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ESTUDO PRELIMINAR NO DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) INCORPORADAS À ISONIAZIDA Débora Rocha da Silva Ferreira Rio de Janeiro 2012
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ESTUDO PRELIMINAR NO DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE
POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) INCORPORADAS À ISONIAZIDA
Débora Rocha da Silva Ferreira
Rio de Janeiro
2012
i
DÉBORA ROCHA DA SILVA FERREIRA
Aluna do curso de Farmácia
Matrícula 0823800161
ESTUDO PRELIMINAR NO DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE
POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) INCORPORADAS À ISONIAZIDA
Rio de Janeiro
2012
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,
apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia
da UEZO como parte dos requisitos para obtenção
do grau de Graduação em Farmácia, sob a
orientação do Professor Leandro Medeiros Motta.
ii
ESTUDO PRELIMINAR NO DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE
POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) INCORPORADAS À ISONIAZIDA
Elaborado por Débora Rocha da Silva Ferreira
Aluna do Curso de Farmácia da UEZO
Este trabalho foi analisado e aprovado com grau: 9,5
Rio de Janeiro, 04 de Julho de 2012.
____________________________________________________
Leandro Medeiros Motta, Prof. Dr., CCBS - UEZO Presidente
____________________________________________________
Marco Antônio Mota da Silva, Prof. Dr., CCBS - UEZO
____________________________________________________
Éverton Dias D’Andrea, Prof. MSc, CCBS - UEZO
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL
JULHO DE 2012
iii
Dedico este trabalho ao meu
filho, Matheus, fonte da minha
alegria e inspiração.
iv
Agradecimentos
A Deus, por ter me dado saúde e força para lutar.
Aos meus pais Jacira e Carlos, por todo incentivo ao longo desses anos e porque
não mediram esforços para que eu chegasse até essa etapa na minha vida.
Ao meu esposo Diego que de forma especial me deu força e coragem, me apoiando
nos momentos de dificuldades.
A toda minha família pelo incentivo e pela confiança depositada em mim.
A todos os professores que me acompanharam durante a graduação, em especial ao
Prof. Dr. Leandro Motta, responsável pela realização deste trabalho, obrigada pela
orientação, paciência e disponibilidade que tornaram possível a conclusão desta
monografia.
À aluna de doutorado Mariana Satto (IMA/UFRJ) que muito contribuiu para a
realização deste trabalho.
v
RESUMO
A tuberculose é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis e tem
sido considerada um problema de saúde pública mundial dado o número de óbitos
observados nos últimos tempos. A falência do tratamento deve-se principalmente ao
abandono por parte dos pacientes devido à longa duração do tratamento e a grande
quantidade de comprimidos do esquema terapêutico. As ações de combate à
tuberculose incluem tanto o desenvolvimento de novos medicamentos, quanto à
busca de novas formas de administração que proporcionem maior eficácia
terapêutica. A nanoencapsulação de fármacos é uma técnica bastante utilizada na
preparação de sistemas de liberação prolongada. Sabe-se que esses sistemas
oferecem inúmeras vantagens quando comparados a outros de dosagens
convencionais, dentre elas o aumento da adesão terapêutica. O principal objetivo
deste trabalho foi desenvolver e caracterizar nanopartículas de Poli(Álcool Vinílico)
(PVA) contendo isoniazida pela técnica de nanoencapsulação por spray drying. As
nanopartículas obtidas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de
Varredura, Espalhamento de Luz e Difração de Raios-X. O fármaco e o polímero
também foram caracterizados isoladamente por Espectroscopia de Infravermelho. Os
resultados obtidos mostraram que foi possível criar condições para nanoencapsular a
isoniazida em Poli(Álcool Vinílico). O método de spray dryer mostrou-se adequado
para obtenção das nanopartículas.
vi
ABSTRACT
Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis and has
been considered a worldwide public health problem given the number of deaths
observed in recent times. The treatment failure is mainly due to abandonment by
patients due to the long duration of treatment and the large number of tablets of the
treatment regimen. Actions to combat tuberculosis include both the development of
new drugs, and the search for new forms of administration that provide greater
therapeutic efficacy. The drug nanoencapsulation is a technique widely used in the
preparation of sustained release systems. It is known that these systems offer
numerous advantages when compared to other conventional dosage, among them
the increased adherence. The main objective of this study was to develop and
characterize nanoparticles of Poly (Vinyl Alcohol) (PVA) containing isoniazid
nanoencapsulation the technique of spray drying. The nanoparticles obtained were
characterized by Scanning Electron Microscopy, Light Scattering and Diffraction of X-
Rays. The drug and the polymer isolation also were characterized by infrared
spectroscopy. The results showed that it was possible to create conditions for
nanoencapsular isoniazid in Poly (Vinyl Alcohol). The spray drying method was
adequate to obtain the nanoparticles.
vii
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais
voltará ao seu tamanho original”.
