sobre sua atividade, devido ao fato de
serem sintetizadas em uma forma pró-inativa que requer processamento
proteolítico para ativação. A zimografia é uma técnica simples, sensível e
confiável para a análise da atividade proteolítica em células e extratos de
tecidos. As MMPs possuem a capacidade de renaturação após a remoção do
64
SDS e exercer atividade proteolítica em substratos polimerizados, sendo
portanto analisadas por este método (Frederiks & Mook, 2004).
Existem fortes evidências de que as respostas inflamatórias em vários
tecidos possam ser influenciadas tanto pela ACh secretada pelo nervo vago
(Borovikova et al., 2000; Tracey, 2002; Bernik et al., 2002; Wang et al., 2003;
Saeed et al., 2005; Czura & Tracey 2005) quanto pela ACh secretada por
outras células não-neuronais, como células epiteliais e endoteliais (Tracey,
2002; Czura & Tracey, 2005). Os autores supracitados concordam com a
existência de um mecanismo eferente vagal chamado via colinérgica anti-
inflamatória, no qual a ACh é capaz de inibir a secreção de citocinas
inflamatórias em macrófagos localizados em tecidos acometidos.
Borovikova e colaboradores (2000) validaram essa teoria através de
alguns experimentos, mostrando que: a ACh é capaz de se ligar aos AChRs de
macrófagos residentes, e essa interação inibe a síntese de TNFα a nível pós-
transcricional. A ACh inibe a secreção especificamente de citocinas pró-
inflamatórias, sem alterar a liberação da citocina anti-inflamatória IL-10. Além
disso, ratos vagotomizados ficavam mais sensíveis ao LPS produzindo
significativamente mais TNFα e se tornando mais susceptíveis à hipotensão,
porém quando sofriam estimulação elétrica vagal os níveis de TNFα no soro e
no fígado eram fortemente atenuados. Bernik e colaboradores (2002)
afirmaram que a inibição da produção de TNFα em macrófagos era
dependente de αBgtx-AChRs. Os autores mostraram que o tratamento de ratos
Lewis com CNI-1493, uma molécula inibidora da fosforilação da p38 MAPK,
inibia a inflamação sistêmica por via endovenosa ou diretamente nos
ventrículos cerebrais (100 mil vezes mais efetivo), reduzindo os níveis de TNFα
65
e atenuando a inflamação sistêmica da mesma forma que a estimulação
elétrica vagal. Entretanto, quando os ratos foram vagotomizados, perderam os
efeitos protetores do tratamento intracerebral com CNI-1493. Mostraram
também que a estimulação vagal foi eficiente em inibir os níveis de TNFα no
coração e fígado, porém falhou em inibir os níveis de TNFα nos pulmões. Estes
dados indicam a especificidade anatômica da via colinérgica anti-inflamatória
em inibir o TNFα, comprovando a existência de órgãos alvo como o coração e
fígado, já que os pulmões sofrem inervação vagal e não apresentaram
alteração desta citocina.
Wang e colaboradores (2003) demonstraram pela primeira vez que a
αBgtx-AChRα7 era expressa em macrófagos humanos. Mostraram que
macrófagos tratados com LPS e expostos a oligonucleotídeos antisenso
(ASα7) eram significativamente menos responsivos à ação inibitória da
nicotina, restaurando a secreção de TNFα. Estudos com camundongos
nocautes evidenciaram uma importante função para a AChRα7 como
componente periférico da via colinérgica anti-inflamatória: o tratamento com
nicotina ou ACh em macrófagos isolados desses camundongos que não
expressavam AChRα7 falhou em inibir a secreção de TNFα quando tratados
com LPS. O nível sérico de citocinas inflamatórias desses animais também
encontrava-se elevado quando comparado aos selvagens, e a estimulação
vagal nos camundongos nocautes tratados com LPS não surtiu efeito ao
contrário dos animais selvagens tratados. Esses dados indicam fortemente que
a AChRα7 é um componente essencial para a inibição colinérgica de secreção
de TNFα em macrófagos de camundongos.
66
Nosso trabalho objetivou compreender melhor as distintas fases da
miopatia no camundongo mdx, investigando a regulação da AChRα7. Devido
aos camundongos mdx possuírem primeiramente uma fase de intensa
mionecrose (S4) seguida de fase onde predomina a regeneração (S12),
provavelmente possuem algum mecanismo natural de equilíbrio, pois o curso
da miopatia é benigno.
