ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA

COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO

LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.

Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida

Manaus – AM

Julho, 2016

ii

Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.

Orientador(a): Dra. Cecilia Veronica Nunez

Dissertação apresentada à

Coordenação do Programa

Integrado de Pós-Graduação em

Botânica do INPA, como parte dos

requisitos para obtenção do título

de Mestre em Botânica.

Manaus - AM

Julho, 2016

vi

À minha amada família, meus pais Eneida e Lauro, e meu irmão Igor, por serem os eternos pilares da minha vida, e aos verdadeiros e preciosos amigos que fiz nesta longa caminhada chamada vida, dedico esta dissertação.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à DEUS, pelas inúmeras coisas boas que possuo em

minha vida e por sempre contar com sua força na hora dos mais diversos desafios.

Agradeço à minha família, em especial aos meus pais e meu irmão. À minha

mãe Eneida, eterna companheira e apoiadora, por nunca me deixar faltar nada e sempre

me incentivar a crescer na vida, a ela devo uma gratidão eterna. Ao meu pai Lauro, que

mesmo longe atualmente, me apoiou e me deu amor, e me ensinou que, na vida,

pensamento positivo é tudo, e que no fim tudo dá certo. Ao meu irmão Igor, que sempre

me estendeu a mão sem questionar, que sempre esteve lá quando eu mais precisei, um

segundo pai, uma pessoa que sei que posso contar pelo resto de minha vida.

Aos meus amigos, pelos momentos felizes, aventuras e companheirismo, que me

ajudavam a desligar dos problemas, nas horas boas e ruins, em especial à Alan Soares,

Alan Almeida, Bruno da Mata Tio, Daniel Martini, Dennis Rafael, Maximiliano

Moraes, Marcos Deilson, Rafael Ribeiro e Thales Filizola.

Aos meus amigos da faculdade e da Botânica, pela amizade, pelos inúmeros

momentos hilários e aventuras que passamos, e pelo grande conhecimento científico que

adquiri com os mesmos ao longo deste mestrado, em especial à Alysson, Diana,

Gabriel, Jhenny, Lincoln, Marcos Melo, Rodrigo e Wellison.

Aos eternos companheiros e amigos de Laboratório, obrigado pela imensa e

indispensável ajuda que me deram, tudo foi possível graças a vocês, nos momentos

felizes e difíceis dessa jornada, vocês estavam lá. Agradeço à minha querida e amada

Fabiele Cruz, sempre prestativa e pronta a ajudar, companheira de fracionamentos nas

madrugadas de finais de semana, pelo amor, amizade, conhecimento e pela ajuda nos

ensaios biológicos e diversos experimentos. Aos valiosíssimos amigos, pelos inúmeros

momentos descontraídos no Laboratório, pelos vários momentos felizes fora do

ambiente de trabalho, por serem incrivelmente prestativos e sempre terem tempo para

me ajudar, pelas dicas, pelo imenso conhecimento que adquiri com eles e pelo apoio

emocional e profissional: Alan, David, Fabiana, Jaci, Juliana, Kissinara (ensaio

antioxidante cheio de emoções), Leomara, Luana, Sabrina e Vanessa.

viii

À Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos, da UFAM, pela colaboração e

realização do ensaio antitumoral.

À minha orientadora Dra. Cecilia Veronica Nunez, por me receber em seu

laboratório e me conceder a oportunidade de realizar este trabalho, pelos ensinamentos e

confiança.

Aos professores do PPG de Botânica do INPA, pelos ricos ensinamentos e

incentivos à continuar sempre pesquisando as maravilhas da natureza.

Ao grupo CALTQPN, pelas análises de Ressonância Magnética Nuclear e

Espectrometria de massas.

Ao CNPq pela concessão da bolsa e apoio financeiro para o projeto.

Ao INPA pela infraestrutura e amparo, e por possibilitar a realização deste

sonho.

À todos os colegas de Laboratório que contribuíram direta e indiretamente para

este trabalho, meu imenso obrigado!

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“A sorte favorece os audazes”

VIRGÍLIO – A Eneida (10, 284)

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RESUMO

A espécie Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) apresenta uma vasta riqueza de substâncias isoladas, contudo, existem poucos trabalhos de indivíduos do bioma amazônico, podendo apresentar substâncias novas ou potenciais biológicos diferenciados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi realizar a análise fitoquímica de E. bulbosa coletada na região de Altamira-PA, no bioma amazônico, e avaliar o potencial biológico de seus extratos. As folhas, flores e bulbos foram secos e posteriormente moídos. O material vegetal foi então submetido a extração com hexano ou diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e H2O, e seus extratos analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). O extrato hexânico apresentou precipitação de cristais após a concentração, sendo estes separados por lavagem com solvente e analisado por CCDC. O extrato selecionado para ser fracionado foi o metanólico do bulbo, revelando indícios da presença de classes de substâncias fenólicas, diferentes classes de terpenos, além de derivados antraquinônicos, sendo o mesmo posteriormente submetido à partição líquido-líquido e sua fase DCM fracionada. Foi possível isolar oito substâncias: sete do fracionamento da fase DCM, e uma do extrato hexânico. Por meio da análise de RMN, ao todo foi possível caracterizar 5 substâncias, eleuterina, eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol. Os extratos e eleuterina apresentaram uma alta toxidade no teste com Artemia salina, onde o metanólico do bulbo e eleuterina apresentaram a maior toxidade, nas concentrações de 1000 µg/mL e 500 µg/mL. Para o ensaio antitumoral, nenhum dos extratos e nem eleuterina apresentaram uma citotoxidade significativa frente às linhagens tumorais MCF-7, MRC-5, HCT116 e Sk-Mel-28, com exceção do extrato hexânico do bulbo que causou morte celular de 50-60% contra as linhagens MCF-7, MRC-5 e Sk-Mel-28. No ensaio antimicrobiano, o extrato metanólico e a fase DCM apresentaram uma concentração inibitória mínima (CIM) de 1000 µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente, e as substâncias Fr 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina apresentaram CIM de 500 µg/mL frente à Staphylococcus aureus e Pseudomonas fluorescens. No geral, todos os extratos analisados não apresentaram atividade antioxidante significativa frente ao radical DPPH, nem ao Fe3+/fenantrolina. Eleuterina, eleuterinol e isoeleuterina se mostraram importantes marcadores químicos desta espécie, por sua predominância na planta, e esta é a segunda vez que é relatado a presença do eleuterinol glicosilado nesta espécie. Estudos mais profundos com as substâncias isoladas, bem como a caracterização das principais responsáveis pelo potencial antimicrobiano, são necessários. Ainda, os resultados obtidos podem ser utilizados em futuros estudos comparativos da espécie e gêneros da tribo, aliados à dados morfológicos e filogenia, para a solução de problemas taxonômicos.

Palavras – chave: Eleutherine bulbosa, ensaio antimicrobiano, ensaio antitumoral, Artemia salina, quinonas.

xi

ABSTRACT

Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) species presents a vast wealth of isolated substances, however, there are few studies of individuals from the Amazon biome, that may present new substances or different biological potentials. Therefore, the aim of this study was to perform the phytochemical analysis of E. bulbosa collected in Altamira-PA, region from the Amazon biome, and evaluation of the biological potential of its extracts. The leaves, flowers and bulbs were dried and then grounded. Subsequently, the plant material was subjected to extraction with hexane or dichloromethane (DCM), methanol (MeOH) and H2O, and their extracts analyzed by thin layer chromatography (TLC). The hexane extract showed precipitation of crystals after concentration, which were separated by washing with solvent and analyzed by TLC. The extract selected for fractionation was the bulb's methanolic extract, which revealed evidence of the presence of phenolic substance classes, different classes of terpenes, and anthraquinone derivatives, the same being further subjected to liquid-liquid partition and it's DCM phase fractionated. It was possible to isolate eight substances: seven from the DCM phase fractionation, and one from the hexane extract. By NMR analysis, it was possible to characterize 5 substances: eleutherin, eleutherol, eleutherinol-8-O-β-glucoside, isoeleutherin and eleutherinol. The extracts and eleutherin showed high toxicity in Artemia salina assay, where the bulb's methanolic extract and eleutherin showed the highest toxicity at 1000 µg/mL and 500 µg/mL concentrations. For antitumor assay, none of the extracts or eleuterine showed significant cytotoxicity against MCF-7, MRC-5, HCT116 and Sk-Mel-28 tumor cell lines, except the bulb’s hexanic extract, which caused 50-60% cell death against MCF-7, MRC-5 and Sk-Mel-28 cell lines. In the antimicrobial assay, the methanolic extract and the DCM phase showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 1000 µg/mL and 500 µg/mL, respectively, and also the substances Fr 61+62 (FD), eleutherol and isoeleutherin showed a MIC of 500 µg/mL against Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens. Overall, all extracts analyzed showed no significant antioxidant activity against the DPPH radical, or the Fe3+/phenanthroline. Eleutherin, eleutherol and isoeleutherin showed to be very important chemical markers of this species since its predominance in the plant, and this is the second time it is reported the presence of glycosylated eleutherinol in this species. Further studies with the isolated substances, as well the characterization of the main ones responsible for the antimicrobial potential, are necessary. Thus, the results obtained can be used in future comparative studies of the species and genera of the tribe, combined with morphological and phylogeny data, to solve taxonomical problems.

Key-word: Eleutherine bulbosa, antimicrobial essay, antitumor essay, Artemia salina,

quinones.

xii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xiv

LISTA DE TABELAS E QUADROS ...................................................................... xviii

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... xx

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 3

2.1 METABOLISMO SECUNDÁRIO E PRODUTOS NATURAIS .......................... 3

2.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS .................................................................................... 11

2.2.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................... 11 2.2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.............................................................. 12 2.2.3 ATIVIDADE TÓXICA E CITOTÓXICA ..................................................... 13 2.2.3.1 Artemia salina ............................................................................................ 13 2.2.3.2 CULTIVO CELULAR E ATIVIDADE ANTITUMORAL ....................... 14

2.3 FAMÍLIA IRIDACEAE JUSSEU ........................................................................ 15

2.4 Eleutherine Herbert ............................................................................................... 18

2.5 Eleutherine bulbosa (Miller) Urb. ........................................................................ 19

3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 25

3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 25

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 25

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 26

4.1 PREPARO E SELEÇÃO DOS EXTRATOS ....................................................... 26

4.2 ANÁLISES, FRACIONAMENTOS CROMATOGRÁFICOS E ISOLAMENTO ................................................................................................................................27

4.2.1 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DOS EXTRATOS ................................. 27 4.2.2 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO ................................................................ 29 4.2.3 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS E ISOLAMENTO ........................ 30

4.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS ..................................................................................... 34

4.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................... 34 4.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.............................................................. 35

4.3.3 TESTE DE TOXIDADE UTILIZANDO Artemia salina ............................. 36

4.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL .................................................................. 36 4.3.4.1 Linhagens Celulares .............................................................................. 36 4.3.4.2 Teste do Alamar blue ............................................................................ 37

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 38

5.1 Coleta e obtenção dos extratos .............................................................................. 38

5.2 Análises Cromatográficas, Isolamento e Elucidação Estrutural ........................... 38

xiii

5.2.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e RMN ........ 38 5.2.1.1 Cristais do extrato bruto hexânico ............................................................... 38 5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo ......................... 390 5.2.1.3 Fracionamento do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa ................... 49 5.2.1.4 Análise e Fracionamento das Fases da partição líquido-líquido ................. 51 5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD) ..................... 54 5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12) ................ 63 5.2.1.7 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 29+30 (06-12).................72 5.2.1.8 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 34+35 (14-20).................81

5.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS .................................................................................... 90

5.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................... 90 5.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.............................................................. 93 5.3.3 TESTE DE TOXIDADE FRENTE À Artemia salina ................................... 99 5.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL ......................................................................... 100

6. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 103

7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 104

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: SANTOS (2007)..................................................................................................p.3

Figura 2: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Adaptado de Santos (2007) e Dewick (2002).....................................................p.4

Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002).................................................................................p.6

Figura 4 - Estrutura química da flavona Fonte: Adaptado de Campos (2005)...............................................................................p.7

Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003)......................................................p.8

Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-Lapachona e β-Lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013).....................................................p.9 Figura 7 – Estrutura química dos tetraterpenos β-caroteno e licopeno. Fonte: Adaptado de Saxena et al. (2013).....................................................................p.10

Figura 8: Mapa de distribuição global de Iridaceae Fonte: STEVENS (2008).............................................................................................p.15

Figura 9: Morfologia de Eleutherine bulbosa Fonte: GOLDBLATT & SNOW (1991)......................................................................p.20

Figura 10: Flores, bulbo e espécie cultivada numa horta doméstica no interior de São Paulo Fonte: LORENZI & MATOS (2008)...........................................................................p.20

Figura 11: Eleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...................................................................p.22

Figura 12: Isoeleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...................................................................p.22

Figura 13: Isoeleuterol Fonte: Adaptado de Insanu et al. (2014).....................................................................p.22 Figura 14: Eleuterinona Fonte: Adaptado de Alves, Kloos & Zani (2003).......................................................p.22

xv

Figura 15: Hongconin Fonte: Adaptado de Zhengxiong et al. (1986)…..……………………………...........p.22

Figura 16: Fluxograma da preparação dos extratos de Eleutherine bulbosa..............p.26

Figura 17: Fluxograma da partição do extrato metanólico de Eleutherine

bulbosa.........................................................................................................................p.29

Figura 18: Fluxograma geral de fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa.....................................................................................................p.33

Figura 19 – (a) Eleutherine bulbosa coletada no município de Altamira, PA. (b) Exsicata fértil depositada no herbário do INPA, Manaus, AM..................................p.38

Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa.....................................................................................................p.39

Figura 21 - Análise em CCDC do cristal originário do extrato hexânico do bulbo. Eluição em Hex/Acetona (7:3). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – cloreto férrico; 5 – DPPH; 6 – Dragendorff; 7 – KOH 10 %; 8 – vapor de iodo..............................................................................................................................p.40

Figura 22 – Estrutura da eleuterina e suas correlações no COSY e HMBC..............p.43

Figura 23 – Espectro de RMN de 1H da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).................p.44

Figura 24 – Espectro de RMN de 13C da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)................p.45

Figura 25 – Mapa de contorno HSQC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...............p.46

Figura 26 – Mapa de contorno COSY da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...............p.47

Figura 27 – Mapa de contorno HMBC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)..............p.48

Figura 28 - Análise em CCDC do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH (9:1). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – cloreto férrico; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico........................................p.49

Figura 29 – Fluxograma parcial do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa. Fases da partição líquido-líquido...............................................p.50

Figura 30 – Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa. Fracionamento da FDE, da FD e o posterior fracionamento das frações da FD................................................................................................................p.53

Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico...............................................................................................................p.54

xvi

Figura 32 – Estrutura do eleutherinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC.........................................................................................................................p.56

Figura 33 – Espectro de RMN de 1H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6

(300 MHz)...................................................................................................................p.57

Figura 34 – Espectro de RMN de 13C do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6

(300 MHz)...................................................................................................................p.58

Figura 35 – Espectro de DEPT 135o do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)............................................................................................................................p.59

Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6

(300 MHz)...................................................................................................................p.60

Figura 37 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6

(300 MHz)...................................................................................................................p.61

Figura 38 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6

(300 MHz)...................................................................................................................p.62

Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico....................................................................................p.63

Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC...............p.65

Figura 41 – Espectro de RMN de 1H do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).................p.66

Figura 42 – Espectro de RMN de 13C do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.67

Figura 43 – Espectro de DEPT 135 do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)....................p.68

Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.69

Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.70

Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...............p.71

Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico.....................................................................................p.72

Figura 48 - Estrutura da isoeleuterina e suas correlações no COSY e HMBC...........p.74

Figura 49 – Espectro de RMN de 1H da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)............p.75

Figura 50 – Espectro de RMN de 13C da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...........p.76

xvii

Figura 51 – Espectro de RMN de DEPT 135o da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).............................................................................................................................p.77

Figura 52 – Mapa de contorno COSY da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.78

Figura 53 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.79

Figura 54 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.80

Figura 55 - Análise em CCDC da Fração Fr 34+35 do fracionamento da fração Fr 14-20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – cloreto férrico; 6 – KOH 10 %; 7 – KOH 10% (UV – 365)...............................................................................................................................p.82

Figura 56 - Estrutura do eleuterinol e suas correlações no COSY e HMBC..............p.83

Figura 57 - Espectro de 1H do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).........................p.84

Figura 58 - Espectro de 13C do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)........................p.85

Figura 59 - Espectro de RMN de DEPT 135o do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).............................................................................................................................p.86

Figura 60 - Mapa de contorno COSY do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).......p.87

Figura 61 - Mapa de contorno HSQC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)........p.88

Figura 62 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)......p.89

Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa

frente a S. aureus..........................................................................................................p.90

Figura 64 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase DCM obtida do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus........................................................................p.94

Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine

bulbosa frente a P. fluorescens....................................................................................p.96

Figura 66 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine

bulbosa frente a S. aureus...........................................................................................p.96

Figura 67 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine

bulbosa frente a P. fluorescens...................................................................................p.97

xviii

Figura 68 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine

bulbosa frente a S. aureus...........................................................................................p.97


bulbosa frente a P. fluorescens.....................................................................................p.98

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 – Reveladores químicos e físicos aplicados nas cromatoplacas de sílica como

método colorimétrico para revelar as diversas classes químicas presentes no extrato, de

acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984. ............................................................p.28

Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos,

produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI-

INPA............................................................................................................................p.38

Tabela 3 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo...................................................................................................................p.42 Tabela 4 – Visão geral das massas obtidas pela partição do extrato metanólico do bulbo

de Eleutherine bulbosa, mostrando a massa inicial obtida de cada fase, o rendimento em

relação à massa do extrato bruto, a massa armazenada para eventuais análises e testes,

as fases unidas por semelhança na CCDC, e a massa final utilizada no

fracionamento...............................................................................................................p.51

Tabela 5 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz,

DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo........................................p.55

Tabela 6 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol.....................................................................................p.65

Tabela 7 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 29+30 (06-12), isoeleuterina...............................................................................p.74

Tabela 8 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 34+35 (14-20), eleuterinol...............................................................p.83

xix

Tabela 9 – Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da

naftoquinona Eleuterine, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa

utilizando o método com DPPH, mostrando valores de absorbância, equivalência do

ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios

padrão...........................................................................................................................p.90

Tabela 10 - Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da

naftoquinona Eleuterine, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa

utilizando o método com Fe3+ + Fenantrolina, mostrando valores de absorbância,

equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos

desvios padrão.............................................................................................................p.91

Tabela 11 – Concentração inibitória mínima (MIC) para os extratos e fases de

Eleutherine bulbosa.....................................................................................................p.93

Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos

em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterine frente à

Artemia salina, valores finais em porcentagem............................................................p.99

Tabela 13 – Determinação da morte celular de linhagens de células tumorais frente à

extratos de Eleutherine bulbosa e à naftoquinona eleuterina.....................................p.102

Quadro 01: Substâncias químicas e atividades biológicas de constituintes químicos isolados de Eleutherine e sinonímias..........................................................................p.22

xx

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt – Acetato de Etila

CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CDCl3 – Clorofórmio deuterado

CIM – Concentração Mínima Inibitória

CL – Concentração Letal

CLSI – Clinical Laboratory and Standards Institute

COTI – Coordenação de Tecnologia e Inovação

DCM – Diclorometano

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO – Dimetilssulfóxido

DMSO – d6 – Dimetilssulfóxido deuterado

DPPH – 1,1-difenil-2-picril-hidrazila

FD – Fase DCM

FA – Fase AcOEt

HEX – Hexano

Hz – Hertz

INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

KOH – Hidróxido de Potássio

J – Constante de acoplamento

MeOH – Metanol

RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze

UV – Ultravioleta

d – Dubleto

t – Tripleto

ddd – Duplo Duplo Dupleto

dt – Duplo Tripleto

m – Multipleto

s – Singleto

ppm – Partes por milhão

1

1. INTRODUÇÃO

A Floresta Amazônica é conhecida pela sua vasta biodiversidade, abrigando

cerca de 20% da biodiversidade mundial (SUFFREDINI et al., 2002). A utilização das

plantas, no tratamento e cura de diversas doenças, é uma prática milenar e, até hoje, se

mostra como principal recurso terapêutico de muitos grupos e comunidades tradicionais.

