Estudo dos extratos dos frutos de Sapindus saponaria ... · SHEILA BARRETO GUTERRES Estudo dos...

SSHHEEIILLAA BBAARRRREETTOO GGUUTTEERRRREESS

EEssttuuddoo ddooss eexxttrraattooss ddooss ff rruuttooss ddee SSaappiinndduuss ssaappoonnaarr iiaa eennrriiqquueecciiddooss eemm ssaappoonniinnaass ee oouuttrrooss ggll iiccoossddeeooss ee ssuuaa

aappll iiccaaoo eemm eelleettrrooffoorreessee ccaappii llaarr

DDiisssseerrttaaoo aapprreesseennttaaddaa aaoo IInnssttiittuuttoo ddee

QQuummiiccaa ddee SSoo CCaarrllooss,, ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee ddee SSoo

PPaauulloo ppaarraa oobbtteennoo ddoo ttttuulloo ddee MMeessttrree eemm

CCiinncciiaass ((QQuummiiccaa AAnnaallttiiccaa))..

OOrriieennttaaddoorr:: EEmmaannuueell CCaarrrriillhhoo

SSoo CCaarrllooss

22000055

RREESSUUMMOO

Os frutos de S. saponaria, espcie bastante abundante em So Carlos e outras

regies do Brasil so ricos em glicosdeos anfiflicos, ou seja, compostos por uma parte

polar e outra apolar. Devido a esta peculiaridade tendem a formar espuma mostrando

propriedades qumicas semelhantes s dos tensoativos. Alguns destes glicosdeos

pertencem classe das saponinas e so constitudos por uma aglicona de estrutura

carbnica a qual est ligada a uma ou duas cadeias de acar. O interesse pelas

propriedades tensoativas deste glicosdeos motivou o estudo destas substncias para uso

em eletroforese capilar. Os frutos foram extrados com metanol e fracionados em coluna

cromatogrfica preparativa utilizando sephadex LH-20 como fase estacionria. Aps a

eluio, as fraes foram analisadas por espectrometria de massas e estudadas por

eletroforese capilar. A eletroforese capilar de zona mostrou-se uma tcnica vivel para o

estudo das fraes obtidas. Embora um grau de pureza elevado no tenha sido

alcanado, a frao B foi utilizada como aditivo para tampo em cromatografia

eletrocintica micelar (MEKC) e uma interao diferenciada foi observada do

nitrobenzeno com o tampo aditivado em relao ao tampo com SDS puro.

AABBSSTTRRAACCTT

Sapindus saponaria is a very abundant species in So Carlos and others regions

of Brazil. Fruits of S. saponaria have a high content of glycosides which possess well-

defined regions of hydrophobic and hydrophilic feature denominated amphiphilic

molecule. Thus, this can form a foam showing chemical proprieties equals to

surfactants. Some glycosides belong to class of saponins and are composed of carbonic

structure designates aglycone, which is linked in one or two sugar chains. The purpose

of the present study was the use of glycosides due to their surfactants properties in

further applications of capillary electrophoresis. The extraction of crude fruits was

carried out with methanol and this extract was fractionated in Sephadex LH-20. The

fractions were analyzed for mass spectrometry and studied in capillary electrophoresis

(CE). This is a feasible technique for the study of fractions obtained. Although a high

degree of purity was not reached, the fraction B were used as additive for the electrolyte

background in MEKC. The nitrobenzene showed different interaction with micellar

system in the electrolyte background with fraction B.

DDeeddiiccoo eessttee ttrraabbaallhhoo aaooss mmeeuuss ssuuppeerr ppaaiiss JJOOOO GGOONNAALLVVEESS GGUUTTEERRRREESS ee MMAARRIIAA TTEERREEZZAA BBAARRRREETTOO GGUUTTEERRRREESS...... ......ppeelloo aammoorr iinnccoonnddiicciioonnaall qquuee ttmm ppoorr mmiimm,, ppeellooss eennssiinnaammeennttooss mmoorraaiiss pprriimmoorrddiiaaiiss qquuee ccuullttiivvaarraamm eemm mmeeuu ccoorraaoo ddeessddee aa mmaaiiss tteennrraa iiddaaddee.. VVaalloorreess ccoommoo hhoonneessttiiddaaddee,, aammoorr aaoo pprrxxiimmoo,, ppeerrsseevveerraannaa ee ddeetteerrmmiinnaaoo.. IIssssoo aa mmaaiioorr ccoonnttrriibbuuiioo qquuee hheerrddeeii.. MMuuiittoo oobbrriiggaaddaa..

AAAAAAAAGGGGGGGGRRRRRRRRAAAAAAAADDDDDDDDEEEEEEEECCCCCCCCIIIIIIIIMMMMMMMMEEEEEEEENNNNNNNNTTTTTTTTOOOOOOOOSSSSSSSS

AA DDeeuuss,, ppeellaa ssuuaa iinnffiinniittaa bboonnddaaddee ee aammoorr iinnccoonnddiicciioonnaall qquuee ppeerrmmiittee qquuee tteennhhaammooss iinnmmeerraass

cchhaanncceess ddee eerrrraarr,, aapprreennddeerr,, ssee aarrrreeppeennddeerr ee,, aassssiimm,, eevvoolluuiirr..

ss aaggnncciiaass ddee ffoommeennttoo ppeessqquuiissaa:: CCAAPPEESS ppeellaa bboollssaa ccoonncceeddiiddaa,, CCNNPPqq ee FFAAPPEESSPP,, ppeellaa iinnffrraa--

eessttrruuttuurraa ddooss llaabboorraattrriiooss..

AAooss mmeeuuss ppaaiiss JJoooo GGoonnaallvveess GGuutteerrrreess ee MMaarriiaa TTeerreezzaa BBaarrrreettoo GGuutteerrrreess,, ccoomm mmuuiittoo aammoorr..

AAoo mmeeuu oorriieennttaaddoorr EEmmaannuueell CCaarrrriillhhoo ppeellaa ppaacciinncciiaa,, ccoommpprreeeennssoo ,, aammiizzaaddee ee ccoonnffiiaannaa..

AAooss mmeeuuss iirrmmooss ee ssoobbrriinnhhooss CCaarrllooss AAllbbeerrttoo,, GGiillbbeerrttoo,, WWaaggnneerr,, JJhhoonnii,, JJeenniiffffeerr ee NNiicchhoollaass ppeelloo

aammoorr ee ccaarriinnhhoo qquuee mmee ccoonncceeddeemm..

AAoo mmeeuu aammaaddoo GGeebbssoonn EEdduuaarrddoo BBsscchheerr ppeelloo aammoorr,, ffoorraa ee iinncceennttiivvoo nnoo ttrrmmiinnoo ddoo ttrraabbaallhhoo..

AAoo mmeeuu aammiiggoo AAnnddeerrssoonn EEsspprriittoo SSaannttooss BBeezzeerrrraa ppeellaa aammiizzaaddee,, ccaarriinnhhoo ee vvaalliioossaa aajjuuddaa..

AAooss mmeeuuss aammiiggooss SSoo CCaarrlleennsseess ttrrii lleeggaaiiss!!!!!! CCrriissttiiaannee ddee PPaauullaa MMoocccciioo,, RRoossiilleennee PPrreesstteess,,

RRooddrriiggoo MMaarrqquueess,, AAmmiillttoonn TTeeiixxeeiirraa MMaattooss,, PPrriisscciillaa MMaarriiaa AAllvveess,, PPaauullaa RRaattttiiss TTeeiixxeeiirraa,, CCllaauuddeettee

AAllvveess,, llvvaarroo JJooss NNeettoo,, MMaarriibbeell FFuunneess HHuuaaccccaa,, NNiillssoonn AAssssuunnoo,, AArrlleettee FFeerrrreeiirraa,, CClliiaa CCaarruussoo,,

DDaanniiaannee VViicceennttiinnee,, CChhrriissttiiaann ee RRaaffaaeellaa FFeerrnnaannddeess,, ppeellaa aammiizzaaddee,, ccaarriinnhhoo,, ccoommppaannhhiiaa ee

pprriinncciippaallmmeennttee ppeellaa aajjuuddaa qquuee mmee ddiissppeennssaarraamm..

AAoo PPrrooff.. DDrr.. EEddssoonn RRooddrriigguueess FFiillhhoo ((DDQQ--UUFFSSCCaarr)) ppeellaa ccoollaabboorraaoo ee ccoo--oorriieennttaaoo..

AAoo PPrroo.. DDrr.. FFeerrnnaannddoo MMaauurroo LLaannaass..

AAooss ccoolleeggaass,, PPrrooffss.. ee ffuunncciioonnrriiooss ddooss llaabboorraattrriiooss:: CCrroommaa ((UUSSPP)),, PPrroodduuttooss NNaattuurraaiiss ((UUFFSSCCaarr)),,

EEssppeeccttrroommeettrriiaa ddee MMaassssaass ((UUFFSSCCaarr)),, CCLLAAEE ((UUFFSSCCaarr)) ee SSnntteessee ddee PPrroodduuttooss NNaattuurraaiiss ((UUFFSSCCaarr))

ppeellooss eennssiinnaammeennttooss tteerriiccoo ee pprrttiiccoo,, ppeellaass aajjuuddaass nnaa rreeaalliizzaaoo ddooss eexxppeerriimmeennttooss ee ppeellaass ggaarrggaallhhaaddaass..

AAooss PPrrooffss.. DDrrss.. HHaammiillttoonn VVaarreellaa ee WWaaggnneerr LLuuiizz PPoolliittoo ppeellaa ppaacciinncciiaa aaoo mmee pprreessttaarraarreemm

eessccllaarreecciimmeennttooss eemm eelleettrrooqquummiiccaa ee eeqquuiillbbrriioo qquummiiccoo,, rreessppeeccttiivvaammeennttee..

ss sseeccrreettaarriiaass ddaa ppss--ggrraadduuaaoo SSllvviiaa ee AAnnddrraa ppeellaa ddiissppoonniibbiilliiddaaddee eemm aajjuuddaarr ee sseerrvviirr ee ss

ffuunncciioonnrriiaass ddaa bbiibblliiootteeccaa ddoo IIQQSSCC....

AAooss ttooddooss ooss ccoolleeggaass ddoo IIQQSSCC ee ddoo DDQQ--UUFFSSCCaarr ppeellaa ppaarrcceerriiaa ee ttrrooccaa ddee iiddiiaass ppeellooss ccoorrrreeddoorreess..