Os camundongos com S2 de ambos os grupos apresentaram padrão
similar tanto na expressão das isoformas protéicas da AChRα7, quanto na
expressão de mRNA. No camundongo mdx com S2, a expressão da proteína
TNFα solúvel foi significativamente menor que a expressão de TNFα
membranar (p<0,005). Apresentaram também padrão similar na expressão de
mRNA do TNFα ao grupo controle. No mdx com S2 não houve atividade da
MMP-9, enzima esta altamente relacionada com a liberação da forma solúvel
da proteína TNFα por clivagem, embora expressa também por células satélites
ativadas possivelmente para contribuir na degradação da ECM e facilitar sua
migração para regenerar o tecido muscular lesado (Kherif, et al., 1999). Ainda
nesta idade, tanto a pro-MMP-2 quanto o seu produto, a MMP-2 ativa
mostraram padrões similares entre os dois grupos estudados, estando a última
enzima diretamente relacionada com a regeneração muscular (Kherif, et al.,
1999). Correlacionando os dados pesquisados, temos a forte sugestão de que
durante esta fase inicial da vida do camundongo mdx as alterações no
microambiente muscular relacionados com a miopatia sejam menos intensas.
Esta afirmação baseia-se no fato de não ter havido diferença significativa em
nenhum dos parâmetros analisados entre os grupos. Isto pode ser devido ao
camundongo mdx com S2 ainda estar sendo amamentado pela mãe, ingerindo
67
hormônios da lactação que estão protegendo todo o sistema do animal.
Lembramos que a musculatura do animal mdx não expressa a proteína
distrofina, responsável por proporcionar suporte estrutural e conectar a matriz
extracelular ao citoesqueleto. Nesta idade de aleitamento, o mdx tem menor
contração da musculatura esquelética, deixando-a menos propensa a atrito,
forças de cisalhamento, e conseqüente surgimento de micro-fissuras e
exposição de material intracelular para o meio extracelular, que acaba por
induzir atividade inflamatória local. A forma ativa da MMP-2 encontrada em
ambos os grupos nesta idade sugere função no desenvolvimento e maturação
muscular, já que não houve atividade em nenhuma outra idade analisada do
grupo controle.
Comparados aos camundongos mdx com S2, os mdx com S4 não
mostraram alteração significativa na expressão total das proteínas AChRα7-2 e
TNFα, embora tenhamos encontrado o importante achado de inversão na
expressão entre as isoformas solúvel e membranar do TNFα. Por outro lado, os
camundongos mdx com S4 apresentaram aumento na expressão de mRNA da
proteína AChRα7 de quase três vezes, e aumento na expressão de mRNA da
proteína TNFα de quase quatro vezes. Todavia, o fato de haver grande
aumento na expressão de mRNA não quer dizer que haverá tradução protéica
proporcional. Nessa fase da miopatia, o camundongo já foi desmamado e está
em constante atividade física, ocasionando atrito muscular e surgimento de
micro-fissuras na membrana basal das células musculares. Como já citado, a
ocorrência dessas micro-fissuras musculares permite que o material intracelular
extravase para o meio extracelular, induzindo atividade inflamatória local.
Células inflamatórias ativadas são induzidas a produzir MMP-9, que por sua
68
vez são ativadas pela interação com o Ca+ extravasado. A forte sinalização
inflamatória nessa fase em parte pode ser derivada da grande atividade da
MMP-9, que cliva o TNFα com alta afinidade liberando sua forma solúvel, que
por sua vez pode induzir inflamação em grande escala. Este fenômeno justifica
o aumento de TNFα solúvel em relação ao TNFα membranar encontrado
nessa idade. A atividade enzimática da MMP-9 juntamente com a atividade
inflamatória do TNFα solúvel induzem ativação de NFκB em células
inflamatórias e musculares, que acaba por resultar em maior produção de
MMP-9 e TNFα (Kherif, et al., 1999). A pro-MMP-2 aumentou seus níveis em
quase três vezes, embora a sua forma realmente efetiva, a MMP-2 ativa,
reduziu significativamente sua atividade (p<0,05). Isso ocorre provavelmente
pela prevalência do grande estímulo de inflamação sobre o estímulo à
regeneração. Portanto, nota-se a existência de um “círculo vicioso” com
necessidade de modulação. Esses resultados nos sugerem que na idade de S4
do mdx esteja havendo forte sinalização inflamatória, devido tanto ao aumento
de mRNA e da forma solúvel do TNFα, além de forte atividade proteolítica da
MMP-9. Entretanto, esses resultados também nos sugerem a ocorrência de
sinalização anti-inflamatória, embora em menor grau, devido ao não-aumento
de produção total de TNFα mesmo havendo grande aumento de seu mRNA,
resultando em inflamação modulada em níveis pós-transcricionais e de acordo
com Borovikova (2000).