As informações populares sobre o uso dessas plantas conduziram ao longo dos anos a

uma gama de informações de grande validade com relação à eficiência e aos efeitos

medicinais das plantas (OTTOBELLI et al., 2011). Segundo Cunha & Roque (2005a),

uma planta medicinal pode ser definida como aquela que possui atividade

farmacológica, usada com fins terapêuticos, e ainda, cujos metabólitos posteriormente

passam a ser incluídos em medicamentos.

As plantas são um dos principais organismos estudados produtores dos diversos

tipos de estruturas moleculares na natureza, através de seu metabolismo primário,

envolvido na manutenção da própria planta, e principalmente através do seu

metabolismo secundário, onde tais substâncias não são essenciais à manutenção da

planta, mas são essenciais para a sobrevivência da mesma no ecossistema, podendo ter

inúmeras funções diferentes. Ciente do papel dos metabólitos secundários, estes estão

especialmente relacionados com as propriedades terapêuticas das plantas (NEVES &

CUNHA, 2012).

Os estudos dos metabólitos foram iniciados pelos químicos orgânicos, do século

XIX e início do século XX, interessados nessas substâncias pela sua importância como

drogas medicinais, venenos, aromatizantes e materiais industriais. Os medicamentos de

origem natural possuem vantagem por serem de fácil disponibilidade, econômicos, e

apresentarem pouco ou nenhum efeito colateral. Hoje em dia, há um interesse renovado

em medicamentos de origem natural, por serem considerados mais seguros para a saúde

humana e com produção menos prejudicial ao meio ambiente, ao contrário das drogas

sintéticas (CHANDA, 2014).

Ainda, nos últimos anos, com o aumento da resistência de micro-organismos

patogênicos a múltiplos fármacos, verificou-se um esforço maior na investigação de

produtos naturais de forma a identificar novas substâncias ativas que pudessem ser

2

utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos (NEWMAN et

al., 2003; SHU, 1998).

No campo da fitoquímica se encontra um grande número de trabalhos

experimentais publicados. A importância científica das pesquisas desenvolvidas nesta

área é demonstrada pelos resultados obtidos em diversos trabalhos, que contribuíram

para a elucidação e o conhecimento de milhares de substâncias naturais aplicados para a

criação de novos medicamentos de origem vegetal (MATOS, 2009).

Brito e Brito (1993) apontam diversos estudos químicos e/ou farmacológicos

realizados com espécies da flora brasileira, desde a Floresta Amazônica até o Pantanal,

ressaltando as potencialidades de utilização de várias delas, bem como a necessidade de

maiores estudos dessa riquíssima flora. A região Amazônica, com sua imensa

biodiversidade, desponta como um celeiro a contribuir para o surgimento de novos

medicamentos fitoterápicos (MALHEIROS, 2008).

Dentre as famílias vegetais encontradas na região Amazônica, com reconhecido

potencial terapêutico, destaca-se Iridaceae, considerada por Reeves e colaboradores

(2001) como uma das maiores famílias das Lilianae e provavelmente uma das mais

estudadas entre as monocotiledôneas. Das diversas espécies estudadas da família

Iridaceae, encontra-se a espécie Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., planta inclusa na

Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), reconhecida

por diversos potenciais terapêuticos e vasta riqueza de substâncias isoladas até hoje em

diversos estudos e revisões recentes sobre a espécie e sinonímias (COUTO et al., 2016;

INSANU, KUSMARDIYANI & HARTATI, 2014; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

Ainda, apesar de diversos estudos existirem sobre a espécie Eleutherine bulbosa, os

variados potenciais de suas substâncias não foram inteiramente explorados,

principalmente de indivíduos do bioma amazônico, do qual existem poucos trabalhos

realizados. Assim, este trabalho teve como finalidade avaliar mais profundamente os

potenciais dos extratos e das substâncias isoladas de um indivíduo de Eleutherine

bulbosa do bioma amazônico, e verificar as substâncias produzidas pelo mesmo a fim

de contribuir mais com o estudo da espécie.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 METABOLISMO SECUNDÁRIO E PRODUTOS NATURAIS

A floresta amazônica é conhecida por deter a maior diversidade vegetal do

mundo com pelo menos 16 mil espécies de árvores. Apesar de existirem muitos estudos

de plantas amazônicas em busca de metabólitos secundários de interesse, o

conhecimento atual das plantas do bioma Amazônico representa apenas uma pequena

parte dessa enorme diversidade (SKIRYCZ et al., 2016; TER STEEGE et al., 2013).

O aparecimento de metabólitos biologicamente ativos na natureza é determinado

por necessidades ecológicas e possibilidades biossintéticas, tendo como fatores

estimulantes à produção desses metabólitos secundários a co-evolução de plantas,

insetos, micro-organismos e mamíferos (RHODES, 1994), além de vários outros fatores

como temperatura, sazonalidade, disponibilidade de água, radiação Ultra Violeta (UV),

disponibilidade de nutrientes e altitude, como observado na Figura 1 (GOBBO-NETO

& LOPES, 2007). Atualmente, sabe-se que muitos metabólitos secundários têm funções

ecológicas importantes, como proteção contra herbivoria e infecção por micro-

organismos, ação atrativa para polinizadores e agentes de competição planta-planta

(GERSHENZON & ENGELBERTH, 2013).

Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: GOBBO-NETO & LOPES (2007)

4

A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do

metabolismo da glicose através da via do ácido chiquímico e do acetato, onde o

primeiro origina aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos

secundários aromáticos (alcaloides indólicos, quinolínicos, isoquinolínicos,

benzilisoquinolínicos, protoalcaloides, taninos hidrolisáveis, lignanas e cumarinas), e o

segundo origina derivados do acetato via ácido cítrico, mevalonato e através da

condensação do acetato (terpenoides, esteróis, alcaloides pirrolidinicos, tropânicos,

pirrolizidínicos, piperidínicos e quinolizidínicos), e ainda, a formação de isoprenoides

conta com uma via alternativa da 5-desoxixilulose para sua formação. Metabólitos como

antraquinonas, flavonoides e taninos condensados são produzidos a partir de reações de

ambas as vias, como pode ser observado na figura 2 (DEWICK, 2002; SANTOS, 2007).

Figura 2: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Adaptado de Santos (2007) e Dewick (2002).

condensação via mevalonato

polissacarídeos heterosídeos

ácido chiquímico

triptofano fenilalanina/ tirosina

ácido gálico

Alcaloides indólicos e

quinolínicos

protoalcaloides alcaloides

isoquinolínicos e benzilisoquinolínicos

ácido cinâmico

fenilpropanoides

lignanas e ligninas cumarinas

acetil - CoA

taninos hidrolisáveis

antraquinonas flavonoides

taninos condensados

Ciclo do

ácido

ornitina lisina

alcaloides pirrolidínicos,

tropânicos, pirrolizidínicos, piperidínicos e quinolizidínicos

ácidos graxos acetogeninas

isoprenoides

terpenoides e esterois

5-desoxixilulose

GLICOSE

5

Depois de séculos de uso empírico das ervas, o início do século XIX marcou a

nova era da pesquisa moderna de plantas medicinais, através dos primeiros isolamentos

de princípios ativos tais como a morfina, quinina e etc. A investigação dos metabólitos

vegetais neste período era feita principalmente sob o ponto de vista fitoquímico e

quimiotaxonômico, e posteriormente, com o desenvolvimento da ciência química e da

farmacognosia, os médicos da época começaram a extrair substâncias químicas de

plantas medicinais (SAXENA et al., 2013; HAMBURGER & HOSTETTMANN,

1991).

Com o passar dos anos, diversos estudos relataram o isolamento e a identificação

de milhares de metabólitos secundários de diversas plantas com uma extensa gama de

potenciais medicinais, entre eles potenciais antibacterianos, antitumorais, antioxidantes,

inseticidas, fungicidas, diuréticos, antivirais, anti-inflamatórios, antiespasmódicos, anti-

helmínticos, anti-alergênicos, etc. (CUNHA, CAVALEIRO & SALGUEIRO, 2005;

FISCHER et al., 1998; LACAILLE-DUBOIS & WAGNER, 1996; SCHENKEL,

GOSMANN & ATHAYDE, 2007; PESSOA et al., 2002; MIRANDA, 2001; CAMPOS,

2005).

Muitos metabólitos são de importância comercial, tanto na área farmacêutica

quanto nas áreas alimentares, agronômica, da perfumaria, e entre outras. Entre estas

áreas, há um maior interesse do ponto de vista farmacêutico por conta do grande

número de substâncias farmacologicamente importantes já encontradas, tais como o

taxol (diterpeno com potencial anticancerígeno, isolado de plantas do gênero Taxus), a

artemisinina (presente em Artemisia annua, que exerce potente atividade antimalárica) e

a forscolina (oriundo de Coleus barbatus, possui promissor potencial contra

hipertensão, asma, glaucoma e certos tumores) (KAMCHONWONGPAISAN &

MESHNICK, 1996; DE SOUZA, 1993; CORRÊA, 1995; GERSHENZON &

ENGELBERTH, 2013).

Entre os muitos metabólitos secundários com importantes potenciais medicinais,

destacam-se as substâncias fenólicas, as quinonas e os terpenos.

As substâncias fenólicas possuem um grupo fenol em sua estrutura química e

apresentam diversas funções, dentre elas: defesa contra herbivoria, atrativo para

polinizadores e proteção contra radiação ultravioleta. Estes se enquadram em diversas

categorias como fenóis simples, ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides, estilbenos,

6

taninos condensados e hidrolisáveis e lignanas, e são uma boa fonte de antioxidantes

(NACZK & SHAHIDI, 2004; CHUN et al., 2005).

As principais substâncias fenólicas, flavonoides e cumarinas, podem ser

encontrados em várias partes das plantas como flores, frutos, raízes, sementes, caule e

cascas (CUNHA & BATISTA, 2005; CAMPOS, 2005; CUNHA & CAMPOS, 2005).

As cumarinas são oriundas da oxidação do ácido trans-cinâmico tornando-se

ácido o-cumárico seguindo-se glicosilação, sendo posteriormente isomerizado para

forma –cis dando origem à cumarina (CUNHA & CAMPOS, 2005), como demonstrado

na figura 3. Elas possuem uma grande variedade de atividades biológicas, como ação

antimicrobiana, antiviral, anti-inflamatória, antiespasmódica, antitumoral e antioxidante

(MIRANDA, 2001), além de poderem estar relacionadas com a inibição de enzimas e

com a sua capacidade de suprimir espécies ativas de oxigênio (EAO) (HOULT &

PAYÁ, 1996).

Podem ser encontradas sozinhas ou combinadas com açúcares ou ácidos.

Possuem características odoríferas que permitem o uso na fabricação de perfumes e

agentes flavorizantes, como por exemplo, em repelente de insetos (MIRANDA, 2001).

Já os flavonoides são moléculas que tem por base a estrutura da flavona (figura

4), e as estruturas predominantes são de flavonóis e flavonas quase sempre na forma

heterosídica. Os flavonoides sintetizam-se nas plantas e participam na fase luminosa da

fotossíntese, a fenilalanina e a tirosina dão lugar ao ácido cinâmico e ao ácido p-

hidroxicinâmico que originam a estrutura cinamoil dos flavonoides após condensar-se

com unidades de acetato. O ácido cinâmico forma-se da fenilalanina, e é o precursor de

outro fenilpropanoides como a lignina, flavonoides e cumarinas (CAMPOS, 2005).

Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002).

O

O

7

Neste grupo encontram-se as antocianidinas, flavonas, flavonóis e, com menor

freqüência, as auronas, calconas e isoflavonas (SOARES, 2002).

De acordo com Campos (2005), os flavonoides têm atraído a atenção da ciência

médica devido às suas propriedades anti-carcinogênica, anti-alergênica, anti-

inflamatória, antioxidante, antibacteriana, antidiarreica e antiviral, além de serem pouco

tóxicos para o homem, sendo então, considerado por Fracaro (2004), como um dos

grupos fenólicos mais importantes, estando amplamente distribuídos no reino vegetal e

sendo altamente diversificados entre os produtos de origem natural.

Outro grupo que se destaca por sua importância medicinal são as quinonas. As

quinonas são substâncias orgânicas originários da oxidação de fenóis, onde da mesma

forma, a redução de quinonas dá origem aos fenóis. Esta classe tem como principal

característica a presença de dois grupos carbonílicos formando um sistema conjugado

(FALKENBERG, 2007).

As quinonas podem ser classificadas de acordo com a sua estrutura, onde leva-se

em consideração o tipo de sistema aromático que sustenta o anel quinonoídico: as

benzoquinonas, que possuem apenas um anel de 6 carbonos com duas carbonilas ligadas

na sua estrutura; as naftoquinonas, que possuem um anel naftalênico; e as

antraquinonas, que possuem um anel antracênico, podendo este ser linear ou angular,

como demonstrado na figura 5. As quinonas naturais são consideradas de vital

importância para diversos seres vivos como vegetais superiores, artrópodes, fungos,

liquens e diversos micro-organismos, e sua distribuição nestes organismos se dá,

possivelmente, de acordo com as suas funções biológicas (SILVA, FERREIRA &

SOUZA, 2003).

Figura 4 - Estrutura química da flavona. Fonte: Adaptado de Campos (2005).

O

O

8

As quinonas são encontradas em abundância na flora brasileira, sendo altamente

estudadas e seus potenciais biológicos comprovados, demonstrando potenciais

antimicrobiano, antimalárico, antitumoral e até mesmo tripanossomicida quando

associada a outras substâncias. Elas são encontradas em diversas famílias de plantas

superiores, sobretudo nas famílias Rubiaceae, Fabaceae (Caesalpinioideae),

Verbenaceae, Bignoniaceae, Myrsinaceae, Iridaceae, e entre outras (DE MOURA et al.,

2001; MORELLO et al., 1995; VERMA, 2006; DE ANDRADE-NETO et al., 2004;

FALKENBERG, 2007).

Um exemplo de substância conhecida é o lapachol, uma naftoquinona natural

encontrada principalmente na família Bignoniaceae, especificamente no gênero

Tabebuia (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Descrito pela primeira vez

por Paternò em 1882, e estrutura química estabelecida por Hooker em 1896, o lapachol

possui a capacidade de induzir estresse oxidativo através da formação intracelular de

espécies reativas do oxigênio, como o radical hidroxila (OH), sendo portanto capaz de

danificar significativamente células normais e malignas, pela indução da apoptose em

células tumorais e impedir seu crescimento desordenado. Contudo, por conta da mesma

poder prejudicar células sadias, muitos estudos foram realizados para criar substâncias

derivadas do lapachol, tornando esta a matéria prima para síntese e semi-síntese de

muitas outras substâncias de distintas bioatividades. Exemplos disso seriam a α-

lapachona e a β-lapachona (Figura 6), que possuem reconhecidas atividades biológicas

Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003)

A B C

O

O

O

O

O

O

9

já descritas na literatura, tais como atividade antitumoral, leishmanicida, anti-

inflamatória, anti-fúngica, tripanomicida, antiprotozoária e antimicrobiana (ASCHE,

2005; LIU, LI & SAKYA, 2004; SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003; ALMEIDA et

al., 1990; DE MOURA et al., 2001; GAFNER et al., 1996; TEIXEIRA et al., 2001;

ZANI et al., 1997; MACHADO et al., 2003).