LLIISSTTAA DDEE IILLUUSSTTRRAAEESS

Figura 1: Estrutura de uma saponina isolada dos frutos de Sapindus saponaria..................................13

Figura 2: Ilustrao de um sistema utilizado em eletroforese capilar.....................................................24

Figura 3: Variao do potencial eltrico com a distncia da parede do capilar......................................27

Figura 4: Esquema que mostra o comportamento das espcies no capilar durante a

eletroforese..............28

Figura 5: Esquema que resume a relao entre os parmetros que influenciam as separaes

em eletroforese capilar............................................................................................................28

Figura 6: Ilustrao esquemtica que mostra o comportamento de uma soluo de SDS,

tamponada, dentro do capilar utilizado em eletroforese...........................................................30

Figura 7: Esquema das partes de um espectrmetro de massas com triplo quadrupolo,

utilizado para experimentos de espectrometria de massa tandem.............................................36

Figura 8: Ilustrao mostrando o mecanismo de formao do spray.......................................................38

Figura 9: Ilustrao dos componentes de um analisador do tipo quadrupolo..........................................40

Figura 10: Ilustrao esquemtica dos procedimentos realizados no processo de extrao

e fracionamento em cromatografia lquida preparativa do extrato metanlico.......................44

Figura 11: Espectro de massas (A) extrato metanlico e (B) extrato hidrometanlico..........................

53

Figura 12: Espectro do extrato aquoso (superior) e da espuma (inferior)..............................................54

Figura 13: Representao microscpica do gel. (A) Estrutura microscpica das esferas do gel polimrico

empacotado, v0 o volume intersticial, vi o volume do poro e a poro preta a matriz do gel.

(B) Estrutura polimrica do gel de dextran hidroxipropilado com cadeias

entrecruzadas....................................................................................................................56

Figura 14: Grfico mostrando o gradiente de eluio utilizado para as anlises de HPLC...................59

Figura 15: Cromatograma da frao 16 da coluna MeOH/H2O (8:2)..............................................60

Figura 16: Cromatograma da frao 20 da coluna MeOH/H2O (8:2)..............................................61

Figura 17: Espectro de massas das fraes reunidas 16-19 (inferior) e das fraes reunidas 20-26

(superior)..........................................................................................................................62

Figura 18: Conjunto de espectro de massas das fraes eludas com MeOH/H2O (1:1).

Debaixo para cima: frao 12, 24, 49 e 62......................................................................64

Figura 19: Espectro de massas do resduo evaporado do efluente da coluna de HPLC

preparativo........66

Figura 20: Eletroferograma da frao (A) utilizando borato puro. Modo CZE..................................71

Figura 21: Eletroferograma da frao (A) utilizando borato/SDS. Modo

MEKC.............................72

Figura 22: Eletroferograma da frao (C) utilizando borato puro, modo CZE....................................73

Figura 23: Eletroferograma da frao (P) utilizando borato puro. Modo CZE...................................74

Figura 24: Eletroferograma da frao do extrato bruto eluda com ACN/H2O (3/7)

em um catucho de SPE com C18......................................................................................76

Figura 25: Mistura -naftol/nitrobenzeno analisada no tampo com SDS 50 mmol L-

......................78

Figura 26: Eletroferograma da mistura nitrobenzeno/-naftol utilizando

tampo misto SDS/Frao B...........................................................................................79

Figura 27: Linha de base do tampo misto SDS/frao B.................................................................80

Figura 28: Eletroferogramas do nitrobenzeno e da mistura nitrobenzeno/-naftol

obtidos utilizando tampo misto.......................................................................................82

Figura 29: Eletroferograma da mistura nitrobenzeno/-naftol utilizando tampo SDS

em soluo aquosa.............................................................................................................83

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS EE SSIIGGLLAASS

TTCCNNIICCAASS **

CE - Capillary Electrophoresis

CZE Capillary Zone Electrophoresis

MEKC/MECC Micellar Electrokinetic Chromatography/Micellar Electrokinetic Capillary

Chromatography

CEG Capillary Electrophoresis Gel

CIEF Capillary

CITP -

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

RP-HPLC Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography

IEC Ionic Exchange Chromatography

SEC Size Exclusion Chromatography

SPE Solid Phase Extraction

TLC Thin Layer Chromatography

MS Mass Spectrometry

LC/MS Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

ESI-MS/MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry Tandem

MALDI- Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

APCI - Atmospheric Pressure Chemical Ionization

FAB - Fast Atom Bombardment

NMR Nuclear Magnetic Ressonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Ressonance

13C- NMR Carbon Nuclear Magnetic Ressonance

2D- NMR - Two Dimensional Nuclear Magnetic Ressonance

SSUUBBSSTTNNCCIIAASS

ODS - Octadecilsilano

MeOH - Metanol

ACN - acetonitrila

SDS* Sodium Dodecyl Sulfate

OGSA oligoglicosdeos sesquiterpnicos alicclicos

OOUUTTRRAASS

Da Dalton

OHP* Outer Helmholtz Plane

EOF* Electroosmotic Flow

*Siglas mantidas em ingls

SSUUMMRRIIOO

LLIISSTTAA DDEE IILLUUSSTTRRAAEESS

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS EE SSIIGGLLAASS

RREESSUUMMOO

AABBSSTTRRAACCTT

11.. IINNTTRROODDUUOO........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................1122

11..11.. SSAAPPOONNIINNAASS EE QQUUMMIICCAA AANNAALLTTIICCAA........................................................................................................................................................................................1122

11..22.. EEXXTTRRAAOO,, IISSOOLLAAMMEENNTTOO EE PPUURRIIFFIICCAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS......................................................................................1144

11..22..11..TTCCNNIICCAASS CCRROOMMAATTOOGGRRFFIICCAASS DDEE SSEEPPAARRAAOO AAPPLLIICCAADDAASS

DDEETTEERRMMIINNAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS..............................................................................................................................................................1166

11..22..22..TTCCNNIICCAASS EELLEETTRROOFFOORRTTIICCAASS DDEE SSEEPPAARRAAOO AAPPLLIICCAADDAASS

DDEETTEERRMMIINNAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS..............................................................................................................................................................1177

11..22..33.. EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS CCOOMMOO TTCCNNIICCAA DDEE IIDDEENNTTIIFFIICCAAOO DDEE

SSAAPPOONNIINNAASS..........................................................................................................................................................................................................................................................1199

JJUUSSTTIIFFIICCAATTIIVVAA..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................2211

OOBBJJEETTIIVVOOSS............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................2233

22.. TTEEOORRIIAA DDAASS TTCCNNIICCAASS UUTTIILLIIZZAADDAASS......................................................................................................................................................................................................................2244

22..11.. EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR....................................................................................................................................................................................................................................2244

22..11..11.. EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR DDEE ZZOONNAA........................................................................................................................................................2244

22..11..22.. CCRROOMMAATTOOGGRRAAFFIIAA EELLEETTRROOCCIINNTTIICCAA MMIICCEELLAARR........................................................................................................3300

22..22 EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS..............................................................................................................................................................................................................3344

3 E.XPERIMENTAL.....................................................................................................................................................41

3.1 COLETA DOS FRUTOS............................................................................................................................41

33..22 OOBBTTEENNOO DDOOSS EEXXTTRRAATTOOSS..............................................................................................................................................................................................................................4411

3.3 FRACIONAMENTO EM COLUNA PREPARATIVA.....................................................................43

3.4 ANLISES DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS.........................................................................4455

33..55 AANNLLIISSEESS DDEE EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR......................................................................................................................................................................4466

33..66 PPRREEPPAARROO DDAASS SSOOLLUUEESS........................................................................................................................................................................................................................................4466

44.. DDIISSCCUUSSSSOO EE AAPPRREESSEENNTTAAOO DDOOSS RREESSUULLTTAADDOOSS..............................................................................................................................................................5500

44..11.. EEXXTTRRAAOO EE PPUURRIIFFIICCAAOO..........................................................................................................................................................................................................................5500

44..11..11 AANNLLIISSEESS DDAASS FFRRAAEESS PPOORR EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS..............................................5500

44..11..22.. EESSCCOOLLHHAA DDOO EEXXTTRRAATTOO AA SSEERR FFRRAACCIIOONNAADDOO..................................................................................................................5511

44..11..33.. FFRRAACCIIOONNAAMMEENNTTOO PPOORR CCRROOMMAATTOOGGRRAAFFIIAA DDEE EEXXCCLLUUSSOO PPOORR

TTAAMMAANNHHOO......................................................................................................................................................................................................................................................................5555

44..11..33..11.. FFRRAACCIIOONNAAMMEENNTTOO MMEEOOHH//HH22OO ((88::22)) ............................................................................................................................5577

44..11..33..22.. FFRRAACCIIOONNAAMMEENNTTOO MMEEOOHH//HH22OO ((11::11)) ......................................................62

44..11..44.. CCOONNCCLLUUSSEESS DDAA PPRRIIMMEEIIRRAA EETTAAPPAA..........................................................................................................................................................6666

44..22.. AANNLLIISSEESS EELLEETTRROOFFOORRTTIICCAASS..............................................................................................................................................................................................................6677

44..22..11.. AANNLLIISSEESS EELLEETTRROOFFOORRTTIICCAASS DDAASS FFRRAAEESS ............................................................................................................6688

44..22..22.. TTEESSTTEE DDAA FFRRAAOO BB CCOOMMOO AADDIITTIIVVOO PPAARRAA MMEEKKCC..............................................................................................7777

44..22..33.. CCOONNCCLLUUSSEESS DDAA SSEEGGUUNNDDAA EETTAAPPAA......................................................................................................................................................8844

44..33 PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS DDEE CCOONNTTIINNUUIIDDAADDEE DDOO TTRRAABBAALLHHOO........................................................................................................................8855

55.. RREEFFEERRNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRFFIICCAASS........................................................................................................................................................................................................................................8866

IInnttrroodduuoo

12

11.. IINNTTRROODDUUOO

11..11.. SSAAPPOONNIINNAASS EE QQUUMMIICCAA AANNAALLTTIICCAA

As saponinas pertencem a uma classe de compostos de natureza glicosdica que

ocorrem em plantas superiores e alguns organismos marinhos. A principal caracterstica

que classifica este grupo de substncias a presena de uma poro hidroflica (cadeia

de acar) e outra hidrofbica (aglicona) na sua estrutura qumica que por isso

considerada anfiflica. Assim, a principal propriedade qumica das saponinas a

capacidade de diminuir a tenso superficial de uma soluo aquosa, assemelhando-se a

um detergente. Estruturalmente so constitudas por uma aglicona com esqueleto de

triterpeno, esteride ou alcalide esteroidal, a qual est ligada uma ou duas cadeias de

acar que podem ser lineares ou ramificadas. Elas so classificadas dentro de dois

grupos de acordo com a estrutura da sua poro aglicona, tambm chamadas de

sapogenina: grupo triterpenide, no qual a aglicona usualmente um oleano, ursano ou

dammareno e o grupo esteride que inclui os esterides e os alcalides esteroidais. Os

acares podem ser ligados a aglicona em um ou dois stios de glicosilao (atravs de

uma ligao ter ou ster), originando as correspondentes saponinas monodesmosdicas

ou bidesmosdicas, respectivamente. (SIMES et. al., 1999)

Sapindus saponaria uma rvore da famlia sapindaceae encontrada nos

trpicos onde seus frutos so utilizados como sabo devido ao alto teor de saponinas.