Comparados aos camundongos mdx com S2, os mdx com S8
mostraram aumento significativo na expressão da AChRα7-2 (p<0,005). A
expressão da isoforma membranar e principalmente a solúvel do TNFα em S8
apresentou redução significativa comparada aos mdx com S4 (p<0,0005),
69
sendo nítida a diferença entre as isoformas nessa idade. A expressão de
mRNA da AChRα7 praticamente voltou ao padrão encontrado em S2, embora
a expressão de mRNA do TNFα tenha reduzido em apenas 43% do encontrado
em S4. A atividade da MMP-9 também foi reduzida em mais de 50%,
contribuindo com a redução de clivagem do TNFα, associado ao forte aumento
da forma ativa da MMP-2 e redução inversamente proporcional da pró MMP-2,
contribuindo para migração de células satélites e conseqüentemente com a
regeneração. Esses resultados nos sugerem que por volta da idade de S8 do
camundongo mdx esteja ocorrendo uma modulação mais eficiente da forte
inflamação encontrada em S4. A drástica redução de ambas as isoformas
protéicas do TNFα em S8, principalmente da forma solúvel, justifica a redução
da prevalência de TNFα solúvel sobre o TNFα membranar; e correlacionado ao
aumento de expressão protéica da AChRα7-2, justifica o aumento da
prevalência da AChRα7-2 em relação ao TNFα solúvel. Dessa forma, estes
dados indicam fortemente a existência de uma efetiva redução da inflamação
por um mecanismo fisiológico próprio, e possivelmente relacionado ao aumento
da AChRα7-2.
Os camundongos mdx com S12 apresentaram o nível máximo de
expressão da AChRα7-2, embora a análise da expressão de seu mRNA tenha
se mostrado próximo do encontrado em S2. Esse dado pode nos sugerir maior
preservação da AChRα7-2 na membrana dos macrófagos, assim como maior
taxa de reciclagem do receptor. Não houve diferença significativa na expressão
do mRNA da proteína TNFα tanto quando comparado ao respectivo grupo
controle quanto aos mdx com S8. A expressão da proteína TNFα solúvel
continuou a reduzir enquanto a membranar aumentava, mostrando claramente
70
a proporcionalidade inversa dessas moléculas. Esses dados justificam a
continuada redução da prevalência de TNFα solúvel sobre o TNFα membranar,
bem como o aumento e nível máximo atingido da prevalência da AChRα7-2 em
relação ao TNFα solúvel. A redução na expressão da citocina TNFα solúvel
parece estar intimamente relacionada com a continuada redução de atividade
da MMP-9, o qual acaba por reduzir sua ação de clivagem. Observamos nessa
idade o nível máximo da forma ativa da MMP-2, associado à redução
inversamente proporcional da pro-MMP-2. Notamos que nesta fase da miopatia
foi atingido o nível máximo de expressão da AChRα7-2 e da forma ativa da
MMP-2, bem como próximo do nível mínimo de expressão de TNFα solúvel e
MMP-9. Esses dados nos sugerem fortemente que a diminuição da inflamação
atingiu seu grau máximo e prosseguiu de maneira eficiente, tanto a níveis pré
quanto pós-transcricionais, sugerindo também a existência de alguma relação
de equilíbrio entre as diferentes MMPs.
Os camundongos mdx com S24 ainda apresentavam maior expressão
da AChRα7-2 em comparação com seu respectivo grupo controle, porém
sendo visível uma redução em comparação ao mdx com S12, já que nesta
idade o mdx apresentava o nível máximo de expressão de toda a vida do
animal. Observamos que a expressão da proteína TNFα solúvel estava
reduzida em seu nível máximo nessa idade enquanto a membranar aumentava,
da mesma forma que ocorreu nos mdx com S12, evidenciando a
proporcionalidade inversa dessas moléculas. Não observamos diferença
significativa na expressão de mRNA da AChRα7 e do TNFα nos mdx de S24
tanto quando comparados ao respectivo grupo controle quanto ambos os
grupos com S12. Também não observamos nenhuma atividade da MMP-9.