Outra classe de metabólitos com grande potencial medicinal são os terpenos. Os

terpenoides são uma classe derivada de unidades de isopreno de 5 carbonos (C5), que

possuem estruturas multi-cíclicas variadas que se diferenciam nos grupos funcionais e

nos esqueletos básicos de carbono, e podem ser encontrados em praticamente todas as

classes de seres vivos, por isso sendo considerado o maior grupo de produtos naturais.

Estes são encontrados principalmente em óleos essenciais de plantas, e por conta disso,

muitos dos terpenoides possuem alto interesse comercial por possuírem fragrâncias

distintas, sendo usados no campo de alimentação e cosmética.

Os terpenos podem ser classificados em hemiterpenoides (C5), possuindo apenas

uma unidade isoprênica em sua estrutura; monoterpenoides (C10), com duas unidades

isoprênicas estruturadas de forma linear ou contendo dois anéis, como no caso do

eucaliptol e do limoneno; sesquiterpenos (C15), que possuem três unidades isoprênicas,

como no caso do eudesmol, encontrado no óleo de Eucalipto; diterpenos (C20),

compostos por quatro unidades isoprênicas; triterpenos (C30), que consistem em seis

unidades isoprênicas, encontrados, por exemplo, em óleos de oliva; e tetraterpenos

(C40), que contém oito unidades isoprênicas em sua estrutura, exemplos de

Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-lapachona e β-lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013)

lapachol α-lapachona β-lapachona

O

O

OH

CH3

CH3

O

O

O

CH3CH3

O

O

O

CH3

CH3

10

tetraterpenos seriam o licopeno e o betacaroteno (figura 7) (SAXENA et al., 2013;

LANGENHEIM, 1994).

Os terpenoides são conhecidos por serem o grupo com maior diversidade

estrutural entre os metabólitos secundários, conferindo a eles uma ampla gama de

funções, como defesas contra herbivoria, produção de óleos voláteis para atração de

polinizadores, e funções de compostos sinalizadores e reguladores de crescimento na

planta (fitohormônios). Ainda, eles apresentam diversas propriedades medicinais

comprovadas, como propriedades anti-malárica, anti-tumoral, hepaticida e

antimicrobiana (DEGENHARDT et al., 2003; DUDAREVA, PICHERSKY &

GERSHENZON, 2004; LANGENHEIM, 1994; MCCASKILL; CROTEAU, 1998).

β-caroteno

licopeno

Figura 7 – Estrutura química dos tetraterpenos β-caroteno e licopeno. Fonte: Adaptado de Saxena et al. (2013)

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3 CH3CH3CH3

CH3CH3CH3 CH3

11

2.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS

2.2.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Um antioxidante pode ser definido como qualquer substância que, em baixas

concentrações, retarda ou previne significativamente a oxidação de um substrato. Eles

podem ser sintéticos ou naturais e, entre os naturais destacam-se ácido ascórbico, vi-

tamina E e β-caroteno. Além dessas vitaminas antioxidantes, outras substâncias de

origem vegetal atuam como antioxidantes, como por exemplo, os polifenois das plantas

que são uma importante classe de antioxidantes. Estes compostos estão distribuídos em

grande quantidade em plantas alimentícias, e incluem fenóis, ácidos fenólicos,

flavonoides, taninos e lignanas (HALLIWELL et al., 1995; PIETTA, 2000).

A oxidação representa um processo essencial da vida aeróbica e do nosso

metabolismo no processo de produção de energia. Durante este processo, elétrons

singulares ou não acoplados podem surgir no fluxo de elétrons, gerando radicais livres

ou espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs estão relacionados com o

envelhecimento humano, além de diversas doenças degenerativas como doenças do

coração, cataratas, disfunção cognitiva e câncer (PIETTA, 2000).

Os produtos antioxidantes eficazes são os que impedem o excesso de EROs,

através da estimulação do mecanismo de reparo antioxidante ou da doação ou captura

de elétrons para a estabilização do radical livre (NÚÑEZ-SELLÉS, 2005).

O ácido ascórbico (vitamina C) é considerado um dos mais potentes e o menos

tóxicos dos antioxidantes naturais, atuando como sequestrador eficaz de radicais livres,

além de combater eficientemente espécies reativas de nitrogênio em soluções aquosas,

impedindo a nitrosação de moléculas. Entre as principais fontes de vitamina C, estão os

frutos cítricos, acerola, goiaba e kiwi, além de algumas hortaliças (SUCUPIRA et al.,

2014; WEBER, BENDICH & SCHALCH, 1996).

Os antioxidantes naturais atuam nas plantas protegendo-as contra injúrias nos

tecidos e ação danosa de subprodutos provenientes da fotossíntese. Muitas dessas

substâncias são similares em sua estrutura molecular básica, onde todos possuem pelo

menos um anel aromático com uma hidroxila ligada a ele (SHAHIDI, 1996).

12

2.2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

O corpo humano é um conhecido habitat de uma microflora muito diversificada,

composta de populações benéficas, populações prejudiciais à saúde e populações que

exercem pouca influência sobre seu hospedeiro em condições normais. Desde tempos

remotos as bactérias provocam doenças nos seres humanos, comprometendo a saúde

dos seres vivos em geral com constantes ameaças ocasionadas por infecções de micro-

organismos, onde a maior preocupação é o surgimento de cepas resistentes aos

antimicrobianos disponíveis. Neste sentido, torna-se importante a pesquisa e o

desenvolvimento de drogas mais eficazes, o que constitui uma estratégia promissora no

campo da biotecnologia, através da prospecção de novas classes de moléculas naturais

ou sintéticas (SILVA & FERREIRA, 2003; SOUZA et al., 2003; WANNMACHER,

2004).

A pesquisa de atividade antimicrobiana refere-se a diferentes técnicas ou

métodos laboratoriais in vitro, os quais são utilizados para determinar o potencial

antimicrobiano de um determinado agente. Para isso existem três métodos que podem

ser utilizados para esta avaliação: método de difusão, método de diluição e

bioautográfico.

O método de difusão consiste em utilizar um reservatório (disco de papel,

cavidade no meio de cultura ou cilindro sobre a superfície) onde é colocada a substância

a ser testada, ficando em contato direto com o meio de cultura sólido inoculado com um

determinado micro-organismo, onde, após o tempo adequado de incubação, mede-se o

diâmetro ou o halo de inibição. O método de diluição utiliza uma quantidade fixa de

amostra que é dissolvida homogeneamente num meio sólido ou líquido, onde se

encontra inoculado o micro-organismo de interesse em interação com a amostra. Após o

período de incubação, é avaliado a inibição do crescimento bacteriano pela amostra. O

potencial inibitório da amostra é definido pela concentração inibitória mínima (CIM),

que é a menor concentração capaz de inibir o crescimento do micro-organismo. Já a

bioautografia é um método que visa detectar substâncias com ação antimicrobiana nas

bandas individuais numa placa cromatográfica onde está impregnado um extrato ou

fração, permitindo assim guiar o isolamento da substância ativa (SOUZA et al., 2003).

13

2.2.3 ATIVIDADE TÓXICA E CITOTÓXICA

2.2.3.1 Artemia salina

Artemia salina é um microcrustáceo conhecido desde 1755, onde a partir da

metade do século XIX, foram realizados vários estudos em relação à sua morfologia e

taxonomia. O bioensaio utilizando este organismo foi inicialmente proposto por

Michael e colaboradores (1956), onde se avaliou a toxidade de inseticidas.

Posteriormente, este crustáceo seria usado em diversos experimentos científicos. O

microcrustáceo Artemia salina tem sido introduzido em laboratórios de Produtos

Naturais no intuito de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de extratos de plantas

na procura de substâncias bioativas. Podem ser observadas a validade e confiabilidade

deste bioensaio, onde a toxicidade para Artemia salina convergiu para frações que

continham uma substância reconhecidamente ativa, o que demonstra a sensibilidade da

metodologia (VINATEA, 1982; SIQUEIRA, BOMM & PEREIRA, 1998).

Substâncias bioativas são quase sempre tóxicas em altas doses, com isso,

letalidade in vivo em um organismo zoológico simples pode ser usado como um

conveniente monitor para varredura e fracionamento no descobrimento e

monitoramento de compostos naturais bioativos. Os ovos de Artemia salina (Leach),

estão prontamente disponíveis em pet shops a baixo custo e se mantem viáveis por anos

quando mantidos em estado seco. Quando colocados em água salgada, os ovos eclodem

dentro de 48h, fornecendo um grande número de larvas (nauplii) para uso experimental,

permitindo a avaliação de metabólitos e extratos tóxicos e a determinação de sua

concentração em que a porcentagem de mortalidade seja de 50% dos indivíduos (CL50),

conferindo assim, confiabilidade estatística. Além disso, as larvas possuem ciclo de vida

relativamente curto, o que favorece seu uso em testes de toxidade. (MCLAUGHLIN,

ROGERS & ANDERSON, 1998; GONZÁLEZ et al., 2007).

Alguns trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com

atividades como antifúngica, viruscida, antimicrobiana, e ainda, como indicador prévio

de possível atividade antitumoral (MACRAE, HUDSON & TOWERS, 1988;

(MCLAUGHLIN, ROGERS & ANDERSON, 1998).

14

2.2.3.2 CULTIVO CELULAR E ATIVIDADE ANTITUMORAL

O cultivo de células animais tem sido utilizado pela indústria biotecnológica para

sintetizar produtos, destinados em grande parte à área de saúde humana e animal.

Diversos fatores como a composição do meio de cultivo, a densidade do inóculo celular

e o tipo de suporte para adesão celular, quando combinados se tornam para o sucesso do

cultivo in vitro das células animais (MITSUHASHI, 1989).

Muitas células animais, com os devidos cuidados específicos, podem ser induzidas

a crescer fora de seus órgãos ou tecidos de origem. Células isoladas, tecidos e órgãos

podem crescer quando mantidos a temperaturas definidas usando incubadora, meio

suplementado com nutrientes para célula e fatores de crescimento. A cultura in vitro de

órgãos, tecidos e células é conhecida como cultura de tecidos, e é usada em muitas áreas

da ciência. Diversos tipos de células podem crescer em cultura, exemplos disso incluem

elementos conectores de tecidos como os fibroblastos, tecido ósseo (osso e cartilagem),

músculos cardíaco e liso, tecido epitelial (fígado, rim, pele, bexiga), células neuronais

(células da glia e neurônios, contudo, estes não podem se proliferar in vitro), células

endócrinas (adrenal, pituitária, células pancreáticas), melanócitos e vários tipos

diferentes de células tumorais. O desenvolvimento dessas técnicas de cultura de tecidos

tem muito a contribuir com as duas principais linhas de pesquisa na área médica:

pesquisas sobre câncer e virologia, e no desenvolvimento da biotecnologia

(UNCHERN, 1999).

A história da medicina é repleta de relatos marcantes em como a descoberta de

produtos naturais causou um grande impacto no avanço da pesquisa de drogas para

terapia, permitindo a descoberta de substâncias com atividade antitumoral, por exemplo,

que nunca poderiam ter sido previstas sem estes estudos direcionados (SHEN, 2015).

Os produtos naturais têm sido o pilar da quimioterapia para o tratamento do câncer

nos últimos 30 anos, onde 70% das drogas anticâncer aprovadas pelo Food and Drug

Administration (agência de vigilância de drogas e alimentos nos EUA) podem ser

rastreadas de volta à sua origem até as plantas, tradicionalmente usadas como remédios

antigos para várias doenças. A identificação de substâncias bioativas de plantas

medicinais se tornou uma área de pesquisa altamente ativa. Este entusiasmo surgiu

devido aos tratamentos atuais para doenças malignas e inflamatórias estarem longe de

serem satisfatórias. A quimioterapia permanece como a principal estratégia como

15

tratamento ao câncer, mas os tratamentos são, em geral, cheios de diversas

complicações à saúde do paciente (BARBERENA et al., 2004; WONG, YUAN &

LUK, 2012).

2.3 FAMÍLIA IRIDACEAE JUSSEU

Dentre as famílias de monocotiledôneas de grande relevância medicinal

encontradas na floresta amazônica, destaca-se Iridaceae. A família Iridaceae é

pertencente à ordem Asparagales, monocotiledôneas petaloides, onde possui 2035

espécies distribuídas em 66 gêneros e 7 subfamílias (Isophysidoideae, Iridoideae,

Patersonioideae, Geosiridoideae, Aristeoideae, Nivenioideae e Crocoideae), sendo

destas subfamílias, Iridoideae a mais abundante na América do Sul e a única

representada nos Neotrópicos, como visto na figura 8 (GOLDBLATT & MANNING,

2008; STEVENS, 2008). O nome da família deriva do gênero Iris L., descrito pelo

botânico sueco Carolus Linnaeus em 1753, quando este fez referência à deusa grega

Íris, responsável por levar as mensagens do Olimpo à Terra através do arco íris cujas

cores estão presentes nas flores de muitas espécies deste gênero (MANNING, 2004).

Distribuída pelo mundo inteiro, esta família tem marcada concentração no sul

da África, além de ser amplamente distribuída nos Neotrópicos, desde o México,

América Central até a América do Sul, principalmente no Brasil. Iridaceae pode ser

reconhecida por suas folhas bifoliadas e isobifaciais, e suas grandes flores com tépalas

vistosas, três anteras, um estigma visível e complexo, e um ovário inferior (STEVENS,

2008).

Figura 8: Mapa de distribuição global de Iridaceae. Fonte: STEVENS, 2008.

16

No Brasil ocorrem 170 espécies (dentre as quais 80 são endêmicas), 18

subespécies e 1 variedade, pertencentes a 22 gêneros. Na Amazônia, ocorrem cerca de 4

gêneros, 4 espécies e 1 subespécie: Cipura paludosa Aubl., Eleutherine bulbosa (Mill.)

Urb., Ennealophus foliosus (Kunth) Ravenna, Ennealophus foliosus subsp. amazonicus

(N.E.Br.) Ravenna e Trimezia martinicencis (Jacq.) Herb. (EGGERS et al., 2013).

Muitas destas espécies ainda estão escassamente estudadas devido ao curto período de

floração, à fragilidade das flores e à dificuldade de preservação das características

morfológicas importantes para definição das espécies (EGGERS, 2008).

As espécies ocorrem em uma variedade de habitats, desde savanas, florestas com

secas sazonais, florestas tropicais, florestas secundárias e campos rupestres. Muitas

Iridáceas neotropicais são adaptadas para habitats com seca sazonal e algumas até

preferem ambientes secos nos quais seus sistemas subterrâneos possam permanecer

dormentes por um longo período (AVILA, 2012).

A família Iridaceae é constituída de plantas perenifólias ou ervas decíduas,

ocasionalmente arbustos com crescimento secundário anômalo (Klattia Baker, Nivenia

Vent., Witsenia Thunb.), raramente anuais (Sisyrinchium L.). São plantas que podem

possuir rizoma, cormo, bulbo ou quando arbustivas, um caule lenhoso. Apresentam

folhas basais ou caulinares, às vezes duas ou três inferiores sem lâmina, embainhando a

base do caule e sobressaindo-se um pouco do nível do solo, tal como catafilos. As

bainhas das folhas podem ser abertas ou fechadas. As folhas caulinares possuem

lâminas unifaciais, nervação paralela, com ou sem nervação central distinta

(GOLDBLATT, MANNING & RUDALL, 1998).

As flores são dispostas em inflorescências determinadas, monocásios do tipo

ripídio, frequentemente muito modificadas e, às vezes, reduzidas a uma flor solitária

terminal. São protegidas por brácteas (espatas), sendo geralmente pediceladas. As flores

são perfeitas e possuem simetria radial ou bilateral. Apresentam seis tépalas, as externas

às vezes diferenciadas das internas, livres ou conatas, imbricadas, petaloides, podendo

portar manchas. Os estames são tipicamente em número de três, opostos às tépalas

externas, com filetes livres ou conatos, às vezes adnatos ao perianto; anteras livres ou às

vezes adnatas aos ramos do estilete. Os grãos de pólen são geralmente monossulcados.

O gineceu apresenta três carpelos conatos e o ovário é geralmente ínfero com

placentação axial. Os ramos do estilete podem ser expandidos e petaloides, com dois ou

17

três estigmas terminais, ou também, presentes na superfície abaxial dos ramos do

estilete. Os óvulos podem ser poucos a numerosos, anátropos ou campilótropos. As

flores podem apresentar nectários nos septos do ovário ou nas tépalas. O fruto é uma

cápsula loculicida, podendo apresentar sementes ariladas ou com uma testa carnosa. As

principais sinapomorfias em Iridaceae são: i) folhas isobilaterais e unifaciais com

lâminas orientadas no mesmo plano, dispostas em leque; ii) presença de cristais

prismáticos de oxalato de cálcio, denominados estiloides, nas bainhas dos feixes

vasculares (ocasionalmente ausentes); iii) inflorescências determinadas tipo ripídio e iv)

três estames (GOLDBLATT et al., 2008; JUDD et al., 2009).

A família Iridaceae apresenta uma ampla gama de flavonoides quando

comparados a outras famílias de monocotiledôneas petaloides, além de apresentar

também aminoácidos livres e peptídeos. Como constituintes químicos comuns, são

encontrados flavonóis O-glicosilados e flavonas C-glicosiladas, sendo que algumas

espécies do gênero Pillansia apresentam um flavonol sulfatado, o qual é único nas

Iridaceas (GOLDBLATT, 1990). Além disso, em monocotiledôneas, poucas famílias

(apenas 6 têm sido registradas) parecem ser capazes de produzir isoflavonoides. Esta

família é a maior fonte de isoflavonoides nesse grupo, com mais de 50 compostos

diferentes, principalmente no gênero Iris onde eles estão presentes no rizoma de

aproximadamente 20 espécies (HANAWA, TAHARA & MIZUTANI, 1991).