Albert Einstein
viii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS .................................................................................... x
RESUMO .................................................................................................... v
ABSTRACT ................................................................................................ vi
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1
2. OBJETIVOS ............................................................................................ 3
2.1. Objetivos específicos ...................................................................... 3
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................... 4
3.1. A Tuberculose ................................................................................. 4
3.1.1. Considerações gerais sobre a tuberculose ............................ 4
3.1.2. Etiologia, fisiologia e transmissão da doença ......................... 5
3.1.3. O tratamento ........................................................................... 6
3.2. Isoniazida: O fármaco modelo ........................................................ 8
3.3. A liberação controlada de fármacos e a técnica de
micro(nano)encapsulação ...................................................................... 9
3.3.1. A técnica de spray drying ...................................................... 12
3.4. O polímero: Poli(Álcool Vinílico) ...................................................... 14
4. METODOLOGIA ...................................................................................... 16
4.1. Preparação das partículas obtidas por spray drying ...................... 16
4.2. Caracterização das partículas ........................................................ 16
4.2.1. Morfologia ............................................................................. 16
4.2.2. Análise do tamanho das partículas ....................................... 17
4.2.3. Difração de Raios-X (DRX) ................................................... 17
ix
4.2.4. FTIR ...................................................................................... 17
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 18
5.1. Caracterização das partículas ........................................................ 18
5.1.1. Morfologia .............................................................................. 18
5.1.2. Análise do tamanho das partículas ....................................... 21
5.1.3. Difração de Raios-X (DRX) .................................................... 22
5.1.4. FTIR ........................................................................................ 25
6. CONCLUSÕES ...................................................................................... 28
7. PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................ 29
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... 30
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estimativa da incidência de tuberculose no ano de 2010 ....................... 4
Figura 2. Estrutura molecular da isoniazida ........................................................... 7
Figura 3. Perfis de liberação de drogas em função do tempo: convencional x
controlada ................................................................................................................ 9 Figura 4. Diferença morfológica entre as formas de micro(nano)esfera e micro(nano)cápsula ................................................................................................. 11 Figura 5. Representação esquemática do funcionamento do equipamento spray-
dryer ........................................................................................................................ 13 Figura 6. Estrutura química do PVA ....................................................................... 14 Figura 7. Fotomicrografias da amostra de isoniazida ............................................ 18 Figura 8. Fotomicrografias das nanopartículas de PVA obtidas por spray drying.. 18 Figura 9. Fotomicrografias das nanopartículas de PVA dopadas com isoniazida obtidas por spray drying .......................................................................................... 19 Figura 10. Determinação do tamanho médio das nanopartículas de PVA e de
PVA dopadas com isoniazida .................................................................................. 21 Figura 11. Difratograma de Raios-X da isoniazida ................................................. 22 Figura 12. DR-X do Poli(álcool vinílico) matéria-prima e das nanopartículas obtidas após a passagem pelo spray drying ........................................................................ 23 Figura 13. DR-X das nanopartículas de PVA dopadas com isoniazida .................. 24
Figura 14. FTIR da isoniazida ................................................................................. 25
Figura 15. FTIR PVA ............................................................................................... 26
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose é uma doença milenar causada pelo Mycobacterium
tuberculosis e continua sendo a principal causa de morte por doença infecciosa no
mundo (JUNIOR, 2007). Aproximadamente um terço da população global, cerca de
dois bilhões de pessoas, está infectada pelo M. tuberculosis, havendo, anualmente,
mais de dois milhões de óbitos e oito milhões de novos casos (CAVALCANTI, 2009).
A isoniazida, ou hidrazina do ácido nicotínico é o mais antigo fármaco sintético
efetivo contra a doença. Sugere-se que seu mecanismo de ação decorra da inibição
de biossíntese de ácidos micólicos que compõem a parede celular, tornando a
bactéria susceptível aos fatores do meio (CAVALCANTI, 2009).
O tratamento atual da tuberculose envolve a administração em longo prazo, de
elevadas doses de múltiplas drogas (OHASHI, 2009). Além da isoniazida, utilizam-se
também rifampicina, pirazinamida, e etambutol que são drogas de primeira linha
utilizadas no tratamento (MEHTA, 2009).
A longa duração do tratamento e a grande quantidade de comprimidos do
esquema terapêutico não são bem aceitos pelos pacientes e a baixa aderência ao
tratamento é uma das principais razões da ineficácia do mesmo, contribuindo
também para a resistência multidrogas (SOSNIK, 2009).
Trabalhos da literatura fornecem evidências de que os sistemas de liberação
controlada oferecem inúmeras vantagens quando comparados a outros de dosagem
convencional. Dentre elas, maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e
controlada do fármaco, a partir da degradação da matriz; diminuição significativa da
toxicidade e maior tempo de permanência na circulação.
Segundo a Farmacopéia Americana (USP 2000), sistemas de liberação
prolongada são aqueles que reduzem, pelo menos à metade, a freqüência de
administração ou aumentam significativamente a adesão ou a performance
terapêutica, quando comparada às formas de dosagens convencionais.
2
A tecnologia associada à modificação da liberação de princípios ativos é
vasta. Entre essas tecnologias, destaca-se a micro(nano)encapsulação de fármacos.
Micro(nano)cápsulas são partículas constituídas por um núcleo interno contendo o
agente ativo recoberto por uma camada de polímero de espessura variável. Em tais
produtos, o princípio ativo protegido é liberado gradativamente por meio de estímulos
adequados, tais como mudança de pH, rompimento físico, intumescimento,
dissolução, etc. (SUAVE, 2006).
O desenvolvimento de sistemas que permitem a liberação controlada do
fármaco aparece como uma possibilidade de otimizar a terapia de doenças que
exigem tratamento prolongado e com alta carga de comprimidos, como na
tuberculose, pois aumentam a adesão do paciente impedindo a interrupção do
tratamento.
Dentro do contexto apresentado, o presente trabalho consiste no
desenvolvimento e na caracterização de sistemas de liberação controlada veiculando
a isoniazida, fármaco com ação tuberculostática.
3
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Apresentar o preparo e a caracterização de nanopartículas de PVA (polímero
biodegradável) dopadas com isoniazida, utilizando-se para isso a técnica de
nanoencapsulação por spray drying.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Obtenção de nanopartículas poliméricas de PVA associadas à isoniazida
através da técnica de nanoencapsulação por spray drying.
2) Caracterização das partículas através de suas propriedades físico - químicas.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. A tuberculose
3.1.1. Considerações gerais
Historicamente, a tuberculose faz parte do grupo de doenças negligenciadas,
nas quais as companhias farmacêuticas têm relutado em investir devido à percepção
de baixo potencial comercial, fato que explica a lacuna de 30 anos sem a introdução
de nenhuma nova droga para seu tratamento (CAVALCANTI, 2009).
Segundo a Organização Mundial da Saúde, em 2010, foram relatados 8,8
milhões de novos casos de tuberculose no mundo, o equivalente a 128 casos por
100.000 habitantes. Ainda em 2010, cerca de 1,1 milhões de mortes ocorreram entre
pessoas HIV-negativos e 0,35 milhões de mortes entre as pessoas HIV-positivos,
assim, em total, cerca de 1,4 milhões de pessoas morreram de tuberculose no
mundo. O Brasil está entre os 22 países com maior projeção de incidência de
tuberculose, com 43 casos por 100 mil habitantes (WHO, 2011).
