01

ESTUDO EM RECEPTOR DE EFLUENTES INDUSTRIAIS UTILIZANDO BIOMARCADOR DE COMPOSTOS AROMÁTICOS PARA AVALIAÇÃO

DE CONTAMINAÇÃO EM CORPOS D’ÁGUA

Graça Regina Armond Matias Ferreira;Lafayette Luz; Iracema Nascimento; Mauro Rebelo e Igor Rodrigues

15 de julho de 2010Salvador – BA

02

Projetos de gerenciamento ambiental e de recursos hídricos

Indústrias petroquímicas buscam otimizar seus processos em tecnologias P+L [Economia e Ambiente]

INTRODUÇÃOPrecisão nas estimativas de impacto

Proteção e a Restauração de Ecossistemas

Crescimento industrial no Brasil Risco de contaminação

ECOSSISTEMAS EFLUENTES TOXICIDADEORGÂNICOS

INORGÂNICOS

INDUSTRIAL DOMÉSTICOS

RapidezDeterminação das ConcentraçõesCertificação quanto à obediência aos limites estabelecidos

Não informa:◦ os efeitos dos

contaminantes aos organismos

◦ as conseqüências biológicassobre sua biodisponibilidade.Não contempla seus efeitos interativos

ANÁLISES QUÍMICAS

INTRODUÇÃO (Cont.)

Metodologias de avaliação de poluentes no ambiente:

ANÁLISES BIOLÓGICAS –TESTE ECOTOXICOLOGICOS

• Detecção de efeitos de contaminantes em organismos

• Avaliação integrada dos efeitos• Avaliação da sensibilidade de ≠

espécies.

Definição: exposição de organismos por

período determinado

• Não identificam a substância que causa o efeito tóxico

• São mais demorados (em alguns casos).

03

Níveis de Organização Biológica

Ecossistema

Comunidade

População

Organismo

RapidezDeterminação das ConcentraçõesCertificação quanto à obediência aos limites estabelecidos

Não informa:◦ os efeitos dos contaminantes

aos organismos◦ as conseqüências biológicas

de transformações químicas◦ sobre sua biodisponibilidade.Não contempla seus efeitos interativos

4

• Não identificam a substância que causa o efeito tóxico

• São mais demorados (em alguns casos).

•Detecção de efeitos de contaminantesem organismos vivos•Avaliação integrada dos efeitos•Avaliação da sensibilidade de ≠ espécies

ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

INTRODUÇÃO (Cont.)

Metodologias de avaliação de poluentes no ambiente:ANÁLISES BIOLÓGICAS –

TESTE ECOTOXICOLOGICOS

USO INTEGRADO

AVALIAÇÃO E PREVISÃO DO RISCO AMBIENTAL E

SAÚDE HUMANA

Resolução CONAMA n° 357 de 17/03/2005Ensaios ecotoxicológicos na investigação de interações

BIOMARCADORES Celular/Bioquímico04

Respostas de sistemas vivos a agentesestressores, mensurados em nível bioquímicocelular (NASCIMENTO et al., 2002).

Biomarcadores Ambientais

INTRODUÇÃO (Cont.)

Expressão de CYP1A e EROD: um biomarcador de exposição para HPAs, empregado em estudos de monitoramento ambiental que reflete exposição à

poluentes de origem industrial (VENTURA et al, 2002).

Hidrocarbonetos Poliaromáticos (HPAs).

05

CITOCROMOS P450-1A Hemoproteínas, localizadas nos hepatócitos e outras células corporais.

Fonte: MARCUSSEN, 1997.

Indução, reflete a expressão dos gens que codificam proteínas 1A (CYP1A).

sensibilidade e especificidade

Associação à Atividade EROD (Etoxiresorufina-O-deetilase)

O cálculo se baseia na comparação da florescência obtida (resorufina formada) com concentração conhecida (padrão).

Na presença de NADPH, EROD converte o substrato etoxiresorufina em resorufina, com produção de um composto fluorescente, lido por

espectrofluometria.

Mensurados espectrofotometricamente.

Fig. 02- Reação Química da Atividade Enzimática da EROD.Fonte: PARENTE, 2004

A indução de EROD como biomarcador de exposição é considerado um método de biotecnologia ambiental (PARENTE et al., 2006; SCHLEZINGER et al, 2006).

Procedimento rápido, confiável e de fácil repetibilidade.

Princípio de ação do Biomarcador EROD

06

INTRODUÇÃO (Cont.)

Analisar o grau de contaminação das águas de umreceptor de águas de uma área industrial do PoloPetroquímico de Camaçari (Bahia), através do uso deum biomarcador específico para HPAs, que evidenciama toxicidade resultante, através do aumento da atividadeEROD determinada em organismo-teste (Tilápia do Nilo,Oreochromis niloticus) (Linnaeus, 1758) exposto à águae sedimento do local.