Certas espécies da sub-família Nivenioideae apresentam uma predominância de

flavonóis O-glicosilados, incluindo derivados de myricertina e alguns traços de flavonas

C-glicosiladas. As espécies das tribos Sisyrinchieae, Mariacea e Tigridieae não

apresentam estes flavonóis. As sub-famílias Iridoideae e Ixioideae apresentam com

freqüência, mas não de modo universal, o acúmulo da xantona mangiferina C-

glicosilada (GOLDBLATT, 1990).

Outros grupos de metabólitos secundários encontrados na família são saponinas,

frutanos, amino ácidos não-proteicos, esteroides e bufadienolideos. Dentro desta riqueza

de metabólitos, alguns se destacam por suas importâncias econômicas, como por

exemplo, os isolados de Iris florentina L., α-irona e iridina, ambos usados na

perfumaria, sendo o primeiro um sesquiterpeno visado por sua fragrância similar de

flores de violetas, e o segundo uma isoflavona que constitui a maior parte da

composição química do rizoma desta espécie. Outro exemplo seria o pigmento croceína

18

oriundo da espécie Crocus sativus L., popularmente conhecido como açafrão

verdadeiro, usado como corante alimentar (HARBORNE & WILLIAMS, 2000).

Dentro de Iridaceae, destaca-se o gênero Eleutherine, nativo da região

amazônica, e hoje cultivado e naturalizado através do mundo, e que contém uma espécie

considerada um elemento importante da farmacopeia indígena americana e um das

poucas iridáceas neotropicais com conhecidos usos medicinais (GOLDBLATT &

SNOW, 1991).

2.4 Eleutherine Herbert

Pertencente à família Iridaceae, subfamília Iridoideae e tribo Tigridieae,

Eleutherine é um gênero de plantas bulbosas e nativas da América. O gênero é

composto por quatro espécies caracterizadas por terem uma grande folha caulinar

subapical e flores brancas, estreladas, pequenas, com abertura ao anoitecer. As espécies

pertencentes a este gênero são: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., distribuída pela

América do Sul e amplamente cultivada por suas propriedades medicinais, Eleutherine

latifolia (Standl. & L.O. Williams) Ravenna, distribuída em regiões tropicais da

América do Sul e Central, Eleutherine citriodora (Ravenna) Ravenna, do norte da

Argentina, e por último Eleutherine angusta Ravenna, distribuída pelo Paraguai e no

Brasil, na região do Mato Grosso do Sul (RAVENNA, 1984; RAVENNA, 2003;

GOLDBLATT & SNOW, 1991).

O gênero possui uma distribuição que abrange desde a América do Sul Tropical,

através da América Central até o México e nas Índias Ocidentais (AVILA, 2012).

Ainda, de acordo com Goldblatt & Snow (1991), são cultivadas, e agora naturalizadas,

na África e Ásia, especialmente nas Filipinas e Indochina.

No Brasil, de acordo com Chukr (2010), ocorre apenas a espécie Eleutherine

bulbosa, distribuída na Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica, e conhecida também por

doze sinônimos botânicos: basiônimo Sisyrinchium bulbosum Mill., heterotípicos

Cipura plicata (Sw.) Griseb., Eleutherine americana (Aubl.) Merr. Ex K. Heyne,

Eleutherine angusta Ravenna, Eleutherine anomala Herb., Eleutherine longifolia

Gagnep., Eleutherine plicata (Sw.) Herb., Eleutherine subaphylla Gagnep., Galatea

19

Americana (Aubl.) Kuntze, Galatea plicata (Sw.) Baker, Galatea vespertina Salisb. e

homotípico Galatea bulbosa (Mill.) Britton.

Munõz e colaboradores (2000), em seu estudo com plantas medicinais da

amazônia boliviana, revelou potencial antimalárico dos extratos de Eleutherine

citriodora de todas as partes da planta, utilizada pela tribo de índios Mosetene para

tratamento de anemia, disenteria, feridas e corrimento vaginal.

Não foram encontrados estudos fitoquímicos ou usos medicinais pelo homem de

Eleutherine latifolia, corroborando com a afirmação de Goldblatt & Snow (1991) sobre

não haver registros de usos pelo homem desta espécie, e o mesmo vale para a espécie

Eleutherine angusta.

2.5 Eleutherine bulbosa (Miller) Urb.

Conhecida como coquinho, marupari, marupazinho, palmeirinha, marupá-

piranga, lírio-folha-de-palmeira e wá-ro, Eleutherine bulbosa é uma planta herbácea,

bulbosa e rizomatosa, acaule, entourecida, de 20-30 cm de altura, nativa da América

tropical, incluindo os campos secos da Amazônia brasileira. Os bulbos apresentam

escamas semelhantes à cebola, de coloração vinho e exsudando látex branco quando

cortados. Caracterizam-se por folhas simples, inteiras, plissadas longitudinalmente, de

cerca de 25 cm de comprimento. Flores brancas ou rosadas, dispostas numa panícula

ampla no ápice de um longo escapo rígido acima da folhagem, que se abrem apenas ao

pôr do sol (figura 9). Multiplica-se facilmente por bulbos, tornando-se persistente em

muitas áreas a ponto de ser considerada “planta daninha”. É amplamente utilizada na

medicina caseira na Amazônia, usada para o tratamento de diarreia e amebíase, tomando

chá preparado a partir do bulbo (ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1992). Nas regiões

Sul e Sudeste a parte aérea se perde durante o inverno e no Nordeste forma touceiras

decumbentes (figura 10) (LORENZI & MATOS, 2008).

20

Diversos estudos revelaram o uso medicinal popular e os constituintes químicos

desta espécie e de suas sinonímias:

Brasileiro e colaboradores (2006) realizaram triagem de atividade

microbiológica e citotóxica sobre plantas utilizadas na medicina tradicional da cidade de

Governador Valadares-MG, e mostraram que o extrato etanólico de Eleutherine bulbosa

(Mill.) Urb. (espécie utilizada como purgante e anti-cancerígeno por seus habitantes),

preparado a partir das folhas e bulbo desta planta, inibiu o crescimento de cepas de

Staphylococcus aureus e apresentou toxidade sobre larvas de Artemia salina.

Vásquez, Mendonça & Noda (2014) registraram o uso de Eleutherine bulbosa

para o tratamento de diarreia e dor de estômago em comunidades ribeirinhas de

Manacapuru no Estado do Amazonas.

Martins e colaboradores (2005) registraram usos de Eleutherine plicata pela

medicina tradicional para o tratamento de dor de estômago, cólicas, diarreia e amebíase.

Figura 10: Flores, bulbo e espécie cultivada numa horta doméstica no interior de São Paulo Fonte: LORENZI & MATOS, 2008

Figura 9: Morfologia de Eleutherine bulbosa Fonte: GOLDBLATT & SNOW, 1991

21

Shibuya e colaboradores (1997) isolaram três glicosídeos aromáticos dos bulbos

de Eleutherine palmifolia, parte da planta usada na medicina tradicional da Indonésia

para o tratamento de câncer.

Ribeiro (2008) avaliou o potencial antimicrobiano do extrato etanólico seco das

folhas frescas e bulbo de Eleutherine plicata, revelando potencial de inibição do

crescimento de Staphyloccoccus aureus.

Alves, Kloos & Zani (2003) isolaram a eleuterinona, uma naftoquinona isolada

do extrato diclorometânico de Eleutherine bulbosa, que apresentou atividade

antifúngica.

Nascimento e colaboradores (2012) revelaram atividade da isoeleuterina contra

Entamoeba histolytica e Entamoeba díspar isolada do extrato aquoso dos bulbos de

Eleutherine plicata.

Compostos principais da espécie e sinonímias (Figuras 11-15) como eleuterol,

isoeleuterol, eleuterina, isoeleuterina (HARA et al., 1997) e hongconin

(ZHENGXIONG et al., 1986), além de seus derivados como a eleuterinona (KOMURA

et al., 1983; ALVES, KLOOS & ZANI, 2003) e seus glicosídeos (SHIBUYA et al.,

1997), já foram isolados e identificados dos bulbos de plantas pertencentes a esse

gênero e muitos destes compostos apresentam importante atividade biológica,

observando-se ao mesmo tempo, uma predominância de quinonas (quadro 01).

22

Quadro 01: Compostos químicos e atividades biológicas de alguns constituintes

químicos isolados de Eleutherine e sinonímias.

SUBSTÂNCIA ISOLADA E ESPÉCIE

VEGETAL ATIVIDADE BIOLÓGICA

Eleuterina (Figura 11):

Eleutherine bulbosa, (BIANCHI & CERIOTTI, 1975)

Eleutherine americana, (KOMURA et al., 1983)

Inibição de TOPO II (HARA et al., 1997), atividade

contra C. sphaerospermum, (ALVES, KLOOS & ZANI,

2003).

Isoeleuterina (Figura 12):

Eleutherine americana, (KOMURA et al., 1983)

Inibição da atividade de replicação do HIV em linfócitos

(HARA et al., 1997).

Isoeleuterol (Figura 13):

Eleutherine americana, (HARA et al., 1997)

Inibição da atividade de replicação do

HIV em linfócitos (HARA et al., 1997)

Eleuterinona (Figura 14):

Eleutherine bulbosa, (ALVES, KLOOS & ZANI, 2003)

Atividade contra C. sphaerospermum, (ALVES, KLOOS &

ZANI, 2003).

Hongconin (Figura 15):

Eleutherine americana, (ZHENGXIONG et al., 1986) Inibição da atividade da NOs, (HAN et al., 2008)

Figura 11: Eleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997).

Figura 12: Isoeleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997).

Figura 14: Eleuterinona Fonte: Adaptado de Alves, Kloos & Zani (2003).

Figura 15: Hongconin Fonte: Adaptado de Zhengxiong et al. (1986)

Figura 13: Isoeleuterol Fonte: Adaptado de Insanu et al. (2014).

OCH3 OH

OH

O

CH3

CH3

OH

O

OCH3 OH HCH3

O

O

O

O

CH3

H

H

CH3

OCH3

O

OCH3 O

O

CH3H

CH3

H

O

CH3

O

O

OCH3

23

Foram também realizados ensaios microbianos em alguns estudos com

Eleutherine bulbosa e espécies do gênero, onde foram observados resultados positivos

contra diversos tipos de microrganismos de importância médica (ALVES, KLOOS &

ZANI, 2003; BRASILEIRO et al., 2006; RIBEIRO, 2008; IFESAN et al., 2009a;

IFESAN et al., 2009b).

A espécie Eleutherine bulbosa se mostrou muito promissora para estudos

farmacológicos e fitoquímicos, pelo seu vasto potencial terapêutico já comprovado em

pesquisas mencionadas neste estudo. Porém, apesar de já existirem diversos estudos

realizados com a espécie e suas sinonímias, poucos são os estudos realizados com

espécies da Amazônia brasileira (MALHEIROS, MELLO & BARBOSA, 2015);

RIBEIRO, 2008; NASCIMENTO et al., 2012).

A pesquisa fitoquímica continua a contribuir significativamente para a geração

de conhecimento referente à diversidade de compostos naturais de plantas, bem como a

crescente descoberta de possíveis fármacos naturais. Além disso, essa linha de pesquisa

enriquece o conhecimento do perfil metabólico de plantas e contribui para programas

com foco em conservação da biodiversidade, através do reconhecimento do potencial e

diversidade química de espécies de plantas endêmicas raras ou ameaçadas de extinção.

Ainda, existem estudos fitoquímicos que oferecem dados importantes para estudos

quimiotaxonômicos objetivando a classificação de plantas baseado na sua composição

química, sendo de grande ajuda para taxonomistas, fitoquímicos e farmacologistas na

solução de problemas taxonômicos. Bancos de dados contendo dados de Ressonância

Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de massas e de cromatografia, são

normalmente a principal fonte de informação para referenciar as substâncias, bem

como as técnicas mais eficientes na descoberta dos mesmos (COLEY et al., 2003;

SINGH, 2016; SKIRYCZ et al., 2016).

Registros de estudos etnobotânicos revelam o amplo uso de Eleutherine bulbosa

na medicina popular no combate à doenças do trato digestivo, como diarreia, dor de

estômago, entre outros (VÁSQUEZ, MENDONÇA & NODA, 2014; OLIVEIRA

NETO et al., 2007; MARTINS et al., 2005). Ainda, não há relatos de estudos com esta

espécie que tenham realizado testes antimicrobianos contra Salmonella enteritidis,

24

bactéria responsável por causar problemas graves de diarreia no mundo inteiro

(O’RYAN, PRADO & PICKERING, 2005; OYOFO et al., 2002).

Recentemente, Insanu, Kusmardiyani & Hartati (2014) realizaram uma revisão

de literatura sobre todas as substâncias isoladas, os respectivos usos e potenciais

farmacológicos de Eleutherine americana, sinonímia de Eleutherine bulbosa originária

da Ásia. Neste estudo, eles relataram que até hoje foram isoladas cerca de 34

substâncias, onde a maior parte delas apresentaram variados potenciais farmacológicos

como antimicrobiano, anti-inflamatório, antiviral, antidiabético, anti-hipertensivo, anti-

dermatófito, antimelanogênese e citotóxico.

A composição química das plantas pode variar de acordo com diversos fatores

ambientais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Sabendo disso, existe a possibilidade de

o indivíduo da espécie do estudo em questão, coletado na Amazônia Brasileira,

apresentar novos compostos químicos além dos já isolados em diversos trabalhos

realizados até hoje com espécies nativas e cultivadas/naturalizadas em outros

continentes, e, ainda, podendo apresentar diferentes potenciais biológicos. Com isso,

faz-se necessário um estudo mais profundo para elucidar as estruturas químicas

responsáveis por esse potencial medicinal.

O estudo fitoquímico de Eleutherine bulbosa pode fornecer informações que

possam contribuir com trabalhos de quimiotaxonomia dentro do gênero Eleutherine,

visto o grande número de estudos realizados na área de fitoquímica e sistemática sobre

família e gênero (GOLDBLATT, 1990; GOLDBLATT & SNOW, 1991; WILLIAMS,

HARBORNE & GOLDBLATT, 1986; WILLIAMS & HARBORNE, 1985;

NØRBAEK & KONDO, 1998; NØRBAEK, NIELSEN & KONDO, 1999).

25

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Realizar a análise fitoquímica e avaliar os extratos de Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.

quanto ao potencial antioxidante, antibacteriano e tóxico.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Caracterizar classes de substâncias químicas presentes nos extratos de Eleutherine

bulbosa através de técnicas cromatográficas;

- Avaliar o potencial tóxico e citotóxico de extratos, frações e substâncias isoladas

através de ensaios com Artemia salina e atividade antitumoral;

- Avaliar o potencial antioxidante dos extratos, frações e substâncias isoladas;

- Avaliar os extratos quanto ao potencial antibacteriano contra Aeromonas hydrophila,

Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,

Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae, Enterobacter clocae, Morganella morganii, Propionibacterium acnes,

Yersinia enterocolitica, Enterococcus faecalis e Acinetobacter baumanii;

- Fracionar, isolar e identificar as substâncias majoritárias presentes nos extratos que

tenham atividade biológica.

26

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 COLETA DO MATERIAL, PREPARO E SELEÇÃO DOS EXTRATOS

A coleta do material vegetal foi realizada na Volta Grande do Xingu (Jurucuá),

no município de Altamira, PA em 11/11/2008 (Figura 16a). A exsicata depositada no

herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA sob o nº 259.172

(Figura 16b).

As folhas, flores e bulbo de indivíduos da espécie Eleutherine bulbosa foram

secos em temperatura ambiente e posteriormente moídas em moinho de facas Tecnal,

modelo Willye TE-650. Cerca de 156,21 g de bulbos secos, 20,46 g de folhas secas e

2,15 g de flores secas foram submetidos à extração com hexano ou diclorometano

(DCM), metanol (MeOH) e H2O. Foram realizadas três extrações com cada solvente,

utilizando um banho de ultrassom por 20 minutos em cada extração. Após o banho de

ultrassom, o material foi filtrado. Os extratos hexânicos, diclorometânicos e metanólicos

Figura 16 – (a) Eleutherine bulbosa coletada no município de Altamira, PA. (b) Exsicata fértil depositada no herbário do INPA, Manaus, AM.

a b

27

foram concentrados em rotaevaporador, e os aquosos em liofilizador. Para a evaporação

dos solventes, foi utilizado evaporador rotativo a vácuo (FISATOM) (figura 17).

A seleção do extrato fracionado neste estudo foi realizada levando em

consideração ensaios de toxidade previamente realizados, análises de cromatografia em

camada delgada comparativa (CCDC) e literatura.

4.2 ANÁLISES, FRACIONAMENTOS CROMATOGRÁFICOS E ISOLAMENTO

4.2.1 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DOS EXTRATOS

Os solventes utilizados para partições, cromatografias em coluna aberta e

cromatografias em camada delgada possuem grau comercial de pureza, sendo

previamente destilados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia, Coordenação

de Tecnologia e Inovação, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

Figura 17: Fluxograma da preparação dos extratos de Eleutherine bulbosa

Material vegetal coletado de Eleutherine bulbosa

secagem, trituração e moagem

DCM ou HEX

Torta

MeOH Torta

1) Extração com DCM ou Hex usando ultrassom por 20 minutos

2) Filtração 3) Concentração

3x

1) Extração com MeOH usando ultrassom por 20 minutos


3x

H2O

resíduo

1) Extração com H

2O usando

ultrassom por 20 minutos


3xX

28

Para a Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC), foram

utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60, com indicador de fluorescência UV 254 nm,

com 0,20 mm de espessura (MACHEREY – NAGEL - MN). Para as revelações das

cromatofolhas foram utilizados: solução de sulfato de cério IV (VETEC), solução de

cloreto férrico (VETEC), solução de anisaldeído sulfúrico, vapores de Iodo, solução

metanólica de KOH a 10% e reagente de Dragendorff para a revelação de alcaloides,

com o intuito de realizar uma investigação fitoquímica completa (tabela 1). Também foi

utilizado irradiação no UV (254 e 365 nm). Esse procedimento visou escolher o melhor

sistema de eluição, para a realização dos fracionamentos cromatográficos, e a obtenção

do perfil químico preliminar da espécie. A aplicação das amostras nas cromatoplacas foi

realizada com o uso de tubos capilares de vidro de 75 mm de comprimento e diâmetro

interno e externo de 1,0 mm e 1,5 mm, respectivamente.