71
Esses dados sugerem que os camundongos mdx com S24 ainda apresentam a
característica de modulação da inflamação ocorrida em S12, embora com
menos vigor, mas suficiente para manter reduzido os níveis de TNFα e
nenhuma atividade da MMP-9. Entretanto, não foi observado a presença da
forma ativa da MMP2, bem como aumento de atividade da pro-MMP2,
indicando a ausência de clivagem. Isso nos indica que possivelmente com S24
não esteja ocorrendo regeneração muscular como ocorria nas idades
anteriores. Isto pode ocorrer devido as células satélites estarem escassas ou
simplesmente ausentes, motivado pelos constantes e ininterruptos ciclos de
mionecrose e regeneração sofrido pelos camundongos mdx. Outra
possibilidade seria pelo equilíbrio direto entre a MMP-9, TNFα solúvel e MMP-
2. Se há ausência de atividade da MMP-9 e a expressão de TNFα solúvel está
controlada em níveis não-deletérios, a forma ativa da MMP-2 poderia ser
reduzida para voltar próximo de sua normalidade e a pró MMP-2
conseqüentemente aumentaria pela ausência de clivagem, estando nossos
resultados coerentes.
Os camundongos mdx com S48 mostraram forte queda na expressão da
AChRα7-2 assumindo padrão semelhante ao encontrado no mdx com S2, e
ainda menor expresso que o respectivo grupo controle. A expressão de TNFα
membranar também mostrou queda enquanto a expressão da forma solúvel do
TNFα se manteve. Isso justifica o grande aumento na prevalência de TNFα
solúvel sobre o membranar, e a redução da prevalência da AChRα7-2 em
relação ao TNFα solúvel. Entretanto, houve aumento na expressão de mRNA
da AChRα7-2, bem como aumento de mais de 8 vezes na expressão de mRNA
do TNFα nesta idade. O aumento na expressão de mRNA da AChRα7-2 e
72
principalmente de TNFα não resultaram em aumento de tradução, já que a
expressão protéica da AChRα7-2 diminuiu e a de TNFα praticamente se
manteve. Não observamos atividade da MMP-9 e da forma ativa da MMP-2,
mesmo tendo observado expressão da pro-MMP-2. Esses resultados sugerem
que nesta fase da miopatia não houve modulação tão eficiente da inflamação
como observado nas outras idades do mdx, apesar da ausência de atividade
da MMP-9 e da manutenção na expressão do TNFα solúvel.
Herber e colaboradores (2004) fizeram ensaio de imunohistoquímica por
microscopia convencional utilizando o mAb319 em cortes cerebrais de
camundongos selvagens e nocaute para a AChRα7, onde mostraram ter
detectado a marcação da AChRα7 em ambos os grupos, afirmando que ambas
marcações eram inespecíficas. No presente trabalho foi realizado o ensaio de
imuno-histoquímica criteriosamente sob as mesmas condições como publicado
por Herber, inclusive com o mesmo tipo e marca comercial tanto do anticorpo
secundário biotinilado quanto do conjugado. Porém, realizado em cortes do
músculo gastrocnêmio de camundongos mdx, e como controle negativo a
utilização de PBS ao invés do anticorpo primário. Observamos que além de
haver marcação nos cortes onde não foi utilizado o mAb319, ocorreu o mesmo
padrão de marcação como nos cortes onde o anticorpo foi utilizado, estando o
resultado de nosso experimento absolutamente similar ao mostrado por Herber.
Entretanto, ao realizarmos o ensaio de imuno-histoquímica com o uso do
anticorpo secundário conjugado à fluoresceína observamos a existência de
marcação específica para a AChRα7, já que não houve nenhuma marcação em
nosso controle negativo. Nossas imagens obtidas através de microscopia
73
confocal se mostraram conclusivas e validaram o experimento. Esses dados
comprovam falha em ambos ensaios de imuno-histoquímica com imagens
obtidas por microscopia convencional. Em alguns casos neste tipo de imuno-
histoquímica, faz-se necessário a obtenção da maior amplificação possível de
um sinal, que pode ser feito com auxílio de um conjugado de avidina marcada
com peroxidase para interagir com a biotina do anticorpo secundário. Contudo,
este tipo de reação abre precedente para uma ampla gama de interações e
marcações inespecíficas, pois se sabe que muitas proteínas são naturalmente
biotiniladas. Dessa forma, a avidina conjugada à peroxidase liga-se à biotina
associada a alguma proteína tecidual, resultando em marcação inespecífica
quando revelada. Este pode ter sido o motivo das marcações encontradas
tanto por Herber nos cortes cerebrais de camundongos selvagens e nocautes
para AChRα7, quanto por nós nos controles positivos e negativos de cortes do
músculo gastrocnêmio de camundongos mdx.