Pode ser considerada como uma importante fonte para obteno destas substncias, j

que esta rvore se encontra em grande parte do pas e produz quantidade abundante de

frutos com alto teor de saponinas. A Figura 1 mostra a estrutura de uma saponina

IInnttrroodduuoo

13

isolada da planta Sapindus saponaria. As saponinas possuem atividades biolgicas

diversas como: ao moluscicida, atividade piscicida, e txica para vrios animais,

principalmente os de sangue frio, antiinflamatria, analgsica, expectorante,

antioxidante, espermicida, redutora de colesterol, antiviral, antibacteriana e antifngica.

Uma das teorias mais aceita para explicar a alta concentrao de saponinas em muitas

espcies de plantas de muitas famlias diferentes que estas funcionariam como

proteo ao ataque de patgenos, sejam estes fungos, bactrias ou vrus. (SPARG et. al.,

2004; MURGU, 2002; MAHATO et. al., 1988)

O

HO

OH

OH

O

OHO

OH

O

O

OH

CH3

CH3CH3

CH3

CH3 OH

CH3

H

O

HOH

H

O

O

H

O

O

Figura 1: Estrutura de uma saponina isolada dos frutos de Sapindus saponaria. (MURGU,

2002)

O principal interesse qumico analtico nas saponinas est relacionado com as

propriedades tensoativas destas. Quando substncias anfiflicas so solubilizadas em um

meio aquoso, por exemplo, a energia do sistema aumentada devido a pouca afinidade

de interao entre o meio polar e a poro apolar da molcula. Assim, a cada molcula

adicionada, ocorre um aumento na energia total do sistema de modo que, em uma dada

IInnttrroodduuoo

14

concentrao denominada concentrao crtica micelar, as pores apolares das espcies

presentes se organizam pela interao mtua e formam aglomerados moleculares

dinmicos denominados micelas. (WEINBERGER, 2000) A equao 1 mostra que, embora

a formao destes aglomerados seja desfavorvel entropicamente, a energia liberada no

processo grande o suficiente para que a energia livre seja negativa e a micelizao se

torne espontnea quando a concentrao de tensoativo atinge a concentrao crtica

micelar.

( )1STHG =

Em solues aquosas as micelas comportam-se como gotas de fase hidrofbica

presentes dentro de um meio hidroflico. Esta propriedade juntamente com a capacidade

que tm de interagir seletivamente com uma grande variedade de molculas possibilita o

uso destas em separaes analticas. Os sistemas nos quais as micelas movimentam-se

com velocidade global diferente do meio aquoso constituem meios de separao para

compostos com diferentes graus de hidrofobicidade. A fase hidrofbica micelar pode ser

considerada como uma pseudo-fase estacionria visto que ocorre uma defasagem

entre as velocidades das duas fases e, considerando que a micela mova-se numa

velocidade menor que o meio aquoso, ela ficar retardada com relao a este.

11..22.. EEXXTTRRAAOO,, IISSOOLLAAMMEENNTTOO EE PPUURRIIFFIICCAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS

Como explicado anteriormente, a estrutura qumica peculiar classifica estes

compostos. Pequenas modificaes na aglicona ou nas cadeias de acares, ou ainda, na

seqncia em que as unidades glicosdicas esto ligadas, geram uma nova substncia.

Assim, a diversidade destas em uma mesma espcie de planta muito grande, o que

IInnttrroodduuoo

15

resulta em extratos com misturas altamente complexas devido similaridade dos seus

componentes. Aliado a isto as saponinas so muito polares e possuem alta massa

molecular o que aumenta a dificuldade de isolamento e purificao.

O procedimento de extrao deve ser o mais brando possvel, pois algumas

saponinas podem sofrer algumas transformaes durante o processo, tais como:

hidrlise enzimtica durante a extrao aquosa; esterificao de saponinas cidas com o

tratamento com lcool; hidrlise de grupos steres lbeis; transacilao. Os

procedimentos para a obteno do extrato bruto em geral utilizam metanol, etanol, gua

ou solues hidrometanlicas como solventes extratores, no entanto, as extraes mais

eficientes so realizadas com metanol e solues hidro-metanlicas. (HOSTETTMANN,

1995a)

As primeiras tentativas de determinao de saponinas em plantas estavam

baseadas em mtodos gravimtricos ou em mtodos que levavam em conta algumas das

caractersticas qumicas e biolgicas destas. Atualmente diversos mtodos so

empregados para a determinao qualitativa e quantitativa de saponinas. Estes vo

desde os cromatogrficos (LIU et. al., 2005; KIM E PARK, 2001) e eletroforticos (EMARA et.

al., 2001) para a separao at os espectromtricos (WANG et. al., 2005; LI et. al., 2004; WANG

et. al., 1999) e espectroscpicos (KRIEF et. al., 2005; ELIAS et. al., 2004) para a deteco e a

elucidao estrutural. Entre os mtodos cromatogrficos destacam-se a cromatografia

lquida de alta eficincia (HPLC), cromatografia por excluso de tamanho (SEC) e

cromatografia de troca inica (IEC). Alguns relatos mostram as vantagens do uso de

sistemas de separao on-line, como cromatografia lquida acoplada a espectrometria de

massas (LC/MS) e a extrao em fase slida acoplada a ressonncia nuclear magntica

(SPE/NMR), no isolamento, separao e deteco de saponinas em extratos brutos de

ervas utilizadas em medicina popular. (NYBERG et. al., 2003; LIU et. al., 2002)

IInnttrroodduuoo

16

11..22..11.. TTCCNNIICCAASS CCRROOMMAATTOOGGRRFFIICCAASS DDEE SSEEPPAARRAAOO AAPPLLIICCAADDAASS

DDEETTEERRMMIINNAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS

A cromatografia gasosa uma tcnica eficiente de separao, porm est

limitada pela estrutura e as propriedades fsicas dos analitos de interesse. Os compostos

que podem ser analisados por esta so, em geral, molculas de baixa massa molecular e

com pontos de ebulio baixos. As saponinas so polares e possuem alta massa

molecular, por isso a cromatografia gasosa no uma tcnica corriqueiramente utilizada

para anlise destes compostos. A cromatografia lquida de alta eficincia geralmente

indicada quando compostos no so adequados para anlise por cromatografia gasosa.

A dificuldade da determinao de saponinas em HPLC utilizando um detector

de ultravioleta a ausncia de grupos cromforos capazes de resultar em absoro

adequada na estrutura da grande maioria das saponinas. Em baixos comprimentos de

onda (200-210 nm) uma sensibilidade satisfatria para a deteco alcanada. No

entanto, esta limitao impe restries na escolha do solvente e dos gradientes que

podem ser utilizados. Os solventes que absorvem menos nesta regio do ultravioleta so

respectivamente: a gua, a acetonitrila e o metanol. Este ltimo por absorver na faixa

utilizada usado com menos freqncia enquanto que gradientes de acetonitrila-gua

mostram melhores resultados e por isso so mais utilizados. O uso do gradiente, no

entanto, exclui a deteco por ndice de refrao e por isso este tipo de deteco

raramente utilizado. Os trabalhos mais recentes utilizam a deteco por espectrometria

de massas. Este detector alm de ser muito sensvel, fornece a massa molecular dos

compostos eludos e permite experimentos de fragmentao controlada do analito o que

possibilita a obteno de detalhes estruturais destes. Posteriormente a anlise de

saponinas por espectrometria de massas ser detalhada.

IInnttrroodduuoo

17

11..22..22.. TTCCNNIICCAASS EELLEETTRROOFFOORRTTIICCAASS DDEE SSEEPPAARRAAOO AAPPLLIICCAADDAASS

SSEEPPAARRAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS

A eletroforese capilar uma tcnica com caractersticas bastante interessantes

principalmente quando a natureza da mistura a ser separada complexa, como o caso

de misturas oriundas de produtos naturais. Esta fornece alta eficincia, tempo de anlise

reduzido, baixo custo, simplicidade de operao e, ainda, a coluna de separao

preenchida unicamente com o tampo de corrida. Isto evita a impregnao de impurezas

que possam prejudicar a separao e a prpria vida til da coluna, como acontece nas

colunas cromatogrficas empacotadas. Uma limitao surge quando o sistema de

deteco ultravioleta utilizado, pois o caminho ptico o dimetro do capilar quando

a deteco on column. Algumas maneiras de contornar essa limitao so: a utilizao

de capilares com caminho ptico estendido que tm o seu dimetro ampliado na janela

de deteco; o uso de clulas de deteco em Z; desenvolver o mtodo de anlise

usando deteco indireta, quando o composto no absorve, e dependendo do caso, a

derivatizao do analito. Outros detectores muito sensveis, tais como o de fluorescncia

induzida por laser e os eletroqumicos, tambm podem ser utilizados, embora sejam

seletivos apenas para compostos fluorescentes e eletroquimicamente ativos,

respectivamente. O acoplamento on line da eletroforese capilar com a espectrometria de

massas tem contornado o problema da deteco, visto que este tipo de detector tem

baixos limites de deteco, permite a determinao da massa molecular do analito

separado e, com o uso da espectrometria tandem, possibilita o detalhamento estrutural

dos analitos alvos. A eletroforese capilar no permite a separao e escala preparativa,

porm tem se destacado na separao e quantificao de uma grande variedade de

produtos naturais, incluindo as saponinas. (SHEU e CHEN, 1995; EMARA et al. 2001)