Tabela 1 – Reveladores químicos e físicos aplicados nas cromatoplacas de sílica como

método colorimétrico para revelar as diversas classes químicas presentes no extrato, de

acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984.

Reveladores Classes Químicas

Solução de Sulfato de Cério IV Terpenoides

Solução de Anisaldeído Sulfúrico Diversas classes químicas (açúcares, esteroides, terpenos)

Solução de Cloreto de Ferro III Substâncias fenólicas

Solução de Cloreto de Alumínio Alcaloides

Solução de DPPH Substâncias antioxidantes

Solução de Hidróxido de Potássio

10% em MeOH Quinonas e Antraquinonas

Solução de Dragendorff Alcaloides e outras substâncias nitrogenadas

UV 254 nm Derivados antraquinônicos, cumarinas, alcaloides

UV 365 nm Substâncias fenólicas, cumarinas, antraquinonas

29

4.2.2 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

Após a análise em CCDC, o extrato metanólico do bulbo foi submetido à

partição. Para tal procedimento, 10 g de extrato bruto metanólico foram solubilizados

em 500 mL de solução de MeOH e água destilada (7:3), transferidos para um funil de

separação de 2 L e extraídos pelo menos três vezes com 500 mL de cada um dos

solventes utilizados na partição, totalizando 1,5 L de cada solvente utilizado no

processo. A partição foi realizada com diclorometano (DCM) e acetato de etila

(AcOEt). Esse procedimento visou uma separação preliminar dos constituintes químicos

para facilitar o fracionamento cromatográfico do mesmo (Figura 18).

Extrato metanólico de Eleutherine bulbosa (10 g)

Extrato solubilizado

Fase DCM (3,139 g)

Fase Hidroalcoólica

Fase AcOEt (1,504 g)

Fase Hidroalcoólica (4 g)

Solução de MeOH e H2O destilada 7:3 (500 mL)

DCM (3X)

AcOEt (3X)

Fase DCM (Emulsão) (0,547 g)

Figura 18: Fluxograma da partição do extrato metanólico de Eleutherine bulbosa

30

4.2.3 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS E ISOLAMENTO

Para o fracionamento dos extratos, foram realizadas cromatografia em coluna

aberta, utilizando como fases estacionárias Sílica Gel e Florisil.

Após a partição do extrato metanólico do bulbo, ambas as fases DCM e AcOEt

foram analisadas por CCDC e posteriormente fracionadas, e suas frações também foram

submetidas a CCDC para o posterior refracionamento. As frações foram reveladas com

Vapores de Iodo, Anisaldeído Sulfúrico, Cloreto Férrico, Sulfato de Cério IV, Reagente

de Dragendorff e KOH 10%.

Fracionamento da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine

bulbosa:

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta com altura da

fase estacionária x diâmetro interno de 47 cm x 2 cm, Florisil como fase estacionária e

eluição com gradiente de sistemas DCM 100%, DCM/MeOH (95:5), DCM/MeOH

(9:1), DCM/MeOH (8:2), DCM/MeOH (7:3), DCM/MeOH (1:1) e MeOH 100%, fase

normal. A massa de amostra utilizada foi de 2 g para 100 g de Florisil, numa proporção

de 1g de amostra para 100g de Florisil (1:50), cada sistema de eluição consistiu em uma

quantidade de 400 mL. Foi preparada pastilha com Florisil para a inserção do material

na coluna. Foram recolhidas 70 frações com aproximadamente 27 mL cada, que foram

analisadas posteriormente por CCDC, reunidas, e analisadas novamente.

Fracionamento da fase AcOEt + fase DCM (emulsão) do extrato metanólico do

bulbo de Eleutherine bulbosa:

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro e sem

torneira, com altura da fase estacionária x diâmetro interno de 32 cm x 2,5 cm, Florisil

como fase estacionária e eluição com gradiente de sistemas DCM/MeOH (95:5),

DCM/MeOH (9:1), DCM/MeOH (8:2), DCM/MeOH (7:3), DCM/MeOH (1:1), MeOH

100%, MeOH/Acetona 1:1, Acetona/H2O 1:1 e H2O 100%, fase normal. A massa de

amostra utilizada foi de 1,35g para 68g de Florisil, numa proporção de 1 g de amostra

para 50 g de Florisil (1:50), cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de

120 mL. Foi preparada pastilha com Florisil para a inserção do material na coluna.

Foram recolhidas 86 frações com aproximadamento 27 mL cada, que foram analisadas

31

posteriormente por CCDC, reunidas, e analisadas novamente para posterior

refracionamento.

Fracionamento da fração 06 – 12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de

Eleutherine bulbosa:

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro com

torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 34 cm x 1,5 cm,

Sílica Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas Hex/DCM 6:4,

Hex/DCM 1:1, Hex/DCM 4:6, Hex/DCM 3:7, DCM 100 %, DCM/MeOH 99:1,

DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5 e DCM/MeOH 9:1,

DCM/MeOH 7:3 e MeOH 100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de

345,9 mg para 28 g de sílica, numa proporção de 1 g de amostra para 80 g de sílica

(1:80), e cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 150 mL. Foi

preparada pastilha com Sílica e amostra para a inserção da mesma na coluna. Foram

recolhidas 59 frações em frascos de aproximadamente 10 mL cada, que foram

analisadas posteriormente por CCDC.




torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 28 cm x 1 cm,

Síliga Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas DCM 100%,

DCM/MeOH 99:1, DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5,

DCM/MeOH 9:1, DCM/MeOH 8:2, DCM/MeOH 7:3, DCM/MeOH 1:1 e MeOH

100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de 150 mg para 12 g de Sílica,

numa proporção de 1g de amostra para 80g de sílica (1:80), e cada sistema de eluição

consistiu em uma quantidade de 48 mL. Foi preparada pastilha com Sílica e amostra

para a inserção da mesma na coluna. Foram recolhidas 47 frações em frascos de

aproximadamente 10 mL cada, que foram analisadas por CCDC.




torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 24,5 cm x 0,8 cm,

32

Sílica Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas DCM 100 %,

DCM/MeOH 99:1, DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5,

DCM/MeOH 9:1, DCM/MeOH 8:2, DCM/MeOH 7:3, DCM/MeOH 1:1 e MeOH

100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de 90,4 mg para 8 g de Sílica,

numa proporção de 1 g de amostra para 80 g de sílica (1:80), e cada sistema de eluição

consistiu em uma quantidade de 62 mL. Foi preparada pastilha com sílica e amostra

para inserção da mesma na coluna. Foram recolhidas 14 frações em frascos de

aproximadamente 27 mL cada, que foram analisados por CCDC.

As substâncias isoladas foram identificadas/elucidadas por Ressonância

Magnética Nuclear (RMN) de 1H e de 13C (mono e bidimensionais), e análise em

Espectrometria de Massas. As análises dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear

foram realizadas em equipamento de 300 MHz (BRUKER) e as de Massas por

Ionização por Eletrospray (ESI) em instrumento micrOTOF-Q (BRUKER).

O fluxograma geral de fracionamento e refracionamento dos extratos analisados

neste estudo, podem ser visualizados a seguir (Figura 19).

33

CCDC Cr-Bulbo

Frações reunidas Frações reunidas Frações reunidas

CC de Sílica CC de Sílica CC de Sílica

Figura 19: Fluxograma geral de fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa.

24 frações 10 frações 22 frações

Fr 07+08 Fr 34+35 Fr 29+30 Fr 01+02

Precipitação de cristais e lavagem com hexano

Fr 61+62 Fr 51-53 Fr 55-60

CCDC CCDC CCDC

Fr 06 - 12 Fr 14 - 20 Fr 21 - 38


Frações reunidas

Bulbo

Hexano MeOH

Partição

Fase DCM (emulsão)

Fase DCM

Fase AcOEt


CCDC CCDC

Frações reunidas

CC de Florisil

CC de Florisil

70 frações 86 frações


34



A avaliação da atividade antioxidante dos extratos (0,5 mg/mL) foi realizada

utilizando os ensaios quantitativos com o 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) e com o

complexo Fe3+/1,10-Fenantrolina 0,25%, e os resultados obtidos foram comparados em

termo de equivalência com os obtidos do padrão ácido ascórbico. A concentração

equivalente do ácido ascórbico foi obtida pela interpolação dos dados entre a variação

da absorbância e a concentração do ácido ascórbico representados em uma curva

analítica. Para a construção desta curva analítica foram preparadas em seis microtubos,

alíquotas diluídas do padrão ácido ascórbico. A quantificação foi realizada através da

leitura da absorbância em espectrofotômetro. Foram usados para a curva do DPPH 10

µL dessas alíquotas diluídas em seis novos microtubos, adicionando em seguida 990 µL

de DPPH para posteriormente serem submetidas à leitura em espectrofotômetro em um

comprimento de onda de 517 nm, por 30 minutos. Para a curva do Fe3+ foram utilizados

10 µL dessas alíquotas diluídas em seis novos microtubos também e então adicionado a

eles 10 µL de Fe3+ e 980 µL de 1,10-fenantrolina, 1 hora depois essas alíquotas foram

submetidas também a leitura em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 508

nm.

A solução do DPPH foi preparada no dia do experimento dissolvendo

aproximadamente 3 mg do reagente em 100 mL de metanol (30 µg/mL). O ácido

ascórbico foi preparado dissolvendo 44 mg do reagente em 50 mL de água deionizada

(44 µg/mL). Para o procedimento utilizando DPPH como agente oxidante, foram

adicionados 10 µL da solução do extrato e 990 µL da solução de DPPH, após 30

minutos foram realizadas a leitura em espectrofotômetro em um comprimento de onda

de 517 nm. O preparo do branco consistiu em adicionar 10 µL de água deionizada com

990 µL de DPPH. Para o procedimento usando Fe3+ como agente oxidante, foram

utilizados 10 µL de extrato acrescidos de 10 µL de uma solução padrão de Fe3+ e 980

µL de 1,10-fenantrolina. A leitura foi realizada após 1 hora em espectrofotômetro em

um comprimento de onda de 508 nm. O preparo do branco consistiu em adicionar 10 µL

de água deionizada, 10 µL da solução padrão de Fe3+ e 980 µL de 1,10-fenantrolina. Os

ensaios foram realizados em triplicata.

35


Neste estudo foram realizados ensaios microbianos para as seguintes bactérias:

Aeromonas hydrophila (ATCC 7966) Edwardsiella tarda (ATCC 15947), Escherichia

coli (ATCC 11775), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Serratia marcescens

(ATCC 13880), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Salmonella enteritidis (ATCC

13076), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Klebsiella pneumoniae (ATCC

13883), Enterobacter clocae (ATCC 13047) , Morganella morganii (ATCC 8019),

Propionibacterium acnes (ATCC 6919), Yersinia enterocolitica (ATCC 9610),

Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e Acinetobacter baumanii (ATCC 19606),

cedidas pela Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária –

CRMVS, FIOCRUZ-INCQS, Rio de Janeiro, RJ. Estas bactérias foram selecionadas por

serem considerados microrganismos patógenos humanos de alta significância médica

(CLARRIDGE et al., 1980; TURNBULL et al., 1979; TILDEN et al., 1996;

GERSHMAN et al., 2008; O’RYAN, PRADO & PICKERING, 2005; OYOFO et al.,

2002; TELZAK et al., 1990; MARAGAKIS et al., 2008).

A atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de microdiluição em caldo

segundo orientações propostas por CLSI (2002). Os extratos, fases e frações foram

primeiramente solubilizados em DMSO a 5%, em seguida, foram realizadas diluições

sucessivas dos extratos e fases a partir da concentração de 1000 μg/mL a 7,8 μg/mL, e

das substâncias a partir da concentração de 500 a 3,9 μg/mL.

Para a realização do ensaio, o inóculo foi previamente ajustado em

espectrofotômetro, obtendo-se uma absorbância de 0,08 em 625 nm (o que equivale à

escala 0,5 de Mc Farland), este então foi diluído 20 vezes. Assim, o volume final de

bactéria aplicado em cada poço foi de aproximadamente 5 x 104 UFC. Em seguida

foram adicionados em cada um dos poços (microplaca de 96 poços) 8 μL desta solução

de inóculo e 100 μL de cada concentração do extrato.

Para o controle negativo foram utilizados 100 μL de caldo Müeller Hinton

contendo 5% de DMSO e 8 μL de inóculo. Para o controle positivo foram utilizados 100

μL do antibiótico oxitetraciclina na concentração de 125 μg/mL e 8 μL de inóculo.

Todos os testes foram realizados em triplicata. Em seguida a placa foi incubada à

temperatura e tempo adequados para cada micro-organismo (30 ou 37 oC). Cada

36

microplaca foi avaliada através da leitura espectrofotométrica em 625 nm. Os dados

obtidos foram processados utilizando-se o programa estatístico Origin 8.

4.3.3 ENSAIO DE TOXICIDADE UTILIZANDO Artemia salina

O ensaio de atividade tóxica foi realizado de acordo com o desenvolvido por

Meyer e colaboradores (1982) com adaptações. Para uma triagem inicial, os extratos

foram testados, em triplicata, na concentração de 1000 µg/mL. Após esses resultados,

prosseguiu-se com o teste apenas com os extratos que foram ativos, ou seja,

apresentaram toxidade para mais de 50% dos indivíduos. Neste teste os ovos de Artemia

salina Leach foram eclodidos (náuplios) durante 48h em água do mar sintética (38 g/L

de sal marinho) sob aeração e iluminação artificial. Os extratos ativos foram testados

nas concentrações de 1000, 500, 250 e 125 µg/mL e solubilizados em DMSO 25%. Em

uma placa de 24 poços transferiu-se dez larvas para cada poço contendo os extratos.

Como controle negativo do teste utilizou-se DMSO 25% e solução salina. Após 24h sob

iluminação artificial mortos e realizou-se a contagem dos indivíduos mortos em cada

poço, o cálculo da média e desvio padrão da quantidade de indivíduos mortos, e as

médias apresentadas em porcentagem.

4.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL

4.3.4.1 Linhagens Celulares

Foram utilizadas linhagens de células neoplásicas: HCT116 (carninoma

colorretal humano), MCF-7 (carcinoma de mama), SK-Mel-28 (melanoma humano) e

uma linhagem não neoplásica: MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano). Estas foram

cultivadas em meio DMEM, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e 1% de

antibióticos, mantidas em estufa a 37ºC e atmosfera contendo 5% de CO2. As amostras

foram dissolvidas em DMSO na concentração estoque de 5 mg/mL paras as substâncias

isoladas e de 20 mg/mL para os extratos brutos, e posteriormente separadas para teste

nas concentrações de 50 µg/mL para extratos brutos e 20 µM para substâncias isoladas.

37

4.3.4.2 Teste do Alamar blue

O Alamar Blue é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades

redox, e em células em proliferação o Alamar Blue é reduzido. A forma oxidada é azul e

não fluorescente (indicando célula não viável) e a forma reduzida é rósea e fluorescente

(indicando célula viável).

O teste do Alamar Blue foi realizado conforme metodologia descrita por Ahmed

e colaboradores (1994) com o intuito de se analisar a viabilidade celular das células

testadas na presença de diferentes concentrações das substâncias e dos extratos testados.

Células cultivadas em garrafa de cultura com meio DMEM foram contadas em câmara

de Neubauer e plaqueadas em placas de 96 poços. A cada poço foram adicionadas 1 x

104 células em 200 µL de meio de cultura. A placa foi incubada por 24h em estufa a 37

oC com atmosfera de 5% de CO2. Após este tempo, as células foram tratadas por 72 h.

Como controle positivo, foi utilizada a Doxorrubicina a 5 μg/mL. O grupo controle

recebeu no poço a mesma quantidade de DMSO da maior concentração das substâncias

e extratos. Após 24 h de tratamento, 10 mL da solução de uso de Alamar Blue (solução

estoque a 0,4% 1:5 em meio de cultura sem soro fetal bovino) foi adicionada em cada

poço da placa. Após 3 h de exposição ao Alamar Blue, a placa foi retirada da estufa

meia hora antes do término e a fluorescência foi medida usando-se um leitor de placas

de Elisa (Beckman e Coulter®).

Os resultados foram analisados segundo suas médias e respectivos erros-padrão.

Seus respectivos desvios foram realizados a partir da regressão não-linear no

programa Graph Prism (versão 5).

38

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Obtenção dos extratos

Os extratos foram produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e

Biotecnologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (LABB – INPA) e

posteriormente submetidos a testes e análises. As massas obtidas da extração podem ser

visualizadas na tabela 2. As maiores massas de extrato obtido foram oriundas da

extração hexânica e metanólica do bulbo.

5.2 Análises Cromatográficas, Isolamento e Elucidação Estrutural

5.2.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e RMN

Todos os extratos brutos foram submetidos à análise de CCDC, a fim de obter-se

um perfil químico. Abaixo é descrita a análise de CCDC dos extratos selecionados para

fracionamento e de substâncias. As interpretações das revelações com CCDC foram

feitas de acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984.