Figura 1: Estimativa da incidência de tuberculose no ano de 2010 (WHO, 2011).
5
3.1.2. Etiologia, fisiologia e transmissão da doença
O Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose, foi
descoberto em 1882 por Robert Koch. O gênero Mycobacterium é constituído por
bacilos retos ou ligeiramente curvos com dimensões que variam entre 0,2 e 0,6 µ por
1 a 10 µ, imóveis e não formadores de esporos. A contaminação ocorre pela inalação
das gotículas contendo bacilos viáveis eliminadas durante a tosse, os quais
alcançam os alvéolos pulmonares, onde se implantam (VERONESI, 2005).
O Mycobacterium tuberculosis possui um envelope celular altamente
hidrofílico e produz enzimas hidrolíticas ou enzimas modificadoras como às beta
lactamases e as acetil transferases que lhe conferem extrema resistência aos
fármacos utilizados no seu combate (ROSSETI, 2002).
O período de incubação do Mycobacterium tuberculosis dura de 4 a 12
semanas para identificação das lesões primárias. A probabilidade de que o indivíduo
infectado evolua para a doença propriamente dita, depende de múltiplas causas,
destacando-se, dentre estas, a idade avançada, as condições sócio-econômicas e
algumas condições médicas (diabetes mellitus, alcoolismo, infecção pelo vírus da
imunodeficiência adquirida, etc.). De um modo geral, a evolução ocorre quando o
sistema imune está debilitado e não consegue manter o bacilo sob controle (BRASIL,
2009).
O Mycobacterium tuberculosis não se apresenta livre na natureza. Sua
infecção ocorre de modo interpessoal, através das vias respiratórias, progredindo
para a doença ativa. A infecção latente inicia-se com uma reação inflamatória aguda
e inespecífica, formando um pequeno foco de broncopneumonia, evolui para uma
reação granulomatosa específica (2-4 semanas), e posteriormente para a cura por
fibrose e calcificação, sendo que nem todos os bacilos são destruídos podendo
permanecer viáveis por décadas (VERONESI, 2005).
Os sintomas associados à tuberculose pulmonar são a tosse - inicialmente
seca, que se torna produtiva com a evolução da doença, hemoptise (expectoração
6
sanguínea através da tosse), dispnéia, dor torácica, rouquidão, febre, anorexia com
perda ponderal (VERONESI, 2005).
3.1.3. O tratamento
Os fármacos utilizados no tratamento da tuberculose podem ser divididos em
duas categorias principais: os agentes de “primeira linha”, que combinam o maior
nível de eficácia com um grau aceitável de toxicidade, incluem a isoniazida, a
rifampicina, o etambutol, a estreptomicina e a pirazinamida; e, os agentes de
“segunda linha”, incluem a etionamida, o ácido aminosalicílico, a ciclosserina, a
amicacina, a canamicina, a capreomicina e a linezolida (JUNIOR, 2007).
A farmacoterapia padrão de primeira linha compreende uma primeira etapa (2
meses) combinando rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol e uma
segunda (4 meses) com apenas rifampicina e isoniazida (MORETTON 2010). O
tratamento de segunda linha, com custo mais elevado, por períodos mais longos e
com maior toxidade, decorre da multi-droga resistência, explicada pela resistência
aos dois mais efetivos fármacos desse tratamento: isoniazida e rifampicina
(CAVALCANTI, 2009).
O tratamento prolongado e a alta carga de comprimidos resultam na baixa
adesão dos pacientes aos regimes terapêuticos e a interrupção do tratamento é a
principal causa do fracasso terapêutico e do desenvolvimento de tuberculose
multirresistente (MORETTON, 2010).
Uma estratégia potencial para o tratamento da tuberculose é a utilização de
Doses Fixas Combinadas (DFC) que são a associação de duas ou mais drogas de
primeira linha numa só formulação, sob fixas proporções, e assume importância
devido ao menor custo do tratamento, menor risco de erros de medicação,
simplificação e efetiva implementação do tratamento sob observação direta
(CAVALCANTI, 2009).
7
Esforços têm sido feitos para promover DFC na terapia, porém, ao longo dos
anos, foram detectados problemas na sua qualidade, como a falha na
biodisponibilidade de rifampicina, instabilidade das formulações, desenvolvimento de
resistência e efeitos tóxico-alérgicos. Alguns estudos consideram como principal
problema na terapia com DFC da tuberculose a pobre biodisponibilidade oral da
rifampicina. Essa perda na biodisponibilidade é atribuída à reação de degradação da
rifampicina com a isoniazida em condições de estômago vazio, verificando-se grande
perda de rifampicina antes da sua absorção (CAVALCANTI, 2009).
Superar os principais inconvenientes tecnológicos dos agentes terapêuticos
para aumentar a aderência ao tratamento assim como aumentar a efetividade das
drogas nos reservatórios infecciosos continua sendo um dos principais objetivos da
Tecnologia Farmacêutica. Neste contexto, a nanotecnologia parece ser uma das
mais promissoras abordagens. O mercado global de nanotecnologia baseado na
liberação de fármacos espera crescer de cerca de US$ 3,4 (2007) para US$ 220
bilhões até 2015 (SOSNIK, 2009).
Segundo TOIT (2006), o desenvolvimento de sistemas de liberação de uso
oral especialmente nos países em desenvolvimento ainda é uma necessidade onde
sistemas injetáveis ou inalantes são caros e não são bem aceitos pelos pacientes.
O investimento em tecnologia a fim de obter novas formas farmacêuticas tem
se mostrado uma alternativa promissora para diminuir os casos de resistência e
contribuir com a prevenção, controle e cura da doença (CAVALCANTI, 2009). No
entanto, segundo LOPES (2003), há pouco interesse das indústrias farmacêuticas na
pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para tuberculose em virtude de se
tratar de doença de notificação compulsória, de responsabilidade governamental e
laboratórios oficiais e assim, um mercado pouco atrativo para investimentos.