IInnttrroodduuoo

18

A CZE separa analitos carregados, assim, necessrio induzir uma carga nas

saponinas a serem separadas. Isto pode ser feito pela complexao do nion borato com

os carboidratos da molcula. Dessa forma as saponinas so analisadas como nions e

um fluxo eletrosmtico alto conveniente para uma reduo no tempo de anlise. Este

mtodo foi utilizado com sucesso para separar 3 saikosaponinas (a, c, d) presentes em

ervas medicinais popularmente consumidas na China. Alm do uso de borato, a mono-

3-fenicarbamoil--ciclodextrina foi utilizada como agente de separao. A concentrao

de ciclodextrina, bem como o pH e a concentrao de borato foram avaliados com o

objetivo de chegar a uma boa condio de separao, que se deu em pH 10, 8 mM de

mono-3- fenicarbamoil --ciclodextrina e 40 mM de borato. Utilizando um capilar de

50 m de dimetro interno (D.I.), o meio tamponante mencionado acima, obtiveram uma

boa resoluo na anlise destas saponinas em extratos etanlico, mostrando que: o

mtodo proposto pode ser aplicado para uma determinao rpida destas saponinas e

que a CE uma tcnica capaz de fornecer bons resultados para a separao de misturas

complexas, como no caso apresentado. (LIN et al., 2005)

Para a determinao de saikosaponinas em Bupleuri Radix, MEKC foi o modo

de eletroforese escolhido, pois fornece separaes altamente eficientes para compostos

neutros e hidrofbicos. Neste estudo as cinco saponinas majoritria foram analisadas

utilizando colato de sdio, SDS e ciclodextrinas como aditivos. Porm, devido a

complexidade das amostras, BRIJ 35 foi adicionado ao tampo de corrida. Apesar disto,

os resultados obtidos demonstraram que o mtodo proposto pode ser usado para a

determinao de saponinas. (HSIEH e HUANG, 1997)

A eletroforese capilar com deteco ultravioleta, apesar de fornecer bons

resultados em termos de separao, est limitada a anlise de substncias previamente

IInnttrroodduuoo

19

identificadas e com a estrutura molecular conhecida. A aplicao da eletroforese capilar

acoplada a espectrometria de massas, constituiria uma ferramenta ideal para este tipo de

trabalho, porm este trs algumas limitaes na composio do tampo de corrida.

Existem trabalhos tentando contornar essas limitaes, que atingem principalmente a

MEKC. (LEE e YANG, 1997)

11..22..33.. EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS CCOOMMOO TTCCNNIICCAA DDEE

IIDDEENNTTIIFFIICCAAOO DDEE SSAAPPOONNIINNAASS

A identificao completa de uma saponina inclui: a determinao da estrutura

da aglicona; a composio e a seqncia dos componentes monosacardeos na poro

carboidrato; como as unidades de monossacardeos esto ligadas umas nas outras; a

configurao anomrica de cada unidade de monossacardeo glicosidicamente ligado; a

localizao da poro carboidrato na aglicona. Devido a esta complexidade, a

identificao de saponinas uma tarefa bastante rdua e pouco provvel que possa ser

realizada apenas utilizando a espectrometria de massas. As tcnicas que consolidam e

complementam os dados obtidos por espectrometria de massas so as relacionadas

ressonncia nuclear magntica, 1H-NMR, 13C- NMR, 2D- NMR, espectroscopia de

correlao e tcnicas relacionadas.

A identificao de molculas grandes um processo bastante trabalhoso,

principalmente quando estas no esto puras o suficiente ou no apresentam massa

necessria para anlises de NMR. A espectrometria de massas uma tcnica que pode

dar uma importante contribuio nesses casos, pois muito sensvel, possui alta

resoluo e permite que as molculas sejam analisadas sem que ocorra degradao. A

ligao ter entre o grupo hidroxil hemiacetal dos acares e a poro triterpenide

IInnttrroodduuoo

20

chamada ligao glicosdica enquanto que as ligaes ter entre as unidades de

monossacardeos so denominadas interglicosdicas. So justamente estas ligaes que

sero os pontos de fragmentao nas saponinas e atravs de experimentos MS/MS, que

possibilitam uma fragmentao controlada, a poro sapogenina (aglicona) separada

dos acares e estes, por sua vez, separados em suas unidades bsicas.

A espectrometria de massas tandem deu uma grande contribuio para facilitar

este tipo de anlise, pois antes eram realizadas reaes para quebrar a molcula em

partes menores. As reaes mais comumente utilizadas eram: a hidrlise cida, hidrlise

bsica, hidrotermlise, hidrlise enzimtica e hidrlise microbiolgica. Alm dos passos

serem demorados, existia a possibilidade de formao de artefatos dificultando a anlise

dos resultados.

A espectrometria de massas uma tcnica muito importante na anlise de

carboidratos porque fornece resultados precisos, alta sensibilidade e boa versatilidade

analtica. Os modos de ionizao mais utilizados atualmente para a ionizao de

oligosacardeos so a ionizao por electrospray (ESI) e a ionizao/dessoro auxiliada

por laser (MALDI), mas os modos de ionizao qumica presso atmosfrica (APCI) e

bombardeamento por tomos rpidos (FAB), entre outros, j foram relatados. (ZAIA,

2004; MURGU, 2002; HOSTETTMANN, 1995c).

A volatilizao destas substncias dificultada por causa da grande polaridade

e da massa molecular elevada. Assim, a escolha do procedimento de ionizao crucial

para obter-se bons resultados. O modo ESI aparece na literatura atual (LIU et. al., 2005; LIU

et. al., 2002; CHAI et. al., 2001) com elevada freqncia sendo o mtodo de escolha para a

ionizao de saponinas, ainda que alguns trabalhos relatem o sucesso do uso do nanoESI

(KARAS et al., 2000). A ionizao utilizando MALDI mais usual para a anlise de

oligossacardeos neutros e com maiores massas moleculares visto que a eficincia da

IInnttrroodduuoo

21

ionizao observada constante com o aumento da massa molecular o que no ocorre

para ESI (HARVEY et. al., 1993). As saponinas de Sapindus saponaria j foram

previamente estudadas e parcialmente caracterizadas (MURGU, 2002), assim, a faixa de

massa molecular observada das saponinas isoladas est entre 700 1000 Da. Neste caso

a ionizao por ESI mais conveniente, principalmente porque fornece um espectro

mais limpo em regies de baixas massas moleculares. Essa vantagem muito relevante,

pois experimentos de fragmentao so necessrios para a obteno de detalhes

estruturais de determinadas saponinas. Alm disso, algumas destas possuem grupos

cidos na aglicona o que possibilita aprimorar algumas condies experimentais para

melhorar a eficincia de ionizao e assim obter um sinal espectral de melhor qualidade.

JJUUSSTTIIFFIICCAATTIIVVAA

Alguns estudos investigando a utilizao das saponinas em MEKC foram

relatados. Em um deles, a digitonina, uma saponina oriunda da Digitalis purpurea que

pode ser obtida comercialmente (PUBCHEM, 2005), foi usada para separar derivados de

aminocidos feniltiohidantonados. Por ser no-inica, foi combinada com SDS para

formar micelas mistas carregadas negativamente. Nas condies de separao, o tempo

necessrio para a resoluo foi muito longo o que no desejvel pois utilizando

mtodos cromatogrficos essa separao facilmente alcanada com menores tempo e

dificuldade. (OTSUKA e TERABE, 1990) O cido glicirzico e a -escina tambm foram

utilizados para separao enantiomrica de derivados aminocidos dansilados. As

micelas compostas por cido glicirzico, octil--D-glucosdeo e SDS realizaram a

separao enatiomrica de alguns aminocidos, porm o tempo necessrio para a

IInnttrroodduuoo

22

obteno de uma resoluo satisfatria foi grande. Micelas compostas de -escina e SDS

separaram alguns derivados de DL-aminocidos feniltiohidantoinados, sob condies

cidas, em tempos menores quando comparados com os obtidos com o cido glicirzico,

porm estes ainda no podem ser considerados curtos. Verificaram, tambm, que

condies cidas eram mais favorveis separao enquanto que condies neutras no

produziram boas separaes. (ISHIHAMA e TERABE, 1993) Essa informao foi a base

para a formulao da proposta do estudo das saponinas de Sapindus saponaria como

meio de separao em MEKC.

importante salientar que o objetivo do trabalho no requer uma focalizao

intensiva no processo de isolamento, purificao e identificao destas substncias,

visto que os extratos obtidos so de grande complexidade, pois alm de serem

compostos por diversas saponinas, contm oligoglicosdeos sesquiterpnicos alicclicos.

Estes so estruturalmente compostos por uma cadeia sesquiterpenide alicclica em

cujas extremidades esto ligadas cadeias de acares. Embora sejam mais polares que as

saponinas contribuem para aumentar a complexidade dos extratos, principalmente

quando o interesse se volta para as saponinas mais polares que esto presentes no

extrato aquoso e hidrometanlico.

Neste trabalho tcnicas cromatogrficas (HPLC, SEC, SPE) e eletroforticas (CZE

e MEKC) foram empregadas, assim como a espectrometria de massas com modo de

ionizao electrospray (ESI-MS), para a separao do extrato bruto e a anlise da

composio das fraes obtidas.

OObbjjeettiivvooss

23

OOBBJJEETTIIVVOOSS

O objetivo inicial do trabalho era isolar uma determinada saponina dos frutos da

S. saponaria, medir a concentrao crtica micelar e utiliz-la como fase micelar em

MEKC, induzindo uma carga negativa na molcula pela complexao com borato para que

a micela fosse aninica. Porm, como o processo de isolamento dessa saponina revelou-se

bastante complexo, o foco do trabalho desviou-se para o estudo da obteno e

caracterizao das fraes enriquecidas em saponinas e outros glicosdeos presentes nos

frutos de S. Saponaria utilizando mtodos cromatogrficos e eletroforticos de anlise.

A partir da obteno das fraes enriquecidas, os objetivos buscados foram:

verificar o comportamento das fraes enriquecidas obtidas em sephadex e das

fraes eludas em SPE frente s anlises de CZE e MEKC.

verificar o comportamento do uso das fraes como aditivo em tampo utilizando

SDS em separao de compostos simples.