Respaldado pelos experimentos e observações supracitadas, podemos
afirmar que o mAb319 é totalmente confiável e viável para a detecção da
AChRα7, e que Herber e colaboradores talvez tenham se precipitado em
colocar em dúvida a especificidade do anticorpo em questão.
Wonnacott e Jones (2005) mostraram-se de acordo com Herber, tanto
que publicaram as mesmas imagens sob autorização para justificar a afirmação
de suposta marcação inespecífica do mAb319, inclusive se baseando nesses
resultados para formularem algumas hipóteses. Essas hipóteses tentam
explicar a reação cruzada de outro tipo de anticorpo testado e não do mAb319.
Já com o anticorpo monoclonal mAb306, que reconhece o epítopo
correspondente aos aminoácidos 380 a 400, a reação cruzada pode ocorrer
74
devido à existência do mesmo epítopo de reconhecimento em outras proteínas.
Além disso, os autores sugerem que o problema de marcação inespecífica
pode ser exacerbado pela baixa tolerância dos AChRs às condições de fixação,
resultando em redução de ligação específica do anticorpo e fraca taxa de
reconhecimento. No presente trabalho, esta hipótese está descartada porque
os camundongos foram perfundidos, e o mAb319 reconheceu a AChRα7 com
alta especificidade, já que não houve marcação nos controles negativos. Com
base em nossas imagens obtidas por microscopia confocal, o mAb319
reconheceu a AChRα7 com alta especificidade.
Herber e colaboradores (2004) através de western blot, encontraram 2
bandas protéicas com diferentes pesos moleculares, tanto em camundongos
selvagens quanto em nocautes para AChRα7, afirmando que o anticorpo é
capaz de reconhecer múltiplas proteínas e que partilham as mesmas
distribuições celulares e subcelulares. Ainda relacionam que a ocorrência de
transcrições alternativas e mecanismos compensatórios podem comprometer o
uso destes tecidos como controle, como ocorre em humanos. Esses autores
não levaram em consideração as publicações de Saragoza (2003) e
principalmente de Severance (2004), que afirma e comprova a presença de
uma nova isoforma da AChRα7 em ratos e que isso provavelmente ocorre em
camundongos, devido à inclusão do novo exon (4a) possuir 85% de homologia
com o intron 4 do gene da AChRα7 murino e de acordo com a detecção de
uma nova isoforma da AChRα7 no cérebro de camundongos em estudos
preliminares do grupo. Portanto, o que pode estar ocorrendo é um mecanismo
compensatório também nos camundongos através de clivagem alternativa,
podendo até mesmo ocorrer nos camundongos nocautes a longo prazo. Isso
75
explicaria as 2 bandas protéicas consideradas inespecíficas encontradas por
Herber e colaboradores (2004).
Wonnacott e Jones (2005) se basearam em experimentos e conclusões
precipitadas de Herber e colaboradores (2004), além de terem também
sugerido hipóteses questionáveis e não considerado os importantes achados
de Saragoza (2003) e Severance (2004). Colocaram vários trabalhos
publicados em dúvida, sem considerar a possibilidade de existência de uma
nova isoforma, como é de fato. Afirmaram como resolução do problema o uso
do antagonista de alta afinidade α-Bgtx conjugado, embora a α-Bgtx possa se
ligar seletivamente também aos receptores homoméricos α8 e α9, receptores
heteropentaméricos α7, α8 ou α9 e α10 já citados na introdução, como
também ao α1 (Yoshikawa et al., 2006). Nota-se, portanto, que a utilização de
α-Bgtx além de não solucionar o problema de inespecificidade, ainda pode se
ligar seletivamente a alguns outros tipos de receptores. Faz-se necessário
primeiramente realizar experimentos com o máximo de critério possível, para
minimizar tanto as eventuais marcações inespecíficas quanto conclusões
errôneas.
Com base em todos os nossos resultados apresentados, podemos
qualificar as idades características de inflamação em S4 e de regeneração em
S12 nos camundongos mdx, e correlacioná-las através da imuno-histoquímica
por fluorescência. As imagens obtidas através de microscopia confocal nos
permitiram evidenciar nos infiltrados inflamatórios do músculo gastrocnêmio
uma importante e crucial diferença entre as idades: o número de macrófagos
76
que co-expressavam a AChRα7 na idade de S12 mostrou-se significativamente
superior em mais de 9 vezes à encontrada em S4 (p<0,0005).