8
3.2. O Fármaco modelo: Isoniazida
A isoniazida (figura 2) é um pró-farmaco que continua sendo o principal agente
para a quimioterapia da tuberculose (JUNIOR, 2007). Foi sintetizada em 1912 a partir
do etil-isonicotinato e hidrazina e seus efeitos no tratamento da tuberculose foram
comprovados em 1945 (CAVALCANTI, 2009).
Figura 2. Estrutura molecular da isoniazida
A isoniazida é utilizada tanto no tratamento profilático quanto na doença ativa
da tuberculose. Embora seu exato mecanismo de ação seja desconhecido
(GOODMAN & GILMAN, 2004), sugere-se que a enzima catalase-peroxidase
micobacteriana converte a isoniazida em um metabólito ativo que age inibindo a
síntese do ácido micólico, peculiar na formação da parede celular do bacilo (JUNIOR,
2007).
Sua fórmula molecular é C6H7N3O e tem peso molecular de 137,14 Da.
Apresenta-se como um pó cristalino branco, solúvel em água 125mg mL-1 (25ºC),
ligeiramente solúvel em etanol e praticamente insolúvel em éter e benzeno. Suas
soluções em água na proporção 1:10 possuem pH entre 6,0 a 7,5. Valores de pka de
2,0 e 3,5 e Log P (pH 7,4) é de 1,1 (UNITED STATES PHARMACOPEIA DI, 2007).
A isoniazida é rapidamente absorvida pelo trato gastrintestinal e apresenta
ampla distribuição pelos tecidos e líquidos corporais (RANG; DALE; RITTER, 2001).
Os picos das concentrações plasmáticas (3 a 5 µg/ml) são atingidos dentro de 1 a 2
horas após sua ingestão (GOODMAN & GILMAN, 2004).
9
Existem evidências de apreciável efeito de primeira passagem após a
administração oral de isoniazida. Essas evidências baseiam-se no fato de que a
excreção renal do fármaco sob a forma inalterada é de aproximadamente 29% após
a administração oral e de que percentuais mais elevados são encontrados após
administração intravascular. No entanto, não se encontram estabelecidos os valores
da biodisponibilidade oral (GOODMAN & GILMAN, 2004).
3.3 A liberação controlada de fármacos e a técnica de
micro(nano)encapsulação
Os sistemas de liberação controlada oferecem inúmeras vantagens quando
comparados a outros de dosagem convencional.
Nas formas de administração convencionais (spray, injeção, pílulas) a
concentração da droga na corrente sanguínea apresenta um aumento, atinge um
pico máximo e então declina. Desde que cada droga possui uma faixa de ação
terapêutica acima da qual ela é tóxica e abaixo da qual ela é ineficaz, os níveis
plasmáticos são dependentes das dosagens administradas. Este fato é problemático
se a dose efetiva estiver próxima à dose tóxica. O objetivo dos sistemas de liberação
controlada é manter a concentração do fármaco entre estes dois níveis por um tempo
prolongado, utilizando-se de uma única dosagem (AZEVEDO, 2002).
A diferença de concentração plasmática efetiva em função do tempo, entre
sistemas convencionais e de liberação controlada, pode ser visualizado na Figura 3.
10
Figura 3. Perfis de liberação de drogas em função do tempo: convencional x controlada (AZEVEDO, 2002).
A tecnologia associada à modificação da liberação de princípios ativos, como
fármacos, pesticidas, corantes, aromatizantes e etc., é vasta. Entre essas
tecnologias, os sistemas matriciais poliméricos são amplamente aplicados na forma
de micro(nano)partículas (SUAVE, 2006).
Os primeiros registros de tentativas de aplicação da técnica de
micro(nano)encapsulação datam da década de 1930. Desde então, ela vem sendo
estudada e empregada em diversas áreas industriais, sobretudo no setor
farmacêutico.
No início dos anos 70, TODD definiu micro(nano)encapsulação como a
tecnologia de empacotamento com finas coberturas poliméricas aplicáveis em
sólidos, gotículas de líquidos ou material gasoso, formando pequenas partículas
denominadas micro(nano)cápsulas, que podem liberar seu conteúdo sob velocidade
e condições específicas.
As micro(nano)partículas são subdivididas em micro(nano)esferas e
micro(nano)cápsulas, segundo a sua estrutura. Denominam-se micro(nano)esferas
11
aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se homogeneamente disperso ou
solubilizado no interior da matriz polimérica. Desta forma obtém-se um sistema
monolítico, onde não é possível identificar um núcleo diferenciado.
Micro(nano)cápsulas, ao contrário, constituem os chamados sistemas do tipo
reservatórios, onde é possível se identificar um núcleo diferenciado, que pode ser
sólido ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma
membrana, geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo (AZEVEDO,
2002).
A diferença morfológica entre a forma farmacêutica de micro(nano)esfera
(sistema polimérico matricial) e micro(nano)cápsula (sistema polimérico do tipo
reservatório) está ilustrada na Figura 4.
Figura 4. (A) micro(nano)esfera – o agente ativo está distribuído em uma matriz polimérica; (B) micro(nano)cápsula – o agente ativo está envolvido pelo agente encapsulante (polímero) (AZEVEDO, 2002).
O conceito de micro(nano)cápsula surgiu da idealização do modelo celular.
Neste, a membrana que envolve e protege o citoplasma e os demais componentes
exerce ao mesmo tempo outras funções, como controlar a entrada e a saída de
12
material na célula. De modo semelhante, a micro(nano)cápsula consiste em uma
camada de um agente encapsulante, geralmente um material polimérico que atua
como um filme protetor, isolando a substância ativa (gotículas líquidas, partículas
sólidas ou material gasoso) e evitando o efeito de sua exposição inadequada. Essa
membrana se desfaz sob estímulo específico, liberando a substância no local ou
momento ideais (RÉ, 2000).