TTeeoorriiaa ddaass ttccnniiccaass uuttiilliizzaaddaass

24

22.. TTEEOORRIIAA DDAASS TTCCNNIICCAASS UUTTIILLIIZZAADDAASS

22..11.. EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR

Eletroforese capilar o nome genrico dado a um conjunto de tcnicas que

utilizam o fenmeno da migrao de partculas carregadas sob a ao de um campo eltrico

elevado em um capilar de slica fundida. O objetivo promover a separao de misturas de

compostos que podem ser inicos, ionizveis ou neutros, dependendo do modo de

eletroforese utilizado. Os modos de operao mais comuns so cinco: eletroforese capilar

de zona (CZE), cromatografia eletrocintica micelar (MEKC), eletroforese capilar em gel

(CEG), focalizao isoeltrica (CIEF) e isotacoforese (CITP).

22..11..11.. EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR DDEE ZZOONNAA

A eletroforese capilar de zona o modo mais utilizado devido a sua versatilidade

e simplicidade de operao. A Figura 2 ilustra a esquematizao de um sistema utilizado

em eletroforese capilar.

Figura 2: Ilustrao de um sistema utilizado em eletroforese capilar.


25

Quando uma amostra contendo espcies carregadas introduzida no capilar o qual

est sob a ao de um dado campo eltrico E, a velocidade de migrao v das espcies,

atravs do capilar, depender da mobilidade destas segundo a equao (2):

( )2Ev =

A mobilidade , por sua vez, proporcional razo entre as foras eltrica e

friccional como mostra a equao (3):

( )( ) ( )3F

E

FFriccionalFora

FEltricaFora

A fora eltrica FE dada pela equao (4) enquanto que a fora friccional FF

dada pela equao (5):

( )6qEFE =

( )56 vrFF =

Onde q a carga do on, a viscosidade da soluo, r o raio do on solvatado

e v a velocidade do on. Durante a eletroforese o estado estacionrio alcanado quando

o balano entre estas foras estabelecido, ou seja, quando FE FF = (6). Substituindo a

equao (4) e (5) na (6) obtemos a equao (7), que mostra como a mobilidade

eletrofortica e das espcies depende da razo rq destas j que 6 constante para

uma dada anlise.

( )76 r

qe

=

Porm, o movimento de migrao das espcies atravs do capilar no est sujeito

apenas ao movimento eletrofortico destas, mas tambm influenciado por um fluxo de

soluo que se dirige para o ctodo denominado fluxo eletroosmtico (EOF). A origem


26

deste est relacionada formao da dupla camada eltrica na interface entre a parede do

capilar e o meio tamponante. A superfcie interna do capilar de slica fundida apresenta

grupos Si-OH, cidos, que so ionizados gradualmente em pH acima de 3. Esta ionizao

deixa a superfcie interna do capilar carregada negativamente que atrai os ctions do

tampo para manter a eletroneutralidade do sistema. Quando a diferena de potencial

estabelecida nas extremidades do capilar a camada de ctions que est fixa parede

movimenta-se ordenadamente em direo ao ctodo e arrasta consigo a soluo.

Quando a superfcie eletricamente carregada (parede interna do capilar)

colocada em contato a soluo (meio tamponante) ocorre uma perturbao eletrosttica na

soluo nas imediaes muito prximas superfcie do capilar. O sistema reage contra essa

perturbao e, na tentativa de minimiz-la e retornar ao equilbrio eletrosttico, ocorre a

formao da dupla camada eltrica. Esta composta por trs regies distintas: a camada

adsorvida (que fixa superfcie), a camada compacta e a camada difusa. O plano externo

de Helmholtz (OHP), que definido como o plano que passa pelo centro de massa das

espcies diretamente adsorvidas na superfcie, limita a camada adsorvida. A variao de

potencial eltrico nesta camada linear enquanto nas camadas compacta e difusa

exponecial. A Figura 3 mostra a representao grfica da variao de potencial eltrico

entre a superfcie do capilar e o interior da soluo tamponante.


27

Figura 3: Variao do potencial eltrico com a distncia da parede do capilar. (HAMANN et. al., 1998)

Onde o comprimento da camada compacta, =1/ o valor onde a camada

difusa comea, OHP o potencial no OHP, H a diferena de potencial no OHP, cap o

pontencial na parede do capilar, a diferena de potencial total e dif= o potencial

zeta. A diferena de potencial eltrico estabelecido entre o OHP e o interior da soluo

denominado potencial zeta . Outra definio bastante usual que o potencial o

potencial eltrico no plano de cisalhamento, ou seja, o plano que separa a camada fixa

(adsorvida) da camada mvel (compacta).

A velocidade total de cada espcie no capilar depender do balano entre os

movimentos de migrao eletrofortica e de eletroosmose. Assim, durante a eletroforese as

espcies catinicas migraro com a maior velocidade, seguidas pelas espcies neutras e,

por fim, as aninicas. A ilustrao da Figura 4 esquematiza o movimento de migrao

dentro do capilar.


28

+-/+-

+ -n

odo

C

todo

Detector

vep = velocidade eletroforticaveo = velocidade eletroosmticaveff = velocidade efetiva

vepveo

veff

vepveoveff

vepveo

veff++-/+-/+--

+ -n

odo

C

todo

Detector

vep = velocidade eletroforticaveo = velocidade eletroosmticaveff = velocidade efetiva

vepveo

veff

vepveoveff

vepveo

veff

Figura 4: Esquema que mostra o comportamento das espcies no capilar durante a eletroforese.

A otimizao da separao realizada pela alterao dos parmetros que

influenciam nas velocidades eletrofortica e eletrosmtica de modo a maximizar as

diferenas na velocidade efetiva dos analitos que compem a mistura. Os fatores que

afetam a velocidade das espcies no capilar so inerentes aos componentes do sistema, que

so: a instrumentao, o tampo e o on (a espcie) a ser analisado. A Figura 5 mostra a

relao entre os parmetros experimentais que modificam a velocidade dos ons em

soluo. Como vemos, o controle do potencial zeta da parede do capilar e dos ons

imprescindvel para uma separao seletiva e reprodutvel.

on

Tampo

Instrumentao

Parededo Capilar

Comprimento do Capilar

Voltagem V

SolvataoAdsoro

pKa

Massa MolecularEstrutura

Campo EltricoE = V/L

pH

Geometria

CargaEfetiva

Fora InicaViscosidade Permissividade

Ev eoeoparede

eoparede =

=

4

vtot = vep + veo

Ev epepon

epon ==

6

on

Tampo

Instrumentao

Parededo Capilar

Comprimento do Capilar

Voltagem V

SolvataoAdsoro

pKa

Massa MolecularEstrutura

Campo EltricoE = V/L

pH

Geometria

CargaEfetiva

Fora InicaViscosidade Permissividade

Ev eoeoparede

eoparede =

=

4

vtot = vep + veo

Ev epepon

epon ==

6

Figura 5: Esquema que resume a relao entre os parmetros que influenciam as separaes em eletroforese capilar. (VINDEVOGEL E SANDRA, 1992)


29

Parmetros importantes como: tempo de migrao, eficincia, seletividade e

resoluo podem ser otimizadas para se obter o sucesso da separao. As equaes que

regem estas variveis so expressas a seguir:

( ) ( )8VlL

tEOFep

m += ,

Onde: mt o tempo mdio de migrao, l o comprimento efetivo do capilar (da

injeo deteco), ep a mobilidade eletrofortica, EOF a mobilidade do fluxo

eletrosmtico e V a diferena de potencial aplicada.

( ) ( )92D

VN EOFep

+=

Onde: N o nmero de pratos tericos e D o coeficiente de difuso do soluto.

( )102

1 b=

Onde: a seletividade, 1 e 2 , respectivamente, as mobilidades dos analitos 1

e 2 e b uma constante.

( ) )11(177,0 DEL

Reofep

ep

+=

Onde: R a resoluo e ep a mobilidade mdia dos analitos 1 e 2.


30

22..11..22.. CCRROOMMAATTOOGGRRAAFFIIAA EELLEETTRROOCCIINNTTIICCAA MMIICCEELLAARR

A cromatografia eletrocintica micelar foi introduzida no incio da dcada de 80

(TERABE et al., 1984) e consiste de um modo de operao de eletroforese capilar que permite a

separao eletrocintica de substncias neutras e carregadas simultanemente.

Um agente tensoativo (que pode ser aninico, catinico, neutro ou zwiterinico),

geralmente dodecil sulfato de sdio (SDS), aninico, utilizado para originar micelas

carregadas em soluo. Um capilar de slica fundida preenchido com a soluo micelar

tamponada e uma diferena de potencial aplicada nas suas extremidades. Geralmente, o

tensoativo no inico pode ser utilizado juntamente com um tensoativo inico a fim de

otimizar a seletividade da separao. A Figura 6 esquematiza a situao acima descrita.

Figura 6: Ilustrao esquemtica que mostra o comportamento de uma soluo de SDS, tamponada, dentro do capilar utilizado em eletroforese. (VINDEVOGEL e SANDRA, 1992)


31

Definindo: EOF a mobilidade do fluxo eletrosmtico; ep,MC a mobilidade

eletrofortica da micela; MCeff a mobilidade efetiva da micela; t0 o tempo necessrio

para que um soluto, que no tenha nenhuma interao com a micela, percorra o capilar da

entrada ao detector, St o tempo de migrao dos analitos; mict o tempo necessrio para

que uma substncia, que interaja somente com o interior da micela, percorra o capilar. O

tempo decorrido entre t0 e tmic denominado janela de migrao. Quanto maior este

intervalo, maior a capacidade de pico, ou seja, um nmero maior de compostos podero ser

separados com resoluo 1, em uma mesma anlise.

As micelas carregadas negativamente tm uma mobilidade eletrofortica no

sentido do nodo enquanto que o sentido do fluxo eletroosmtico para o ctodo. Supondo

que a magnitude do fluxo eletrosmtico seja maior que a magnitude da mobilidade

eletrofortica da micela, estas sero arrastadas para o ctodo, com uma mobilidade

resultante menor que a do fluxo eletrosmtico. Teremos duas fases movimentando-se com

velocidades diferentes, a fase aquosa mais rpida e a fase micelar mais lenta. O princpio

de separao baseia-se na partio diferencida dos analitos com o interior das micelas e o

meio aquoso. Quanto mais hidrofbico maior a afinidade com o ncleo micelar, mais

tempo o analito permanece interagindo com a micela e, portanto, mais lentamente ele se

movimenta em relao ao analito que permanece na soluo. Devido ao fato da micela

movimentar-se na soluo ela considerada uma pseudo-fase estacionria, esta

considerao tem implicaes diretas na deduo das equaes que regem o processo de

separao.