Como já citado, a isoforma clássica da AChRα7 não mostrou diferença
significativa no ensaio de western blot tanto entre os grupos quanto entre as
idades estudadas. Apenas a AChRα7-2 mostrou-se variável, e nos
camundongos mdx. Portanto, podemos sugerir que a alteração no número de
co-localizações evidenciada pela imuno-histoquímica é resultante da expressão
em grande maioria da isoforma AChRα7-2 nos macrófagos dos mdx.
Saeed e colaboradores (2005) mostraram que sinais colinérgicos eram
capazes de inibir respostas inflamatórias em células endoteliais, ou seja,
inibição na expressão de moléculas de adesão, como V-CAM e E-Selectina,
tanto in vitro quanto in vivo, devido a ativação das AChRα7. A expressão
destas moléculas é importante na migração de macrófagos ativados e outras
células do sistema imune para o infiltrado inflamatório. Entretanto, quando a
inflamação se torna deletéria e intermitente, como na DMD, se faz necessário
reduzir seus efeitos danosos, já que a própria citocina TNFα é capaz de ativar
maior produção de mediadores inflamatórios. Na linhagem celular HuMVECs, a
nicotina reduziu a translocação nuclear do NFκB após estimulação com TNFα
e LPS, aumentando os níveis citoplasmáticos das proteínas inibidoras de
NFκB: IκBα e IκBε, que se ligam ao NFκB e o retém no citoplasma. Portanto,
sugeriram que a ACh e a nicotina ativariam células endoteliais e monocíticas a
aumentarem seus níveis citoplasmáticos de IκBα e IκBε, resultando em inibição
de translocação nuclear do NFκB e conseqüentemente inibindo a produção de
TNFα induzido por mediadores inflamatórios.
77
Yoshikawa e colaboradores (2006) afirmaram que a ativação do NFκB é
causada pela fosforilação em resíduos serina-específicos da proteína inibitória
IκB mediada pela ativação da IKK (I kappa B kinase), permitindo com que a
forma ativa do NFκB se transloque para o núcleo iniciando a transcrição
gênica. Em monócitos humanos, os níveis citosólicos de IκBα não mudaram
após a estimulação com LPS. Entretanto, a fosforilação de IκBα foi induzida
quando os monócitos foram estimulados com LPS, inibida quando tratados com
nicotina, e restaurada com o tratamento concomitante de nicotina e α-Bgtx.
Estes dados sugerem que os efeitos inibitórios da nicotina reduzam a atividade
da IKK, e como conseqüência ocorre inibição da fosforilação de IκBα
resultando em redução na ativação do NFκB.
A produção de TNFα é dependente da ativação e translocação nuclear
do NFκB. Portanto, a AChRα7 tem participação fundamental no controle e
modulação da inflamação, já que sua ativação inibe a fosforilação de IκBα,
impedindo com que o NFκB se transloque para o núcleo e exerça atividade
transcricional de mediadores inflamatórios como TNFα. Embora saibamos que
sinais colinérgicos tenham ação de inibição inflamatória, não se sabe ao certo
se a nicotina modula a transcrição ou a ativação de IκB, ou inibe algum
mediador que previna sua ubiquitinação e subseqüente degradação.
Existem evidências de que a nicotina ativa a via de transcrição Jak2-
STAT3 através da AChRα7, bem como a ocorrência de interação direta da
STAT3 fosforilada com o NFκB em macrófagos. Vale ressaltar que STAT3 é
um regulador negativo da resposta inflamatória, e quando ligado ao NFκB,
impede sua ligação ao DNA.
78
Associemos essas evidências com a realidade de nosso trabalho. O fato
do camundongo mdx com S12 comparado ao com S4 possuir quase 2 vezes
mais a expressão da AChRα7 e apresentar mais de 9 vezes o número de
macrófagos a expressando nos sugere que o camundongo nesta fase da
miopatia possui um mecanismo fisiológico próprio para aumentar a captação do
ligante ACh e amplificar sua sinalização. Isso provavelmente se deve à
necessidade de inibição de citocinas inflamatórias para amenizar os danos
causados pela miopatia, como é o caso da forte redução de TNFα solúvel
observada. Sugerimos que nesta fase da miopatia após a detecção local da
inflamação, seguido de modulação da resposta e eferência vagal com
subseqüente liberação de ACh e ativação das AChRα7 de macrófagos, esteja
ocorrendo a redução de atividade dos IKK que por sua vez reduzem a
fosforilação de IκB resultando em inibição de translocação nuclear do NFκB e
contribuindo com a inibição na produção de TNFα observada, bem como outros
possíveis importantes mediadores inflamatórios. A ACh pode também estar
ativando no camundongo mdx a via Jak2-STAT3 através da AChRα7, em
adição à ocorrência de interação direta da STAT3 fosforilada com o NFκB,
impedindo sua ligação ao DNA nuclear em macrófagos e inibindo a produção
de TNFα.