07

OBJETIVO

Fig. 03. Mapa de Camaçari (WIKIPEDIA, 2006); acima imagem do Polo de Camaçari (COFICPOLO, 2006)

08

LOCAL DE ESTUDO

• Os pontos de amostragem foram definidos em função da localização eimportância.

Descrição dos pontos de amostragem

Fig. 8- Esquema dos pontos de amostragem

P5

P3

P4

P2P1

P8P7

P6

Bacia II

Bacia I

Ponto Descrição Amostragem

P1 Interior da bacia I – na borda oeste Água e Sedimento

P2 Interior da bacia I – na borda leste Água e Sedimento

P3 Interior da bacia I – parte + profunda Água e Sedimento

P4 Interior da bacia I – canal Água e Sedimento

P5 Interior da Bacia II Água e Sedimento

P6 Canal da bacia II Água

P7 Canal III Água

P8 Canal Final Água

MATERIAIS E MÉTODOS

9

Pontos Amostrais

A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é cultivada desde a bacia do rioAmazonas até o Rio Grande do Sul. Acredita-se que, no Brasil, metade daprodução anual de peixes cultivados seja de tilápias (RAMOS, 2005).

Os juvenis que foram utilizados nos ensaios provieram do DNOCS (DepartamentoNacional de Obras contra as Secas) onde normalmente são criadas sob condiçõescontroladas.

Organismos-teste

Fig. 04- Foto tilápia (Oreochromis niloticus).

Fonte: AQUABIOTEC, 10/2006.

010

MATERIAIS E MÉTODOS

• 6 campanhas:3 no período seco: Agosto, Outubro e Dezembro /20053 no período chuvoso: Abril, Maio e Junho /2006

• Coleta:Água SuperficialSedimento

• Pontos Amostrais (8):P1 a P8 (amostra líquida)P1 a P5 (amostra de sedimento)

• Análises de Parâmetros Ambientais: •Campo: oxigênio dissolvido, pH, salinidade, cloreto, condutividade, temperatura, turbidez, sólidos totais dissolvidos, potencial de oxi-redução e resistividade (Sonda multi-parâmetros 6600 Multi-Parameter Water Quality Monitor)

•Laboratoriais: análises de metais, voláteis, semi-voláteis, sílica, aromáticos – através de HPLC

•Determinação de Proteínas Totais: Método de Bradford•Quantificação da Atividade EROD: KIT CYP1A1 EROD ACTIVITY (IKZUS)

DESENHO EXPERIMENTAL

11

Coleta de amostras

Água

Preparação dos Organismos

Execução dos testes - Exposição

Exposição dos organismos

• Seleção: 9 -13cm e 30 – 40g• 5 réplicas/ponto – Aquários 10L• Controle: água de diluição e Sedimento de área controle• Amostra Líquida: 1 peixe + 4L amostra• Sedimento: 1 peixe + 300g (± 1,5cm) amostra + 4L água diluição• Análise de Parâmetros físico-químicos: TºC; pH; Nitrato; Amônia;

Dureza; Sulfeto.

Sedimento

12

MATERIAIS E MÉTODOS

Execução dos Testes

•Sacrifício: 24h exposição (incisão cerebral)•Biometria•Secção do fígado → Pesagem → Lavagem KCl → N2(liq) → Freezer -80ºC

Homogeneização

Preparação da fração citosólicaCentrifugação

•2mL (Sol. A + B)/0,5g tecido•2mL PTN + 2mL EROD (x3)

•Fração S9:•9000g •30min •4ºC

MATERIAIS E MÉTODOS

13

14

Determinação de Proteínas Totais

Método de Bradford

Spectrofluorcephotometer-Shimadreu RF-5000.

Análise e Quantificação Enzimática

Gráficos gerados pelo espectrofluorômetro

•30ºC/550nm/582nm/5nm•Reação: Tampão reação + Etoriresorufina + Amostra (50 ou 100ųL) + B-NADPH (3x)•Média de Fluorescência – 1,5 min

MATERIAIS E MÉTODOS

14

Tratamento Estatístico• Grafphad usando-se o teste t de Student;

• Comparação de médias múltiplas grupos amostrais e controle (p< 0,05).

• Cálculos de correlação MINITAB 14 (MINITAB Statistical Software) e ORIGIN 1.6

OBS: O controle negativo compara as amostras coletadas no ambiente-testecom amostras consideradas padrão.

Controle Positivo

Controle positivo: compara atividade enzimática encontrada (teste) comamostras expostas à altas concentrações de indutores conhecidos. Controlepositivo em tilápias tratadas com Ascarel (potente indutor de CYP1A).