Esta tcnica pode ser definida como um tcnica hbrida onde a instrumentao

utilizada de eletroforese enquanto que o princpio de separao cromatogrfico. Assim,

as equaes que regem o processo de separao derivam da cromatografia com a


32

considerao adicional do tempo de migrao do marcador da micela. O fator de reteno

definido na equao (12)

( )12aq

mc

n

n=

Onde micn e aqn so o nmero de mol do analito na micela e na fase aquosa,

respectivamente. O valor do em termos do tempo de migrao das espcies pode ser

obtido pela equao (13):

( )1310

0

=

mic

S

S

t

tt

tt

Onde St , mict e 0t so, respectivamente, os tempos de migrao do analito, do

marcador da micela e do marcador do fluxo eletroosmtico. A diferena entre a equao

(13) e a usada em cromatografia restringe-se ao tempo de migrao da micela que limita a

janela de migrao em MEKC.

A equao da resoluo em MEKC dada pela equao (14):

( )141

1

1

1

41

0

0

2

22/1

+

+

=

kt

tt

t

k

kNR

mic

mics

Onde N o nmero de pratos, a seletividade, o fator de reteno, 0t e

mict so, respectivamente, os tempos de migrao do marcador de fluxo eletroosmtico e

do marcador da micela.

A equao (14) semelhante a utilizada em cromatografia exceto pelo ltimo

termo do lado direito. Este vem da migrao da micela dentro do capilar, ou seja, a


33

migrao da micela causa uma reduo no comprimento do capilar. Se a migrao da

micela completamente suprimida com mict tendendo ao infinito, a equao iguala-se a da

cromatografia convencional.

A maneira mais fcil para se otimizar a sepao aumentar a seletividade. Em

RP-HPLC, a seletividade da separao alterada pela variao da composio da fase

mvel enquanto que a fase estacionria quase sempre utilizada C18. J em MEKC, a

pseudo-fase estacionria so as micelas e vrios tensoativos podem ser utilizados para

form-las, mundando a seletividade da separao. O uso micelas mistas, ou seja,

combinaes de tensoativos inicos e no inicos ou inicos e zwitterinicos uma outra

forma de alterar a seletividade das separaes.

O valor timo de para maximizar a resoluo obtido pela equao (15):

( )150t

tmicot

=

Para ajustar o em MEKC necessrio variar a concentrao do tensoativo pois o

linearmente proporcional concentrao de tensoativo como mostra a equao (16):

( ) ( )16cmcCKV

VK ten

aq

mic =

Onde K o coeficiente de distribuio do analito entre a micela e a fase aquosa,

micV e aqV so, respectivamente, os volumes da fase micelar e da fase aquosa, o

volume especfico parcial da micela e tenC a concentrao do tensoativo.

Os analitos extremamente hidrofbicos com altos valores de ainda so um

grande desafio para MEKC pois so muito difceis de separar. A adio de solventes

orgnicos no tampo de corrida reduz significativamente o e proporciona uma melhor

resoluo para a separao destes analitos. No entanto, os solventes orgnicos aumentam a


34

viscosidade do tampo de corrida tornando o tempo de migrao maior. Adicionalmente, o

solvente orgnico pode destruir a estrutura micelar e/ou diminuir a janela de migrao, por

que ocasiona a reduo da mobilidade eletrofortica da micela.

Assim como em CZE, MEKC possui limitaes de sensibilidade quando a

deteco espectrofotomtrica utilizada. Os mtodos de pr-concentrao de amostra on-

line so uma escolha bastante interessante para aumentar a sensibilidade. Estes se baseiam

na injeo de uma zona de amostra maior do que o normal e atravs da focalizao dentro

do capilar esta zona contrada aumentando a concentrao do analito. Tanto a injeo

hidrodinmica quanto a eletrocintica podem ser utilizadas. As duas tcnicas mais

utilizadas para a concentrao de analitos neutros so: eletric field-enhanced sample

stacking e sweeping.

22..22 EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS

A espectrometria de massas uma tcnica analtica instrumental utilizada para a

anlise, em fase gasosa, de tomos ou molculas de uma amostra que so ionizados e

separados de acordo com a razo massa/carga quando submetidos a condies especficas

de um campo eltrico e/ou magntico. Esta tcnica possibilita: a determinao da massa

molecular; a caracterizao estrutural; o estudo da reatividade em fase gasosa; a anlise

qualitativa e quantitativa dos componentes de uma mistura. (LABORATRIO, 2005) A idia

da tcnica determinar a estrutura de uma molcula desconhecida a partir do

conhecimento dos fragmentos que esta produz em determinadas condies. A molcula

inteira pode ter infinitas combinaes de tomos e grupos funcionais orgnicos arranjados

de infinitas maneiras. Assim, dificilmente conseguiremos propor uma estrutura por causa


35

do grande nmero de possibilidades. No entanto, conhecendo as propriedades das ligaes

entre os diferentes tomos e em diferentes combinaes podemos ter uma noo de como

as ligaes sero quebradas e/ou como sero formadas. Assim, conhecendo o padro de

fragmentao de certas classes de compostos podemos fazer com que a molcula inteira

seja fragmentada, os fragmentos identificados e a partir destes, como em um quebra-

cabea, propor uma estrutura qumica que dependendo da sua complexidade pode exigir ou

no outras anlises para a sua confirmao. A ionizao por eltrons permite essa

fragmentao que executada pela incidncia de um feixe de eltrons de alta energia nas

molculas em condies de presso baixa. Porm, este modo de ionizao to drstico a

ponto de estraalhar todas as molculas e fazer com que a informao importante da massa

molecular do composto seja perdida. Para contornar este problema um mtodo de

ionizao mais brando foi implementado. A ionizao qumica, como foi chamado, produz

a ionizao branda das espcies a serem analisadas pelo mecanismo de

protonao/desprotonao permitido que a informao da massa molecular seja preservada.

A necessidade de se obter, simultaneamente, a informao da massa molecular e o

detalhamento estrutural foi o impulso necessrio para o desenvolvimento da espectrometria

de massas tandem que permite a ionizao branda e, com um arranjo de analisadores de

massa intermediados por uma cmara de coliso, a fragmentao controlada dos compostos

a serem analisados. Apesar de todas essas melhorias a espectrometria de massas era restrita

a gases, substncias volteis e termicamente estveis porque a ionizao destas era

conduzida sob condies de baixa presso. Isto porque para que as leis fsicas que regem o

equacionamento da trajetria dos ons quando estes passam pelo analisador de massas so

deduzidas considerando o sistema evacuado e porque se existissem molculas gasosas

quaisquer no sistema os ons a serem analisados poderiam colidir com estas, o que poderia


36

resultar em novas fragmentaes, rearranjos e perdas quaisquer. Estes tipos de eventos

contribuiriam para aumentar a complexidade dos espectros obtidos dificultando, assim, a

sua interpretao. A dificuldade existente era compatibilizar o sistema de alto vcuo do

analisador de massas com maiores presses na fonte de ionizao para que molculas mais

pesadas e menos volteis pudessem ser analisadas. O desenvolvimento das tcnicas de

ionizao a presso atmosfrica foi o grande avano que contornou esse problema e

permitiu o acoplamento com HPLC e, com isso, o aumento do nmero de compostos

analisveis por espectrometira de massas. As pesquisas objetivando melhorar as fontes de

ionizao continuam avanando e aumentando a gama de compostos analisveis por

espectrometria de massas. A Figura 7 esquematiza um espectrmetro de massas com triplo

quadrupolo especificando as funes de cada parte do equipamento.

Figura 7: Esquema das partes de um espectrmetro de massas com triplo quadrupolo, utilizado para experimentos de espectrometria de massa tandem (ANALYTICAL CHEMISTRY, 1984)

A tabela 1 mostra os modos de operao que podem ser executados neste

equipamento. Vemos a variedade de experimentos que podem ser realizados para se obter

informaes estruturais de substncias com estrutura desconhecida.


37

Tabela 1: Modos de operao que podem ser executados no equipamento acima mencionado.(ANALYTICAL CHEMISTRY, 1984)

Modo de operao Quad Q1 Quad Q2 Quad Q3 Resultado

MS

Separao por massa

Todas as massas passam

(sem gs de coliso)


Espectro de massas normal.

Filhos

Massa especfica

fixada


(Com gs de coliso)

Separao por massa

Espectro de todo ons filhos do on pai selecionado.

Pais

Separao por massa


(Com gs de coliso)

Massa especfica

fixada

Espectro dos ons pais cujo fragmento da origem a um

on filho especfico.

Perda de

massa neutra

Separao por massa


(Com gs de coliso)

Separao por massa

As diferenas de massa entre duas varreduras

fornece perdas de massas neutras especficas.

Monitoramen

to de ons selecionados

Massa especfica

fixada


(Com gs de coliso)

Massa especfica

fixada

Monitoramento de uma ou mais reaes.

A Tcnica de Ionizao Utilizada

Existem vrias tcnicas de ionizao que podem ser utilizadas em espectrometria

de massas. Dentre estas podemos citar, as principais: a ionizao por impacto eletrnico, a

ionizao qumica, o bombardeamento com tomos rpidos (FAB), a ionizao qumica

presso atmosfrica (APCI), a ionizao por electrospray e a ionizao/desoro auxiliada

por laser (MALDI). A escolha da tcnica depende de uma srie de fatores, mas

principalmente das caractersticas fsico-qumicas do analito a ser ionizado pois

dependendo do modo escolhido a eficincia da ionizao aumentada, produzindo sinais

espectrais melhores. O modo de ionizao utilizado neste trabalho foi a ionizao por

electrospray, que ser mais bem detalhada.

A ionizao por electrospray um modo de promover a transferncia de ons em

soluo para a fase gasosa presso atmosfrica. A energia necessria para levar um on


38

do estado solvatado para o estado gasoso muito alta, maior que a energia necessria para

romper uma ligao entre dois carbonos. Se essa energia fosse fornecida ao sistema, de

uma vez s, mesmo que por um curto tempo, poderia causar a fragmentao nao controlada

das espcies. Com o electrospray a dessolvatao conseguida gradualmente por energia

tmica em temperaturas relativamente baixas, o que impede a fragmentao das espcies.