5.2.1.1 Cristais do extrato bruto hexânico

Em análise visual do extrato, observou-se a presença de estruturas cristalinas à

parte do extrato bruto. Foi realizada uma lavagem com hexano para precipitação dos

cristais, onde estes foram separados e postos para secar em temperatura ambiente

Solvente utilizado e Rendimento (R)

Material

Vegetal

Massa

inicial (g) Hex (g) R (%) DCM (g) R (%) MeOH (g) R (%) H2O (g) R (%)

Folhas 20,46 - - 0,499 2,43 1,841 8,99 0,212 1,03

Flores 2,15 - - 0,072 3,34 0,245 11,39 0,295 13,72

Bulbos 156,21 1,954 1,25 - - 12,089 7,73 - -

Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos, produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI-INPA

39

(figura 20) obtendo-se uma amostra 50 mg de massa, posteriormente submetida à

análise de CCDC para verificar o grau de pureza da substância.

5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo

A substância em questão foi denominada CR-Bulbo até a sua

identificação. A análise de CCDC dos cristais revelou que a amostra encontrava-se em

mistura (figura 21). Puderam-se observar fluorescências persistentes em ambos os

comprimentos de onda do UV (254 nm e 365 nm, respectivamente), indicando a

possível presença de derivados antraquinônicos e substâncias fenólicas. A revelação

com anisaldeído indicou a possível presença de classes de terpenos, além de uma

Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa.

40

complexidade de substâncias que torna difícil inferir as possíveis classes de metabólitos

presentes na amostra. Na revelação com cloreto férrico, observou-se a presença de

substâncias aromáticas na amostra. O DPPH revelou a presença de substância com

potencial antioxidante. Já a revelação com Dragendorff não se mostrou positiva para a

presença de alcaloides, contudo, houve a aparição de uma mancha de cor preta na placa,

incomum para este revelador, e por isso não se pôde inferir a classe de metabólito que

causou essa reação. A revelação com KOH 10% revelou a forte presença de classes de

quinonas, representadas pelas manchas de cor vermelha e violeta. Na revelação com

vapores de iodo, foi revelada a presença de substâncias com duplas ligações em sua

estrutura. Por fim, na revelação com sulfato cérico, revelou manchas de cores

avermelhadas que são indicativas da presença de terpenos (mas não houve a revelação

de manchas roxas que são mais comuns para a presença de terpenos). E foram reveladas

manchas de cor verde, que não são características de nenhuma classe química

específica. A fluorescência de cor amarela na placa 2 é típica de classes como chalconas

e flavonoides, e quando revelada com DPPH, revela uma substância com potencial

antioxidante, característica comumente encontrada em substâncias fenólicas, o que

reforça a possibilidade de esta mancha ser uma substância fenólica. É interessante

ressaltar ainda que os cristais, quando testados no ensaio antioxidante, apresentaram

baixo potencial. Essa observação sugere que as substâncias fluorescentes apresentem

potencial antioxidante quando não estão em mistura, provavelmente por serem

compostos minoritários da amostra.

A análise em CCDC indica a presença de um constituinte majoritário, o qual

apresenta uma intensa absorção no comprimento de onda 254 nm, revelou com KOH e

com o vapor de iodo, sendo que tudo isso indica se tratar de uma substância aromática,

possivelmente da classe das antraquinonas.

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M]+ revelou íon pico

molecular majoritário de 273.11 m/z, correspondendo à fórmula molecular de C16H16O4.

No espectro de RMN de 1H (300 MHz) do CR-Bulbo (Figura 23), foram observados

sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 1,33 (3H, d, J = 6,05, 3H) e δ

1,51 (3H, d, J = 6,6, 3H), sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,17 (ddd, J = 18,25;

10,24; 3,8, 1H) e 2,72 (dt, J = 18,25; 2,5, 1H). O sinal de singleto em δ 3,97 (3H)

representa um sinal bem característico de metoxila, radical comumente presente nas

substâncias isoladas desta espécie. Os sinais em δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e

41

δ 7,68 (d, J = 7,54) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático. Por meio

das análises dos espectros de 13C (Figura 24) e HSQC (Figura 25), pôde-se definir que a

substância em questão possui três carbonos metílicos (CH3), sendo um ligado à oxigênio

(metoxila), um carbono metilênico (CH2), cinco carbonos metínicos e sete carbonos

quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.

No mapa de contorno COSY (Figura 26) e no mapa de contorno HMBC (Figura

27), pôde-se observar as correlações de carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos,

em específico as correlações entre os sinais δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e δ

7,68 (d, J = 7,54). Por estes dados (Tabela 3), e em comparação com dados da literatura

(HARA et al., 1997; KUSUMA et al., 2010; SHIBUYA et al., 1997), a substância CR-

Bulbo foi identificada como sendo a naftoquinona eleuterina em mistura (Figura 22).

A naftoquinona eleuterina já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em diversos

trabalhos, tornando ela um potencial marcador quimiotaxonômico da espécie. Ainda, ela

apresentou comprovados potenciais biológicos como antimicrobiano, antifúngico, ação

vaso dilatadora (útil para tratamento de doenças do coração) e inibição da

topoisomerase II humana (útil para inibição da replicação de células cancerígenas)

(HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI,

2012; PARAMAPOJN et al., 2008; ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006).

42

Tabela 3 - Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo.

Posição δ C DEPT 135o

δ H (mult., J (Hz)

COSY HMBC

1 70,19 CH 4,82 (m) H-Me-1 - 3 68,65 CH 3,55 (m) H-Me-3, H-4 -

4 29,82 CH2 2,72 (dt, J = 18,25; 2,5),

2,17 (ddd, J = 18,25, 10.4; 3,8) H-3, H-4 C-11, C-12

5 183,68 C - -

6 118,91 CH 7,68 (d, J = 7,54) H-7 C-8, C-14, C-5, C-10

7 134,50 CH 7,61 (t, J = 8,0) H-6, H-8 C-8, C-7, C-

13, C-9 8 117,69 CH 7,24 (d, J = 7,54) H-7 C-6, C-14

9 159,30 C - - -

10 183,95 C - - - 11 139,85 C - - - 12 148,60 C - - -

9 5

2 3 4

8 7 6

1

Figura 21 - Análise em CCDC do cristal originário do extrato hexânico do bulbo de E.

bulbosa. Eluição em Hex/Acetona (7:3). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – cloreto férrico; 5 – DPPH; 6 – Dragendorff; 7 – KOH 10 %; 8 – vapor de iodo; 9 – sulfato cérico.

43

13 134,66 C - - - 14 120,15 C - - -

Me-1 21,17 CH3 1,33 (d, J = 6,05) H-1 C-1

Me-3 20,70 CH3 1,51 (d, J = 6,6) H-3 C-3, C-12 Me-O 56,37 OCH3 3,97 (s) - C-9

Figura 22 – Estrutura da eleuterina e suas correlações no COSY e HMBC.

COSY

HMBC O

O

O

OCH3

H

HH H H

H CH3

CH3

H

1

345

6

7

8

9 1011

12

13

14

Me-O

Me-1

Me-3

Continuação da Tabela 3

44

Figura 23 – Espectro de RMN de 1H da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

45

Figura 24 – Espectro de RMN de 13C da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

46

Figura 25 – Mapa de contorno HSQC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

47

Figura 26 – Mapa de contorno COSY da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

48

Figura 27 – Mapa de contorno HMBC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

49

5.2.1.3 Fracionamento do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa

A análise por CCDC do extrato metanólico do bulbo mostrou, a princípio, conter

substâncias fenólicas e diferentes classes de terpenos (Figura 28). Na placa 1 e placa 2,

pode-se visualizar fluorescências persistentes de cor azulada em ambos os

comprimentos de onda, típico da presença de cumarinas. Na placa 3, os vapores de iodo

revelaram a presença de substâncias com ligações duplas conjugadas em suas estruturas,

típicos de substâncias fenólicas e seus derivados. Na placa 4, a revelação com cloreto

férrico mostrou no centro da placa uma coloração azulada, e no topo da placa uma

coloração vermelha-marrom, característicos de taninos, além de forte coloração negra

na origem, típica de substâncias aromáticas. Na placa 5, no topo da placa pode-se

visualizar na revelação com sulfato cérico, manchas roxas características de terpenos.

Na placa 6, a revelação com anisaldeído sulfúrico revelou manchas de cor roxa e

avermelhada, indicando a presença de diferentes classes de terpenos.

A análise por CCDC do extrato metanólico do bulbo revelou a presença de

classes de substâncias aromáticas, diferentes classes de terpenos, além de derivados

antraquinônicos. Posteriormente, esse extrato foi submetido à partição líquido-líquido,

para a melhor análise de seus componentes, e as fases analisadas por CCDC, como

indicado no fluxograma a seguir (Figura 29). As massas utilizadas posteriormente para

realizar o fracionamento são diferentes das obtidas, pois uma parte da massa de cada

fase obtida na partição foi separada e armazenada para eventuais testes e análises. A

fase AcOEt e a fase DCM (emulsão) foram unidas por apresentarem uma grande

similaridade na análise de CCDC, com isso, uma parte da amostra dessas fases unidas

também foi separada para eventuais análises. A fase hidroalcoólica foi analisada por

CCDC, porém, não foi fracionada, e com isso sua massa inicial se manteve. No final,

foi selecionada para fracionamento foram fase DCM (emulsão) + fase AcOEt (1,351 g)

e a fase DCM (2 g) (tabela 4).

50

1 2 3 4 5 6

Bulbo

Extrato MeOH

Partição

Fase DCM (emulsão) (0,547 g)

Fase DCM

(3,139 g)

Fase AcOEt

(1,504 g)


(4 g)

CCDC

Figura 29 – Fluxograma parcial do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa. Fases da partição líquido-líquido.

Figura 28 - Análise em CCDC do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH (9:1). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – cloreto férrico; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico.

51

Tabela 4 – Visão geral das massas obtidas pela partição do extrato metanólico do bulbo

de Eleutherine bulbosa, mostrando a massa inicial obtida de cada fase, o rendimento em

relação à massa do extrato bruto, a massa armazenada para eventuais análises e testes,

as fases unidas por semelhança na CCDC, e a massa final utilizada no fracionamento.

Fase

Massa

inicial

(g)

Rendimento em

relação à massa

do extrato bruto

(10 g) (%)

Massa

reserva para

eventuais

análises (g)

Massa final para

fracionamento (g)

Fase DCM (emulsão) 0,547 5,47% 0,200 0,347*

Fase DCM 3,139 31,39% 1,139 2

Fase AcOEt 1,504 15,04% 0,300 1,204*

Fase Hidroalcoólica** 4 40% 4 4

Fase DCM (emulsão) +

Fase AcOEt 1,551 - 0,200 1,351

5.2.1.4 Análise e Fracionamento das Fases da partição líquido-líquido

Todas as fases foram submetidas à análise por CCDC. A fase hidroalcoólica foi

analisada separadamente por apresentar um grau de polaridade mais alto em relação às

outras fases. A fase DCM (Emulsão) e a fase AcOEt apresentaram alta similaridade na

análise por CCDC, por isso, estas fases foram unidas e posteriormente fracionadas. A

análise por CCDC da fase DCM foi refeita com um sistema mais adequado e com mais

reveladores, para melhor visualizar as classes químicas presentes. A fase hidroalcoólica

não apresentou uma grande diversidade de classes químicas quando revelada com os

diversos reveladores, portanto, esta não foi fracionada.

A análise por CCDC das fases, no geral, indicou a presença de classes de

terpenos, flavonoides (na revelação com cloreto de alumínio) e antraquinonas. A fase

DCM (FD) e a fase DCM (emulsão) (FDE) + fase Acetato (FA) se mostraram as fases

mais interessantes, portanto, estas foram selecionadas para fracionamento.

*Massas de Fases posteriormente unidas

** Fase não fracionada

52

O fracionamento gerou 70 frações para a fase DCM (FD) e 86 frações para a

fase DCM (emulsão) (FDE) + fase Acetato (FA). As frações foram analisadas por

CCDC, e constatou-se que ainda se encontravam em considerável mistura. As frações

de ambas as colunas, que se mostraram semelhantes entre si na CCDC, foram reunidas,

reduzindo o número total de frações das duas fases para 28 frações e 18 frações,

respectivamente. Na análise por CCDC, a FD se mostrou mais interessante do que a

FDE + FA, por se mostrar mais diversa em relação às classes de metabólitos presentes,

por isso, o foco no fracionamento foi para a fase DCM. Das frações da fase DCM, 7

frações se destacaram na análise por CCDC por se mostrarem bem interessantes, e

destas, 3 foram mandadas para análise de RMN e 4 foram refracionadas por se

mostrarem ainda em grande mistura. As frações refracionadas foram analisadas por

CCDC, reunidas de acordo com a semelhança entre si, e as que se mostraram

interessantes foram mandadas para análise em RMN (figura 30).

No final, foram caracterizadas, em mistura, sete substâncias da fase DCM e

frações, denominadas: Fr 51-53 (FD) (42, 8 mg); Fr 55-60 (FD) (91,4 mg); Fr 61+62

(FD) (6,3 mg); Fr 01+02 (06-12) (19,5 mg); Fr 29+30 (06-12) (30 mg); Fr 34+35 (14-

20) (22,4 mg) e Fr 07+08 (21-38) (12 mg). No total, contando com a primeira

substância isolada do extrato hexânico, foram caracterizadas oito substâncias, contudo,

no tempo hábil do trabalho, apenas 5 foram elucidadas neste trabalho.

53

CCDC

Figura 30 – Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine

bulbosa. Fracionamento da FDE, da FD e o posterior fracionamento das frações da FD.

CCDC

Frações reunidas Frações reunidas Frações reunidas

CC de Sílica CC de Sílica CC de Sílica

18 frações

CCDC

CC de Florisil

CCDC

Frações reunidas

CC de Florisil


Fase DCM

Fase DCM (emulsão) + Fase AcOEt

28 frações

Frações reunidas

Fr 61+62 (6,3 mg)

Fr 51-53 (42,8 mg)

Fr 55-60 (91,4 mg)

CCDC CCDC CCDC

Fr 06 - 12 (346 mg)

Fr 14 – 20 (150 mg)

Fr 21 – 38 (90,4 mg)



Fr 07+08 (12 mg)

Fr 34+35 (22,4 mg)

Fr 29+30 (30 mg)

Fr 01+02 (19,5 mg)

CCDC

54

5.1.2.4 Análise das Frações da Fase DCM (FD)

5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD)

A análise por CCDC da fração Fr 51-53 (FD) apresentou fluorescências

persistentes em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e UV-365 nm, além de

forte revelação no iodo indicando substâncias com duplas ligações, corroborando com a

revelação com cloreto férrico, que indicou a presença de substâncias aromáticas. A

coloração roxa visualizada no anisaldeído indicaria a presença de terpenos, porém, a

revelação com sulfato cérico não apresentou indícios desta classe, não corroborando

então para o indício de terpenos nas frações. Por fim, a revelação com KOH 10%

demonstrou a presença de derivados de quinonas na amostra (Figura 31).

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H]+ revelou íon pico

molecular majoritário de 419.1337 m/z, com fórmula molecular de C21H23O9. No

espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 51-53 (Figura 33), foram observados

sinais típicos de hidrogênios de metilas na região entre δ 0,81 e δ 2,73, sinais de

hidrogênios de metilenos em δ 3,50 e 3,70 e sinais de metinos na região entre δ 3,24 e

3,38. O dupleto em δ 4,99 (1H, J = 7,26 Hz) demonstra a presença de hidrogênio

próximos à oxigênio. Na região entre δ 6,21 e 7,31, há sinais típicos de hidrogênios

ligados a anéis aromáticos. Os demais hidrogênios não foram considerados como sendo

da substância, tal como o sinal em δ 1,20, típico de metilas de graxas ou lipídios,

comumente isoladas de materiais extraídos com solventes mais apolares como hexano e

diclorometano.

Através das análises dos espectros de 13C (Figura 34) e DEPT 135o (Figura 35),

pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois carbonos metílicos

(CH3), um sinal de carbono metilênico (CH2), dez sinais carbonos metínicos e oito

sinais de carbonos quaternários (C), totalizando 21 carbonos na estrutura.

A análise das correlações observadas nos mapas de contorno COSY (Figura 36),

HSQC (Figura 37) e HMBC (Figura 38), permitiu correlacionar os deslocamentos

químicos que confirmaram a presença de anéis aromáticos na estrutura, além de

correlações que demonstraram a presença de hidrogênios típicos de açúcares, mais

especificamente da região entre δ 3,24 e 3,38 do espectro de 1H. Por estes dados (Tabela

55

6), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010), a substância Fr 51-

53 (FD) foi identificada como sendo o policetídeo eleuterinol-8-O-β-glicosídeo (Figura

32).

Esta substância foi previamente isolada por Gallo e colaboradores (2010),

tornando este o segundo relato de isolamento deste policetídeo na literatura. Ainda, não

há também relatos de ensaios biológicos com esta substância.

Posição δ C DEPT 135o δ H

(mult., J (Hz) COSY HMBC

2 163,86 C - - - 3 112,19 CH 6,21 (s) - C-2, C-4a 4 178,70 C - - -

Tabela 5 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo.

2 1 3 4

5 6 7

51-53 51-53 51-53 51-53

51-53 51-53 51-53

Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico

56

4a 117,10 CH - - - 5 134,64 C - - -

6 125,61 CH 7,31 (s) - C-10b, C-6a, C-4a, C-10a, C-9

6a 138,22 C - - -

7 103,31 CH 6,80 (d, J = 2,05) - C-8, C-10, C-10a,

C-9 8 158,59 C - - -

9 101,48 CH 6,90 (d, J = 2,05) - C-8, C-6, C-10a, C-7

10 156,82 C - - - 10a 108,78 C - - - 10b 156,47 C - - -

Me-2 19,58 CH3 2,38 (s) - -

Me-5 23,07 CH3 2,73 (s) - C-5, C-6, C-4a 1’ 100,01 CH 4,99 (d, J = 7,26) H-2’ C-8 2’ 73,29 CH 3,29 (m) H-1’ - 3’ 77,13 CH 3,38 (m) - - 4’ 69,66 CH 3,24 (m) - - 5’ 76,73 CH 3,31 (m) - - 6’ 60,64 CH2 3,5-3,70 (m) H-6’ -

2

3

4

4a

5

6

6a

10a

10

9

7

8

1’ 2’

3’

4’

5’

6’

10b

COSY

HMBC

O

O

CH3

H

CH3

H

H

H

OHO

O

OH

OH

OHH

H

OH H

H

Continuação da Tabela 5

Figura 32 – Estrutura do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC.