MATERIAIS E MÉTODOS

15

RESULTADOS

16

Valores médios da indução da atividade EROD (pmoles resorufina/mg proteína/min) em células hepáticas (fração S9) de tilápias (O. niloticus)

expostas à água superficial da área de estudo Camaçari-BA.

RESULTADOS

17

Valores médios da indução da atividade EROD (pmoles resorufina/mg proteína/min) em células hepáticas (fração S9) de tilápias (O. niloticus)

expostas ao sedimento da área de estudo Camaçari-BA.

RESULTADOS

18

RESULTADOS

19

Média dos valores de Aromáticos (µg/Kg) analisados emsedimentos na área de estudo. (OBS: Escala na base logarítimica)

CONCLUSÕES- Caracterizam o ambiente como contaminado por indutores deCYP1A1 evidenciado por elevadas concentrações de atividadeEROD, em alguns pontos de amostragem, quando comparadas aocontrole.

- As análises químicas revelaram a presença de HPAs emdiferentes concentrações entre os períodos de amostragem,embasando as respostas biológicas encontradas nos testes.

- Indicam a necessidade de incorporação de tecnologias queminimizem a produção destes contaminantes nas diferentes etapasde produção em complexos industriais e na adoção e seleção deprocessos adequados de descontaminação da massa hídricaefluente, com isso, inclusive, facilitando o seu reaproveitamentonos processos.

20

- Para reuso, este deve ser precedido de uma análise em função dosobjetivos de uso, para que se evitem riscos à saúde do ambiente.Todavia, o uso desta área para fins não industriais (como pesca econtato direto) não é recomendado devido à extrapolação dos limitesdos parâmetros químicos e físicos baseados nas ResoluçõesCONAMA 357/2005 e 344/2004, e do acentuado valor de atividadeenzimática EROD em alguns pontos.

- Por fim, a metodologia empregada para detectar abiodisponibilidade de compostos aromáticos em corpos hídricos,mostrou-se viável e com boa confiabilidade, além de atuarproativamente num nível inicial de impactação, permitindo a tempo aexecução de ações que previnam impactos ambientais em níveissuperiores de organização da biota.

21

CONCLUSÕES

22

REFERÊNCIAS• COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL (CETESB). Procedimento para utilização de testes de toxicidade no controle de efluentes líquidos. São Paulo. Setembro. 1990a.

• COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL (CETESB). Implementação de testes de toxicidade no controle de efluentes líquidos. São Paulo. Outubro. 1990b.

• CONAMA BRASIL – CONSELHO NACIONAL EM MEIO AMBIENTE.(2005) Resolução Nº 357, de 17 de março de 2005. Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências. São Paulo 24 p.

• MARCUSSEN, M.G.E.; BARRA, R. (1997). Enzimas Citocromo P450. Universidad de Concepcíon. Centro EULA-Chile.

• NASCIMENTO, I.A. Técnicas de coleta, preservação e preparo de amostras líquidas e de sedimentos para testes de toxicidade. In: Métodos em Ecotoxicologia Marinha: aplicações no Brasil. Cap. II. São Paulo. Editora Artes Gráficas e Indústria Ltda. 262p. 2002

• PAYNE, A.L.; PENROSE, W.R. (1987). Induction of aryl hydrocarbon (bezo[a]pyrene in fish by petroleum. Bull Environ. Contam. Toxicol. Jul; 14(01):112-116.

• PARENTE, Thiago Estavam Martins. Indução do CYP1A em peixes como biomarcador da poluição aquática – o caso do rio Guandu. Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ. Instituto de Biologia. Departamento de Genética. RJ. 2006 (no prelo).

• RAMOS, Maria Loreto Nazar Ramos. Desenvolvimento e aplicações de técnicas para avaliação da Toxicidade de 14 formulações de gasolina, utilizando Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758); Cichlidae, Teleostei, e ovas do Gastrópode Pomacea lineata (SPIX, 1827) como organismos testes. [Tese de Mestrado] Programa em Ecologia e Biomonitoramento, Janeiro 2005. 89f.

• SCHLEZINGER, J.J.; STRNTZ, W.D.; GOLDSTONE, J.V.; STEGEMAN, J.J. (2006) Uncoupling of cytochrome P450 and stimulation of reactive oxygen species production by co-planar polychlorinated biphenyl congeners. Aquatic Toxicology. 77: 422-432.

• VENTURA, E.C.; GAELZER, L.R.; ZANETTE, L.; MARQUES, M.R.E.; BAINY, A.C.D. (2002). Biochemical indicators of contaminant exposure in spotted pigfish (Orthopristis ruber) caught at three bays of Rio de Janeiro coast. Marine EnvironmentalResearch. 54: 775-779.

-Graça Regina Ferreira –ginamatias@hotmail.com