Os mecanismos de liberação dos materiais ativos micro(nano)encapsulados
variam de acordo com a natureza do agente encapsulante, sendo que normalmente
ocorrem devido a mecanismos como: variação de temperatura e de pH, solubilidade
do meio, biodegradação, difusão, ruptura mecânica, permeabilidade seletiva e
gradiente de concentração existente em relação ao meio de liberação (FAVARO-
TRINDADE, 2008).
Segundo VILA JATO (1999), é importante destacar que as
micro(nano)partículas podem constituir por si próprias uma forma farmacêutica ou
então serem acondicionadas em uma forma farmacêutica secundária. É possível,
portanto, administrá-las sob a forma de suspensão ou incluí-las em uma cápsula ou
comprimido.
Varias técnicas têm sido empregadas na elaboração de micro(nano)cápsulas,
tais como: spray drying, spray cooling, coacervação, extrusão, extrusão centrífuga,
recobrimento em leito fluidizado, lipossomas e complexação por inclusão (FAVARO-
TRINDADE, 2008).
3.3.1 A técnica de spray drying
Um processo para micro(nano)encapsulação bastante usado é o spray drying.
Nele, o material ativo a ser encapsulado é misturado a uma solução do composto
que constitui o material encapsulante, formando uma emulsão. Ao ser atomizado
dentro do secador, ocorre a evaporação do líquido da solução do agente
13
encapsulante com a formação da membrana ao redor das gotas do material ativo
(VILA JATO, 1999).
Micro(nano)partículas contendo um agente ativo podem ser preparadas por
spray-drying a partir de sistemas homogêneos (soluções) ou heterogêneos
(dispersões). No caso de soluções, o ativo e o polímero estão co-dissolvidos em um
mesmo solvente. No caso de dispersões, partículas finamente divididas do ativo são
incorporadas a uma solução polimérica (RÉ, 2006).
O processo envolve quatro estágios sequenciais: (a) Atomização dos materiais
de alimentação através de um bico atomizador; (b) Contato das gotículas produzidas
com o ar; (c) Secagem (d) Coleta do produto sólido (partículas) obtido.
A representação esquemática do processo de spray-drying pode ser
observado na Figura 5.
Figura 5. Representação esquemática do funcionamento do equipamento spray-dryer (Ré, 2006).
Em comparação com as outras técnicas de micro(nano)encapsulação, a
secagem por atomização oferece algumas vantagens, como a reprodutibilidade da
técnica para obtenção de partículas, a aplicabilidade tanto com materiais sensíveis
quanto resistentes à temperatura, a capacidade de processar diversas matérias-
14
primas e a flexibilidade na formulação. Os fatores de formulação e os parâmetros de
processo determinam as propriedades das partículas produzidas (RÉ, 2006).
As condições operacionais e o design do equipamento podem ser escolhidos
de acordo com características desejadas para a secagem e quanto às especificações
requeridas para o produto. A seleção cuidadosa das variáveis do processo, como
metodologia e condições de atomização, temperatura do ar de secagem e
concentração da solução/suspensão de alimentação, determina a obtenção de
partículas com tamanho, distribuição granulométrica e conteúdo de umidade
adequados. Estas variáveis também são determinantes da morfologia das partículas
formadas, uma vez que para dadas condições de secagem, as partículas podem
inflar, colabar, sofrer fraturas ou apresentar poros (WALTON, 2000).
Quanto à morfologia das partículas formadas por spray, WALTON (2000),
classificou-as em três categorias distintas, denominadas aglomeradas, formadoras
de filme e cristalinas. Aglomeradas são partículas compostas por outras pequenas
partículas individuais submicrométricas; formadoras de filmes são partículas
compostas de uma fase contínua não-líquida de natureza polimérica ou sub-
microcristalina; e, finalmente, as cristalinas são partículas compostas por cristais
individuais grandes, ligados por uma fase microcristalina contínua.
3.4 O polímero: Poli(Álcool Vinílico)
A melhoria no desenvolvimento de sistemas de liberação controlada depende
estritamente da seleção de um agente apropriado capaz de controlar a liberação do
fármaco e sustentar a ação terapêutica ao longo do tempo. Dentro das várias
opções, os polímeros são agentes versáteis e promissores para exercer tal função.
Sistemas poliméricos de liberação de fármacos são largamente utilizados, pois
permitem uma liberação lenta e gradual do ingrediente ativo no organismo. Alguns
exemplos de polímeros sintéticos largamente utilizados são o poli(etileno), poli(ácido
acrílico), poli(acrilamidas), poli(etilenoglicol), poliésteres e o poli(álcool vinílico).
15
O Poli(Álcool Vinílico) (algumas vezes abreviado como PVOH, PVA, ou PVAL,
do inglês polyvinyl alcohol) é um polímero sintético hidrossolúvel.
Foi obtido pela primeira vez em 1924, por Herrman e Haehnel, a partir da
hidrólise do Poli(Acetato de Vinila), e é a forma de obtenção comercial utilizada até
hoje (MARTEN, 1985). Sua fórmula molecular é (C2H4O)x. A estrutura química do
PVA é apresentada na Figura 6.
Figura 6. Estrutura química do PVA.
Por causa de suas propriedades, o PVA tem sido utilizado em um grande
número de aplicações industriais. Este polímero é um excelente adesivo, possui boa
resistência a solventes, óleos e graxas e sua resistência à passagem de oxigênio é
superior a de qualquer polímero conhecido. É um dos poucos polímeros
semicristalinos solúveis em água, e apresenta boas características interfaciais e
mecânicas (MARTEN, 1985).
Quanto à solubilidade, o Poli(Álcool Vinílico) é solúvel em solventes altamente
polares e hidrófilos, tais como acetamida, glicóis, dimetilsulfóxido (DMSO),
dimetilformamida (DMF), sendo a água o melhor solvente.
16
4. METODOLOGIA
4.1. Preparação das partículas obtidas por spray drying.
Preparou-se uma primeira solução de PVA (3% p/v) e uma segunda solução de
PVA na mesma concentração e isoniazida (20% p/p em relação à massa do
polímero), utilizando-se água destilada como solvente. As soluções foram aquecidas
sob agitação mecânica a 50º C durante 4 horas até completa homogeneização.