57

Figura 33 – Espectro de RMN de 1H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

58

Figura 34 – Espectro de RMN de 13C do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

59

Figura 35 – Espectro de DEPT 135o do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

60

Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

61

Figura 37 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

62

Figura 38 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

63

5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12)

A fração Fr 01+02, originária do refracionamento da fração 06-12 da fase DCM,

apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e

UV-365 nm, sugerindo a presença de derivados antraquinônicos e substâncias

aromáticas. Na revelação com anisaldeído sulfúrico, manchas de coloração esverdeada e

roxa sugerem a presença de classes de terpenos, incluindo os presentes em óleos

essenciais devido a coloração esverdeada. Na revelação com sulfato cérico, formas

circulares de coloração marrom revelaram-se ao redor das amostras, não podendo então

inferir o tipo de classe revelada através deste revelador. Na revelação com KOH 10%,

não houve revelação de quinonas para a fração 01+02, somente para as frações

posteriores, sendo representadas pelas colorações em vermelho e roxo. Na revelação

com o cloreto férrico não houve revelação de substâncias aromáticas para a fração

01+02, somente para as frações posteriores (Figura 39).

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H]+ revelou íon pico


espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 01+02 (06-12) (Figura 41), pôde-se

observar um dupleto em δ 1,74 (3H, J = 6,5) típico de hidrogênio de metila, além de um

forte sinal de singleto em δ 4,12, característico de metilas ligadas à oxigênio. Na região

entre δ 5,70 e 7,88, verificou-se a presença de sinais típicos de hidrogênios ligados a

carbonos de anéis aromáticos.

Através das análises dos espectros de 13C (Figura 42), DEPT 135o (Figura 43) e

HSQC (Figura 44), pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois

carbonos metílicos (CH3), cinco sinais carbonos metínicos (CH2) e 7 sinais de carbonos

quaternários (C), totalizando 14 carbonos na estrutura. A ausência de carbonos

metilênicos sugere uma estrutura química composta de anéis aromáticos onde

predomina-se a presença de metinos na estrutura.

No mapa de contorno do COSY (Figura 45) e no mapa de contorno do HMBC

(Figura 46), pôde-se correlacionar os deslocamentos químicos que confirmaram a

presença de anéis aromáticos na estrutura, além de correlações que demonstraram

carbonos quaternários ligados a oxigênio, como o carbono 1 no sinal em δ 170,60, o que

justifica seu deslocamento elevado. Por estes dados (Tabela 7), e em comparação com

dados da literatura (IEYAMA, GUNAWAN-PUTERI & KAWABATA, 2011;

01+02

64

SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 01+02 (06-12) foi identificada como sendo o

naftaleno eleuterol (Figura 40).

Esta substância é comumente isolada nesta espécie e suas sinonímias ao redor do

mundo, tendo sido isolada em diversos outros trabalhos já publicados, com

comprovadas atividades biológicas como antifúngico e estimulante da circulação

sanguínea (BIANCHI & CERIOTTI, 1975; HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983;

ZHENGXIONG et al., 1986).

1 2 3

4 5 6

Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico

65

Posição δ C DEPT 135 δ H


1 170,60 C - H - Me-3 - 3 77,41 CH 5,73 (q, J = 6,5) - Me-3, C-11, C-4, C-1 4 149,16 C - - - 5 156,56 C - - - 6 106,25 CH 6,93 (d, J = 7,6) H-7 C-12, C-8, C-5 7 126,60 CH 7,41 (t, J = 8,1) H-8, H-6 C-6, C-13, C-5

8 123,64 CH 7,57 (d, J = 8,2) H-7 C-6, C-9, C-12, C-13,

C-5

9 116,51 CH 7,88 (s) - C-13, C-8, C-4, C-12,

C-11 10 125,88 C - - 11 127,90 C - - 12 117,49 C - - 13 137,19 C - -

Me-3 19,16 CH3 1,74 (d, J = 6,5) H-1 C-3, C-11 Me-O 56,39 CH3 4,12 (s) - C-6, C-5 OH 149,16 C 9,65 (s) - C-12, C-11, C-4

Me-3

Me-O

9 8

7

6

5

4

3

1

10

11 12

13

COSY

HMBC

Tabela 6 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol.

O

CH3

H

OHHH

H

OCH3

OH

Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC.

66

Figura 41 – Espectro de RMN de 1H do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

67

Figura 42 – Espectro de RMN de 13C do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

68

Figura 43 – Espectro de DEPT 135o do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

69

Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

70

Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

71

Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).

72



também apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-

254 e UV-365 nm, típicos de substâncias aromáticas, e cromóforos de coloração

amarela típicos de derivados antraquinônicos. No geral, esta fração apresentou classes

de substâncias como quinonas, representadas por manchas azuladas na revelação com

KOH 10%, classes de terpenos visto na revelação com anisaldeído sulfúrico

representados por manchas roxas e esverdeadas, porém não houve indícios de terpenos

na revelação com sulfato cérico. A revelação com cloreto férrico não apresentou

manchas típicas de substâncias aromáticas (escuras e marrons), apenas as manchas

amarelas persistentes da amostra.


molecular majoritário de 273.11 m/z, com fórmula molecular de C16H16O4. Os dados

espectrais desta substância possuem grande semelhança com a substância eleuterina, por

esta ser sua forma “iso”. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da Fr 29+30 (06-12)

(Figura 49), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ

1,34 (3H, d, J = 6,05) e δ 1,54 (3H, d, J = 6,71), onde comprova-se a diferença na

estrutura da eleuterina pela constante de acoplamento da metila em δ 1,54. Foi possível

visualizar também sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,23 (ddd, J = 19,0; 10,2;

1,8) e 2,69 (dd, J = 19,0; 3,3). O sinal de singleto em δ 4,01 (3H) representa um sinal

bem característico de metoxila. Os sinais em δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ

7,73 (dd, J = 8,0; 1,0) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático.

Através das análises dos espectros de 13C (Figura 50) e DEPT 135o (Figura 51) pôde-se

definir que a substância em questão possui três carbonos metílicos (CH3), sendo um

ligado à oxigênio (metoxila), um carbono metilênico (CH2), cinco carbonos metínicos e

sete carbonos quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.

Através das análises dos mapas de contorno COSY (Figura 52), HSQC (Figura

53) e no mapa de contorno HMBC (Figura 54), pôde-se observar as correlações de

carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos, em específico as correlações entre os

sinais δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0). Por estes dados

(Tabela 8), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010; HARA et

al., 1997; MALHEIROS, 2008; SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 29+30 (06-12)

73

foi identificada como sendo a naftoquinona (Figura 48), justificando o fato de sua

fórmula molecular e massa serem idênticas a da eleuterina.

A naftoquinona isoeleuterina, já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em

diversos trabalhos, sendo considerada como um dos importantes isoeleuterina

constituintes químicos do gênero. Ainda, ela apresentou comprovados potenciais

biológicos como antimicrobiano, antifúngico, antiamebiana, moduladora de respostas

imunes em células de camundongos, ação vaso dilatadora (útil para tratamento de

doenças do coração) e atividade inibitória da replicação do vírus HIV (HARA et al.,

1997; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI, 2012; PARAMAPOJN et al., 2008;

ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2012; HONG et

al., 2008).

29+30

29+30 29+30 29+30

29+30 29+30 1 2 3

4 5 6

Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico

74

Posição δ C DEPT

135 δ H


1 62,43 CH 3,98 (m) H-Me-1 Me-3, C-3, C-12, C-11

3 67,39 CH 5,01 (q, J = 6,5) H-4, H-Me-3

Me-3, C-1

4 29,48 CH2 2,23 (ddd, J = 19,0; 10,2; 1,8)

2,69 (dd, J = 19,0; 3,3) H-4, H-3

C-11, C-12, C-3, Me-3, C-5, Me-1

5 184,21 C - - - 6 119,06 CH 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0) H-8, H-7 C-5, C-8, C-14 7 134,73 CH 7,64 (t, J = 8,0) H-8, H-6 C-13, C-9

8 117,77 CH 7,28 (d, J = 8,0) H-7, H-6 C-6, C-14, C-9,

C-10 9 159,68 C - - -

10 182,73 C - - - 11 147,97 C - - - 12 139,35 C - - - 13 134,00 C - - - 14 119,64 C - - -

Me-1 19,75 CH3 1,54 (d, J = 6,71) H-1 C-11, C-1 Me-3 21,52 CH3 1,34 (d, J = 6,05) H-3 C-3, C-4 Me-O 56,44 CH3 4,01 (s) C-9

Tabela 7 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 29+30 (06-12), isoeleuterina.

Figura 48 – Estrutura da isoeleuterina e suas correlações no COSY e HMBC.

COSY

HMBC

O

O

OH H

CH3

H

H

CH3

OCH3

H

H

H

Me-1

Me-3

1

3

45

6

7

8

9 10

11

1213

14

Me-O

75

Figura 49 – Espectro de RMN de 1H da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

76

Figura 50 – Espectro de RMN de 13C da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

77

Figura 51 – Espectro de RMN de DEPT 135o da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

78

Figura 52 – Mapa de contorno COSY da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

79

Figura 53 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

80

Figura 54 – Mapa de contorno HMBC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).

81



também apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-

254 e UV-365 nm, típicos de substâncias aromáticas. No geral, esta fração apresentou

antronas e antranois no KOH 10% quando visualizada no UV-365, representadas pela

fluorescência amarela. Pode-se visualizar também classes de terpenos vistos na

revelação com anisaldeído sulfúrico representados por manchas roxas, porém não houve

indícios de terpenos na revelação com sulfato cérico. Por fim, a revelação com cloreto

férrico apresentou fraca revelação de substâncias aromáticas (Figura 55).



espectro de RMN de 1H (300 MHz) da Fr 34+35 (14-20) (Figura 57), foram observados

sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 2,37 (3H, s) e δ 2,70 (3H, s),

bem como sinais característicos de hidrogênios ligados a anéis aromáticos em δ 6,18 (s),

6,55 (d, J = 2,2), 6,58 (d, J = 2,2) e 7,19 (s). Foi possível visualizar também sinais de

hidrogênios bem desprotegidos em δ 10,11 (s) e 10,21 (s), característicos de hidroxilas

ligadas à anéis aromáticos. Através das análises dos espectros de 13C (Figura 58) e

DEPT 135o (Figura 59) pôde-se definir que a substância em questão possui dois

carbonos metílicos (CH3), quatro carbonos metínicos (CH) e nove carbonos

quaternários (C), totalizando 15 carbonos na estrutura.

Através das análises dos mapas de contorno COSY (Figura 60), HSQC (Figura

61) e no mapa de contorno HMBC (Figura 62), pôde-se observar as correlações de

carbono e hidrogênio que possibilitaram a interpretação da estrutura, como por

exemplo, as correlações dos hidrogênios em δ 10,11 (s) e 10,21 (s) com os carbonos

ligados aos hidrogênios em δ 6,18 (s), 6,55 (d, J = 2,2), 6,58 (d, J = 2,2) e 7,19 (s),

comprovando a proximidade entre eles e a formação de um padrão de interação cíclico.

Por estes dados (Tabela 8), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al.,

2010; HAN et al., 2008), a substância Fr 34+35 (14-20) foi identificada como sendo a

naftopirona eleuterinol (Figura 56).

82

Eleuterinol já foi isolada em pesquisas anteriores (GALLO et al., 2008; HAN et

al., 2008) dos bulbos de E. bulbosa e sua sinonímia E. americana, e poucos estudos

averiguando os diversos potenciais desta substância foram realizados até hoje, onde, um

dos poucos, realizado por Hong e colaboradores (2008), revelaram o potencial inibitório

do eleuterinol frente à células Th do sistema imune através da inibição da transcrição

genética das mesmas, e tal potencial pode ser de grande relevância na aplicação em

ensaios anti-tumorais e anti-microbianos.

34+35 34+35

34+35

Figura 55 - Análise em CCDC da Fração Fr 34+35 do fracionamento da fração Fr 14-20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – cloreto férrico; 6 – KOH 10 %; 7 – KOH 10% (UV – 365)

1 2 3

4 5 6 7

83

Posição δ C DEPT

135 δ H


2 163,61 C - -

3 112,10 CH 6,18 (s) H-Me-2 C-4, C-2, C-4a,

Me-2 4 178,69 C - - - 4a 116,28 C - - - 5 134,44 C - - -

6 124,88 CH 7,19 (s) H-Me-5 C-7, C10a, C-4a, C-6a, C-10b, Me-

5 6a 138,73 C - - -

7 101,26 CH 6,58 (d, J = 2,2) - C-9, C-10a, C-6,

C-6a, C-8 8 159,30 C - - -

9 102,98 CH 6,55 (d, J = 2,2) - C-7, C-10b, C-10,

C-8, C-10a 10 156,91 C - - - 10a 107,19 C - - - 10b 156,81 C - - -

Me-2 19,56 CH3 2,37 (s) H-3 C-2, C-10b, C-3

Me-5 23,11 CH3 2,70 (s) H-6 C-4, C-10b, C-5, C-6, C-4a

O

O

CH3

H

CH3

HH

OH

H

OH2

3

4

5

67

8

910

10a

10b

4a

6a

Me-2

Me-5

Tabela 8 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 34+35 (14-20), eleuterinol.

Figura 56 – Estrutura do eleuterinol e suas correlações no COSY e HMBC.

COSY

HMBC

84

Figura 57 – Espectro de RMN de 1H do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

85

Figura 58 – Espectro de RMN de 13C do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

86

Figura 59 – Espectro de RMN de DEPT 135o do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

87

Figura 60 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

88

Figura 61 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

89

Figura 62 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

90



Os resultados da atividade antioxidante de todos os extratos estão presentes nas

tabelas a seguir. A equivalência de cada resultado é comparada com os valores de

equivalência do Ácido Ascórbico (AA). Os extratos foram testados utilizando duas

metodologias, DPPH e Fe3+/Fenantrolina, para que se tenha uma confiabilidade maior

dos dados.

Tabela 9 – Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da

naftoquinona eleuterina, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa

utilizando o método com DPPH, mostrando valores de absorbância, equivalência do

ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios padrão.

Extrato ou substância

testada |ABS517| [AA]eq Equivalência

Eleuterina -0,005±0,009 0,034±0,069 12,543±118,837

Bulbo_Hexano 0,031±0,015 0,323±0,117 17,159±7,027

Bulbo_MeOH 0,033±0,007 0,344±0,056 14,762±2,183

Flor_DCM -0,014±0,006 0,033±0,050 125,827±531,410

Folha_DCM -0,002±0,011 0,063±0,085 1414,472±2617,595

Flor_MeOH 0,059±0,006 0,550±0,047 9,132±0,817

Folha_MeOH 0,089±0,017 0,791±0,138 6,441±1,052

Folha_H2O 0,039±0,001 0,392±0,008 12,746±0,261

Flor_H2O 0,057±0,002 0,532±0,017 9,412±0,300

91

Tabela 10 - Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da

naftoquinona eleuterina, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa

utilizando o método com Fe3+/Fenantrolina. mostrando valores de absorbância,

equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos

desvios padrão.

Extrato ou substância

testada [Fe2+] [AA]eq Equivalência

Eleuterina 0,040±0,017 -0,040±0,029 -164,602±83,380

Bulbo_Hexano 0,097±0,038 0,186±0,063 29,449±11,626

Bulbo_MeOH 0,213±0,028 0,377±0,046 13,414±1,742

Flor_DCM 0,086±0,027 -0,115±0,044 -47,610±15,747

Folha_DCM 0,015±0,018 0,001±0,030 -262,581±434,764

Flor_MeOH 0,370±0,003 0,636±0,005 7,861±0,059

Folha_MeOH 0,548±0,092 0,929±0,151 5,490±0,982

Folha_H2O 0,199±0,068 0,355±0,111 14,948±4,073

Flor_H2O 0,290±0,018 0,504±0,029 9,950±0,580

No geral, todos os extratos analisados apresentaram valores de equivalência

distantes dos do ácido ascórbico, tanto no teste com DPPH (Tabela 8) quanto no com

Fe3+/Fenantrolina (Tabela 9), portanto, não apresentaram atividade antioxidante

significativa. Na análise de CCDC dos extratos brutos do bulbo, a revelação com cloreto

férrico indicou a presença de substâncias aromáticas, porém, a falta de atividade

antioxidante indica que as substâncias aromáticas não são fenólicas.

Contudo, ao mesmo tempo a análise de CCDC revelou a forte presença de

quinonas através da revelação com KOH 10%, tal como a naftoquinona eleuterina

oriunda do extrato hexânico do bulbo, que são classes de metabólitos secundários

92

conhecidos por induzir o estresse oxidativo. Malheiros (2008) obteve resultados

semelhantes no teste antioxidante do extrato etanólico do bulbo de Eleutherine plicata

(coletada em Belém-PA), das naftoquinonas isoeleuterina e isoeleuterol, e sugere que a

presença de quinonas no extrato possa inibir a capacidade antioxidante das substâncias

fenólicas presentes, caso existam, o que justificaria o fraco potencial antioxidante destes

extratos e, claro, da naftoquinona eleuterina. Estudos feitos com Eleutherine bulbosa e

Eleutherine americana da Indonésia (KARMINI, YULIET & KHUMAIDI, 2014;

KUNTORINI & ASTUTI, 2010; KUNTORINI, 2013; SULASTRI & OKTAVIANI,

2015) mostraram resultados positivos quanto ao potencial antioxidante do extrato

etanólico do bulbo e das naftoquinonas isoladas, presentes no mesmo (elecanacina,

eleuterina, eleuterol, eleuterinona). Essa diferenciação no potencial antioxidante pode

ser devido a uma produção diferenciada dos metabólitos secundários em resposta a

estímulos ambientais dos diferentes biomas, podendo até mesmo aumentar ou diminuir

a concentração das substâncias antioxidantes.