Por esta caracterstica essa tcnica tida como uma das mais suaves e a que possibilita um

melhor controle na fragmentao.

Existem trs etapas majoritrias na passagem de ons em soluo para ons em

fase gasosa por electrospray, so elas: (1) a produo de gotas carregadas no capilar; (2) O

encolhimentodas gotas carregadas pela evaporao do solvente e a desintegrao das gotas

originando gotas muito pequenas e altamente carregadas capazes de produzir ons em fase

gasosa; (3) mecanismo no qual os ons em fase gasosa so produzidos a partir de gotas

muito pequenas e altamente carregadas. Essas etapas ficam melhores visualizadas na

Figura 8, que segue:

Figura 8: Ilustrao mostrando o mecanismo de formao do spray. (TITATO, 2004)


39

Uma diferena de potencial aplicada entre o capilar e o eletrodo planar que fica

em frente a este. Quando esta difena de potencial aplicada uma dupla camada eltrica

forma-s no interior do capilar, fazendo com que os ons negativos fiquem prximos a

parede e os positivos sejam repelidos para a superfcie do lquido. Esse enriquecimento de

ons positivo na superfcie do lquido ocasiona a desestabilizao do menisco e um cone

(cone de Taylor) forma-se e, posteriormente, gotas com excesso de ons positivos so

emitidas para fora do cone. As gotas carregadas comeam a diminuir por causa da

evaporao do solvente e gotas cada vez menores so formadas. A diminuio do tamanho

faz com que aumente a densidade de carga e ons passam a ser ejetados da gota. Assim,

ons positivos em fase gasosa so formados e atrados para o anteparo negativo que os

conduz para o interior da regio de alto vcuo.

Analisador de massas utilizado

O analisador de massas o local onde os ons formados sero separados e

selecionados de acordo com a sua razo massa/carga. O analisador do tipo quadrupolo foi

o analisador utilizado nestes experimentos. Este consiste de dois pares de barras cilndricas

paralelas que esto localizadas entre a fonte de ons e o detector, conforme ilustra a Figura

9. Uma diferena de potencial formada por duas componentes aplicada entre os dois

pares de barras. A primeira componente o potencial de corrente contnua e a segunda

uma rdio-freqncia (RF) alternada. As barras opostas so conectadas eletricamente e a

RF faz com que a polaridade das barras se alterne de modo que os ons selecionados dentro

de uma faixa de m/z sejam repelidos e atrados de tal maneira que percorram a trajetria


40

entre as barras e cheguem at o detector. Aqueles ons que esto fora da faixa de m/z

selecionada simplesmente colapsam ao colidirem com as barras.

Figura 9: Ilustrao dos componentes de um analisador do tipo quadrupolo. (TITATO, 2004)

EExxppeerriimmeennttaall

41

33.. EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL

33..11 CCOOLLEETTAA DDOOSS FFRRUUTTOOSS

Os frutos foram coletados em rvores da espcie S. saponaria localizadas no

estacionamento da Prefeitura Universitria da UFSCar. Parte das folhas e frutos coletados

nestas rvores foram depositados no herbrio do Departamento de Botnica da UFSCar

(HUFSCar) sob o nmero 003651.

33..22 OOBBTTEENNOO DDOOSS EEXXTTRRAATTOOSS

Os frutos foram lavados com gua, escorridos e secos a temperatura ambiente.

Aps, uma massa de 720 g de frutos tiveram as suas sementes removidas, sendo o

restante triturado a seco em liquidificador. O metanol utilizado nas extraes foi

destilado no DQ-UFSCar e a gua destilada no laboratrio de cromatografia do DQ-

UFSCar.

Extrato aquoso

Os frutos triturados foram extrados com gua, pela simples imerso destes em

um becker contendo gua, sob a agitao de um basto de vidro e deixado em descanso

por 1 dia. Aps o perodo de descanso, a soluo foi filtrada e colocada em frascos com

aberturas largas e curtas para evaporar em temperatura ambiente com ventilao

aquecida.


42

Extrato da espuma

A espuma formada na etapa de extrao com gua foi recolhida colocada em

um becker e solubizada em metanol.

Extrato hidro-metanlico

Outra poro de frutos triturados foi posta em contato com uma soluo hidro-

metanlica MeOH/H2O, (1:1, v/v), agitada com basto de vidro e deixada em repouso

por 3 dias. Aps o repouso, ela foi filtrada e o excesso de metanol foi evaporado no

evaporador rotatrio. A soluo resultante foi colocada em frascos com aberturas largas

e curtas e deixada evaporar em temperatura ambiente com ventilao aquecida.

Extrato metanlico

Os frutos utilizados na extrao hidro-metanlica foram batidos no

liquidificador com metanol puro, filtrados e deixado em repouso por 1 dia. A soluo

resultante foi evaporada em evaporador rotatrio e como ficou muito viscosa, devido a

composio glicosdica alta, foi colocada em frascos com aberturas largas e curtos e

deixado evaporar em temperatura ambiente e com ventilao aquecida.


43

33..33 FFRRAACCIIOONNAAMMEENNTTOO EEMM CCOOLLUUNNAA PPRREEPPAARRAATTIIVVAA

O fracionamento em coluna preparativa foi realizado utilizando uma coluna de

vidro com 4 cm de dimetro preenchida com sephadex LH-20 (especificaes) onde o

comprimento da fase estacionria foi 120 cm. O metanol utilizado como eluente foi

destilado no DQ-UFSCar e a gua destilada no laboratrio de cromatografia do DQ-

UFSCar.

Fracionamento utilizando como eluente MeOH/H2O (8:2)

A coluna inicialmente foi limpa com metanol puro e posteriormente foi

condicionada com 500 mL de MeOH/H2O (8:2). O extrato metanlico ( 8 g) foi

dissolvido em 50 mL de eluente, ultra sonicado por 10 minutos para melhorar a

solubilizao e filtrado em papel filtro comum. Em seguida foi aplicado na coluna e

eludo por 3 dias, resultando em 50 fraes de 25 mL.

Fracionamento utilizando como eluente MeOH/H2O (1:1)

Procedeu-se do mesmo modo que o fracionamento anterior, porm a

quantidade de extrato dissolvida na fase mvel foi 10 g. Foi aplicado na coluna e

eludo por 5 dias, resultando em 65 fraes de 25 mL.


44

Fracionamento das fraes reunidas 41-63 eluda com MeOH/H2O (1:1)

A coluna inicialmente foi limpa com metanol puro e posteriormente foi

condicionada com 200 mL de MeOH/H2O (1:1) Em seguida foi aplicado na coluna e

eludo por 6 horas, resultando em 15 fraes de 25 mL.

A Figura 10 mostra uma ilustrao esquematizando os procedimentos

realizados em cada etapa do fracionamento em cromatografia lquida preparativa.

As fraes 41-63foram reunidas pois estavamenriquecidas em saponinasFrao reunida 50% (C)

Massa final: 390 mg

Fracionamento em coluna Preparativa: Sephadex LH-20

(70 x 3 cm)

O pericarpo dos frutos foi extrado com MeOH/H2O (1:1)

e MeOH puro

MeOH/H2O (1:1) MeOH puro

Fracionamento em colunaPreparativa.

Fase estacionria: Sephadex LH-20(120 x 4 cm)

Eluente: MeOH/H2O(8:2)


As fraes 7-13 foramReunidas dando origem frao mais purificada (P)

Massa final: 8.5 mg

As fraes 20-26 foramReunidas e deram origem

frao Frao reunida 20% (A)

Massa final: 253 mg

O extratohidro-metanlico

No foi fracionado

Fraes reunidas16-19 (B)

Massa final: 2,0778 g

As fraes 41-63foram reunidas pois estavamenriquecidas em saponinasFrao reunida 50% (C)

Massa final: 390 mg

Fracionamento em coluna Preparativa: Sephadex LH-20

(70 x 3 cm)

O pericarpo dos frutos foi extrado com MeOH/H2O (1:1)

e MeOH puro

MeOH/H2O (1:1) MeOH puro

Fracionamento em colunaPreparativa.

Fase estacionria: Sephadex LH-20(120 x 4 cm)



As fraes 7-13 foramReunidas dando origem frao mais purificada (P)

Massa final: 8.5 mg

As fraes 20-26 foramReunidas e deram origem

frao Frao reunida 20% (A)

Massa final: 253 mg

O extratohidro-metanlico

No foi fracionado

Fraes reunidas16-19 (B)

Massa final: 2,0778 g

Figura 10: Ilustrao esquemtica dos procedimentos realizados no processo de extrao e fracionamento em cromatografia lquida preparativa do extrato metanlico.


45

Fracionamento e enriquecimento em SPE

Um grama de extrato metanlico bruto foi dissolvido em 3 mL

acetonitrila/gua (ACN/H20) (2:8, v/v) e aplicado em um cartucho contendo 2000 mg de

octadecilsilano (ODS) como fase estacionria (Macherey Nagel, Chromabond C18). A

acetonitrila utilizada foi de grau analtico da marca Baker e a gua ultrapurificada Milli-

Pore. A eluio das fraes foi conduzida sob presso reduzida em um sistema de vcuo

Supelco em um fluxo de 1 mL/min, com a aplicao de 5 mL de eluente com diferentes

propores de ACN/H2O. O cartucho foi condicionado com 5 mL de ACN/H2O (2:8,

v/v) com um fluxo de 1,5 mL/min. Inicialmente a amostra foi aplicada sob ao da

gravidade, porm como a consistncia desta era muito viscosa e o tempo de aplicao

estendeu-se muito a presso do sistema foi reduzida para que aplicao fosse concluda.

Aps a aplicao da amostra esta foi eluda com gua pura, ACN/H2O (2:8) e por fim

ACN pura. A frao eluda com acetonitrila foi utilizada para um fracionamento

posterior. Um volume correspondente a 5 mL da frao eluda com ACN pura foi

aplicada em um cartucho de 2000 mg de ODS e eluda com o seguinte sistema de

eluo: gradiente de ACN/H2O nas seguintes propores: 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 e

8:2, v/v. Todas estas fraes foram submetidas a anlise de CZE.