Posteriormente as soluções foram submetidas à secagem por spray drying. A
secagem das soluções foi conduzida no Instituto de Macromoléculas Professora
Eloísa Mano (IMA) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, em um secador
spray-dryer modelo 190 marca BÜCHI com capacidade nominal de evaporação 1,5
Kg H2O/h. As condições operacionais para a secagem da solução foram as
seguintes: vazão de alimentação (0,20 L/h), vazão de ar (3,74 m3/min), temperatura
de entrada do ar no secador (130 °C) e temperatura de saída do ar no secador
(85°C).
4.2. Caracterização das partículas
4.2.1. Morfologia
A análise microscópica (superfície e forma) dos pós foi realizada em um
microscópio eletrônico de varredura (MEV) FEI Quanta 400, com um sistema de
microanálise química por dispersão de energia (EDS) Bruker Quantax acoplado. Este
sistema conta com espectrômetro de energia dispersiva Bruker XFlash 4030,
tecnologia SSD (silicon drift detector) com janela de 30 mm2, e resolução espectral
melhor que 133 eV para Mn kα. O MEV foi operado em alto vácuo, tensão de
aceleração de elétrons de 20 kV, e spot size de 5. As imagens são de elétrons retro-
espalhados, com níveis de cinza proporcionais ao número atômico médio a cada
17
pixel. As análises pontuais, quando apresentadas, foram calculadas após calibração
espectral com padrão de Cu, mas sem padrões de quantificação, com ajuste de
Bremsstrahlung e deconvolução por parâmetros fundamentais com significado físico.
As análise são semi-quantitativas.
4.2.2. Análise do tamanho das partículas
O diâmetro médio das partículas foi determinado após a dispersão do pó em
água destilada na concentração de 1:1000. O diâmetro foi determinado por
equipamento de luz a laser (Multi Angle Particle Sizing Option, Brookhaven, USA). O
ângulo de detecção foi de 90º, sendo procedida à leitura em uma cela de quartzo de
1 cm de caminho óptico, a temperatura controlada e mantida a 25ºC e os dados
obtidos foram integrados com auxílio do software MAS OPTION.
4.2.3. Difração de Raios-X (DR-X)
As partículas obtidas foram analisadas em um difratômetro de Raios-X
operado a 30KV, 15mA, 0,05 1ºC/min, em temperatura ambiente. A radiação
CuKα foi utilizada como fonte dos raios X, com comprimento de onda de 0,15418 nm.
A faixa de varredura da difração foi ajustada para ângulos de 1 a 30°.
4.2.4. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR)
As análises de FTIR foram realizadas com o objetivo de verificar os principais
grupos funcionais do PVA e da Isoniazida. As análises foram realizadas em um
espectrômetro de absorção na região do infravermelho de marca Perkin-Elmer, com
transformada de Fourier, FTIR. Faixa de varredura: 4000 a 500 cm -1.
18
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização das partículas
5.1.1. Morfologia
A B C
Figura 7. Fotomicrografias da amostra de isoniazida. (A) 100x (B) 500x (C) 1000x.
A B C
D E F
Figura 8. Fotomicrografias das partículas de PVA obtidas por spray drying. (A) 250x (B) 500x (C)
1000x (D) 2500x (E) 5000x (F) 10000x.
19
A B C
D E F
Figura 9. Fotomicrografias das partículas de PVA dopadas com isoniazida obtidas por spray drying.
(A) 300x (B) 600x (C) 1300x (D) 2500x (E) 5000x (F) 10000x.
A avaliação da morfologia foi realizada pela observação por microscopia
eletrônica de varredura (MEV) da isoniazida (figura 7), das partículas de PVA obtidas
por spray drying (figura 8) e das partículas de PVA dopadas com isoniazida obtidas
pelo mesmo método (figura 9).
A amostra de isoniazida apresentou uma mistura de cristais irregulares tipo
haste (figura 7).
A análise morfológica das partículas realizadas através do MEV com
aumentos de 1000x (figura 8) e 1300x (figura 9) revelou a existência de um sistema
particulado polidisperso. Constatou-se que a presença do fármaco não levou a
alterações significativas no aspecto físico das partículas obtidas quando observamos
em maior magnificação. Em aumentos de 5000x, pôde-se evidenciar que ambas as
partículas apresentaram-se com forma semelhante à hemácias, com a presença de
20
concavidades. Esta característica é mais evidenciada na figura 8, embora na figura 9
as partículas também tenham apresentado concavidades, porém menos profundas,
dando a ideia de partículas menos “delgadas”. Outra constatação relevante é a
presença, em ambas as amostras, de partículas pequenas internalizadas em outras
maiores.
Em aumentos superiores (10.000 vezes) foi possível observar a superfície das
partículas. Ambas as amostras apresentaram partículas de superfície lisa e
compacta (sem a presença de poros).
A presença de concavidades citada é explicada por WALTON (2000): a ação
de capilaridade da superfície seca das partículas no momento da extração do líquido
para o exterior acontece uniformemente ao redor da gotícula, criando uma pressão
interna sub-atmosférica, resultando em partículas colabadas. Este fenômeno também
pode ser devido ao impacto das partículas úmidas na parede da câmara de
secagem, que acabam por deformar ou colabar. Já a ocorrência de partículas
pequenas dentro de outras de maior tamanho pode ser devido à entrada daquelas
através de espaços ou crateras formados nestas últimas. Também deve ser
considerada a possibilidade das partículas menores terem sido formadas dentro das
maiores (WALTON, 2000).
21
5.1.2 Análise do tamanho das partículas
A análise dos tamanhos das partículas de PVA e de PVA dopadas com
isoniazida obtidas por spray drying foi realizada através da técnica de espalhamento
de luz e pode ser visualizada na figura 10.
Figura 10. Determinação do tamanho médio das partículas de PVA e de PVA dopadas com isoniazida.