Pela primeira vez no modelo experimental murino in vivo da DMD
humana foi mostrada a co-localização da AChRα7 em macrófagos, além do
envolvimento da nova isoforma AChRα7-2, ambas relacionadas à modulação
da inflamação através da via colinérgica anti-inflamatória.
79
Tabela 3 Síntese dos resultados obtidos
- : similar ao controle n : nenhuma atividade
80
6 CONCLUSÕES
Os animais de ambos os grupos expressam 2 isoformas da proteína
AChRα7, onde a isoforma clássica AChRα7-1 não mostrou variação entre
eles. A isoforma AChRα7-2 não mostrou diferença entre os animais do
grupo controle, entretanto, nos animais mdx evidenciou variações
significativas.
Observamos a presença de apenas uma marcação para o mRNA da
proteína AChRα7, ao contrário da proteína que evidenciou a presença de
duas isoformas, sugerindo alteração e tradução do intron 4 como se fosse
um exon (exon 4a).
A análise da expressão do mRNA da proteína AChRα7 mostrou forte
aumento no pico da mionecrose (S4), redução em S8 e manutenção em S12
e S24. Entretanto, a expressão protéica da AChRα7 nestas duas últimas
fases foram as maiores encontradas. Isso nos sugere, portanto, preservação
do mRNA em S4 para futura tradução em S8 e S12, maior taxa de
conservação do receptor na membrana e maior taxa de reciclagem. A
expressão do mRNA da AChRα7 aumentou em S48, porém não resultando
em tradução, pois a expressão protéica estava reduzida nesta fase.
A técnica de western blot mostrou a presença de duas marcações para
a citocina TNFα no músculo esquelético do camundongo mdx, a forma
membranar ou não-clivada com 27kDa, e a forma solúvel com 17kDa,
produto da clivagem da isoforma membranar.
Camundongo mdx com S4 apresentava aumento na expressão da
forma solúvel e diminuição na expressão da forma membranar do TNFα,
81
indicando clivagem da citocina. Na fase de regeneração com S12, foi
observada forte redução de ambas isoformas.
A análise da atividade da MMP-9 no músculo esquelético mostrou que
esta enzima não é constitutiva no camundongo controle. No pico da
mionecrose (S4) o mdx apresentou o nível máximo de atividade, com
subseqüente redução até não se detectar nenhuma atividade no zimograma
do mdx com S24.
Foi observada modulação na expressão do mRNA da citocina TNFα no
músculo esquelético do mdx. No pico da mionecrose (S4) observou-se forte
aumento, redução em S8, e seguido de aumento em S48, provavelmente
motivada pela forte redução da prevalência da AChRα7-2 sobre a forma
solúvel do TNFα. O aumento do mRNA do TNFα no mdx com S48 pode ser
derivado em parte do aumento no número de fibroblastos no músculo
esquelético para contrapor a grande deposição de tecido não funcional.
A expressão máxima da forma solúvel do TNFα no músculo
esquelético do mdx ocorreu na idade de S4, enquanto a expressão da
AChRα7-2 não foi alterada nesta idade em relação à S2. Entretanto, com
S12 o músculo esquelético do camundongo mdx apresentou a expressão
máxima da AChRα7-2, enquanto a expressão de TNFα solúvel se mostrou
bem próximo do mínimo observado. Em S24 ainda era observado nível
elevado da AChRα7-2 e máxima redução do TNFα solúvel. Em S48
observamos forte redução da AChRα7-2, inclusive com menor expressão
que o encontrado no respectivo controle. Em adição, nesta fase da miopatia
podemos observar aumento da prevalência do TNFα solúvel em relação ao
membranar e à AChRα7-2.
82
A análise da expressão protéica da AChRα7-2 no músculo esquelético
do camundongo mdx se mostrou inversamente proporcional à expressão
protéica do TNFα solúvel nas idades estudadas, salvo em S2, pois nessa
idade as alterações no microambiente muscular relacionado a miopatia
parecem ser menos intensas.