33..44 AANNLLIISSEESS DDEE EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS

As anlises de ESI-MS foram realizadas por insero direta em um

espectrmetro de massas Micromass Quattro LC, com analisador triplo quadrupolo. As

amostras foram diludas em metanol (Baker) e injetadas em um loop de 10 L e


46

carregadas para o interior da fonte de ionizao com o auxlio da fase mvel ACN/H2O

(1:1, v/v). O gs de nebulizao e dessolvatao utilizado foi nitrognio (White

Martins). Os parmetros do tuning foram otimizados para cada anlise e so descritos

nas legendas dos espectros. A temperatura do bloco da fonte: 135 C; temperatura de

dessolvatao: 420 C. O programa para operao do equipamento e tratamento dos

dados foi o Masslynx 3.3 (Micromass).

33..55 AANNLLIISSEESS DDEE EELLEETTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR

As anlises de eletroforese capilar foram realizadas em um aparelho de

eletroforese capilar, HPCE 3D HEWLETT PACKARD. As dimenses dos capilares

utilizados bem como os parmetros do tampo, voltagem e comprimento de onda

analisados esto especificados na legenda de cada eletroferograma. Um pr-

condicionamento do capilar foi realizado antes de cada injeo. Este foi realizado pelo

bombeamento de NaOH 0,1 mol L-1por 1 minuto, gua por 1 minuto de gua e o tampo

da anlise por 3 minutos.

33..66 PPRREEPPAARROO DDAASS SSOOLLUUEESS

As solues tampo estoques foram preparadas em concentraes mais

elevadas e estas diludas no mximo at um volume duas vezes maior, para garantir que

a capacidade tamponante destas no fosse esgotada. A gua utilizada no preparo de

todas as solues foi ultrapurificada em sistema Milli-Q. Estas solues foram filtradas


47

em filtro de mebrana com 22m de poro, eram levadas temperatura ambiente e

desgaseificadas sempre antes da diluio.

Soluo estoque de dodecilsulfato de sdio 500 mmol L-1

A soluo estoque de SDS na concentrao de 500 mmol . L-1 (2,8838 g em

0,20 L) foi preparada pela adio de 3,0356 g de SDS 95% (J. T. Baker) em 20 mL de

gua. Antes do volume final ser completado algumas gotas de diclorometano foram

adicionadas com o objetivo de diminuir a espuma e preservar a soluo. Todas as outras

solues contendo SDS foram preparadas a partir da diluio desta.

Soluo tampo estoque fosfato de sdio 20 mmol L-1

O tampo fosfato de sdio foi preparado pela neutralizao de uma soluo 20

mmol L-1 de Na2HPO4 7 H2O (1,3404 g em 0,25 L de gua) (Mallinckrodt) com uma

soluo 20 mmol L-1 de H3PO4 (137 L de H3PO4 p.a em 0,1 L) at pH 8. Aps a

soluo foi transferida para um balo volumtrico de 200 mL. Essa soluo foi utilizada

para preparar os tampes na concentrao de 20 e 10 mmol L-1, pH 8.

Soluo tampo estoque borato de sdio 150 mmol L-1

A soluo foi preparada pela neutralizao de uma soluo 150 mmol L-1 de

cido brico (0,9275 g em 0,1 L) (Vetec) com uma soluo 0,1 mol L-1 de NaOH

(Mallinckrodt) at pH 9,0.


48

Soluo tampo estoque borato de sdio 20 mmol L-1

A soluo foi preparada pela neutralizao de uma soluo de cido brico

(0,3092 g em 0,25 L) (Vetec) com uma soluo 0,1 mol L -1 de NaOH (Mallinckrodt) at

pH 9,1.

Solues dos tampes de corrida

Em um balo de 25 mL, foram adicionado 20 mL de soluo estoque de

tampo fosfato ou borato quando a concentrao era 20 mmol L-1 e 10 mL quando a

concentrao era 10 mmol L-1. Um volume de soluo estoque 500 mmol L-1 de SDS

era adicionado para se obter a concentrao de SDS desejada. Em seguida o volume era

completado com gua at 25 mL.

Soluo da Frao B

A massa de 2,0778 g da frao B foi dissolvida em 25 mL de gua.

Soluo mista 100 mmol L-1 de SDS/frao B

Esta soluo foi preparada pela adio de 2 mL de SDS 500 mmol L-1 em 8 mL

da soluo da frao B.


49

Soluo tampo borato pH 9,1 10 mmol L-1 50 mmol L-1 SDS/Frao B

Esta soluo foi preparada pela adio de 2,5 mL de soluo tampo estoque

borato 20 mmol L-1 em 2,5 mL de soluo mista 100 mmol L-1 SDS/frao B

DDiissccuussssoo ee aapprreesseennttaaoo ddooss rreessuullttaaddooss

50

44.. DDIISSCCUUSSSSOO EE AAPPRREESSEENNTTAAOO DDOOSS RREESSUULLTTAADDOOSS

O presente trabalho foi desenvolvido em duas etapas distintas: uma envolvendo

conhecimentos de qumica orgnica e outra, conhecimentos de qumica analtica. A

primeira etapa consistiu na tentativa de isolamento e caracterizao das saponinas de S.

Saponaria. Nesta os conhecimentos desenvolvidos foram de tcnicas de separao em

escala preparativa, analtica, conhecimento de espectrometria de massas como tcnica

de caracterizao. A segunda etapa envolveu o conhecimento de tcnicas eletroforticas

de separao, porm sem identificao dos compostos pela ausncia de um padro para

auxiliar as anlises e tambm ausncia de um detector de massas acoplado ao

equipamento de eletroforese. Dois modos de eletroforese capilar foram utilizados para a

separao dos extratos, CZE e MEKC, e os resultados foram comparados

qualitativamente.

44..11.. EEXXTTRRAAOO EE PPUURRIIFFIICCAAOO

44..11..11.. AANNLLIISSEESS DDAASS FFRRAAEESS PPOORR EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRIIAA DDEE MMAASSSSAASS

O monitoramento das fraes por espectrometria de massas foi realizado

utilizando o modo de ionizao electrospray negativo e os ons analisados por um

sistema quadrupolar. O modo negativo envolve espcies desprotonadas, ento quanto

mais grupos com facilidade para doar prtons forem encontrado na espcie analisada,

melhor ser a eficincia de ionizao. Algumas das saponinas de Sapindus saponaria

possuem grupos cidos na aglicona o que facilita o processo de desprotonao/ionizao


51

tornando o modo eficiente e sensvel para a anlise destes compostos. As principais

informaes adquiridas por espectrometria de massas so: a massa molecular obtida a

partir do on molecular desprotonado e, por experimentos de fragmentao, a

identificao de grupos funcionais com padres de fragmentao conhecidos.

Os principais tipos de fragmentaes envolvidos na anlise as saponinas so a

quebra da ligao glicosdica, as perdas de unidades monossacardeas e as perdas de

grupos acetatos. Os acetatos podem sair na forma de cido actico e H2C=C=O, que

possuem massas 60 e 42 Da, respectivamente. Os picos na faixa de 800-1000 Da que

diferem por estas massas indicam saponinas com diferentes graus de acetilao. A partir

da saponina desacetilada, com massa 882 Da (MURGU, 2002), podemos chegar aos

fragmentos gerados pela perda parcial e total das unidades monossacardeas. Um

fragmento importante o m/z 472 que corresponde massa da aglicona no protonada.

Essa informao importante, pois quando um espectro de massas normal (definido na

tabela 1) gerado, a presena deste on pode indicar que uma fragmentao precoce est

ocorrendo na fonte. Enquanto que em experimentos de MS/MS a presena deste fornece

meios de se obter a confirmao da presena das saponinas no extrato. Com base nestas

informaes a espectrometria de massas foi utilizada para acompanhar a composio

das fraes eludas nas colunas prepativas com sephadex.

44..11..22.. EESSCCOOLLHHAA DDOO EEXXTTRRAATTOO AA SSEERR FFRRAACCIIOONNAADDOO

Os extratos dos frutos de Sapindus saponaria compem-se basicamente de

oligoglicosdeos sesquiterpnicos alicclicos (OGSA) e saponinas, sendo estas menos

polares que os primeiros. Inicialmente o interesse estava voltado para as saponinas, mas


52

com o decorrer do trabalho os OGSA se mostraram interessantes, pois eles tambm

possuem propriedades tensoativas, embora produzam espuma em menor quantidade e

menos estvel do que as saponinas.

Quando os frutos foram extrados com gua, uma espuma abundante formou-se

na superfcie da soluo de extrao. Essa espuma foi coletada e solubilizada em

metanol e analisada juntamente com os demais extratos obtidos. O perfil de massas

destes extratos (aquoso, hidrometanlico, metanlico e da espuma) foi investigado por

espectrometria de massas antes da realizao do fracionamento, pois seria interessante

fracionar um extrato cuja composio fosse enriquecida em saponinas. No espectro

apresentado na Figura 11 os sinais foram adquiridos at a m/z 1200 e os sinais 882, 924,

966 correspondem aos ons de algumas saponinas desprotonadas que diferem por 42 Da,

o que equivale a perda de um acetato. Os sinais 1002, 1116, 1146 e 1188, correspondem

aos ons de OGSA desprotonados, os quais foram isolados anteriormente. (MURGU,

2002).

Na Figura 11 (A) o sinal em m/z 1188 tem intensidade pouco superior a dos

picos 966 e 924, indicando que, nesta amostra, a quantidade de molculas com estas

massas aproximadamente igual enquanto que em (B) as intensidades mostram uma

diferena maior.


53

Figura 11: Espectro de massas (A) extrato metanlico e (B) extrato hidrometanlico. Condies de anlise: electrospray no modo negativo, os parmetros do tuning foram otimizados para cada amostra.

O sinal em m/z 966, correspondente a uma saponina, tem um ligeiro aumento

na sua intensidade, quando o comparamos com o sinal em m/z 1188 no (A) e no (B).

Isto sugere um enriquecimento da saponina com massa 967 no extrato metanlico.

Porm, a diferena mais significativa mostra-se na relao entre os picos 686 e 710.

Estas massas esto fora da faixa de massa das saponinas e a sua discusso no

necessria.

A Figura 12 mostra os espectros dos extratos: aquoso (superior) e da espuma

(inferior). Podemos observar que a composio predominante de OGSA,

principalmente os de maiores massas moleculares, que so mais polares. O espectro da

espuma mostra

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