As partículas apresentaram tamanhos nanométricos. É importante neste
momento definirmos alguns termos relacionados à microencapsulamento. Estas
estruturas variam grandemente e vários tipos são possíveis. O termo micropartículas
é genérico, sendo usado de acordo com o tamanho da partícula a que se está
referindo. Partículas com tamanho menor que 1 µm são consideradas
nanopartículas, enquanto que as partículas maiores são denominadas
micropartículas. Desta forma, as partículas obtidas tratam-se de nanopartículas, de
acordo com o seu tamanho.
Sabe-se que partículas com tamanho reduzido possuem potencial aplicação
para administração por via oral.
22
5.1.3 Difração de Raios-X (DR-X)
A principal aplicação da Difração de Raios-X refere-se à identificação de
compostos cristalinos. Os planos de difração e suas respectivas distâncias
interplanares, bem como as densidades de átomos (elétrons) ao longo de cada plano
cristalino, são características específicas e únicas de cada substância cristalina, da
mesma forma que o padrão difratométrico por ela gerado (equivalente a uma
impressão digital).
O difratograma da isoniazida está representado na Figura 11.
0 20 40 60 80
0
2000
4000
6000
8000
10000
Inte
nsi
ty
2 theta
Isoniazida
Figura 11. Difratograma de Raios-X da isoniazida.
Reflexões intensas foram observadas em regiões características da
cristalinidade do fármaco. Os valores encontram-se bem próximos dos relatados na
literatura de 2θ entre 15,6° e 27,3° (TIBOLA, 2009).
23
O difratograma do Poli(Álcool Vinílico) matéria-prima e das nanopartículas
obtidas após a passagem pelo spray drying estão representados na Figura 12.
Figura 12. DR-X do Poli(Álcool Vinílico) matéria-prima e das nanopartículas obtidas após a passagem
pelo spray drying.
Sabe-se que o PVA apresenta um intenso pico de difração a 2θ = 19,4°
relacionado ao plano cristalográfico (BUNN, 1948). Na análise realizada pôde-se
confirmar este pico característico relatado na literatura, tanto para a amostra de PVA
quanto para a amostra deste polímero após passagem no spray dryer (figura 11). No
entanto, ao compararmos os dois difratogramas, observamos uma diminuição da
cristalinidade do PVA após a passagem pelo spray dryer, devido à diminuição de
intensidade dos picos cristalinos.
24
O difratograma das nanopartículas de PVA dopadas com isoniazida obtidas
após a passagem pelo spray drying estão representados na Figura 13.
Figura 13. DR-X das nanopartículas de PVA/isoniazida.
O DR-X foi utilizado para se avaliar a alteração na natureza cristalina da matriz
de PVA em função da presença de isoniazida.
Um intenso pico de difração foi observado em 22,4º (2θ). Observa-se que a
presença do fármaco na concentração sugerida neste trabalho não causou alteração
na microestrutura cristalina da matriz de PVA, pois o pico de difração principal para
PVA se manteve.
25
5.1.4. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR)
O espectro de absorção da isoniazida (figura 14) e do PVA (figura 15) na
região do infravermelho médio foi registrado no intervalo de 4500 a 500 cm-1.
Figura 14. FTIR da isoniazida
Os dados espectrais observados no espectro FTIR da isoniazida são
concordantes com outros autores. Segundo TIBOLA (2009), o espectro de absorção
da isoniazida apresenta bandas de média intensidade de absorção em 3302, 3209,
3172 e 3113 cm-1 que são atribuídas às vibrações de estiramento da ligação N-H do
grupo hidrazida. As bandas em 3017 e 3050 cm-1 são atribuídas às vibrações do
estiramento da ligação C(sp2)-H do anel aromático. As bandas em 1556, 1602 estão
relacionadas com o estiramento simétricos e assimétricos do anel aromático da
molécula enquanto as bandas em 746 e 675 cm-1 são atribuídas às flexões fora do
plano do anel. A banda de forte intensidade em 1667 cm-1 refere-se à vibração do
estiramento da carboxila da azida; a banda em 1636 cm-1 é atribuída à deformação
26
do grupamento NH2 da hidrazida (CONHNH2) e, a banda em 1337 cm-1, à vibração
de estiramento do C-N. As bandas em 1493 e 1412 e 1222 cm-1 correspondem às
vibrações C-CH dentro do anel. A posição da banda em 1142 cm -1 corresponde às
vibrações de N-N que estão localizadas fora do plano de flexão do anel aromático da
molécula.
A banda em 996 cm-1 está relacionada às deformações no plano do anel
aromático da molécula, sendo que a vibração C-H fora do plano de flexão do anel é
atribuída à banda na posição 888 cm-1. A banda em 845 cm-1 corresponde ao
grupamento NH2 do espectro de infravermelho.
A banda na posição 660 cm-1 é atribuída à vibração do NH fora do anel e em
504 cm-1 pela flexão do CO no plano do anel.
A figura 15 representa o espectro de absorção do PVA.
Figura 15. FTIR PVA
Os dados espectrais observados no espectro FTIR do PVA são concordantes
com outros autores. Os grupos acetato e hidroxila, existentes no PVA, são
relacionados a bandas características que podem ser verificados pela espectroscopia
de infravermelho. (MANSUR, 2007; COSTA JR., 2008):
27
As vibrações correspondentes aos grupos químicos principais do PVA
encontram-se descritas na literatura e são listadas na Tabela 1.
Tabela 1. Grupos característicos no infravermelho do PVA (MANSUR, 2007; COSTA JR., 2008).
28
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos mostraram que foi possível criar condições para
nanoencapsular a isoniazida em Poli(Álcool Vinílico). O método de spray dryer
mostrou-se adequado para obtenção das nanopartículas.
A avaliação morfológica através de MEV evidenciou a formação de partículas
”colabadas”, com a presença de partículas pequenas internalizadas em outras
maiores e de superfície lisa e compacta. Constatou-se ainda que a presença do
fármaco não levou a alterações significativas no aspecto físico das partículas obtidas,
quando comparamos as partículas de PVA puro e destas dopadas com isoniazida. A
análise do tamanho das partículas por espalhamento de luz revelou tamanhos
nanométricos, caracterizando estas partículas como de potencial aplicação para
administração oral. A Difração de Raios-X mostrou que a presença do fármaco não
causou alteração na microestrutura cristalina da matriz de PVA. Os valores
encontrados no Difratograma do PVA e da isoniazida foram concordantes com outros
autores, assim como os dados espectrais observados no espectro FTIR do polímero
e do fármaco.