A forma pro-MMP-2 estava mais expressa no músculo esquelético do
mdx que no controle nas idades de S4 a S48, salvo em S2 que se mostrou
similar, indicando eficiente sinalização para remodelamento tecidual.
Todavia, a forma ativa da MMP-2, produto da clivagem da pro-MMP-2,
estava aumentada em S8 e atingindo seu ápice em S12, mostrando
atividade inversamente proporcional à pro-MMP-2 e indicando efetivo
remodelamento tecidual.
O número de macrófagos localizados nos infiltrados inflamatórios do
músculo esquelético do mdx que expressavam a AChRα7-2 na idade de S12
foi significativamente maior em 908% (±23%, p<0,0005) comparado à idade
de S4.
Em conjunto, os resultados indicam que a AChRα7-2 possui uma
função relevante na modulação da inflamação no músculo esquelético do
camundongo mdx. A ativação da via colinérgica anti-inflamatória relacionada
também à isoforma AChRα7-2 poderia ser capaz de influenciar a migração
de células do sistema imunológico, a produção local de mediadores
inflamatórios como TNFα e imunomoduladores como MMPs nas fases tanto
de aumento da inflamação e mionecrose, quanto de aumento regenerativo,
influenciando na remodelagem tecidual.
83
7 PERSPECTIVAS FUTURAS
O impedimento da translocação nuclear do NFκB como terapia é muito
importante para minimizar os efeitos exacerbados da inflamação em doenças
crônicas como a DMD, pois muitos mediadores inflamatórios além do TNFα
para serem transcritos necessitam de sua ativação e translocação nuclear.
Outras citocinas inflamatórias para serem produzidas são dependentes
também do aumento direto dos níveis de TNFα. Um exemplo é a citocina
HMGB1, induzida pelo TNFα e secretada tardiamente por macrófagos e
monócitos ativados, agindo como mediador inflamatório sistêmico, às vezes
letal. O HMGB1 é passivamente liberado por células em processo de necrose
nas áreas de injúria, amplificando o processo inflamatório ao induzir liberação
de outras citocinas inflamatórias. A ACh é capaz de impedir a secreção de
HMGB1 induzida por LPS, através da inibição de sua translocação do núcleo
para o citoplasma em macrófagos. Entretanto, diferentemente de outras
citocinas, a síntese desta é requerida para sobrevivência dos macrófagos, e a
ACh, por outro lado, não afeta os níveis intracelulares deste mediador. Essas
evidências sugerem que a ACh deve regular a secreção de HMGB1 a nível
pós-traducional, modulando por acetilação ou fosforilação. Além disso, o INFγ é
capaz de induzir maior produção de TNFα e HMGB1 em macrófagos, ficando
claro, portanto, a manutenção de um “círculo vicioso” onde o TNFα está
sempre presente (Rendon-Mitchell et al., 2003).
Possivelmente, o uso terapêutico tanto de nicotina quanto de outros
agonistas específicos para a AChRα7 e AChRα7-2 podem contribuir para
minimizar os efeitos deletérios da inflamação, também na DMD. Sugerimos que
84
a alteração no número de co-localizações evidenciada pela imuno-histoquímica
é resultante da expressão em grande maioria da isoforma AChRα7-2 nos
macrófagos dos mdx. Contudo, para investigar essa teoria, será necessário
realizar culturas primárias de macrófagos e de células musculares
separadamente para analisar a expressão de cada isoforma, sem a
interferência da inflamação como ocorre in vivo. Neste contexto, são
importantes os estudos in vivo e in vitro para analisar os mecanismos
envolvidos na ativação da via colinérgica anti-inflamatória em músculos com
diferentes padrões de inervação. Tais estudos também servirão de base para
selecionar um agonista natural ou sintético análogo à ACh, tendo como alvo a
inibição de ativação do NFκB, porém que não seja capaz de dessensibilizar os
receptores se utilizado durante tempo prolongado. Esta estratégia de
tratamento provavelmente possibilitará baixa morbidade e melhor qualidade de
vida, favorecendo a regeneração muscular, mitigando a mionecrose e a
inflamação.
85
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROIMUNOLOGIA
PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE
ESTUDO DO POSSÍVEL ENVOLVIMENTO DA
SUBUNIDADE α7 DO RECEPTOR NICOTÍNICO DE
ACETILCOLINA NA ATIVAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NO
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