O extrato metanólico das folhas foi o que apresentou, de todos os extratos, o

menor valor de equivalência, ainda sim, não foi considerada uma atividade antioxidante

relevante. O mesmo padrão de resultado se repetiu no teste com Fe3+/Fenantrolina,

corroborando com os dados obtidos no teste com o DPPH. Com isso, os extratos e a

naftoquinona eleuterina não apresentaram atividade antioxidante significativa.

93


Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato metanólico do bulbo e fase

DCM

O extrato metanólico do bulbo e a fase DCM, foram submetidos ao ensaio de

microdiluição em caldo, sendo testados para 14 bactérias. O extrato metanólico do

bulbo apresentou resultado positivo contra sete bactérias na concentração de 1000

µg/mL. Já a fase DCM apresentou atividade positiva contra onze bactérias na

concentração de 1000 µg/mL, e atividade contra S. aureus na concentração de 500

µg/mL.

Bactérias

Concentração mínima inibitória (MIC) em μg/mL

Extrato Bruto

Fase

Aeromonas hydrophila 1000 1000 Edwardsella tarda - -

Pseudomonas aeruginosa - 1000 Pseudomonas fluorescens 1000 1000

Salmonella enteritidis - 1000 Staphylococcus aureus 1000 500 Klebsiella pneumoniae 1000 1000

Enterobacter clocae - 1000 Serratia marcescens - - Morganella morganii 1000 1000

Propionibacterium acnes 1000 1000 Yersinia enterocolitica 1000 1000 Enterococcus faecalis - -

Acinetobacter baumanii - 1000 *O controle positivo utilizado foi oxitetraciclina a uma concentração de 125 μg/mL. Concentração dos extratos e das fases de 1000 µg/mL até 7,8 µg/mL

O extrato metanólico apresentou uma inibição significativa na concentração de

1000 µg/mL quando comparado com o controle positivo, e uma inibição de mais de

50% na concentração de 500 µg/mL frente à S. aureus, quando comparado com o

controle negativo (figura 63). Já a fase DCM apresentou uma atividade inibitória

significativa em ambas as concentrações de 1000 e 500 µg/mL (figura 64).

Tabela 11. Concentração inibitória mínima (MIC) para o extrato metanólico e a fase DCM oriundos do bulbo de Eleutherine bulbosa

94

Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa

frente a S. aureus.

Figura 64 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase DCM obtida do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus.

Bra

nco

Contr

ole

+

Contr

ole

-

1000

500

250

125

62,5

31,2

5

15,6

7,8

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

De

nsid

ad

e o

ptica

µg/mL

Bra

nco

Contr

ole

+

Contr

ole

-

1000

500

250

125

62,5

31,2

5

15,6

7,8

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

De

nsid

ad

e o

ptica

µg/mL

95

Com este resultado ficou clara a presença de substâncias com potenciais

antimicrobianos, e com isso, foi realizado o teste de CIM para as substâncias isoladas.

Concentração Inibitória Mínima (CIM) das substâncias isoladas

As sete substâncias isoladas da fase DCM do extrato metanólico do bulbo, bem

como a substância isolada do extrato hexânico do bulbo, foram submetidas ao teste de

CIM frente à todas as bactérias mencionadas. Para as substâncias, a concentração inicial

foi de 500 µg/mL sendo diluídas até 3,9 µg/mL.

No geral, de todas as substâncias testadas, apenas três delas apresentaram CIM

de pelo menos 50% de inibição, contra somente S. aureus e P. fluorescens, sendo estas

as frações 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina. Na fração 61+62 (FD) observou-se que

houve uma inibição de 49,68% na concentração de 500 µg/mL, contra P. fluorescens,

quando comparado com o crescimento do controle negativo (figura 65). Para o

eleuterol, observou-se que houve uma inibição de 51,59% na concentração de 500

µg/mL contra S. aureus (figura 66), e de 65,43% na concentração de 500 µg/mL, contra

P. fluorescens (figura 67). Já para a isoeleuterina, observou-se que houve uma inibição

de 49,13% na concentração de 500 µg/mL contra S. aureus (figura 68), quando

comparado com o crescimento do controle negativo, e de 81,23% na concentração de

500 µg/mL contra P. fluorescens (figura 69). Eleuterinol e isoeleuterina apresentaram

atividades semelhantes, com exceção do fato da isoeleuterina apresentar uma inibição

maior contra P. fluorescens.

Observou-se que eleuterina não demonstrou potencial antimicrobiano

significativo, ao contrário de isoeleuterina. Isto pode ser justificado pelo fato que as

atividades biológicas das naftoquinonas estão diretamente relacionadas com os seus

aspectos estruturais, sendo ativas ou inativas, por exemplo, pela simples retirada de um

metileno (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Com isso, é provável que a

mudança na posição do hidrogênio e da metila do C-3 da estrutura de ambos influencie

no potencial antimicrobiano.

96

Bra

nco

Contr

ole

+

Contr

ole

-

500

250

125

62,5

31,2

5

15,6

7,8

3,9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Den

sid

ad

e o

ptica

µg/mL

Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine

bulbosa frente a P. fluorescens.

Bra

nco

Con

tro

le +

Co

ntr

ole

-

50

0

25

0

12

5

62,5

31

,25

15,6

7,8

3,9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Den

sid

ad

e o

ptica

µg/mL

Figura 66 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa

frente a S. aureus.

97

Bra

nco

Con

trole

+

Con

trole

-

50

0

25

0

12

5

62

,5

31

,25

15

,6

7,8

3,9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

De

nsid

ade

optica

µg/mL

Figura 67 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa

frente a P. fluorescens.

Bra

nco

Con

trole

+

Co

ntr

ole

-

50

0

25

0

12

5

62,5

31

,25

15,6

7,8

3,9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

De

nsid

ade

op

tica

µg/mL


bulbosa frente a S. aureus.

98

Malheiros (2008) também realizou testes antimicrobianos com o extrato

etanólico do bulbo de Eleutherine plicata coletada em Belém-PA contra S. aureus e E.

coli, onde obteve resultados positivos para atividade antimicrobiana, enquanto que a do

presente estudo, não apresentou atividade frente a essas cepas.

Padhi & Panda (2015) realizaram testes antimicrobianos com extratos de

Eleutherine bulbosa, coletada na Índia, contra S. aureus, E. coli e P. fluorescens,

encontrando resultados positivos para o extrato etanólico da espécie, testado através da

metodologia de difusão em ágar, em uma concentração de 30 mg/mL de amostras.

Ifesan e colaboradores (2009) também realizaram testes antimicrobianos com

extratos de Eleutherine americana, coletada na Tailândia, onde os extratos da mesma

apresentaram atividade inibitória frente a várias cepas de S. aureus presentes em

alimentos. Ainda, Ifesan, Ibrahim & Voravuthikunchai (2010) testaram os extratos

contra diversos outros micro-organismos, e nesse trabalho constataram atividade contra

S. aureus e nenhuma atividade contra E. coli.

Panda e colaboradores (2016), realizaram teste antimicrobiano com os extratos

aquoso e metanólico de Eleutherine bulbosa frente a diversas bactérias, encontrando

resultados positivos, onde uma porcentagem bem maior de inibição bacteriana foi

Bra

nco

Co

ntr

ole

+

Co

ntr

ole

-

500

250

125

62

,5

31,2

5

15

,6

7,8

3,9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Den

sida

de o

ptic

a

µg/mL


bulbosa frente a P. fluorescens.

99

demonstrada pelo extrato metanólico, apresentando uma concentração inibitória mínima

ainda maior do que a deste estudo, onde a menor foi de 22 µg/mL. Os autores justificam

esse potencial maior do extrato metanólico por conta dele possuir substâncias de baixa e

média polaridade, além de substâncias polares primárias. Além disso, extratos

metanólicos que são parcialmente diluídos em água, tem maior chance de quebrar a

membrana celular de bactérias, especialmente as Gram-Negativas, por estas possuírem

uma camada parcialmente hidrofílica que permite a passagem de pequenas moléculas

hidrofílicas do extrato na membrana, perturbando o equilíbrio celular e levando a morte

celular da bactéria.

5.3.3 TESTE DE TOXIDADE FRENTE À Artemia salina

O teste com Artemia salina foi realizado em triplicata de cada uma das amostras

testadas, nas concentrações de 1000, 500, 250, 125 µg/mL. Na tabela abaixo, são

mostrados os valores da taxa de mortalidade dos indivíduos e os controles do solvente e

solução salina, para uma maior confiabilidade nos resultados. As médias e o desvio

padrão das amostras foram calculados baseados na mortalidade dos indivíduos de

Artemia salina nos três poços, os resultados são demonstrados na tabela 12.

Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos

em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterina frente à

Artemia salina.

Concentrações das amostras (µg/mL)

1000 500 250 125

Amostras Valores médios (%) e Desvio Padrão

Eleuterina 100±0 100±0 0±0 0±0

Bulbo Hexano 86,66±0,57 100±0 96,66±0,57 80±1

Bulbo MeOH 93,33±1,15 100±0 100±0 100±0

Folhas DCM 90±0 86,66±1,54 83,33±0,57 76,66±1,52

Folhas MeOH 93,33±0,57 63,33±4,72 83,33±1,54 73,33±3,78

Flor DCM 73,33±2,51 93,33±1,15 83,33±0,57 0±0

Flor MeOH 83,33±2,08 100±0 80±2,64 96,66±0,57

Controle DMSO 25% 0±0 0±0 0±0 0±0

Controle solução salina 0±0 0±0 0±0 0±0

100

De modo geral, as amostras apresentaram uma alta toxidade frente ao micro-

crustáceo, nas menores e maiores concentrações. Eleuterina apresentou uma alta

toxidade frente ao micro crustáceo nas concentrações de 1000 e 500 µg/mL, não

apresentando toxidade nas menores concentrações. Os extratos do bulbo, tanto hexânico

quanto metanólico, apresentaram alta toxidade, sendo o metanólico do bulbo o que

apresentou, de todas as amostras, a maior toxidade. Os extratos de folhas e flores

também apresentaram de média a alta toxidade, demonstrando que os extratos de

diversas partes de Eleutherine bulbosa, possuem no geral, de média a alta toxidade

frente à Artemia salina. De acordo com Harada (2009), os resultados de ensaio com

Artemia salina mostram uma correlação positiva com ensaios antitumorais quando

analisados de uma maneira qualitativa e não quantitativa, portanto, funcionando como

uma pré-avaliação eficiente de substâncias com potenciais farmacológicos a serem

avaliados por um bioensaio específico, como o antitumoral. Ainda, os produtos naturais

que apresentarem baixa toxidade, podem subsidiar estudos de modificação estrutural,

para explorar ainda mais o potencial das substâncias em diferentes circunstâncias, além

de serem ideais para testes em organismos, pois a ausência de toxidade oferece uma

tolerância do organismo teste ao princípio ativo encontrado na planta.

Com isso, os resultados mostrados tornaram as amostras interessantes para a

realização de um ensaio antitumoral, para ver se tal toxidade tem potencial para inibir

ou até mesmo eliminar células cancerígenas.

5.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL

Na avaliação dos extratos e da naftoquinona eleuterina quanto ao seu potencial

antitumoral, nenhuma das amostras mostrou uma citotoxidade significativa frente às

linhagens tumorais, com exceção do extrato hexânico do bulbo, como demonstrado na

Tabela 13. Todas as linhagens apresentaram entre 10-30% de morte celular após 24 h de

reação com os extratos e a substância, contudo, o extrato hexânico do bulbo apresentou

uma porcentagem de letalidade de 50-60% contra as linhagens MCF-7, MRC-5 e SK-

Mel-28, valores que se aproximam dos apresentados pela Doxorrubicina, o que torna

este extrato um extrato interessante para um futuro fracionamento, análise das

substâncias presentes e estudos de sinergia com substâncias para explorar seu potencial

101

de uma maneira mais profunda. Ainda, é interessante ressaltar que a naftoquinona

eleuterine apresentou uma porcentagem de letalidade de aproximadamente 10-30 %

contra todas as linhagens, sendo ela originária do extrato hexânico do bulbo que

apresentou uma letalidade de 50-60%, demonstrando que a eleuterina não é a principal

responsável pela atividade antitumoral, podendo ser que ela contribua para este

potencial quando em sinergia com outras substâncias. Com isso, torna-se importante

fracionar o extrato hexânico para isolar as substâncias responsáveis por esta atividade.

As quinonas são conhecidas por apresentarem alta citotoxidade, e com isso

serem responsáveis por intensa atividade antitumoral, devido a suas estruturas químicas

apresentarem unidade quinonoídica capaz de gerar intermediários alquilantes,

conhecidos por serem agentes antineoplásicos biorredutores, através da ativação por

redução de suas carbonilas quinonoídicas (BRAND & FISHER, 1990; GAUDIANO &

KOCH, 1991; SALMON-CHEMIN et al., 2001; SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003;

LIN et al., 1984).

Kusuma e colaboradores (2010) realizaram teste antitumoral com a naftoquinona

eleuterina isolada de E. americana cultivada na Indonésia, contra células de melanoma

B16, obtendo resultados positivos com inibição de 87% das células tumorais nas

concentrações de 50 e 25 µg/mL. Krishnan & Bastow (2000) descreveram atividade

antitumoral de eleuterine, isolada também de E. americana, ao relatar a capacidade da

substância de inibir a ação da topoisomerase II, uma importante enzima na replicação do

DNA que ao ser inibida em células tumorais, impede que as mesmas continuem a se

replicar, impedindo então a proliferação e crescimento do tumor.

Estes resultados quando relacionados com os do bioensaio com Artemia salina,

mostraram algumas diferenças na correlação de toxidade, como por exemplo, do extrato

metanólico do Bulbo, que apresentou baixa toxidade no ensaio antitumoral, e alta

toxidade frente à Artemia salina. Harada (2009) afirmou que a correlação entre o teste

de Artemia salina e o teste antitumoral é qualitativa, mas não quantitativa, o que poderia

explicar a correlação vista neste trabalho, justificando que provavelmente a quantidade

de extrato ou substância necessária para apresentar toxidade às linhagens tumorais, seja

maior que a necessária para apresentar toxidade às larvas de Artemia.

102

Tabela 13 – Determinação da morte celular de linhagens de células tumorais frente à

extratos de Eleutherine bulbosa e à naftoquinona eleuterina.

EXTRATOS/SUBSTÂNCIAS

MORTE CELULAR (%)

LINHAGENS DE CÉLULAS

MCF-7 MRC-5 HCT116 SK-MEL-28

Eleuterina 30,10 33,81 11,47 15,29

Bulbo – Hexano 50,23 59,61 42,63 53,58

Bulbo - MeOH 27,15 34,25 10,93 22,74

Folha – DCM 18,83 12,72 14,39 23,29

Folha – MeOH 19,53 25,01 21,22 22,60

Folha – H2O 23,63 26,38 25,23 13,65

Flor – MeOH 23,27 30 18,04 9,73

Flor – H2O 17,68 17,93 20,81 13,68

Doxorrubicina (controle positivo) 62,76 67,11 62,56 66,08 DMSO (controle negativo) 0 0 0 0

103

6. CONCLUSÃO

A análise fitoquímica de Eleutherine bulbosa coletada no bioma amazônico,

revelou a presença quinonas e derivados de quinonas. Foi possível o isolamento de

sete substâncias, contudo só foi possível a caracterização de cinco delas: eleuterina,

eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol.

O ensaio biológico de toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina, revelou

que os extratos de folhas, flores e bulbo possuem substâncias com alta toxidade, sendo

interessantes para a realização de ensaios antitumorais.

O ensaio antitumoral com revelou que o extrato hexânico do bulbo conseguiu

matar 50-60% da células tumorais de MCF-7, MRC-5 e SK-Mel-28, sendo promissor

para posteriores ensaios a fim de explorar esse potencial. Os extratos de folhas, flores

e bulbo, juntamente com a naftoquinona eleuterina, não apresentaram potencial

antitumoral frente às linhagens tumorais testadas, apesar da sua toxidade no ensaio

contra Artemia salina.

O ensaio antimicrobiano revelou que o extrato metanólico do bulbo e a fase

DCM, originária do mesmo, possuem substâncias com potencial antimicrobiano

presente nas amostras para 11 das bactérias testadas, e em menor concentração para a

fase DCM frente à S. aureus. Das substâncias isoladas, apenas a fração 61+62 (FD),

eleuterol e isoeleuterina, apresentaram CIM de 500 µg/mL contra S. aureus e P.

fluorescens.

Os extratos de folhas, flores e bulbo, juntamente com naftoquinona eleuterina,

não apresentaram atividade antioxidante significativa.

Os resultados deste estudo contribuíram para o conhecimento químico e

potencial biológico de Eleutherine bulbosa do bioma amazônico, contudo, em estudos

posteriores faz-se necessário o teste das substâncias isoladas e em sinergia com outras

substâncias, contra diferentes linhagens tumorais e cepas bacterianas para explorar

ainda mais o potencial desta espécie. Os dados aqui podem ser usados em futuros

trabalhos comparativos da química da espécie e gêneros inclusos em sua tribo, para

estudos quimiotaxonômicos, aliados com dados de morfologia e genética para a

solução de problemas taxonômicos.

104

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