29
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
Sugere-se para trabalhos futuros a realização de testes in vitro da liberação da
isoniazida na sua forma nanoencapsulada para que seja avaliada a cinética de
dissolução das partículas obtidas, de maneira que seja possível garantir a efetividade
dessas partículas como sistemas moduladores da liberação do fármaco, bem como
predizer o seu comportamento in vivo.
Mesmo diante dos avanços alcançados nos estudos de liberação de fármacos
a partir de micro(nano)partículas, metodologias oficiais para a determinação do perfil
de liberação in vitro desses sistemas ainda estão ausentes. Assim, métodos
conhecidos têm sido utilizados, tais como técnicas que empregam membranas de
difusão ou diálise, dispersão em volume fixo de meio, célula de fluxo ou mesmo
dissolutor utilizando pás ou cestas, com variações capazes de adaptar essas
metodologias à avaliação de sistemas micro(nano)particulados (OBACH, 2002).
Os testes de dissolução, apesar de ausentes em códigos oficiais para a
avaliação de sistemas micro(nano)particulados, são importantes para orientar o
desenvolvimento das formulações. Os perfis de liberação obtidos com esses ensaios
encerram informações fundamentais capazes de descrever a estrutura e o
comportamento da formulação em uma escala microscópica, bem como sugerir
mecanismos de interação fármaco-polímero durante a liberação (AULTON, 2005).
30
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARANHA, I. B.; LUCAS, E. F. Poli(álcool vinílico) modificado com cadeias hidrocarbônicas: Avaliação do balanço hidrófilo/lipófilo. Polímeros: Ciência e Tecnologia, 11( 4), 174-181, (2001). AULTON, M.E. Delineamento de formas farmacêuticas. Artmed: Porto Alegre, 2005. AZEVEDO, M.M.M. Nanoesferas e a liberação controlada de fármacos. Monografia - LQES. Instituto de Química da UNICAMP, 2002. 20 p. BRASIL. RE n.310, de primeiro de setembro de 2004. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Guia para realização do estudo e elaboração do relatório de equivalência farmacêutica e perfil de dissolução, 2004. BUNN C. W.; Crystal structure of poly(vinyl alcohol); Nature 161, 929-930, (1948) CAVALCANTI, A.C. et al. Novas formas farmacêuticas como alternativa para o tratamento da tuberculose visando à diminuição de casos de multi-droga resistência. Latin American Journal of Pharmacy. v. 28, n 6. p. 945 – 947. Jul. 2009. COSTA, JR. Desenvolvimento de matriz de quitosana/PVA quimicamente reticulado para aplicação em engenharia de tecido epitelial. Tese de doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo horizonte (2008). FAVARO-TRINDADE, C. S. et al. Revisão: Microencapsulação de ingredientes alimentícios. Braz. J. Food Technol., v. 11, n. 2, p. 103-112, abr./jun. 2008 HARDMAN, J.G; LIMBIRD, L.E. GOODMAN & GILMAN: As bases farmacológicas da terapêutica. 10. ed. Rio de Janeiro: McGRAW-Hill, 2004. p. 852-855. JUNIOR, S.V.C. Técnicas de caracterização de polímeros. Editora Artiliber, 2004. p.17-261.
LOPES, S. C. Cerco a uma poderosa inimiga. Jornal da USP. Caderno especial, p.58. São Paulo, maio 2003. MANSUR, A. A. P. Mecanismo físico-químico de aderência na interface argamassa modificada com polímeros/cerâmica de revestimento. Universidade Federal de Minas Gerais, Tese de Doutorado, Belo Horizonte, (2007).
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MARTEN, F. L. Vinyl Alcohol Polymer. Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 17, H. F. Mark, N. M. Bikales, C. G. Overberger & G. Menges (eds.), John-Wiley, New York (1985). MEHTA, S.K.; KAUR, G.; BHASIN, K.K. Entrapment of Multiple Anti-Tb Drugs in Microemulsion System: Quantitative Analysis, Stability, and In Vitro Release Studies. Wiley InterScience. Vol. 99, n. 4. p.1896 – 1911. April. 2010. MORETTON, Marcela A. et al. Molecular implications in the nanoencapsulation of the anti-tuberculosis drug rifampicin within flower-like polymeric micelles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. v. 79. p. 467 – 479. Maio. 2010. OBACH, E.S. Avaliação dos perfis de Liberação In Vitro e da Toxicidade Gastrointestinal In Vivo de Indometacina a partir de Nebulizados de Nanocápsulas. Porto Alegre: UFRGS, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2002. Dissertação (Mestrado em Farmácia). OHASHI, K.; KABASAWA, T.; OZEKI, T.; OKADA, H. One-step preparation of rifampicin/poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticle-containing mannitol microspheres using a four-fluid nozzle spray drier for inhalation therapy of tuberculosis. Journal of Controlled Release. v. 135. p. 19 – 24. 2009. RANG, H. P; DALE, M. M; RITTER, J. M. Agentes antimicobacterianos. In: Farmacologia. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara koogan, 2001. p. 590-592. RÉ, M. I. Microencapsulação: Em busca de produtos inteligentes. Ciência Hoje 27(162):24-29, 2000. RÉ, M.I. Formulating Drug Delivery Systems by Spray Drying. Drying Technology, v.24, p.433–446, 2006. ROSSETI, M.L.R. et al. Tuberculose resistente: revisão molecular. Revista de Saúde Pública, 2002. v.36, n. 4. p.525-532. SOSNIK, A; CARCABOSO, A.M; GLISONI, R.J; MORETTON, M.A.; CHIAPPETTA, D.A. New old challenges in tuberculosis: Potentially effective nanotechnologies in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 62. p. 547 - 559. 2009. SUAVE, J. et al. Microencapsulação: Inovação em diferentes áreas. Revista Saúde e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 7, n. 2. 2006.
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